ES2317786B1 - Agregado o complejo molecular carotenoide soluble, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Agregado o complejo molecular carotenoide
soluble, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
El objeto de la presente invención es
solubilizar en agua una matriz oleosa enriquecida en pigmentos
carotenoides formando agregados moleculares que acomplejen la
fracción carotenoide lo que les proporcionará la solubilidad en
agua y una mayor estabilidad física y química sin necesidad de
recurrir a una instrumentación costosa.
Description
Agregado o complejo molecular carotenoide
soluble, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
La presente invención se circunscribe al sector
de la química alimentaria, concretamente a la producción de
compuestos colorantes y antioxidantes, y más concretamente, a un
concentrado carotenoide procesado convenientemente para aportar
cualidades funcionales tanto tecnológicas (color, capacidad
antioxidante) como fisiológicas (propiedades bioactivas de los
carotenoides) a zumos, bebidas y alimentos deshidratados.
Entre todos los compuestos bioactivos, destacan
los carotenoides debido a su amplia presencia y distribución,
diversidad estructural y a las acciones biológicas que desempeñan
en los mamíferos. El interés que despiertan estos compuestos en la
industria alimentaria ha evolucionado desde su mero uso como
colorantes, para conferir y corregir el color en alimentos, o su
empleo como fuente de pro-vitamina A, hasta
incluirlos en el amplio catálogo de componentes bioactivos que, una
vez incorporados al organismo a través de la dieta, ejercen
funciones como antioxidantes, mejoran la comunicación intercelular
y potencian el sistema inmune. Como contraposición a las acciones
beneficiosas de estos compuestos están la dependencia absoluta de
la dieta para incorporar carotenoides a nuestro organismo y una
biodisponibilidad muy poco eficiente, debido al carácter
liposoluble de los carotenoides. Para contrarrestar estos factores
se recomienda una ingesta adecuada de fuentes ricas en carotenoides
(frutas, vegetales y aceites) manteniendo unos niveles apropiados
de carotenoides en plasma y aquellos tejidos donde desarrollen su
actividad.
Sin embargo, la liposolubilidad de los
carotenoides dificulta su empleo en alimentos en los que la matriz
es hidrofílica, como zumos y bebidas refrescantes. Para
diversificar las fuentes de ingesta, la industria alimentaria ha
desarrollado procedimientos con los que se facilita la
incorporación de carotenoides a alimentos constituidos básicamente
por una matriz hidrofílica y así aumentar su bioaccesibilidad.
El primer recurso extendido es la formulación de
carotenoides en dispersiones o emulsiones utilizando agentes
emulsionantes para obtener una dispersión "aceite en agua".
Como en todas las emulsiones los parámetros tamaño de gota y su
distribución, son los implicados en la estabilidad, reología,
reactividad química y eficiencia fisiológica de la emulsión. En el
caso de los carotenoides, la estabilidad de la emulsión no sólo se
contabiliza en términos físicos sino también químicos por la
sensibilidad de estos compuestos a agentes oxidantes. Más
concretamente, para los carotenoides se ha descrito la obtención de
microemulsiones como los procedimientos descritos en las patentes
US 641774, JP 03-089532, EP
96-610003 y WO 00/00250 (ES), utilizando una amplia
variedad de surfactantes, generalmente no iónicos, y/o biopolímeros,
tanto proteínas como polisacáridos. La obtención de dispersiones no
necesita de una instrumentación compleja o costosa pero la
formulación requerida suele contener distintos compuestos para
estabilizar tanto física como químicamente la dispersión.
Otro procedimiento para la obtención de
soluciones acuosas de carotenoides es la encapsulación. La
encapsulación es el proceso por el que compuestos liposolubles,
como los carotenoides, y que ejercen el rol de "huéspedes",
son introducidos en una matriz, material pared o "anfitrión"
que los recubre impidiendo con ello su degradación por contacto
directo con agentes oxidantes. En función de la matriz y método de
encapsulación empleado, el producto final será un polvo, un sólido
que puede ser molido a diferentes tamaños de partícula o una
dispersión del conjunto resultante
"huésped-anfitrión". Entre los métodos
generales de encapsulación más ampliamente utilizados en la
industria alimentaria destacan el secado por aspersión, la
aspersión por enfriamiento o congelación, la extrusión y la
inclusión de complejos. Se han descrito diferentes técnicas de
encapsulación de carotenoides mediante secado por aspersión
resultando como más eficiente el uso de maltodextrinas de distintos
pesos moleculares (valores de equivalentes de dextrosa de 4, 15,
25, 36,5) como matriz de encapsulación. Esta técnica tiene un coste
bajo en comparación con otras como la aspersión por congelación
aunque al proporcionar un área superficial elevada se incrementa la
posibilidad de oxidación. Otros procedimientos descritos utilizan
la técnica de aspersión por congelación empleando matrices amorfas,
como pullulan, un polisacárido lineal de glucosa, PVP40 y PVP360,
que son poliamidas de diferente peso molecular. Para la
encapsulación de carotenoides también se ha descrito la técnica de
inclusión de complejos, utilizando
beta-ciclodextrina como "anfitrión" para la
encapsulación molecular. Las patentes JP 62267261, JP 04244059 y WO
9513047 describen procedimientos para ello. En este caso el
pigmento se asocia, mediante uniones no covalentes, con
beta-ciclodextrina generando un agregado soluble en
agua. En general, la encapsulación es una técnica más eficiente
proporcionando una mayor estabilidad a la preparación pero se
requiere una instrumentación más
costosa.
costosa.
Finalmente, se pretende disminuir la
sensibilidad de los carotenoides a factores oxidantes que con
relativa facilidad pueden disminuir de forma significativa la
concentración de estos compuestos en el alimento al que se
adicionan.
- Carotenoid nanodispersions for use in
water-based systems and a process for their
preparation. Fullmer, L., Emmick, T. US 641774
(20030815) [Fullmer, Ankeny, IA, USA] 2005.
- Process for producing carotenoid emulsion.
Mori, T. Ogata, T., Shimamura, S.,
Tanaka, H., Taniguchi, K., Kitayama, M. JP
03-089532 (20030328) [Kuraray, Okayama, Japan]
2004.
- Water dispersible compositions containing
natural hydrophobic pigment, method of preparing same and their
use. Winning, M., Isager, P. P. EP
96-610003 (19960122) [Chr. Hansen, 2970 Hoersholm,
Denmark] 2003.
- Method for the production of a
water-dipersible formulation containing
carotenoids. Eller, T., Christiansen, C., Collados
de la Vieja, A. J., Muñoz, A., Morales, E. WO
00/00250(ES) (20000713) [Vitatene, E-24080
Leon, Spain] 2002.
- Preparation of cyclodextrin inclusion
compounds containing \beta-carotene as material
for drug, food and cosmetics. Hasebe, K., Ando, Y.,
Chikamatsu, Y., Hayashi, K. Patent JP 62267261;
1987.
- Preparation of cyclodextrin inclusion
compounds containing \beta-carotene as food dyes
and antioxidants. Murao, T., Maruyama, T.,
Yamamoto, Y. Patent JP 04244059; 1992.
- Decolorized
carotenoid-cyclo-dextrin complexes.
Schwartz, J. L., Shklar, G., Sikorski, C.
Patent WO 9513047; 1995.
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Un aspecto de la invención lo constituye un
agregado o complejo molecular carotenoide, en adelante complejo
carotenoide de la invención, constituido por una fracción monoéster
de sacarosa asociada, no covalentemente, con una fracción o
pigmento carotenoide.
Un aspecto preferente de la invención lo
constituye el complejo carotenoide de la invención que presenta,
preferentemente, una relación monoéster de sacarosa:pigmento
carotenoide de 1:1 ó 2:1.
Otro aspecto preferente de la invención lo
constituye el complejo carotenoide de la invención en el que el
carotenoide pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, al siguiente grupo:
\beta-caroteno, licopeno, zeaxantina,
cantaxantina, \beta-criptoxantina, capsantina y
luteína.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de elaboración del complejo carotenoide, en adelante
procedimiento de la invención, basado en el uso de una enzima con
actividad ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa, EC 2.4.1.19) y
porque comprende las siguientes etapas:
- i)
- mezcla en agua del carotenoide con un exceso de monoéster de sacarosa,
- ii)
- adición de una enzima con actividad ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa) a la solución de i) permitiendo su acción a temperatura adecuada, preferentemente entre 60 y 90ºC, y más preferentemente a 70ºC, durante al menos 2 horas, preferentemente entre 2 y 24 horas, y
- iii)
- eliminación del exceso de monoéster de sacarosa, preferentemente mediante centrifugación o filtrado.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso del complejo carotenoide de la invención, en adelante uso de
la invención, en la elaboración de un aditivo alimentario o
compuesto terapéutico al que aportan sus cualidades funcionales
tanto tecnológicas (color, capacidad antioxidante) como
fisiológicas (propiedades bioactivas de los carotenoides). Entre
los alimentos se puede contar por ejemplo, zumos, bebidas y
alimentos deshidratados.
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El carácter lipofílico de los pigmentos
carotenoides impide su solubilidad en agua. En la presente
invención se consigue formar agregados polisacáridos, que
interaccionan con el carotenoide, dando lugar a estructuras más
complejas (con uniones no covalentes), que confieren al conjunto
propiedades que son compatibles con las del agua. Por tanto, la
invención se enfrenta al problema de aportar nuevos aditivos
alimentarios bioactivos en formatos solubles.
Más concretamente, la presente invención se basa
en que los inventores han observado que es posible solubilizar en
agua un extracto oleoso enriquecido en pigmentos carotenoides
mediante la adición de monoéster de sacarosa que, modificado
enzimáticamente, forma agregados moleculares que posteriormente se
asocian, no covalentemente, con la fracción carotenoide (Ejemplo
1). La enzima ciclodextringlucanotransferasa cataliza la unión de
moléculas de glucosa para formar ciclodextrinas de distinto rango
proporcionando receptáculos eficaces para alojar carotenoides.
El procedimiento para obtener estos agregados se
inicia con la mezcla de una alícuota de la matriz oleosa rica en
carotenoides con un exceso de monoéster de sacarosa, adicionando el
enzima ciclodextringlucanotransferasa. Este enzima cataliza
diversas reacciones como la ciclación, acoplamiento y la de
desproporción. El enzima ejerce su actividad sobre los residuos de
glucosa y, desde el punto de vista del mecanismo de reacción, de
una forma muy similar a las \alpha-amilasas,
aunque la ciclodextringlucanotransferasa no pertenezca al grupo de
las hidrolasas. Los inventores desconocen el mecanismo concreto por
el que se forman los agregados en el caso de la presente invención,
tan sólo que se produce una asociación molecular entre el sustrato
y el pigmento carotenoide, gracias a la actividad del enzima, de
tal forma que el agregado posee características físicas más
polares, modificando, en este sentido, las del carotenoide lo que
le permite una buena solubilidad en agua. En concreto y con el
sustrato utilizado, monoéster de sacarosa, el enzima produce
agregados moleculares de dos y tres unidades. Estos agregados se
asocian mediante uniones no covalentes con la fracción carotenoide
adicionada inicialmente, en relación 1:1 ó 2:1 de la relación
monoéster de sacarosa:pigmento carotenoide, obteniendo un complejo
soluble en agua. El proceso de formación del complejo es en
realidad una encapsulación molecular lo que resulta una gran
ventaja para la fracción acomplejada (carotenoides) ya que la
protege de la degradación por radiación UV, altera su reactividad
química, aumentando su estabilidad frente a las soluciones
orgánicas en que el pigmento está solubilizado en forma libre, y se
hace soluble en agua. Los dos procesos, tanto la reacción
enzimática de formación de agregados moleculares a partir del
monoéster de sacarosa como la formación del complejo con el
pigmento carotenoide tienen lugar simultáneamente, verificándose el
proceso en agua aproximadamente entre 60 y 90ºC, preferentemente
70ºC, y entre 2 y 24 horas. El complejo es lo suficientemente
estable como para impedir la transferencia de la fracción
carotenoide desde la fase acuosa al disolvente extractante (hexano,
éter etílico) (Ejemplo 1). La solución acuosa obtenida se
centrifuga o filtra para eliminar restos del monoéster de sacarosa
que no hayan reaccionado.
La solución carotenoide resultante es de una
elevada capacidad colorante que se puede utilizar en dilución para
colorear bebidas y zumos. Otra posibilidad es su liofilización,
obteniendo un polvo que se puede emplear para transferir color a
alimentos deshidratados.
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye un agregado o complejo molecular carotenoide, en
adelante complejo carotenoide de la invención, constituido por una
fracción monoéster de sacarosa asociada, no covalentemente, con una
fracción o pigmento carotenoide.
Un aspecto preferente de la invención lo
constituye el complejo carotenoide de la invención que presenta,
preferentemente, una relación monoéster de sacarosa:pigmento
carotenoide de 1:1 ó 2:1.
Una realización preferente lo constituye el
complejo carotenoide de la invención en la que el monoéster de
sacarosa es palmitato de sacarosa.
Otro aspecto preferente de la invención lo
constituye el complejo carotenoide de la invención en el que el
carotenoide pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, al siguiente grupo:
\beta-caroteno, licopeno, zeaxantina,
cantaxantina, \beta-criptoxantina, capsantina y
luteína. Los carotenoides utilizados en el procedimiento pueden
estar en forma purificada o en forma de extracto oleoso de origen
vegetal, como por ejemplo oleorresinas de
\beta-caroteno y licopeno u oleorresinas de
marigold (Tapetes erecta) y de pimientón (Capsicum annuum
L.) sometidas previamente a desesterificación.
Los carotenoides desde el punto de vista
químico, pertenecen a la familia de los terpenos. Se conocen
alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos
tipos básicos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las
xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los
apocarotenoides, de tamaño menor, formados por ruptura de los
carotenoides típicos.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de elaboración del complejo carotenoide, en adelante
procedimiento de la invención, basado en el uso de una enzima con
actividad ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa, EC 2.4.1.19) y
porque comprende las siguientes etapas:
- i)
- mezcla en agua del carotenoide con un exceso de monoéster de sacarosa,
- ii)
- adición de una enzima con actividad ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa) a la solución de i) permitiendo su acción a temperatura adecuada, preferentemente entre 60 y 90ºC, y más preferentemente a 70ºC, durante al menos 2 horas, preferentemente entre 2 y 24 horas, y
- iii)
- eliminación del exceso de monoéster de sacarosa, preferentemente mediante centrifugación o filtrado.
Otro aspecto preferente de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención en el que el
carotenoide de i) se utiliza en forma pura o en forma de extracto
oleoso y pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, al siguiente grupo: extracto oleoso de
\beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina,
cantaxantina, \beta-criptoxantina, capsantina y
extracto oleoso de pimiento (Capsicum annuum L.) sometido
previamente a desesterifi-
cación.
cación.
Otro aspecto preferente de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención en el que el monoéster
de sacarosa de i) se utiliza en forma de un extracto vegetal,
preferentemente, enriquecido en un monoéster de sacarosa o en forma
pura.
Una realización preferente lo constituye el
procedimiento de la invención en el que el monoéster de sacarosa es
un extracto de origen vegetal con palmitato de sacarosa.
Una enzima con actividad
ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa, EC 2.4.1.19) puede
obtenerse a partir de distintos microorganismos, entre otros,
bacterias Bacillus, Thermoanaerobacter, etc. Por otro
lado, la reacción enzimática puede llevarse a cabo utilizando la
enzima CGTasa libre en la solución o inmovilizada a un soporte que
permita su reutilización tras su uso. Las diferentes CGTasas útiles
para llevar a cabo el procedimiento de la invención pueden ser
aisladas y seleccionadas por un experto en la materia.
Otro aspecto preferente de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención en el que la enzima
ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa) es de origen bacteriano,
preferentemente una CGTasa de Thermoanaerobacter o de
Bacillus. Una realización particular sería la utilización de
la CGTasa de Thermoanaerobacter descrita en el ejemplo de la
presente invención.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso del complejo carotenoide de la invención, en adelante uso de
la invención, en la elaboración de un aditivo alimentario o
compuesto terapéutico al que aportan sus cualidades funcionales
tanto tecnológicas (color, capacidad antioxidante) como
fisiológicas (propiedades bioactivas de los carotenoides). Entre
los alimentos se puede contar por ejemplo, zumos, bebidas y
alimentos deshidratados.
Figura 1.- Espectro de absorción electrónica del
complejo palmitato de sacarosa:luteína en agua.
Figura 2.- Espectro de masas del complejo
palmitato de sacarosa:luteína, obtenido mediante la técnica ESI en
modo negativo. La identificación de los iones característicos es la
siguiente: 579 uma, palmitato de sacarosa; 615 uma, palmitato de
sacarosa dihidrato; 1147 uma, aducto palmitato de sacarosa:luteína
(1:1); 1183 uma, aducto palmitato de sacarosa:luteína (1:1)
dihidrato; 1727 uma, aducto palmitato de sacarosa:luteína
(2:1).
Figura 3.- Cromatograma obtenido a partir del
análisis por HPLC-UV-Vis de una
muestra de complejo de luteína. El análisis cromatográfico se
realizó en modo isocrático empleando como fase móvil
agua:acetonitrilo:ácido fórmico 50:50:0,1 a 1 mL/min.
Figura 4.- Cromatograma obtenido a partir del
análisis por
HPLC-UV-Vis-MS de
una muestra de complejo palmitato de sacarosa:luteína. El análisis
cromatográfico se realizó en modo isocrático empleando como fase
móvil agua:acetonitrilo:ácido fórmico 50:50:0,1 a 1 mL/min y
registrado a 434 nm.
Figura 5 a y b.- Espectro de masas obtenido
mediante un sistema de HPLC-UV-Vis
acoplado al espectrómetro de masas, on line, para la muestra de
complejo con luteína. La identificación de los iones
característicos es la siguiente: 579 uma, palmitato de sacarosa;
615 uma, palmitato de sacarosa dihidrato; 1147 uma, aducto
palmitato de sacarosa:luteína (1:1); 1183 uma, aducto palmitato de
sacarosa:luteína (2:1) hidrato.
Ejemplo
1
El monoéster de sacarosa utilizado para
ejemplificar la invención es palmitato de sacarosa presente en un
extracto vegetal enriquecido en dicho monoéster. Este producto lo
comercializa la empresa Gattefossé bajo la especificación Sucro
Ester 15 (número CAS 26446-38-8).
Por otro lado, la fuente de carotenoides es una oleorresina de
marigold desesterificada comercializada por la empresa Kemin Foods
bajo la denominación FloraGlo Lutein (20% Liquid in Corn Oil).
En un tubo de ensayo se pesaron 0,1 gramos de
oleorresina, 0,5 gramos de palmitato de sacarosa y se añadieron 30
mL de agua. El tubo se introdujo en un baño de agua a 70ºC,
agitando la mezcla reactante con un agitador magnético. A
continuación, se añadieron 0,5 mL de preparación enzimática
Toruzyme 3.0 L comercializada por la empresa Novozymes que contiene
la enzima ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa). El enzima se
obtiene a partir de una cepa de Bacillus a la que se le
introdujo el gen para la producción de CGTasa a partir de una cepa
de Thermoanaerobacter. La mezcla se dejó en agitación
durante 3 horas manteniendo la temperatura constante e igual a
70ºC.
Transcurrido el periodo de reacción, la mezcla
se centrifuga a 20000 rpm durante 20 minutos para eliminar el
exceso de palmitato de sacarosa que no ha reaccionado. Se puede
sustituir la centrifugación por una filtración de la mezcla a
través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 \mum. El
producto final es una solución acuosa de color amarillo intenso. En
la Figura 1 se muestra el espectro de absorción electrónica de la
solución acuosa obtenida. La concentración del pigmento en la
solución se determina espectrofotométricamente. Para ello, una
alícuota de la solución (100-200 \muL) se mezcla
con 2 mL de N,N-dimetilformamida, 2 mL de hexano y
5 mL de agua. La mezcla se agita vigorosamente en un vortex durante
1 minuto y se centrifuga a 5000 rpm durante 10 minutos. La fase de
hexano se recoge, se evapora y el residuo se disuelve con 2 mL de
etanol, determinando la absorbancia de esta disolución. El cálculo
de la concentración se realiza utilizando la siguiente
expresión:
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\vskip1.000000\baselineskip
La ionización a presión atmosférica (APCI, APPI,
ESI, etc), y en especial la ionización por electrospray viene
siendo la técnica preferentemente utilizada en el estudio de
complejos unidos por fuerzas no covalentes debido, sobre todo, a
que es un método de ionización de los denominados "soft
ionization methods". De los, al menos, cuatro tipos de fuerzas
no covalentes más conocidos: iónicas, enlaces de hidrógeno, fuerzas
de van der Vaals e interacciones hidrofóbicas existen datos de
experimentos llevados a cabo con éxito en la detección de este tipo
de compuestos. En todos los casos estas fuerzas son débiles por lo
que estos compuestos son muy frágiles a la hora de conseguir la
transferencia a la fase gaseosa de los iones en solución.
El proceso de evaporación del solvente en
soluciones de complejos unidos por enlaces no covalentes y su
transferencia como complejo intacto desde la solución a la fase
gaseosa es una etapa crítica. La energía aplicada en el proceso de
ionización debe ser la adecuada como para no traspasar la línea
entre la producción de un ión o la que produce su disociación.
Los parámetros que afectan a la formación y
transporte de los iones a la fase gaseosa son:
1. Composición de la solución (% de fase
orgánica).
2. La concentración de analito en la fase
móvil.
3. Modificadores de la solución que facilitan la
ionización.
4. Energía de electrospray.
5. Valores de tensión de los elementos de la
interfase, especialmente el capilar calentado (desolvatación final)
y skimmer.
En el presente caso y para el complejo
carotenoide realizado con luteína, se seleccionaron las siguientes
condiciones:
1. Se parte del preparado del complejo bruto que
es previamente liofilizado. Posteriormente se prepara una
disolución en agua:acetonitrilo:ácido fórmico 50:50:0,1 a
concentración 0,1 \muM.
2. El método de ionización seleccionado fue ESI
en modo negativo.
3. La tensión de electrospray fue de 3 kV.
4. La introducción de la muestra se hizo
mediante bomba de infusión a velocidad 10 \muL/min y por HPLC
on-line para verificación.
5. La temperatura del capilar fue de 175ºC. Este
valor es claramente insuficiente para desolvatar completamente el
spray generado, lo que se traduce en la formación de aductos
desprotonados del portador (palmitato de sacarosa) con el agua y el
modificador (fórmico), pero por contra se preserva la presencia del
aducto de [Portador + Invitado]^{-}, es decir, [palmitato
de sacarosa + luteína-H]^{-} observándose
con intensidades que varían entre 0,1 y 3% a m/z 1147. Asimismo, a
m/z 1727 aparece el aducto [2(palmitato de
sacarosa)+luteína-H]^{-}. Para valores
superiores de temperatura del capilar, el ión molecular no aparece,
lo que se correspondería con el espectacular incremento de la
intensidad del ión de palmitato de sacarosa, consecuencia de la
liberación de la molécula de luteína. A temperaturas superiores
estos aductos están ausentes.
En la Figura 2 se representa el espectro de
masas del complejo de luteína.
El análisis por HPLC se realizó, no sólo para
tratar de verificar los datos obtenidos mediante inyección
continua, sino para tratar de evitar en lo posible las posibles
interferencias debidas a la matriz de reacción, ya que se esperaba
que al eluirlas a través de una columna de C18, aquellas pudieran
ser evitadas en su mayoría. No obstante, y como puede verse en el
registro HPLC-UV-Vis (Figura 3) la
muestra presenta un perfil de elución muy "ancho", típico de
una mezcla de compuestos (pull de ésteres de sacarosa) del que
mediante fragmentogramas de masas pueden ser extraídos los iones
de interés.
Se inyectaron 50 \muL de solución original en
agua:acetonitrilo:ácido fórmico 50:50:0,1 filtrada, en un sistema
HPLC-UV-Vis-MS
online eluido en modo isocrático con agua:acetonitrilo:ácido
fórmico 50:50:0,1 a 1 mL/min y registrado a 434 nm. La introducción
de muestra en el espectrómetro se hizo en modo split postcolum (200
\muL a la interfase). En la Figura 4 se muestra el cromatograma
obtenido. También se obtiene así un registro simultáneo en
UV-Vis y MS. La inyección de la muestra por HPLC
mostró igualmente la formación del ión molecular desprotonado del
aducto [palmitato de
sacarosa+luteína-H]^{-} a m/z 1147 así
como de [palmitato de
sacarosa+2H_{2}O+luteína-H]^{-} a m/z
1183, (Figura 5 a y b).
La estabilidad térmica del complejo carotenoide
de la invención se determinó provocando su degradación. La
obtención de la constante de degradación a varias temperaturas de
ensayo permite predecir la estabilidad del complejo carotenoide a
cualquier temperatura, según la ecuación de Arrhenius. El
experimento se realizó en las siguientes condiciones. Las
temperaturas de ensayo seleccionadas fueron 60, 80 y 100ºC
aplicando un tiempo de calentamiento de la muestra de,
aproximadamente, 1-3 vida media. La reacción de
degradación se corresponde con una cinética de primer orden
obteniendo las siguientes constantes de degradación a las
temperaturas ensayadas: K_{60^{o}C}, 0,0147 h^{-1};
K_{80^{o}C}, 0,034901 h^{-1}; K_{100^{o}C}, 0,1823 h^{-1}.
Una vez obtenidos los parámetros de la ecuación de Arrhenius se
predice la constante de degradación a 25ºC y a 4ºC y el tiempo de
vida media resultando los valores siguientes:
La estabilidad del complejo carotenoide de la
invención se determinó provocando su oxidación espontánea inducida
por radicales lo que se traduce en una pérdida progresiva del color
en el espectro visible de la solución acuosa del complejo
carotenoide. La reacción de oxidación se inicia mediante la adición
de una disolución acuosa de un promotor de radicales libres que a
una temperatura concreta se descompone espontáneamente en especies
radicalarias. El promotor utilizado en este caso fue el
2,2'-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrocloruro, en adelante AAPH, a las concentraciones de 1, 10,
50 y 125 mM. Una alícuota de la solución de complejo carotenoide,
se mezcló con un volumen de la disolución de AAPH. La reacción
transcurrió en un tubo de ensayo inmerso en un baño termostatizado
a 60ºC con agitación. El muestreo se realizó cada 2 minutos,
tomando de la mezcla reactante una alícuota para determinar la
absorbancia a 450 nm. Los datos de absorbancia se transformaron en
datos de concentración (expresada en términos de porcentaje de
complejo carotenoide remanente respecto al valor inicial). Para el
cálculo de la constante cinética se utilizó el método integral. El
orden de reacción que mejor se ajustaba a los datos experimentales
es el de orden 1 obteniendo las siguientes constantes cinéticas
para cada concentración de radical utilizada:
A partir de los valores de la constante cinética
se pudo calcular el tiempo de vida media del complejo carotenoide
para cada concentración de radical obteniendo los valores de 2,12
minutos, 2,56 minutos, 5,72 minutos, y 23,98 minutos, para las
concentraciones de 125, 50, 10 y 1 mM, respectivamente.
Claims (11)
1. Complejo o agregado molecular carotenoide
caracterizado porque está constituido por una fracción
monoéster de sacarosa asociada, no covalentemente, con una fracción
o pigmento carotenoide.
2. Complejo carotenoide según la reivindicación
1 caracterizado porque presenta, preferentemente, una
relación monoéster de sacarosa:pigmento carotenoide de 1:1 ó
2:1.
3. Complejo carotenoide según la reivindicación
1 caracterizado porque el monoéster de sacarosa es
palmitato de sacarosa.
4. Complejo carotenoide según la reivindicación
1 caracterizado porque el carotenoide pertenece al siguiente
grupo: \beta-caroteno, licopeno, zeaxantina,
cantaxantina, \beta-criptoxantina, capsantina y
luteína.
5. Procedimiento de elaboración del complejo
carotenoide según las reivindicaciones 1 a la 4
caracterizado porque se basa en el uso de una enzima con
actividad ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa, EC 2.4.1.19) y
porque comprende las siguientes etapas:
i) mezcla en agua del extracto oleoso que
contiene el carotenoide con un exceso de monoéster de sacarosa,
ii) adición de una enzima con actividad
ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa) a la solución de i)
permitiendo su acción a temperatura adecuada, preferentemente entre
60 y 90ºC, y más preferentemente a 70ºC, durante al menos 2 horas,
preferentemente entre 2 y 24 horas, y
iii) eliminación del exceso de monoéster de
sacarosa, preferentemente mediante centrifugación o filtrado.
6. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque el carotenoide de i) se utiliza en
forma pura o en forma de extracto oleoso y porque pertenece al
siguiente grupo: extracto oleoso de
\beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina,
cantaxantina, \beta-criptoxantina, capsantina y
extracto oleoso de pimiento (Capsicum annuum L.) sometido
previamente a desesterificación.
7. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque el monoéster de sacarosa de i) se
utiliza en forma de un extracto vegetal, preferentemente,
enriquecido en un monoéster de sacarosa o en forma pura.
8. Procedimiento según la reivindicación 7
caracterizado porque el monoéster de sacarosa es un extracto
de origen vegetal con palmitato de sacarosa.
9. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque la enzima
ciclodextringlucanotransferasa (CGTasa) de ii) es de origen
bacteriano, preferentemente una CGTasa de Thermoanaerobacter
o de Bacillus.
10. Uso del complejo según las reivindicaciones
1 a la 4 en la elaboración de un aditivo alimentario o compuesto
terapéutico al que aportan sus cualidades funcionales tanto
tecnológicas como fisiológicas.
11. Uso según la reivindicación 10
caracterizado porque el alimento pertenece al siguiente
grupo: zumos, bebidas y alimentos deshidratados.
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