ES2313530T3 - Aditivos de sales organicas para la amplificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
La utilización de 3-etil-1-[4-(3-etil-3H-bencimidazol-1-io)]-but-1-il]3H-bencimidazol-1-io como aditivo para la amplificación de ácidos nucleicos.
Description
Aditivos de sales orgánicas para la
amplificación de ácidos nucleicos.
La nueva invención está relacionada con el campo
de la amplificación de ácidos nucleicos. De forma más precisa, la
nueva invención proporciona compuestos y métodos para mejorar la
Reacción en Cadena de la Polimerasa.
La amplificación de DNA mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental en la
biología molecular. El análisis de ácidos nucleicos mediante PCR
requiere preparación de muestras, amplificación, y análisis del
producto. Aunque estos pasos se realizan normalmente de forma
secuencial, la amplificación y el análisis pueden realizarse de
forma simultánea. Se pueden añadir colorantes del DNA o sondas
fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y
utilizarse para analizar los productos de PCR durante la
amplificación. El análisis de las muestras se realiza a la vez que
la amplificación, en el mismo tubo y con el mismo instrumento. Esta
aproximación combinada disminuye la manipulación de la muestra,
ahorra tiempo y reduce enormemente el riesgo de contaminación del
producto en las siguientes reacciones, ya que no es necesario
retirar las muestras de sus recipientes cerrados para su posterior
análisis. El concepto de combinar la amplificación con el análisis
del producto se conoce como PCR "a tiempo real". Véase, por
ejemplo, la Patente Estadounidense Nº 6.174.670.
Se sabe desde hace tiempo que la concentración
iónica afecta fuertemente la temperatura de fusión de los híbridos
de DNA de doble cadena. También se sabe desde hace tiempo que los
iones metálicos u otros iones son capaces de unirse o interaccionar
con los ácidos nucleicos y las polimerasas de ácidos nucleicos, como
la polimerasa Taq termoestable utilizada para la PCR. En
consecuencia, la adición de dichos iones específicos en muchos
casos ha demostrado tener un fuerte impacto en el rendimiento de una
reacción de amplificación. En particular, se sabe que dependiendo
del cebador concreto y las secuencias de ácido nucleico diana, cada
reacción de PCR diferente tiene un rango óptimo específico y muy
estrecho de concentración de ion magnesio.
Un gran problema en la amplificación de ácidos
nucleicos, y más especialmente con la PCR, es la generación de
productos de amplificación inespecíficos como la formación de
dímeros de cebador artefactuales. En muchos casos, esto se debe al
cebado inespecífico de los oligonucleótidos y la posterior extensión
del cebador antes del procedimiento concreto de termociclado en sí,
ya que las polimerasas de DNA termoestables son también
moderadamente activas a temperatura ambiente. Por ejemplo,
frecuentemente se observan productos de amplificación debido la
dimerización del cebador al azar y su posterior extensión.
Se ha observado que la extensión de cebadores
hibridados inespecíficamente puede inhibirse mediante la adición de
fragmentos cortos de DNA de doble cadena (Kainz, P., et al.,
Biotechniques 28 (2000) 278-282). En este caso, la
extensión del cebador se inhibe a temperaturas por debajo del punto
de fusión del fragmento corto del DNA de doble cadena, pero es
independiente de la secuencia del DNA competidor en sí. No obstante,
se desconoce hasta que punto el exceso de DNA competidor influye en
el rendimiento de la reacción de amplificación de ácidos
nucleicos.
Alternativamente, se pueden utilizar aptámeros
de oligonucleótidos con una secuencia específica que resulta en una
estructura secundaria definida. Dichos aptámeros se han seleccionado
mediante la tecnología SELEX por su muy alta afinidad a la
polimerasa de DNA (US 5.693.502; Lin, Y., y Jayasena, S.D., J. Mol.
Biol. 271 (1997) 100-111). La presencia de dichos
aptámeros dentro de la mezcla de amplificación antes del proceso
concreto de termociclado en sí, resulta de nuevo en una alta
afinidad de unión a la polimerasa de DNA y consecuentemente una
inhibición lábil por calor de su actividad.
Debido al proceso de selección, no obstante,
todos los aptámeros disponibles pueden utilizarse sólo en
combinación con una especie particular de polimerasa de DNA.
Se ha visto que los inhibidores de
oligonucleótidos (WO 01/02559) con los extremos 3' y 5' bloqueados
aumentan la sensibilidad y especificidad de las reacciones de PCR.
Éstos compiten con el cebador en la unión con la polimerasa.
También se sabe que la adición de la proteína de
unión a cadena sencilla (US 5.449.603) o de tRNA (Sturzenbaum, S.
R., Biotechniques 27 (1999) 50-52) resulta en la
asociación no covalente de estos aditivos a los cebadores. Esta
asociación se elimina durante el calentamiento en la PCR. Se ha
encontrado también que la adición de helicasas de DNA evita la
hibridación aleatoria de los cebadores (Kaboev, O. K., et
al., Bioorg Khim 25 (1999) 398-400). Además, en
muchos casos puede utilizarse el poliglutamato (WO 00/68411) para
inhibir la actividad polimerasa a bajas temperaturas.
Otros aditivos orgánicos conocidos en la
materia, como el DMSO, betaínas y formamidas (WO 99/46400; Hengen,
P. N., Trends Biochem. Sci. 22 (1997) 225-226;
Chakrabarti, R., y Schutt, C. E., Nucleic acids Res. 29 (2001)
2377-2381) dan como resultado una mejora en la
amplificación de secuencias ricas en GC, en lugar de evitar la
hibridación inespecífica. De forma similar, la heparina puede
estimular la transcripción iniciada in vitro
(run-on) presumiblemente mediante la eliminación de
proteínas como las histonas para hacer accesible el DNA cromosómico
(Hildebrand, C. E., et al., Biochimica et Biophysica Acta 477
(1977) 295-311). En particular, la patente WO
99/46400 describe los efectos beneficiosos en el rendimiento de la
PCR al añadir compuestos como la 4-metilmorfolina
N-óxido, betaína y los
N-alquil-imidazoles como la prolina,
1-metilimidazol o 4-metilimidazol.
Por contra, se ha demostrado que los compuestos de bencimidazol
trifosfato cuando se utilizan como protección del extremo 5' del
mRNA pueden inhibir la traducción in vitro (Cai et
al., Biochemistry 38 (1999) 8538-8547.
Desafortunadamente, ninguno de los aditivos de
PCR descritos en la materia hasta el momento puede proporcionar una
especificidad absoluta de hibridación del cebador mientras se
mantiene una sensibilidad suficiente.
Por lo tanto, existe una necesidad en la materia
de proporcionar un método de PCR alternativo, que sea barato, fácil
de realizar, y -lo más importante- que mejore el rendimiento de la
reacción de PCR en sí.
Así, la presente descripción está dirigida a la
utilización de un bencimidazolio, que comprende una cadena lateral
en al menos uno de sus residuos N, pudiendo ser dicha cadena tanto
un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, como un aditivo para
una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que se caracteriza
porque n es preferiblemente \geq3.
En una realización, la presente descripción está
dirigida a la utilización de un bencimidazolio, que comprende una
cadena lateral en al menos uno de sus residuos N, pudiendo ser dicha
cadena tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, que se
caracteriza porque n es preferiblemente \geq3 y dicho
bencimidazolio posee la fórmula
que se caracteriza porque R1 y un
R2 están seleccionados de forma independiente de un grupo que
consiste en H, alquilo C1, alquilo C2, alquilo C3, alquilo
C4,
-
(CH2)_{o}-O-(CH2)_{p}- H, en el
que o+p \leq3,
\vskip1.000000\baselineskip
en los que q \leq6, y R3 =
alquilo
C_{1-4}.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, dicho
bencimidazolio es
3-etil-1-[4-(3-etil-3H-benzimidazol-1-io)]-but-1-ilo]3H-benzimidazol-1-io.
Se ha demostrado que es ventajoso que dichos
compuestos particulares de bencimidazolio se añadan a la mezcla de
amplificación como sales, con un sulfonato o un halogenuro como
contraión.
La adición de los compuestos descritos
anteriormente puede utilizarse en general para disminuir las
interacciones entre pares de bases de nucleótidos, para disminuir
la temperatura de fusión de un producto de amplificación.
La adición de los compuestos descritos
anteriormente a una mezcla de reacción de amplificación puede
también utilizarse para aumentar la eficiencia de una reacción de
amplificación y una reacción de amplificación particular en la que
dicha amplificación se monitoriza en tiempo real.
Además, también está dentro del alcance de la
presente descripción, si un compuesto tal como se ha descrito antes
se utiliza como aditivo para la determinación del punto de fusión de
ácidos nucleicos de un producto de amplificación o un híbrido de
sonda-ácido nucleico diana.
En otro aspecto, la presente descripción también
está dirigida a una composición que comprende todos los componentes
necesarios para realizar una reacción de ácidos nucleicos y un
compuesto descrito anteriormente.
En aún otro aspecto, la presente descripción
está dirigida a un equipo que comprende una composición con
componentes necesarios para realizar una reacción de ácidos
nucleicos y un compuesto descrito anteriormente.
El uso de bencimidazolio comprende una cadena
lateral en al menos uno de sus residuos N, pudiendo ser dicha
cadena tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, que se
caracterizan porque n es \geq3, aumenta la eficiencia,
sensibilidad y especificidad de la reacción de amplificación. El
aumento de la eficiencia de amplificación se observa en una
reacción de amplificación típica, en el hecho de que la adición de
dicho bencimidazolio resulta en un aumento en la cantidad de
producto de amplificación finalmente sintetizada y/o en que la
síntesis de cierta cantidad de un producto de amplificación se logra
en ciclos de amplificación más tempranos. El aumento de la
especificidad de la amplificación se observa mediante el hecho de
que la adición de dicho bencimidazolio resulta en la reducción de
la síntesis de productos de amplificación inespecíficos como
dímeros de cebador.
Además, la presencia de tales sales de
bencimidazolio facilita el diseño y optimización de las condiciones
de nuevos ensayos, ya que pueden eliminarse los efectos inhibitorios
debidos a los cationes inorgánicos.
De acuerdo con la presente descripción, es
ventajoso utilizar cualquier clase de compuesto bencimidazolio que
comprenda una cadena lateral en al menos uno de sus residuos N,
pudiendo ser dicha cadena tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn
sustituido, que se caracterizan porque n es \geq3.
Preferiblemente, dichos compuestos presentan la
fórmula genérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que se caracteriza porque R1 puede
ser tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, que se
caracterizan porque n es \geq3. R2 se selecciona de H, un alquilo
Cn o un alquilo Cn sustituido, que se caracterizan porque n es
\geq3.
\newpage
Más preferiblemente, dichos compuestos poseen la
fórmula
que se caracteriza porque R1 y un
R2 se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en
H, alquilo C1, alquilo C2, alquilo C3, alquilo C4,
-(CH2)_{o}-O-(CH2)_{p}- H, en el
que o+p
\leq3,
\vskip1.000000\baselineskip
en los que q \leq6, pero
preferiblemente 4, y R3 = alquilo C_{1-4}, con la
condición de que al menos uno de entre R1 y R2 sea un alquilo Cn o
un alquilo Cn sustituido, que se caracterizan porque n es
\geq3.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, dicho
bencimidazolio es un mono-bencimidazolio que se
caracteriza porque R1 es H o alquilo C1-C4, y R2 es
alquilo C1-C4, por ejemplo
1-metil-3-propil-bencimidazolio
o 1
butil-3-metil-benzimidazolio.
En otra realización particular, dicho
bencimidazolio es un bis-bencimidazolio, que se
caracteriza porque R1 es un alquilo C1-C4 y R2 es
una cadena C1-C6 que en el átomo de C distal está
sustituido por un segundo imidazol o grupo benziimidazol. Ejemplos
para esta realización particular son
3-etil-1-[4-(3-etil-3H-benzimidazol-1-io)]but-1-il]-3H
benzimidazol-1-io, y
3-metil-1-[4-(3-metil-3H-benzimidazol-1-io)]
but-1-il]-3H
benzimidazol-1-io.
En una realización alternativa, en dicho
compuesto de acuerdo con la fórmula I, ambos R1 y R2 son -CH_{3}.
Dicha estructura molecular proporciona a la molécula el grado
suficiente de hidrofobicidad necesario para alcanzar el rendimiento
deseado para potenciar la reacción de PCR.
Se ha comprobado que es ventajoso si dichos
compuestos bencimidazolio particulares se añaden a la mezcla de
amplificación como sales, con un sulfonato o un halogenuro como
contraiones. Preferiblemente, el sulfonato es un toluilsulfato o un
ditoluilsulfato. También preferiblemente, el halogenuro es yodo.
Estas sales están disponibles comercialmente en
empresas como Sigma o pueden sintetizarse de acuerdo con los
métodos de química estándar conocidos en la técnica.
No obstante, también se describe que, en el caso
de los compuestos bencimidazolio descritos anteriormente se añaden
a la mezcla de amplificación como compuestos sin cargar, mientras
sean disolubles.
Se ha demostrado que todos los compuestos
descritos anteriormente son ventajosos para las siguientes
aplicaciones, usos, composiciones, mezclas de reacción y
equipos:
Diferentes usos de un compuesto
bencimidazolio que comprende una cadena lateral en al menos uno de
sus residuos N, pudiendo ser dicha cadena tanto un alquilo Cn o un
alquilo Cn sustituido, que se caracterizan porque n > 3.
Preferiblemente, la reacción de amplificación de
ácidos nucleicos es una reacción en cadena de la polimerasa, que
utiliza un cebador directo y uno reverso, una polimerasa
termoestable de DNA y nucleósidos trifosfato para poder generar un
producto de amplificación durante un protocolo de termociclado
ajustado que comprende una fase de hibridación de cebadores, una
fase de elongación del cebador y una fase de desnaturalización.
También preferiblemente, el compuesto de acuerdo con la invención se
añade a la mezcla de amplificación en forma de una sal.
La potenciación de la especificidad de la
reacción de PCR puede ser debida probablemente a la inhibición de
la formación de dímeros de cebadores tal como se mostrará en algunos
ejemplos. En el caso de que se use una concentración de cebador en
un rango en el que la tasa de hibridación del cebador sea un paso
limitante de la reacción de amplificación, esta inhibición de la
formación de dímeros de cebadores puede también llevar a un aumento
de la sensibilidad para detectar ácidos nucleicos diana de
abundancia baja.
La concentración final exacta óptima del
bencimidazol específico que puede utilizarse según la invención, no
obstante, puede variar dependiendo del derivado de bencimidazol
exacto que se utiliza y también dependiendo de la naturaleza de los
otros compuestos de la mezcla de amplificación.
También se describe que, si un bencimidazol
específico utilizado de acuerdo con la invención se añade a una
reacción de RT-PCR, que se caracteriza porque una
secuencia molde de RNA es amplificada. La RT-PCR
puede realizarse de acuerdo con diferentes protocolos, en los que
la síntesis de la primera y segunda cadenas se realiza mediante dos
enzimas diferentes o utilizando la misma enzima para los dos
pasos.
Para la síntesis de la primera cadena, puede
utilizarse cualquier tipo de polimerasa de DNA dependiente de RNA
(transcriptasa reversa), por ejemplo, transcriptasa reversa de AMV o
transcriptasa reversa de MMLV. Posteriormente, el híbrido RNA/cDNA
se somete a una desnaturalización térmica o alternativamente, el
molde de RNA incluido en el híbrido puede digerirse mediante RNasa
H. La síntesis de la segunda cadena y la amplificación puede
realizarse entonces en presencia de un aditivo con cualquier tipo de
polimerasa de DNA dependiente de RNA termoestable como por ejemplo,
la polimerasa de DNA Taq de acuerdo con los protocolos.
Alternativamente, para una aproximación en la
que la síntesis de la primera y segunda cadenas se realiza con una
enzima, pueden utilizarse polimerasas de DNA termoestables como las
de Thermus thermophilus o C. Therm (Roche
Diagnostics) en presencia de un aditivo de acuerdo con la
invención.
En una realización específica, el bencimidazol
específico que se utiliza de acuerdo con la invención puede
utilizarse como aditivo para la mezcla de amplificación de la PCR a
tiempo real. En dicha aproximación cinética, la formación de
productos de PCR se mide normalmente en termocicladores que poseen
dispositivos adicionales para monitorizar las señales de
fluorescencia durante la reacción de amplificación.
Por ejemplo, pueden utilizarse sondas de
hibridación marcadas de forma fluorescente para la monitorización a
tiempo real. Aquellas sondas de hibridación utilizadas para el
método original de acuerdo con la invención son normalmente ácidos
nucleicos de cadena sencilla, como DNA o RNA de cadena sencilla o
derivados de los mismos, o alternativamente LNA o PNA que hibridan
a la temperatura de hibridación de la reacción de amplificación con
el ácido nucleico diana. Estos oligonucleótidos normalmente poseen
una longitud de 20 a 100 nucleótidos.
El marcaje puede introducirse sobre cualquier
ribosa o grupo fosfato del oligonucleótido dependiendo del formato
particular de detección. Son preferibles los marcajes en los
extremos 5' y 3' de las moléculas de ácidos nucleicos.
El tipo de marcaje debe detectarse en modo a
tiempo real de la reacción de amplificación. Esto no sólo es
posible para las sondas marcadas de forma fluorescente sino que
también es posible con la ayuda de marcajes que pueden detectarse
mediante RMN. Los métodos que son particularmente preferidos son los
que los ácidos nucleicos amplificados se detectan con la ayuda de
al menos una sonda de hibridación marcada de forma fluorescente.
Son posibles muchos procedimientos de ensayo
diferentes. Son particularmente útiles los siguientes formatos de
detección en relación con el uso de un bencimidazolio que comprende
una cadena lateral en al menos uno de sus residuos N, pudiendo ser
dicha cadena tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, que
se caracterizan porque n \geq3:
Estas sondas de hibridación están también
marcadas con un primer componente y con un bloqueador, estando los
marcajes preferiblemente localizados en ambos extremos de la sonda.
Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos
componentes están próximos en el espacio en la solución. Tras la
hibridación con los ácidos nucleicos diana, ambos componentes se
separan el uno del otro de forma que puede medirse la emisión de
fluorescencia del primer componente después de la excitación con
luz de una longitud de onda adecuada (US 5.118.801).
El formato de ensayo con sonda de hibridación
FRET es especialmente útil para todo tipo de ensayos homogéneos de
hibridación (Matthews, J.A., y Kricka, L.J., Analytical Biochemistry
169 (1988) 1-25). Se caracteriza por dos sondas de
hibridación de cadena sencilla que se utilizan de forma simultánea y
son complementarias en sitios adyacentes de la misma cadena del
ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con
diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excitan con luz de
una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la
energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio
de la transferencia de energía mediante resonancia de la
fluorescencia, de tal forma que puede medirse una emisión
fluorescente del segundo componente cuando ambas sondas de
hibridación se unen a posiciones adyacentes de la molécula diana a
detectar. Alternativamente, para monitorizar el aumento de la
fluorescencia del componente aceptor de FRET, también es posible
monitorizar la disminución de la fluorescencia del componente
donador de FRET como una medición cuantitativa del evento de
hibridación.
En particular, el formato de sonda de
hibridación FRET puede utilizarse en la PCR a tiempo real, para
poder detectar el DNA diana amplificado. Entre todos los formatos
de detección conocidos en la técnica de la PCR a tiempo real, el
formato de sonda de hibridación FRET se ha determinado que es el de
mayor sensibilidad, mayor exactitud y fiabilidad (WO 97/46707; WO
97/46712; WO 97/46714). Como alternativa a la utilización de dos
sondas de hibridación FRET, también es posible utilizar un cebador
marcado con fluorescencia y sólo una sonda de oligonucleótidos
marcada (Bernard, P.S., et al., Analytical Biochemistry 255
(1998) 101-107). Ésta puede escogerse de forma
arbitraria mientras el cebador esté marcado con el compuesto donador
de FRET o el compuesto aceptor de FRET.
Al margen de la PCR y la PCR a tiempo real, las
sondas de hibridación FRET se utilizan para el análisis de la curva
de fusión. En este tipo de ensayo, los ácidos nucleicos diana se
amplifican primero en una reacción típica de PCR con cebadores de
amplificación adecuados. Las sondas de hibridación también pueden
estar presentes durante la reacción de amplificación o añadirse
a posteriori. Tras completar la reacción de PCR, la
temperatura de la muestra se aumenta de forma constitutiva, y se
detecta la fluorescencia mientras la sonda de hibridación esté
unida al DNA diana. A la temperatura de fusión, las sondas de
hibridación se liberan de su diana, y la señal fluorescente
disminuye inmediatamente hasta el nivel de ruido de fondo. Esta
disminución se monitoriza con una representación adecuada de
fluorescencia versus tiempo-temperatura, de forma
que puede determinarse un valor de la primera derivada, en la que
se observa el máximo descenso de fluorescencia.
Si durante dicho análisis de la curva de fusión,
está presente en la muestra un bencimidazol que comprende una
cadena lateral en al menos uno de sus residuos N, pudiendo ser dicha
cadena tanto un alquilo Cn como un alquilo Cn sustituido, que se
caracterizan porque n \geq3, las curvas obtenidas serán más
agudas, cuando se determina la primera derivada de la
correspondiente representación de la fluorescencia versus tiempo de
temperatura.
Este formato de detección consiste en un único
oligonucleótido marcado con un marcador único fluorescente en
cualquiera de los extremos 5'- o 3'- (WO 02/14555). Se pueden
utilizar dos diseños diferentes para el marcaje de los oligos:
sondas bloqueadoras G y sondas desbloqueadoras Nitroindol. En la
realización de bloqueo G, el marcador fluorescente está unido a una
C en los extremos 5'- o 3'- del oligo. La fluorescencia disminuye
significativamente cuando la sonda está hibridada con la diana, en
el caso de que dos G estén localizadas en la cadena diana opuesta a
la C y en la posición 1 al lado de la sonda de oligonucleótido
complementaria. En la realización de desbloqueo de Nitroindol, el
marcador fluorescente está unido al Nitroindol en el extremo 5'- o
3'- del oligonucleótido. El Nitroindol de alguna forma disminuye la
señalización fluorescente de la sonda libre. La fluorescencia
aumenta cuando la sonda está hibridada con el DNA diana gracias a un
efecto desbloqueador.
Una sonda de hibridación de una sola cadena está
marcada con dos componentes. Cuando el primer componente se excita
con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se
transfiere al segundo componente, el llamado bloqueador, de acuerdo
con el principio de la transferencia de energía por resonancia de la
fluorescencia. Durante el paso de hibridación de la reacción de
PCR, la sonda de hibridación se une al DNA diana y es degradado
mediante la actividad exonucleasa 5'-3' de la
Polimerasa Taq en la posterior fase de elongación. Como resultado,
el componente fluorescente excitado y el bloqueador están
espacialmente separados el uno del otro y así se puede medir la
emisión de fluorescencia del primer componente. Los ensayos con
sonda TaqMan se describen en detalle en las US 5.210.015, US
5.538.848 y US 5.487.972. Las sondas de hibridación TaqMan y las
mezclas de reactivos se describen en la US 5.804.375.
Además, se han descrito recientemente otros dos
formatos restringidos a la detección específica de alelo que están
basados en el principio de la detección específica de la liberación
de un nucleótido marcado en el extremo 3', debido a una situación
de emparejamiento o falta de emparejamiento en su unión al ácido
nucleico diana. La patente US 6.391.551 describe un método, que se
caracteriza porque el nucleótido terminal 3' de una sonda de
hibridación es liberado por una enzima despolimerizante en el caso
de que suceda un emparejamiento perfecto entre la secuencia diana y
la sonda. De forma similar, la patente EP 0 930 370 sugiere utilizar
un cebador marcado con una porción marcadora y una bloqueadora, que
se caracteriza porque la actividad de corrección de lectura de
3'-5' elimina una porción, en el caso de que no
suceda un emparejamiento perfecto entre el cebador y la diana
de
amplificación.
amplificación.
También se ha descrito que, si se realiza una
PCR a tiempo real en presencia de un aditivo de acuerdo con la
invención, el producto de amplificación se detecta utilizando una
matriz de unión a un ácido nucleico de doble cadena. Por ejemplo,
el respectivo producto de amplificación también puede detectarse de
acuerdo con la invención mediante un colorante fluorescente de
unión a DNA que emite la correspondiente señal fluorescente tras su
interacción con el ácido nucleico de doble cadena tras su excitación
con luz de una longitud de onda adecuada. Se ha comprobado que los
colorantes SybrGreen I y SybrGold (Molecular Probes) son
particularmente adecuados para esta aplicación. Alternativamente
pueden utilizarse agentes intercalantes. Sin embargo, en este
formato, para discriminar diferentes productos de amplificación, es
necesario realizar un respectivo análisis de la curva de fusión (US
6.174.670).
Debido al hecho de que la detección de
amplicones a tiempo real con este formato no puede discriminar entre
productos específicos y artefactos de amplificación como los
dímeros de cebadores, suele realizarse un subsiguiente análisis de
la curva de fusión. Tras completar la reacción de PCR, la
temperatura de la muestra se aumenta constitutivamente, y la
fluorescencia se detecta mientras el SybrGreen está unido al DNA de
doble cadena presente en las muestras. Tras la disociación del DNA
de doble cadena la señal se reduce inmediatamente. Este descenso es
monitorizado mediante una gráfica apropiada de fluorescencia frente
a temperatura a lo largo del tiempo, de forma que puede
determinarse una primera derivada en la que se observa el máximo
descenso de fluorescencia. Como los DNA de doble cadena de dímeros
de cebadores son normalmente cortos, la disociación en DNA de cadena
sencilla ocurre a temperaturas bajas comparado con la disociación
del producto de amplificación específico de doble cadena.
Si durante el análisis de tal curva de fusión,
se encuentra presente en la mezcla bencimidazolio que comprende una
cadena lateral en al menos uno de sus residuos N, siendo dicha
cadena un alquilo C_{n} o un alquilo C_{n} sustituido, que
se caracteriza porque n \geq3, se obtienen curvas mucho más
definidas en muchos casos, cuando se determina la primera derivada
de una respectiva gráfica de fluorescencia frente a la temperatura
a lo largo del tiempo. En particular, esto es cierto para aquellas
realizaciones, en las que se utilizan los compuestos de
bis-bencimidazolio de acuerdo con la invención.
En otra realización de la descripción que
también puede incluir una monitorización a tiempo real, las
reacciones de amplificación se realizan en presencia de un aditivo
de acuerdo con la invención mediante un termociclado rápido, en el
que un ciclo es de menos de un minuto. La base instrumental de tal
termociclado rápido la proporciona por ejemplo el LightCycler
(Roche Diagnostics GmbH) y se describe en la WO 97/46707 y la WO
97/46712. De acuerdo con la presente invención, la hibridación de
cebadores no es el paso limitante de la tasa de amplificación
cuantitativa de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra
en poca abundancia. Por lo tanto, los parámetros temporales para un
respectivo protocolo de termociclado multiplex para amplificar
parámetros de poca abundancia no necesitan optimizarse comparado
con cualquier tipo de protocolo de termociclado conocido en la
materia.
También se describe que, si se utiliza un
bencimidazolio que comprende una cadena lateral en al menos uno de
sus residuos N, siendo dicha cadena un alquilo C_{n} o un alquilo
C_{n} sustituido, caracterizado porque n \geq3 como aditivo
para una mezcla que contiene ácidos nucleicos para reducir los
efectos de la hibridación no específica mediante una rehibridación
lenta del amplicón. Además de su efecto positivo en la prevención
de la formación de dímeros de cebadores en un aproximación de PCR de
inicio en caliente, la adición de tal bencimidazol también puede
potenciar la especificidad de cualquier tipo de método de
hibridación analítico como, por ejemplo el análisis de Southern
blot, análisis de Northern blot, análisis de Dot blot, etc.
En otro aspecto de la descripción, puede
utilizarse tal bencimidazolio que comprende una cadena lateral en
al menos uno de sus residuos N, siendo dicha cadena un alquilo
C_{n} o un alquilo C_{n} sustituido, caracterizado porque n
\geq 3 como aditivo para la determinación de puntos de fusión de
ácidos nucleicos, es decir la determinación de las temperaturas de
fusión a las que una molécula híbrida de ácidos nucleicos al menos
parcialmente de doble cadena se desnaturaliza en dos moléculas de
cadena sencilla independientemente de una reacción de PCR a tiempo
real.
En otro aspecto, la invención está relacionada
con una composición o mezcla de reacción que comprende los
componentes necesarios para realizar una reacción de amplificación
de ácidos nucleicos y un bencimidazolio que comprende una cadena
lateral en al menos uno de sus residuos N, siendo dicha cadena un
alquilo C_{n} o un alquilo C_{n} sustituido, que se caracteriza
porque n \geq 3. En una realización, la composición novedosa es
una composición genérica, que comprende todos los componentes
necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos pero carece de
cebadores de amplificación específicos. En una segunda realización,
la composición novedosa o mezcla de reacción es una composición
específica de parámetro que comprende todos los componentes
necesarios para realizar una reacción de amplificación específica
que incluye un par específico de cebadores de amplificación. En una
tercera realización, una composición o mezcla de reacción de acuerdo
con la segunda realización comprende adicionalmente matrices de
detección como sondas de hibridación fluorescentes adecuadas o
compuestos de unión a ácidos nucleicos ds como el SybrGreen. En una
cuarta realización, una composición o mezcla de reacción de acuerdo
con la tercera realización comprende de forma adicional una muestra
de ácido nucleico a partir de la que el ácido nucleico diana se
amplificará.
De forma similar, la invención está relacionada
con un equipo que comprende una composición con todos los
componentes necesarios para realizar una reacción de ácidos
nucleicos en presencia de un bencimidazolio que comprende una
cadena lateral en al menos uno de sus residuos N, siendo dicha
cadena un alquilo C_{n} o un alquilo C_{n} sustituido, que se
caracteriza porque n \geq3. Preferiblemente, estos equipos
comprenden composiciones descritas con las realizaciones 1, 2 y 3
anteriores. Alternativamente, los componentes necesarios para la
amplificación y el aditivo de acuerdo con la invención pueden estar
presentes en diferentes recipientes de almacenamiento.
Figura 1a: Análisis de la curva de fusión de la
reacción de PCR sin el compuesto 1.
A (5 x 10^{6} copias): formación de producto
de PCR específico
B (5 x 10 copias): formación de dímeros de
cebadores con un punto de fusión menor
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1b: Análisis de la curva de fusión de la
reacción de PCR con el compuesto 1
A (5 x 10^{6} copias): formación de producto
de PCR específico
C (5 x 10 copies) formación de producto de PCR
específico
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Electroforesis en gel del producto de
PCR de molde largo (Agarosa al 1%)
A: banda diana
B: productos de PCR no específicos
C: dímeros de cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Mejora de la sensibilidad y eficiencia
de la PCR
A: eficiencia de la PCR sin el compuesto 1 o 2:
1,869
B: eficiencia de la PCR con el compuesto 2:
2,027
C: eficiencia de la PCR con el compuesto 1:
1,891
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 20,0 g de bencimidazol (169 mmol)
y 26,4 g de yodometilo (186 mmol) en 100 ml de acetonitrilo y se
sometieron a reflujo durante 7 horas. Tras la eliminación del
solvente bajo vacío el residuo se purificó con gel de sílice
(acetato de etilo/petróleo 9:1).
Se disolvieron 3,2 g de butanol (43,2 mmol) en
80,0 ml de piridina y se añadieron lentamente 9,47 g de sulfocloruro
de toluilo (49,7 mmol) a 0ºC. Tras una agitación de 3 horas a 0ºC
la mezcla de reacción se añadió a 400 ml de agua helada y se
añadieron 30,0 ml de HCl 2N. La fase orgánica se separó y disolvió
en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con HCl 2N y se secó
sobre sulfato magnésico. Tras la eliminación del solvente el de
sulfonato de butilo se utilizó directamente sin posterior
purificación.
Se añadieron 1,8 g de metilbencimidazol (13,6
mmol) y 3,11 g de sulfobutirato de tolueno (13,6 mmol) a 30,0 ml de
acetonitrilo y se sometieron a reflujo durante 24 horas. El solvente
se eliminó bajo presión reducida y el residuo se disolvió en 70,0
ml de éter de dietilo. Tras una filtración el residuo se lavó a
continuación con éter de dietilo y acetato de etilo. Tras la
eliminación del solvente se obtuvieron 4,64 g (12,9 mmol) del polvo
cristalino.
Rendimiento del 64%
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d6):
9,7 (s, 1H), 8,1 (dd, 2H), 7,7 (m, 2H), 7,5 (d,
2H), 7,10 (d, 2H), 4,48 (t, 2H), 4,07 (s, 1H), 2,29 (s, 3H), 1,86
(m, 2H), 1,35 (m, 2 H), 0,94 (t, 3H).
Se utilizaron dos equipos diferentes para este
experimento:
- -
- Equipo de síntesis de la primera cadena de cDNA LC-Transkriptor (Nº de Cat.: 04379012001 de Roche Diagnostics GmbH) que contiene la mezcla de enzima.
- -
- Equipo de genes de mantenimiento LC-h-G6PDH (Nº de Cat.: 03261883001 de Roche Diagnostics GmbH) que contiene la mezcla de cebadores y el RNA molde de G6PDH, MgCl_{2} y agua.
Se prepararon seis diluciones individuales
seriadas del RNA estándar de G6PDH con concentraciones de c =
5*10^{6} copias/5 \mul, 5*10^{5} copias/5 \mul, 5*10^{4}
copias/5 \mul, 5*10^{3} copias/5 \mul, 5*10^{2} copias/5
\mul y 5*10 copias/5 \mul en agua de grado PCR.
Se realizó una PCR con el instrumento
LightCycler^{TM} (Roche Diagnostics GmbH) en presencia o ausencia
del compuesto 1 del ejemplo 1 a 10 mM.
Los valores para la desnaturalización,
amplificación y análisis de la curva de fusión se programaron como
sigue:
Se añadieron 5 \mul de estándar: volumen
total: 20 \mul
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
1
\newpage
Programa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
3
\newpage
Programa
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
5
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se monitorizó en tiempo real
utilizando el modo SybrGreen del instrumento LightCycler y se
determinaron los ciclos umbral de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los ciclos umbral obtenidos en relación a la
concentración del molde se muestran en la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la imposibilidad de distinguir la
formación de productos de PCR específicos y no específicos en un
formato de SybrGreen la validez de la reacción de
RT-PCR se confirmó mediante el análisis de la curva
de fusión en el instrumento LightCycler de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Figuras 1a y 1b). Como puede
observarse a continuación, a una concentración de molde de
5*10^{4} copias se detectó una importante formación de dímeros de
cebadores con un punto de fusión bajo (Figura 1a) sin compuesto 1.
En presencia de compuesto 1 la formación de dímeros de cebadores se
redujo fuertemente (Figura 1b). Incluso con una concentración de
molde de 5 x 10 copias se observó la formación de producto de PCR
específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este experimento se utilizó el compuesto 2
(SIGMA (Nº Cat.: L203599) y el sistema "Expand High Fidelity PCR
System" (de Roche Diagnostics GmbH, Nº Cat. 1732650) que contiene
la mezcla de enzima Expand High Fidelity, tampón Expand High
Fidelity (10 x) con MgCl_{2} 25 mM y se utilizó una mezcla de
nucleótidos para PCR (Roche Diagnostics GmbH, Nº Cat. 11814362) que
contiene la mezcla de nucleótidos para PCR a 10 mM.
Los cebadores fueron:
| Cebador Roche (10 \muM) | 5'-GAG GTC CGG CAG CGT CAG G-3' | (Id. de Sec. Nº. 1) |
| Cebador Roche (10 \muM) | 5'-CGC AGG TCG CGA CGC AAC G-3' | (Id. de Sec. Nº. 2) |
\newpage
La PCR se realizó con un instrumento Blockcycler
en presencia o ausencia de compuesto 2 a 0,1 mM de acuerdo con la
fórmula 5.
Como molde se utilizó un fragmento de 2,8 kb, un
molde rico en GC de una secuencia de DNA genómico vegetal
amplificable a partir de DNA genómico total con los cebadores
| Roche F1 | CAG GTG GAA GGT GCG TCC GTT G | (3) |
| Roche R1 | CTT CTC CCT CTG TGG CCT TCA C | (Id. de Sec. 4) |
que se utilizó a una concentración
de c = 0,1
ng/\mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores para la desnaturalización y
amplificación se programaron como sigue:
La PCR se realizó en presencia o ausencia de
compuesto 2. Los productos de PCR se cargaron en un gel de agarosa
al 1% con tinción de bromuro de etidio.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. Como
puede observarse en la Figura, se consigue una mejora de la
especificidad y la reproducibilidad en un rango de temperatura de
hibridación del molde más amplio en presencia del compuesto 2 a 0,1
mM.
Para este experimento se utilizaron dos equipos:
el LC-Factor V Leiden Mutation Detection (Nº Cat.:
2212161 de Roche Diagnostics GmbH) que contiene el DNA estándar y
el Lightcycler DNA Master HybProbe (Nº Cat.:
12158825-001 de Roche Diagnostics GmbH) que
contiene agua para PCR, MgCl_{2} 25 mM para PCR y mezcla de
reacción 10 x.
Se utilizaron los siguientes cebadores y
sondas:
| Cebador Factor V F. | 5'-GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A-3' | (Id. de Sec. Nº 5) |
| Cebador Factor V R. | 5'-TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA-3' | (Id. de Sec. Nº 6) |
| Sonda Factor V Fluos | 5'-AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC- | |
| \hskip0.3cm Fluoresceína-3' | (Id. de Sec. Nº 7) | |
| Sonda Factor V LC-Red-640: | 5'-LC-Red-640-NH(CH2)6-AGG-GAT CTG CTC | |
| \hskip0.3cm TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p-3' | (Id. de Sec. Nº 8) |
Se preparó una mezcla de cebadores 10x con c = 5
\muM/L, una mezcla de Fluos 10x con c = 2 \muM/L y una mezcla
de Red-640 10x con c = 2 \muM/L. Se diluyó el
estándar del equipo LC-Factor V Leiden Mutation
Detection hasta 50 pg/\mul, 5 pg/\mul, 500 fg/\mul, 50
fg/\mul, 5 fg/\mul, y 0,5 fg/\mul.
La PCR se realizó con el instrumento
LightCycler^{TM} (Roche Diagnostics GmbH) en presencia o ausencia
de compuesto 1 a 20 mM y en presencia o ausencia de compuesto 2 a 1
mM de acuerdo con fórmulas 4 y 5 (véanse los ejemplos 1 y 3)
Los valores para la desnaturalización,
amplificación y análisis de la curva de fusión se programaron como
sigue:
Se añadieron 5 \mul de estándar: volumen
total: 20 \mul
Programa
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
2
\newpage
Programa
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
4
\newpage
La reacción se monitorizó en tiempo real y la
eficiencia de la reacción se determinó utilizando el modo HybProbe
640 nm del instrumento LightCycler de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Como puede observarse en la Figura 3, apareció
amplificación con una eficiencia de 1,841 por ciclo de
amplificación, si no se añadían aditivos (Fig. 3A). Por el
contrario, la eficiencia de amplificación aumentó en presencia del
compuesto 1 a 1,891 por ciclo de amplificación y a 2,027 en
presencia del compuesto 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para este experimento, se preparó una mezcla de
cebadores genérica 10x para la amplificación de una secuencia a
partir de la región 16S de las bacterias Gram positivas utilizando
los siguientes cebadores:
| Cebador F | (Secuencia: 5'-GAA CCT TAC CAG ATC TTG ACA TCC-3') | (Id. de Sec. Nº 9) |
| Cebador R | (Secuencia: 5'-CCA TGC ACC ACC TGT CAC-3') | (Id. de Sec. Nº 10) |
Los cebadores se diluyeron a una concentración
de 5 \muM.
La detección se realizó utilizando SYBR Green Nº
ID: 11988131001 en una dilución 1:100 en agua para PCR.
Como molde se utilizó DNA genómico de
Staphylococcus del siguiente modo. Se prepararon cuatro diluciones
seriadas sencillas del DNA del S. aureus con concentraciones
de c = 10^{2} geq./50 \mul, c = 10 geq./50 \mul, c = 1
geq./50 \mul y c = 0,5 geq./50 \mul en tampón de elución (TRIS
10 mM pH 8,3).
Para simular un procedimiento de preparación de
una muestra a partir de sangre humana se añadieron 5 \mug de
hDNA, (Roche Diagnostics GmbH, Nº Cat. 11691112001) a las diluciones
estándar.
Como experimento control se realizó un
experimento de PCR sin ningún DNA molde (CSM = control sin
molde).
Se añadieron 5 \mul de estándar: volumen
total: 20 \mul
Se pipetearon 50 \mul de la mezcla maestra en
un capilar de LC de 100 \mul y se añadieron 50 \mul de
estándar.
La PCR se realizó con el instrumento
LightCycler^{TM} 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) utilizando
una mezcla maestra sin DNA personalizada - Equipo LightCycler
UniTool 100 v.3 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nº Cat. 03 585
727) - que básicamente contiene un vial 1a: enzima Fast Start, vial
1b: mezcla de reacción 5x, vial 2: MgCl_{2} (25 mM) de grado M,
vial 3: H_{2}O, para PCR de grado M y vial 16: buffer de elución
para una reacción de 100 \mul.
Los valores para la desnaturalización,
amplificación y análisis de la curva de fusión se programaron como
sigue:
Programa
1
Programa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Programa
4
\newpage
Programa
5
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se monitorizó en tiempo real
utilizando el modo SybrGreen del instrumento LightCycler de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
La validez de la reacción de PCR se comprobé
adicionalmente mediante electroforesis en gel.
Los valores de Cp de las curvas de
cuantificación del experimento en LightCycler (no se muestran)
confirmaron la linealidad y sensibilidad de este experimento. La
señal positiva del control sin molde (CSM) es resultado de la
formación de dímeros de cebadores y en presencia de hDNA de
formación de producto de PCR no específico. Pudo distinguirse del
amplicón de PCR de Staphylococcus (83 pb) a través del análisis de
curva de fusión y mediante la determinación del tamaño de amplicón
en una electroforesis en gel.
<110> Roche Diagnostics GmbH F.
Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Aditivos de sales orgánicas para la
amplificación de ácidos nucleicos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 23379
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PE 05022774
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-10-10
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggtccggc agcgtcagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaggtcgc gacgcaacg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtggaag gtgcgtccgt tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctccctc tgtggccttc ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagacatc gcctctgggc ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttatcaca ctggtgctaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacctgta ttcctcgcct gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaccttacc agatcttgac atcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgcacca cctgtcac
\hfill18
Claims (6)
1. La utilización de
3-etil-1-[4-(3-etil-3H-bencimidazol-1-io)]-but-1-il]3H-bencimidazol-1-io
como aditivo para la amplificación de ácidos nucleicos.
2. La utilización de un compuesto de acuerdo con
la reivindicación 1 como aditivo para la amplificación de ácidos
nucleicos, que además comprende un sulfonato o halogenuro.
3. La utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 1-2, en la que dicha amplificación
es una PCR a tiempo real.
4. La utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 1-2, en la que dicha amplificación
además comprende la determinación del punto de fusión de un
producto de amplificación o un híbrido sonda-ácido nucleico
diana.
5. Una composición de amplificación que
comprende todos los componentes necesarios para realizar una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos y un compuesto, en la
que dicho compuesto es un
3-etil-1-[4-(3-etil-3H-bencimidazol-1-io)]-but-1-il]3H-bencimidazol-1-io.
6. Un equipo que comprende una composición con
los componentes necesarios para realizar una reacción de
amplificación de ácidos nucleicos y un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1-2, en la que dicho compuesto es
un
3-etil-1-[4-(3-etil-3H-bencimidazol-1-io)]-but-1-il]3H-bencimidazol-1-io.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05022774 | 2005-10-19 | ||
| EP05022774 | 2005-10-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2313530T3 true ES2313530T3 (es) | 2009-03-01 |
Family
ID=35464198
Family Applications (1)
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