ES2316806T3 - Casete de inmunoensayo automatizado, aparato y procedimiento. - Google Patents
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Abstract
Un casete de inmunoensayo (10) para el uso en la detección de un analito en una muestra de fluido corporal líquida, comprendiendo a) un conjunto de casete (12) con un pocillo de muestra (18) para recibir dicha muestra; b) llevado por dicho conjunto (12), (i) un depósito (24) conteniendo una primera composición de reactivo eficaz para reaccionar con uno o más componentes de muestra con el fin de formar una muestra modificada cuando la muestra migre del pocillo de muestra al depósito; c) un soporte (14) montado sobre dicho conjunto (12) para moverse hacia delante y atrás de una posición de transferencia; y d) llevado por dicho soporte (14) una tira de reactivo (30) conteniendo una segunda composición de reactivo eficaz para reaccionar con la muestra modificada formada en dicho depósito (24) con el fin de formar un producto detectable dependiente del analito, dicha tira (30) teniendo una zona de transferencia (32) que se pone en contacto con dicho depósito de reactivo (24) cuando el soporte (14) se mueve a su posición de transferencia de muestra, y una zona de detección (34) ubicada hacia abajo de la zona de transferencia (32); y e) dicho soporte (14) incluye una ventana (36) por la cual se puede observar una reacción detectable en la zona de reacción en la tira de reactivo (30); caracterizado porque la zona de detección de la tira de reactivo (30) está cubierta por una película reflectora (39) en la superficie de la tira orientada hacia el otro lado de dicha ventana (36) eficaz para aumentar la intensidad de reflectancia de manera que el flujo de líquido de muestra por la zona de detección produce un primer cambio de reflectancia mensurable por la ventana, y la presencia de la reacción dependiente del analito en la zona de detección produce un segundo cambio de reflectancia mensurable por la ventana.
Description
Casete de inmunoensayo automatizado, aparato y
procedimiento.
La presente invención se refiere a un casete, un
aparato y un procedimiento útiles para analizar un analito
seleccionado en una muestra de fluido corporal y particularmente
útiles para ensayos multipasos automatizados.
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Patentes WO 00/42 434, WO 98/37 416,
EP-A2-0 249 851.
Se conocen ensayos para detectar la presencia y
los niveles de una variedad de analitos en muestras de fluido
corporal. Tales ensayos a menudo están diseñados con el fin de
simplificar el uso para que se puedan llevar a cabo fiablemente en
una consulta médica o en otro entorno clínico donde el personal
puede tener poca práctica en el procedimiento de un ensayo clínico
o en la interpretación de los resultados de un ensayo. Para
minimizar la necesidad de participación de un operador, es
preferible que el ensayo se lleve a cabo de manera automatizada o
independiente.
Para simplificar el funcionamiento, tales
ensayos independientes se han limitado típicamente a procedimientos
de ensayos de un solo paso. Un número de ensayos útiles, sin
embargo, son multipasos por naturaleza, necesitando más de un paso
de reacción o de unión. Además, uno o más de los pasos pueden
limitar la velocidad o pueden ser afectados por concentraciones de
reactivos localizados. Típicamente, los ensayos multipasos se
automatizan menos fácilmente y necesitan generalmente más
aportación del usuario, aumentando así la posibilidad de
errores.
La Patente WO 00/42434 muestra un procedimiento
y una tira de ensayo con al menos dos almohadillas de prueba para
la determinación diferencial de una cantidad de, al menos, un
analito en una muestra líquida.
La Patente WO 98/37416 describe un casete de
inmunoensayo automatizado en el que dos soluciones diferentes,
principalmente el fluido de muestra y el fluido de lavado, se
transfieren secuencialmente a la misma tira de reacción y
posteriormente a una zona de detección común. Por lo tanto, el
casete cambia de una primera fase de reacción de un ensayo a una
segunda fase, como una fase de lavado de una manera independiente
automatizada, sin necesidad de añadir soluciones ni otra aportación
del usuario.
La Patente
EP-A2-0 249 851 describe un
dispositivo de prueba de zonas múltiples que puede comprender una
capa reflectora.
Es por tanto deseable proporcionar un
dispositivo de ensayo independiente automatizado que sea capaz de
llevar a cabo ensayos multipasos, en particular aquellos que
contienen pasos de reacción o de unión múltiples en el que uno o
más de los pasos limitan la velocidad o en el que se afecta el
resultado del ensayo final por concentraciones de reactivo de
analito localizadas.
En un aspecto, se divulga la invención que
incluye un casete de inmunoensayo para usarlo en la detección de un
analito en una muestra de fluido corporal líquida. El casete
proporciona un conjunto de casete que tiene un pocillo de muestra
para recibir la muestra, un soporte montado en el conjunto para el
movimiento hacia delante y atrás de una posición de transferencia,
y un depósito de reactivo y una tira de reactivo llevados por el
conjunto y el soporte respectivamente. El depósito de reactivo
contiene una primera composición de reactivo capaz de reaccionar
con uno o más componentes de muestra formando así una muestra
modificada cuando la muestra migra desde el pocillo de muestra
hasta el interior del depósito. La tira de reactivo contiene una
segunda composición de reactivo capaz de reaccionar con la muestra
modificada formando así un producto detectable dependiente del
analito. La tira de reactivo tiene una zona de transferencia que se
pone en contacto con el depósito cuando el soporte se mueve a su
posición de transferencia y una zona de detección situada hacia
abajo de la zona de transferencia. Controlando el movimiento del
soporte hacia delante y atrás de su posición de transferencia, se
pueden controlar el volumen y la velocidad del flujo de muestra
desde el depósito hasta la tira optimizando y/o estandarizando así
las condiciones de transferencia de muestra en el ensayo.
Para la detección de un analito plurivalente en
una muestra de fluido corporal líquida, la primera composición de
reactivo en el depósito de reactivo puede incluir un conjugado no
soportado de un anticuerpo antianalito y un grupo indicador
detectable donde la reacción para formar una muestra modificada
incluye la unión del conjugado con el analito de muestra para
formar un complejo de analito y conjugado. La segunda composición
de reactivo en la tira de reactivo puede incluir un anticuerpo
antianalito soportado en una región de detección de la tira de
reactivo ubicada hacia abajo de la región de transferencia de
muestra de la tira donde la reacción para formar un producto
detectable dependiente del analito incluye la unión del complejo con
el anticuerpo soportado para localizar el indicador detectable en
el complejo en la zona de detección. El conjugado no soportado en
este modo de realización puede ser un conjugado de un anticuerpo
antianalito y un indicador visible, como partículas metálicas,
partículas marcadas con restos de color o fluorescentes, polímeros
marcados con restos de color o fluorescentes, partículas, o
moléculas de color o
fluorescentes.
fluorescentes.
Para el uso en la detección de analitos de
proteínas C-reactivas en una muestra sanguínea, el
anticuerpo antianalito en el conjugado no soportado en el depósito
de reactivo y el anticuerpo antianalito soportado en la tira de
reactivo pueden ser anticuerpos específicos contra un epítopo común
en una proteína C-reactiva. Alternativamente, los
dos anticuerpos se pueden dirigir contra diferentes epítopos de
proteínas C-reactivas.
El soporte incluye una ventana a través de la
cual se puede ver la unión del complejo en la zona de detección en
la tira de reactivo. Además, la zona de detección en la tira de
reactivo está cubierta por una película reflectora en la superficie
de la tira orientada hacia el otro lado de la ventana.
El casete puede incluir además un depósito de
absorción llevado por el soporte, hacia abajo de dicha zona de
detección, para recibir líquido de muestra transferida por la tira
de reactivo.
En otro aspecto, la invención incluye un aparato
útil para detectar un analito en una muestra de fluido corporal
líquida. El aparato incluye un casete del tipo descrito
anteriormente y un instrumento para manejar el casete. El
instrumento tiene (a) una carcasa de casete en la que se puede poner
de forma desmontable el casete durante el ensayo de muestra, (b) un
actuador manejable para mover el soporte en el casete hacia delante
y atrás de su posición de transferencia de muestra, (c) un detector
manejable para detectar una reacción específica para un analito en
la zona de detección en la tira de reactivo, y (d) un procesador
manejablemente conectado con el actuador para controlar la
regulación de volumen y la velocidad de movimiento de material de
muestra desde el depósito de reactivo hasta la tira de
reactivo.
La zona de detección de la tira de reactivo en
el casete está cubierta por una película reflectora en la superficie
de la tira orientada hacia el otro lado de dicha ventana para que
el flujo de líquido de muestra que pasa por la zona de detección
produzca un primer cambio en la reflectancia mensurable a través de
la ventana, y la presencia de una reacción dependiente del analito
en la zona de detección produzca un segundo cambio en la
reflectancia mensurable a través de la ventana. El detector puede
ser manejable para detectar flujo de líquido a través de la zona de
detección por un primer cambio de la reflectancia óptica medida y es
manejable para medir una reacción subsiguiente dependiente del
analito en la zona de detección por un segundo cambio de la
reflectancia óptica medida.
La unidad de control puede ser manejable para
controlar el volumen y la velocidad de la transferencia de muestra
desde el depósito de reactivo hasta la tira de reactivo controlando
uno o más de (i) la frecuencia de ciclos con la que el actuador
mueve el soporte hacia delante y atrás de su posición de
transferencia, (ii) el tiempo de contacto que se mantiene el
soporte en su posición de transferencia durante cada ciclo, y (iii)
el número total de ciclos de transferencia. Preferiblemente, la
unidad es manejable para controlar el volumen y la velocidad de la
transferencia de muestra desde dicho depósito hasta la tira de
reactivo controlando (i) la frecuencia de ciclos con la que el
actuador mueve el soporte hacia delante y atrás de su posición de
transferencia y (ii) el tiempo de contacto que se mantiene el
soporte en su posición de transferencia durante cada ciclo.
En otro aspecto más, la invención incluye un
procedimiento para llevar a cabo un ensayo para un analito de
fluido corporal por los pasos de: (a) introducir un fluido corporal
que contenga el analito en un depósito de absorción que contenga
una primera composición de reactivo capaz de reaccionar con uno o
más componentes de muestra formando así una muestra modificada, (b)
poner en contacto repetidamente el depósito, con dicho contenido de
muestra de fluido corporal absorbida, con una almohadilla de
reactivo de absorción que contenga una segunda composición de
reactivo capaz de reaccionar con la muestra modificada formada en el
depósito para producir un producto detectable dependiente del
analito, y (c) controlar la frecuencia y la duración de dicho
contacto controlando así el volumen y la velocidad de transferencia
del fluido de muestra desde el depósito hasta la almohadilla.
En un modo de realización general, la
almohadilla de reactivo es una tira de reactivo alargada que tiene
una zona de transferencia de muestra donde el depósito entra en
contacto con la tira y una zona de detección situada hacia abajo de
la zona de transferencia.
Para detectar un analito plurivalente en una
muestra de fluido corporal líquida, como una proteína
C-reactiva en una muestra sanguínea o en una
muestra de suero, la primera composición de reactivo en el depósito
de reactivo puede incluir un conjugado no soportado de un
anticuerpo antianalito y un grupo indicador detectable, y la
composición de reactivo en la tira de reactivo puede incluir un
anticuerpo antianalito soportado en una región de detección en la
tira de reactivo.
Éstos y otros objetos y características de la
invención quedarán más plenamente aparentes cuando se lea la
siguiente descripción detallada de la invención en conjunción con
las figuras que acompañan.
Las Figuras 1A y 1B representan vistas en planta
de un casete de inmunoensayo construido de acuerdo con un modo de
realización de la invención, con el casete en una posición de carga
de muestra inicial (Figura 1A) y en una posición de transferencia
de muestra (Figura 1B);
La Figura 2 representa una vista de sección
ampliada del soporte de casete en la región de la zona de
detección;
Las Figuras 3A y 3B ilustran la distribución de
un fluido de muestra antes (Figura 3A) y después (Figura 3B) de la
transferencia de fluido de muestra en el casete.
La Figura 4 representa una vista en perspectiva
de un instrumento para manejar el casete construido de acuerdo con
un modo de realización de la invención;
La Figura 5 ilustra varios componentes
funcionales del instrumento para manejar el casete en relación con
un casete de inmunoensayo de la invención;
Las Figuras 6A y 6B ilustran perfiles de
transferencia de volumen de muestra diferentes alcanzables con la
invención;
La Figura 7 ilustra perfiles de reflectancia de
un analito de proteína C-reactiva a tres
concentraciones diferentes durante un procedimiento de ensayo de
acuerdo con un modo de realización de la invención; y
La Figura 8 representa un diagrama de
reflectancia medida como función de concentración de analito de
proteína C-reactiva creado de acuerdo con la
invención.
Por comodidad, la numeración de elementos
similares se retiene en todas las figuras para identificar
características estructurales parecidas.
Las Figuras 1A y 1B muestran un casete de
inmunoensayo 10 construido según un modo de realización de la
invención. El casete contiene dos elementos en forma de chapa, un
elemento de base o conjunto 12 y un soporte o elemento de soporte
14 que se pueden fabricar por métodos estándares moldeadores o
mecanizados. El soporte está montado en el conjunto para moverse en
una dirección vertical en las Figuras desde una posición de reposo
ilustrada en la Figura 1A hasta una posición de transferencia de
muestra mostrada en la Figura 1B. Más particularmente, el soporte
está montado para moverse hacia delante y atrás de una posición de
transferencia de muestra.
La estructura que monta el soporte en el
conjunto puede ser de bloques compresibles, como bloques
elastoméricos tal como se ilustra por 16, que sostienen los
extremos opuestos del soporte. Estos bloques se comprimen cuando se
mueve el soporte desde su posición de reposo, en la que los bloques
están sustancialmente sin compresión, hasta la posición de
transferencia de muestra, en la que los bloques están a compresión
máxima. Se notará que se puede montar el soporte en el conjunto de
casete por una variedad de estructuras compresibles, como muelles o
imanes, con el fin de obtener movimientos transversales hacia
delante y atrás de la posición de transferencia de muestra.
En el conjunto 12 se proporciona un pocillo de
muestra 18 para recibir la muestra de fluido corporal a analizar.
El pocillo está diseñado para recibir una muestra de fluido
corporal, como una muestra de suero o de sangre, que tiene
típicamente un volumen entre unos 20 y unos 60 \mul. El pocillo de
muestra transfiere muestra a una almohadilla central 20. La
almohadilla central, a su vez, se comunica por una mecha de
capilares 22, a la que también nos referiremos aquí por capa de
extensión, con una almohadilla de reactivo o un depósito 24 que
contiene un primer reactivo o composición de reactivo que queda por
describir. Cuando se pone líquido de muestra en el pocillo 18,
migra por capilaridad por la almohadilla central y desde la
almohadilla central por la capa de extensión al depósito 24. Cuando
la muestra que se está analizando es una muestra sanguínea, uno o
más de los elementos en el camino del flujo entre el pocillo de
muestra y el depósito, y típicamente la almohadilla central y/o la
capa de extensión, pueden servir para quitar o retardar el flujo de
los glóbulos rojos, con lo que el material de muestra que llega al
depósito se ha deliberado de células sanguíneas u otros componentes
corpusculares. El material de fibra de vidrio y otro material de
matriz apropiados para este propósito son bien conocidos.
Alternativamente, o adicionalmente, uno o más de
los elementos en el camino del flujo pueden ser eficaces para
quitar componentes de muestra no deseados mediante el uso de
reactivos de unión soportados, por ejemplo anticuerpos, específicos
contra los componentes no deseados. Los componentes de muestra no
deseados se pueden quitar también exponiendo la muestra en el
camino del flujo a un agente precipitante eficaz para precipitar de
manera selectiva los componentes de muestra no deseados. Por
ejemplo, se puede usar sulfato de dextrano para precipitar
selectivamente determinadas lipoproteínas en una muestra sanguínea.
O bien se bloquea la migración de las partículas precipitadas a
través del camino del flujo, o bien se retarda su flujo. La
almohadilla central, la tira de transferencia de muestra y el
depósito están formados preferiblemente por un material fibroso y
altamente absorbente capaz de sacar fluido vía flujo capilar. Una
variedad de materiales fibrosos, tal como se usan habitualmente
para esteras filtrantes fibrosas, incluyendo celulosa, acetato de
celulosa y matrices de fibra de vidrio, son materiales apropiados
para la tira de transferencia. Las fibras pueden ser reticuladas,
si se desea, por reticulación química, fusión térmica o similares.
Los sustratos porosos también son apropiados, como el vidrio
aglomerado, las perlas fusionadas de polímero y similares, cuyas
mojabilidad y dimensiones de intersticios son tales que promueven
el movimiento de un medio acuoso en la tira humedeciendo la
superficie. Un material a título de ejemplo es un filtro de fibra
de vidrio que tiene una densidad de relleno de
0,2-0,5 gm/cm^{3} aproximadamente. El vidrio central, la capa de extensión y el depósito pueden ser montados en el conjunto directamente en el conjunto o por un respaldo hecho de plástico u otro material inerte de soporte.
0,2-0,5 gm/cm^{3} aproximadamente. El vidrio central, la capa de extensión y el depósito pueden ser montados en el conjunto directamente en el conjunto o por un respaldo hecho de plástico u otro material inerte de soporte.
Aunque el modo de realización del casete
mostrado está diseñado para un ensayo único por el lado derecho del
casete en las figuras, hay que notar que el casete se puede adaptar
para ensayo(s) adicional(es) por el lado izquierdo
del casete. Además, el ensayo adicional puede tener el mismo formato
de flujo de fluido o puede tener un formato diferente, por ejemplo,
la almohadilla central puede estar comunicada con una tira de
reactivo alargada que se extiende a lo largo de la región de borde
izquierdo superior del conjunto de casete.
Para completar la descripción del conjunto de
casete, un par de bloques elastoméricos 26 a ambos lados de la
almohadilla central sirven para proteger y limitar el movimiento del
soporte cuando se mueve hacia su posición de transferencia de
muestra.
El soporte 14 tiene un par de barras de reacción
alargadas, como la barra 28, que extienden hacia el exterior desde
el centro del soporte como se ilustra en las Figuras 1A y 1B. Una
tira de reactivo alargada 30 está fijada a, y se extiende por, la
superficie inferior orientada hacia adentro del soporte como se
ilustra. La tira tiene una zona de transferencia de muestra hacia
arriba 32 y una zona de detección hacia abajo 34 ubicada
directamente debajo de una ventana 36 formada en la barra de
soporte. Como se ilustra en la Figura 1B, el movimiento del soporte
a su posición de transferencia de muestra, con la compresión de los
bloques 16, deja la zona de transferencia de muestra entrar en
contacto con el depósito de reactivo en el conjunto de casete
promoviendo un flujo capilar de fluido del depósito a la tira de
reactivo.
La tira de reactivo está formada de un material
poroso o fibroso que promueve un flujo capilar a través suyo. Los
materiales preferidos incluyen membranas porosas, de polímeros
fusionados o de polímero microporoso, como las membranas
microporosas de polisulfona, polipropileno, nylon, nitrocelulosa,
Teflón^{TM} o cloruro de polivinilo. En el presente caso, se
prefiere particularmente la nitrocelulosa tal como está disponible
de Sartorius, teniendo dimensiones de longitud, anchura y grosor de
entre 5-20 mm, 1-5 mm y
0,1-0,5 mm, respectivamente.
El extremo hacia abajo de la tira 30 está en
contacto con una almohadilla absorbente 38 que funciona como un
depósito para sacar líquido de muestra suministrado a la tira en la
zona de transferencia de muestra y fluye en una dirección hacia
abajo (a la derecha en las figuras) hacia el interior y a través de
la zona de detección. La almohadilla está hecha de un material
absorbente apropiado, tal como vidrio fibroso o celulosa. El
volumen de absorción de la almohadilla es, preferentemente, por lo
menos la mitad del volumen de la muestra añadida, por ejemplo, 10 a
30 \mul.
En el camino de fluido definido por la tira de
reactivo están dispuestos reactivos, que se describirán
posteriormente, eficaces para producir un producto de reacción
detectable dependiente del analito, que se detecta en la zona de
detección. Por lo tanto, se pueden llevar a cabo varios ensayos
usando el casete como se describirá posteriormente.
La superficie orientada al exterior de la tira
de reactivo hacia abajo de la zona de transferencia de muestra,
está cubierta por una película reflectora impermeable 39, como una
película Mylar. En particular, la película se extiende por la zona
de detección en la tira de reactivo que está interpuesta entre la
ventana de soporte y la película reflectora. El objetivo de la tira
de reactivo es la mejora de la reflectividad de la tira de
reactivo, tal como se ve por la ventana de soporte y, en particular,
la mejora del cambio de reflectividad que se observa cuando se
humedece la tira de reactivo y, en respuesta a una reacción analito
especifico que tiene lugar en la zona de detección, tal como se
comentará más adelante.
La construcción de las varias capas en el
soporte se ilustra en la vista despiezada de la Figura 2. Aquí se
ven la barra de soporte 28 con la ventana 36 ubicada en su interior,
y la tira de reactivo 30 con la zona de transferencia de muestra 32
hacia arriba y la zona de detección 34. La tira está atada a la
barra de soporte con una tira adhesiva bilateral 44 que está
inicialmente recubierta con un respaldo desmontable 45. Como se ve,
la tira adhesiva está separada por un espacio que corresponde a la
ventana de soporte y la zona de detección. La almohadilla
absorbente 38 está posicionada de manera que se traslapa con el
extremo hacia abajo de la tira de reactivo 30, y la película
reflectora está posicionada de manera que se extiende desde un punto
justo hacia abajo de la región de transferencia de muestra en la
tira 30 hasta un punto más allá de la almohadilla absorbente. En
construcción, los anteriores componentes están situados como se
ilustra, y atados a la barra de soporte y entre sí quitando el
respaldo adhesivo 44 y apretando firmemente la cara adhesiva del
montaje contra la barra de soporte.
El casete está diseñado particularmente para un
ensayo de analito en el que (i) componentes de muestra que
típicamente incluyen el analito mismo, reaccionan con uno o más
reactivos en el depósito con el fin de formar una muestra
modificada, y (ii) la muestra modificada, típicamente analito
modificado, reacciona con una segunda composición de reactivo para
producir un producto detectable dependiente del analito. Es decir,
tanto el depósito de reactivo como la tira de reactivo en este modo
de realización preferido contienen uno o más reactivos para llevar
a cabo estas reacciones. El o los reactivos del depósito y de la
tira también se mencionan aquí como una primera y segunda
composiciones de reactivo, respectivamente, y pueden incluir uno o
más enzimas, anticuerpos, anticuerpos marcados o sustratos de
enzima, reactivos de unión y/o agentes precipitantes tal como se
comentará más adelante.
En un casete a título de ejemplo, para la
detección de un analito antígeno plurivalente, la composición de
reactivo en el depósito incluye un anticuerpo de analito específico
no soportado marcado, por ejemplo, covalentemente con un indicador
detectable, por ejemplo, partículas metálicas, moléculas
fluorescentes o de color, polímeros ramificados conteniendo restos
acoplados fluorescentes o de color y partículas recubiertas, por
ejemplo, partículas de látex con un recubrimiento fluorescente.
"No soportado" significa que el reactivo está libremente móvil
dentro del depósito. Por tanto, cuando se añade el analito al
depósito, reacciona específicamente con el reactivo de anticuerpo
para formar un complejo marcado móvil de analito y anticuerpo. En
otros modos de realización, las composiciones de reactivo pueden
ser soportadas o no soportadas, dependiendo de si el reactivo tiene
que migrar junto con el analito y/o si se esperaría que el reactivo
interfiriera con la determinación de analito final.
Se conocen en el ramo métodos para marcar un
reactivo de unión, tal como anticuerpos marcados, incluyendo el uso
de marcaciones radioactivas, marcaciones fluorescentes o enzimas
unidos que convierten un sustrato separado en una especie
detectable. Una variedad de anticuerpos marcados con
identificadores, tal como anticuerpos marcados con enzimas, están
disponibles en el mercado o se pueden preparar fácilmente según
métodos conocidos (véase, por ejemplo, Harlow, pp.
319-358). Para el uso del presente casete de
inmunoensayo, se prefieren métodos de marcación detectables
ópticamente. Con este propósito se usan mucho enzimas que reaccionan
con un sustrato para producir un producto de reacción visible. Un
reactivo marcado particularmente preferido es un anticuerpo de
analito específico conjugado a una partícula visible, tal como una
perla de látex de color o de oro coloidal. Tales conjugados se
describen en la Patente US nº 4.313.734 (Leuvering) y se pueden
obtener también de fabricantes tales como BB International
(Cardiff, UK) y NanoProbes (Stony Brook, NY).
La composición de reactivo en la tira de
reactivo, que puede incluir uno o más reactivos, puede ser repartida
por toda la tira o puede ser localizada en la tira, por ejemplo, en
la zona de transferencia de muestra justo hacia abajo de la zona de
transferencia, o en la zona de detección de forma soportada o no
soportada. En el modo de realización descrito anteriormente, para
detectar un analito plurivalente la segunda composición de reactivo
incluye un anticuerpo antianalito soportado en la zona de detección.
En este formato, el complejo de analito y anticuerpo marcado
transferido desde el depósito hasta la tira de reactivo migra en una
dirección hacia abajo por la tira, donde es atrapado en la zona de
detección. La etapa de formación de un producto de reacción
detectable incluye atrapar un complejo detectable en la zona de
detección.
En otros modos de realización, la segunda
composición de reactivo puede incluir enzimas soportados o no
soportados, sustratos, reactivos de unión marcados, agentes
fotosensibilizadores, agentes reductores u oxidantes y/o grupos de
ácido o de base que pueden donar proteínas e iones hidroxilos como
parte de una reacción de detección de analito, según procedimientos
de reacción conocidos de dos pasos donde, en la presente invención,
una de las etapas debe llevarse a cabo en el depósito de reactivo y
la segunda en la tira de reactivo.
Más específicamente, la zona de detección puede
contener reactivos eficaces para producir un producto de reacción
detectable con un complejo de analito y anticuerpo no marcado. Por
ejemplo, la zona de detección puede contener una oxidasa, una
peroxidasa y un compuesto que se puede oxidar a una especie
detectable tal como un colorante. Cuando el complejo de analito y
anticuerpo incluye un sustrato para la oxidasa, el H_{2}O_{2}
generado en la reacción resultante reacciona con el compuesto
oxidable, catalizado por la peroxidasa, para generar el colorante
detectable. Tales ensayos están descritos, por ejemplo, en Hewett
et al.
Los reactivos pueden ser incorporados en el
depósito y en la tira empapando el material de depósito o de tira
en una solución de los reactivos, secando o añadir después una
solución del material de reactivo a toda o a una zona localizada de
la tira, secando posteriormente. Donde el reactivo está soportado,
la región de depósito o de tira puede proporcionar por naturaleza,
o estar modificada químicamente según métodos conocidos para tener
grupos de superficie reactivos, como grupos amino, carboxilo,
sulfhídrico o aldehído que permiten un acoplamiento covalente
usando agentes activadores o agentes de acoplamiento
bifuncionales.
En un modo de realización particular, el casete
está diseñado para la detección de proteína
C-reactiva, típicamente medida en una muestra
sanguínea o de suero. En este modo de realización, la composición de
reactivo en el depósito es un anticuerpo monoclonal no soportado
específico contra un epítopo de proteína C-reactiva,
es decir, un epítopo de una de las 5 subunidades idénticas en
proteína C-reactiva. Un anticuerpo de proteína anti
C-reactivo a título de ejemplo es un anticuerpo
monoclonal producido por la línea celular identificada por el
número CC002, y disponible por Scripps Laboratories (San Diego, CA).
El anticuerpo está marcado por conjugación a micropartículas de
oro, según métodos estándares, por ejemplo, como se describe en
Chandler, et al., "The place of gold in rapid tests",
IVD Technology, 6(2)37-49 (2000). El
segundo reactivo es un anticuerpo específico contra la proteína
C-reactiva y está soportado en la zona de detección.
Un anticuerpo a título de ejemplo es el mismo que el que se usa en
el primer reactivo de anticuerpo (de depósito). Detalles del ensayo
se encuentran en el Ejemplo 1.
Las Figuras 3A y 3B ilustran el flujo de líquido
de muestra hasta el interior y a través de los elementos de flujo
de fluido del casete durante el funcionamiento del casete. Como se
ilustra en la Figura 3A, la muestra líquida aplicada al pocillo de
muestra 18 se saca por capilaridad hasta la almohadilla central 20,
y desde aquí por la capa de extensión al depósito 24. Aquí, la
muestra puede ser detenida durante un tiempo de incubación deseado,
en presencia del primer reactivo. Tiempos de incubación típicos
pueden variar de unos pocos segundos hasta diez minutos o más.
Cuando el soporte en el casete se mueve a su
posición de transferencia de muestra, ilustrado en la Figura 3B, el
líquido de muestra fluye por capilaridad hasta el interior de la
zona de transferencia de la tira cuando esta última entra en
contacto con el depósito. Desde la zona de transferencia, el líquido
de muestra migra en una dirección hacia abajo hasta el interior y a
través de la zona de detección y finalmente hasta el interior de la
almohadilla absorbente 38. Controlar la demora entre la adición de
material de muestra en el pocillo de muestra del casete y el
movimiento inicial del soporte hacia su posición de transferencia de
muestra, el casete se puede manejar para controlar el periodo de
incubación de muestra antes que la muestra se transfiera
primeramente desde el depósito hasta la tira de reactivo.
Adicionalmente, la velocidad de la transferencia
de líquido y el volumen de muestra total transferido se pueden
controlar controlando (i) la frecuencia de ciclo con la cual el
actuador mueve el soporte hacia delante y atrás de su posición de
transferencia, (ii) el tiempo de contacto que se mantiene el soporte
en su posición de transferencia durante cada ciclo, y (iii) el
número total de ciclos de transferencia. Tal como se va a comentar
en la siguiente sección, este control está proporcionado
convenientemente por un instrumento para manejar el casete en un
aparato de ensayo construido de acuerdo con otro aspecto de la
invención.
La Figura 4 representa una vista en perspectiva
de un instrumento para manejar el casete 48 construido de acuerdo
con la invención, y la Figura 5 muestra elementos funcionales clave
del instrumento en forma esquemática. El instrumento incluye una
carcasa de casete, constituida por brazos 50, adaptada para recibir
y mantener el casete en una condición operativa cuando un líquido
de muestra se ha añadido al casete. En particular, los brazos 50
están al bies para encajar con muescas guía, como las muescas 52, en
el conjunto de casete para sujetar el casete con la carcasa en una
posición deseada.
El instrumento incluye además un actuador 53 que
tiene pistones o empujadores activados por solenoide indicados con
54, manejables para encajar con el soporte del casete y mover el
soporte de su estado de reposo a su posición de transferencia de
muestra cuando una unidad de control 55 actúa en el instrumento. En
particular, la unidad de control se puede programar o ajustar por
el usuario para controlar uno o más de los siguientes actuadores
variables:
- (i)
- el periodo entre la adición de muestra en el casete la transferencia de muestra a la tira. Este tiempo corresponde aproximadamente al periodo de incubación de la exposición del líquido de muestra a, y reacción con, la primera composición de reactivo, y puede variar desde unos segundos hasta 10 minutos o más, dependiendo de la naturaleza de la primera reacción de muestra.
- (ii)
- la frecuencia de ciclo con la cual el actuador mueve el soporte hacia delante y atrás de su posición de transferencia. La frecuencia se puede variar entre uno por ensayo a unos pocos por minuto a uno por segundo.
- (iii)
- el tiempo de contacto que se mantiene el soporte en su posición de transferencia durante cada ciclo. Junto con la frecuencia, esta variable define la velocidad total a la que el líquido de muestra se transfiere a la tira de reactivo. Esta velocidad se puede optimizar para tipos diferentes de químicas de ensayo. Por ejemplo, puede ser deseable regular el flujo de material del pocillo de muestra por el depósito de reactivo para asegurar un tiempo de reacción suficiente en el depósito de reactivo, o medir la velocidad de flujo por la tira de reactivo para asegurar un tiempo de reacción adecuado en la tira.
- (iv)
- el número total de ciclos de transferencia que junto con el tiempo de contacto en cada ciclo determinará el volumen total transferido del conjunto de casete a la tira. Controlando el volumen total transferido, se puede determinar una medida más cuantitativa de la concentración de analito expresado en cantidad de analito/volumen de muestra. En particular, el volumen que pasa por la zona de detección será la cantidad total transferida menos una cantidad predeterminada que se retiene en la parte de la tira hacia arriba de la zona de detección.
Hay que notar que la unidad de control se puede
preprogramar para controlar la transferencia de líquido en el
ensayo de una manera optimizada para cualquier tipo elegido de
química de ensayo. Varios perfiles de transferencia de líquido que
se pueden obtener con la presente invención se considerarán
posteriormente.
También como se ilustra en la Figura 5, el
instrumento para manejar el casete incluye un fotodetector 56
manejable para detectar cambios en la reflectancia de la zona de
detección observable por la ventana 36. En este caso, el
fotodetector puede ser un dispositivo sencillo para medir la
intensidad de luz de la reflectancia en la ventana cuando la
ventana de detección se ilumina con una fuente de luz, por ejemplo,
un LED que también forma parte del detector. En otros modos de
realización, el detector puede incluir un detector de luz emitida y
rayo de excitación fluorescente de longitud de onda seleccionada, o
una fuente de luz visible de longitud de onda seleccionada y
fotodetector para medir la absorción de luz en la superficie de
detección.
Particularmente donde el detector de luz está
diseñado para medir la reflectancia de la superficie de la tira de
reactivo en la zona de detección, la película reflectora es eficaz
para aumentar, es decir, amplificar la intensidad de reflectancia y
mejorar así la resolución y la exactitud. Como se verá en la
siguiente sección, la reflectancia aumentada también permite a la
zona de detección servir como un "control" para monitorizar el
flujo de fluido por la tira de reactivo.
Como se ha mencionado anteriormente, una
característica es la capacidad de controlar la velocidad y el
volumen del flujo de fluido de un área de reacción a otra, y así la
cinética de las reacciones y el volumen total del ensayo. Esta
característica es importante cuando una o más reacciones de ensayo
son de paso limitante o cuando se quiere ensayar un punto final
cinético. La característica también es importante para controlar la
cantidad total de líquido de muestra que fluye hasta el interior de
y a través de la zona de detección, para cuantificar la
concentración de analito en la zona.
Las Figuras 6A y 6B muestran dos curvas de
transferencia de muestra que ilustran las diferentes características
de transferencia de muestra que se pueden obtener en la invención.
En el primer caso, ilustrado en la Figura 6A, la muestra se añade
al casete en tiempo t_{0}, y se la permite incubar en el depósito
de reactivo hasta un tiempo t_{1}, cuando la barra de soporte en
el casete se pone en contacto con el depósito. Si la barra de
soporte se mantiene en contacto con el depósito por un periodo de
tiempo prolongado, la transferencia de muestra a la tira, expresada
como volumen de muestra en función del tiempo, aumenta de forma
lineal hasta un tiempo t_{f} cuando tanto la tira como la
almohadilla se encuentran completamente saturadas (ignorando los
efectos de evaporación de muestra).
En la Figura 6B, el tiempo de incubación de
muestra, de t_{0} a t_{1}, es el mismo que en la Figura 6A pero
la transferencia de muestra está afectada por tres eventos de
transferencia diferenciados, intercalados por intervalos en los que
el soporte se va del contacto con el depósito y la acumulación de
volumen durante todo el tiempo es plana. Como se puede ver, el
último enfoque permite una velocidad de transferencia de volumen
más controlada y típicamente más lenta que cuando la transferencia
de muestra se realiza como un evento ininterrumpido.
La Figura 7 muestra una curva de reflectancia a
título de ejemplo de un ensayo en el que un analito de proteína
C-reactiva reacciona primero con un anticuerpo
antianalito marcado en el depósito de casete para formar un
complejo de anticuerpo y analito detectable, y luego se transfiere
el complejo a la tira de reactivo donde es atrapado por un
anticuerpo antianalito soportado en la zona de detección. La
reflectancia inicial durante los primeros pocos segundos después de
la transferencia de muestra al soporte, corresponde a una
reflectancia de tira seca. El descenso abrupto de reflectancia
tiene lugar cuando el borde frontal de la muestra transferida pasa
por la zona de detección. El descenso de reflectancia se debe tanto
al humedecimiento de la tira en la zona de detección como a la
presencia de anticuerpos marcados con oro coloidal, tanto en
complejos como en forma no complejada.
Con un flujo continuo de material de muestra por
la zona de detección, el nivel de reflectancia empieza de cambiar
con el tiempo, dependiendo de la concentración relativa de conjugado
de anticuerpo complejado y no complejado, es decir, dependiendo de
la concentración de analito de muestra. A una concentración de
analito más baja, donde hay relativamente más conjugado en forma no
complejada y se atrapa relativamente menos conjugado en la zona de
detección, la reflectancia empieza a aumentar con el tiempo cuando
más y más del conjugado se lleva fuera de la zona de detección por
la transferencia de muestra a través de la zona. Esto se ve en la
gráfica de "diamante" de la Figura 7. En cambio, a
concentraciones de analito más altas, se atrapa progresivamente más
conjugado en la zona de detección con flujo de muestra a través de
la zona actuando para bajar la reflectancia con el tiempo tal como
se indica en la gráfica de "triángulo" de la misma figura.
La concentración de analito se mide comparando
la reflectancia medida en un punto final elegido, por ejemplo 4
minutos, con mediciones de reflectancia estándares de
concentraciones de analito conocidas. La reflectancia medida se
puede expresar, por ejemplo, como una proporción entre el porcentaje
de reflectancia final y el porcentaje de reflectancia inicial. Como
se ve en la gráfica mostrada en la Figura 8, una gráfica de esta
relación muestra una curva dependiente del analito por una
concentración de proteína C-reactiva de 0 a 8
\mug/ml.
De los precedentes se puede notar cómo se
obtienen varios objetos y características de la presente invención.
El casete proporciona un formato de ensayo de tira seca en el cual
se pueden llevar a cabo reacciones consecutivas dependientes del
analito de manera controlada controlando la transferencia de
velocidad y volumen de una región de reacción a otra. Además, el
casete está diseñado para permitir volúmenes de muestra controlados
y medidos a través de la zona de detección, para una determinación
más cuantitativa de la concentración de analito. El formato de
casete sirve para ensayos múltiples en el mismo casete y alimentados
de la misma muestra. Finalmente, la tira reflectora en la barra de
soporte actúa para aumentar los cambios de reflectancia, aumentando
la fiabilidad y la resolución de un ensayo.
Preferiblemente, el casete de la invención se
suministra de soluciones y reactivos precargados y por lo tanto es
completamente independiente, no necesitando la carga de soluciones
por un operador. El lector que contiene el casete puede ser
programado para ajustar el casete a sus posiciones de funcionamiento
diferentes en tiempos designados. Un ensayo de pasos múltiples se
puede por tanto llevar a cabo con el casete contenido dentro de un
lector de casete, no necesitando aportación de un operador
exterior.
Ejemplo
1
En una aplicación específica del presente
dispositivo, se analizó una muestra sanguínea por niveles de
proteína C-reactiva. Se ha demostrado que niveles
alterados de este compuesto son diagnóstico de trastornos
caracterizados por factores de riesgo para el derrame cerebral y la
isquemia vascular cerebral, y el derrame y la cardiopatía
isquémicos (véase, por ejemplo, De Maat, Grau, Kuller, Liuzzo,
Mendall, Thompson y Tracy).
El casete para el ensayo se preparó como sigue:
La almohadilla central era una almohadilla de fibra de vidrio capaz
de absorber aproximadamente 20 \mul de líquido. La capa de
extensión también era de fibra de vidrio. El depósito era de un
material de plástico poroso con un volumen de absorción total de
aproximadamente 6 \mul. El depósito se empapó inicialmente con 6
\mul de una solución de 20 D.O. de conjugado de anticuerpo formado
por oro coloidal conjugado con anticuerpo específico contra
proteína C-reactiva obtenido de BBInternational
(Cardiff, UK). Luego, el depósito se secó.
La tira de reactivo en el casete era una tira de
nitrocelulosa de 11 mm por 3 mm, obtenida de Sartorius (Goettingen,
GmbH), con un espesor de menos que 10 mils (0,25 mm). El anticuerpo
contra la proteína C-reactiva se acopló a la región
de detección mediante interacción hidrofóbica con la nitrocelulosa.
La región de detección se ubicó aproximadamente a 6 mm de la región
de transferencia de muestra. La almohadilla de absorción del extremo
hacia abajo de la tira era de un material de fibra de celulosa con
un volumen de absorción total de aproximadamente 25 \mul.
En el método de ensayo, se aplicó una muestra
sanguínea humana de 50 \mul al pocillo de muestra en el casete.
Después de un periodo de incubación de 3 minutos, se movió el
soporte a su posición de transferencia de muestra durante 4
minutos. Durante el flujo de líquido de muestra a la tira, se
monitorizó la reflectancia en la ventana de la barra de soporte. A
los 4 minutos aproximadamente, se alcanzó un punto final estable
(Figura 8). Se determinó la proporción de señal entre reflectancia
de punto final y reflectancia inicial y se la usó para calcular la
concentración de analito de una curva estándar generada por muestras
con cantidades conocidas de proteína
C-reactiva.
Ejemplo
2
Se prepara un casete sustancialmente igual que
se describe en el Ejemplo 1. El casete se pone de forma desmontable
en una carcasa de casete durante el ensayo de muestra. El casete se
mueve hacia delante y atrás de su posición de transferencia de
muestra por un actuador con el fin de llevar a cabo la incubación de
los reactivos. La reacción de analito específico en la zona de
detección de la tira de reactivo se detecta con un detector. El
volumen y la velocidad de transferencia de muestra desde dicho
depósito de reactivo hasta la tira de reactivo durante el
procedimiento de ensayo se controlan por una unidad de control que
está conectada con el actuador.
Ejemplo
3
Se introduce un fluido corporal que se sospecha
contiene el analito de interés en un depósito de absorción que
contiene una composición de reactivo eficaz para reaccionar con uno
o más componentes de muestra para formar una muestra modificada. El
depósito de absorción que contiene la muestra de fluido corporal
absorbida se pone en contacto repetidamente con una tira de
reactivo que contiene una segunda composición de reactivo eficaz
para reaccionar con la muestra modificada formada en el depósito con
el fin de producir un producto detectable dependiente del analito.
La frecuencia y la duración de los contactos repetidos se controlan
para controlar el volumen y la velocidad de transferencia de fluido
de muestra desde el depósito hasta la tira de reactivo. El producto
dependiente del analito se detecta por cualquier medio conocido.
Claims (18)
1. Un casete de inmunoensayo (10) para el uso en
la detección de un analito en una muestra de fluido corporal
líquida, comprendiendo
- a)
- un conjunto de casete (12) con un pocillo de muestra (18) para recibir dicha muestra;
- b)
- llevado por dicho conjunto (12), (i) un depósito (24) conteniendo una primera composición de reactivo eficaz para reaccionar con uno o más componentes de muestra con el fin de formar una muestra modificada cuando la muestra migre del pocillo de muestra al depósito;
- c)
- un soporte (14) montado sobre dicho conjunto (12) para moverse hacia delante y atrás de una posición de transferencia; y
- d)
- llevado por dicho soporte (14) una tira de reactivo (30) conteniendo una segunda composición de reactivo eficaz para reaccionar con la muestra modificada formada en dicho depósito (24) con el fin de formar un producto detectable dependiente del analito, dicha tira (30) teniendo una zona de transferencia (32) que se pone en contacto con dicho depósito de reactivo (24) cuando el soporte (14) se mueve a su posición de transferencia de muestra, y una zona de detección (34) ubicada hacia abajo de la zona de transferencia (32); y
- e)
- dicho soporte (14) incluye una ventana (36) por la cual se puede observar una reacción detectable en la zona de reacción en la tira de reactivo (30);
caracterizado porque la zona de detección
de la tira de reactivo (30) está cubierta por una película
reflectora (39) en la superficie de la tira orientada hacia el otro
lado de dicha ventana (36) eficaz para aumentar la intensidad de
reflectancia de manera que el flujo de líquido de muestra por la
zona de detección produce un primer cambio de reflectancia
mensurable por la ventana, y la presencia de la reacción dependiente
del analito en la zona de detección produce un segundo cambio de
reflectancia mensurable por la ventana.
2. El casete de la reivindicación 1 para
detectar un analito plurivalente en una muestra de fluido corporal
líquida, en el que la primera composición de reactivo en el
depósito de reactivo (24) incluye un conjugado no soportado de un
anticuerpo antianalito y un grupo indicador detectable, la reacción
para formar una muestra modificada incluye la unión del conjugado
con el analito de muestra con el fin de formar un complejo de
analito y conjugado, la composición de reactivo en la tira de
reactivo (30) incluye un anticuerpo antianalito soportado en una
región de detección (34) en la tira de reactivo, y la reacción para
formar un producto detectable dependiente del analito incluye la
unión del complejo con el anticuerpo soportado con el fin de
localizar el indicador detectable en el complejo en la zona de
detección.
3. El casete de la reivindicación 2, en el que
dicho conjugado no soportado es un conjugado de un anticuerpo
antianalito y un indicador detectable seleccionado del grupo que
consta de partículas metálicas, partículas marcadas con restos de
color o fluorescentes, polímeros marcados con restos de color o
fluorescentes, partículas y moléculas de color o fluorescentes.
4. El casete de la reivindicación 3 para el uso
en la detección de analito de proteína C-reactiva en
una muestra sanguínea, en el que el anticuerpo antianalito en el
conjugado no soportado en el depósito de reactivo y el anticuerpo
antianalito soportado en la tira de reactivo (30) son anticuerpos
específicos contra un epítopo común en la proteína
C-reactiva.
5. El casete de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que incluye además un depósito de
absorción (38) llevado por dicho soporte (14) hacia abajo de dicha
zona de detección y en comunicación de flujo de fluido con dicha
tira (30) para recibir líquido de muestra transferido encima de la
tira de reactivo.
6. Un aparato para el uso en la detección de un
analito en una muestra de fluido corporal líquida, comprendiendo
- A)
- un casete (10) de acuerdo con la reivindicación 1 y
- B)
- un instrumento para manejar el casete (48) teniendo
- a)
- una carcasa de casete (50) en lo cual se coloca el casete de manera desmontable durante un ensayo de muestra,
- b)
- un actuador (53) manejable para mover el soporte (14) en el casete hacia delante y atrás de su posición de transferencia de muestra,
- c)
- un detector (56) manejable para detectar una reacción específica de analito en la zona de detección en la tira de reactivo (30), y
- d)
- una unidad de control (55) manejablemente conectada con el actuador para controlar el volumen y la velocidad de la transferencia de muestra de dicho depósito de reactivo a la tira de reactivo durante un procedimiento de ensayo.
7. El aparato de la reivindicación 6 para
detectar un analito plurivalente en una muestra de fluido corporal
líquida, en el que la primera composición de reactivo en el depósito
de reactivo incluye un conjugado no soportado de un anticuerpo
antianalito y un grupo indicador detectable, la reacción para formar
una muestra modificada incluye la unión del conjugado con el
analito de muestra con el fin de formar un complejo de conjugado y
analito, la composición de reactivo en la tira de reactivo incluye
un anticuerpo antianalito soportado en una región de detección en
la tira de reactivo, y la reacción para formar un producto
detectable dependiente del analito incluye la unión del complejo
con el anticuerpo soportado con el fin de localizar el indicador
detectable en el complejo en la zona de detección.
8. El aparato de la reivindicación 7, en el que
dicho conjugado no soportado es un conjugado de un anticuerpo
antianalito y un indicador detectable seleccionado del grupo que
consta de partículas metálicas, partículas marcadas con restos de
color o fluorescentes, polímeros marcados con restos de color o
fluorescentes, partículas y moléculas de color o fluorescentes.
9. El aparato de la reivindicación 8 para el uso
en la detección de analito de proteína C-reactiva en
una muestra sanguínea, en el que el anticuerpo antianalito en el
conjugado no soportado en el depósito de reactivo (24) y el
anticuerpo antianalito soportado en la tira de reactivo son
anticuerpos específicos contra un epítopo común en la proteína
C-reactiva.
10. El aparato de la reivindicación 6, en el que
dicho detector (56) es manejable para detectar flujo líquido a
través de la zona de detección por un primer cambio de reflectancia
óptica mensurada y es manejable para medir una reacción
subsiguiente dependiente de analito en la zona de detección por un
segundo cambio de reflectancia óptica mensurada.
11. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que dicha unidad de control (55) es
manejable para controlar el volumen y la velocidad de transferencia
de muestra desde el depósito de reactivo (24) hasta la tira de
reactivo (30) controlando una o más de las (i) frecuencias de ciclo
con las cuales el actuador mueve el soporte hacia delante y atrás
de su posición de transferencia, (ii) el tiempo de contacto que se
mantiene el soporte en su posición de transferencia durante cada
ciclo y (iii) el número total de ciclos de transferencia.
12. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, en el que dicha unidad de control (55) es
manejable para controlar el periodo de incubación de muestra antes
que la muestra se transfiera primeramente del depósito a la tira de
reactivo.
13. El aparato de la reivindicación 11 o 12, en
el que la unidad de control (55) es manejable para controlar la
velocidad de transferencia de muestra desde dicho depósito hasta la
tira de reactivo controlando (i) la frecuencia de ciclo con la cual
el actuador mueve el soporte hacia delante y atrás de su posición de
transferencia y (ii) el tiempo de contacto que se mantiene el
soporte en su posición de transferencia durante cada ciclo.
14. Un método para llevar a cabo un ensayo para
un analito de fluido corporal comprendiendo
- proporcionar un casete de inmunoensayo (10) de acuerdo con la reivindicación 1;
- introducir un fluido corporal conteniendo el analito en un depósito de absorción (24) del casete (10) conteniendo una primera composición de reactivo eficaz para reaccionar con uno o más componentes de muestra con el fin de formar una muestra modificada;
- poner en contacto repetidamente el depósito (24), conteniendo una muestra de fluido corporal absorbida, con una tira de reactivo (30) conteniendo una segunda composición de reactivo eficaz para reaccionar con la muestra modificada formada en dicho depósito (24) con el fin de producir un producto detectable dependiente del analito; y
- controlar la frecuencia y la duración de dicho contacto repetido controlando así el volumen y la velocidad de transferencia de fluido de muestra desde el depósito (24) a la tira de reactivo (30).
15. El método de la reivindicación 14, en el que
dicha tira de reactivo (30) es una tira de reactivo alargada (30)
teniendo una zona de transferencia de muestra (32) en la que el
depósito (24) hace contacto con la tira (30), y una zona de
detección (34) ubicada hacia abajo de la zona de transferencia
(32).
16. El método de la reivindicación 15 para
detectar un analito plurivalente en una muestra de fluido corporal
líquida, en el que la primera composición de reactivo en el depósito
de reactivo incluye un conjugado no soportado de un anticuerpo
antianalito y un grupo indicador detectable, la reacción para formar
una muestra modificada incluye la unión del conjugado con el
analito de muestra con el fin de formar un complejo de conjugado y
analito, la composición de reactivo en la tira de reactivo incluye
un anticuerpo antianalito soportado en una región de detección en
la tira de reactivo, y la reacción para formar un producto
detectable dependiente del analito incluye la unión del complejo
con el anticuerpo soportado con el fin de localizar el indicador
detectable en el complejo en la zona de detección.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
dicho conjugado no soportado es un conjugado de un anticuerpo
antianalito y un indicador detectable seleccionado del grupo que
consta de partículas metálicas, partículas marcadas con restos de
color o fluorescentes, polímeros marcados con restos de color o
fluorescentes, partículas y moléculas de color o fluorescentes.
18. El método de la reivindicación 17 para el
uso en la detección de analito de proteína
C-reactiva en una muestra sanguínea, en el que el
anticuerpo antianalito en el conjugado no soportado en el depósito
de reactivo y el anticuerpo antianalito soportado en la tira de
reactivo son anticuerpos específicos contra un epítopo común en la
proteína C-reactiva.
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