ES2310524T3 - Eliminacion de terminadores didesoxi marcados con colorante de reacciones de secuenciacion de adn. - Google Patents

Abstract

Un método para eliminar moléculas marcadas con colorante no incorporadas de una mezcla que comprende las moléculas marcadas con colorante y un polímero en el que se incorporan las moléculas marcadas con colorante, comprendiendo el método: poner en contacto a la mezcla con una pluralidad de partículas que comprenden un material hidrófobo poroso incluido en el interior de una matriz hidrófila; mezclar e incubar la mezcla y las partículas durante un tiempo suficiente para que las moléculas marcadas con colorante que no estén incorporadas en el polímero pasen hacia la matriz hidrófila y se adsorban en el material hidrófobo; y eliminar las partículas de la mezcla, eliminando también de este modo las moléculas marcadas con colorante no incorporadas adsorbidas.

Description

Eliminación de terminadores didesoxi marcados con colorante de reacciones de secuenciación de ADN.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención pertenece al campo de la purificación de polinucleótidos a partir de mezclas que contienen moléculas marcadas con colorantes fluorescentes. Los polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, productos de reacción de reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos.

Antecedentes

Las demandas del Proyecto del Genoma Humano y las implicaciones comerciales del descubrimiento de polimorfismos y genes han impulsado el desarrollo de mejoras significativas en la tecnología de secuenciación de ADN. Las estrategias contemporáneas de secuenciación de ADN han impuesto demandas rigurosas sobre la fiabilidad y el rendimiento de los secuenciadores de ADN. Informes recientes han demostrado el extraordinario potencial de la electroforesis capilar (CE) para la secuenciación de ADN dada la velocidad intrínseca, el poder de resolución y la facilidad de automatización asociada con este método en comparación con los métodos electroforéticos en placas de gel (Carrilho et al., Anal. Chem. 1996, 68, 3305-3313; Tan y Yeung, Anal. Chem. 1997, 69, 664-674; Swerdlow et al., Anal. Chem. 1997, 69, 848-855).

Con respecto a columnas de electroforesis capilar en gel reticulado, el reciente desarrollo de soluciones poliméricas sustituibles para conseguir la separación por tamaños de fragmentos de ADN monocatenarios ha aumentado la vida útil de las columnas y eliminado la necesidad de vertido y moldeo del gel (Ruiz-Martínez et al., Anal. Chem. 1993, 65, 2851-2858). Además, las mejoras en la composición de la matriz de separación han conducido a la secuenciación de más de 1000 bases por procesamiento (Carrilho et al., Anal. Chem. 1996, 68, 3305-3313). Se han introducido en el mercado sistemas de electroforesis capilar automatizada para secuenciación de ADN por tres fabricantes de instrumentos científicos principales (Beckman Coulter CEQ^{TM} 2000 DNA Analysis System; Amersham Pharmacia MegaBACE 1000 DNA Sequencing System; y PE Biosystems ABI Prism 3700 DNA Analyzer).

No obstante, hacer realidad el potencial de estos secuenciadores de ADN automatizados de nueva generación está demostrando ser difícil, puesto que sigue habiendo problemas en la longitud y la precisión de lectura, principalmente debido a las limitaciones asociadas con los métodos actualmente disponibles para purificar los productos de reacciones de secuenciación cíclica. De hecho, no se ha enfatizado lo bastante la importancia crítica de la preparación de muestras para la aplicación con éxito de la electroforesis capilar.

Al contrario que la electroforesis en placas de gel, los productos de extensión de los cebadores se introducen en la columna capilar usando una inyección electrocinética que proporciona la concentración de los fragmentos de ADN monocatenarios en la parte superior de la columna (Swerdlow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 9660-966). Sin embargo, la inyección electrocinética está orientada hacia iones de elevada movilidad electroforética tales como cloruro, desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos que, si están presentes en la solución de reacción de secuenciación, afectan negativamente a la concentración de fragmentos de ADN monocatenarios. Por consiguiente, para aumentar la cantidad de ADN inyectado en la columna capilar, y para mejorar la concentración del ADN inyectado, se requiere una eliminación eficaz de estas pequeñas especies iónicas.

Un grupo adicional de iones de elevada movilidad electroforética especialmente problemáticos son los terminadores didesoxinucleótidos fluorescentes marcados con colorante y, en particular, los terminadores recientemente comercializados que tienen dos restos fluorescentes configurados como pares de transferencia de energía (por ejemplo, ABI PRISM BigDye^{TM} Terminators de PE Biosystems y DYEnamic ET^{TM} Terminators de Amersham Pharmacia). Se ha demostrado que estos reactivos y los productos de hidrólisis derivados de los mismos son particularmente difíciles de eliminar de las reacciones de extensión de los cebadores, dando como resultado la presencia de artefactos fluorescentes (rutinariamente descritos como "manchas de colorante") que afectan negativamente al análisis automático de los datos de secuenciación (Rosenblum, B.; Lee, L.; Spurgeon, S.; Khan, S.; Manchen, S.; Heiner, C. y Chen, S., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4500-4504). Los cebadores de secuenciación marcados con colorante, cuando se emplean como alternativa a los terminadores marcados con colorante, proporcionan problemas similares (Jingyue, J.; Ruan, C.; Fuller, C.; Glazer, A. y Mathies, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4347-4351. Jingyue, l.; Kheterpal, l.; Scherer, J.; Ruan, C.; Fuller, C.; Glazer, A. y Mathies, R., Anal. Biochem., 1995, 231, 131-140. Jingyue, J.; Glazer, A. y Mathies, R., Nucleic Acids Research, 1996, 24, 1144-1148. Lee, L.; Spurgeon, S.; Heiner, C.; Benson, S.; Rosenblum. B.; Menchen, S.; Graham, R.; Constantinescu, A.; Upadhya, K. y Cassel, J., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 2816-2822).

Se describen terminadores de didesoxinucleótidos trifosfato marcados con colorante de transferencia de energía fluorescente adecuados para el uso en la secuenciación de ADN en la Patente de Estados Unidos Nº 5.800.996. Se describen cebadores marcados con colorante de transferencia de energía fluorescente adecuados para el uso en la secuenciación de ADN en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.688.648, 5.707.804 y 5.728.528.

Durante el desarrollo de las reacciones de secuenciación cíclica, los desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y los didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) marcados con colorante experimentan la hidrólisis de los enlaces éster fosfato durante la etapa de desnaturalización que desarrolla cada ciclo de amplificación cuando la temperatura se eleva de 95ºC a 99ºC. Esto da como resultado la generación de artefactos marcados con colorante que incluyen didesoxinucleótidos difosfato (ddNDP), didesoxinucleótidos monofosfato (ddNMP) y didesoxinucleósidos. Los ddNTP procedentes de las bases de pirimidina, didesoxitimidina (ddTTP) y didesoxicitidina (ddCTP) son particularmente lábiles a este respecto. Los ddNTP, ddNDP y ddNMP marcados con colorante se eluyen a partir de columnas de electroforesis capilar antes de los productos de extensión de los cebadores marcados con colorante y, por consiguiente, no interfieren directamente con la interpretación de los datos de secuenciación. Sin embargo, la intensidad de las señales asociadas con los ddNTP, ddNDP y ddNMP marcados con colorante puede exceder a la de los productos de extensión de los cebadores en muchos órdenes de magnitud. Esta discontinuidad en la intensidad de señal ha demostrado ser problemática con respecto a los programas informáticos de asignación de bases automática, dando como resultado, en el peor de los casos, que el programa informático interprete los picos de artefactos fluorescentes como productos de extensión de los cebadores y los productos de extensión de los cebadores como interferencias basales. Una complicación significativa adicional está asociada con la presencia de didesoxinucleósidos marcados con colorante, por el hecho de que se observa que se coeluyen de las columnas tanto de electroforesis capilar como de placas de gel con los productos de extensión de los cebadores. No sólo la intensidad de la señal de los artefactos es desproporcionadamente elevada en comparación con las señales asociados con los productos de extensión de los cebadores, sino que la anchura del pico es suficientemente amplia para complicar el análisis de 5 a 20 bases.

El esquema de preparación de muestras que se emplea actualmente tanto para la electroforesis en placas de gel como para la CE consiste en la desalinización de muestras de secuenciación de ADN mediante precipitación con etanol o isopropanol, seguida de reconstitución de los fragmentos de ADN y del molde en una mezcla de formamida-EDTA 0,5 M (49:1) antes de la carga o inyección (Figeys et al., 1996, 744, 325-331; Sambrook, l.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 1989; sección 9.49). Aunque se utiliza mucho, se ha descubierto que este método presenta una reproducibilidad variable en términos de recuperación de ADN, proporciona un rendimiento marginal con respecto a la eliminación cuantitativa de artefactos marcados con colorante y no es fácil de automatizar (Tan, H.; Yeung, E. S. Anal. Chem. 1997, 69, 664-674 y Hilderman, D.; Muller, D. Biotechniques 1997, 22, 878-879).

Las especies iónicas de elevada movilidad electroforética en las muestras de secuenciación de ADN no son los únicos contaminantes que provocan la degradación de la longitud de lectura de la secuenciación. También se ha demostrado que el ADN molde interfiere con el análisis de los productos de extensión de los cebadores tanto en placas de gel finas (Tong et al., Biotechniques 1994, 16, 684-693) como en columnas capilares (Swerdlow et al., Electrophoresis 1996, J 7, 475-483). Tras la inyección de la solución de reacción de la secuenciación, se observa una disminución de corriente y un deterioro significativo en el poder de resolución de la columna capilar cuando existe ADN molde en la muestra (Salas-Solano et al., Anal. Chem. 1998, 70, 1528-1535). Sin embargo, en la actualidad, la eliminación del ADN molde rara vez se considera un aspecto esencial de la preparación de muestras para la secuenciación de ADN por electroforesis capilar.

Se han propuesto hasta ahora dos estrategias para la preparación de muestras que abordan la necesidad de eliminación del molde y de otros reactivos. En la primera estrategia, que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.484.701, un cebador biotinilado permite la captura y la purificación de los productos de extensión de los cebadores sobre partículas magnéticas de estreptavidina. Después del lavado exhaustivo de los productos de extensión de los cebadores inmovilizados sobre las partículas magnéticas de estreptavidina para eliminar los constituyentes de la reacción de secuenciación, incluyendo el ADN molde y los desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos no incorporados, se efectúa la liberación de los productos de extensión de los cebadores a partir de las partículas por calentamiento de las partículas magnéticas de estreptavidina de aproximadamente 90ºC a 100ºC en una solución de
formamida.

Aunque esta estrategia tiene una utilidad considerable junto con la electroforesis en placas de gel (en la que con frecuencia se añade formamida a las muestras de secuenciación para facilitar la desnaturalización del dúplex de ADN y para aumentar la viscosidad de la muestra para facilitar la carga en las placas de gel), se ha demostrado recientemente que es problemática cuando se utiliza junto con la electroforesis capilar. Se han identificado al menos tres problemas diferentes (excluyendo el coste) como asociados con esta estrategia. En primer lugar, la solución de formamida utilizada para efectuar la liberación de los productos de extensión de los cebadores inmovilizados es incompatible con la inyección electrocinética, debido a la elevada fuerza iónica de la solución debida a la presencia de iones de elevada movilidad electroforética (en particular EDTA 10 mM o acetato sódico 30-140 mM en formamida al 95%). En ausencia de sal en la solución de formamida, se ha demostrado que la eficacia de liberación de los productos de extensión de los cebadores biotinilados está significativamente reducida de >95% a <40% (Tong y Smith, Anal. Chem. 1992, 64, 2672-2677). Se ha demostrado que la fuerza iónica eficaz de la solución de liberación se aumentada aún más por la descomposición de la formamida al 95% que se produce cuando la solución se calienta y da como resultado la liberación de amoniaco.

En segundo lugar, se ha descubierto que las muestras recuperadas de partículas magnéticas de estreptavidina están contaminadas con proteínas derivadas de la estreptavidina. La liberación de los productos de extensión de los cebadores inmovilizados es el resultado de la desnaturalización de la estreptavidina, que está unida covalentemente a la partícula magnética. La estreptavidina es una proteína de múltiples subunidades con un elevado punto isoeléctrico. La desnaturalización de la estreptavidina inmovilizada se acompaña siempre de la liberación concomitante de esas subunidades proteicas que no están unidas covalentemente a las partículas magnéticas. Esta proteína contaminante actúa de una forma un tanto análoga a la del ADN molde, como consecuencia de su carácter aniónico y elevado peso molecular. Por último, se ha descubierto que los terminadores de didesoxinucleótidos fluorescentes marcados con colorante y los productos de hidrólisis procedentes de los mismos se unen inespecíficamente a las partículas magnéticas de estreptavidina y se liberan en la solución de formamida tras la desnaturalización de la estreptavidina. Por lo tanto, los terminadores unidos inespecíficamente pueden acompañar al producto de extensión de los cebadores "purificado" y afectar desfavorablemente al análisis posterior.

Una segunda estrategia para la purificación de productos de extensión de los cebadores que incluye la eliminación del ADN molde y de los reactivos no incorporados utiliza una metodología de múltiples etapas que implica: (1) Ultrafiltración para eliminar el ADN molde. (2) Concentración al vacío para reducir el volumen de muestra. (3) Cromatografía de exclusión por tamaños (dos columnas de filtración en gel secuenciales) para reducir la fuerza iónica y eliminar los artefactos marcados con colorante. Y (4) concentración al vacío para reducir el volumen de muestra antes del análisis (Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem. 1998, 70, 1516-1527 y Salas-Solano et al., Anal. Chem. 1998, 70, 1528-1535). Aunque esta estrategia proporciona muestras excelentes para el análisis por CE, generalmente es compleja, costosa, requiere mucho tiempo y es inadecuada para automatización en un entorno de alto rendimiento. De hecho, en comparación con el potencial de rendimiento de los secuenciadores de ADN de electroforesis capilar multicolumna, la metodología mencionada anteriormente constituiría la etapa limitante de la velocidad en un laboratorio de secuenciación.

Los métodos actualmente empleados para purificar productos de extensión de los cebadores para el análisis mediante electroforesis capilar y en placas de gel se han resumido anteriormente. Aunque se sabe que la precipitación con etanol o isopropanol reduce el nivel tanto de iones de elevada movilidad electroforética como de artefactos marcados con colorante presentes en la muestra, el nivel residual de artefactos marcados con colorante continúa siendo problemático. La cromatografía de exclusión por tamaños en columnas de centrifugación puede eliminar tanto los iones de elevada movilidad electroforética como los artefactos marcados con colorante, pero es la menos compatible con automatización para entornos de alto rendimiento y la más cara. Además, el uso de columnas de centrifugación da como resultado una dilución considerable de las muestras, introduciendo a menudo la necesidad de una etapa de precipitación o evaporación para concentrar la muestra antes del análisis. La metodología de biotina/estreptavidina debería, en principio, eliminar cuantitativamente los artefactos marcados con colorante. Sin embargo, los artefactos marcados con colorante se unen inespecíficamente a la estreptavidina inmovilizada y se liberan junto con los productos de extensión de de los cebadores cuando la muestra se calienta en formamida. Otra desventaja de los métodos de biotina/estreptavidina es que las moléculas cortas se adsorben de forma preferencial a la matriz, dando como resultado una disminución en la señal para moléculas más grandes.

Por lo tanto, ninguno de los métodos actualmente disponibles proporciona la eliminación cuantitativa de todos los constituyentes potencialmente contaminantes asociados con las reacciones de secuenciación de ADN. Por consiguiente, se requiere un método que evite esta limitación considerable si se va a hacer realidad en un futuro no muy lejano el potencial extraordinario de la electroforesis capilar para la secuenciación de ADN. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

El documento US 5.830.912 describe colorantes fluorescentes sustituidos con flúor. El documento 5.830.912 también describe métodos para preparar conjugados de colorante que comprenden la mezcla del colorante reactivo apropiado y la sustancia que se va a conjugar en un disolvente adecuado. La mezcla se incuba durante un periodo de tiempo adecuado, se elimina el exceso de colorante y el conjugado de biomolécula-colorante se usa en solución o
liofilizado.

El documento US 5.935.572 describe composiciones que contienen una proteasa y una glicosidasa para el uso en el tratamiento de una infestación por piojos. La proteasa y la glicosidasa se separan entre sí por encapsulación de una en una vesícula de bicapa lipídica y dejando la otra fuera de la vesícula.

El documento US 5.281.356 describe composiciones líquidas de gran rendimiento que contienen una enzima no proteolítica y comprenden (a) una cápsula que comprende una enzima proteolítica y (b) un polímero compuesto que a su vez comprende una porción hidrófila y partículas de núcleo de polímero hidrófobo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para eliminar moléculas fluorescentes u otras marcadas con colorante de una mezcla que incluye uno o más polímeros, tales como polinucleótidos, en la que se incorporan moléculas marcadas con colorante, así como las moléculas marcadas con colorante no incorporadas. Los métodos implican poner en contacto a la mezcla con una pluralidad de partículas que están compuestas por una matriz polimérica hidrófila tridimensional reticulada que ha incluido en su interior un material hidrófobo adsorbente poroso. Las moléculas marcadas con colorante no incorporadas pasan a través de la matriz hidrófila y se adsorben de forma preferencial sobre los materiales hidrófobos porosos. La posterior eliminación de las partículas de la mezcla elimina también, por lo tanto, las moléculas marcadas con colorante adsorbidas a partir de la mezcla que incluye los
polímeros.

En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para la purificación de productos de extensión de los cebadores marcados fluorescentemente procedentes de reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y reacciones de secuenciación cíclica (CSR). Las mezclas de reacción de extensión de los cebadores generalmente contienen cebadores y/o terminadores marcados con colorante no incorporados, que incluyen cebadores y terminadores de transferencia de energía marcados con colorante (ddNTP), así como sus productos de hidrólisis, que incluyen ddNDP, ddNMP y didesoxinucleósidos marcados con colorante. Los métodos producen muestras que están sustancialmente libres de artefactos fluorescentes y, por lo tanto, son adecuadas para la secuenciación de ADN por electroforesis capilar o en placas de gel.

Los métodos de la invención implican, en algunas realizaciones, la extensión de un cebador por medio de una reacción de extensión de los cebadores dirigida por molde en presencia de cebadores marcados con colorante o terminadores marcados con colorante;

el contacto de los constituyentes de la reacción de extensión de los cebadores con una pluralidad de partículas que están compuestas por una matriz polimérica hidrófila tridimensional reticulada en la que se incluyen materiales hidrófobos adsorbentes porosos, de tal modo que se logre la absorción preferencial a las partículas de los cebadores marcados con colorante o terminadores marcados con colorante, así como de los artefactos marcados con colorante derivados de los mismos; y

la separación, físicamente, de las partículas de la fase líquida que contiene los constituyentes restantes de la reacción de extensión de los cebadores.

Algunas realizaciones de los métodos de la invención implican además purificar la fase líquida que contiene los constituyentes restantes de la reacción de extensión de los cebadores si es necesario, y analizar la fase líquida que contiene los constituyentes restantes de la reacción de extensión de los cebadores mediante electroforesis capilar o en placas de gel.

La invención también proporciona métodos para preparar polinucleótidos marcados con colorante que estén sustancialmente libres de reactivos marcados con colorante no incorporados. Estos métodos implican:

(a) hibridar un cebador con un molde y poner en contacto al cebador hibridado con una polimerasa en una mezcla de reacción que comprende el reactivo marcado con colorante, extendiendo de este modo el cebador para formar una pluralidad de polinucleótidos marcados con colorante;

(b) poner en contacto a la mezcla de reacción con una pluralidad de partículas que están compuestas por materiales hidrófobos porosos que están retenidos en el interior de una matriz polimérica hidrófila, de tal modo que se efectúe la absorción preferencial del reactivo marcado con colorante no incorporado y de los artefactos marcados con colorante derivados del mismo; y

(c) separar las partículas de (b) de la mezcla de reacción que contiene los polinucleótidos marcados con colorante.

Otros aspectos de la invención incluyen, por ejemplo, el uso de reactivos bloqueantes para acondicionar previamente las partículas magnéticas de tal modo que se minimice la unión inespecífica de los productos de extensión de los cebadores.

Breve descripción de los dibujos

Esta patente contiene al menos un dibujo realizado en color. Se proporcionarán copias de esta patente con dibujos en color por la Oficina de Patentes y Marcas previa petición y pago de las tasas necesarias.

La Figura 1 resume la metodología de secuenciación cíclica a partir de la que puede usarse la invención para purificar los productos de extensión de los cebadores. Se genera una escalera de secuenciación por repetición de varios ciclos en los que se hibrida primero un cebador con el ADN molde, que proporciona un híbrido adecuado para la extensión posterior del cebador por acción de una ADN polimerasa termoestable en presencia de desoxinucleótidos trifosfato. Cada uno de los productos de extensión de los cebadores se termina finalmente por incorporación de un terminador de didesoxinucleótido trifosfato marcado con colorante.

La Figura 2 ilustra la metodología de secuenciación cíclica al tiempo que se enfatiza que un terminador de didesoxinucleótido trifosfato marcado con colorante fluorescente puede sustituirse por un terminador no marcado, generando de este modo una escalera de secuenciación adecuada para la detección en un secuenciador de ADN automático que tenga capacidades de detección de fluorescencia.

La Figura 3 ilustra las estructuras químicas de los BigDye^{TM} Terminators marcados con colorante (PE Applied Biosystems, Foster City CA) procedentes de las bases de pirimidina, timina y citosina. Para la didesoxitimidina (ddT), R es OH; para la didesoxitimidina monofosfato (ddTMP), R es HPO_{4}^{-}; para la didesoxitimidina difosfato (ddTDP), R es HP_{2}O_{7}^{2-}; y para la didesoxitimidina trifosfato (ddTTP), R es HP_{3}O_{10}^{3-}. Para la didesoxicitidina (ddC), R es OH; para la didesoxicitidina monofosfato (ddCMP), R es HPO_{4}^{-}; para la didesoxicitidina difosfato (ddCDP), R es HP_{2}O_{7}^{-2}; y para la didesoxicitidina trifosfato (ddCTP), R es HP_{3}O_{10}^{3-}.

La Figura 4 ilustra las estructuras químicas de los BigDye^{TM} Terminators marcados con colorante (PE Applied Biosystems, Foster City CA) procedentes de las bases de purina, adenina y guanina. Para la didesoxiadenosina (ddA), R es OH; para la didesoxiadenosina monofosfato (ddAMP), R es HPO_{4}^{-}; para la didesoxiadenosina difosfato (ddADP), R es HP_{2}O_{7}^{2-}; y para la didesoxiadenosina trifosfato (ddATP) R es HP_{3}O_{10}^{3-}. Para la didesoxiguanosina (ddG), R es OH; para la didesoxiguanosina monofosfato (ddGMP), R es HPO_{4}^{-}; para la didesoxiguanosina difosfato (ddGDP), R es HP_{2}O_{7}^{-2}; y para la didesoxiguanosina trifosfato (ddGTP), R es HP_{3}O_{10}^{3-}.

La Figura 5 ilustra los datos sin procesar registrados en un Perkin Elmer ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer. Los productos de extensión de los cebadores se purificaron mediante precipitación con isopropanol según recomienda el fabricante del instrumento. Obsérvese la presencia de artefactos marcados con colorante en la parte delantera de la separación electroforética capilar (ddNTP, ddNDP y ddNMP), así como los artefactos de ddT cerca del centro de la separación electroforética. Se representan en verde los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA; se representan en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG.

La Figura 6 muestra los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar que se muestran en la Figura 5. Obsérvese que a la región entre las bases 200 y 214 se le ha asignado por el programa informático la secuencia GCTTT TTTTT TTTNA (SEC ID Nº: 1), a pesar del hecho de que la inspección visual de los datos procesados indica claramente que la secuencia es probablemente GCTTT CCAGT CGGAA (SEC ID Nº: 2). Esta anomalía es el resultado de la presencia del artefacto de ddT marcado con colorante en la separación electroforética capilar. Se representan en verde los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA; se representa en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG. El programa informático asigna una "N" a los productos de extensión de los cebadores que no pueden identificarse.

La Figura 7 ilustra los datos sin procesar registrados en un Perkin Elmer ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer. Los productos de extensión de los cebadores se purificaron mediante el método descrito en la presente memoria por adición de 20 \mul de producto a las partículas magnéticas sedimentadas a partir de 100 \mul de una suspensión al 10% (v/v). El contenido de cada pocillo se mezcló por retirada de la suspensión con una punta de pipeta y después desplazando la suspensión 10 veces. A cada uno de los sobrenadantes retirados de las partículas magnéticas se añadieron 20 \mul de formamida que contenía sorbitol al 10% (p/v). La solución resultante se mezcló brevemente por agitación vorticial y después se analizó. Obsérvese que después de la purificación por el método que se describe en la presente memoria, sólo se registraron artefactos de ddTTP y ddTCP a magnitudes que superaban las de los productos de extensión de los cebadores. Se representan en verde los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA; se representan en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG.

La Figura 8 muestra los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar que se muestran en la Figura 7. Aunque pueden observarse algunos artefactos de ddT residuales mediante una inspección cuidadosa de las medidas basales en la región entre 190 y 200 bases, la magnitud de la señal de los artefactos es tan baja con respecto a las señales asociadas con los productos de extensión de los cebadores que el programa informático de análisis no encontraba obstáculos. Los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA se representan en verde; se representan en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG. El programa informático asigna una "N" a los productos de extensión de los cebadores que no pueden identificarse.

La Figura 9 ilustra los datos sin procesar registrados en un Perkin Elmer ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer. Los productos de extensión de los cebadores se generaron a partir de una reacción de secuenciación cíclica compuesta por 2 \mul de ADN molde de pUC19 (125 ng/\mul), 4 \mul de cebador (cebador m13/pUC -48 24 nucleótidos), 6 \mul de agua de calidad de HPLC y 8 \mul de Terminator Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems) diluida 1:1 con halfBD^{TM} Dye Terminator Sequencing Reagent (Genpak, Ltd., Stony Brook NY). Los productos de extensión de los cebadores (20 \mul) se añadieron a las partículas magnéticas retenidas a partir de 100 \mul de una suspensión al 10% (p/v) en cada pocillo de una placa multipocillo. El contenido de cada pocillo se mezcló por retirada de la suspensión con una punta de pipeta y después desplazando la suspensión 10 veces. La placa multipocillo se colocó en un imán para sedimentar las partículas y los sobrenadantes se transfirieron a tubos de muestra de secuenciador. A cada uno de los tubos se añadieron 20 \mul de formamida que contenía sorbitol al 10% (p/v). Las muestras se mezclaron por agitación vorticial brevemente y se analizaron. Obsérvese que después de la purificación por el método descrito anteriormente, ninguno de los artefactos marcado con colorante se registró a magnitudes que superasen las de los productos de extensión de los cebadores. Se representan en verde los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA; se representan en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG.

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La Figura 10 muestra los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar que se muestran en la Figura 9. La inspección cuidadosa de las medidas basales revela que los artefactos de ddT marcados con colorante no pueden detectarse. Se representan en verde los productos de extensión de los cebadores terminados con ddA; se representan en rojo los productos de extensión de los cebadores terminados en ddT; se representan en azul los productos de extensión de los cebadores terminados en ddC; y se representan en negro los productos de extensión de los cebadores terminados con ddG. El programa informático asigna una "N" a los productos de extensión de los cebadores que no pueden identificarse.

La Figura 11 muestra un curso de tiempo de la eliminación de dNTP fluorescentes mediante perlas de
MagaCharc^{TM}. La cantidad relativa de fluorescencia se determinó a lo largo del tiempo entre 0 y 120 segundos.

La Figura 12 muestra una curva de respuesta para cantidades crecientes de perlas de MagaCharc^{TM} añadidas a una mezcla de dNTP fluorescentes. Las perlas se incubaron con los dNTP durante un minuto y se retiraron. Se determinaron después las unidades relativas de fluorescencia restantes.

La Figura 13 muestra un ejemplo de calibración de un agitador vorticial.

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Descripción detallada

La presente invención proporciona métodos y kits para eliminar moléculas marcadas con colorante no incorporadas de una mezcla que incluye una pluralidad de moléculas poliméricas marcadas con colorante (por ejemplo, polinucleótidos) y las moléculas marcadas con colorante no incorporadas. Los métodos de la invención proporcionan un medio eficiente y eficaz por el que se pueden eliminar moléculas marcadas con colorante no incorporadas de los productos de, por ejemplo, reacciones de secuenciación de ADN. La eliminación de las moléculas marcadas con colorante no incorporadas de los productos de reacción reduce enormemente o elimina los artefactos que pueden ser resultado de la presencia de moléculas marcadas con colorante no incorporadas en muestras que se cargan en, por ejemplo, columnas de electroforesis en gel o capilares para el análisis.

Además, los métodos son sencillos de realizar y muy eficaces y pueden adaptarse a un secuenciación automatizada de alto rendimiento. La purificación de polinucleótidos marcados con colorante usando los métodos de la invención está particularmente bien adaptada a la automatización. No es necesario llevar a cabo una etapa de centrifugación o una etapa de filtración al vacío, siendo ambas difíciles de adaptar a un sistema de secuenciación robótico automatizado. Otra ventaja significativa de los métodos y kits de la invención es que no es necesario el uso de cebadores modificados (por ejemplo, biotinilados).

Los métodos implican poner en contacto a una mezcla que contiene una pluralidad de polinucleótidos marcados con colorante, así como moléculas marcadas con colorante que no están incorporadas en los polinucleótidos, con una pluralidad de partículas que están compuestas por una matriz polimérica hidrófila reticulada en la que se incluyen materiales hidrófobos porosos cristalinos o particulados a los que pueden adsorberse las moléculas marcadas con colorante. Las moléculas marcadas con colorante no incorporadas pasan rápidamente a través de la matriz hidrófila y se adsorben sobre los materiales hidrófobos, mientras que las moléculas marcadas con colorante que están incorporadas en los polinucleótidos no pueden pasar a través de la matriz hidrófila debido a su tamaño molecular. Después, las partículas se eliminan de la mezcla, eliminando también por lo tanto las moléculas marcadas con colorante no incorporadas adsorbidas.

Los métodos de la presente invención son útiles para la purificación de productos de extensión de los cebadores que estén sustancialmente libres de artefactos marcados con colorante que son el resultado de la presencia de ddNTP marcados con colorante y productos de hidrólisis derivados de los mismos. Los productos se obtienen en una forma que es óptima para la secuenciación de ADN automatizada mediante electroforesis en placas de gel o, en particular, electroforesis capilar, y para otros métodos analíticos.

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Reacciones de extensión de los cebadores

Los métodos de purificación de la invención son útiles para purificar una amplia diversidad de productos que se obtienen mediante extensión dirigida por molde y mediada por polimerasa de cebadores oligonucleotídicos. Estas reacciones se usan a menudo en la caracterización de ácidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN. Los métodos de purificación pueden usarse, por ejemplo, para purificar los productos de la reacción en cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa y otros métodos de amplificación que emplean extensión de los cebadores y/o ligación. Estos y otros protocolos que implican extensión de los cebadores son conocidos por los especialistas en la técnica. Se encuentran ejemplos de estas técnicas en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª Ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, lnc. y John Wiley & Sons, Inc., (1994 Suplemento) (Ausubel); Cashion et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.017.478; y Carr, Patente Europea Nº 0.246.864. Se encuentran ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a especialistas a través de métodos de implicación in vitro en Berger, Sambrook y Ausubel así como en Mullis et al., (1987) Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; PCR Prolocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science, 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology, 8: 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene, 4: 560; y Barringer et al. (1990) Gene, 89: 117.

Los métodos de purificación de la invención son particularmente útiles cuando se requiere una preparación de producto de extensión de los cebadores muy limpia. La secuenciación de ADN, en particular cuando se usa electroforesis capilar, proporciona un ejemplo ilustrativo de un método analítico para el que los métodos de la invención pueden resolver desventajas importantes que han impedido que la secuenciación de ADN mediada por electroforesis capilar alcance su máximo potencial.

Las reacciones de secuenciación cíclica de ADN se llevan a cabo típicamente como se resume en la Figura 1. En una realización típica, se permite que un cebador hibride con el ADN molde a una temperatura de hibridación adecuada que generalmente está entre aproximadamente 50ºC y 55ºC, en preparación para la extensión de los cebadores. La enzima polimerasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP), terminadores de didesoxinucleótidos (ddNTP) y otros reactivos necesarios se añaden al complejo de molde-cebador hibridado y la mezcla de reacción se incuba a una temperatura apropiada para la polimerasa particular, que generalmente está entre aproximadamente 60ºC y aproximadamente 70ºC para una polimerasa termoestable o entre aproximadamente la temperatura ambiente y aproximadamente 37ºC para una polimerasa no termoestable, dando como resultado la extensión dirigida por molde de los cebadores. Después, el complejo que se forma entre los cebadores extendidos y el ADN molde se desnaturaliza, por ejemplo, por calentamiento a una temperatura de entre aproximadamente 95ºC y aproximadamente 99ºC u otro método adecuado. Esto produce la liberación de los productos de extensión de los cebadores terminados y libera el ADN molde antes de iniciarse un segundo ciclo de extensión de los cebadores (Figura 2). Rutinariamente, este ciclo se repite de aproximadamente 10 a 50 veces.

Las mezclas de reacción y los productos de extensión de los cebadores resultantes producidos en el ciclo mencionado anteriormente contienen, en algunas realizaciones, terminadores de didesoxinucleótidos marcados con colorante. Las estructuras químicas de los terminadores de didesoxinucleótidos marcados con colorante contenidos dentro del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit se muestran en las Figuras 3 y 4. Los didesoxinucleótidos trifosfato derivados de las bases de pirimidina (ddCTP y ddTTP) se ilustran en la Figura 3 y los didesoxinucleótidos trifosfato derivados de las bases de purina (ddATP y ddGTP) se ilustran en la Figura 4. Estos reactivos representan el estado de la técnica y cada uno está compuesto por dos colorantes configurados como pares de transferencia de energía. En cada uno de los reactivos el resto de fluoresceína actúa como un donador de transferencia de energía y el resto de rodamina como un aceptor de transferencia de energía. La eficacia de la transferencia de energía se aproxima al 100%. La luminosidad de estos reactivos es 2 o 3 veces mayor que la generación previa de terminadores de didesoxinucleótidos que procedían de las diclororrodaminas. Sin embargo, los terminadores BigDye^{TM} son particularmente hidrófobos y presentan una solubilidad limitada a un pH neutro y bajo. Por consiguiente, los terminadores BigDye^{TM} y los productos de hidrólisis derivados de los mismos han demostrado ser particularmente difíciles de eliminar de los productos de extensión de los cebado-
res.

La hidrólisis de los terminadores BigDye^{TM}, que da como resultado una desfosforilación progresiva del nucleótido trifosfato y se piensa que se produce durante la fase de desnaturalización de la reacción de secuenciación cíclica cuando la temperatura se eleva hasta entre 95ºC y 99ºC, produce los ddNDP, ddNMP y didesoxinucleósidos correspondientes. Los ddNTP inicialmente presentes en la reacción son menos hidrófobos que los de ddNDP que resultan de su hidrólisis y los ddNDP son menos hidrófobos que los ddNMP que resultan de la hidrólisis de los ddNDP. Los ddNMP a su vez son menos hidrófobos que los didesoxinucleósidos que resultan de la hidrólisis de los ddNMP. Los ddNTP derivados de las bases de pirimidina son más susceptibles a la desfosforilación hidrolítica que los ddNTP derivados de las bases de purina. No se han explicado las bases de la mecánica de esta
diferenciación.

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Purificación de productos de extensión de los cebadores

La invención proporciona métodos para la purificación de productos de extensión de los cebadores para eliminar o reducir la cantidad de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) marcados con colorante no incorporados y los productos de hidrólisis derivados de los mismos (ddNDP, ddNMP y didesoxinucleósidos) que están presentes en la preparación de productos de extensión de los cebadores. Los métodos implican poner en contacto a los constituyentes de la reacción de extensión de los cebadores, después del termociclado, durante un periodo exacto de aproximadamente 10 segundos a 5 minutos, más preferiblemente entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 2 minutos, con partículas que están compuestas por una matriz polimérica hidrófila reticulada. Incluida en el interior de la matriz hidrófila reticulada hay materiales hidrófobos porosos. Las mezclas de reacción y partículas se mezclan típicamente mediante agitación vorticial.

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A. Partículas

Los materiales hidrófobos porosos adsorbentes usados en los métodos de la invención son preferiblemente de una composición que retiene selectivamente, a partir de una solución acuosa de una fuerza iónica de moderada a elevada moléculas orgánicas de peso molecular relativamente bajo que presentan propiedades hidrófobas. Las propiedades hidrófobas de las moléculas pueden deberse a, por ejemplo, la presencia de, predominantemente, sustituyentes de hidrocarburos aromáticos y alifáticos, tales como moléculas colorantes. Las moléculas también pueden presentar una solubilidad limitada en solución acuosa.

Los materiales hidrófobos usados en las partículas son, con frecuencia (pero no necesariamente), cristalinos o particulados y están preferiblemente compuestos por carbón vegetal activado, polímeros hidrófobos porosos u otras partículas de sílice y vidrio recubiertas con alquildimetilsilano o arildimetilsilano. Los ejemplos de polímeros hidrófobos adecuados incluyen divinilbenceno, látex, poliestireno y polimetilmetacrilato. Los ejemplos de partículas de sílice y vidrio tratadas con alquildimetilsilano y arildimetilsilano adecuadas incluyen las preparadas a partir de butildimetilclorosilano (C4), octildimetilfluorosilano (C8), ocadecildimetilsilano (C18) y fenildimetilsilano. En realizaciones actualmente preferidas, el diámetro medio de los materiales hidrófobos porosos es de aproximadamente dos órdenes de magnitud más pequeño que el diámetro de la partícula. Se describen partículas que incluyen un material hidrófobo en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.790.964.

Los materiales hidrófobos porosos están incluidos en interior de una matriz hidrófila tal como una matriz polimérica hidrófila tridimensional reticulada. Esta matriz es relativamente muy permeable a moléculas de peso molecular bajo y relativamente bajo (es decir, las que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 daltons), tales como desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos marcados fluorescentemente no incorporados, de tal modo que las moléculas pueden pasar a través de la matriz mientras que moléculas de mayor tamaño (por ejemplo, productos de extensión de los cebadores) no pueden hacerlo. El grado de porosidad y permeabilidad de la matriz hidrófila puede variarse cambiando el porcentaje de reticulación asociada con la matriz. Pueden prepararse matrices a partir de, por ejemplo, acrilamida, agarosa o dextrano, por reticulación con reactivos apropiados de tal modo que se incluyan los materiales hidrófobos porosos al tiempo que se controle simultáneamente la porosidad de la matriz hidrófila. En realizaciones actualmente preferidas, las matrices hidrófilas son poliacrilamida reticulada a entre aproximadamente el 2,5-15% y, más preferiblemente, tienen una reticulación de aproximadamente el 5%. Habitualmente, las partículas son tridimensionales, de una forma irregular y típicamente tienen diámetros medios de aproximadamente 5 a 40 micrómetros.

En una realización preferida, las partículas también incluyen un constituyente magnetizable para permitir que las partículas se separen de una mezcla por colocación de las partículas en proximidad a un imán. Una diversidad de constituyentes magnetizables diferentes son adecuados para el uso en las partículas. Estos incluyen, por ejemplo, óxido férrico, óxido de níquel, ferrita de bario y óxido ferroso. Pueden prepararse partículas magnéticas adecuadas mediante, por ejemplo, mezcla de cantidades equivalentes de óxido de hierro y partículas hidrófobas (por ejemplo, carbón vegetal) con acrilamida/bisacrilamida. Estos componentes se mezclan vigorosamente para formar una "torta" que después se hace pasar a través de un molino de café o equivalente. El material molido se pasa después a través de un molino de bolas para obtener partículas que son preferiblemente de aproximadamente 5-20 \mum de
diámetro.

Las partículas de MagaCharc^{TM} AA (Cortex Biochem, San Leandro CA) son un ejemplo de una partícula disponible en el mercado que es adecuada para el uso en los métodos de la invención. Se preparan partículas de MagaCharc^{TM} por reticulación de una mezcla 1:1 (p/p) de carbón vegetal (Noria SX-Ultra) y óxido de hierro (Fe_{3}O_{4}) en el interior de una matriz polimérica que se prepara a partir de poliacrilamida al 80% (p/p) reticulada con N,N-metilen-bis-acrilamida al 5% y que contiene ácido acrílico al 15% (p/p). La presencia del óxido de hierro distribuido por toda la partícula, preferiblemente uniformemente, da lugar a la partícula magnetizable y facilita de este modo la eliminación de sobrenadantes de las partículas por colocación de las partículas en proximidad a un imán.

Puede reducirse la absorción inespecífica asociada con una matriz hidrófila por inclusión de un monómero de ácido acrílico o ácido metacrílico durante la polimerización de la matriz. Esto asegura que la matriz presente una carga aniónica residual que es mutuamente repulsiva, desde un punto de vista electroestático, con respecto a los polinucleótidos que están presentes en la reacción de extensión de los cebadores.

Otro modo de reducir la unión inespecífica es acondicionar previamente las partículas con uno de varios reactivos que se sabe que minimizan la absorción inespecífica de ácidos nucleicos sobre membranas de transferencia, incluyendo albúmina sérica bovina (BSA), reactivo de Denhardt, sulfato de heparina, poliacrilamida lineal (LPA), leche en polvo desnatada, polivinilpirrolidona (PVP), ADN de esperma de salmón y Tween 20. Por ejemplo, las partículas se acondicionan previamente en lotes preferiblemente con sulfato de heparina.

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B. Métodos de purificación

Para efectuar la eliminación de los desoxinucleótidos o didesoxinucleótidos marcados con colorante no incorporados de los productos de extensión de los cebadores deseados, las partículas se añaden a la mezcla que contiene los productos de extensión de los cebadores y los desoxinucleótidos o didesoxinucleótidos marcados con colorante no incorporado (por ejemplo, una reacción de extensión de los cebadores o reacción de secuenciación cíclica). Los ddNTP, ddNDP, ddNMP y didesoxinucleósidos no incorporados hidrófobos permean selectivamente el recubrimiento hidrófilo de las partículas, debido a su peso molecular relativamente bajo en comparación con los productos de extensión de los cebadores, y se absorben por los núcleos hidrófobos. Después de un periodo de incubación apropiado, que generalmente también implica mezcla, las partículas se retiran de la mezcla. Las moléculas de colorante no incorporadas se eliminan junto con las partículas, dejando de este modo los polinucleótidos marcados deseados sustancialmente libres de las moléculas de colorante.

También pueden absorberse en las partículas productos de extensión de los cebadores relativamente cortos. Sin embargo, la pérdida de productos de extensión de los cebadores cortos puede conseguirse que no sea importante mediante la elección juiciosa de un cebador apropiado. En términos generales, se ha descubierto que la eficacia de la eliminación de terminadores marcados con colorante está relacionada con la hidrofobicidad de cada reactivo. Por consiguiente, los ddNMP se eliminan más eficazmente que los ddNDP, que se eliminan más eficazmente que los ddNTP.

Los métodos de purificación de la invención se llevan a cabo convenientemente en placas de microtitulación. El uso de placas de microtitulación facilita la automatización del proceso de purificación usando sistemas robotizados. Se usan con frecuencia placas de microtitulación de 96 pocillos y, para volúmenes de reacción muy pequeños (por ejemplo, \sim15 \mul), pueden usarse placas de 192 ó 384 pocillos. El uso de volúmenes de reacción pequeños reduce el coste por reacción por reducción de la cantidad de reactivos necesarios.

Las partículas pueden añadirse a las mezclas de reacción como una suspensión acuosa. Como alternativa, una suspensión de partículas en un líquido puede colocarse en un pocillo de una placa de microtitulación u otro recipiente que se vaya a usar para el procedimiento de purificación y la fase líquida puede retirarse antes de la adición de las mezclas de reacción a las partículas. Por ejemplo, puede colocarse una suspensión de partículas magnéticas en un pocillo de una placa de microtitulación que después se coloca en presencia de un campo magnético para recoger las partículas. El líquido se retira después del pocillo antes de la adición de la mezcla de reacción al pocillo.

Las mezclas de reacción y las suspensiones de partículas deberían dejarse que se atemperen a temperatura ambiente antes de la adición de las partículas a las mezclas de reacción. Para muestras que se han almacenado a 4ºC, esto lleva habitualmente aproximadamente 15 minutos.

Con frecuencia es deseable optimizar las condiciones de purificación para un reactivo marcado con colorante particular, cantidad de reactivo marcado con colorante en cada reacción, volumen de reacción, tampón de dilución y/o instrumento de secuenciación particular. Por ejemplo, secuenciadores de ADN tales como el Applied Biosystems Prism 3700® DNA Analyzer, que usa cabezales de flujo laminar, son más sensibles para la purificación que otros secuenciadores. De forma similar, el uso de diferentes diluciones de reactivos de kits de secuenciación de ADN disponibles en el mercado puede afectar a las condiciones óptimas para la purificación.

Las variables del método de purificación que pueden ajustarse para optimizar la purificación obtenida incluyen la cantidad de partículas usadas por reacción, el tiempo de incubación y mezcla y la intensidad de mezcla. Puede lograrse una optimización relativamente rápida de las condiciones de purificación por preparación de reacciones en una placa de microtitulación. Convenientemente, se fijan dos de las tres variables, mientras que la tercera se varía para determinar la condición de purificación óptima para una combinación particular de reactivos y secuenciador. Por ejemplo, pueden añadirse cantidades variables de partículas a diferentes pocillos de la placa de microtitulación y el tiempo de incubación y la intensidad de mezcla mantenerse constantes para determinar una cantidad óptima de partículas. Como alternativa, los pocillos pueden tener cada uno la misma cantidad de partículas y la intensidad de mezcla puede mantenerse constante mientras que se varía el tiempo de incubación para determinar el tiempo de incubación óptimo. De forma similar, para obtener la intensidad de mezcla óptima, se puede variar la intensidad de mezcla mientras se mantienen constantes la cantidad de partículas y el tiempo de incubación. Después de la retirada de las partículas de las mezclas de reacción, las muestras se procesan después en un secuenciador y las condiciones que proporcionan los mejores resultados se emplean después rutinariamente para ese secuenciador y reactivo colorante. Generalmente, es muy conveniente usar una cantidad constante de partículas en cada pocillo y variar el tiempo de incubación y/o la intensidad de mezcla para obtener las condiciones óptimas para una situación
particular.

La cantidad de partículas usadas en los métodos es esa cantidad que es suficiente para eliminar sustancialmente todas las moléculas marcadas con colorante no incorporadas. Generalmente, se añaden entre aproximadamente 1 \mug y 10 \mug (ambos inclusive) de partículas por 1 \mul de mezcla de reacción. Más preferiblemente, se añaden entre 3 \mug y 7 \mug (ambos inclusive) de partículas por 1 \mul de mezcla de reacción y, aún más preferiblemente, la cantidad de partículas añadida está entre 4 \mug y 6 \mug por \mul de mezcla de reacción. Por ejemplo, se añaden típicamente de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 1 \mug, más preferiblemente de aproximadamente 200 \mug a aproximadamente 600 \mug de partículas y, aún más preferiblemente, de aproximadamente 300 \mug a aproximadamente 400 \mug de partículas a aproximadamente 100 \mul de mezcla de reacción. La cantidad de moléculas marcadas con colorante en la mezcla de reacción es un factor significativo en la determinación de la cantidad de partículas. Por lo tanto, para un volumen de reacción más pequeño que tiene una cantidad similar de moléculas marcadas con colorante que un volumen de reacción mayor, la cantidad de partículas por \mul de mezcla de reacción puede ser proporcionadamente mayor que para el volumen más grande. Por ejemplo, cada pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos usado para purificar un volumen de reacción de sólo 15 \mul puede contener sin embargo de 100 \mug a aproximadamente 1 mg, más preferiblemente, de aproximadamente 200 \mug a aproximadamente 600 \mug de partículas y, aún más preferiblemente, de aproximadamente 300 \mug a aproximadamente 400 \mug de partículas.

Las partículas se incuban en la mezcla de reacción durante un periodo exacto de tiempo, generalmente entre aproximadamente diez segundos a aproximadamente 5 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 2 minutos. Durante la incubación, es preferible mezclar las mezclas de reacción minuciosamente. Como se ha descrito anteriormente, el tiempo de incubación y la intensidad de mezcla son variables que pueden optimizarse para conseguir los mejores resultados.

La mezcla puede ser por cualquier método conocido por los especialistas en la técnica, incluyendo pipeteo arriba y abajo y similares. Este método de mezcla es particularmente adecuado para el uso con un sistema robotizado, permitiendo de este modo que se automatice completamente el proceso de purificación. La agitación vorticial es otro método particularmente adecuado para mezclar. Un ejemplo de un agitador vorticial disponible en el mercado adecuado es el Vortex Genie 2 Model G-560 (Fisher, Pittsburg, PA, Nº Catálogo 12-812). Para el uso con placas de microtitulación, es adecuado el cabezal de placas de 96 pocillos de Vortex Genie 2 (Fisher, Nº Catálogo 18-812C).

Cuando se usa un agitador vorticial, es deseable calibrar el agitador vorticial antes del uso. El ajuste óptimo para un agitador vorticial se determina por extrapolación del "umbral de salpicadura" (el ajuste de velocidad a la que 100 \mul de líquido comienzan a salpicarse fuera de un pocillo). Se restan dos medidas completas del umbral de salpicadura para obtener el ajuste óptimo para usar en los métodos de la invención. Por ejemplo, si las salpicaduras comienzan a un ajuste de 5,0, el ajuste de calibrado para usar en los métodos de purificaciones es de 3,0 (Figura 13). Cuando se realiza la calibración, se prefiere usar una placa de polipropileno porque las placas de poliestireno tienen una tensión superficial mayor y un umbral de salpicadura superior que las placas de polipropileno. Si se usa, no obstante, una placa de poliestireno para la calibración, el ajuste del calibrado es el umbral de salpicadura -3,5. La calibración se realiza preferiblemente por adición de 100 \mul de un líquido acuoso (por ejemplo, agua coloreada) a dos o tres pocillos de una placa de microtitulación. La placa se coloca en un cabezal de placas de microtitulación de agitación vorticial con la velocidad de agitación vorticial ajustada a cero. El agitador vorticial se enciende y la velocidad se aumenta lentamente. La agitación vorticial se detiene periódicamente para revisar para salpicaduras fuera de los pocillos. El líquido parecerá agitarse vorticialmente bastante vigorosamente antes de que se observen salpicaduras.

Después de la incubación de las muestras con las partículas, las partículas se retiran de las mezclas de reacción. La retirada puede ser por cualquier método conocido por un especialista en la técnica (por ejemplo, filtración). En realizaciones preferidas, se emplean partículas magnéticas y la retirada se logra por colocación de los recipientes de muestra en contacto con imán. Los imanes adecuados incluyen, por ejemplo, imanes de neodinio que presentan una remanencia superior a 12 KG (Kgauss). Son adecuados imanes que tienen elementos magnéticos de tierras raras tales como el separador magnético Prolinx RapXtract^{TM}.

El sobrenadante puede retirarse para usarlo después de la separación de las partículas. Por ejemplo, las muestras pueden colocarse en una placa de carga que contenga un tampón de carga para usar en un secuenciador. Los métodos de purificación de la invención eliminan sustancialmente los reactivos marcados con colorante no incorporados de los productos de extensión de los cebadores. Mediante "eliminar sustancialmente" se entiende que se eliminan al menos aproximadamente el 60% de los reactivos marcados con colorante no incorporados de una mezcla. Más preferiblemente, se eliminan al menos aproximadamente el 75% de los reactivos marcados con colorante no incorporados, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y, más preferiblemente, se eliminan sustancialmente todos los reactivos marcados con colorante no incorporados.

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C. Kits de purificación

La invención también proporciona kits para llevar a cabo los métodos de purificación de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona kits que incluyen una o más placas de microtitulación que tienen alícuotas de las partículas en algunos o en todos de sus pocillos. Dichos kits permiten la fácil incorporación de los métodos de purificación de la invención en una operación de secuenciación automatizada. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas para el uso de las partículas para eliminar los reactivos marcados con colorante no incorporados de los polinucleótidos. Por ejemplo, las instrucciones pueden proporcionar información como para condiciones de mezcla óptimas, tiempos de incubación y similares.

En algunas realizaciones, los pocillos de las placas de microtitulación contienen una cantidad de las partículas que se ha determinado que proporcionan resultados óptimos para un reactivo marcado con colorante dado, para una dilución dada del reactivo y/o para un secuenciador de ADN particular. Por ejemplo, la invención proporciona kits en los que los pocillos de una placa de microtitulación contienen una cantidad de partículas que está optimizada para un secuenciador PE Biosystems ABI PRISM® 373, 377, 310 ó 3700 usando una dilución específica de PE Biosystems BigDye® Ready Reaction Mix. Por ejemplo, un kit podría estar optimizado para el uso con un PRISM® 373 usando una dilución 4:20 (\mul totales de BigDye® Ready Reaction Mix:\mul totales de volumen de reacción). La tabla 1 muestra las cantidades de partículas por pocillo en kits para los secuenciadores y diluciones de BigDye® Ready Reaction Mix específicas indicadas.

TABLA 1

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1

* \mul totales de BigDye® Ready Reaction Mix:\mul totales de volumen de reacción

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En otras realizaciones, los pocillos de la placa de microtitulación contienen una cantidad constante de partículas. La optimización de dichas placas para una dilución de mezcla de reacción y/o para un aparato de secuenciación particular implica variar el tiempo y/o la intensidad de agitación vorticial en lugar de variar la cantidad de partículas. Por ejemplo, la invención proporciona placas de microtitulación en las que uno o más pocillos contienen entre aproximadamente 100 \mug y 1 mg de las partículas. Más preferiblemente, los pocillos contienen entre aproximadamente 200 y 800 \mug y, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 300 y 600 \mug de partículas en uno o más pocillos. Cada pocillo que contiene partículas contiene aproximadamente la misma cantidad de partículas. Para optimizar estas placas de microtitulación para un molde, dilución, aparato de secuenciación y similar particular, se pueden ensayar diferentes tiempos de incubación/mezcla y/o diferentes intensidades de mezcla. Las placas microtitulación de la invención, en algunas realizaciones, contienen una cantidad constante de partículas en cada pocillo en la placa de
microtitulación.

Las placas de microtitulación incluidas en los kits pueden tener un precinto de película que permita usar sólo una porción de los pocillos cada vez, conservando los pocillos restantes para usos futuros. Esto proporciona un uso económico de todos los pocillos y reduce el gasto.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero no limitar la presente invención.

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Ejemplo 1

Purificación de productos de extensión de los cebadores a partir del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mediante precipitación con isopropanol

Se secuenció una región del ADN plasmídico de pUC19 mediante secuenciación cíclica de ADN usando modificaciones del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems, Foster City CA). Para cada muestra se dispensaron los siguientes ingredientes en tubos de reacción con tapa MicroAmp^{TM} (PE Applied Biosystems): 2 \mul de ADN molde de pUC19 (125 ng/\mul), 4 \mul de cebador (1 pmol/\mul, M13/pUC -48 24 nucleótidos), 6 \mul de agua de calidad de HPLC y 8 \mul de Terminador Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems). Los tubos con tapa se colocaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) precalentados a 96ºC. Las reacciones se desnaturalizaron a 96ºC durante cinco minutos y se prolongaron durante 30 ciclos térmicos a 96ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 20 segundos y 60ºC durante 4 minutos.

Después del termociclado, las reacciones se purificaron para eliminar los terminadores marcados con colorante y otros constituyentes de la reacción mediante precipitación con isopropanol. Se añadieron veinte \mul de agua desionizada y 60 \mul de isopropanol a cada tubo MicroAmp^{TM} (isopropanol al 60% en el volumen final). Los tubos se sellaron y el contenido se mezcló invirtiendo los tubos varias veces. Los tubos se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. El precipitado se recogió por centrifugación a 2000 x g durante 45 minutos. Se desechó el sobrenadante y se centrifugó a 700 x g durante 1 min. El precipitado se disolvió en 20 \mul de formamida que contenía sorbitol al 10% (p/v) y la muestra se analizó en un ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) mediante electroforesis capilar. Los datos sin procesar registrados se ilustran en la Figura 5. Obsérvese la presencia de artefactos marcados con colorante en la parte delantera de la separación electroforética capilar (ddNTP, ddNDP y ddNMP), así como el artefacto de ddT cerca del centro de la separación electroforética. Los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar se ilustran en la Figura 6. Obsérvese que a la región entre 200 y 214 bases se le ha asignado mediante el programa informático de análisis la secuencia de ADN GCTTT TTTTT TTTNA (SEC ID Nº: 1), a pesar del hecho de que la inspección visual de los datos procesados indica claramente que la secuencia de ADN es probablemente GCTTT CCAGT CGGAA (SEC ID Nº: 2). Esta anomalía es el resultado de la presencia del artefacto de ddT marcado con colorante en la separación electroforética
capilar.

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Ejemplo 2

Purificación de productos de extensión de los cebadores a partir del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mediante absorción sobre partículas magnéticas

Se secuenció una región del ADN plasmídico de pUC19 mediante secuenciación cíclica de ADN usando modificaciones del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems, Foster City CA). Para cada muestra, se dispensaron los siguientes ingredientes en tubos de reacción con tapa MicroAmp^{TM} (PE Applied Biosystems): 2 \mul de ADN molde de pUC19 (125 ng/\mul), 4 \mul de cebadores (1 pmol/\mul, M13/pUC -48 24 nucleótidos), 6 \mul de agua de calidad de HPLC y 8 \mul de Terminator Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems). Los tubos con tapa se colocaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems), precalentado a 96ºC. Las reacciones se desnaturalizaron a 96ºC durante 5 minutos y se prolongaron durante 30 ciclos térmicos a 96ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 20 segundos y 60ºC durante 4 minutos.

Después del termociclado, las reacciones se purificaron para eliminar los terminadores marcados con colorante mediante absorción con partículas magnéticas. Las partículas de MagaCharc^{TM} (Cortex Biochem, San Leandro CA) se acondicionaron previamente en lotes para minimizar la absorción inespecífica de productos de extensión de los cebadores. Se retiró el sobrenadante de 5 ml de una suspensión al 10% (v/v) de partículas MagaCharc^{TM} y se remplazó con reactivo de Denhardt 10x (Denhardt, D. T. Biochem. Biophys. Res. Commun 1996, 23, 641). La suspensión se colocó en un mezclador giratorio durante una hora a temperatura ambiente y después se lavó 3 veces con alícuotas de 5 ml de agua de calidad de HPLC y después se suspendió finalmente en 5 ml de agua de calidad de
HPLC.

A cada pocillo de una placa multipocillo se añadieron 100 \mul de una suspensión al 10% (v/v) de partículas de MagaCharc^{TM}. La placa multipocillo se colocó en un imán para sedimentar las partículas y se retiró el sobrenadante. A cada pocillo se añadieron después 20 \mul del producto de la reacción de secuenciación cíclica y el contenido de cada pocillo se mezcló por retirada de la suspensión de partículas con una punta de pipeta y después desplazando la suspensión 10 veces. La placa multipocillo se colocó después en un imán para sedimentar las partículas y los sobrenadantes se transfirieron a tubos de muestras de secuenciador. A cada uno de los tubos se añadieron 20 \mul de formamida que contenía sorbitol al 10% (p/v). Las muestras se mezclaron brevemente por agitación vorticial y se analizaron en un ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) mediante electroforesis
capilar.

Los datos sin procesar registrados se ilustran en la Figura 7. Obsérvese que después de la purificación mediante el método descrito anteriormente, sólo se registraron artefactos de ddTTP y ddTCP en magnitudes que superaban las de los productos de extensión de los cebadores. Los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar se ilustran en la Figura 8. Aunque pueden observarse algunos artefactos de ddT residuales mediante la inspección con cuidado de las medidas basales en la región entre 190 y 200 bases, la magnitud de la señal de artefactos es tan baja con respecto a las señales asociadas con los productos de extensión de los cebadores que el programa informático de análisis les asignó la secuencia de ADN correcta aún en presencia de cantidades traza del artefacto.

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Ejemplo 3

Purificación de productos de extensión de los cebadores a partir de ½ de reacciones mediante absorción con partículas magnéticas

Se secuenció una región de ADN plasmídico de pUC19 mediante secuenciación cíclica de ADN usando modificaciones del ABI PRISM® BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems, Foster City CA). Para cada muestra se dispensaron los siguientes ingredientes en tubos de reacción con tapa MicroAmp^{TM} (PE Applied Biosystems); 2 \mul de ADN molde de pUC19 (125 ng/\mul); 4 \mul de cebador (1 pmol/\mul, M13/pUC -48 24 nucleótidos); 6 \mul de agua de calidad de HPLC; y 8 \mul de Terminator Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems) que se había diluido (1:2) con halfBD^{TM} Dye Terminator Sequencing Reagent (Genpak Ltd., Stony Brook NY). Los tubos tapados se colocaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems), precalentado a 96ºC. Las reacciones se desnaturalizaron a 96ºC durante cinco minutos y se prolongaron durante 30 ciclos térmicos a 96ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 20 segundos y 60ºC durante 4 minutos.

Después del termociclado, las reacciones se purificaron para eliminar los terminadores marcados con colorante mediante absorción con partículas magnéticas. Las partículas de MagaCharc^{TM} (Cortex Biochem, San Leandro CA) se acondicionaron previamente en lote para minimizar la absorción inespecífica de productos de extensión de los cebadores como se ha descrito en el Ejemplo 2. A cada pocillo de la placa multipocillo se añadieron 100 \mul de una suspensión al 10% de partículas de MagaCharc^{TM}. La placa multipocillo se colocó en un imán para sedimentar las partículas y se retiró el sobrenadante. A cada pocillo se añadieron después 20 \mul del producto de la reacción de secuenciación cíclica y el contenido de cada pocillo se mezcló por retirada de la suspensión de partículas mediante una punta de pipeta y después desplazando la suspensión 10 veces. La placa multipocillo se colocó de nuevo en un imán para sedimentar las partículas y los sobrenadantes se transfirieron a tubos de muestra de secuenciador.

A cada uno de los tubos se añadieron 20 \mul de formamida que contenía sorbitol al 10% (p/v). Las muestras se mezclaron brevemente por agitación vorticial y se analizaron en un ABI PRISM^{TM} 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) mediante electroforesis capilar. Los datos sin procesar registrados se ilustran en la Figura 9. Obsérvese que después de la purificación mediante el método descrito anteriormente ninguno de los artefactos marcados con colorantes se registraba a magnitudes que superasen las de los productos de extensión de los cebadores. Los datos de secuenciación de ADN procesados que se corresponden con los datos sin procesar se ilustran en la Figura 10. La inspección cuidadosa de las medidas basales revela que el artefacto de ddT marcado con colorante no puede detectarse.

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Ejemplo 4

Curso de tiempo y curva de valoración para la eliminación de desoxinucleótidos marcados con colorante fluorescente

Este ejemplo muestra un curso de tiempo y una curva de valoración para la eliminación de desoxinucleótidos marcados con colorante fluorescente no incorporados usando partículas de MagaCharc^{TM} (Cortex Biochem, San Leandro CA). Se calentaron 8 \mul de Big Dye en un volumen total de 20 \mul (la reacción simulada no contenía molde) a 96ºC durante 30 minutos.

El experimento de curso de tiempo se realizó por adición de las cantidades de partículas de MagaCharc^{TM} que se muestran en la Figura 11 a la mezcla de desoxinucleótidos marcados con colorante. Las muestras se mezclaron por agitación vorticial y se incubaron durante los periodos de tiempo indicados. Las unidades relativas de fluorescencia restantes en la mezcla para cada uno de los puntos de tiempo se muestran en la Figura 11. Estos resultados muestran que más del 70% de las moléculas fluorescentemente marcadas se eliminan después de una incubación de 60 segundos cuando se usan 240 \mug o más de las partículas magnéticas. Un tiempo de incubación adicional no aumentó significativamente la cantidad eliminada.

Para investigar el efecto de cantidades crecientes de partículas magnéticas sobre la eliminación de los colorantes fluorescentes, se calentaron mezclas de desoxinucleótidos marcados con colorante como se ha descrito anteriormente, se llevaron a temperatura ambiente y se añadieron las cantidades indicadas de partículas de MagaCharc^{TM}. Las muestras se agitaron vorticialmente durante 1 minuto y se retiraron las partículas magnéticas. Después se determinó la cantidad de unidades relativas de fluorescencia restantes en la fase líquida.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 12. La máxima eficacia se logró aproximadamente 200 \mug de partículas de MagaCharc^{TM}.

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Ejemplo 5

Preparación de reacciones de secuenciación

Este ejemplo describe ejemplos de condiciones de reacción que son adecuados para el uso con los métodos de purificación y kit de la invención. En las siguientes mezclas de reacción, todo el ADN molde y de cebadores se resuspende preferiblemente en agua desionizada. Estas condiciones de reacciones están adaptadas para el uso de moldes de pUC y pGem.

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Reacciones 4:20 (4 \mul de BigDye® Ready Reaction Mix (PE Biosystems) en 20 \mul de reacción

2

\bullet

\vtcortauna Golpear suavemente el tubo para mezclar.

\bullet

\vtcortauna Centrifugar brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo.

\bullet

\vtcortauna Para unos resultados mejores, preparar las reacciones de secuenciación preparando primero una mezcla maestra de BigDye® Ready Reaction Mix con tampón de secuenciación 5x de PE Biosystems (por ejemplo, una mezcla que contenga 200 \mul de tampón de secuenciación 5x de PE Biosystems, 400 \mul de BigDye® Ready Reaction Mix y 800 \mul de agua desionizada será suficiente para 96 muestras); y después dividiendo la mezcla maestra en alícuotas de 14 \mul en tubos que contengan cada mezcla de cebadores/molde.

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Reacciones 4:10 (4 \mul de BigDye® Ready Reaction Mix (PE Biosystems) en 10 \mul de reacción)

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3

\bullet

\vtcortauna Golpear suavemente para mezclar.

\bullet

\vtcortauna Centrifugar brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo.

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Ejemplo 6

Protocolo para la eliminación de terminadores marcados con colorante no incorporados

Este ejemplo describe protocolos para eliminar terminadores marcados con colorante de reacciones de secuenciación cíclica de ADN.

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I. Preparación de muestras

Se preparan reacciones de secuenciación de acuerdo con los protocolos convencionales. Como siempre, se usa ADN molde de gran calidad y kits de preparación de molde para resultados fiables y se tiene en cuenta la pureza y el tipo de molde.

Se preparan reacciones de secuenciación de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del secuenciador de ADN. Si se está usando un instrumento de Applied Biosystems o MJ Research, a continuación se muestran ejemplos de protocolos convencionales. Todo el ADN molde y de cebadores debería resuspenderse en agua destilada desionizada (ddH_{2}O).

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II. Ejemplo de un protocolo de reacción de secuenciación típico 1. Preparar reacciones de secuenciación en placas de PCR de 96 pocillos

La tabla 2 muestra los componentes de la mezcla de reacción para diferentes diluciones de terminadores didesoxi marcados con colorante.

TABLA 2

4

2. Golpear suavemente el tubo para mezclar.

3. Centrifugar brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo.

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III. Ejemplo de protocolos de termociclado típicos usando RapExtract Kit disponible en el mercado

Se muestran en la tabla 3 condiciones típicas de reacción.

Nota: Usar un termociclador de gran calidad tal como Applied Biosystems, Eppendorf Scientific o MJ Research.

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TABLA 3

6

IV. Materiales y condiciones preferidas 1. Equipamiento

\bullet

Separador magnético Prolinix® RapXtract, Nº catálogo RAP1000-1

\bullet

Vortex Genie 2 Model G-560

\bullet

Cabezal de placas de 96 pocillos de Vortex Genie 2

\bullet

Pipetas sencillas o de 8 canales (una de cada, 200 \mul y 20 \mul)

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2. Conservar a 4ºC

Conservar refrigerado hasta el uso. No congelar.

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3. Usar a temperatura ambiente

Llevar a temperatura ambiente antes del uso (aproximadamente 15 minutos).

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4. Calibrar el agitador vorticial

Sencillo -pero importante- de hacer porque cada agitador vorticial es diferente. Además, revisar la calibración del agitador vorticial al menos una vez al mes o si se ha usado para otras aplicaciones. La velocidad de agitación vorticial tiende a disminuir con el tiempo.

La velocidad de rotación varía de un agitador vorticial al otro. El ajuste óptimo se determina por extrapolación del umbral de salpicadura (el ajuste de velocidad al que 100 \mul de líquido comienzan a salpicarse fuera de los pocillos menos dos medidas completas). Por ejemplo, si las salpicaduras comienzan a un ajuste de 5,0, el ajuste de calibrado a usar para el kit RapXtract es de 3,0; si la salpicaduras comienzan a un ajuste de 5,5, el ajuste a usar para RapXtract es de 3,5 ("salpicadura menos 2"). Véase la Figura 13.

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Protocolo de calibración del agitador vorticial

1. Use una placa de polipropileno (las placas poliestireno tienen una mayor tensión superficial y un umbral de salpicadura superior, sin embargo, véase la etapa 6 si tiene que usar una placa de poliestireno).

2. Añada 100 \mul de líquido acuoso (tal como agua coloreada) a dos o tres pocillos.

3. Coloque la placa en el cabezal de placas de 96 pocillos de agitación vorticial.

4. Ajuste la velocidad a 0 y encienda el agitador vorticial.

5. Aumente lentamente la velocidad del agitador vorticial y deténgalo periódicamente para revisar para salpicaduras fuera de los pocillos.

\hrule

Nota: El líquido parecerá agitarse vorticialmente bastante vigorosamente antes de que se observen salpicaduras.

\hrule

\vskip1.000000\baselineskip

6. Una vez que comienzan las salpicaduras, anote el ajuste y retráselo dos números enteros en el agitador vorticial -para placas de polipropileno- (ajuste a "salpicaduras menos 2"). Registre este ajuste para consultas futuras.

\hrule

Nota: Se produce una mezcla óptima si el ajuste está 2 medidas por debajo del umbral de salpicadura para placas de polipropileno o 3,5 medidas por debajo del umbral de salpicadura para placas de poliestireno.

\hrule

\vskip1.000000\baselineskip

V. El protocolo Para comenzar:

Dejar que las reacciones de secuenciación y las placas de RapXtract se equilibren a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Preparar y marcar tubos o placas para reacciones de secuenciación, si no se ha hecho ya.

Ajustar el agitador vorticial al ajuste de calibración apropiado (salpicaduras menos 2) para el uso con RapXtract (véase la sección 3, Requerimientos importantes para el uso con éxito, para las instrucciones sobre la calibración del agitador vorticial).

Procedimiento

1. Golpear suavemente la microplaca de 96 pocillos RapXtract en una encimera para depositar las partículas magnéticas en el fondo de los pocillos.

\hrule

Consejo: Si las partículas se adhieren a la película superior, sostenga la placa en su mano y mueva suavemente su brazo hacia abajo y hacia atrás varias veces. Una acción ligeramente brusca podría ayudar. Está bien si se quedan unas pocas perlas en la película.

\hrule

\vskip1.000000\baselineskip

2. Colocar la microplaca de 96 pocillos RapXtract en el separador magnético Prolinx RapXtract con los elementos magnéticos (barras metálicas) hacia arriba. Golpear ligeramente para sedimentar las perlas.

3. Usando una cuchilla de afeitar, cortar y retirar el precinto de película para exponer sólo los pocillos que se desee usar.

\hrule

Nota: Cuando se tienen menos de 96 muestras, se puede guardar la placa para un uso posterior si se deja la película intacta en los pocillos sin usar y se conserva a 4ºC.

\hrule

\vskip1.000000\baselineskip

4. Ajustar la pipeta multicanal a 100 \mul. Una vez que las partículas están completamente depositadas, retirar y desechar el tampón de almacenamiento. Tener cuidado de no retirar las partículas (unas pocas está bien).

\hrule

Consejo: El separador magnético tira de las partículas hacia el mismo lado en cada columna de ocho pocillos. Para una retirada fácil del sobrenadante de las partículas, usar una pipeta de ocho canales y trabajar en columnas verticales de ocho. El imán y la placa pueden levantarse e inclinarse si es necesario.

\hrule

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5. Añadir inmediatamente las reacciones de secuenciación a cada pocillo de la placa RapXtract.

6. Retirar la placa del separador magnético y colocar la placa RapXtract en el Vortex Genie 2 equipado con el cabezal de placas de 96 pocillos de Vortex Genie 2.

7. Ajustar el agitador vorticial al ajuste de calibrado y agitar vorticialmente durante el número de segundos especificado en la Tabla 4 a continuación para la dilución de la reacción de secuenciación que se use:

TABLA 4

7

* Todas las demás diluciones: seleccionar el volumen y el tiempo más próximos.

\newpage

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Nota:

Para MJ Basestation SOLAMENTE - Después de agitar vorticialmente, añadir 45 \mul de colorante de carga (formamida al 100% con cristal violeta a 1 ng/\mul).

8. Colocar la placa RapXtract de nuevo en el separador magnético RapXtract para sedimentar las partículas.

9. Una vez que las partículas se han depositado completamente, transferir el sobrenadante que contiene las reacciones purificadas a la placa de carga o a tubos de muestra para cargarlo en el secuenciador.

10. Cargar las muestras en el instrumento:

\hrule

Notas:

\bullet Si se secan las muestras, obsérvese que el tiempo de secado será de aproximadamente 30 minutos a calor elevado o de 60 minutos a calor medio. Cuando las muestras se secan, pueden parecer brillantes (es decir, no están húmedas pero pueden parecerlo).

\bullet Cuando se cargan geles de poliacrilamida, algunas partículas pueden arrastrarse hacia los pocillos del peine durante la carga; esto no interfiere con la electroforesis.

\hrule

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Recomendaciones de carga para instrumentos específicos

En general, preparar muestras para geles de carga o inyectar las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante del secuenciador (dependiendo del instrumento particular que se use, por ejemplo, evaporar las muestras hasta sequedad usando calor o vacío; o inyectar electrocinéticamente las muestras). Las recomendaciones son como se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5

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8

9

Claims (40)

1. Un método para eliminar moléculas marcadas con colorante no incorporadas de una mezcla que comprende las moléculas marcadas con colorante y un polímero en el que se incorporan las moléculas marcadas con colorante, comprendiendo el método:

poner en contacto a la mezcla con una pluralidad de partículas que comprenden un material hidrófobo poroso incluido en el interior de una matriz hidrófila;

mezclar e incubar la mezcla y las partículas durante un tiempo suficiente para que las moléculas marcadas con colorante que no estén incorporadas en el polímero pasen hacia la matriz hidrófila y se adsorban en el material hidrófobo; y

eliminar las partículas de la mezcla, eliminando también de este modo las moléculas marcadas con colorante no incorporadas adsorbidas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el colorante es un colorante fluorescente.

3. El método de la reivindicación 2, en el que las moléculas marcadas con colorante no incorporadas comprenden dos moléculas de colorante fluorescentes configuradas como un par de transferencia de energía.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que se añaden entre 1 \mug y 10 \mug de partículas por \mul de mezcla.

5. El método de la reivindicación 4, en el que se añaden entre 3 \mug y 7 \mug de partículas por \mul de mezcla.

6. El método de la reivindicación 5, en el que se añaden entre 4 \mug y 6 \mug de partículas por \mul de mezcla.

7. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la mezcla de reacción se añade a entre 100 \mug y 1 mg de partículas.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la mezcla de reacción se añade a entre 200 \mug y 600 \mug de partículas.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la mezcla de reacción se añade a entre aproximadamente 300 \mug y 400 \mug de partículas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas se colocan en un pocillo de una placa de microtitulación como una suspensión acuosa, las partículas se recogen y la fase acuosa se retira del pocillo antes de añadir la mezcla de reacción al pocillo.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los polímeros son moléculas de polinucleótidos y las moléculas marcadas con colorante son didesoxinucleótidos marcados con colorante.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la mezcla es una mezcla de reacción para una reacción de extensión de los cebadores.

13. El método de la reivindicación 12, en el que las moléculas marcadas con colorante fluorescente no incorporadas son cebadores marcados con colorante fluorescente.

14. El método de la reivindicación 12, en el que las moléculas marcadas con colorante fluorescente no incorporadas son didesoxinucleótidos o desoxinucleótidos marcados con colorante fluorescente o productos de la hidrólisis de los mismos.

15. El método de la reivindicación 12, en el que la reacción de extensión de los cebadores es una reacción de secuenciación de ADN.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la reacción de secuenciación de ADN es una reacción de secuenciación cíclica.

17. El método de la reivindicación 12, en el que la reacción de extensión de los cebadores es una reacción en cadena de la polimerasa o una reacción en cadena de la ligasa.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas comprenden además un resto paramagnético.

19. El método de la reivindicación 18, en el que resto paramagnético es óxido de hierro.

\newpage

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material hidrófobo se selecciona de carbón vegetal activado, un polímero hidrófobo, partículas de sílice y vidrio recubiertas con alquildimetilsilano o arildimetilsilano.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el material hidrófobo comprende un polímero hidrófobo seleccionado del grupo constituido por divinilbenceno, látex, poliestireno y polimetilmetacrilato.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la matriz hidrófila es un polímero reticulado seleccionado del grupo constituido por acrilamida, agarosa y dextrano.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la matriz hidrófila comprende ácido acrílico o ácido metacrílico.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas se tratan con un reactivo bloqueante antes del contacto con la mezcla para reducir la unión inespecífica del polímero a la partícula.

25. El método de la reivindicación 24, en el que reactivo bloqueante se selecciona de albúmina sérica bovina (BSA), reactivo de Denhardt, poliacrilamida lineal (LPA), leche en polvo desnatada, polivinilpirrolidona (PVP), sulfato de heparina, ADN de esperma de salmón y Tween 20.

26. Un método de preparación de polinucleótidos marcados con colorante que están sustancialmente libres de reactivo marcado con colorante no incorporado, comprendiendo el método:

(a) hibridar un cebador con un molde y poner en contacto al cebador hibridado con una polimerasa en una mezcla de reacción que comprende el reactivo marcado con colorante, extendiendo de este modo el cebador para formar una pluralidad de polinucleótidos marcados con colorante;

(b) poner en contacto la mezcla de reacción con una pluralidad de partículas, en la que dichas partículas tienen materiales hidrófobos que están incluidos en el interior de una matriz hidrófila porosa, de tal modo que se efectúa la absorción selectiva de reactivo marcado con colorante no incorporado y artefactos marcados con colorante no incorporados derivados de los mismos; y

(c) separar las partículas de (b) de la mezcla de reacción que contiene los polinucleótidos marcados con colorante.

27. El método de la reivindicación 26, en el que el método comprende además:

(d) analizar los polinucleótidos marcados con colorante mediante electroforesis capilar o en placas de gel.

28. El método de la reivindicación 26, en el que el método comprende además purificar adicionalmente los polinucleótidos marcados con colorante después de separar las partículas de la mezcla de reacción.

29. El método de la reivindicación 26, 27 ó 28, en el que el reactivo marcado con colorante se selecciona de cebadores marcados con colorante y terminadores marcados con colorante.

30. El método de la reivindicación 29, en el que los reactivos marcados con colorante son uno o más didesoxinucleótidos marcados con colorante fluorescente o productos de la hidrólisis de los mismos.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en el que las partículas son partículas magnéticas y las partículas se separan de la mezcla de reacción por colocación de las partículas magnéticas en una estrecha proximidad a un imán.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que los polinucleótidos marcados con colorante son productos de una reacción de secuenciación de ADN.

33. El método de la reivindicación 32, en el que la reacción de secuenciación de ADN es una reacción de secuenciación cíclica.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en el que se añaden entre 1 \mug y 10 \mug de partículas por \mul de mezcla de reacción.

35. El método de la reivindicación 34, en el que se añaden entre 3 \mug y 7 \mug de partículas por \mul de mezcla de reacción.

36. El método de la reivindicación 35, en el que se añaden entre 4 \mug y 6 \mug partículas por \mul de mezcla de reacción.

37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en el que se añaden entre 100 \mug y 1 mg de partículas a la mezcla de reacción.

38. El método de la reivindicación 37, en el que se añaden entre 200 \mug y 600 \mug de partículas a la mezcla de reacción.

39. El método de la reivindicación 38, en el que se añaden entre 300 \mug y 400 \mug de partículas a la mezcla de reacción.

40. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 39, en el que los polinucleótidos marcados con colorante se desnaturalizan a partir del molde antes de la adición de las partículas.