ES2315493T3 - Dispositivo de ablacion. - Google Patents

Abstract

Aparato para la ablación de células nucleadas, comprendiendo el aparato: (a) unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico para generar una señal de campo eléctrico; (b) un componente de aplicación de campo eléctrico conectado para recibir la señal de campo eléctrico y que puede funcionar para aplicar un campo eléctrico a un sitio de tratamiento; (c) unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos para generar una señal de ultrasonidos; (d) un componente de aplicación de ultrasonidos conectado para recibir la señal de ultrasonidos y que puede funcionar para aplicar los ultrasonidos al sitio de tratamiento; y (e) un controlador operativo para controlar (i) los circuitos de generación de señales de campo eléctrico, de tal forma que el componente de aplicación del campo eléctrico aplique un campo eléctrico de una intensidad operativa para sensibilizar una célula nucleada en el sitio de tratamiento, e (ii) los circuitos de generación de señales de ultrasonidos para realizar la ablación de una célula nucleada en el sitio de tratamiento.

Description

Dispositivo de ablación.

Campo

La presente invención se refiere a un dispositivo capaz de realizar la ablación de células o tejido; dicho dispositivo puede utilizarse como dispositivo médico para destruir tumores u otras células o tejidos no deseados, por ejemplo.

Antecedentes

En general, las aplicaciones terapéuticas de ultrasonidos en la clínica pueden dividirse en dos categorías principales: aplicaciones en las que se emplean intensidades bajas (de 0,125 a 3 W/cm^{2}) y aplicaciones en las que se emplean intensidades más altas (\geq 5 W/cm^{2}) (ter Haar, (1999) Eur. J. Ultrasound 9:3). Las primeras se utilizan comúnmente en aplicaciones tales como la fisioterapia, y comprenden la estimulación de respuestas fisiológicas normales a las lesiones o la aceleración de algunos procesos, tales como el transporte de fármacos a través de la piel. El tratamiento con ultrasonidos de baja intensidad raras veces provoca efectos adversos sobre los tejidos, y en realidad se pone mucho empeño en reducir al mínimo dichos efectos. Esto comprende reducir al mínimo el calentamiento excesivo del tejido como consecuencia de la exposición a la correspondiente dosis de ultrasonidos. Habitualmente, esto se logra reduciendo el tiempo de tratamiento o aplicando los ultrasonidos de manera pulsada.

El objetivo principal de las aplicaciones que comprenden la utilización de ultrasonidos de alta intensidad consiste en destruir tejido de manera selectiva mediante procedimientos hipertérmicos. La ablación de tejido por ultrasonidos de alta intensidad puede categorizarse además basándose en la forma en que se aplica la energía a los tejidos. El ultrasonido puede aplicarse directamente desde el transductor hasta el área de tratamiento. Como alternativa, la aplicación puede realizarse por medio de un dispositivo de acoplamiento que da por resultado la focalización de los ultrasonidos. En esta alternativa, los ultrasonidos que pasan a través de los tejidos intermedios suelen ser de baja intensidad y, por consiguiente, sus efectos destructivos pueden considerarse relativamente nulos. No obstante, en el punto focal, la energía acumulada asciende hasta una intensidad más alta predeterminada y se produce destrucción del tejido en dicho punto focal o alrededor del mismo. Ventajosamente, esto se produce de una manera relativamente selectiva, lo cual impide que se produzcan daños más graves en los tejidos intermedios.

En general, la utilización de ultrasonidos focalizados de alta intensidad o HIFU aprovecha el calentamiento del punto local, hecho que ha dado origen a una serie de propuestas de procedimientos junto con dispositivos para realizar la focalización y la ablación del tejido (véase las patentes US nº 4.888.746, nº 5.895.356 y nº 5.938.608 y las solicitudes de patentes internacionales WO 9735518A1 y WO 9922652A1).

Aparte requerir equipos relativamente complejos capaces de realizar la focalización de ultrasonidos de alta intensidad, una de las principales desventajas asociadas a la utilización de los HIFU es que conlleva el riesgo de que se produzcan eventos de cavitación, lo cual a su vez determina la formación de radicales libres destructores o posiblemente mutagénicos (Miller et al., (1996) Ultrasound in Med. & Biol. 22, 1131). Un sistema alternativo que comprenda un mecanismo de sensibilización del tejido de destino a los ultrasonidos de baja intensidad (ya sea focalizados o bien no focalizados) resultará, pues, ventajoso.

Se ha comprobado que la aplicación de impulsos eléctricos cortos e intensos a poblaciones de células o tejidos (in vivo) provoca una permeabilización transitoria, constituyendo dicha comprobación la base de lo que se conoce como electroquimioterapia (Heller et al. Advanced Drug Delivery Rev. 35.119; 1999). Originalmente, la electroquimioterapia tenía como finalidad facilitar la entrada de fármacos quimioterapéuticos en las células cancerosas que se habían vuelto impermeables a dichos fármacos. Desde entonces, dicha técnica se ha desarrollado hasta alcanzar una fase en la que se explota la aplicación de los impulsos eléctricos in vivo en áreas tales como la terapia genética para mediar en la introducción del ADN en las áreas deseadas. Actualmente, se dispone de dispositivos diseñados para facilitar la aplicación de los impulsos in vivo en una diversidad de condiciones (transdérmica, laparoscópica, por catéter, etc.) (véase las solicitudes de patentes internacionales WO 9922809A1 y WO 9906101A1 [Gentronics Inc.], WO 9901157A1, WO 9901157A1 y WO 9901158 [Rhone Poulenc Rorer S.A.].

Más recientemente, se ha comprobado que la exposición de los eritrocitos humanos a impulsos eléctricos cortos e intensos que facilita la permeabilización transitoria también provoca una sensibilización espectacular al ultrasonido de baja intensidad (WO/01/07011).

Sumario

La presente invención se basa en la demostración de que la sensibilización de las células, tales como las células nucleadas, mediante la aplicación de un campo eléctrico ("electrosensibilización") hace que las células se vuelvan sensibles a la ablación mediante ultrasonidos de baja intensidad, y aporta de ese modo unos medios para eliminar los tejidos no deseados en el cuerpo. Por consiguiente, se proporciona un dispositivo o un aparato capaz de realizar la ablación de una célula o un tejido, aplicando un campo eléctrico y ultrasonidos a la célula o al tejido.

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Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un aparato para la ablación de células nucleadas, que comprende: (a) unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico para generar una señal de campo eléctrico; (b) un componente de aplicación de campo eléctrico conectado para recibir la señal de campo eléctrico y operativo para aplicar un campo eléctrico a un sitio de tratamiento; (c) unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos para generar una señal de ultrasonidos; (d) un componente de aplicación de ultrasonidos conectado para recibir la señal de ultrasonidos y operativo para aplicar los ultrasonidos al sitio de tratamiento y (e) un controlador operativo para controlar (i) los circuitos de generación de señales de campo eléctrico, de tal forma que el componente de aplicación del campo eléctrico aplique un campo eléctrico de una intensidad operativa para sensibilizar una célula nucleada en el sitio de tratamiento e (ii) los circuitos de generación de señales de ultrasonidos para realizar la ablación de una célula en el sitio de tratamiento.

La presente invención se basa también en el descubrimiento de que la exposición de una célula a los ultrasonidos seguida de la exposición a unos campos eléctricos provoca asimismo la disrupción celular. Por lo tanto, la exposición de una célula, preferentemente una célula nucleada a los ultrasonidos y a un campo eléctrico, aplicados en cualquier orden, provoca disrupción celular, siendo el aparato descrito en la presente memoria capaz de administrar en cualquier orden los ultrasonidos y el campo eléctrico a una célula.

No obstante, en las formas de realización preferidas, el aparato genera y aplica el campo eléctrico a la célula para sensibilizarla o electrosensibilizarla. Preferentemente, pues, el campo eléctrico es operativo para sensibilizar una célula en el sitio de tratamiento. Además, en las formas de realización preferidas, el aparato genera y aplica los ultrasonidos a una célula sensibilizada (preferentemente una célula electrosensibilizada) para romperla. Por consiguiente, en dichas formas de realización preferidas de la presente invención, los ultrasonidos son operativos para realizar la ablación de una célula sensibilizada en el sitio de tratamiento.

El componente de aplicación de campo eléctrico y el componente de aplicación de ultrasonidos pueden estar situados dentro de un cabezal de aplicación común. Preferentemente, el controlador es operativo para aplicar el campo eléctrico antes de los ultrasonidos en el sitio de tratamiento. De forma alternativa o adicional, el controlador puede ser operativo para aplicar simultáneamente el campo eléctrico y los ultrasonidos al sitio de tratamiento.

El componente de aplicación de campo eléctrico puede adoptar diversas formas (por ejemplo, puede comprender un único contacto eléctrico). De forma alternativa o adicional, el componente de aplicación de campo eléctrico puede comprender una pluralidad de contactos eléctricos situados en los vértices de un polígono regular, preferentemente, un triángulo, un cuadrado, un pentágono, un hexágono o un heptágono. Pueden disponerse uno o más electrodos de contacto dentro de la circunferencia del polígono. El componente de aplicación de campo eléctrico puede comprender una pluralidad de electrodos de contacto dispuestos en una rejilla.

En una forma de realización preferida, el electrodo de contacto o cada uno de los electrodos de contacto comprende una aguja. La aguja puede ser preferentemente hueca o puede estar aislada eléctricamente a lo largo de por lo menos una parte de su extensión y puede preferentemente comprender un manguito aislante extensible.

Una aguja hueca es ventajosa para administrar material en la zona situada en los alrededores de la célula que se está tratando. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el aparato es operativo para aplicar un agente inductor de muerte celular en la zona situada en los alrededores de la célula por medio de la aguja hueca.

El componente de aplicación de campo eléctrico puede comprender un contacto eléctrico que comprende una parte conductora de una placa de contacto. Puede acoplarse una pluralidad de contactos eléctricos a una pluralidad de señales de campo eléctrico en el aparato. Preferentemente, los circuitos de generación de señales de campo eléctrico son operativos para aplicar campos eléctricos comprendidos entre 1 V/cm y 10 kV/cm en el sitio de tratamiento.

Ventajosamente, el aparato puede comprender además un componente de diagnóstico por ultrasonidos. El componente de aplicación de ultrasonidos puede comprender un transductor de ultrasonidos. Cuando se utiliza una pluralidad de transductores de ultrasonidos, éstos pueden acoplarse a una pluralidad de señales de ultrasonidos. Los circuitos de generación de señales de ultrasonidos pueden ser operativos para aplicar ultrasonidos a una densidad de potencia media comprendida entre 0,1 W/cm^{2} y 50 W/cm^{2}, y preferentemente de hasta 7 W/cm^{2}, en el sitio de tratamiento.

El componente de aplicación de ultrasonidos puede acoplarse a la superficie de un tejido por medio de un depósito de presión de contacto dispuesto para deformar la superficie del tejido. Dicha disposición es ventajosa en la medida en que permite focalizar y dirigir los ultrasonidos, por ejemplo, hacia un sitio situado en el interior del cuerpo del paciente que se está tratando.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un aparato según el primer aspecto de la invención en un procedimiento de ablación de células o tejidos in vitro o ex vivo.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de ablación de células in vitro o ex vivo que comprende las etapas siguientes: provisión de un aparato según el primer aspecto de la presente invención; generación de una señal de campo eléctrico para hacer que un componente de aplicación de campo eléctrico del aparato aplique un campo eléctrico a una célula del sitio de tratamiento y generación de una señal de ultrasonidos para hacer que un componente de aplicación de ultrasonidos del aparato aplique un campo eléctrico a la célula.

Preferentemente, el aparato comprende unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico para generar una señal de campo eléctrico y unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos para generar una señal de ultrasonidos.

Se describe además un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende uno o más contactos eléctricos, en el que el contacto o los contactos eléctricos comprenden una o más agujas huecas.

Preferentemente, las agujas huecas están dispuestas en una rejilla. De forma alternativa o adicional, las agujas huecas están situadas en los vértices de un polígono regular, preferentemente un triángulo, un cuadrado, un pentágono, un hexágono o un heptágono. Opcionalmente, el componente de aplicación de campo eléctrico comprende una o más agujas huecas dispuestas dentro de la circunferencia del polígono.

Breve descripción de las figuras

Para facilitar la comprensión de la presente invención e ilustrar cómo se puede llevar a la práctica, a continuación se hace referencia a título de ejemplo a los dibujos adjuntos, que comprenden las figuras siguientes:

La figura 1A es un diagrama esquemático de una forma de realización de un dispositivo de terapia tumoral según un aspecto de la presente invención.

La figura 1B es un diagrama esquemático de otra forma de realización de un dispositivo de terapia tumoral según un aspecto de la presente invención.

La figura 2A es un diagrama esquemático de un componente de aplicación de campo eléctrico (EFD) para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 2B es un diagrama esquemático del EFD representado en la figura 2A cuando se emplea en una orientación.

La figura 2C es un diagrama esquemático del EFD representado en la figura 2A cuando se emplea en otra orientación.

La figura 3A es una vista en perspectiva esquemática de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 3B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 3A.

La figura 4A es una vista en perspectiva esquemática de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 4B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 4A.

La figura 5A es una vista en perspectiva esquemática de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 5B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 5A.

La figura 6A es una vista en perspectiva esquemática de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 6B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 6A.

La figura 7A es una vista lateral esquemática de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral.

La figura 7B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 7A.

La figura 8A es una vista lateral esquemática de una parte de un EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral dispuesta para evitar el contacto eléctrico con tejido esencial.

La figura 8B es una vista lateral esquemática de una parte de otro EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral dispuesta para evitar el contacto eléctrico con tejido esencial.

La figura 9 es una vista lateral esquemática de una parte de un EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral dispuesta para aplicar una señal de campo eléctrico a unos electrodos de contacto implantados quirúrgicamente.

La figura 10A es una vista en planta esquemática de una parte de un EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral que comprende las partes conductoras de una placa de contacto.

La figura 10B es una vista lateral esquemática de la parte del EFD representada en la figura 10A.

La figura 11A es una vista en planta esquemática de una configuración de electrodos de contacto sobre una placa de contacto.

La figura 11B es una vista en planta esquemática de otra configuración de electrodos de contacto sobre una placa de contacto.

La figura 11C es una vista en planta esquemática de otra configuración de electrodos de contacto sobre una placa de contacto.

La figura 12 es una vista lateral esquemática de un EFD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral, que comprende agujas y partes conductoras de una placa de contacto como electrodos de contacto.

La figura 13A es una vista lateral esquemática de un componente de aplicación de ultrasonidos (USD) para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral acoplado a una masa tisular a través de un gel mediador.

La figura 13B es una vista lateral esquemática de un USD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral acoplado a una masa tisular mediante una placa adhesiva.

La figura 14 es una vista lateral esquemática de un USD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral acoplado a una masa tisular mediante un depósito de baja presión de contacto que determina la deformación del tejido y facilita la focalización de los ultrasonidos.

La figura 15 es una vista esquemática de la parte inferior de un USD para utilizar en un dispositivo de terapia tumoral que comprende tres transductores de ultrasonidos direccionales.

La figura 16 es una vista esquemática de un USD combinado con un componente de aplicación de ultrasonidos diagnósticos y exploración (DDS).

La figura 17 es una vista esquemática de un cabezal de aplicación combinado que comprende un EFD y un USD en funcionamiento.

La figura 18 es una vista esquemática de un cabezal de aplicación combinado que comprende un EFD, un USD y un DDS en funcionamiento.

Las figuras 19 a 33 representan cómo una combinación de campo eléctrico y ultrasonidos es capaz de destruir una célula.

la figura 19 es un gráfico que representa el efecto de los ultrasonidos sobre unas células de control (\ding{115}) y electrosensibilizadas (\blacksquare) 707 en suspensión. Las células se electrosensibilizan mediante un tratamiento con impulsos eléctricos de 3,625 kV/cm a 1 \muF, y se determina la viabilidad de las células inmediatamente después del tratamiento con ultrasonidos.

La figura 20 es un gráfico que representa el efecto de los ultrasonidos sobre unas células de control (\blacksquare), unas células electrosensibilizadas a 1,875 kV/cm a 1 \muF (\ding{115}) y unas células electrosensibilizadas a 2,5 kV/cm (V). La viabilidad de las células se determina 1 hora después de la exposición a los ultrasonidos.

La figura 21 es un diagrama de barras que representa el efecto de los ultrasonidos sobre unas células de control y electrosensibilizadas inmovilizadas en matrices de alginato de calcio.

La figura 22 es un gráfico de un ensayo de inducción de tumores en ratones CH3 tras el tratamiento de una línea de células RIF-1 con campos eléctricos (\ding{115}), ultrasonidos (\boxempty) y campos eléctricos en combinación con ultrasonidos (\medbullet). Las poblaciones de control (\blacksquare) constan de células que no reciben ningún tratamiento. El eje de las X representa el tiempo medido en días y el eje de las Y representa el volumen del tumor medido en mm^{3}.

La figura 23 representa el tratamiento de tumores RIF-1 in situ en ratones con campos eléctricos (\ding{115}), ultrasonidos de onda pulsada (\boxempty), ultrasonidos de onda continua (\medbullet), campo eléctrico más ultrasonidos de onda continua (\ding{116}) y campo eléctricos más ultrasonidos de onda pulsada (\medcirc). Los ultrasonidos de onda continua se aplican a 0,7 W/cm^{2} y a 3 MHz durante 2 minutos, mientras que los ultrasonidos de onda pulsada se aplican a una potencia de entre 1,8 y 1,9 W/cm^{2} y a 3 MHz durante 2 minutos al 35%. Los campos eléctricos se aplican a 1,333 kV/cm. Los tumores de control (\blacksquare) no reciben ningún tratamiento. El eje de las X representa el tiempo medido en días y el eje de las Y representa el volumen del tumor medido en mm^{3}. Las barras de error representan el +/- SEM (error estándar de la media).

La figura 24 es un gráfico que representa la supervisión prolongada de los experimentos, en los que los tumores se sensibilizan con corriente continua (CC) y posteriormente se tratan con ultrasonidos. Se emplean grupos de 6 animales en cada grupo y los tumores se tratan solo con ultrasonidos (\medbullet), solo con CC (\ding{115}) y con CC más ultrasonidos (\ding{117}). Los animales de control (\blacksquare) no reciben ningún tratamiento. Las flechas en negrita insertadas junto a la indicación "Ter" ilustran el momento en que se retiran los animales del experimento. Las barras de error representan el +/- SEM (error estándar de la media).

La figura 25 representa el tratamiento de tumores RIF-1 in situ en ratones, con campos eléctricos (\ding{115}), ultrasonidos de onda pulsada (\boxempty), ultrasonidos de onda continua (\medbullet), campo eléctrico más ultrasonidos de onda continua (\ding{116}) y campos eléctricos más ultrasonidos de onda pulsada (o). Los ultrasonidos de onda continua se aplican a 1,25 W/cm^{2} y a 3 MHz durante 2 minutos, mientras que los ultrasonidos de onda pulsada se aplican a 2,5 W/cm^{2} y a 3 MHz durante 2 minutos al 35%. Los campos eléctricos se aplican a 1,33 kV/cm. Los tumores de control (\blacksquare) no reciben ningún tratamiento. El eje de las X representa el tiempo medido en días y el eje de las Y representa el volumen del tumor medido en mm^{3}. Las barras de error representan el +/- SEM (error estándar de la media).

La figura 26 es un gráfico que representa los resultados del tratamiento de tumores electrosensibilizados con ultrasonidos, una vez transcurridas 0 (\ding{115}), 0,5 (\medbullet), 1 (\ding{117}), 2 (\ding{116}), 6 (\boxempty) y 18 (\ding{83}) horas desde la electrosensibilización. Las poblaciones de control consisten en tumores no tratados (\blacksquare) o tratados con impulsos eléctricos (x) o ultrasonidos (o) solo. En estos experimentos las barras de error representan el \pm SEM, siendo n=3.

La figura 27 representa el efecto del tratamiento combinado de células 707 con una intensidad de campo eléctrico creciente (impulso único) y ultrasonidos a 1,25 W/cm^{2} durante 30 segundos, utilizando un cabezal de ultrasonidos de 3 MHz. Las concentraciones celulares (\blacksquare) se determinan utilizando un hemocitómetro y la proporción de células apoptóticas (\medbullet) y necróticas (\ding{115}) de cada población se calcula tiñendo con Anexina V-FLUOS y ioduro de propidio y a continuación realizando un análisis mediante citometría de flujo. Los datos reflejan los valores medios de \pm SEM de tres experimentos.

La figura 28 representa el efecto de la inducción de la apoptosis in vivo, tras el tratamiento con campos eléctricos y ultrasonidos. Las secciones de los animales de control (columna C) y los animales tratados (columna T) se tiñen para detectar la apoptosis. Los paneles de las secciones recolectadas al cabo de 0, 6, 12, 18 y 24 horas se presentan por orden descendente en cada columna. El panel situado en la parte inferior de la figura representa un control positivo generado tratando las secciones con DNAse I antes de teñirlas.

La figura 29 representa el efecto del tratamiento de tumores con ultrasonidos antes de la aplicación de los campos eléctricos. Los grupos de animales utilizados en los experimentos comprenden animales no tratados de control (\blacksquare), electrosensibilizados (\ding{115}), tratados con ultrasonidos de onda pulsada (\ding{117}), tratados con ultrasonidos de onda continua (\medbullet), tratados con ultrasonidos de onda pulsada seguidos de campos eléctricos (X) y tratados con ultrasonidos de onda continua seguidos de campos eléctricos (\ding{116}). En cada grupo, n = 4 y las barras de error representan + SEM.

La figura 30 representa el efecto de la corriente eléctrica continua (\blacksquare) y la corriente eléctrica continua junto con ultrasonidos (\medbullet) sobre el volumen del tumor.

La figura 31 representa el efecto del tratamiento de tumores RIF-1 con ultrasonidos (\medbullet), corriente eléctrica continua (\ding{115}) y corriente eléctrica continua combinada con ultrasonidos (\ding{117}). Los animales de control son animales no tratados (\blacksquare). Las barras de error representan el \pm SEM, siendo n=2.

La figura 32 es un gráfico que representa los resultados del tratamiento de los tumores con ultrasonidos, 22 horas después de la sensibilización con corriente continua (CC). Cada grupo consta de 4 animales y los grupos se tratan con corriente continua solo (\ding{115}), ultrasonidos solo (\medbullet) y corriente continua seguida, 22 horas más tarde, de ultrasonidos (\ding{117}). Los animales de control (\blacksquare) no reciben ningún tratamiento. Las flechas en negrita insertadas junto a la indicación "Ter" indican el momento en que se retiran los animales del experimento. Las barras de error representan el +/- SEM (error estándar de la media).

La figura 33 es un gráfico que representa la sensibilización de los tumores a los ultrasonidos, utilizando impulsos eléctricos de ondas cuadradas de corta duración y alta intensidad. Cada grupo consta de 4 animales y cada grupo se trata con impulsos eléctricos solo (\medbullet), ultrasonidos solo (\ding{115}),campo eléctrico seguido, 24 horas más tarde, de ultrasonidos (\ding{116}) y campo eléctrico seguido inmediatamente de ultrasonidos (\ding{117}). Los animales de control (\blacksquare) no reciben ningún tratamiento. Las barras de error representan el +/- SEM (error estándar de la media).

Descripción detallada

A continuación, se describe un aparato capaz de realizar la ablación de una célula a través de una combinación de campo eléctrico y ultrasonidos.

El aparato es generalmente capaz de provocar la disrupción o la ablación de las células aplicando dos etapas: una etapa de sensibilización seguida de una etapa de disrupción. En general, la sensibilización y la disrupción pueden realizarse exponiendo las células a una o más fuentes de energía, incluidas las partículas, las ondas o los campos. No obstante, en la forma de realización del aparato descrito en la presente memoria, las fuentes de energía comprenden ultrasonidos y campos eléctricos, y el aparato en general comprende un componente de aplicación de ultrasonidos y un componente de aplicación de campo eléctrico.

El aparato es capaz de generar un campo eléctrico y ultrasonidos; por consiguiente, comprende dos módulos: un módulo de generación de campo eléctrico y un módulo de generación de ultrasonidos. En una forma de realización preferida, el aparato es operativo para aplicar o administrar un campo eléctrico para sensibilizar una célula y es operativo además para aplicar o administrar ultrasonidos a una célula que ha sido sensibilizada, con el objetivo de someterla a disrupción o ablación.

Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el campo eléctrico sirve para sensibilizar las células, preferentemente células nucleadas, y hacer que sean más sensibles a la disrupción mediante un estímulo. Preferentemente, el aparato es capaz de sensibilizar células nucleadas, para que estas sean más susceptibles a la disrupción por una fuente de energía que las células, preferentemente células nucleadas, que no se han sensibilizado de esta forma. La disrupción se realiza mediante exposición a un estímulo de una célula sensibilizada, a una frecuencia o energía suficiente para destruir las células sensibilizadas, preferentemente células nucleadas sensibilizadas, preferentemente a una frecuencia o energía que al mismo tiempo es insuficiente para provocar la disrupción de las células no sensibilizadas. El aparato comprende en general un componente para generar dicho estímulo disruptor. En una forma de realización preferida, el aparato comprende un componente para generar un estímulo de ultrasonidos.

Por consiguiente, es posible realizar la disrupción o la ablación de una célula, preferentemente una célula nucleada, que se ha sensibilizado mediante exposición a un campo eléctrico del aparato (una célula electrosensibilizada), mediante los ultrasonidos generados por el aparato. No obstante, debe tenerse en cuenta que el aparato se puede utilizar simplemente para sensibilizar una célula, y que la disrupción de dicha célula puede realizarse por medio de un estímulo generado en otro lugar. Análogamente, el aparato es capaz de realizar la disrupción e una célula que ya está sensibilizada, aplicando un estímulo de ultrasonidos a la célula.

Cada uno de los componentes de aplicación puede controlarse por medio de unos circuitos de generación de señales, descritos más adelante.

En una forma de realización preferida, el aparato es operativo para realizar la ablación selectiva de las células o, dicho de otro modo, para provocar la disrupción o muerte de las células deseadas.

En una forma de realización preferida, el aparato es operativo para generar energía de ultrasonidos y de campo eléctrico, y la exposición de una célula a estos tipos de energía (en cualquier orden) provoca la muerte celular, la disrupción celular, la ablación celular o la eliminación celular. Más preferentemente, el aparato puede determinar la muerte celular, etc., resultante de la apoptosis de la célula tratada. Preferentemente, la apoptosis se lleva a cabo administrando campos eléctricos desde el aparato, combinando de cualquier forma campos eléctricos de (i) alta intensidad, (ii) de corta duración o (iii) de impulsos exponenciales. Más preferentemente todavía, la apoptosis se realiza administrando campos eléctricos de alta intensidad, de corta duración y de impulsos exponenciales. De forma alternativa o adicional, la apoptosis puede estar provocada por la aplicación de corriente continua de larga duración, como se describe más adelante.

La expresión "alta intensidad" debe hacer referencia a los campos eléctricos comprendidos entre aproximadamente 0,5 kV/cm y 3 kV/cm, preferentemente comprendidos entre aproximadamente 1 kV/cm y 2 kV/cm y más preferentemente de aproximadamente 1,3 kV/cm. Los campos eléctricos de "corta duración" en el contexto del pasaje anterior se refieren a campos eléctricos de una duración comprendida entre aproximadamente 25 microsegundos y 700 ms, preferentemente entre aproximadamente 25 microsegundos y 450 ms y más preferentemente entre aproximadamente 250 ms y 450 ms.

El aparato descrito en la presente memoria es adecuado para eliminar cualquier célula. No obstante, la célula es preferentemente una célula nucleada, y más preferentemente dicha célula pertenece a un organismo multicelular. Preferentemente, la célula forma parte de un tejido. En formas de realización preferidas, la célula es una célula animal, más preferentemente una célula de mamífero y más preferentemente una célula de primate. En las formas de realización muy preferidas, la célula es una célula humana.

En formas de realización preferidas, la ablación celular tiene lugar in vivo, es decir, en el cuerpo del organismo. No obstante, el aparato puede utilizarse igualmente in vitro o ex vivo para realizar la ablación celular.

Preferentemente, el aparato se utiliza para extirpar una célula tumoral, una célula cancerosa, una célula enferma o una célula que de alguna forma es anormal o no deseada. Preferentemente, la célula que se va a extirpar, etc. se halla en un tejido o una masa tisular (por ejemplo, un bulto tal como un quiste o un tejido tumoral o un tumor tal como un tumor sólido). Por consiguiente, el aparato es capaz de tratar y extirpar células, así como tejidos que comprenden células. El tumor puede ser benigno o maligno. Por lo tanto, el aparato descrito en la presente memoria puede utilizarse para tratar tumores benignos que no pueden ser tratados con las terapias tumorales tradicionales (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, etc.), ya que resultan contraindicadas para estos. El aparato también puede utilizarse como un adjunto o un sustituto de cualquier tipo de cirugía convencional para extraer tejidos no deseados.

En otras formas de realización, el aparato se utiliza para provocar la ablación, la disrupción o la muerte de una célula con finalidades cosméticas, es decir, para mejorar el aspecto. En algunas formas de realización, estas finalidades son puramente cosméticas, es decir, no médicas, y no aportan ningún beneficio médico, sino solo la mejora de la imagen o el aspecto de una persona. Por ejemplo, el aparato puede utilizarse para extirpar un lunar, una mancha de nacimiento, una mancha de nacimiento vascular, un parche salmón (nevus simplex), un hemangioma en fresa, una mancha en vino de Oporto (nevus flammeus), una imperfección, una peca, una arruga, un tejido cicatricial, etc. de la piel con el propósito de mejorar el aspecto de una persona.

Los parches salmón (nevus simplex) son parches planos de piel rosa o roja que a menudo son pequeños y habitualmente presentan bordes poco definidos. Los parches salmón aparecen en un porcentaje comprendido entre el 30 por ciento y el 40 por ciento de los recién nacidos. Estos parches se suelen encontrar en la nuca ("marca de la cigüeña"), en la frente entre las cejas ("beso de ángel") o en las pestañas. A menudo, son más perceptibles con el lloro o con los cambios de temperatura. El hemangioma en fresa es una mancha con relieve de color rojo vivo, que suele ser pequeña, suave y comprimible, y que presenta bordes bien definidos. La mayoría de las veces aparece en la cara, el cuero cabelludo, el pecho o la espalda. Puede ser de nacimiento pero más a menudo aparece durante el primer o el segundo mes de vida. La presencia de hemangiomas en fresa en los bebés se cifra entre el 1 y el 3 por ciento. Raras veces interfieren con órganos vitales o están asociados a complicaciones con peligro para la vida. La mancha en vino de Oporto (nevus flammeus) es un parche plano de piel de color morado o rojo oscuro, que suele ser grande y presentar bordes bien definidos. Habitualmente, aparece en un lado de la cara o del cuello y está presente en el nacimiento. Otras afecciones, tales como el acné, pueden tratarse también con el aparato descrito en la presente memoria para mejorar el
aspecto.

El aparato descrito en la presente memoria puede ser utilizado para extirpar células o tejidos de cualquier organismo multicelular y se aplica ventajosamente a los organismos que presentan tejidos diferenciados que pueden exponerse a electrosensibilización. Ventajosamente, el organismo es un mamífero. Preferentemente, el tejido de destino es un tejido tumoral y, más preferentemente, un tejido tumoral sólido. Más preferentemente, la célula, el tejido, el tumor, etc. de destino se tratan in situ en el organismo. No obstante, la célula, el tejido, el tumor, etc. de destino pueden extraerse del organismo (por ejemplo, mediante cirugía) y tratarse ex vivo. En algunas formas de realización, el explante extraído, una vez tratado para eliminar las células, etc. no deseadas, puede reintroducirse en el cuerpo del organismo (o en el de cualquier otro organismo).

Preferentemente, cuando el tejido es un tejido tumoral, el tratamiento del tejido con ultrasonidos y campo eléctrico del aparato descrito en la presente memoria da por resultado una remisión parcial o completa. Por lo tanto, en una forma de realización particular, el tratamiento con el aparato da por resultado un crecimiento celular no significativo de las células tumorales (en el sitio tratado o preferentemente en el cuerpo del organismo) en el período de tiempo aplicable. Dicho período es preferentemente de 1 día, 1 semana, 1 mes, 2, 3, 4, 5 ó 6 meses, o un período superior, tal como un año, dos años, cinco años, 10 años, 20 años, etc.

Preferentemente, el procedimiento de sensibilización se realiza en ausencia de material extraño, por ejemplo, material para incorporar a la célula. Entonces, por ejemplo, cuando la electrosensibilización va seguida de la aplicación de ultrasonidos, el procedimiento de electrosensibilización se realiza en ausencia de material extraño (por ejemplo, material para incorporar a la célula).

No obstante, como se describe en mayor detalle más adelante, pueden aplicarse otros agentes (tales como los citotóxicos y las citocinas) a las células tras la administración del sensibilizador (por ejemplo, un campo eléctrico) o tras la administración del disruptor (por ejemplo los ultrasonidos) para favorecer la muerte celular. Dichos agentes inductores de muerte celular pueden administrarse antes del disruptor (por ejemplo, ultrasonidos), es decir, a las células sensibilizadas. Se describe una forma de realización particular, en la que el campo eléctrico se aplica a la célula o el tejido, o a la zona situada en los alrededores de estos, mediante una o más agujas huecas. Dichas agujas huecas pueden servir de conducto para aplicar un agente inductor de muerte celular a la célula o el tejido, desde un recipiente contenido en el aparato.

Además, los agentes inductores de muerte celular pueden aplicarse al mismo tiempo o después de la administración del disruptor, por ejemplo, los ultrasonidos, utilizando componentes de aplicación de ultrasonidos huecos adecuados.

Los agentes inductores de muerte celular pueden aplicarse individualmente o en combinación; además, los agentes inductores de muerte celular pueden aplicarse en forma de células que expresan los agentes.

El aparato descrito en la presente memoria es preferentemente capaz de tratar o provocar la disrupción de una célula, preferentemente una célula nucleada. Por consiguiente, la célula puede consistir en una célula nerviosa, una célula muscular, una célula epidérmica, una célula capilar, una célula epitelial, una célula endotelial, etc. La célula puede ser normal, enferma, infectada, cancerosa o presentar algún tipo de anormalidad. Mediante el aparato descrito en el presente documento, se puede provocar la disrupción de cualquiera de estas células u otras.

Más preferentemente, la célula forma parte de una masa tisular del organismo, y una proporción del tejido está sensibilizado (por ejemplo, electrosensibilizado o sensibilizado mediante ultrasonidos, preferentemente sensibilizado mediante ultrasonidos). La proporción de tejido sensibilizado variará, pero ventajosamente, una parte sustancial de todo el tejido queda sensibilizada mediante la electricidad o los ultrasonidos. Por ejemplo, cuando se utiliza el aparato descrito en la presente memoria, se puede sensibilizar aproximadamente del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de las células del tejido.

La energía de campo eléctrico se administra preferentemente y sustancialmente como se describe a continuación, utilizando un componente de aplicación de campo eléctrico contenido en el aparato. El componente de aplicación de campo eléctrico está conectado para recibir una señal generada por los circuitos de generación de campo eléctrico. El campo eléctrico que genera el aparato comprende preferentemente uno o más impulsos eléctricos de entre aproximadamente 1 Volt/cm y de aproximadamente 10 kVolt/cm, en condiciones in vivo. En lugar o además de los impulsos, el aparato puede estar adaptado para aplicar un campo eléctrico de manera continua. El impulso eléctrico puede aplicarse durante un tiempo comprendido entre 1 \mus y 700 milisegundos, preferentemente entre 1 \mus y 500 milisegundos y más preferentemente entre 1 \mus y 100 milisegundos. El campo eléctrico puede aplicarse de manera continua o pulsada durante 5 minutos o más.

El aparato comprende asimismo un componente de aplicación de ultrasonidos, que está conectado para recibir una señal generada por los circuitos de generación de señales de ultrasonidos. El aparato es preferentemente capaz de generar y aplicar ultrasonidos a un nivel de potencia comprendido entre de aproximadamente 0,05 W/cm^{2} y de aproximadamente 100 W/cm^{2}. Pueden utilizarse ultrasonidos diagnósticos o terapéuticos o combinaciones de los mismos. Una forma de realización particular del aparato comprende un componente de generación de ultrasonidos separado capaz de generar ultrasonidos a niveles diagnósticos, en conjunción con otro componente de generación de ultrasonidos capaz de generar ultrasonidos a niveles terapéuticos para provocar la disrupción. Los ultrasonidos diagnósticos pueden utilizarse para analizar el tejido antes, durante o después de la disrupción, como se describe en mayor detalle más adelante.

Los circuitos de generación de señales de ultrasonidos y los circuitos de generación de señales de campo eléctrico pueden ser capaces de generar un conjunto de formas de onda diferentes, tales como las ondas continuas y las ondas pulsadas. Los circuitos de generación de señales de ultrasonidos y los circuitos de generación de campo eléctrico son controlados por un controlador, descrito en mayor detalle a continuación.

El controlador puede controlar la aplicación de los ultrasonidos y del campo eléctrico, para aplicar dichas formas de energía de forma simultánea o separada. Por lo tanto, el aparato es capaz de realizar las etapas de sensibilización y disrupción por separado o simultáneamente. La electrosensibilización y la disrupción por ultrasonidos o la sensibilización por ultrasonidos y la disrupción por campo eléctrico pueden ser simultáneas o separadas. Cuando las etapas se realizan por separado, el aparato puede ser capaz de realizarlas en cualquier orden. Por ejemplo, se pueden administrar los ultrasonidos antes del campo eléctrico. Ventajosamente, sin embargo, la etapa de electrosensibilización precede a la etapa de disrupción por ultrasonidos.

Además, el aparato es capaz de realizar aplicaciones individuales o múltiples de campo eléctrico, así como aplicaciones individuales o múltiples de ultrasonidos, en cualquier orden y en cualquier combinación. Por lo tanto, el aparato puede configurarse para realizar varios ciclos de sensibilización, seguidos de disrupción (es decir, S + D, S + D, S + D..., por ejemplo, ES + US, ES + US, ES + US..., siendo ES electrosensibilización y US sensibilización mediante ultrasonidos). Dos o más aplicaciones de sensibilización pueden ir seguidas de una única disrupción (es decir, S + S... + D). Además, dos o más aplicaciones de campo eléctrico pueden ir seguidas de una sola aplicación de ultrasonidos (es decir, ES + ES...+ US) o viceversa (es decir, US + ES + ES...). Puede aplicarse un solo campo de electrosensibilización, seguido de dos o más aplicaciones de ultrasonidos (por ejemplo, ES + US + US...) y viceversa (es decir, US + US + ES...). Pueden aplicarse varios campos de electrosensibilización seguidos de varias aplicaciones de ultrasonidos (ES + ES... + US + US...) o varias aplicaciones de ultrasonidos seguidas de varias aplicaciones de campos de electrosensibilización (US + US... + ES + ES...). En cada una de las opciones anteriores, los ultrasonidos o el campo eléctrico pueden administrarse como una aplicación individual o como varias aplicaciones continuas, o como impulsos (aplicación pulsátil). Los protocolos anteriores pueden combinarse unos con otros.

También se toma en consideración una célula, preferentemente una célula nucleada, que se ha sensibilizado por exposición a un campo eléctrico o a los ultrasonidos aplicados por el aparato descrito en la presente memoria. Por lo tanto, se proporciona una célula, preferentemente una célula nucleada, que se ha vuelto sensible a un estímulo mediante exposición a ultrasonidos o un campo eléctrico. Esta célula puede consistir en una célula (preferentemente una célula nucleada) tratada con ultrasonidos, así como una célula (preferentemente una célula nucleada) tratada con un campo eléctrico, que se vuelve sensible a un estímulo mediante el tratamiento. Por lo tanto, se proporcionan en particular células nucleadas que se vuelven sensibles al ultrasonido mediante exposición a un campo eléctrico del aparato, así como células nucleadas que se vuelven sensibles a un campo eléctrico mediante exposición a los ultrasonidos del aparato.

En el aparato, los procedimientos, los productos, etc. descritos en la presente memoria, se emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se hallan dentro de las aptitudes de los expertos con conocimientos básicos en la materia. Dichas técnicas se describen en la bibliografía especializada, que comprende, por ejemplo, el documento de J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, segunda edición, tomos 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; el documento de Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1995 y suplementos periódicos, caps. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.; el documento de B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, 1996, John Wiley & Sons; el documento de J.M. Polar y James O'D. McGee, In Situ Hybridization: Principles and Practice, 1990, Oxford University Press; el documento de M. J. Gait (Redactor), Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach, 1984, Irl Press; y el documento de D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, 1992, Academic Press. Cada uno de estos textos generales se incorpora a la presente memoria a título de referencia.

Aparato para realizar la ablación de una célula

La estructura de un dispositivo para provocar la destrucción, la ablación o la disrupción de una célula se describe en el apartado "Aparato" haciendo referencia a las figuras. Los aspectos particulares del aparato se describen en mayor detalle en los apartados "Circuitos de generación de señales de campo eléctrico (EFG)", "Componente de aplicación de campo eléctrico (EFD)", "Circuitos de generación de señales de ultrasonidos terapéuticos (USG)", "Componente de aplicación de señales de ultrasonidos terapéuticos (USD)", "Circuitos de generación de señales de ultrasonidos diagnósticos (DG) y componente de aplicación de ultrasonidos diagnósticos y exploración (DDS)" y "Controlador".

Por último, la información de los antecedentes relativos a la ablación celular, incluidos los procedimientos de sensibilización y disrupción se exponen en los apartados "Sensibilización", "Electrosensibilización", "Ultrasonidos", "Sensibilización de baja intensidad y disrupción", "Agentes que inducen la muerte celular", "Citotóxicos", "Citocinas", "Apoptosis" y "Ensayos". Esta información es respaldada por ejemplos detallados que demuestran que la aplicación de un campo eléctrico y ultrasonidos a una célula, tal como una célula nucleada, en cualquier orden, determina la disrupción de la célula. La incorporación de dicha información de antecedentes permite comprender el procedimiento y perfeccionar el aparato para que desempeñe de forma óptima su cometido, es decir, la aplicación de los ultrasonidos y el campo eléctrico a las células para provocar la disrupción o la ablación de estas.

Aparato

La figura 1A es un diagrama muy esquemático que representa un dispositivo de ablación celular o terapia tumoral 1 según una forma de realización de un aspecto de la presente invención. El dispositivo de terapia tumoral 1 comprende un controlador 4, unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico (EFG) 6, un componente de aplicación de campo eléctrico (EFD) 8, unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos terapéuticos (USG) 10 y un componente de aplicación de ultrasonidos terapéuticos (USD) 12. Aunque el controlador 4 puede ser una unidad de aplicación específica, en este ejemplo, comprende un ordenador de uso general configurado para realizar las tareas necesarias. El controlador 4, los EFG 6 y los USG 10 están interconectados mediante cableado de señalización y control 22, formando conjuntamente una unidad principal 20. Algunos o todos los componentes que componen la unidad principal pueden estar contenidos dentro de un único armazón (por ejemplo, para reducir al mínimo el cableado externo o facilitar su transferibilidad). En otras formas de realización, algunos aspectos de la funcionalidad del controlador pueden delegarse a subunidades de control contenidas en los EFG o los USG. El EFD está acoplado a los EFG mediante el cableado de control y señalización 24 y el USD está acoplado a los USG mediante el cableado de control y señalización 26.

La figura 1B es un diagrama muy esquemático que representa un dispositivo de terapia tumoral 2 según otra forma de realización de un aspecto de la presente invención. Como en el dispositivo de terapia tumoral 1 representado en la figura 1A y utilizando los mismos números de referencia para denotar características de funciones similares, el dispositivo de terapia tumoral 2 representado en la figura 1B también comprende un controlador 4, unos EFG 6, un EFD 8, unos USG10 y un USD 12. Estos componentes y sus interconexiones son similares a los de la descripción anterior y se pueden deducir a partir de esta.

No obstante, el dispositivo de terapia tumoral representado en la figura 1B comprende además unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos diagnósticos opcionales (DG) 14 y un componente de aplicación de ultrasonidos diagnósticos y exploración (DDS) 16. El DDS está conectado a los DG mediante el cableado de control y señalización 28. El controlador 4, los EFG 6, los USG 10 y los DG 14 están interconectados mediante el cableado de señalización y control 22, formando conjuntamente una unidad principal 21. Como antes, algunos o todos los componentes que componen la unidad principal pueden estar contenidos dentro de un único armazón (por ejemplo, para reducir al mínimo el cableado externo o facilitar la transferibilidad). En otras formas de realización, algunos aspectos de la funcionalidad del controlador pueden delegarse a unas subunidades de control contenidas en los EFG o los USG.

A continuación, se describen de forma sucesiva cada uno de los componentes principales del dispositivo de terapia tumoral 2 representados en las figuras 1A y 1B, incluidos los circuitos de generación de señales de ultrasonidos diagnósticos opcionales (DG) y el componente de aplicación de ultrasonidos diagnósticos y exploración (DDS).

Circuitos de generación de señales de campo eléctrico (EFG)

Los EFG 6 son operativos para generar una señal de campo eléctrico que se transmite al EFD 8 por medio de un cableado 24 para suministrar un campo eléctrico en un sitio de tratamiento que se halla en la zona situada en los alrededores del EFD. Los EFG pueden ser operativos para generar una amplia diversidad de señales de uno o más campos eléctricos; por ejemplo, oscilatorias, de estado estacionario, pulsadas, pulsadas con disminución exponencial, formas de onda generalizadas periódicas o aleatorizadas o una combinación de estas. Las formas de onda suministradas pueden presentar un rango de períodos de tiempo y amplitudes características que se pueden seleccionar según los requisitos de la aplicación particular.

Los circuitos de generación de señales de campo eléctrico pueden funcionar de cualquier manera conocida para generar la señal de campo eléctrico deseada. Por ejemplo, los EFG pueden comprender uno o más generadores de formas de onda arbitrarias programables, tales como el Wavetek 295 (Wavetek Corp., San Diego, California, USA), acoplados a un amplificador de tensión, un amplificador de corriente o a ambos, que son controlados por el controlador 4. Como alternativa, si se necesita un número inferior de formas de onda específicas, los EFG pueden comprender un dispositivo tal como el BTX ECM 630 o el BTX ECM 830 (BTX Division of Genetronics, Inc., San Diego, California, USA), que generan impulsos de señal de campo eléctrico de disminución exponencial y de onda cuadrada, respectivamente, y funcionan bajo control del controlador 4. En el ejemplo representado en la figura 1B, los EFG 6 son operativos para generar una señal de campo eléctrico de salida con un período de tiempo característico seleccionable de entre 1 ms y 20 minutos, y a una amplitud correspondiente a una tensión seleccionable de entre 1 y 3000 V, por ejemplo.

Dependiendo de las características geométricas específicas del EFD, este rango de tensiones puede generar preferentemente un campo eléctrico comprendido entre 1 V/cm y 10 kV/cm en el sitio de tratamiento. Por lo tanto, el campo eléctrico puede tener una intensidad de 1 V/cm, 2 V/cm, 3 V/cm, 4 V/cm, 5 V/cm, 6 V/cm, 7 V/cm, 8 V/cm,
9 V/cm, 10 V/cm, 20 V/cm, 50 V/cm, 100 V/cm, 200 V/cm, 300 V/cm, 400 V/cm, 500 V/cm, 600 V/cm, 700 V/cm, 800 V/cm, 900 V/cm, 1 kV/cm, 2 kV/cm, 5 kv/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm, 50 kV/cm o más. Más preferentemente, dicha intensidad estará comprendida entre de aproximadamente 0,5 kV/cm y de aproximadamente 4,0 kV/cm. No obstante, las intensidades de campo eléctrico pueden reducirse cuando se incrementa el número de impulsos aplicados al sitio de destino. Por lo tanto, la presente memoria toma en consideración la aplicación pulsátil de los campos eléctricos. Dependiendo de los requisitos terapéuticos de la aplicación, los EFG pueden aplicar más de una señal de campo eléctrico dependiente o independiente por ejemplo, los EFG pueden proveer al EFD de diversas señales de fases diferentes o de diversas señales completamente independientes con formas de onda diferentes o tiempos de aplicación diferentes.

Los EFG pueden ser capaces de suministrar el campo eléctrico en modalidad unipolar y, asimismo, pueden estar dotados de una capacidad para alternar la polaridad.

El controlador 4 puede estar configurado para ser capaz de determinar la cantidad de energía depositada por el campo eléctrico en el sitio de tratamiento. En este ejemplo, esto se consigue supervisando el flujo de corriente hacia el EFD en combinación con la amplitud de señal seleccionada. Como alternativa, se puede medir la impedancia de las trayectorias del flujo de corriente dentro del sitio de tratamiento, y emplearla en combinación con el flujo de corriente supervisado o la amplitud de señal seleccionable. El EFD puede comprender también un sensor de temperatura (no representado) que mide la temperatura de la zona situada en los alrededores del sitio de tratamiento.

Estos parámetros pueden utilizarse para elaborar un perfil de descarga de campo eléctrico (que contiene la información de tensión, corriente, impedancia, temperatura, etc.) durante el funcionamiento de los EFG. El controlador 4 puede almacenar los perfiles de descarga de campo eléctrico para un subsiguiente análisis. Además, basándose en los parámetros del perfil de descarga de campo eléctrico (y otros parámetros operativos similares relativos a los USG y la información de diagnóstico obtenida del DDS), el controlador 4 puede ejercer un control sensible sobre las funciones de los EFG. En otras formas de realización, los aspectos del control por retroalimentación pueden ser internos para los EFG. Aunque no se representa en la presente memoria, los EFG también pueden ser capaces de supervisar el contenido relativo de humedad/lípidos/salinidad en la zona situada en los alrededores del EFD utilizando técnicas conocidas dentro del ámbito de la técnica. Esto permite emplear las mediciones de impedancia para facilitar la predicción de la densidad de campo eléctrico localizada en el sitio de tratamiento.

Componente de aplicación de campo eléctrico (EFD)

En funcionamiento, el EFD 8 es operativo para hacer interactuar los campos eléctricos generados por los EFG 6 con el tejido del sitio de tratamiento y, en el ejemplo descrito aquí, el EFD presenta un acoplamiento intercambiable con los EFG, mediante el cual es posible emplear diferentes geometrías y configuraciones del EFD de conformidad con las necesidades de las aplicaciones terapéuticas específicas. Por lo tanto, el aparato puede comprender uno o más componentes modulares, que son separables e intercambiables, para obtener una mayor flexibilidad.

El EFD es operativo para aplicar el campo eléctrico al sitio de tratamiento, y generalmente comprende uno o más electrodos de contacto (denominados también "contactos eléctricos" para acoplar la señal suministrada por los EFG al sitio de tratamiento. Los términos "electrodo de contacto" y "contacto eléctrico" deben considerarse sinónimos.

Por ejemplo, el EFD puede comprender electrodos de aguja para insertar en el tejido en el sitio de tratamiento. Las agujas pueden fabricarse en cualquier material adecuado (por ejemplo, un material hipoalergénico). Dichos materiales pueden comprender cualquier combinación de acero inoxidable, platino o estructuras con revestimiento de platino, electrodos recubiertos de carbono tipo diamante u otro de los materiales adecuados conocidos dentro de la técnica. Como alternativa, los electrodos de contacto del EFD pueden comprender las partes conductoras de una placa de contacto fijadas a la superficie del tejido en la zona situada en los alrededores del sitio de tratamiento. Otras configuraciones de EFD pueden comprender una combinación de placas y agujas conductoras.

Debe tenerse en cuenta que el término "aguja" en el contexto de este documento pretende comprender cualquier elemento en forma de varilla, tal como una clavija, una varilla o un lápiz. En consecuencia, los contactos eléctricos pueden adoptar dicha forma general y no presentan necesariamente un extremo en punta o afilado.

Debe observarse también que no es necesario que todos los electrodos de contacto se hallen en el entorno inmediato del sitio de contacto. Por ejemplo, si así lo exige una aplicación terapéutica particular, el EFD puede comprender un único electrodo de contacto en el sitio de tratamiento y un segundo electrodo de contacto más distante que, por ejemplo, puede mantenerse conectado al potencial de tierra.

La figura 2A es una vista lateral esquemática que representa en detalle una configuración de EFD adecuada para utilizar en el dispositivo de terapia tumoral 1 representado en la figura 1A o un dispositivo de terapia tumoral 2 representado en la figura 1B. El EFD 8 representado en la figura 2A comprende el cuerpo del EFD 30 y un par de agujas paralelas 32. El cuerpo del EFD es operativo para sostener las agujas y asimismo contiene sensores para determinar los parámetros descritos anteriormente, utilizando técnicas estándar. Las señales de los EFG se encaminan desde el cableado 24 hasta las agujas 32 por medio de conexiones (no representadas) situadas en el interior del cuerpo del EFD 30. En funcionamiento, las agujas 32 se comportan como un par de contactos eléctricos que se insertan dentro del tejido que rodea el sitio de tratamiento, y el campo eléctrico generado por los EFG se aplica de la forma deseada. La separación de las agujas puede elegirse basándose en el tamaño del sitio de tratamiento o la intensidad de campo eléctrico necesaria para una tensión determinada suministrada por los EFG.

Las figuras 2B y 2C son unas vistas esquemáticas que representan dos ejemplos de orientaciones del EFD representado en la figura 2A en funcionamiento. En la figura 2B, las agujas 32 se introducen en el tejido 34 en una dirección que generalmente es perpendicular a la superficie del tejido 35, de tal forma que las agujas quedan situadas a ambos lados del sitio de tratamiento 36 (por ejemplo, un tumor). En la figura 2C, las agujas 32 se introducen en el tejido 34 en una dirección que generalmente es paralela a la superficie del tejido 35, de tal forma que las agujas quedan situadas a ambos lados del sitio de tratamiento 36. La orientación preferida dependerá del acceso al sitio de tratamiento y las características geométricas de este, siendo adecuados otros ángulos de introducción en otras situaciones.

Para algunas aplicaciones por ejemplo, si el sitio de tratamiento 36 se halla particularmente cerca de la superficie del tejido 34 o si el tejido que se va a tratar sobresale de la superficie (por ejemplo, cuando se trata un lunar), no es necesario insertar en el tejido las agujas 32 que componen los contactos eléctricos, sino sujetarlas contra este. No obstante, para dichas aplicaciones tal vez sea preferible utilizar un electrodo de placa de contacto eléctrico, como el descrito más adelante.

Además, es evidente que no siempre es necesario utilizar electrodos rectos, sino que las configuraciones de electrodos doblados, curvos u ondulados pueden ser más adecuadas para ciertos propósitos (por ejemplo, los descritos anteriormente).

La configuración de contacto eléctrico del EFD representada en la figura 2A (un par de agujas paralelas) es relativamente simple. En otras situaciones, resultará adecuado utilizar otras configuraciones de contacto eléctrico del EFD, tales como las que se describen más adelante. Por ejemplo, si el sitio de tratamiento está distribuido, un conjunto de contactos eléctricos controlados adecuadamente pueden generar, por todo el sitio de tratamiento, un campo eléctrico más uniforme que el generado con un único par de electrodos. En otros casos, puede necesitarse un campo eléctrico localizado frente a un campo eléctrico de fondo más bajo, y entonces las configuraciones de contacto eléctrico del EFD pueden diseñarse adecuadamente basándose en las leyes bien entendidas de la electrodinámica y la electrostática.

Los aspectos del EFD que no se describen de manera específica en los ejemplos siguientes, tales como los cables que acoplan el EFD con los EFG, son similares a los de la descripción anterior y pueden deducirse a partir de estos. Algunas de las configuraciones siguientes son de amplia aplicabilidad, mientras otras son de aplicabilidad más específica. Algunas aplicaciones terapéuticas pueden requerir el diseño de contactos eléctricos de EFD de características geométricas diferentes y, entonces, estas pueden basarse o no en combinaciones de las características representadas en los siguientes ejemplos. Como se ha indicado anteriormente, la escala geométrica del EFD también puede basarse en los requisitos específicos de cada aplicación. Dentro de la técnica, se conocen otros conjuntos de electrodos (véase, por ejemplo, los documentos US nº 5.720.921, WO 99/62592, WO 98/56893, US nº 6.041.252 y US nº 5.873.849), y el dispositivo descrito en el presente documento puede emplear una o varias de dichas configuraciones de electrodos.

La figura 3A es una vista en perspectiva esquemática de un EFD 8 con una configuración de electrodos que comprende un conjunto de seis agujas paralelas 32. La figura 3B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 3A y representa la disposición de las agujas en un plano perpendicular a los ejes de extensión. Las agujas 32 están acopladas respectivamente a los EFG, de tal manera que los pares de agujas opuestos aportan los contactos eléctricos para la aplicación de tres señales de generación de campo eléctrico independientes de los EFG. Como en todos los ejemplos descritos a continuación, la secuencia en la que se aplican las señales a los electrodos de aguja (es decir, simultáneamente, una tras otra o con retardo de fase) puede ser controlada por el controlador 4 o los EFG 6. Pueden utilizarse números diferentes de pares de agujas y disponerse similarmente en un conjunto poligonal (por ejemplo, 2, 4 ó 5 pares de agujas en una distribución cruzada, octagonal o decagonal) dependiendo de las particularidades del área de tejido que se va a tratar. En otros ejemplos, las agujas no están dispuestas de manera regular.

La figura 4A es una vista en perspectiva esquemática de un EFD 8 con una configuración de electrodos que comprende un conjunto de tres agujas paralelas 32. La figura 4B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 4A y representa la disposición de agujas en un plano perpendicular a los ejes de extensión. En este ejemplo, las agujas 32 están acopladas a los EFG, de tal manera que se pueden generar campos eléctricos entre dos agujas cualesquiera de las tres (o en realidad, puede aplicarse simultáneamente una tensión a las tres agujas) para obtener una configuración de campo eléctrico deseada en el sitio de tratamiento.

Como en el ejemplo de EFD representado en las figuras 4a y 4b, en el que el campo eléctrico puede generarse entre cualquier combinación de los electrodos de contacto, debe tenerse en cuenta que también pueden generarse campos eléctricos entre cualquier combinación de los electrodos de contacto de un EFD que contiene más de tres electrodos de contacto. En un caso, considerado solo a título de ejemplo, aunque las seis agujas del EFD representado en las figuras 3a y 3b estén emparejadas para formar tres circuitos independientes, también podría emplearse una disposición similar de las agujas con unos EFG configurados para aplicar la señal a cualquier combinación de las agujas y generar el campo eléctrico deseado en el sitio de tratamiento.

La figura 5A es una vista en perspectiva esquemática de un EFD 8 con una configuración de electrodos que comprende un conjunto de siete agujas paralelas 32, en el que una aguja central está rodeada por seis agujas dispuestas formando un anillo externo. La figura 5B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 5A, que representa la disposición de agujas en un plano perpendicular a los ejes de extensión. Como se ha descrito anteriormente, las señales pueden aplicarse a cualquier número de agujas en cualquier combinación. Por ejemplo, puede aplicarse un campo eléctrico entre la aguja central y una de las agujas externas, entre la aguja central y dos o más de las agujas externas o solamente entre combinaciones de las agujas externas. Asimismo, puede variarse la dirección del campo eléctrico aplicado.

La figura 6A es una vista en perspectiva esquemática de un EFD 8 con una configuración de electrodos que comprende un conjunto de seis agujas paralelas 32 que rodean una aguja central que está vacía en su interior 40. La figura 6B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 6A, que representa la disposición de agujas en un plano perpendicular a los ejes de extensión. La aguja central hueca 40 puede establecer una transferencia de fluidos con un recipiente 42 contenido en el cuerpo del EFD 30. El recipiente 42 está acoplado a un dispositivo de jeringa (no representado), para forzar la entrada del fluido en el recipiente 42 o atraerlo hacia el mismo a través de la aguja central hueca 40. Esto permite, por ejemplo, la administración de un agente inductor de muerte celular o una solución salina para eliminar las células muertas o de otros fármacos en el sitio de tratamiento, o la extracción de muestras del sitio de tratamiento durante la terapia. En la práctica, el recipiente 42 puede comprender simplemente una cámara de flujo hermética para permitir la transferencia de fluido entre la aguja hueca 40 y una jeringa convencional u otro tipo de depósito.

En el caso de un EFD con capacidad para administrar un agente inductor de muerte celular, una solución salina u otro fármaco en el sitio de tratamiento, o para extraer muestras del sitio de tratamiento, estas acciones pueden realizarse bajo control del controlador. Por ejemplo, en aplicaciones que conllevan la administración de un agente inductor de muerte celular, el dispositivo de terapia tumoral puede comprender además, de manera opcional, un recipiente que contiene el agente inductor de muerte celular que se administra (al EFD por medio de un tubo) mediante una bomba mecánica (o presurizando de otra forma la fuente de agente inductor de muerte celular) bajo control del controlador 4. Por ejemplo, si resulta adecuado para una aplicación terapéutica particular, el controlador puede configurarse para administrar el agente inductor de muerte celular al sitio de tratamiento al mismo tiempo que se aplica un campo eléctrico. En otras situaciones, puede resultar adecuado evitar la administración simultánea del agente inductor de muerte celular y un campo eléctrico. Bajo control del controlador, la administración del agente inductor de muerte celular puede regularse de cualquier manera que resulte adecuada para los requisitos de una terapia particular y que pueda ser sensible a las particularidades del campo eléctrico o los ultrasonidos aplicados. Análogamente, el controlador puede configurarse para favorecer el bombeo de solución salina con el objetivo de evacuar las células muertas o para extraer muestras del sitio de tratamiento, en cualquier etapa adecuada de la terapia.

Pueden aplicarse los campos eléctricos que se deseen entre cualquiera de las agujas, incluida la aguja central hueca. En otras configuraciones de EFD, puede existir más de una aguja hueca. Por ejemplo, si alguna o todas las agujas del anillo externo de seis agujas representado en las figuras 6A y 6B son huecas y capaces de establecer una transferencia de fluidos con el recipiente 42, puede inyectarse un fluido en una serie de ubicaciones situadas dentro o alrededor del sitio de tratamiento (o extraerse de estas). Como alternativa, el cuerpo del EFD 30 puede contener varios recipientes separados, de tal forma que puedan inyectarse fluidos diferentes en ubicaciones diferentes situadas dentro o alrededor del sitio de tratamiento, u obtener muestras de dichas ubicaciones.

La figura 7A es una vista en sección esquemática de un EFD 8 con una configuración de electrodos que comprende una matriz que, en este ejemplo, comprende cincuenta y cinco agujas paralelas 32 dispuestas en una matriz rectangular regular. La figura 7B es una vista en planta esquemática del EFD representado en la figura 7A, que representa la disposición de agujas en un plano perpendicular a los ejes de extensión. Como en otros ejemplos, se pueden aplicar campos eléctricos entre cualquier combinación de agujas 32 para obtener el campo eléctrico deseado en el sitio de tratamiento, bajo control del controlador 4 o los EFG 6.

En los ejemplos descritos anteriormente, las agujas que componen los electrodos de contacto no están aisladas a lo largo de los ejes de extensión. En algunas situaciones, por ejemplo, cuando se necesita el contacto eléctrico con un sitio de tratamiento que se halla cerca de un tejido con el que debe evitarse el contacto eléctrico, algunas o todas las agujas pueden estar parcialmente aisladas.

La figura 8A representa una vista lateral esquemática de dos electrodos de aguja 32 insertados en tejido 34 para acceder a un sitio de tratamiento 36. En este ejemplo, hay una capa de tejido esencial 50 (es decir, una capa que no debe establecer contacto eléctrico con las agujas) situada justo debajo de la superficie del tejido 35. Las agujas 32 están aisladas eléctricamente a lo largo de una parte de su longitud mediante aisladores 48. Los aisladores pueden fabricarse en cualquier material no conductor o poco conductor adecuado por ejemplo, PTFE que pueda pegarse a las agujas 32.

En una forma de realización preferida, el grado de aislamiento de la aguja es variable y puede ajustarse. Esto puede realizarse aplicando diferentes grosores de material aislante o ajustando la extensión de la aguja que se recubre con el material aislante. De esta forma, la aguja puede recubrirse de material aislante a lo largo de una parte variable de su longitud. De forma alternativa o adicional, el material aislante puede formar un manguito que cubre la aguja, siendo la longitud del manguito ajustable o extensible. Para este propósito, puede utilizarse cualquier material aislante adecuado, por ejemplo, material que es deformable.

Se mantiene una trayectoria de conducción dentro del aislador 48, para que las señales de campo eléctrico de los EFG se acoplen a la parte inferior de las agujas 32 situadas dentro del tejido 34 y apliquen un campo eléctrico al sitio de tratamiento 36. Los aisladores 48 aseguran que no se establezca ningún flujo de corriente dentro de la capa de tejido esencial 50 y, por lo tanto, evita los posibles daños a esta. Las característica de aislamiento de algunas o todas las agujas a lo largo de una parte de su longitud puede utilizarse fácilmente en combinación con cualquier configuración de agujas, tales como las descritas anteriormente.

La figura 8B es una vista lateral esquemática de otro ejemplo, en el que una zona de tejido esencial 50 se protege contra el flujo de corriente impulsado por el campo eléctrico. Debido a las características geométricas particulares del sitio de tratamiento y el tejido esencial de este ejemplo, las agujas 32 son de longitudes diferentes. Como en el caso anterior, las agujas se aíslan mediante aisladores 48 para asegurar que las señales de campo eléctrico de los EFG no impulsen el flujo de corriente hacia el tejido esencial 50, sino hacia el sitio de tratamiento 36.

Además de proporcionar directamente la fuente para el campo eléctrico en la zona situada en los alrededores del sitio de tratamiento, las agujas también pueden utilizarse para acoplar la señal de los EFG con unos electrodos de contactos implantados previamente.

La figura 9 es una vista en sección esquemática de dos agujas 32, también aisladas eléctricamente a lo largo de una parte de sus longitudes mediante aisladores 48, que se han insertado dentro del tejido 34 para establecer contacto con unos contactos receptores 52 conectados a unos electrodos de contacto 54, como se representa en la figura. Esta disposición es adecuada, por ejemplo, en caso de que el sitio de tratamiento 36 se extienda sustancialmente a lo largo de un plano paralelo a la superficie del tejido 35, pero el tipo de acceso representado en la figura 2C no sea viable.

Los electrodos de contacto 54 de este ejemplo se implantan quirúrgicamente en el tejido 34, donde pueden permanecer durante un período prolongado para permitir un tratamiento regular y repetido. Los implantes quirúrgicos pueden ser biodegradables para evitar la necesidad de realizar su extracción quirúrgica. Durante una sesión de tratamiento, las agujas 32 se insertan dentro del tejido 34 para establecer contacto con unos contactos receptores 52. El tamaño del contacto receptor vendrá determinado por la capacidad de reposicionar las agujas en subsiguientes inserciones. Las agujas pueden ser accionadas por resorte para facilitar el contacto eléctrico. Una vez se ha establecido el contacto, los electrodos 54 se acoplan con los EFG por medio de las agujas 32, y entonces pueden aplicarse campos eléctricos al sitio de tratamiento cuando sea necesario.

No es necesario que la configuración del EFD, que es como cualquiera de las descritas anteriormente, funcione con el EFD situado fuera del tejido, sino que puede introducirse en el cuerpo dentro del tejido, utilizando ejemplares adecuadamente reducidos montados en un dispositivo de cirugía laparoscópica, endoscópica, broncoscópica o cualquier tipo de dispositivo quirúrgico de cerradura, para facilitar el acceso a un sitio de tratamiento interno.

Como se ha indicado anteriormente, los electrodos de contacto del EDS 8 también pueden comprender partes conductoras de una placa de contacto. Dichas configuraciones son probablemente las más adecuadas cuando el sitio de tratamiento está en la superficie del tejido o cerca de la misma.

La figura 10A es una vista en planta esquemática de una placa de contacto 40 de un EFD (cuerpo principal del EFD no representado) aplicada a la superficie de un tejido 35. La figura 10B es una vista en sección esquemática en mayor detalle de la placa de contacto 40, obtenida en un plano que es perpendicular a la vista en planta representada en la figura 10A. Los electrodos de contacto comprenden dos partes conductoras alargadas 33 adheridas de forma fija a la placa de contacto 40 que pueden mantenerse en contacto con la superficie del tejido por ambos lados del sitio de tratamiento 36. La placa de contacto puede ser autoadhesiva para ayudar a mantener el contacto con la superficie del tejido 35. A continuación, se aplica, cuando es necesario, una señal de campo eléctrico generada por los EFG al sitio de tratamiento, por medio del cableado (no representado) situado dentro del cuerpo del EFD y la placa de contacto. Como antes, la separación de los electrodos de contacto se elige, basándose en el tamaño del sitio de tratamiento o la intensidad de campo eléctrico necesaria, como una función de la tensión suministrada por los EFG.

Además de aplicar un campo eléctrico directamente a la superficie de un tejido, un beneficio adicional de un EFD basado en placa de contacto es que las partes conductoras pueden formarse utilizando muchas técnicas de fabricación de circuitos impresos convencionales, tales como, por ejemplo, la litografía y el grabado estándar, el estarcido, la serigrafía y otras técnicas de impresión estándar utilizadas en conjunción con una tinta conductora (incluida la impresión por chorro de tinta o la impresión láser con un tóner conductor), o incluso dibujando directamente con un bolígrafo de tinta conductora. Esto permite realizar con facilidad configuraciones geométricas de electrodos de contacto para casos muy específicos. Por ejemplo, cuando se utiliza una placa de contacto de circuito impreso, es posible obtener sin dificultades una configuración de electrodos que contiene varios contactos de formas irregulares adecuados para adaptarse a un sitio de tratamiento de características geométricas sumamente específicas, mientras se reduce al mínimo la exposición no deseada del tejido circundante a los campos eléctricos.

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La placa de contacto, tanto si está impresa con los circuitos como si no lo está, puede comprender preferentemente un material que presenta una baja absorción de ultrasonidos, para que no se produzca una atenuación significativa de los ultrasonidos.

Las figuras 11A, 11B y 11C representan esquemáticamente en una vista en planta tres ejemplos de configuraciones de electrodos que pueden implementarse fácilmente con una placa de contacto de circuito impreso. En cada caso, la configuración de electrodos puede acoplarse a los EFG como se ha descrito anteriormente, y pueden aplicarse diferentes combinaciones de campos eléctricos. Como se deducirá, esencialmente no existe ningún límite en el número de configuraciones de electrodos de contacto que se pueden formar.

La figura 12 es una vista en sección esquemática de un EFD 8 que comprende varias de las características descritas anteriormente. El EFD 8 comprende un cuerpo principal que admite y acopla las señales de campo eléctrico de los EFG con los electrodos de contacto. Los electrodos de contacto comprenden dos partes conductoras 33, montadas sobre una placa adhesiva 40, y cuatro agujas 32, que se aíslan mediante aisladores 48. Como se ha descrito anteriormente, pueden aplicarse campos eléctricos entre cualquier combinación de electrodos de contacto 32 y 33 elegida para obtener el patrón deseado de campo eléctrico en el sitio de tratamiento.

Aunque las configuraciones de electrodos del EFD anteriores se han descrito en el contexto del dispositivo de terapia tumoral 2 representado en la figura 1B, debe tenerse en cuenta que las configuraciones de electrodos descritas también pueden utilizarse en otras aplicaciones. Por ejemplo, estas configuraciones pueden emplearse adecuadamente en la electroporación, electrofusión, acupuntura, electroterapia, etc. En consecuencia, se da a conocer un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende un número de electrodos de contacto, por lo menos uno de los cuales es hueco, para insertar en una masa tisular, siendo por ejemplo dicho número igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 o superior a 10, 20, 30, 40 ó 50.

Se da a conocer asimismo un componente de aplicación de campo eléctrico en el que los electrodos de contacto están situados en los vértices de un polígono regular, por ejemplo, un triángulo, un cuadrado, un pentágono, un hexágono, un heptágono, etc. También se da a conocer un componente de aplicación de campo eléctrico, en el que los diversos electrodos de contacto están situados en los vértices de un polígono regular y en el que uno o más electrodos de contacto adicionales están situados dentro de la circunferencia del polígono y uno o más de los electrodos de contacto adicionales pueden ser huecos también.

Además, se da a conocer un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende un conjunto de electrodos de contacto, por lo menos uno de los cuales es hueco, y en el que los electrodos de contacto están dispuestos formando una rejilla de electrodos de contacto. Cualquiera de los electrodos de contacto precedentes puede estar aislado por lo menos a lo largo de una parte de su longitud. También se da a conocer un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende un conjunto de electrodos de contacto formados a partir de las partes conductoras de una placa de contacto. Además, se da a conocer un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende combinaciones de los electrodos de contacto descritos anteriormente para insertar en una masa tisular y los electrodos de contacto formados a partir de las partes conductoras de una placa de contacto. Se da a conocer también un componente de aplicación de campo eléctrico que comprende una placa de contacto con baja absorción de ultrasonidos.

Circuitos de generación de señales de ultrasonidos terapéuticos (USG)

Los USG 10 son operativos para generar una señal de ultrasonidos que se transmite al componente de aplicación de ultrasonidos (USD) 12 por medio de un cableado 26 para administrar los ultrasonidos en la zona situada en los alrededores del USD. En funcionamiento, la zona situada en los alrededores del USD generalmente será un sitio de tratamiento que estará por lo menos parcialmente superpuesto al sitio de tratamiento del ESD descrito anteriormente. Las características geométricas del USD determinarán la distribución de la energía de ultrasonidos en el sitio de tratamiento, como se describirá en mayor detalle más adelante.

Los USG pueden ser operativos para generar un amplio rango de señales de ultrasonidos. Por ejemplo, la frecuencia de la señal de ultrasonidos puede variarse y la amplitud puede modularse para obtener formas de onda moduladas oscilatorias, de estado estacionario, pulsadas, pulsadas con disminución exponencial, generalizadas periódicas o aleatorizadas, o una combinación de estas. Las formas de onda provistas pueden presentar un rango de períodos de tiempo y amplitudes características que dependerán de los requisitos terapéuticos de una aplicación particular. Los circuitos de generación de señales de ultrasonidos pueden funcionar de cualquier manera conocida para generar la señal de ultrasonidos deseada. Por ejemplo, los USG pueden comprender uno o más generadores de formas de onda arbitrarias programables (acoplados a un amplificador de tensión, un amplificador de corriente o a ambos para generar una señal capaz de activar un transductor de ultrasonidos de la manera conocida dentro de la técnica) bajo control del controlador 4. Como alternativa, los EFG pueden comprender un dispositivo específico para una aplicación, tal como el generador de ultrasonidos RICH-MAR THERASOUND 3 SERIES.

En el ejemplo representado en la figura 1, los USG son operativos para generar una señal de ultrasonidos de salida con una frecuencia portadora de entre 0,1 y 2 MHz y una amplitud capaz de activar el transductor o los transductores acoplados para suministrar un flujo de energía de ultrasonidos medio (denominado también "densidad de potencia") de 0,1 a 7 W/cm^{2} al sitio de tratamiento. La amplitud de la señal portadora puede modularse de la forma descrita anteriormente con un período de tiempo característico seleccionable de 1 ms a 20 minutos. Dependiendo de la aplicación deseada, los USG pueden generar también varias señales de ultrasonidos dependientes o independientes, por ejemplo, para suministrar varias señales de fases diferentes al USD o para suministrar varias señales independientes con formas de onda diferentes (tales como ondas pulsadas u ondas continuas) o tiempos de aplicación diferentes al USD.

El USD también es capaz de suministrar al controlador medidas que especifican la cantidad de energía de ultrasonidos depositada en el sitio de tratamiento mediante técnicas conocidas dentro de la técnica. Estos parámetros, y otros adecuados para una aplicación particular, pueden utilizarse para elaborar un perfil de descarga de ultrasonidos. El controlador 4 almacena los perfiles de descarga de ultrasonidos para un subsiguiente análisis. Además, basándose en los parámetros del perfil de descarga de ultrasonidos (así como en parámetros operativos similares relacionados con los EFG e información de diagnóstico obtenida del DDS, descrito en mayor detalle más adelante), el controlador 4 puede ejercer un control sensible sobre el funcionamiento. En otras formas de realización, los aspectos del control por retroalimentación pueden ser internos a los USG.

Componente de aplicación de señales de ultrasonidos terapéuticos (USD)

En funcionamiento, el USD 12 es operativo para hacer interactuar las señales de ultrasonidos generadas por los USG 10 con el tejido del sitio de tratamiento y, en el ejemplo descrito en la presente memoria, el USD presenta un acoplamiento intercambiable con los USG, de tal forma que es posible emplear diferentes configuraciones de USD cuando las aplicaciones específicas así lo exijan. El USD generalmente comprenderá uno o más transductores de ultrasonidos para acoplar los ultrasonidos obtenidos a partir de las señales de ultrasonidos generadas por los USG con el sitio de tratamiento.

La figura 13A y la figura 13B son unas vistas laterales esquemáticas que representan dos formas de acoplar un USD 12 con la superficie de un tejido 35 para exponer un sitio de tratamiento 36 a los ultrasonidos. Como se ha indicado anteriormente, el USD comprende un transductor de ultrasonidos (no representado) para generar ultrasonidos como respuesta a las señales de los USG. En estos ejemplos, el transductor de ultrasonidos está diseñado para generar un haz cilíndrico indicado esquemáticamente mediante los frentes de onda planos 60. La densidad de potencia de ultrasonidos decae cuando se incrementa la distancia desde el transductor, de una manera que depende de las características de absorbancia de los ultrasonidos del tejido circundante 34, el sitio de tratamiento 36 y cualquier otro material intermedio. Pueden emplearse frecuencias de ultrasonidos particulares para aumentar la absorción de los ultrasonidos en el sitio de tratamiento con respecto al tejido circundante. En la figura 13A, un gel de contacto mediador 58 facilita el acoplamiento acústico entre el USD y la superficie del tejido. En la figura 13B, una placa adhesiva mediadora 59 facilita tanto el acoplamiento mecánico como el acústico entre el USD y la superficie del tejido.

Para reducir al mínimo los posibles daños al tejido circundante, puede ser deseable generar un haz de ultrasonidos focalizado para que de ese modo la densidad de la potencia del tejido circundante sea inferior a la del sitio de tratamiento.

La figura 14 es una vista lateral esquemática que representa un USD 12 acoplado a la superficie de un tejido 35, por medio de un depósito de presión de contacto 68 lleno de un gel mediador 64. El depósito de presión de contacto está abierto hacia la superficie del tejido 35, pero por lo demás es hermético, de tal forma que la conexión 66 con una bomba de vacío (no representada) hace disminuir la presión del gel mediador y provoca la deformación de la superficie del tejido dentro del depósito de presión de contacto 68, como se representa en la figura.

El USD genera un haz cilíndrico de ultrasonidos como el indicado anteriormente. No obstante, la naturaleza curva de la superficie del tejido crea condiciones de refracción diferentes para los frentes de onda planos 60, de tal forma que los frentes de onda se curvan, y por consiguiente el haz de ultrasonidos se focaliza, dentro del tejido 34. Entonces, puede considerarse que la superficie de tejido deformada adopta una configuración de lente para focalizar los ultrasonidos. La presión en el interior del depósito de presión por contacto 68 puede ajustarse para variar la deformación de la superficie del tejido y, por lo tanto, ajustar el punto focal de los ultrasonidos para que coincida con el sitio de tratamiento 36.

La figura 15 es una vista en perspectiva esquemática de la parte inferior de otro ejemplo de USD. En este ejemplo, el USD comprende tres transductores de ultrasonidos 70a, 70b y 70c. Los transductores de ultrasonidos generan haces cilíndricos de ultrasonidos como respuesta a las señales de ultrasonidos de los USG. Cada uno de los tres transductores de ultrasonidos puede recibir la misma señal, señales independientes diferentes o una señal común pero con retardos de fase diferentes. El USD se mantiene sujeto contra la superficie del tejido 35, de tal forma que los respectivos haces de ultrasonidos de cada uno de los transductores converge en el sitio de tratamiento 36. Como con la focalización anterior, esto permite aplicar al sitio de tratamiento una cantidad de potencia mayor que la que se aplica a un correspondiente volumen de tejido circundante 34. Los transductores individuales pueden estar en contacto a través de un gel mediador para dotar de buenas características de transmisión de ultrasonidos a un amortiguador espacial.

Aparte del ejemplo de forma de realización representada en la figura 15, se pueden utilizar muchas otras configuraciones en las que se emplean varios transductores de ultrasonidos (que son activados por unos USG adecuadamente controlados) en un USD, dependiendo de la aplicación. Otros ejemplos que cabe citar comprenden un conjunto de transductores montados sobre una superficie cóncava deformable para realizar una focalización variable o un conjunto plano de transductores en fase activado por los USG bajo control del controlador 4, para realizar la focalización por medio de una puesta en fase adecuada de las señales de ultrasonidos con los transductores individuales.

Aunque las configuraciones de USD anteriores se han descrito en el contexto del dispositivo de terapia tumoral 2 representado en la figura 1B, debe tenerse en cuenta que las configuraciones de USD descritas también pueden utilizarse independientemente en otras aplicaciones en las que se desea administrar ultrasonidos (por ejemplo, en la sonoporación, el diagnóstico por ultrasonidos, etc.). En consecuencia, se da a conocer un componente de aplicación de ultrasonidos que comprende un transductor de ultrasonidos acoplado a un depósito de presión de contacto dispuesto para deformar la superficie de un tejido y focalizar dichos ultrasonidos.

Circuitos de generación de señales de ultrasonidos de diagnóstico (DG) y componente de aplicación de ultrasonidos diagnósticos y exploración (DDS)

El dispositivo de terapia tumoral 2 también comprende unos medios de ultrasonidos diagnósticos que, con referencia a la figura 1B, comprenden los DG 14 acoplados al DDS 16 mediante el cableado 28. Debe tenerse en cuenta que los medios de ultrasonidos diagnósticos son opcionales, y que las capacidades de ablación de tejidos y células del dispositivo descrito en el presente documento no dependen de su presencia.

Los DG y el DDS pueden comprender unidades convencionales que facilitan imágenes de ultrasonidos convencionales del sitio de tratamiento y el tejido circundante. Estas imágenes pueden obtenerse antes de introducir el EFD o el USD para facilitar el guiado, o pueden obtenerse al mismo tiempo que se introducen el EFD y el USD para proveer información de diagnóstico continua durante el tratamiento. Si se desea que los medios de ultrasonidos diagnósticos faciliten información durante todo el procedimiento de tratamiento, el DDS puede combinarse con un USD o un EFD para formar una única unidad.

La figura 16 es una vista en sección esquemática de un USD 8 y un DDS 16 combinados. Aunque en este ejemplo el DDS 16 contiene su propio transductor de ultrasonidos (no representado), el DDS también puede basarse en señales de ultrasonidos generadas por el USD y, entonces, el componente de DDS sólo necesita contener un escáner de ultrasonidos.

La información de diagnóstico facilitada por el DDS puede acoplarse al controlador 4 para permitir el control activo de los parámetros de tratamiento (por ejemplo densidad de potencia de ultrasonidos aplicada, intensidad de campo eléctrico, enfoque, posicionamiento, duración del tratamiento, etc.) como respuesta a las condiciones del sitio de tratamiento establecidas por los requisitos de una aplicación terapéutica particular. La información presentada por el DDS puede asegurar también un posicionamiento continuo perfeccionado del EFD o el USD durante sus respectivas fases de tratamiento.

Por motivos prácticos, especialmente cuando la aplicación requiere que el sitio de tratamiento se exponga a campos eléctricos y ultrasonidos de forma simultánea, alternativa o en rápida sucesión, puede ser preferible combinar el USD y el EFD en un solo cabezal de aplicación.

La figura 17 es una vista esquemática que representa un ejemplo de cabezal de aplicación combinado con un USD y un EFD 80, para la aplicación a un sitio de tratamiento 36 que está situado a cierta profundidad desde la superficie de un tejido 35. El USD 12 está rodeado por un EFD 8, siendo ambos dispositivos similares a los descritos anteriormente y deducibles a partir de las descripciones de estos. El cableado 25 encamina las señales entre el controlador 4, los EFG 6 y los USG 10. En funcionamiento, el cabezal de aplicación combinado 80 está situado de tal forma que las agujas 32 del EFD 8 se disponen a ambos lados del sitio de tratamiento 36 dentro del tejido 34, y el USD 12 se dispone contra la superficie del tejido 35 encima del sitio de tratamiento. Aunque en este ejemplo de cabezal de aplicación combinado 80 se emplean solo configuraciones de EFD y USD relativamente simples, el cabezal también puede comprender cualquiera de las características adicionales resumidas anteriormente (por ejemplo, varios transductores, focalización de ultrasonidos, electrodos de placa de contacto, agujas huecas, etc.).

La figura 18 es una vista esquemática que representa otro ejemplo de cabezal de aplicación de USD y EFD combinados 80 para aplicar a un sitio de tratamiento situado en la superficie de un tejido 35. Los ejemplos descritos anteriormente facilitarán la comprensión del USD 12 y el EFD 8. También se incorpora un DDS 16 que se monta sobre el USD de una manera que se deducirá a partir de la descripción anterior de la figura 16. El EFD de este ejemplo comprende un cuerpo de EFD 30 que sostiene seis electrodos de contacto (una matriz de cuatro agujas 32 y dos partes conductoras 33 de una placa de contacto intermedia (no representada)). En funcionamiento, el cabezal de aplicación combinado está dispuesto de tal forma que es posible aplicar un campo eléctrico al sitio de tratamiento 36. Como en el caso anterior, el campo eléctrico puede aplicarse entre cualquier permutación de electrodos de contactos 32 y 33 para obtener la configuración de campo eléctrico y la dependencia temporal deseadas y predeterminadas por un operador, o determinadas activamente por el controlador 4 como respuesta a las condiciones del sitio de tratamiento. El componente de transductor (no representado) del USD se separa de la superficie del tejido 35 mediante el cuerpo del EFD.

Controlador

El controlador controla las amplitudes, las formas de onda, los encaminamientos de señales específicas para varios electrodos de contacto o transductores, las duraciones del tratamiento, etc., aplicadas por los USG y los EFG al USD y el EFD, respectivamente, enviando señales de control adecuadamente codificadas a los USG o los EFG que contienen circuitos estándar que permiten a éstos dar la respuesta correspondiente.

Empleando un controlador centralizado, los componentes de campo eléctrico y ultrasonidos del dispositivo de terapia tumoral pueden coordinarse para ofrecer el tratamiento más efectivo. Por ejemplo, la energía de campo eléctrico puede suministrarse a un nivel que depende de, y está relacionado con, la deposición de energía de ultrasonidos y viceversa. El controlador puede ser operativo para asegurar que la deposición de la energía de ultrasonidos o de campo eléctrico, o la deposición de energía combinada, no sobrepase un nivel predeterminado que podría provocar daños tisulares.

El controlador también es operativo para aplicar los ultrasonidos y el campo eléctrico en la secuencia necesaria. Por ejemplo, algunas terapias pueden requerir una rápida alternancia entre la aplicación de los ultrasonidos y del campo eléctrico, algunas pueden requerir que ambas aplicaciones sean simultáneas y algunas pueden requerir una exposición prolongada a uno u otro tipo de energía. Asimismo, el controlador es operativo para reaccionar ante las entradas del usuario, la información de diagnóstico del DDS o los perfiles de descarga almacenados previamente, para cambiar cualquiera de los parámetros operativos (tales como la focalización de los ultrasonidos, la amplitud del campo eléctrico, la duración del tratamiento, etc.) y generar parámetros terapéuticos continuamente optimizados. Estas funciones pueden realizarse utilizando algoritmos adecuados diseñados de conformidad con requisitos terapéuticos específicos.

El controlador 4 es operativo para facilitar la generación manual o automática de campos eléctricos por los EFG (y la subsiguiente aplicación a través del EFD) y la generación de ultrasonidos por los USG (y la subsiguiente aplicación a través del USD). Como se ha indicado anteriormente, el controlador puede modificar el funcionamiento de los USG o los EFG basándose en los perfiles de descarga registrados previamente, o actualmente sometidos a muestreo, o el diagnóstico obtenido a partir del DDS.

El controlador 4 también puede presentar visualmente parámetros relativos al funcionamiento de los EFG (tales como la tensión predeterminada, la tensión aplicada, el campo eléctrico previsto, la densidad actual en la zona situada en los alrededores del EFD, la deposición de energía en el sitio de tratamiento, la duración del tratamiento, la impedancia en el sitio de tratamiento, la resistencia interna de los circuitos, etc. o combinaciones de estos) y parámetros relativos al funcionamiento de los USG (tales como la densidad de potencia de salida, la densidad de potencia prevista en el sitio de tratamiento, la distancia hasta el sitio de tratamiento, la duración del tratamiento, la frecuencia de modulación, la frecuencia de ultrasonidos, etc. o combinaciones de estos) para ayudar al operador a supervisar la terapia. Estos parámetros pueden determinarse mediante técnicas estándar. El controlador es operativo para modificar el funcionamiento de los ESG o los USD como respuesta a cualquiera de dichos parámetros de una manera adecuada para los requisitos y las aplicaciones terapéuticas particulares.

Hasta aquí la descripción en detalle del aparato. A continuación, se describen de forma general los procedimientos de sensibilización, electrosensibilización y disrupción, y asimismo se describen los ultrasonidos y los agentes inductores de muerte celular, para comprender mejor el procedimiento de ablación celular realizado por el aparato y las condiciones en las cuales dicho procedimiento puede realizarse y optimizarse. El conocimiento de dichos procedimientos descritos a continuación permite utilizar el aparato descrito de la manera más eficaz.

Sensibilización

Según un aspecto general, la sensibilización de las células se realiza para hacer que estas sean más sensibles que las células no sensibilizadas a la disrupción mediante un estímulo. En consecuencia, una célula "sensibilizada" es una célula que ha sido tratada para hacerla más sensible que una célula no sensibilizada a la disrupción por exposición a un estímulo. La disrupción de dichas células puede realizarse en el lugar deseado mediante exposición a un estímulo. Por lo tanto, se proporcionan en general unos medios de disrupción de una célula mediante exposición a un sensibilizador seguida de exposición a un disruptor. Pueden emplearse diversas combinaciones de sensibilizadores y disruptores.

Por ejemplo, la sensibilización puede realizarse exponiendo las células a los ultrasonidos. Preferentemente, la disrupción de dichas células sensibilizadas por ultrasonidos puede provocarse mediante una posterior exposición a un campo eléctrico. Este aspecto se ilustra en el ejemplo 11.

No obstante, la forma preferida de sensibilización es la electrosensibilización. La electrosensibilización se describe en la solicitud de patente internacional nº PCT/GB00/02848 (publicada con el número WO/01/07011) y se expone detalladamente en la sección siguiente de la presente memoria. Los estímulos de disrupción comprenden la luz láser y otras fuentes de energía, pero en una forma de realización muy preferida comprende los ultrasonidos.

En el aparato particular descrito en la presente memoria, la exposición de una célula a un campo eléctrico o los ultrasonidos generados por el dispositivo determinan la sensibilización de la célula. Preferentemente, el aparato es operativo para aplicar un campo eléctrico para sensibilizar la célula.

Electrosensibilización

El término "electrosensibilización" comprende la desestabilización de las células, de tal forma que estas se vuelven más sensibles a la disrupción mediante un estímulo (por ejemplo, los ultrasonidos). Por lo tanto, el aparato descrito en la presente memoria es operativo para electrosensibilizar las células.

En la electrosensibilización, la exposición de una célula a un campo eléctrico da por resultado la desestabilización de la membrana y la sensibilización de la célula a otros estímulos. La célula puede someterse a una exposición momentánea o una exposición prolongada a un campo eléctrico. El campo eléctrico puede aplicarse en forma de uno o más impulsos. Otra posibilidad es exponer las células a un campo constantemente presente, que puede variar en fuerza, intensidad, dirección, etc. La intensidad del campo eléctrico puede aumentarse o disminuirse, dependiendo de la resistencia o la fragilidad de las células del tejido de destino. El aparato descrito en la presente memoria se puede utilizar de diversas maneras para aplicar dichos campos eléctricos.

La electrosensibilización suele producirse sin necesidad de administrar ningún agente a la célula. La electroporación, que facilita la entrada de los agentes en la célula, se produce en presencia de un agente exógeno que se introduce en la célula y es sobradamente conocido en el ámbito de la técnica. Aunque, como se ha indicado anteriormente, pueden aplicarse otros agentes que favorecen la muerte celular a la célula para inducir su muerte, dichos agentes habitualmente no están presentes cuando tiene lugar la electrosensibilización.

En la presente memoria, la expresión "energía de campo eléctrico" es la energía eléctrica a la cual se expone una célula durante un procedimiento de electrosensibilización como los descritos en este documento. Preferentemente, el campo eléctrico tiene una intensidad comprendida de entre aproximadamente 1 Volt/cm y aproximadamente 10 kVolts/cm o más en condiciones in vivo (véase el documento nº WO97/49450), y el aparato tiene capacidad operativa para aplicar campos de dichas intensidades por lo menos.

En la presente memoria, el término "campo eléctrico" comprende uno o más impulsos de capacitancia y tensión variable que comprenden formas de onda exponenciales, cuadradas, moduladas o cuadradas y moduladas, y el aparato es capaz de aplicar todas y cada una de estas formas de onda. Debe considerarse que las referencias a los campos eléctricos y la electricidad comprenden la referencia a la presencia de una diferencia de potencial eléctrico en el entorno de una célula. Por lo tanto, en el aparato descrito en la presente memoria, el entorno se establece manteniendo una diferencia de potencial entre dos o más electrodos. Dicho entorno puede establecerse por medio de electricidad estática, corriente alterna (CA), corriente continua (CC), etc. como se conoce dentro de la técnica. El campo eléctrico puede ser uniforme, no uniforme o de otro tipo, y puede variar en intensidad o dirección en función del tiempo.

La electroporación se ha utilizado tanto en procedimientos in vitro como in vivo para introducir material extraño en células vivas. Con las aplicaciones in vitro, se mezcla primero una muestra de células vivas con el agente deseado y se coloca entre unos electrodos, tales como unas placas paralelas. A continuación, los electrodos aplican un campo eléctrico a la mezcla de células/implantes. Uno de los ejemplos de sistemas que realizan la electroporación in vitro es el producto Electro Cell Manipulator ECM600 y el producto Electro Square Porator T820, fabricados ambos por BTX Division of Genetronics, Inc (véase la patente US nº 5869326).

Las técnicas de electroporación conocidas (tanto in vitro como in vivo) permiten aplicar un impulso breve de alta tensión a los electrodos situados alrededor de la zona de tratamiento. El campo eléctrico generado entre los electrodos determina que las membranas celulares sean temporalmente porosas, permitiendo de ese modo que las moléculas del agente deseado entren en las células. En las aplicaciones de electroporación conocidas, este campo eléctrico comprende un único impulso de onda cuadrada del orden de 1000 V/cm, de una duración de aproximadamente 100 \mus. Dicho impulso puede generarse, por ejemplo, en aplicaciones conocidas del Electro Square Porator T820.

La electrosensibilización puede realizarse de una manera sustancialmente idéntica al procedimiento seguido para la electroporación, con la excepción de que el campo eléctrico se aplica en ausencia de un agente exógeno, como se indica más adelante, y puede realizarse a unas intensidades de campo eléctrico (y otros parámetros) diferentes de los que se necesitan para la electroporación. Por ejemplo, pueden utilizarse intensidades de campo inferiores para la electrosensibilización. Por lo tanto, los sistemas de electroporación pueden utilizarse para la aplicación de campos eléctricos a las células, los tejidos, etc., en los procedimientos y las composiciones descritas en el presente
documento.

Preferentemente, el campo eléctrico tiene una intensidad comprendida de entre aproximadamente 1 V/cm y de aproximadamente 10 KV/cm en condiciones in vitro. Por lo tanto, el campo eléctrico puede tener una intensidad de
1 V/cm, 2 V/cm, 3 V/cm, 4 V/cm, 5 V/cm, 6 V/cm, 7 V/cm, 8 V/cm, 9 V/cm, 10 V/cm, 20 V/cm, 50 V/cm, 100 V/cm, 200 V/cm, 300 V/cm, 400 V/cm, 500 V/cm, 600 V/cm, 700 V/cm, 800 V/cm, 900 V/cm, 1 kV/cm, 2 kV/cm, 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm, 50 kV/cm o más. Más preferentemente dicha intensidad está comprendida entre aproximadamente 0,5 kV/cm y aproximadamente 4,0 kV/cm en condiciones in vitro. Preferentemente, el campo eléctrico tiene una intensidad comprendida entre aproximadamente 1 V/cm y aproximadamente 10 kV/cm en condiciones in vivo. No obstante, las intensidades de campo eléctrico pueden disminuirse cuando el número de impulsos aplicados al sitio de destino se incrementa. Por lo tanto, en la presente memoria se contempla la aplicación pulsátil de campos eléctricos a intensidades de campo inferiores.

Preferentemente, la aplicación del campo eléctrico se hace en forma de varios impulsos (por ejemplo, impulsos dobles) de la misma intensidad y capacitancia o de impulsos secuenciales de intensidad o capacitancia variable. El término "impulso" en la presente memoria comprende uno o más impulsos eléctricos de capacitancia y tensión variable que comprenden formas de onda exponenciales, cuadradas o moduladas y cuadradas.

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Preferentemente, el impulso eléctrico se aplica como una forma de onda seleccionada que puede ser una forma de onda exponencial, una forma de onda cuadrada, una forma de onda modulada o una forma de onda cuadrada y modulada.

En una forma de realización preferida, se emplea corriente eléctrica continua de baja tensión. Por lo tanto, se da a conocer la utilización de un campo eléctrico que se aplica a la célula, el tejido o la masa tisular a una intensidad de campo comprendida entre 1 V/cm y 20 V/cm, durante un período de 100 milisegundos o más, y preferentemente de 15 minutos o más.

Cuando se utilizan campos eléctricos para la disrupción de células sensibilizadas, por lo general se emplean los mismos parámetros que los especificados anteriormente para la utilización de la electricidad como sensibilizador.

Ultrasonidos

Según un aspecto, la disrupción de las células que se han sensibilizado (en particular, electrosensibilizado) puede provocarse mediante la aplicación de ultrasonidos dirigidos a un tejido o una célula de destino. Según otro aspecto, los ultrasonidos pueden utilizarse como medios para sensibilizar una célula, es decir, como sensibilizadores. El aparato descrito en la presente memoria es capaz de aplicar ultrasonidos a una célula para determinar la sensibilización o la disrupción de la célula.

El término "ultrasonidos" utilizado en la presente memoria hace referencia a una forma de energía que consiste en vibraciones mecánicas cuyas frecuencias son tan altas que están por encima del rango de audición humana. Puede considerarse que generalmente el límite de frecuencia inferior del espectro ultrasónico es de aproximadamente 20 kHz. En la mayor parte de aplicaciones de diagnóstico por ultrasonidos, se emplean frecuencias comprendidas en el rango de 1 a 15 MHz (Ultrasonics in Clinical Diagnosis, P.N.T. Wells, ed., 2ª edición, Publ. Churchill Livingstone [Edimburgo, Londres y NY, 1977]).

Los ultrasonidos se han utilizado en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Cuando se utilizan como una herramienta de diagnóstico ("ultrasonidos diagnósticos"), la densidad de energía de los ultrasonidos habitualmente está comprendida en un rango que alcanza un valor de aproximadamente 100 mW/cm^{2} (recomendación de la FDA), aunque también se han utilizado densidades de hasta 750 mW/cm^{2}. En fisioterapia, los ultrasonidos suelen utilizarse como fuente de energía en el rango de hasta aproximadamente 3 a 4 W/cm^{2} (recomendación de la WHO). En otras aplicaciones terapéuticas, pueden emplearse intensidades de ultrasonidos más altas, tales como los HIFU de intensidades comprendidas entre 100 W/cm^{2} y 1 kW/cm^{2} (o todavía más elevadas) durante cortos períodos de tiempo. En la presente memoria, el término "ultrasonidos", comprende los ultrasonidos diagnósticos, terapéuticos y focalizados.

Los ultrasonidos focalizados (FUS) permiten la aplicación de energía térmica en ausencia de una sonda invasiva (véase el documento de Morocz et al., 1998, Journal of Magnetic Resonante Imaging, vol. 8, nº 1, pp. 136-142). Otra forma de ultrasonidos focalizados son los ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU) estudiados por Moussatov et al. en el documento Ultrasonics, 1998, vol. 36, nº 8, pp. 893-900, y por TranHuuHue et al. en el documento Acustica, 1997, vol. 83, nº 6, pp. 1103-1106.

Preferentemente, se emplea una combinación de ultrasonidos diagnósticos y ultrasonidos terapéuticos. No obstante, esta combinación no pretende ser restrictiva, siendo evidente para los lectores expertos la posibilidad de utilizar cualquier diversidad de combinaciones de ultrasonidos. Además, la densidad de la energía, la frecuencia de los ultrasonidos y el período de exposición pueden variarse. Lo importante es que la aplicación de los ultrasonidos sea capaz de provocar la disrupción de las células sensibilizadas deseadas, o según el caso, conferir a dichas células sensibilidad a la disrupción mediante la aplicación de un estímulo.

Preferentemente, los ultrasonidos se aplican al tejido de destino con una intensidad suficiente como para provocar la disrupción de las células sensibilizadas sin dañar los tejidos circundantes. En la presente memoria, los términos "disrupción" o "ablación" hacen referencia al daño que se provoca (por ejemplo, mediante lisis, necrosis, apoptosis, etc.) en el tejido de destino o las células del mismo. Preferentemente, el daño provocado es de tal magnitud que las células mueren en el acto o los sistemas de defensa internos del organismo las reconocen como dañadas y las elimina. Preferentemente, la "ablación" de un tejido o una célula se produce cuando el daño causado es suficiente para que sea eliminada del cuerpo del organismo.

Preferentemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonidos se realiza a una densidad de potencia comprendida entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 Wcm^{-2}. Todavía más preferentemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonidos se realiza a una densidad comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15 Wcm^{-2}.

Preferentemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonidos se realiza a una frecuencia comprendida entre aproximadamente 0,015 y aproximadamente 10,0 MHz. Más preferentemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonidos se realiza a una frecuencia comprendida entre aproximadamente 0,02 y aproximadamente
5,0 MHz o aproximadamente 6,0 MHz. Más preferentemente, los ultrasonidos se aplican a una frecuencia de 3 MHz.

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Preferentemente, la exposición tiene lugar durante períodos comprendidos entre aproximadamente 10 milisegundos y aproximadamente 60 minutos. Preferentemente, la exposición tiene lugar durante períodos comprendidos entre aproximadamente 1 segundo y aproximadamente 5 minutos. Más preferentemente, los ultrasonidos se aplican durante aproximadamente 2 minutos. No obstante, dependiendo de la célula de destino de ablación particular, la exposición puede tener una duración superior, por ejemplo, de 15 minutos.

Ventajosamente, el tejido de destino se expone a una fuente de energía de ultrasonidos a una densidad de potencia acústica comprendida entre aproximadamente 0,05 Wcm^{-2} y aproximadamente 10 Wcm^{-2},con una frecuencia comprendida entre aproximadamente 0,015 y aproximadamente 10 MHz (véase el documento nº WO 98/52609). No obstante, también son posibles otras opciones, tales como la exposición a una fuente de energía de ultrasonidos a una densidad de potencia acústica superior a 100 Wcm^{-2}, pero durante períodos de tiempo reducidos, por ejemplo,
1.000 Wcm^{-2} durante períodos del orden del milisegundo o menos.

Preferentemente, la aplicación de los ultrasonidos se realiza en forma de varios impulsos; por lo tanto, tanto las ondas continuas como las ondas pulsadas (aplicación pulsátil de ultrasonidos) pueden emplearse en cualquier combinación. Por ejemplo, pueden aplicarse ultrasonidos de onda continua, seguidos de ultrasonidos de onda pulsada o viceversa. Esto puede repetirse cualquier número de veces y en cualquier orden y combinación. Los ultrasonidos de onda pulsada pueden aplicarse contra un fondo de ultrasonidos de onda continua, y se puede utilizar cualquier número de impulsos en cualquier número de grupos.

Preferentemente, los ultrasonidos comprenden ultrasonidos de onda pulsada. En una forma de realización muy preferida, los ultrasonidos se aplican a una densidad de potencia de 0,7 Wcm^{-2} o 1,25 Wcm^{-2} como una onda continua. Pueden emplearse densidades de potencia más elevadas si se utilizan ultrasonidos de onda pulsada.

La utilización de ultrasonidos es ventajosa puesto que, como la luz, estos pueden focalizarse con precisión sobre un blanco. Además, los ultrasonidos son ventajosos en la medida en que pueden focalizarse en los tejidos a una profundidad mayor que con la luz. Por consiguiente, son más adecuados para la terapia de penetración completa en tejidos (tales como, un lóbulo del hígado, pero no limitado al mismo) o la terapia de penetración completa en órganos (tales como el hígado entero o un músculo entero como el corazón, pero no limitados a los mismos). Otra ventaja importante es que los ultrasonidos constituyen un estímulo no invasivo que se utiliza en una amplia variedad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. A título de ejemplo, es conocida la utilización de los ultrasonidos en las técnicas de imaginería médica, así como en la terapia ortopédica. Asimismo, los instrumentos adecuados para la aplicación de ultrasonidos a un sujeto vertebrado son de amplia disponibilidad y su uso es conocido dentro de la técnica.

Sensibilización de baja intensidad y disrupción

Como se ha indicado anteriormente, pueden emplearse campos eléctricos de baja intensidad para sensibilizar células. Pueden establecerse intensidades de baja tensión utilizando corriente alterna o preferentemente utilizando corriente continua (CC). Cuando se utiliza corriente continua, esta puede aplicarse de manera pulsada o continua, igual que cuando se utiliza corriente alterna. La disrupción de dichas células puede realizarse preferentemente con ultrasonidos de baja intensidad.

Por lo tanto, en una forma de realización particular, se utiliza corriente continua a baja tensión para electrosensibilizar células. Pueden emplearse intensidades de campo eléctrico bajas con valores de 1 V/cm, preferentemente de
5 V/cm a 100 V/cm, más preferentemente de 10 V/cm a 20 V/cm (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 V/cm o más). Los campos eléctricos también pueden medirse en términos de corriente y, entonces, preferentemente, la corriente aplicada es de un valor comprendido entre 100 \muA y 200 mA, preferentemente entre 1 mA y 10 mA. Por lo tanto, la corriente aplicada puede ser de aproximadamente 100 \muA, aproximadamente 200 \muA, aproximadamente 300 \muA, aproximadamente 400 \muA, aproximadamente 500 \muA, aproximadamente 600 \muA, aproximadamente 700 \muA, aproximadamente 800 \muA, aproximadamente 900 \muA, aproximadamente 1 mA, aproximadamente 2 mA, aproximadamente 3 mA, aproximadamente 4 mA, aproximadamente 5 mA, aproximadamente 6 mA, aproximadamente 7 mA, aproximadamente 8 mA, aproximadamente 9 mA, aproximadamente 10 mA, aproximadamente 20 mA, aproximadamente 50 mA, aproximadamente 100 mA, aproximadamente 200 mA o más.

Cuando se utilizan campos de baja intensidad o corriente continua, el tiempo de exposición de las células al campo puede ser habitualmente un valor del orden de segundos o minutos. Por lo tanto, las células pueden exponerse al campo eléctrico durante más de 100 \mus, por ejemplo, 1 milisegundo o más, preferentemente 0,5 segundos o más. Más preferentemente, las células se exponen durante más de 1 segundo, preferentemente, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240, 300 segundos o más. Las células pueden exponerse durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 minutos o más.

Las características del campo eléctrico pueden ser constantes o variar durante el transcurso de la exposición (por ejemplo, puede variarse la intensidad o la dirección del campo eléctrico o ambas cosas). La intensidad del campo eléctrico puede ser fija durante la exposición o puede variar en intensidad. Por ejemplo, cuando la célula se expone al campo con un valor de corriente constante, la intensidad del campo eléctrico puede variar. De esta forma, por ejemplo, cuando se aplica una corriente constante de 5 mA, la intensidad del campo eléctrico puede variar entre 10 V/cm y
20 V/cm.

En una forma de realización muy preferida, el campo eléctrico se aplica a la célula, el tejido o la masa tisular a una intensidad de campo comprendida entre 10 V/cm y 20 V/cm. El campo eléctrico se aplica preferentemente durante un período de 100 milisegundos o más, preferentemente de 15 minutos o más. El campo eléctrico puede aplicarse de manera continua o pulsada.

El tratamiento de tumores con corriente continua (CC) de baja tensión sin aplicación de ultrasonidos ("tratamiento electroquímico") se describe en el documento de Nordenstrom, Am. J. Clin. Oncol. 1989, 12, 530-536 y el documento de Wojcicki et al., Med. Sci. Monit. 2000, 6, 498-502. No obstante, en todos los casos, se ha comprobado tanto en los modelos clínicos como en los modelos de animales que dicho tratamiento provoca la formación de lesiones necróticas y que, en muchos casos, los tejidos de destino se restablecen en el sitio de tratamiento. No obstante, en la electrosensibilización de baja tensión descrita en el presente documento, se pueden emplear con eficacia las condiciones y técnicas descritas en estos dos documentos.

La disrupción de las células tratadas con campos eléctricos de baja intensidad, es decir, mediante CC por ejemplo, puede provocarse utilizando ultrasonidos u otro tipo de estímulo. La disrupción de dichas células electrosensibilizadas pueden producirse utilizando ultrasonidos de baja intensidad, tales como los ultrasonidos del rango diagnóstico o terapéutico, es decir, de 100 mW/ cm^{2} a 750 mW/cm^{2} o de un rango de hasta aproximadamente 3 a 4 W/cm^{2} o más, como se describe en mayor detalle más adelante.

Dicho tratamiento con campos eléctricos de baja intensidad, preferentemente acoplados con ultrasonidos de baja intensidad, pueden emplearse para el tratamiento de afecciones benignas y también en la industria cosmética. Las afecciones benignas que pueden tratarse comprenden cualquier afección que pueda curarse, tratarse o prevenirse mediante la disrupción o la escisión celular o tisular. Por ejemplo, pueden utilizarse ultrasonidos o campos eléctricos de baja intensidad para tratar afecciones de la piel, tales como verrugas, papilomas, psoriasis, eczemas, lunares, etc. Además, las terapias en las que se emplea este aspecto pueden utilizarse para aplicar un tratamiento sin fármacos ni cirugía para afecciones benignas, tales como patologías mamarias y prostáticas benignas, infección por virus del papiloma humano (HPV) (condylomata acuminata, Longstaff & von Krogh, 2001, Reg. Tox. Pharm. 33, 117-137), erradicando los tejidos granulomatosos benignos que permanecen tras infecciones localizadas (Hildebrandt et al., 1998, Strahlenther Onkol., 174, 580-588).

Los lipomas, que son depósitos grasos, así como otras afecciones que comprenden depósitos de grasa superflua, también pueden tratarse. Por lo tanto, los presentes procedimientos pueden utilizarse para causar la destrucción o la disrupción de las células o los tejidos adiposos, como sustitutos de tratamientos cosméticos tales como la liposucción.

Además, los presentes procedimientos son adecuados para el tratamiento de áreas o partes relativamente grandes del cuerpo, particularmente para la extracción de grandes áreas de tejido adiposo para finalidades cosméticas.

Agentes que inducen la muerte celular

Según una forma de realización muy preferida, la célula, el tejido o la masa tisular de destino se expone además a un agente que es capaz de inducir la muerte celular. Por lo tanto, el aparato en una forma de realización preferida comprende unos medios para aplicar un agente inductor de muerte celular a la célula, o la zona de su entorno. Dichos medios de aplicación de agente inductor de muerte celular pueden comprender una o más agujas huecas que puede establecer una transferencia de fluidos con un recipiente, como se ha descrito anteriormente.

Un agente capaz de inducir la muerte celular es un agente que, cuando se administra a una célula, un tejido o una masa tisular de destino, es necesario o suficiente para causar la muerte celular es. Preferentemente, dicho agente es un agente que aumenta la capacidad que tiene el tratamiento de causar la muerte celular con sensibilización y disrupción (por ejemplo, con administración de campo eléctrico/ultrasonidos). Por consiguiente, el contacto con dicho agente preferentemente aumenta el efecto de muerte, disrupción o ablación celular causada mediante sensibilización y disrupción (por ejemplo, mediante exposición a un campo eléctrico y ultrasonidos en cualquier orden). En una forma de realización preferida, los agentes inductores de muerte celular se utilizan para realizar una "limpieza" y destrucción de las células que, ya sea de manera involuntaria o voluntaria, no se han visto afectadas por el tratamiento (por ejemplo, la aplicación del campo eléctrico y los ultrasonidos).

Dichos agentes inductores pueden tener la capacidad de favorecer la muerte celular por si solos. En realidad, cualquier agente utilizado para el tratamiento de tumores o cánceres conocido dentro de la técnica es un potencialmente adecuado para utilizar como agente inductor de muerte celular. No obstante, debe considerarse que el término "agente que induce la muerte celular" y "agente inductor de muerte celular" comprende agentes cuya finalidad es favorecer la muerte celular cuando se utilizan en combinación con la sensibilización (por ejemplo, la electrosensibilización) y la disrupción celular (por ejemplo, la exposición a los ultrasonidos), como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, la administración de dichos agentes inductores de muerte celular aumenta la muerte celular en más del 10%, más del 20%, más del 30%, más del 40%, más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 100% con respecto al rendimiento de muerte celular obtenido con los tratamientos (por ejemplo, ultrasonidos/campo eléctrico) solo.

El agente inductor de muerte celular puede funcionar de muchas maneras. Por ejemplo, el agente puede ser directamente tóxico para la célula. Los agentes de esta categoría comprenden los agentes citotóxicos que se utilizan en la terapia tumoral. Asimismo, el agente puede ser un agente que provoca una reacción inmune en el huésped, cuyo efecto es la eliminación o la muerte de la célula, el tejido, etc. de destino mediante los procesos inmunes normales del paciente (comprendidas las respuestas inmunes mediadas por células y humorales). Los ejemplos de dichos agentes comprenden células T citotóxicas y células dendríticas. Además, el agente puede comprender un agente que es capaz de atraer respuestas inmunes, tal como una citocina. Por ejemplo, las citocinas, tales como las IL-2, GMCSF, etc., pueden utilizarse para estimular la respuesta inmune del huésped.

El agente inductor de muerte celular puede aplicarse directamente a la célula o a la zona de su entorno. Debe tenerse en cuenta que, cuando el agente inductor de muerte celular es de naturaleza proteínica (por ejemplo, un péptido, un polipéptido, una proteína o un fragmento de cualquiera de estos), el agente inductor de muerte celular puede administrarse en forma de ácido nucleico con el péptido, polipéptido, etc. codificados. Dicho ácido nucleico preferentemente puede adoptar la forma de un vector de expresión, siendo los procedimientos para crear dichos vectores y constructor, y la inducción de la expresión de estos, conocidos dentro del ámbito de la técnica. Además, se contempla la utilización de agentes inductores de muerte celular en forma de células productoras de dichos agentes (por ejemplo, una célula capaz de expresar un agente inductor de muerte celular, porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho agente). La célula puede transfectarse o transformarse con un ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión) que codifica el agente inductor de muerte celular (por ejemplo, un agente citotóxico, un agente citostático, una citocina, el GM-CSF, la IL-2 o un inmunógeno).

No es necesario que el agente inductor de muerte celular sea de naturaleza molecular. Por lo tanto, la utilización de los tratamientos que provocan la muerte celular por otros medios conocidos dentro de la técnica también está contemplada. Estos medios comprenden, por ejemplo, la utilización de radiación, ya sea aplicada externamente o bien internamente, para provocar la muerte de células tales como las células tumorales. Los procedimientos de utilización de radioterapia como terapia principal o auxiliar para los tumores son conocidos dentro de la técnica.

La célula, el tejido o la masa tisular de destino puede exponerse al agente inductor de muerte celular ya sea antes, durante o después del estímulo causante de la disrupción de las células (por ejemplo, el tratamiento con ultrasonidos en el que las células se electrosensibilizan y a continuación se exponen a ultrasonidos). No obstante, en todos los casos, el sensibilizador (por ejemplo, el campo eléctrico que electrosensibiliza la célula, etc.) se aplica sustancialmente antes de administrar el agente. Dicho de otro modo, el sensibilizador se aplica al elemento de destino en ausencia de dicho agente inductor de muerte celular. En particular, cuando se emplea electrosensibilización, el campo eléctrico se aplica al elemento de destino en ausencia de un agente inductor de muerte celular. Por lo tanto, el agente inductor de muerte celular no es el principal responsable de la inducción de la disrupción o la muerte celular, sino que más bien desempeña un papel complementario favoreciendo la muerte celular de las células, los tejidos, etc. expuestos al sensibilizador y al disruptor (por ejemplo, el campo eléctrico y los ultrasonidos).

La célula, el tejido o la masa tisular de destino pueden exponerse al agente inductor de muerte celular de cualquier manera que sea adecuada. Por ejemplo, el agente puede aplicarse tópicamente a la piel, lo cual resulta ventajoso si, por ejemplo, la célula de destino es epidérmica (por ejemplo, un tumor cutáneo). Además, el agente puede administrarse sistemáticamente al paciente o al sistema al cual pertenece la célula de destino, etc. El agente puede administrarse oralmente (es decir, se toma por la boca), nasalmente o administrarse mediante tecnología de liposomas, etc. El agente puede inyectarse directamente en la masa tumoral o en el sitio del tumor o cerca de este. El agente puede aplicarse en forma de una célula que expresa el agente (por ejemplo, una célula que expresa un agente citotóxico). La utilización de células que expresan dichos agentes citotóxicos, por ejemplo, la IL-2, se conoce en el ámbito de la técnica y se describe, por ejemplo, en el documento de Mir et al., J. Immunotherapy, 17, 30-38 y el documento de Orlowski et al. 1998, Anticancer Drugs, 9, 551-556.

El agente puede aplicarse mediante inserción en un portador adecuado, tal como un portador constituido por un glóbulo rojo. La inserción y la aplicación mediante glóbulos rojos se da a conocer en detalle en las solicitudes de patentes internacionales números PCT/GB00/02848 (publicada con el número WO/01/07011) y PCT/GB00/03056. El agente puede aplicarse dentro de un compartimiento intracelular utilizando secuencias de translocación de la membrana (MTS), descritas en otra sección de este documento. Asimismo, el agente puede administrarse adecuadamente en forma de composición farmacéutica, tal como se describe en mayor detalle más adelante.

Los agentes que son útiles en los procedimientos y las composiciones descritas en la presente memoria se indican a continuación. Los agentes preferidos que son capaces de inducir la muerte celular comprenden las citocinas y los agentes citotóxicos, así como los ácidos nucleicos que los codifican, todos los cuales se describen en mayor detalle en otra sección del presente documento.

El término "agente" utilizado en la presente memoria comprende, de manera no limitativa, un átomo o una molécula, que puede ser inorgánica u orgánica, una molécula efectora biológica o un ácido nucleico que codifica un agente tal como una molécula efectora biológica, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un ácido peptidonucleico (APN), una partícula tipo virus, un nucleótido, un desoxirribonucleótido, un ribonucleótido, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un ácido graso y un hidrato de carbono. Los agentes pueden estar en disolución o en suspensión (por ejemplo, cristalina, coloidal u de otra forma particular). Los agentes pueden adoptar la forma de un monómero, un dímero, un oligómero, etc. u otra forma en un complejo. El agente puede estar cubierto de una o más moléculas, preferentemente macromoléculas, y más preferentemente polímeros, tales como el PEG (polietilénglicol). La utilización de un agente "pegilado" incrementa el tiempo de circulación del agente una vez liberado.

El agente inductor de muerte celular puede ser radioactivo, es decir, un radionúclido utilizado en radioterapia. El radionúclido puede ser un radioisótopo conocido en la técnica, por ejemplo, el cobalto 60, el yodo 131, etc., o una molécula tal como un ácido nucleico, un polipéptido, u otro tipo de molécula como las descritas a continuación conjugadas con dicho radioisótopo. Como se ha indicado anteriormente, las fuentes de radiación externa que utilizan dichos radionúclidos como radioterapia externa o interna también pueden utilizarse para inducir la muerte celular en la célula o el tejido de destino tratado.

Debe tenerse en cuenta que no es necesario utilizar un único agente, sino que es posible utilizar dos o más agentes inductores de muerte celular, de forma secuencial o simultánea, para provocar la muerte celular. En consecuencia, el término "agente" también comprende mezclas, fusiones, combinaciones y conjugados de átomos, moléculas, etc. dados a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, un agente puede comprender, pero sin limitarse a ellos, uno de los siguientes componentes: un ácido nucleico combinado con un polipéptido, dos o más polipéptidos conjugados entre sí, una proteína conjugada con una molécula biológicamente activa (que puede ser una molécula pequeña, tal como un prefármaco) o una combinación de una molécula biológicamente activa y un agente de diagnóstico por la imagen.

La expresión "molécula efectora biológica" y "molécula biológicamente activa" se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a un agente que presenta actividad en un sistema biológico y que comprende los componentes siguientes, aunque sin limitarse a ellos: una proteína, un polipéptido o un péptido que comprende, los componentes siguientes, sin limitarse a ellos: una proteína, una enzima, una citocina (tal como un interferón o una interleucina), un antibiótico, un anticuerpo policlonal o monoclonal o una parte efectiva de éstos, tal como un fragmento Fv, pudiendo ser dicho anticuerpo o dicha parte de anticuerpo natural, sintética o humanizada, una hormona péptida, un receptor y una molécula de señalización. El término "inmunoglobulina" comprende las inmunoglobulinas intactas así como fragmentos de anticuerpos, tales como el Fv, el Fv de cadena sencilla (scFv), el Fab o el F(ab')_{2}.

Las inmunoglobulinas, los anticuerpos, los fragmentos Fv, etc. preferidos son los que pueden ligarse a los antígenos en un entorno intracelular, y se denominan "intracuerpos" o "anticuerpos intracelulares". Un "anticuerpo intracelular" o "intracuerpo" es un anticuerpo que es capaz de ligarse a su antígeno de destino o cognado dentro del entorno de una célula o en un entorno que imita el entorno interior de una célula.

Se han propuesto procedimientos de selección para identificar directamente dichos "intracuerpos", tales como un sistema de dos híbridos in vivo para seleccionar anticuerpos con capacidad de ligamiento dentro de células de mamíferos. Dichos procedimientos se describen en la solicitud de patente internacional número PCT/GB00/00876, incorporada en la presente memoria a título de referencia. Asimismo, se han descrito técnicas para producir anticuerpos intracelulares, tales como el scFvs anti-\beta-galactosidasa, en el documento de Martineau, et al., 1998, J Mol Biol 280, 117-127 y el documento de Visintin et al., 1999, Proc. Natl. Acad Sci. USA 96, 11723-11728.

El agente puede comprender uno de los ácidos nucleicos indicados a continuación, que comprenden los siguientes compuestos, sin limitarse a ellos: un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, un oligonucleótido antisentido o un oligonucleótido antisentido modificado, ADNc, ADN genómico, un cromosoma artificial o natural (por ejemplo, un cromosoma artificial de levadura) o una parte de este, ARN, incluido ARNm, ARNt, ARNr o una ribozima, o un ácido peptidonucleico (APN); unas partículas tipo virus; un nucleótido o ribonucleótido o un análogo sintético de estos, que puede ser modificado o no modificado; un aminoácido o un análogo de este, que puede ser modificado o no modificado, una hormona no peptídica (por ejemplo, esteroide); un proteoglicano; un lípido o un hidrato de carbono. Si la molécula efectora biológica es un polipéptido, puede aplicarse directamente al área de destino. Alternativamente, puede utilizarse una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de codificación del polipéptido, estando dicha secuencia relacionada funcionalmente con elementos reguladores de transcripción y traslación activos en una célula del sitio de destino. También pueden utilizarse moléculas pequeñas, que comprenden compuestos químicos inorgánicos y orgánicos. En una forma de realización particularmente preferida, la molécula biológicamente activa es un agente farmacéuticamente activo (por ejemplo, un isótopo).

Una forma de realización preferida comprende la utilización de una ribozima o un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido, y la exposición de una célula o tejido de destino a dichos agentes para inducir la muerte celular.

Unas clases de moléculas efectoras biológicas particularmente útiles comprenden las siguientes sin limitarse a ellas: antibióticos, fármacos antiinflamatorios, agentes angiogénicos o vasoactivos, factores de crecimiento y agentes citotóxicos (por ejemplo supresores tumorales). Los agentes citotóxicos útiles comprenden, sin limitarse a ellos, la toxina de la difteria, la exotoxina de Pseudomonas, la toxina del cólera, la toxina de la tos ferina y los prefármacos de mostaza de peptidil-p-fenilenodiamina, glutamatos de mostaza de ácido benzoico, ganciclovir, 6-metoxipurina-arabinósido (araM), 5-fluorocitosina, glucosa, hipoxantina, alanina-metotrexato, N-[4-(a-D-galactopiranosil) benciloxicarbonil]-daunorrubicina, amigdalin, mostazas de azobenceno, mostaza de glutamil p-fenilendiamina, mostaza de fenol-glucurónido, epirrubicina-glucurónido, cefalosporina de la vinca, mostaza de fenilendiamina-cefalosporina, mostaza de nitrógeno-cefalosporina, fosfato de mostaza fenólica, fosfato de doxorrubicina, fostafo de mitomicina, fosfato de etopósido, palitoxina-4-hidrofenil-acetamida, doxorrubicin-fenoxiacetamida, melfalan-fenoxiacetamida, ciclofosfamida, isofosfamida o análogos de estos. Si se aplica un prefármaco a la célula, el tejido o la masa tisular de destino en una forma inactiva, puede aplicarse una segunda molécula efectora biológica. Dicha molécula efectora biológica es un polipéptido activador útil que convierte el prefármaco inactivo en una forma de fármaco activa, y dicho polipéptido activador se selecciona de un grupo que comprende, sin limitarse a ellos, timidita quinasa viral (codificada por Genbank, nº de acceso J02224), carboxipeptidasa A (codificada por Genbank, nº de acceso M27717), \alpha-galactosidasa (codificada por Genbank, nº de acceso M13571), \beta-glucuronidasa (codificada por Genbank, nº de acceso M15182), fosfatasa alcalina (codificada por Genbank, nº de acceso J03252 J03512) o citocromo P-450 (codificado por Genbank, nº de acceso D00003 N00003), plasmina, carboxipeptidasa G2, citosina deaminasa, glucosa oxidasa, xantina oxidasa, \beta-glucosidasa, azoreductasa, t-glutamil transferasa, \beta-lactamasa o penicilin amidasa. Se puede administrar el polipéptido o el gen que lo codifica. Si se administra este último, tanto el prefármaco como el polipéptido activador pueden ser codificados por los genes en el mismo constructo de ácido nucleico recombinante.

Preferentemente, se selecciona una molécula efectora biológica de un grupo que comprende: una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, una partícula tipo virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido y un hidrato de carbono o una combinación de estos (por ejemplo, un material cromosómico que comprende tanto componentes de proteína como de ADN o un par o un conjunto de efectores, de los cuales uno o más convierten a otro en una forma activa, por ejemplo, catalíticamente activa).

La molécula efectora biológica es preferentemente un agente inmunomodulador u otro modificador de respuesta biológica, pero también puede ser un polinucleótido que codifica enzimas metabólicas y proteínas, incluidos los compuestos antiangiogénesis, por ejemplo, el factor VIII o el factor IX.

Citotóxicos

Los agentes inductores de muerte celular descritos anteriormente pueden utilizarse, ya sea individualmente o bien en combinación unos con otros, junto con un tratamiento de ultrasonidos/campo eléctrico aplicado por el aparato descrito en la presente memoria. Los agentes inductores de muerte celular preferidos que se aplican en una forma de realización preferida del aparato comprenden los citotóxicos y las citocinas.

El término "citotoxicidad" hace referencia a la propiedad que permite a un compuesto químico (tal como un alimento, un cosmético o un fármaco) o una célula mediadora (célula T citotóxica) provocar la muerte celular. A diferencia de la necrosis y la apoptosis, el término citotoxicidad no necesariamente indica un mecanismo de muerte celular específico. Por ejemplo, la citotoxicidad mediada por células (es decir, la muerte celular mediada por linfocitos T citotóxicos [CTL] o células asesinas naturales [NK]) combina algunos aspectos de la necrosis y la apoptosis. Los términos "citotóxico" y "fármaco citotóxico" pueden intercambiarse y se refieren a cualquier fármaco de un grupo de fármacos que son tóxicos para las células y que causan la muerte celular o impiden cualquier proceso celular, tal como el crecimiento, la proliferación o la replicación celular. Estos fármacos también se denominan "citostáticos" o "fármacos citostáticos".

Preferentemente, los agentes citotóxicos comprenden los agentes quimioterapéuticos dotados de un efecto antitumoral. Los citotóxicos se utilizan principalmente para tratar el cáncer, aunque algunos se destinan a otros usos (tales como el tratamiento de otro tipo de afecciones, tales como la psoriasis y la artritis reumatoide). El tratamiento del cáncer con citotóxicos se conoce con el nombre de "quimioterapia" y se utiliza con una diversidad de propósitos. Los citotóxicos pueden utilizarse para reducir un tumor antes de la cirugía (quimioterapia neoadyuvante), pueden utilizarse una vez que el tumor principal ha sido tratado con quimioterapia o radioterapia para impedir la proliferación y el crecimiento de tumores secundarios (quimioterapia adyuvante) o pueden constituir el tratamiento principal para la enfermedad. La quimioterapia puede administrarse para curar la enfermedad o, si la cura no es posible, para controlar sus síntomas (quimioterapia paliativa).

Los citotóxicos adecuados para utilizar en formas de realización preferidas comprenden fármacos alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de la vinca, antibióticos citotóxicos, compuestos de platino (por ejemplo, carboplatino), taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, procarbazina, crisantaspasa, hidroxiurea, Rituximab (anticuerpo monoclonal) y aldesleucina (interleucina). Otros ejemplos preferidos de citotóxicos comprenden: bleomicina, neocarcinostatina, suramina, doxorrubicina, carboplatino, taxol, mitomicina C, cisplatino, azathioprina (imuran), ciclofosfamida (citoxán), metotrexato (reumatrex), así como otros fármacos citotóxicos relacionados con la ciclofosfamida (citoxán), incluido el clorambucilo (leukeran) y la mostaza nitrogenada (mustargen).

Se han utilizado hormonas sexuales para tratar el cáncer, siendo pues también posible su uso. Los tumores de la glándula prostática a menudo son estimulados por las hormonas sexuales masculinas (los andrógenos) y, por lo tanto, estos cánceres pueden tratarse con estrógenos (para contrarrestar los andrógenos) o con antiandrógenos. También pueden utilizarse análogos de la gonadorelina, tales como la buserelina, la goserelina, la leuprorelina y la triptorelina. Algunos cánceres de mama son estimulados por los estrógenos; dichos cánceres responden a los antagonistas del estrógeno tamoxifeno y toremifeno o a los inhibidores de la aromatasa. Cualquiera de los citotóxicos indicados puede emplearse en los procedimientos preferidos descritas en la presente memoria.

El término "citotóxicos" también comprende células tales como los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células asesinas naturales (NK). Además, se ha comprobado que los compuestos que inhiben los efectos del VEGF, tales como el PTK787/ZK 222584, tienen el potencial de proveer terapias efectivas y bien toleradas para el tratamiento de los tumores sólidos (Word JM, 2000, Medicina (B. Aires) 60 supl. 2:41-7). En consecuencia, también se toma en consideración la utilización de dichos compuestos como agentes inductores de muerte celular.

El citotóxico puede tomarse oralmente o mediante inyección o infusión. En general, los citotóxicos pueden administrarse de cualquier forma adecuada. Las vías de administración preferidas comprenden la administración sistémica, oral y nasal. Una vía muy preferida consiste en administrar localmente los citotóxicos al tejido de destino. Puede emplearse cualquier fórmula adecuada, como las que se dan a conocer en mayor detalle a continuación, y puede administrarse una combinación de dos, tres o más citotóxicos, opcionalmente junto con una, dos, tres o más citocinas (dadas a conocer en mayor detalle en otra sección de la presente memoria). Tal vez sea necesario llevar a cabo una cuidadosa supervisión de los efectos de los citotóxicos y realizar análisis de sangre con regularidad.

Citocinas

En otra forma de realización, el agente inductor de muerte celular que se administra en una forma de realización preferida del aparato comprende un agente que es capaz de estimular, reforzar, atraer o potenciar una respuesta inmune del paciente. Preferentemente, dicha respuesta inmune se dirige contra una célula del sitio de tratamiento, preferentemente, una célula sensibilizada. Más preferentemente, la célula es una célula electrosensibilizada que se ha expuesto a los ultrasonidos, o una célula sensibilizada mediante ultrasonidos que se ha expuesto a un campo eléctrico, por ejemplo, por medio del aparato descrito en este documento. En una forma de realización muy preferida, la administración de un agente inductor de muerte celular da por resultado la destrucción de una célula por medio de uno o más componentes del sistema inmune del paciente.

Dichos agentes preferentemente estimulan respuestas inmunes del huésped, tal como el reclutamiento de células asesinas tales como células T citotóxicas y células dendríticas hacia el sitio de destino. Por ejemplo, para aumentar la muerte celular, pueden administrarse inmunógenos o antígenos al paciente como parte de la terapia descrita en el presente documento.

El término "citocina" puede utilizarse para hacer referencia a cualquier número de moléculas solubles (por ejemplo, glicoproteínas) segregadas por las células del sistema inmune, que actúan no enzimáticamente a través de receptores específicos para regular las respuestas inmunes. Las citocinas se parecen a las hormonas en la medida en que actúan a bajas concentraciones unidas con gran afinidad a un receptor específico. Preferentemente, el término "citocina" se refiere a un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales en concentraciones comprendidas entre los nanomoles y los picomoles y que, tanto en condiciones normales como en condiciones patológicas, modulan las actividades funcionales de las células individuales y los tejidos.

Los ejemplos particulares de citocinas que son adecuadas para utilizar en los procedimientos y las composiciones descritas comprenden las interleucinas, la linfocina, el interferón, los factores estimuladores de colonias (CSF), tales como el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF) y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, los GSF, el factor activador de plaquetas (PAF) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Por lo tanto, es posible utilizar interleucinas tales como la IL1, la IL2 y la IL4, así como interferones, tales como el IFN \alpha, el IFN \beta y el IFN \gamma en los procedimientos descritos en la presente memoria. Los factores de necrosis tumoral TNF \alpha (caquetina) y TNF \beta (linfotoxina) también pueden emplearse correctamente.

Las citocinas preferidas son las que son capaces de disparar respuestas inmunes, por ejemplo, la estimulación de actividad de las células dendríticas o células T citotóxicas, o que son capaces de reclutar macrófagos hacia el sitio de destino. En una forma de realización muy preferida, la citosina comprende la IL-2, el GM-CSF o el GSF.

Apoptosis

La muerte celular puede producirse mediante dos mecanismos diferentes, la necrosis o la apoptosis. Además, se dice que ciertos compuestos químicos y células son citotóxicos para la célula, es decir, provocan su muerte. Según un aspecto preferido, la exposición de las células a un sensibilizador y a un disruptor (por ejemplo, un campo eléctrico y ultrasonidos en cualquier orden), aplicados por medio del aparato descrito, da por resultado la muerte celular por apoptosis de por lo menos una proporción de las células.

Preferentemente, por lo menos el 20% de la muerte celular causada por el tratamiento mediante los procedimientos descritos en la presente memoria es apoptótica. Más preferentemente, por lo menos el 40%, el 60%, el 80% o un porcentaje superior y, todavía más preferentemente, un porcentaje superior al 95% de las células que mueren son apoptóticas cuando se tratan, por ejemplo, con un campo eléctrico y ultrasonidos.

Las intensidades de campo, el tiempo de aplicación y la modalidad de aplicación del campo eléctrico o los ultrasonidos aplicados mediante el aparato pueden manipularse o ajustarse para obtener la proporción deseada de células que mueren por apoptosis. Pueden realizarse ensayos de apoptosis de la manera descrita a continuación. De esta manera, pues, se puede aplicar un impulso eléctrico exponencial de alta intensidad y corta duración mediante el aparato para causar, por ejemplo, la apoptosis.

Debe considerarse que el término "alta intensidad" hace referencia a los campos eléctricos de intensidad comprendida entre aproximadamente 0,5 kV/cm y 3 kV/cm, preferentemente entre aproximadamente 1 kV/cm y 2 kV/cm y más preferentemente aproximadamente 1,3 kV/cm. El término "corta duración" en el contexto del pasaje anterior hace referencia a campos eléctricos de una duración comprendida entre aproximadamente 100 ms y 700 ms, preferentemente entre aproximadamente 250 ms y 450 ms y más preferentemente aproximadamente 250 ms o 450 ms. Por ejemplo, se da a conocer la utilización de un impulso eléctrico simple o múltiple a 1,33 kV/cm, aplicado durante un período comprendido entre aproximadamente 250 ms y 450 nms, en modalidad exponencial, para provocar la disrupción celular por apoptosis.

El término "necrosis" (conocido también como muerte celular "accidental") se refiere al proceso patológico que tiene lugar cuando las células se exponen a un ataque físico o químico grave. La necrosis se produce cuando las células se exponen a una variación extrema de las condiciones fisiológicas (por ejemplo, hipotermia o hipoxia) lo cual puede provocar daños en la membrana plasmática. En condiciones fisiológicas, el daño directo a la membrana plasmática es provocado por agentes tales como los complementos y los virus líticos. La necrosis empieza con una alteración de la capacidad de la célula de mantener la homeostasis, hecho que determina un influjo de agua e iones extracelulares. Los orgánulos intracelulares, muy particularmente las mitocondrias, y la célula entera se hinchan y rompen (lisis celular). Debido a la escisión final de la membrana plasmática, el contenido citoplasmático, incluidas las enzimas lisosomáticas, se liberan en el fluido extracelular. Por consiguiente, in vivo, la muerte celular necrótica a menudo se asocia con un daño tisular considerable que provoca una respuesta inflamatoria intensa.

El término "apoptosis" (muerte celular "normal" o "programada") hace referencia al proceso fisiológico por medio del cual las células no deseadas o inútiles se eliminan durante el desarrollo y otros procesos biológicos normales. La apoptosis es una modalidad de muerte celular que deviene en condiciones fisiológicas normales y la célula es un participante activo de su propia muerte ("suicidio celular"). Esta modalidad es más frecuente durante la renovación celular y la homeostasis tisular normal, la embriogénesis, la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmune, el desarrollo del sistema nervioso y la atrofia tisular dependiente del sistema endocrino. Las células que experimentan apoptosis presentan propiedades morfológicas y bioquímicas características. Estas propiedades comprenden la agregación de cromatina, condensación nuclear y citoplásmica, división del citoplasma y en núcleo en vesículas limitadas por membranas (cuerpos apoptóticos) que contienen ribosomas, mitocondrias morfológicamente intactas y material nuclear. In vivo, estos cuerpos apoptóticos son rápidamente reconocidos y fagocitados por macrófagos o células epiteliales adyacentes. Debido a este mecanismo eficaz de eliminación de células apoptóticas in vivo, no se obtiene ninguna respuesta inflamatoria. In vitro, los cuerpos apoptóticos así como el resto de fragmentos celulares finalmente se hinchan y destruyen. Esta fase terminal de la muerte celular in vitro se denomina "necrosis secundaria".

La tabla 1 resume las diversas diferencias observables entre la necrosis y la apoptosis. Cualquiera de estas diferencias, ya sea sola o en combinación, puede someterse a ensayo para determinar si la muerte celular tiene lugar por apoptosis o necrosis.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Características diferenciales y relevancia de la necrosis y la apoptosis

1

A continuación, se hace referencia a los documentos siguientes, que describen en detalle la apoptosis, así como a diversos ensayos para medir la muerte celular por apoptosis: Schwartzman, R.A. y Cidlowski, J.A. (1993), Endocrine Rev. 14, 133; Vermes, I. y Haanan, C. (1994), Adv. Clin. Chem. 31, 177; Berke, G. (1991), Inmunol. Today, 12, 396; Krähenbühl, O. y Tschopp, J. (1991), Inmuno/. Today 12, 399; Van Furth, R. y Van Zwet, T. L. (1988), J. Inmunol., Methods 108, 45, Cohen, J.J. (1993) Apopotosis, Inmunol. Today 14, 126; Savill, J. S. et al. (1989), J. Clin. Invest. 83, 865; Wyllie, A. H. (1980), Nature 284, 555; Leist, M. et al. (1994) Biochemica Nº. 3, 18-20; Fraser, A y Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Duke, R. C. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6361; Duke, R.C. y Cohen, J.J. (1986), Lymphokine Res. 5, 289; Trauth, B. C. et al. (1994) Eur. J. Cell. Biol. 63, 32, Supl. 40; Matzinger, P. (1991), J. Immunol; Methods 145, 185; Kaeck, M. R. (1993); Anal. Biochem. 208, 393; Prigent, P. et al. (1993), J. Immunol; Methods 160, 139; Huang, P. y Plunkett, W. (1992); Anal. Biochem. 207, 163; Bortner, C. D. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5, 21; Gold, R. et al. (1994); Lab. Invest. 71, 219.

La apoptosis y la citotoxicidad mediada por células se caracterizan mediante segmentación del ADN genómico en fragmentos discretos antes de la desintegración de la membrana. En consecuencia, los ensayos de apoptosis pueden realizarse midiendo la fragmentación del ADN, por ejemplo, observando la presencia de escaleras de ADN. El análisis de los fragmentos de ADN puede realizarse, por ejemplo, detectando las "escaleras" (siendo los múltiplos de 180 bp los "peldaños" de la escalera) obtenidas a partir de poblaciones de células, o mediante cuantificación de los fragmentos de ADN en complejos de histona, por medio de un ensayo tal como el ELISA. Dicho ensayo se basa en un inmunoensayo en sándwich de una etapa para detectar nucleosomas. El procedimiento comprende la obtención de pellets celulares mediante centrifugación y el rechazo del sobrenadante (que contiene el ADN de las células necróticas que atravesaron la membrana durante la incubación). Las células se resuspenden y se incuban en tampón de lisis. Tras la lisis, los núcleos intactos se peletizan mediante centrifugación. Se transfiere una alícuota del sobrenadante a un pocillo de la placa de microtitulación recubierto de estreptavidina, y los nucleosomas del sobrenadante se unen con dos anticuerpos monoclonales, antihistona (marcada con biotina) y antiADN (conjugado con peroxidasa). Los complejos anticuerpo-nucleosoma se unen a la placa de microtitulación mediante la estreptavidina. Los complejos anticuerpo-histona inmovilizados se lavan tres veces para extraer los componentes celulares que no son inmunoreactivos, y la muestra se incuba con sustrato para peroxidasa (ABTS®). La cantidad de producto coloreado (y, por lo tanto, de complejos anticuerpo-histona inmovilizados) se determina entonces mediante espectrofotometría.

En las primeras etapas de la apoptosis participan varias proteasas. Por consiguiente, los ensayos de apoptosis también pueden efectuarse detectando la presencia (adicional o alternativa) de las proteasas inducidas por apoptosis, tales como las caspasas (por ejemplo, la caspasa 3), o analizando la actividad de las mismas. La activación de la caspasa puede analizarse de diferentes maneras, tales como los ensayos enzimáticos in vitro de lisados celulares por ejemplo, recogiendo la caspasa y midiendo la segmentación proteolítica de un sustrato adecuado. Además, los ensayos de caspasas pueden realizarse detectando la segmentación de un sustrato de caspasa in vivo, tal como la PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa). Los fragmentos de la segmentación de la PARP pueden detectarse con un anticuerpo adecuado, tal como un anticuerpo antiPARP. Los ensayos de proteasa y de fragmentación de ADN resultan especialmente adecuados para la evaluación de la apoptosis en poblaciones celulares.

Asimismo, se dispone de procedimientos para estudiar la apoptosis en células individuales, tales como los ensayos de marcaje enzimático ISNT y TUNEL. Como se ha indicado anteriormente, una degradación del ADN de gran alcance es un evento característico que a menudo se produce en las primeras etapas de la apoptosis. La segmentación del ADN da por resultado fragmentos de ADN de doble cadena y bajo peso molecular (mono y oligonucleosomas), así como roturas ("mellas") en ADN de cadena sencilla y alto peso molecular. En el ensayo TUNEL, dichas roturas de la cadena del ADN se detectan mediante marcaje enzimático de los terminales 3'-OH libres con nucleótidos modificados adecuados (tales como el X-dUTP, X = biotina, DIG o fuoresceina). Los enzimas de marcaje adecuados comprenden la ADN polimerasa (traslado de mellas) en ISNT ("traslado de mellas in situ") y la transferasa deoxinucleotidil terminal (marcaje terminal) en TUNEL ("TdT-mediated X-DUPT nick end labeling", Huang. P. y Plunkett, W., 1992, Anal. Biochem. 207, 163 y Bortner, C. D. et al., 1995, Trends Cell Biol. 5, 21).

La apoptosis puede evaluarse también midiendo las alteraciones de la membrana, que comprenden: pérdida de residuos de ácido siálico terminal de las cadenas laterales de las glicoproteínas de la superficie celular, formación de nuevos residuos de azúcar expuestos, aparición de glicoproteínas superficiales que pueden servir de receptores para moléculas de adhesión secretadas por los macrófagos, tales como la trombospondina, y pérdida de asimetría en los fosfolípidos de la membrana celular, lo cual altera la hidrofobicidad y la carga de la superficie de la membrana. En particular, el anticoagulante humano anexina V es una proteína ligante de fosfolípidos dependiente de Ca2+ de 35 a 36 kilodaltons que presenta una gran afinidad por la fosfatidilserina (PS). En las células normales viables, la PS está situada en la superficie citoplasmática de la membrana celular. No obstante, en las células apoptóticas, la PS se trasnsloca desde la cara interna hasta la cara externa de la membrana plasmática, dejando expuesta de ese modo la PS al entorno externo de la célula. Por consiguiente, la anexina V puede utilizarse para detectar fosfatidilserina expuesta asimétricamente en la superficie de las células apoptóticas (Homburg, C. H. E. et al., 1995, Blood 85, 532 y Verhoven, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 182, 1597). Además, pueden utilizarse tinciones para ADN, tales como la tinción con DAPI, bromuro de etidio y ioduro de propidio, etc. para realizar una tinción diferencial que permita diferenciar las células viables de las no viables. También pueden utilizarse perfiles de contenido de ADN. De esta forma se comprueba que las células apoptóticas permeabilizadas dejan pasar ADN de bajo peso molecular, pudiéndose detectar mediante citometría de flujo, por ejemplo, la presencia de "picos sub-G1" o de células "A 0" (células con menos tinción de ADN que las células G 1). Los cambios morfológicos característicos de la apoptosis también pueden detectarse de esta manera.

La detección de proteínas relacionadas con la apoptosis, tales como la ced-3, la ced-4 y la ced-9 (Ellis, H. M. y Horvitz, H. R., 1986, Cell 44, 817-829; Yuan, J. Y. y Horvitz, H. R., 1990, Dev. Biol. 138, 33-41 y Hentgartner, M. O., Ellis, R. E. y Horvitz, H. R., 1992, Nature 356, 494-499), Fas (CD95/Apo-1; Enari et al., 1996, Nature 380, 723-726), Bcl-2 (Baffy, G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 6511-6519; Miyashita, T. y Reed, J. C., 1993, Blood 81, 151-157; Oltvai, Z. N., Milliman, C. L. y Korsmeyer, S. J., 1993, Cell 74, 609-619), p53 (Yonish-Rouach, E. et al., 1991, Nature 352, 345-347), etc. mediante la utilización de anticuerpos también puede emplearse para evaluar la apoptosis.

Composiciones farmacéuticas

Cuando se emplea una forma de realización del aparato, que es capaz de aplicar un agente inductor de muerte celular además de ultrasonidos y un campo eléctrico, la composición que comprende el agente o los agentes inductores de muerte celular puede administrarse sola. No obstante, y preferentemente, el agente inductor de muerte celular se formula y aplica mediante el aparato como una fórmula farmacéutica. Dicha composición farmacéutica está preferentemente contenida en un recipiente situado dentro del aparato y se suministra utilizando unos medios adecuados (por ejemplo, transfiriéndose a través de agujas huecas como las descritas anteriormente).

La composición farmacéutica puede comprender el agente inductor de muerte celular, un compuesto relacionado estructuralmente o una sal ácida del agente. Las fórmulas farmacéuticas dadas a conocer comprenden una cantidad eficaz de agente inductor de muerte celular junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La cantidad eficaz varía dependiendo de las condiciones particulares del tratamiento y el tipo de células, así como de otros factores que comprenden la edad y el peso del paciente, el estado de salud general del paciente, la gravedad de los síntomas y la administración combinada o no del agente inductor de muerte celular con otras terapias.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables son muy conocidos dentro de la técnica y varían con la forma y la modalidad de administración deseada de la fórmula farmacéutica. Por ejemplo, pueden comprender diluyentes o excipientes de relleno, aglutinantes, humectantes, disgregantes, tensoactivos, lubricantes y similares. Habitualmente, el excipiente es un excipiente sólido, un excipiente líquido o un excipiente vaporizable o una combinación de estos. Cada excipiente deberá ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la fórmula y no debe ser perjudicial para el paciente. El excipiente debe ser biológicamente aceptable y no debe provocar ninguna acción adversa (por ejemplo, una respuesta inmune) cuando se administra al huésped.

Las composiciones farmacéuticas útiles pueden comprender un baño de remojo, una pomada o una emulsión de agua en aceite, una crema, una loción, una pasta, un gel, una barra, un spray, un aerosol, un aceite de baño, una solución o una composición similar.

En general, la concentración del agente inductor de muerte celular de la fórmula es de una cantidad comprendida entre aproximadamente el 0,5 y el 50% en peso de la composición, preferentemente entre aproximadamente el 1 y el 30%, más preferentemente entre aproximadamente el 2 y el 20% y más preferentemente entre aproximadamente el 5 y el 10%. La concentración utilizada puede hallarse en la parte superior del rango cuando se inicia el tratamiento y, a medida que este progresa, tanto la concentración como la frecuencia de aplicación de la fórmula pueden disminuirse.

En algunas aplicaciones, es preferible administrar una forma de agente inductor de muerte celular de acción prolongada utilizando fórmulas conocidas en el ámbito de la técnica, tales como los polímeros.

Ensayos

La observación de que las células expuestas a campos eléctricos y ultrasonidos experimentan muerte celular a través de apoptosis puede constituir la base de los ensayos para diferenciar las moléculas útiles y los objetivos para la terapia.

Uno de dichos ensayos tiene como finalidad encontrar moléculas, tales como compuestos que son capaces de modular un proceso relacionado con la apoptosis de una célula. Por ejemplo, se tienen en consideración los ensayos que identifican moléculas que modulan (es decir, estimulan o inhiben) la actividad de las caspasas u otro tipo de proteasa apoptótica. En general, en los ensayos se hace contactar una célula con una molécula candidata, es decir, una molécula o un compuesto sospechosos de presentar actividad modulatoria de apoptosis. Dichas moléculas candidatas pueden facilitarse en forma de bibliotecas, por ejemplo, bibliotecas combinatorias como las conocidas dentro del ámbito de la técnica.

A continuación, la célula se trata mediante exposición a un sensibilizador (por ejemplo un campo eléctrico) seguido de un disruptor (por ejemplo, ultrasonido) aplicados por el aparato descrito anteriormente, a niveles que se conoce o se ha determinado que son capaces de inducir la apoptosis en las células de ese tipo o esas características particulares, etc. El progreso o el grado de apoptosis se observa para determinar qué células son capaces de aumentar, favorecer, inhibir o detener la apoptosis de las células. Las moléculas determinadas mediante dicho ensayo son útiles como fármacos para aumentar o inhibir la muerte celular apoptótica y pueden utilizarse como terapias de enfermedades en las cuales se experimenta muerte celular apoptótica.

En otro ensayo, se pueden determinar los genes que participan en la regulación de la apoptosis, o los genes que participan en procedimientos apoptóticos. Dicho ensayo se basa esencialmente en la modulación de la función de un gen o un producto génico sospechoso de participar en un proceso apoptótico o en la regulación de un proceso apoptótico. Por producto génico se entiende un ARN transcrito a partir del gen o un producto polipeptídico del gen. Por ejemplo, la función génica puede perturbarse debido a una mutación, tal como se conoce dentro del ámbito de la técnica, o debido a la utilización de un inhibidor de productos génicos conocido, por ejemplo, el ARN antisentido o un inhibidor químico. A continuación, la célula se expone a un sensibilizador y un disruptor (por ejemplo, un campo eléctrico y ultrasonidos), aplicados mediante el aparato descrito anteriormente, a unos niveles que se sabe o que se determina que son capaces de inducir apoptosis en células de ese tipo o esas características particulares, etc., y se observa la presencia y el grado o el índice de apoptosis. Análogamente, se puede realzar la función génica y evaluar la apoptosis. Los genes candidatos sospechosos de participar en la apoptosis pueden utilizarse entonces como objetivos potenciales para programas de descubrimiento de fármacos, con la finalidad de hallar moduladores potenciales de apoptosis (por ejemplo, utilizando el ensayo anterior).

En los ejemplos siguientes, se demuestra que una combinación de campo eléctrico y de ultrasonidos aplicados a una célula provoca su disrupción o ablación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Efecto de los ultrasonidos de baja intensidad sobre las células tratadas con impulsos de 3,625 kV/cm

La línea de células de destino empleada en estos estudios es una línea de células de linfoblastos leucémicos procedentes de ratón (clon 707, ECACC, nº 91112126 de European Collection of Animal Cell Cultures) que se mantiene en DMEM complementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal. Los cultivos se mantienen en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células se separan mediante centrifugación, se lavan una vez en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se suspenden a una concentración de 1.065 x 10^{7} células/ml. Se distribuyen alícuotas de 0,7 ml de esta suspensión en cubetas de electroporación (espacio entre electrodos de 0,4 cm) junto con 0,1 ml de PBS. Las cubetas se conservan en hielo y se someten a electroporación mediante aplicación de dos impulsos de 3,625 kV/cm a una capacitancia de 1 \muF. Las células se lavan dos veces en PBS mediante centrifugación, se resuspenden en una solución PBS que contiene MgCl_{2} (4 mM) (PBS/Mg) y se conservan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se lavan dos veces en una solución de PBS/Mg que contiene 10 mM de glucosa, se resuspenden en el mismo tampón y se mantienen a temperatura ambiente durante 1 hora. Se toma una población de células de control a través del mismo procedimiento, excepto por la etapa de electroporación que se omite. Las concentraciones de células se ajustan en 1,4 x 10^{7} células/ml. Se distribuyen alícuotas de células de 100 \mul en los micropocillos de una placa de 96 pocillos y se colocan en un cabezal de ultrasonidos de 3 MHz. Las células se exponen a ultrasonidos durante 30 segundos. La viabilidad se determina utilizando azul de tripano.

El efecto del incremento de la densidad de potencia de los ultrasonidos sobre la viabilidad de las células normales y las células electrosensibilizadas se representa en la figura 19. Los resultados demuestran que el efecto sobre la población de células de control normales es nulo o casi nulo hasta una densidad de potencia de 1.5 W/cm^{2}, mientras que la viabilidad celular decrece hasta un valor cercano a 0 a una densidad de potencia de 1 W/cm^{2} tras el tratamiento de la población electrosensibilizada. Debe tenerse en cuenta que la viabilidad celular se determina inmediatamente después de la exposición a los ultrasonidos. Estos resultados demuestran que es posible sensibilizar las células de destino a las condiciones de ultrasonidos que no tienen ningún efecto sobre las células normales.

Ejemplo 2

Efecto de los ultrasonidos de baja intensidad sobre células expuestas a impulsos de 1,875 y 2,5 kV/cm

Para determinar si la intensidad del campo eléctrico impulsivo tiene algún efecto sobre la sensibilidad de las células tratadas a los ultrasonidos de baja intensidad, se distribuyen alícuotas de células de 0,7 ml (0,8 x 10^{7} células/ml en PBS/Mg) en cubetas de electroporación (espacio entre electrodos de 0,4 cm) junto con 0,1 ml de PBS. Las cubetas se mantienen a temperatura ambiente y se someten a electroporación de la forma descrita para el ejemplo 1, excepto en que una población se trata con dos impulsos a 1,875 kV/cm y otra se trata con dos impulsos a 2,5 kV/cm. Las células se transfieren a una solución de PBS/Mg/glucosa y se mantienen a temperatura ambiente durante 15 min. Las muestras se tratan con ultrasonidos durante 30 segundos y se dejan a temperatura ambiente durante 1 hora antes de determinar la viabilidad de las células mediante azul de tripano. Se obtiene una población de células de control a través del tratamiento anterior, salvo por el evento de electroporación que se omite.

El efecto de los ultrasonidos de baja intensidad sobre las células tratadas a ambos voltajes se representa en la figura 20. En este caso, los ultrasonidos tienen un efecto limitado sobre la viabilidad de las células en la población de células de control hasta 0,75W/cm^{2}. A 1 W/cm^{2} o por encima de este valor, la viabilidad decrece drásticamente en la población de control. Se observan efectos mediados por ultrasonidos en la población de células tratadas con impulsos eléctricos de 1,875 kV/cm, y la viabilidad decrece a las densidades de ultrasonidos inferiores (0,25 a 0,75 W/cm^{2}). En las células tratadas a 2,5 kV/cm^{2}, se perciben efectos más intensos a todas las densidades de potencia de ultrasonidos examinadas entre 0,25 y 1 W/cm^{2}. Los resultados confirman que la sensibilidad a los ultrasonidos puede inducirse mediante la exposición de las poblaciones de células a los impulsos eléctricos. Los resultados demuestran asimismo que la susceptibilidad de las células a los ultrasonidos se incrementa cuando se incrementa la intensidad del campo eléctrico. El descenso de la viabilidad de las células de control experimentado tras el tratamiento con ultrasonidos en este experimento es más radical que el observado en el ejemplo 1 (figura 19), siendo esto tal vez debido al incremento del tiempo de reposo entre el tratamiento de ultrasonidos y la determinación de la viabilidad de las células descrita en el ejemplo 2.

Ejemplo 3

Sensibilización y tratamiento de ultrasonidos de células inmovilizadas en matrices de alginato

Para determinar si este fenómeno de sensibilización puede realizarse o no en una masa de células, y simular de ese modo una masa tumoral, se decide incorporar las células en una matriz de alginato, exponer la masa a impulsos eléctricos y después exponer la masa a ultrasonidos. Entonces, puede determinarse la viabilidad utilizando una modificación del ensayo de MTT descrito previamente (Rollan et al., Bioprocess Eng. 15, 47, 1996). Con dicho propósito, se obtienen células 707 y se suspenden en una solución de alginato de sodio al 1% (p/v) (Keltone LV, Lot nº 35245A, Kelco, GB) a una concentración de 1,16 x 10^{7} células/ml. Esta suspensión se añade mediante goteo a una solución de cloruro de calcio (1,5% [p/v]) y se mantienen microesferas (volumen medio por microesfera = 10 \mul) en CaCl_{2} durante 15 minutos. A continuación, las microesferas se enjuagan con PBS y se distribuyen en cubetas de electroporación (30 microesferas/cubeta) junto con 0,5 ml de PBS. A cada cubeta, se le aplica dos impulsos eléctricos de 2,5 kV/cm a una capacitancia de 1 \muF, y las células se transfieren de inmediato a un medio de cultivo. Se distribuyen alícuotas de 5 microesferas en los pocillos de una placa de 96 pocillos, y estas se exponen a ultrasonidos a 0,75 y 1,5 W/cm^{2} a 3 MHz durante 40 segundos. A continuación, las microesferas se colocan en una incubadora a 37ºC durante 165 minutos. Subsiguientemente, se extrae el medio y las microesferas se lavan una vez con PBS. Se añaden alícuotas de MTT de 1 ml (1 mg/ml en PBS) a cada muestra de microesferas y estas se mantienen a 37ºC durante 1 hora. Entonces, se separa el MTT de las microesferas y se añaden 0,5 ml de NaOH (1M) a cada muestra. La viabilidad de las células de las microesferas se determina midiendo la absorbancia de la solución resultante a 520 nm mediante espectrofotometría. Las muestras de control consisten en células inmovilizadas obtenidas a través del mismo procedimiento, con la excepción de que estas se exponen a impulsos eléctricos o ultrasonidos.

Los resultados de estos experimentos se representan en la figura 21 y demuestran que la exposición a los ultrasonidos, ya sea a 0,75 o bien a 1,5 W/cm^{2}, tiene un efecto muy limitado sobre las células de control que no se han expuesto a los impulsos eléctricos. La exposición de las células a los impulsos eléctricos en ausencia de tratamiento de ultrasonidos da por resultado un descenso del 50% de la viabilidad. No obstante, el tratamiento de las células electrosensibilizadas con ultrasonidos a ambas densidades de potencia presenta efectos drásticos sobre la viabilidad celular, siendo el resultado del tratamiento de las muestras a 1.5 W/cm^{2} una reducción del 84% de la viabilidad celular. Es importante destacar que la misma densidad de potencia tiene un efecto nulo o casi nulo sobre la viabilidad celular en la muestra de control. Los resultados presentados aquí demuestran que es posible conferir a una masa de células sensibilidad a los ultrasonidos mediante impulsos eléctricos e indican la aplicabilidad de los resultados al caso de una masa tisular in vivo.

Los resultados anteriores demuestran que, cuando se someten poblaciones de células en cultivo a campos eléctricos, dichas células se vuelven sensibles a los ultrasonidos de baja intensidad.

Los siguientes ejemplos demuestran que cuando se tratan masas titulares con campos eléctricos in vivo, estos tejidos son sensibles a los ultrasonidos de baja intensidad. En estos ejemplos, se utiliza un modelo de tumor de ratón conocido como RIF-1 (Twentyman et al., 1980, J. Natl. Cancer Inst., 64 595-604). En el ejemplo 4, las células tumorales se tratan in vitro y estas poblaciones tratadas se emplean entonces para inocularlas en animales. Se supervisa el desarrollo de tumores. En el ejemplo 5, se inoculan las células en los animales, y los tumores que se desarrollan se tratan con campos eléctricos in vivo y después con ultrasonidos.

Ejemplo 4

Desarrollo tumoral subsiguiente al tratamiento de electrosensibilización y ultrasonidos de células tumorales in vitro

En este experimento, se tratan células RIF-1 con campos eléctricos, ultrasonidos o una combinación de ambos, y se evalúa la capacidad de las poblaciones tratadas de inducir el crecimiento tumoral.

Las células de destino se cultivan en un medio de RPMI 1640 complementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal y un 1% de caldo de penicilina/estreptomicina (5000 u/ml y 5000 \mug/ml, respectivamente), en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%. Las células se cultivan hasta que llegan a la fase de confluencia y luego se recolectan tras el tratamiento con tripsina-EDTA (0,005% y 0,002% [p/v], respectivamente). Las concentraciones celulares se ajustan a 1 x 10^{6} células/ml en solución salina tamponada con fosfato, y se tratan alícuotas de 0,8 ml con (i) campos eléctricos solo [1 kV/cm, doble impulso a 1 \muF], (ii) ultrasonidos [1,25 W/cm^{2} a 3 MHz durante 30 segundos] y (iii) campos eléctricos inmediatamente seguidos de tratamiento con ultrasonidos. Las poblaciones de control consisten en células a la misma concentración sin tratamiento. Estas poblaciones celulares se utilizan entonces para inocularlas en ratones C3H macho de 8 semanas mediante inyección intradérmica de 0,1 ml en el dorso posterior de cada animal. El volumen tumoral se calcula a partir de la media geométrica del diámetro medido en 3 dimensiones utilizando la fórmula
4/3 \pi r^{3}.

Resultados del ejemplo 4

Los resultados se representan en la figura 22 y demuestran que, mientras los ultrasonidos tienen un efecto nulo o casi nulo sobre la capacidad de las células de inducir el crecimiento tumoral, la electrosensibilización sí tiene un efecto significativo en este sentido. Este último efecto se ha dado a conocer, por ejemplo, en el documento de Mir et al., 1991, Eur. J. Cancer, 27, 68-72.

No obstante, muy en particular, los tumores derivados de las células, que reciben el campo eléctrico combinado con los ultrasonidos, no generan tumores hasta el día 17. Los resultados demuestran que el tratamiento combinado presenta el efecto más radical sobre la inducción de la formación de tumores y además parecen indicar cierto grado de sinergia entre los tratamientos.

Ejemplo 5

Efecto de los ultrasonidos de onda continua y onda pulsada sobre las células tumorales electrosensibilizadas in vivo

En esta serie de experimentos, se inducen tumores en animales y estos se emplean como objetivo para determinar los efectos de los tratamientos in vivo utilizando campos eléctricos, ultrasonidos (tanto de onda continua como de onda pulsada) y tratamientos combinados con campos eléctricos seguidos de ultrasonidos.

Con esta finalidad, se inoculan células tumorales RIF-1 en animales de la forma descrita anteriormente. Cuando los tumores alcanzan un volumen medio de 50 mm^{3}, algunos no se tratan (control) y otros se tratan con campos eléctricos (voltaje predeterminado = 1,66 kV/cm y voltaje aplicado = 1,33 kV/cm, utilizando un sistema BTX 630 junto con unos Tweezertrodes (electrodos tipo pinza) de 7 mm), con ultrasonidos en modalidad de emisión de onda continua a 3 MHz y a 0,7 W/cm^{2}, ultrasonidos en modalidad de emisión de onda pulsada a 3 MHz y 1,8 W/cm^{2} (ciclo de trabajo del 35%) y con combinaciones de campo eléctrico inmediatamente seguido de cada forma de ultrasonidos. El crecimiento tumoral se supervisa midiendo el volumen tumoral tal como se ha descrito anteriormente.

Resultados del ejemplo 5

Los resultados se representan en la figura 23 y demuestran que el tratamiento con ultrasonidos de onda pulsada por sí solo no tiene ningún efecto sobre el crecimiento tumoral. Tanto el tratamiento con campo eléctrico solo y el tratamiento con ultrasonidos de onda continua solo parecen presentar un efecto leve sobre el crecimiento tumoral. En particular, los tratamientos combinados de campo eléctrico y cada uno de los tipos de ultrasonidos dan por resultado la inhibición del desarrollo tumoral más significativa.

De los tumores que se tratan con campos eléctricos combinados con ultrasonidos, los que se han tratado con ultrasonidos de onda pulsada presentan la respuesta más amplia, aunque los efectos negativos sobre el crecimiento tras el tratamiento combinado con ultrasonidos de onda continua también son significativos. No obstante, debe observarse que, en términos de energía total aplicada a las células, los ultrasonidos de onda pulsada parecen resultar ligeramente más eficaces que los de onda continua (78 J/cm^{2} para los ultrasonidos de onda pulsada frente a 84 J/cm^{2} para los ultrasonidos de onda continua).

Estos resultados demuestran que los tumores tratados con impulsos eléctricos in vivo se vuelven sensibles a los ultrasonidos de intensidad relativamente baja.

Ejemplo 6

Sensibilización de células tumorales a los ultrasonidos in vivo, utilizando impulsos eléctricos de onda cuadrada

Este ejemplo demuestra cómo los impulsos eléctricos de onda cuadrada de alta intensidad y corta duración son capaces de sensibilizar in vivo las células tumorales a los ultrasonidos.

En la serie de experimentos anteriores, se demuestra que, cuando se exponen los tumores in vivo, estos se vuelven sensibles a los ultrasonidos de intensidad relativamente baja. En estos experimentos, el campo eléctrico se aplica a los tejidos de maneras diferentes que comprenden tanto los impulsos eléctricos exponenciales de alta intensidad y corta duración como la corriente continua de baja intensidad durante un período de tiempo prolongado.

Para determinar si la utilización de impulsos de onda cuadrada de alta intensidad y corta duración puede aprovecharse o no para facilitar la hipersensibilización de los tejidos tumorales a los ultrasonidos, los tumores se tratan mediante impulsos de onda cuadrada de alta intensidad y corta duración y se determina la sensibilidad a los ultrasonidos. Con esta finalidad se establece una serie de tumores en animales (n = 4 por grupo), se tratan tres grupos de animales con 8 impulsos de onda cuadrada de una duración de 100 \musegundos y se aplica una intensidad de campo eléctrico de 1,25 kV/cm^{2} a una frecuencia de 1 MHz. Inmediatamente después, se somete uno de estos grupos a tratamiento con ultrasonidos de onda pulsada (35% de onda continua) durante 2 minutos a 3,57 W/cm^{2} y a 1 MHz. Otro grupo recibe ultrasonidos 24 horas después de la aplicación del campo eléctrico y un tercer grupo no recibe ultrasonidos. Además, en el experimento, se emplea un grupo de animales no tratados de control, es decir, un grupo tratado solo con ultrasonidos. El crecimiento tumoral se supervisa tal como se ha descrito previamente.

Resultados del ejemplo 6

En la figura 24, se representan los resultados de estos experimentos, que demuestran que el tratamiento con el campo eléctrico solo tiene un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral, tal y como se esperaba (Mir et al., Eur J. Cancer, 22, 1991, 68-72). Cuando los tumores se tratan con campos eléctricos e inmediatamente después con ultrasonidos, se observa una reducción significativa del crecimiento tumoral, aunque no tan drástica como la observada cuando se utiliza un tratamiento de onda exponencial o de CC. Cuando los tumores se tratan con ultrasonidos 24 horas después del tratamiento con campos eléctricos, no se observa ningún efecto sobre el retraso del crecimiento tumoral. Estos resultados parecen indicar que las condiciones del campo eléctrico -impulsos de onda cuadrada de alta intensidad y corta duración- no son tan eficaces como la onda exponencial o la CC para conferir a los tumores in vivo sensibilidad a los ultrasonidos.

No obstante, vale la pena tener en cuenta que, en los estudios realizados con tratamientos de onda exponencial de alta intensidad, las constantes de tiempo observadas durante la aplicación de los impulsos se hallan en la zona comprendida entre los 300 y los 400 ms, mientras que los impulsos de onda cuadrada empleados en este caso están en la zona de los 100 \mus. De conformidad con esto, experimentos similares a los anteriores, pero en los cuales la duración de los impulsos de onda cuadrada se incrementa desde el rango de los \mus hasta el rango de los milisegundos, ponen de manifiesto respuestas más drásticas en la reducción del crecimiento tumoral.

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Ejemplo 7

Efecto de los ultrasonidos de onda continua y onda pulsada de alta intensidad sobre las células tumorales electrosensibilizadas in vivo

Se inoculan células tumorales RIF-1 en animales, se tratan los tumores y se supervisa el crecimiento tumoral de la forma descrita anteriormente en el ejemplo 5. El tratamiento comprende campos eléctricos (1,33 kV/cm), ultrasonidos en modalidad de emisión de onda continua a 3 MHz y a 1,25 W/cm^{2} durante 2 minutos, ultrasonidos en modalidad de emisión de onda pulsada a 3 MHz y a 2,5 W/cm^{2} durante 2 minutos (35% de onda continua) y combinaciones de campo eléctrico seguido inmediatamente de cada una de las formas de ultrasonidos. Se utilizan células no tratadas como control, igual que en los casos anteriores.

Resultados del ejemplo 7

Los resultados se representan en la figura 25 y demuestran que tanto el tratamiento con ultrasonidos de onda pulsada como el tratamiento de ultrasonidos de onda continua de las células electrosensibilizadas son efectivos para retardar el crecimiento tumoral. Como en los casos anteriores, el tratamiento de onda pulsada parece ser más eficaz que el tratamiento de onda continua, aunque la energía total aplicada a las células es de 105 J/cm^{2} en los ultrasonidos de onda pulsada y de 150 J/cm^{2} en los ultrasonidos de onda continua.

Estos resultados demuestran que los tumores tratados in vivo con impulsos eléctricos se vuelven sensibles a los ultrasonidos de intensidades más altas.

Ejemplo 8

Tratamiento de tumores electrosensibilizados con ultrasonidos en diversos tiempos tras el evento de electrosensibilización

En los ejemplos previos, el tratamiento con ultrasonidos se aplica inmediatamente después de la electrosensibilización. Para averiguar cuánto tiempo permanecen sensibles los tumores a los ultrasonidos tras el evento de electrosensibilización, se decide electrosensibilizar los tumores in vivo y tratar dichos tumores con ultrasonidos en diversos tiempos tras la electrosensibilización. Con esta finalidad, se inoculan tumores en ratones receptores tal como se ha indicado anteriormente. Estos tumores se electrosensibilizan mediante exposición a impulsos dobles a 1,33 kV/cm. Los tumores se exponen entonces a ultrasonidos (3,57 W/cm^{2}, 1 MHz, utilizando ondas pulsadas a un 35% de onda continua durante 2 minutos) una vez transcurridas 0, 0,5, 1, 2, 6 y 18 horas desde la electrosensibilización. Los animales de control no se tratan o se exponen al tratamiento con campos eléctricos o ultrasonidos solamente. El volumen tumoral se supervisa después del tratamiento, tal como se ha indicado anteriormente.

Resultados del ejemplo 8

En la figura 26, se representan los resultados de este experimento, que demuestran que se detectan efectos significativos cuando los ultrasonidos se aplican siempre después de la electrosensibilización. Estos resultados demuestran que las células mantienen su electrosensibilidad a los ultrasonidos durante un período de tiempo considerable tras la electrosensibilización. Los resultados demuestran que no es necesario aplicar los ultrasonidos justo después de la electrosensibilización para que la ablación tenga lugar.

Ejemplo 9

Inducción de apopotosis en células tratadas con campos eléctricos y ultrasonidos

Para estudiar el mecanismo molecular por medio del cual la exposición combinada de células a los campos eléctricos y los ultrasonidos induce la muerte celular, las células se tratan con un único impulso a diversas tensiones y se estudian los efectos de los ultrasonidos sobre dichas células.

Además de estudiar el número de células que quedan después del tratamiento, se determina si el resto de la población de células experimenta o no apoptosis o necrosis. Con este fin, se cultivan células 707 y se suspenden en PBS a una concentración de 1,53 x 10^{6} células/ml. Se distribuyen alícuotas de 0,8 ml en cubetas de electroporación (con un espacio entre electrodos de 0,4 cm), y las células se tratan con impulsos eléctricos individuales a una capacitancia de 1 \muF. Se toman las células de las cubetas y cada alícuota de 0,8 ml se lava mediante centrifugación y se resuspende en 2 ml de un medio de cultivo para tejidos que contiene suero bovino fetal. Cada alícuota de 2 ml se distribuye en un pocillo de 2 ml de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Las poblaciones de control de las células no se tratan con impulsos eléctricos, sino que se distribuyen en pocillos de 2 ml. Todas las muestras se tratan con ultrasonidos durante 30 segundos a una densidad de potencia de 1,25 W/cm^{2} utilizando un cabezal de ultrasonidos (de impulso sencillo) de 3 MHz. A continuación, las células se incuban a 37ºC durante 21 horas en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%. Tras la incubación, se recogen las células y se determina la proporción de células que son apoptóticas o necróticas, tiñendo con el equipo de tinción Anexina-V-FLOUS (Roche, GB). Una vez que se han teñido las células, estas se suspenden en tampón HEPES y se analizan utilizando citometría de flujo.

Resultados del ejemplo 9

Los resultados obtenidos se representan en la figura 27. Estos resultados demuestran que el tratamiento con ultrasonidos solo determina una reducción aproximada del 20% en el número de células. Cuando se incrementa la tensión, el tratamiento combinado provoca una reducción muy significativa en el número de células, alcanzando finalmente dicho número un estado estacionario por encima de tensiones de 750 V.

Además de estudiar el número de células en las poblaciones restantes, se estudia la proporción de células apoptóticas y necróticas en dichas poblaciones supervivientes. Los resultados se representan también en la figura 27 y demuestran que una proporción significativamente superior de células que sobreviven después del tratamiento son apoptóticas. Estos resultados parecen indicar que el tratamiento de las células electrosensibilizadas con ultrasonidos facilita el inicio de la apoptosis en lugar de la necrosis.

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Ejemplo 10

Inducción de la apoptosis en tumores tras el tratamiento combinado de campos eléctricos y ultrasonidos in vivo

Como se representa en los ejemplos anteriores, el tratamiento de poblaciones de células de destino con campos eléctricos y ultrasonidos determina la inducción de la apoptosis in vitro. El objetivo de este ejemplo es demostrar que el tratamiento combinado con campos eléctricos seguido del tratamiento con ultrasonidos in vivo determina la inducción de la apoptosis.

Con dicho fin, se inducen tumores RIF-1 en ratones C3H y estos se emplean como tumores de destino para tratamientos combinados con impulsos eléctricos seguidos de ultrasonidos. Los animales de control no reciben ningún tratamiento. Las condiciones de la electrosensibilización comprenden el tratamiento con un régimen de impulsos dobles de 1,33 kV/cm, y el tratamiento con ultrasonidos comprende la utilización de ultrasonidos de onda pulsada (35% de onda continua) a 1 MHz y 3,57 W/cm^{2} durante 2 min. Después del tratamiento, se recogen los tumores de los animales de control no tratados y los tumores de los animales que han recibido el tratamiento, una vez transcurridas 0, 6, 12, 18 y 24 horas después del tratamiento. Tras obtener los tumores, estos se fijan en paraformaldehído al 4% (p/v) hasta el día siguiente. Entonces, se preparan secciones de cera de parafina para cada muestra y se tiñen utilizando el equipo de detección de muerte celular in situ TMR rojo (Roche, GB), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este procedimiento de tinción se basa en el marcaje de extremos libres mediante la transferasa deoxinucleotidil terminal (TUNEL), y la presencia de apoptosis se pone de manifiesto a través de una tinción fluorescente que se observa mediante microscopía de fluorescencia.

Resultados del ejemplo 10

Cuando se tiñen las secciones para detectar la apoptosis, los resultados obtenidos tras la observación con microscopía de fluorescencia son los representados en la figura 28. De las muestras de control, la única que presenta un ligero teñido positivo es la muestra de 24 horas, hecho que puede deberse a la inclusión de células normales en las secciones. Las demás muestras de control no manifiestan ningún indicio de apoptosis. En las muestras tratadas, la tinción de apoptosis resulta muy perceptible 12 horas después de aplicarse el tratamiento y también son claras las señales obtenidas después de 18 y 24 horas (figura 28). Los resultados demuestran claramente que el tratamiento combinado con campos eléctricos y ultrasonidos provoca el inicio de la apoptosis.

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Ejemplo 11

Efecto del tratamiento de tumores con ultrasonidos antes de la exposición a campos eléctricos in vivo

En esta serie de experimentos, se establecen tumores en ratones tal como se ha descrito anteriormente para el ejemplo 5. No obstante, en este ejemplo, los tumores se tratan con ultrasonidos antes de tratarlos con campos eléctricos.

En este caso, los animales se inoculan con tumores RIF-1 de la forma descrita anteriormente. A continuación, los tumores se tratan con ultrasonidos (2 minutos) a 1 MHz y a una densidad de potencia de 1,25 W/cm^{2}, en modalidad de aplicación de onda continua, y de 3,75 W/cm^{2}, en modalidad de aplicación de onda pulsada (35% de onda continua). Inmediatamente después, los tumores se tratan con campos eléctricos (impulsos dobles a la tensión predeterminada = 1,66 kV/cm, utilizando un sistema BTX 630 junto con electrodos Tweezertrodes de 7 mm). El crecimiento tumoral se supervisa midiendo el volumen tumoral de la manera descrita anteriormente.

Resultados del ejemplo 11

Los resultados se representan en la figura 29 y demuestran que el tratamiento de tumores con ultrasonidos antes de aplicar los campos eléctricos también presenta un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los tumores. Además, el efecto inhibitorio obtenido utilizando ultrasonidos de onda pulsada también en este caso es superior al observado utilizando ultrasonidos de onda continua.

Sorprendentemente, los resultados demuestran que la ventaja asociada a la utilización del tratamiento combinado con campos eléctricos y ultrasonidos en términos de tratamiento tumoral se obtiene tanto si los ultrasonidos se aplican antes como si se aplican después del tratamiento con campos eléctricos.

Ejemplo 12

Efecto del tratamiento con electricidad de corriente continua de baja tensión

En los ejemplos anteriores, se emplean campos eléctricos relativamente intensos. No obstante, también se han observado efectos antitumorales después del tratamiento de tumores con corriente continua (CC) de baja tensión solo (documento de Nordenstrom, Am. J. Clin. Oncol. 1989, 12, 530-536 y documento de Wojcicki et al., Med Sci. Monit. 2000, 6, 498-502). Se decide investigar si dicha corriente CC de baja tensión puede conferir, a los tumores u otro tipo de células, hipersensibilidad a los ultrasonidos de intensidad relativamente baja.

Se establecen tumores RIF-1 en ratones C3H receptores tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se insertan agujas horizontalmente en cada lado de los tumores y se conectan electrodos a las agujas. Se establece una corriente constante de 5 mA a través de las agujas durante un período de 15 minutos, y los tumores se tratan inmediatamente con ultrasonidos a 3,75 W/cm^{2} durante un período de 3 minutos. Durante el tratamiento, la intensidad del campo eléctrico varía entre 10 y 20 V/cm, incrementándose la intensidad de campo a medida que el tratamiento avanza. Los animales de control se tratan solo con corriente eléctrica. El volumen tumoral se supervisa entonces tal como se ha descrito anteriormente.

Resultados del ejemplo 12

Los resultados se representan en la figura 30 y demuestran que, en el animal que se trata con corriente eléctrica solo, el volumen tumoral se reduce significativamente a lo largo del período de tiempo estudiado, alcanzando un nivel mínimo al cabo de 13 días. Esto también ocurre en el animal que se trata con corriente eléctrica y ultrasonidos. Sin embargo, la velocidad a la que el volumen tumoral decrece es significativamente mayor. En este caso, el volumen tumoral alcanza el nivel mínimo al cabo de 4 a 6 días.

Debe tenerse en cuenta que, en este experimento, el tamaño tumoral inicial es mucho mayor al de otros estudios descritos previamente y, en ese contexto, el descenso del tamaño tumoral observado es muy drástico. Estos resultados demuestran que, aunque la electrosensibilización de los tumores a los ultrasonidos de intensidad relativamente baja se consigue mediante impulsos de de campo eléctrico de intensidad elevada, este fenómeno también se produce utilizando estrategias en las que se emplean intensidades de campo eléctrico bajas con corriente continua. Esta observación amplía el grado de utilidad de la presente tecnología, particularmente en casos en los que es necesario sensibilizar grandes áreas de tejido.

Ejemplo 13

Tratamiento de tumores con corriente continua junto con ultrasonidos a 5 W/cm^{2} y 1 MHz

El objetivo de los experimentos de este ejemplo es estudiar los efectos de los ultrasonidos a una mayor intensidad sobre los tumores electrosensibilizados con corriente continua. Con este fin, se establecen tumores RIF-1 en ratones C3H receptores tal como se ha descrito anteriormente y los tumores se tratan (i) con corriente continua solo a 5 mA durante 5 minutos, (ii) con ultrasonidos de onda pulsada solo a 5 W/cm^{2} durante 2 minutos a un 35% de onda continua e (iii) con corriente continua más ultrasonidos de onda pulsada en las condiciones citadas. El volumen tumoral se mide tal como se ha descrito previamente. Además, se supervisa también el crecimiento de los tumores de control no tratados.

Resultados del ejemplo 13

Los resultados se representan en la figura 31 y demuestran que el tratamiento con corriente eléctrica continua determina una disminución del volumen tumoral, aunque el tumor empieza a crecer nuevamente durante 4º o el 5º día. El tratamiento con ultrasonidos tiene un ligero efecto sobre el crecimiento tumoral, aunque no se detecta una reducción del volumen tumoral en ninguna fase. En el grupo de animales que recibe el tratamiento combinado con corriente continua y ultrasonidos, se observa una regresión completa que se mantiene durante el período de tiempo estudiado. Nuevamente, los resultados demuestran que el tratamiento combinado de los tumores con corriente eléctrica continua y ultrasonidos determina una drástica regresión del tumor.

Ejemplo 14

Tratamiento de tumores con corriente continua junto con ultrasonidos (seis animales)

El propósito de esta serie de experimentos descrita en este ejemplo es el de confirmar el resultado obtenido en el ejemplo previo (tratamiento con CC) y estudiar el destino de los animales que reciben tratamientos combinados durante un período de tiempo prolongado. En este caso, se utilizan 6 animales en cada grupo y tanto el tratamiento con CC como el tratamiento con ultrasonidos son similares a los descritos en el ejemplo 13. Tras aplicar el tratamiento, se mide el crecimiento tumoral de cada grupo, tal como se ha descrito previamente.

Resultados del ejemplo 14

Los resultados obtenidos se representan en la figura 32 y demuestran nuevamente que se observa una reducción significativa del crecimiento tumoral cuando los animales se tratan con campos eléctricos solo. En este caso, la masa tumoral se erradica tras el tratamiento, aunque en todos los animales vuelve a observarse crecimiento después del 4º día.

En el grupo que recibe el tratamiento combinado de ultrasonidos y campos eléctricos, las masas tumorales también se erradican. Cuando se supervisa este grupo de animales durante un período de tiempo prolongado, tres animales empiezan a presentar crecimiento aproximadamente el día 14, siendo sacrificados finalmente dichos animales el día 23. En el día 27, otros dos animales empiezan a presentar un crecimiento mensurable, siendo sacrificados dichos animales el día 35. A continuación, el único animal que queda se restablece por completo sin contraer la enfermedad durante todo el período de tiempo indicado en la figura 32. Aunque cinco de cada seis animales presentan crecimiento tumoral tras un tratamiento combinado, la supervivencia de un animal que no contrae la enfermedad demuestra que este sistema puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad agresiva.

Ejemplo 15

Tratamiento de tumores con ultrasonidos 22 horas después del tratamiento con corriente continua

En los experimentos previos se ha demostrado que el tratamiento de tumores con ultrasonidos durante períodos de tiempo prolongados tras la aplicación de los impulsos eléctricos presenta un efecto incrementado en términos de retraso del crecimiento tumoral. Para determinar si esto es aplicable o no al tratamiento con CC, se tratan animales que presentan tumores con CC (5 mA durante 5 min) y se deja que estos descansen durante un período de 22 horas. En esta fase, los animales que reciben el tratamiento combinado se exponen a ultrasonidos (5 W/cm^{2} a 1 MHz durante 2 minutos en modalidad pulsada a un 35% de onda continua). En estos experimentos, se emplean cuatro animales por grupo y se supervisa el crecimiento tumoral después del tratamiento, tal como se ha indicado anteriormente.

Resultados del ejemplo 15

Los resultados de estos experimentos se representan en la figura 33 y, de nuevo, confirman un efecto significativo del tratamiento de CC sobre el crecimiento tumoral. No obstante, como antes, los tumores empiezan a reaparecer en los animales tras el 4º día. En el grupo que recibe el tratamiento con CC seguido del tratamiento con ultrasonidos a las 22 h, las masas tumorales también se erradican por completo. Cuando se supervisan estos animales, se observa el crecimiento en un animal después del día 14, siendo sacrificado dicho animal el día 20. En otro animal de este grupo, el crecimiento se manifiesta después del día 30, siendo sacrificado dicho animal el día 37. En este grupo de animales que reciben el tratamiento combinado, dos de los 4 animales no contraen la enfermedad en toda la duración del experimento.

Estos resultados demuestran los efectos positivos del tratamiento con CC combinado con ultrasonidos en términos de erradicación del tumor. Además, los resultados demuestran también que las células tumorales que quedan después del tratamiento con CC permanecen sensibles a los ultrasonidos in vivo durante por lo menos 22 horas.

Otros aspectos

En esta sección y los párrafos numerados, se trata acerca de otros aspectos de la presente invención. Debe tenerse en cuenta que la presente invención comprende los aspectos indicados a continuación.

Se proporciona un aparato de ablación de una célula, preferentemente una célula nucleada, o un tejido que comprende dicha célula, comprendiendo el aparato: (a) unos medios de generación de campo eléctrico y (b) unos medios de generación de ultrasonidos.

Los medios de generación de campo eléctrico, los medios de generación de ultrasonidos o ambos tipos de medios pueden comprender una parte de cabezal que puede colocarse cerca de la célula o el tejido que se va a someter a ablación. Los medios de generación de campo eléctrico pueden ser capaces de generar energía de campo eléctrico para electrosensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada, de tal forma que esta se vuelve más sensible a la disrupción mediante ultrasonidos que una célula no sensibilizada. Preferentemente, los medios de generación de campo eléctrico comprenden un generador de campo eléctrico capaz de generar un campo eléctrico de entre aproximadamente 1 Volt/cm y aproximadamente 10 KVolts/cm en condiciones in vivo. Además, los medios de generación de ultrasonidos son preferentemente capaces de generar energía de ultrasonidos para realizar la disrupción selectiva de una célula de un organismo, que se ha electrosensibilizado previamente mediante exposición a la energía de un campo eléctrico. Además, los medios de generación de ultrasonidos son preferentemente capaces de generar ultrasonidos a un nivel de potencia comprendido entre aproximadamente 0,05 W/cm^{2} y aproximadamente 1,00 W/cm^{2}.

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Asimismo, se describe un dispositivo o un aparato adecuado para realizar la ablación de una célula (por ejemplo, dentro de un organismo).

En general, el dispositivo comprende unos medios de sensibilización y unos medios de disrupción, siendo los medios de sensibilización capaces de sensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada. Dicha célula sensibilizada se vuelve más sensible a la disrupción mediante una fuente de energía, comparada con una célula, preferentemente una célula nucleada, que no se ha sensibilizado. Los medios de disrupción son capaces de generar energía a una frecuencia o una energía suficiente para causar la disrupción de las células sensibilizadas, preferentemente células sensibilizadas nucleadas, preferentemente a una frecuencia o energía que al mismo tiempo es insuficiente para romper las células no sensibilizadas. En consecuencia, el dispositivo comprende unos medios de generación de campo eléctrico y unos medios de generación de ultrasonidos.

En una forma de realización, los medios de sensibilización comprenden unos medios de generación de campo eléctrico, mientras que los medios de disrupción comprenden unos medios de generación de ultrasonidos. En esta forma de realización, los medios de generación de campo eléctrico comprenden preferentemente unos medios de electrosensibilización que son capaces de sensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada, para volverla sensible a la disrupción mediante una fuente de energía. Preferentemente, los medios de electrosensibilización son capaces de generar energía de campo eléctrico para electrosensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada, de tal forma que esta se vuelve más sensible a la disrupción mediante ultrasonidos que una célula no sensibilizada. Preferentemente, los medios de electrosensibilización generan energía de campo eléctrico para electrosensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada, de un organismo a la energía de ultrasonidos, y dicha célula electrosensibilizada se vuelve sensible a la disrupción por ultrasonidos a una frecuencia y una energía suficientes para provocar la disrupción de la célula electrosensibilizada, pero insuficientes para provocar la disrupción de las células no sensibilizadas.

Los medios de generación de ultrasonidos son preferentemente capaces de generar energía de ultrasonidos para realizar la disrupción selectiva de una célula de un organismo, habiéndose electrosensibilizado previamente dicha célula mediante exposición a energía de campo eléctrico. Más preferentemente, el generador de ultrasonidos genera energía de ultrasonidos para realizar la disrupción selectiva de una célula de un organismo, habiéndose electrosensibilizado previamente dicha célula mediante exposición a energía de campo eléctrico, y los ultrasonidos se aplican a una frecuencia y una energía suficientes como para provocar la disrupción de la célula electrosensibilizada, pero insuficientes para provocar la disrupción de las células no sensibilizadas.

Los medios de generación de campo eléctrico preferentemente son capaces de generar un campo eléctrico, preferentemente un impulso, cuyo valor está comprendido entre aproximadamente 1 Volt/cm y aproximadamente 10 kVolts en condiciones in vivo. El generador de ultrasonidos es capaz de generar ultrasonidos a un nivel de potencia comprendido entre aproximadamente 0,05 W/cm^{2} y aproximadamente 100 W/cm^{2}.

Como se apreciará, el aparato puede suministrarse en unidades separadas, es decir, como un generador de campo eléctrico y un generador de ultrasonidos, o en forma de un dispositivo integrado.

A continuación, se describe una forma de realización preferida del aparato. Dicho dispositivo comprende una matriz de electrodos (que puede ser una matriz de dos agujas o varias agujas, en la que cada diagonal representa polos opuestos) dispuesta alrededor de un dispositivo de aplicación de ultrasonidos y aislada de este mediante un anillo de aislamiento que consta de un material que absorbe los ultrasonidos y aísla los electrodos de las descargas de cortocircuito. Los dispositivos pueden tener tamaños variables, es decir, el dispositivo puede consistir en un dispositivo adecuado para el tratamiento de lesiones superficiales o un dispositivo que puede insertarse en el cuerpo mediante caterización o laparoscopia.

La descarga el impulso eléctrico se realiza utilizando una fuente eléctrica o un paquete de alimentación adecuados, y los ultrasonidos se aplican antes, durante o después de la aplicación de los impulsos eléctricos.

La matriz de electrodos puede configurarse de una manera diferente. Por ejemplo, puede constar de un microelectrodo aislado insertado en el tejido y de una matriz de electrodos opuestos montada sobre el cabezal ultrasónico insertado en los tejidos circundantes. En el ámbito de la técnica, se conocen diversos tipos de matrices de electrodos, que se describen, por ejemplo, en los documentos US nº 5.720.921, WO99/62592, WO 98 56893 A, US nº 6.041.252 y US nº 5.873.849. El dispositivo descrito en la presente memoria puede emplear una o más de dichas configuraciones de electrodos.

Los electrodos pueden comprender unos medios adecuados para la introducción de una sustancia, preferentemente una sustancia líquida, en el tejido. Por ejemplo, los electrodos pueden comprender agujas inyectoras. Dichas agujas pueden utilizarse, por ejemplo, para administrar un agente inductor de muerte celular a las células tumorales o una solución salina para evacuar las células muertas.

El aparato está preferentemente adaptado para aplicar ultrasonidos, campos eléctricos o ambas cosas a una parte del cuerpo de un paciente, por ejemplo, un órgano. En consecuencia, el generador de ultrasonidos, el generador de campo eléctrico o ambos pueden comprender una parte de cabezal capaz de moverse de tal forma que puede situarse cerca al objetivo de la ablación. Como alternativa, cuando el objetivo es interno, puede facilitarse una sonda apropiada para disponerse cerca del objetivo. Por ejemplo, si el objetivo está constituido por unas células hepáticas, la sonda de ultrasonidos puede colocarse sobre el abdomen del paciente y de este modo los ultrasonidos se aplican sustancialmente al hígado. La parte de cabezal o la sonda pueden estar conectadas por medio de una conexión adecuada, tal como un cable, con el resto del dispositivo.

En otra forma de realización, los medios de electrosensibilización son capaces de generar un campo eléctrico como estímulo para causar la disrupción de una célula que ya se ha sensibilizado, por ejemplo, una célula sensibilizada mediante ultrasonidos. En esta forma de realización, por consiguiente, los medios de sensibilización comprenden unos medios de generación de ultrasonidos, mientras que los medios de disrupción comprenden unos medios de generación de campo eléctrico. Por consiguiente, los medios de generación de ultrasonidos son capaces de generar ultrasonidos para sensibilizar una célula, preferentemente una célula nucleada, a la disrupción mediante un estímulo tal como una fuente de energía (por ejemplo, un campo eléctrico). En general, dicha forma de realización puede comprender los medios de electrosensibilización y los medios de generación de ultrasonidos definidos en la forma de realización anterior, y en particular puede funcionar de manera similar a la del dispositivo representado en la figura 4.

Cada una de las solicitudes y patentes mencionadas anteriormente y cada documento citado o referenciado en cada una de las solicitudes y patentes anteriores, incluso durante la tramitación de cada una de las solicitudes y patentes anteriores ("documentos citados en solicitudes"), y las instrucciones o los catálogos de cualquier fabricante de cualquier producto citado o mencionado en cada una de las solicitudes y patentes anteriores y en cualquiera de los documentos citados en solicitudes, se incorporan a la presente memoria a título de referencia. Además, todos los documentos citados en este texto y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en este texto, y las instrucciones o los catálogos de cualquier fabricante de cualquier producto citado o mencionado en este texto, se incorporan a la presente memoria a título de referencia.

Las diversas modificaciones y variantes de los procedimientos y el sistema de la presente invención que se acaban de describir resultarán evidentes para los expertos en la materia y podrán ser realizadas por estos sin apartarse del alcance y del espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito con respecto a unas formas de realización preferidas particulares, debe tenerse en cuenta que, de conformidad con las reivindicaciones, no es necesario que la presente invención se limite indebidamente a dichas formas de realización particulares. En realidad, las diversas modificaciones de las modalidades descritas para realizar la presente invención, que resultarán obvias para los expertos en biología molecular o los campos relacionados, se han concebido para estar comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (27)

1. Aparato para la ablación de células nucleadas, comprendiendo el aparato:

(a)

unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico para generar una señal de campo eléctrico;

(b)

un componente de aplicación de campo eléctrico conectado para recibir la señal de campo eléctrico y que puede funcionar para aplicar un campo eléctrico a un sitio de tratamiento;

(c)

unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos para generar una señal de ultrasonidos;

(d)

un componente de aplicación de ultrasonidos conectado para recibir la señal de ultrasonidos y que puede funcionar para aplicar los ultrasonidos al sitio de tratamiento; y

(e)

un controlador operativo para controlar (i) los circuitos de generación de señales de campo eléctrico, de tal forma que el componente de aplicación del campo eléctrico aplique un campo eléctrico de una intensidad operativa para sensibilizar una célula nucleada en el sitio de tratamiento, e (ii) los circuitos de generación de señales de ultrasonidos para realizar la ablación de una célula nucleada en el sitio de tratamiento.

2. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 1, en el que los ultrasonidos son operativos para realizar la ablación de una célula nucleada sensibilizada en el sitio de tratamiento.

3. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de campo eléctrico y el componente de aplicación de ultrasonidos se alojan dentro de un cabezal de aplicación común.

4. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el controlador es operativo para aplicar el campo eléctrico antes de los ultrasonidos al sitio de tratamiento.

5. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el controlador es operativo para aplicar simultáneamente el campo eléctrico y los ultrasonidos al sitio de tratamiento.

6. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de campo eléctrico comprende un contacto eléctrico.

7. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de campo eléctrico comprende una pluralidad de contactos eléctricos situados en los vértices de un polígono regular, preferentemente un triángulo, un cuadrado, un pentágono, un hexágono o un heptágono.

8. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 7, que comprende asimismo uno o más electrodos de contacto dispuestos dentro de la circunferencia del polígono.

9. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de campo eléctrico comprende una pluralidad de electrodos de contacto dispuesto en una rejilla.

10. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el electrodo de contacto o cada uno de los electrodos de contacto comprende una aguja.

11. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 10, en el que la aguja o cada aguja es hueca.

12. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 11, en el que el aparato es operativo para administrar un agente inductor de muerte celular en la proximidad de la célula nucleada por medio de la aguja hueca o cada una de las agujas huecas.

13. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 12, en el que el aparato comprende asimismo un recipiente que contiene el agente inductor de muerte celular y unos medios para hacer llegar el agente inductor de muerte celular, a través de la aguja hueca, hasta la proximidad de la célula nucleada.

14. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 10, 11, 12 ó 13, en el que la aguja o cada aguja está aislada eléctricamente a lo largo de por lo menos una parte de su extensión, preferentemente por medio de un manguito aislante extensible.

15. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de campo eléctrico comprende un contacto eléctrico que comprende una parte conductora de una placa de contacto.

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16. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 15, en el que la parte conductora de la placa conductora se forma mediante técnicas de circuitos impresos.

17. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 16, en el que el aparato es operativo para conectar una pluralidad de señales de campo eléctrico con una pluralidad de contactos eléctricos.

18. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aparato es operativo para aplicar campos eléctricos de entre 1 V/cm y 10 kV/cm al sitio de tratamiento.

19. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende asimismo un componente de ultrasonidos diagnósticos que puede funcionar para facilitar imágenes de ultrasonidos del sitio de tratamiento.

20. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de ultrasonidos comprende un transductor de ultrasonidos.

21. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 20, en el que el aparato pueden funcionar para conectar una pluralidad de transductores de ultrasonidos con una pluralidad de señales de ultrasonidos.

22. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los circuitos de generación de señales de ultrasonidos pueden funcionar para aplicar ultrasonidos a una densidad de potencia media comprendida entre 0,1 W/cm^{2} y 7 W/cm^{2} al sitio de tratamiento.

23. Aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de aplicación de ultrasonidos está adaptado para acoplarse a la superficie de un tejido por medio de un depósito de presión de contacto dispuesto para deformar la superficie del tejido.

24. Aparato de ablación de células nucleadas según la reivindicación 23, en el que la superficie del tejido se deforma para permitir la focalización de los ultrasonidos en el sitio de tratamiento.

25. Utilización de un aparato de ablación de células nucleadas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un procedimiento de ablación de células nucleadas o tejidos in vitro o ex vivo.

26. Procedimiento de ablación de una célula nucleada in vitro o ex vivo, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

(a)

proporcionar un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que puede funcionar para generar una señal de campo eléctrico y una señal de ultrasonidos bajo control del controlador,

(b)

generar una señal de campo eléctrico para hacer que un componente de aplicación de campo eléctrico del aparato aplique un campo eléctrico a una célula nucleada para sensibilizarla; y

(c)

generar una señal de ultrasonidos para hacer que un componente de aplicación de ultrasonidos del aparato aplique ultrasonidos a la célula nucleada.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el aparato comprende unos circuitos de generación de señales de campo eléctrico para generar una señal de campo eléctrico, y unos circuitos de generación de señales de ultrasonidos para generar una señal de ultrasonidos.