ES2310215T3 - Estructuras mimeticas de giro inverso y metodo relacionado. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la siguiente fórmula general (VI): (Ver fórmula) en la que Ra es un grupo arilo bicíclico que tiene de 8 a 11 miembros anulares, que puede tener de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre, y Rb es un grupo arilo monocíclico que tiene de 5 a 7 miembros anulares, que puede tener de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre, y el anillo arílico del compuesto puede tener uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo C1 - 12 y alcoxilo C1 - 12.
Description
Estructuras miméticas de giro inverso y método
relacionado.
El presente invento se refiere en general a
estructuras miméticas de giro inverso. El invento también se refiere
a aplicaciones en el tratamiento de enfermedades cancerosas y a
composiciones farmacéuticas que las comprenden.
La exploración aleatoria de moléculas en cuanto
a su posible actividad como agentes terapéuticos ha tenido lugar
durante muchos años y ha dado lugar a diversos descubrimientos
farmacológicos importantes. Aunque los avances en biología
molecular y química informática han conducido a un interés aumentado
en lo que ha sido denominado "diseño racional de fármacos",
dichas técnicas no han demostrado ser tan rápidas ni fiables como
se preveía inicialmente. De este modo, en los últimos años ha habido
un renovado interés y una vuelta a la exploración aleatoria de
fármacos. Con este fin, se han dado pasos concretos en nuevas
tecnologías basándose en el desarrollo de bancos de química
combinatoria y en la exploración de dichos bancos en búsqueda de
miembros biológicamente activos.
En general, los bancos de química combinatoria
son simplemente una colección de moléculas. Dichos bancos varían en
cuanto a las especies químicas del banco así como en cuanto a los
métodos empleados tanto para generar los miembros del banco como
para identificar los miembros que interaccionan con dianas
biológicas de interés. Aunque este campo es aún joven, los métodos
para generar y explorar bancos ya han llegado a ser bastante
diversos y sofisticados. Por ejemplo, un reciente examen de
diversos bancos químicos combinatorios ha permitido identificar un
número de dichas técnicas (Dolle, J. Com. Chem. 2 (3):
383-433, 2000), incluyendo el uso de miembros del
banco tanto marcados como no marcados (Janda, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91: 10.779-10.785, 1994).
Inicialmente, los bancos de química combinatoria
se limitaban generalmente a miembros de origen peptídico o
núcleotídico. Con este fin, las técnicas de Houghten et al.
ilustran un ejemplo de lo que se denomina un método "iterativo
doblemente definido" para ensamblar bancos de péptidos
combinatorios solubles por medio de técnicas de síntesis dividida
[Nature (Londres) 354: 84-86, 1991; Biotechniques
13: 412-421, 1992; Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:
405-412, 1993]. Mediante esta técnica se han
obtenido bancos de péptidos solubles que contienen decenas de
millones de miembros. Se ha mostrado que tales bancos son eficaces
para la identificación de péptidos opioides, tales como metionina-
y leucina-encefalina (Dooley y Houghten, Life Sci.
52: 1509-1517, 1993), y se ha utilizado un banco de
péptidos N-acilados para identificar acetalinas, que
son potentes antagonistas de opioides (Dooley et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 10.811-10.815, 1993). Más
recientemente, se ha construido un banco de péptidos opioides,
todos de D-aminoácidos, y se ha explorado en cuanto
a la actividad analgésica frente al receptor opioide mu
("\mu") (Dooley et al., Science 266:
2019-2022, 1994).
Aunque los bancos combinatorios que contienen
miembros de origen peptídico y nucleotídico tienen un valor
significativo, aún existe en la técnica la necesidad de bancos que
contengan miembros de un origen diferente. Por ejemplo, en gran
medida, los bancos peptídicos tradicionales varían meramente la
secuencia de aminoácidos para generar los miembros del banco.
Aunque está bien reconocido que las estructuras secundarias de los
péptidos son importantes para la actividad biológica, dichos bancos
peptídicos no imparten una estructura secundaria forzada a sus
miembros.
Con este fin, ciertos investigadores han ciclado
péptidos con puentes disulfuro en un intento de obtener una
estructura secundaria más forzada (Tumelty et al., J. Chem.
Soc. 1067-68, 1994; Eichler et al., Peptide
Res. 7: 300-306, 1994). Sin embargo, dichos
péptidos ciclados son generalmente aún bastante flexibles y están
escasamente biodisponibles y, por lo tanto, sólo han presentado un
éxito limitado.
Mas recientemente, se han desarrollado
compuestos no peptídicos que reproducen más estrechamente la
estructura secundaria de los giros inversos hallados en proteínas o
péptidos biológicamente activos. Por ejemplo, en la Patente de
EE.UU. nº 5.440.013 concedida a Kahn y los Documentos publicados PCT
WO94/03494, PCT WO01/00210A1 y PCT WO01/16135A2 concedidos a Kahn
se describen compuestos no peptídicos conformacionalmente forzados
que reproducen la estructura tridimensional de los giros
inversos.
Aunque se han realizado avances significativos
en la síntesis y la identificación de compuestos miméticos de giro
inverso conformacionalmente forzados, existe en la técnica la
necesidad de moléculas pequeñas que reproduzcan la estructura
secundaria de los péptidos. También ha habido en la técnica la
necesidad de bancos que contuvieran dichos miembros, así como de
técnicas para sintetizar y explorar los miembros de los bancos
frente a dianas de interés, particularmente a dianas biológicas,
para identificar miembros bioactivos de los bancos. Por ejemplo, en
la Patente de EE.UU. nº 5.929.237 y en su Patente de EE.UU. nº
6.013.458 de continuación en parte, concedidas a Kahn, también se
describen compuestos conformacionalmente forzados que reproducen la
estructura secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y
proteínas biológicamente activos. La síntesis y la identificación
de compuestos miméticos de giro inverso conformacionalmente forzados
y su aplicación a enfermedades fueron bien revisadas por Obrecht
(Advances in Med. Chem. 4: 1-68, 1999).
El presente invento también satisface estas
necesidades y proporciona además ventajas relacionadas al
proporcionar compuestos conformacionalmente forzados que reproducen
la estructura secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y
proteínas biológicamente activos.
La vía de señalización de Wnt regula una
diversidad de procesos, incluyendo el crecimiento celular, la
oncogénesis y el desarrollo (Moon et al., 1997, Trends
Genet. 13: 157-162; Miller et al., 1999,
Oncogene 18: 7860-7872; Nusse y Varmus, 1992, Cell
69: 1073-1087; Cadigan y Nusse, 1997, Genes Dev. 11:
3286-3305; Peifer y Polakis, 2000, Science 287:
1606-1609; Polakis, 2000, Genes Dev. 14:
1837-1851). La vía de señalización de Wnt ha sido
ampliamente estudiada en una diversidad de organismos. Se ha hallado
que la activación de la transcripción mediada por
TCF4/\beta-catenina, ocasionada por la
transducción de señales de Wnt, desempeña un papel esencial en sus
funciones biológicas (Molenaar et al., 1996, Cell 86:
391-399; Gat et al., 1998, Cell 95:
605-614; Orford et al., 1999, J. Cell. Biol.
146: 855-868).
En ausencia de señales de Wnt, el gen supresor
de tumores "adenomatous polyposis coli (APC)" interacciona
simultáneamente con la serina quinasa "glucógeno sintasa quinasa
(GSK)-3\beta" y la
\beta-catenina (Su et al., 1993, Science
262, 1734-1737; Yost et al., 1996, Genes Dev.
10, 1443-1454; Hayashi et al., 1997, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 242-247; Sakanaka et
al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,
3020-3023; Sakanaka y William, 1999, J. Biol. Chem.
274, 14.090-14.093). La fosforilación de APC por
GSK-3\beta regula la interacción de APC con la
\beta-catenina, lo cual, a su vez, puede regular
la función de señalización de la \beta-catenina
(B. Rubinfeld et al., Science 272, 1023, 1996). La
señalización de Wnt estabiliza la \beta-catenina,
lo que permite su translocación al núcleo, donde interacciona con
miembros de la familia "factor potenciador linfoide (LEF1; del
inglés, lymphoid enhancer factor)/factor de
células T (TCF4; del inglés, T-cell factor)"
de factores de transcripción (Behrens et al., 1996, Nature
382, 638-642; Hsu et al., 1998, Mol. Cell.
Biol. 18, 4807-4818; Roose et al., 1999,
Science 285, 1923-1926).
Se ha mostrado recientemente que
c-myc, un conocido oncogén, es un gen diana para la
transcripción mediada por \beta-catenina/TCF4 (He
et al., 1998, Science 281, 1509-1512; Kolligs
et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19,
5696-5706). Se ha descubierto que muchos otros genes
importantes, incluyendo ciclina D1 y metaloproteinasa, que están
también implicados en la oncogénesis, son regulados por la vía
transcripcional de TCF4/beta-catenina (Crawford
et al., 1999, Oncogene 18, 2883-2891;
Shtutman et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11,
5522-5527; Tetsu y McCormick, 1999, Nature 398,
422-426).
Además, se ha hallado que la sobreexpresión de
varios mediadores cadena abajo de la señalización de Wnt regula la
apoptosis (Moris et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
7950-7954; He et al., 1999, Cell 99,
335-345; Orford et al., 1999, J. Cell. Biol.
146, 855-868; Strovel y Sussman, 1999, Exp. Cell.
Res. 253, 637-648). La sobreexpresión de APC en
células de cáncer colorrectal humano inducía apoptosis (Moris et
al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
7950-7954), y la expresión ectópica de
\beta-catenina inhibía la apoptosis asociada con
pérdida de fijación a la matriz extracelular (Orford et al.,
1999, J. Cell. Biol. 146, 855-868). La inhibición
de la transcripción de TCF4/\beta-catenina por
expresión de un mutante dominante-negativo de TCF4
bloqueaba la supervivencia celular mediada por
Wnt-1 y volvía las células sensibles a estímulos
apoptóticos tales como un agente anticanceroso (Shaoqiong Chen
et al., 2001, J. Cell. Biol., 152, 1, 87-96),
y la mutación de APC inhibe la apoptosis al permitir la expresión
de survivina constitutiva, una proteína
anti-apoptótica bien conocida (Tao Zhang et
al., 2001, Cancer Research 62, 8664-8667).
Aunque no se han hallado mutaciones en el gen
Wnt en el cáncer humano, una mutación en APC o
\beta-catenina, como es el caso en la mayoría de
los tumores colorrectales, da lugar a una activación inapropiada de
TCF4, una sobreexpresión de c-myc y una producción
de crecimiento neoplásico (Bubinfeld et al., 1997, Science
275, 1790-1792; Morin et al., 1997, Science
275, 1787-1790; Casa et al., 1999, Cell.
Growth. Differ. 10, 369-376). El gen supresor de
tumores (APC) se pierde o inactiva en el 85% de los cánceres
colorrectales y también en una diversidad de otros cánceres
(Kinzler y Vogelstein, 1996, Cell 87, 159-170). El
principal papel de APC es el de un regulador negativo de la cascada
de transducción de señales de Wnt. Una característica central de
esta vía concierne a la modulación de la estabilidad y la
localización de un depósito citosólico de
\beta-catenina por interacción con un gran
complejo basado en axina que incluye APC. Esta interacción da lugar
a la fosforilación de la \beta-catenina,
dirigiéndola por ello a la degradación.
Las proteínas ligantes de CREB (CBP; del inglés,
CREB binding proteins)/p300 fueron inicialmente
identificadas en ensayos de interacción de proteínas, primero a
través de su asociación con el factor de transcripción CREB
(Chrivia et al., 1993, Nature 365, 855-859) y
más tarde a través de su interacción con la proteína transformante
adenovírica E1A (Stein et al., 1990, J. Virol. 64,
4421-4427; Eckner et al., 1994, Genes Dev. 8,
869-884). Las CBP presentaban potencial para
participar en una diversidad de funciones celulares, incluyendo la
función de coactivador transcripcional (Shikama et al.,
1997, Trends Cell. Biol. 7, 230-236; Janknecht y
Hunter, 1996, Nature 383, 22-23). CBP/p300 potencia
la activación del promotor de siamosis, una conocida diana de Wnt,
mediada por \beta-catenina (Hecht et al.,
2000, EMBO J. 19, 8, 1839-1850). La
\beta-catenina interacciona directamente con el
dominio de CBP que se une a CREB, y la
\beta-catenina presenta sinergismo con CBP para
estimular la activación transcripcional de
TCF4/\beta-catenina (Ken-Ichi
Takemaru y Randall T. Moon, 2000, J. Cell. Biol. 149, 2,
249-254).
En el Documento WO 01 00210 A1 se describen
compuestos conformacionalmente tensos que reproducen la estructura
secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y proteínas
biológicamente activos.
\newpage
En el Documento WO 97 15577 A1 también se
describen compuestos conformacionalmente tensos que reproducen la
estructura secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y
proteínas biológicamente activos.
M. Eguchi et al., Tetrahedron Letters
volumen 42, 2001, páginas 1237-1239, describen la
síntesis en fase sólida y la estructura en disolución de compuestos
peptidomiméticos bicíclicos con giros beta.
En el Documento WO 98 49168 A1 se describen
otros compuestos conformacionalmente forzados que reproducen la
estructura secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y
proteínas biológicamente activos.
Con esta base, el complejo de
TCF4/\beta-catenina y CBP de la vía de Wnt puede
ser considerado como molécula diana para la regulación del
crecimiento celular, la oncogénesis y la apoptosis de células, etc.
Es decir, existe la necesidad de compuestos que bloqueen la vía
transcripcional de TCF4/\beta-catenina al inhibir
la CBP y, por lo tanto, puedan ser utilizados para el tratamiento
del cáncer, especialmente del cáncer colorrectal.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra un gráfico para la medición
de la concentración inhibitoria 50 (IC50; del inglés,
inhibitory concentration 50) de un compuesto del
presente invento sobre células SW480, en el que la inhibición del
crecimiento celular sobre células SW480 se midió con diversas
concentraciones del compuesto preparado en el Ejemplo 4 con objeto
de obtener el valor de IC_{50}. Específicamente, se determinó el
grado de inhibición de actividades luciferasa de luciérnaga y
Renilla por dicho compuesto de ensayo. Como resultado, se
halló la IC_{50} de dicho compuesto de ensayo frente al
crecimiento de células SW480, como se describe en la Tabla 4. Los
procedimientos detallados son los mismos que los descritos en el
Ejemplo 6.
De acuerdo con el presente invento, se
proporciona un compuesto que tiene la siguiente fórmula general
(VI):
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en la que R_{a} es un grupo arilo
bicíclico que tiene de 8 a 11 miembros anulares, que puede tener de
1 a 3 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre,
y R_{b} es un grupo arilo monocíclico que tiene de 5 a 7 miembros
anulares, que puede tener de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre
nitrógeno, oxígeno y azufre, y en que el anillo arílico del
compuesto puede tener uno o más sustituyentes seleccionados del
grupo que consiste en los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo
C_{1-12} y alcoxilo
C_{1-12}.
Preferiblemente, R_{a} es un grupo naftilo,
quinoleinilo o isoquinoleinilo, y R_{b} es fenilo, piridilo o
piperidilo, todos los cuales pueden estar sustituidos con uno o más
sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en los grupos
haluro, hidroxilo, ciano, alquilo C_{1-12} y
alcoxilo C_{1-12}.
Ventajosamente, R_{a} es naftilo, y R_{b} es
fenilo, que pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes
seleccionados del grupo que consiste en los grupos haluro,
hidroxilo, ciano, alquilo C_{1-12} y alcoxilo
C_{1-12}.
\newpage
El presente invento también proporciona un
compuesto seleccionado entre:
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El presente invento se dirige a compuestos
conformacionalmente forzados que reproducen la estructura secundaria
de regiones de giro inverso de péptidos y proteínas biológicos (a
los que aquí también se hace referencia como "compuestos miméticos
de giro inverso").
También se describen composiciones que contienen
un compuesto de este invento en combinación con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
Especialmente, el presente invento se refiere a
composiciones farmacéuticas que contienen los mismos para tratar
trastornos, incluyendo cánceres, que están asociados con la vía de
señalización de Wnt. Se refiere además a métodos para tratar
trastornos, incluyendo el cáncer, que están asociados con la vía de
señalización de Wnt.
Estos y otros aspectos de este invento
resultarán evidentes tras referencia a las figuras adjuntas y a la
descripción detallada siguiente. Con este fin, se exponen aquí
diversas referencias, que describen con mayor detalle ciertos
procedimientos, compuestos y/o composiciones, y se incorporan por
referencia en su totalidad.
Mientras tanto, se ha hallado que los compuestos
de fórmula (I), especialmente los compuestos de fórmula (VI), son
eficaces para inhibir o tratar trastornos modulados por la vía de
señalización de Wnt, tal como el cáncer, especialmente el cáncer
colorrectal
en la que R_{a} es un grupo arilo
bicíclico que tiene de 8 a 11 miembros anulares, que puede tener de
1 a 3 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre,
y R_{b} es un grupo arilo monocíclico que tiene de 5 a 7 miembros
anulares, que puede tener de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre
nitrógeno, oxígeno y azufre, y en que el anillo arílico del
compuesto puede tener uno o más sustituyentes seleccionados del
grupo que consiste en los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo
inferior y alcoxilo
inferior.
Por lo tanto, un objeto del presente invento es
proporcionar una composición farmacéutica que comprenda una
cantidad segura y eficaz del compuesto que tiene la fórmula general
(VI) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que pueda ser
utilizada para el tratamiento de trastornos modulados por la vía de
señalización de Wnt, especialmente por el complejo de
TCF4-\beta-catenina-CBP.
Además, el presente invento es para proporcionar
un método para inhibir el crecimiento de células tumorales al
utilizar la anteriormente descrita composición del presente invento;
un método para inducir la apoptosis de células tumorales al
utilizar la anteriormente descrita composición del presente invento;
un método para tratar un trastorno modulado por el complejo de
TCF4-\beta-catenina-CBP
al utilizar la anteriormente descrita composición del presente
invento; y un método para tratar el cáncer, tal como el cáncer
colorrectal, al administrar la composición del presente invento
junto con otro agente anticanceroso tal como
5-fluorouracilo (5-FU), taxol,
cisplatina, mitomicina C, tegafur, raltitrexed, capecitabina,
irinotecán, etc.
En una realización preferida del presente
invento, el compuesto del presente invento tiene una configuración
(6S,10R) como la siguiente:
en la que R_{a} y R_{b} tienen
unos significados iguales a los anteriormente
definidos.
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En otro aspecto de esta descripción, los bancos
contienen compuestos miméticos de giro inverso.
Además, se puede utilizar una combinación de
técnicas de síntesis tanto en disolución como en fase sólida para
sintetizar los compuestos peptidomiméticos de este invento. Por
ejemplo, se puede utilizar un soporte sólido para sintetizar la
secuencia peptídica lineal hasta el punto en que se añade el giro
inverso conformacionalmente forzado a la secuencia. Luego, como
siguiente "aminoácido", se pueden añadir a la síntesis en fase
sólida unas adecuadas estructuras miméticas de giro inverso
conformacionalmente forzadas que han sido previamente sintetizadas
mediante técnicas de síntesis en disolución (es decir, el compuesto
mimético de giro inverso conformacionalmente forzado, que tiene
tanto un extremo N como un extremo C, puede ser utilizado como el
siguiente aminoácido que se va a añadir al péptido lineal). Tras la
incorporación de las estructuras miméticas de giro inverso
conformacionalmente forzadas a la secuencia, se pueden añadir
aminoácidos adicionales para completar el péptido unido al soporte
sólido. Alternativamente, las secuencias peptídicas lineales con
extremo N y extremo C protegidos pueden ser sintetizadas sobre un
soporte sólido, separadas del soporte y luego copuladas en
disolución con las estructuras miméticas de giro inverso
conformacionalmente forzadas usando técnicas de copulación en
disolución conocidas.
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Se pusieron una resina bromoacetálica (37 mg,
0,98 milimoles/g) y una disolución de R_{2}-amina
en DMSO (1,4 ml) en un bloque Robbins (FlexChem) que tenía placas de
96 pocillos. La mezcla de reacción fue sacudida a 60ºC durante 12
horas utilizando una estufa giratoria (Robbins Scientific). La
resina fue lavada con DMF y MeOH y luego con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió a la resina una disolución de
Fmoc-aminoácidos comercialmente asequibles (4
equivalentes), PyBob (4 equivalentes), HOAt (4 equivalentes) y DIEA
(12 equivalentes) en DMF. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de
reacción durante 12 horas a temperatura ambiental, la resina fue
lavada con DMF y MeOH y luego con DCM.
Se añadió piperidina al 25% en DMF a la resina
hinchada por DMF antes de la reacción y se sacudió la mezcla de
reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. Se repitió de
nuevo esta operación de desprotección y se lavó la resina con DMF y
metanol y luego con DCM. Se añadió una disolución de hidrazina-ácido
(4 equivalentes), HOBt (4 equivalentes) y DIC (4 equivalentes) en
DMF a la resina y se sacudió la mezcla de reacción durante 12 horas
a temperatura ambiental. La resina fue lavada con DMF y MeOH y luego
con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida en la Operación 3 fue tratada
con ácido fórmico (1,2 ml en cada pocillo) durante 18 horas a
temperatura ambiental. Una vez que se hubo separado la resina por
filtración, el producto de filtración fue condensado bajo presión
reducida utilizando un dispositivo SpeedVac (SAVANT) para obtener el
producto en forma de aceite. El producto fue diluido con agua al
50%/acetonitrilo y fue luego liofilizado tras ser congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió piperidina al 25% en DMF a la resina
hinchada por DMF antes de la reacción y se sacudió la mezcla de
reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. Se repitió de
nuevo esta operación de desprotección y se lavó la resina con DMF y
metanol y luego con DCM. Se añadió isocianato (5 equivalentes) en
DCM a la resina hinchada por DCM antes de la reacción. Una vez que
se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 12 horas a
temperatura ambiental, la resina fue lavada con DMF y MeOH y luego
con DCM. Se trató la resina con ácido fórmico (1,2 ml en cada
pocillo) durante 18 horas a temperatura ambiental. Una vez que se
hubo separado la resina por filtración, el producto de filtración
fue condensado bajo presión reducida utilizando un dispositivo
SpeedVac (SAVANT) para obtener el producto en forma de aceite. El
producto fue diluido con agua al 50%/acetonitrilo y fue luego
liofilizado tras ser congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió piperidina al 25% en DMF a la resina
hinchada por DMF antes de la reacción y se sacudió la mezcla de
reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. Se repitió de
nuevo esta operación de desprotección y se lavó la resina con DMF y
MeOH y luego con DCM. Se añadieron cloroformiato de
p-nitrofenilo (5 equivalentes) y
diisopropil-etilamina (5 equivalentes) en DCM a la
resina hinchada por DCM antes de la reacción. Una vez que se hubo
sacudido la mezcla de reacción durante 12 horas a temperatura
ambiental, la resina fue lavada con DMF y MeOH y luego con DCM. Se
añadieron aminas primarias en DCM durante 12 horas a temperatura
ambiental a la resina y se lavó la resina con DMF y MeOH y luego
con DCM. Después de la reacción, la resina fue tratada con ácido
fórmico (1,2 ml en cada pocillo) durante 18 horas a temperatura
ambiental. Una vez que se hubo separado la resina por filtración,
el producto de filtración fue condensado bajo presión reducida
utilizando un dispositivo SpeedVac (SAVANT) para obtener el
producto en forma de aceite. El producto fue diluido con agua al
50%/acetonitrilo y fue luego liofilizado tras ser congelado.
Para generar estos bancos de bloques, se
sintetizaron los hidrazina-ácidos intermedios esenciales de acuerdo
con el procedimiento ilustrado en los Ejemplos de Preparación.
En la Tabla 2 se muestra un banco de compuestos
miméticos de giro inverso [4,4,0] que se pueden preparar, cuya
preparación representativa se proporciona en el Ejemplo 4.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se pusieron la resina bromoacetálica (1,6
milimoles/g) y una disolución de R_{1}-amina en
DMSO (disolución 2 M) en un bloque Robbins (FlexChem) de 96
pocillos. La mezcla de reacción fue sacudida a 60ºC durante 12
horas usando una estufa giratoria (Robbins Scientific). La resina
fue lavada con DMF y MeOH y luego con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió a la resina una disolución de
Fmoc-aminoácidos comercialmente asequibles (4
equivalentes), PyBob (4 equivalentes), HOAt (4 equivalentes) y DIEA
(12 equivalentes) en DMF. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de
reacción durante 12 horas a temperatura ambiental, la resina fue
lavada con DMF y MeOH y luego con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió piperidina al 25% en DMF a la resina
hinchada por DMF antes de la reacción. Luego se sacudió la mezcla
de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. Se repitió
de nuevo esta operación de desprotección y luego se realizó un
lavado con DMF y metanol y luego con DCM. Se añadió una disolución
de cloruro de carbamoilo-hidrazina (4
equivalentes), HOBt (4 equivalentes) y DIC (4 equivalentes) en DMF a
la resina. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción
durante 12 horas a temperatura ambiental, la resina fue lavada con
DMF y MeOH y luego con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió piperidina al 25% en DMF a la resina
hinchada por DMF antes de la reacción. Luego se sacudió la mezcla
de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. Se repitió
de nuevo esta operación de desprotección y luego se realizó un
lavado con DMF y metanol y luego con DCM. Se añadió
R_{1}-isocianato (5 equivalentes) en DCM a la
resina hinchada por DCM antes de la reacción. Una vez que se hubo
sacudido la mezcla de reacción durante 12 horas a temperatura
ambiental, la resina fue lavada con DMF y MeOH y luego con DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató la resina con ácido fórmico (1,2 ml en
cada pocillo) durante 18 horas a temperatura ambiental. Una vez que
se hubo separado la resina por filtración, el producto de filtración
fue condensado bajo presión reducida utilizando un dispositivo
SpeedVac (SAVANT) para obtener el producto en forma de aceite. Estos
productos fueron diluidos con agua al 50%/acetonitrilo y fueron
luego liofilizados tras ser congelados.
En la Tabla 3 se muestra un banco de compuestos
miméticos de giro inverso [4,3,0] que se pueden preparar de acuerdo
con el presente invento, cuya preparación representativa se
proporciona en el Ejemplo 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 4 siguiente muestra compuestos y
valores de IC_{50} de los mismos que son medidos mediante el
ensayo del gen informador del modo descrito en el Ejemplo 6.
Se ha hallado en el presente invento que el
compuesto de fórmula general (I), especialmente el compuesto de
fórmula general (VI), puede inhibir la activación transcripcional
mediada por CBP en células cancerosas a causa de su unión
específica a CBP, lo que viene apoyado por la inmunoprecipitación de
CBP de células SW480 con el compuesto del presente invento.
El compuesto del presente invento puede inhibir
también la expresión de survivina en células SW480 y, por lo tanto,
puede inhibir la actividad oncogénica en células cancerosas. El
compuesto del presente invento puede ser usado para inhibir células
cancerosas y, de esta manera, sería útil para la regulación del
crecimiento celular. Apoyando tales resultados, se muestra además
que el compuesto del presente invento puede inducir la activación
de caspasa-3 en células SW480 y, por lo tanto, puede
inducir la actividad apoptótica en las células. El compuesto del
presente invento puede ser también usado ventajosamente para inducir
la apoptosis en células.
Para confirmar la actividad oncogénica en
células cancerosas in vitro, se probó el ensayo de
citotoxicidad de MTS mediante el método siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron células SW480 o HCT116 en una
microplaca de 96 pocillos (10^{4} células/pocillo) y se incubaron
durante 24 horas a 37ºC. Se trataron las células con el compuesto de
TCF4 en diversas concentraciones durante 24 horas. Se añadieron 20
\mul de disolución de
[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio,
sal interna] (MTS; Promega) a cada pocillo y se realizó una
incubación durante 2 horas a 37ºC. Se midió la viabilidad celular
leyendo la absorbancia a 490 nm mediante un lector de microplacas
(Molecular Device) y se calculó la citotoxicidad del compuesto para
cada concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron células SW480 o HCT116 en una
microplaca de 96 pocillos (10^{4} células/pocillo) y se incubaron
durante 24 horas a 37ºC. Se añadieron 20 \mul de disolución de MTS
(Promega) a cada pocillo y se leyó la absorbancia después de una
incubación de 2 horas a 37ºC (testigo negativo). Se trataron luego
las células con el compuesto de TCF4 en diversas concentraciones
durante 48 horas. Se añadieron 20 \mul de disolución de MTS
(Promega) a cada pocillo y se realizó una incubación durante 2 horas
a 37ºC. Se midió la viabilidad celular leyendo la absorbancia a 490
nm mediante un lector de microplacas (Molecular Device) y se calculó
la citotoxicidad del compuesto para cada concentración.
En la Tabla 5 se muestran los resultados de la
actividad oncogénica para compuestos de banco seleccionados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
GI50 (del inglés, growth
inhibition 50) es la concentración que causa una inhibición
del crecimiento del 50%.
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En otro aspecto del presente invento, se
describe una composición farmacéutica que contiene el compuesto que
tiene la fórmula general (I), especialmente el compuesto de fórmula
general (VI). Para la preparación de la composición farmacéutica
que contiene los presentes compuestos, una persona experta en la
técnica puede utilizar los conocimientos públicamente conocidos y
las técnicas que se conocen en el pertinente campo técnico. Para la
preparación de la composición del presente invento, se utilizan
generalmente variedades conocidas de vehículos y otros aditivos.
Las composiciones farmacéuticas de este invento pueden ser
administradas de una manera estándar para el estado morboso que se
desea tratar, tal como, por ejemplo, mediante administración oral,
rectal o parenteral.
\newpage
Para estos fines, los compuestos del presente
invento pueden ser formulados, por medios conocidos en la técnica,
en forma de, por ejemplo, tabletas, cápsulas, disoluciones o
suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones (lípidos), polvos
dispersables, supositorios, ungüentos, cremas, gotas y disoluciones
o suspensiones estériles inyectables, acuosas u oleosas.
Una composición farmacéutica adecuada del
presente invento es una adecuada para administración oral en una
forma de dosificación unitaria tal como, por ejemplo, una tableta o
cápsula que contiene de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g
del compuesto de este invento.
En otro aspecto, una composición farmacéutica
del presente invento es una adecuada para inyección intravenosa,
subcutánea o intramuscular. Un paciente puede recibir, por ejemplo,
una dosis intravenosa, subcutánea o intramuscular de
aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 1g/kg del compuesto
del presente invento. La dosis intravenosa, subcutánea o
intramuscular puede ser administrada por medio de una inyección en
bolo. Alternativamente, la dosis intravenosa puede ser administrada
por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo.
Alternativamente, un paciente recibirá una dosis
oral diaria que será aproximadamente equivalente a la dosis
parenteral diaria, administrándose la composición de 1 a 4 veces al
día.
En la tabla siguiente se ilustran formas de
dosificación farmacéutica representativas que contienen el compuesto
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso
terapéutico o profiláctico en seres humanos.
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La composición farmacéutica que contiene el
compuesto de fórmula general (I), especialmente el compuesto de
fórmula general (VI), puede ser utilizada para el tratamiento de
trastornos modulados por la vía de señalización de Wnt,
especialmente del cáncer, más especialmente del cáncer
colorrectal.
En otro aspecto del presente invento, se
describe un método para inhibir el crecimiento de células tumorales
en un sujeto, método que comprende administrar una cantidad segura y
eficaz de los compuestos del presente invento a una célula tumoral.
La composición que contiene tales compuestos puede ser también
utilizada para la inhibición de células tumorales. De este modo,
este método puede ser útil para el tratamiento del cáncer en un
sujeto mamífero. Puede ser ventajosamente utilizado para el
tratamiento del cáncer colorrectal.
En otro aspecto del presente invento, se
describe un método para tratar un trastorno modulado por la vía de
señalización de Wnt, método que comprende administrar una cantidad
segura y eficaz de los compuestos que tienen la fórmula general
(I), especialmente del compuesto de fórmula general (VI), a un
paciente. La composición farmacéutica que contiene el compuesto del
presente invento puede ser también utilizada para este fin. A este
respecto, se ha hallado en el presente invento que los compuestos
que tienen la fórmula general (I), especialmente el compuesto de
fórmula general (VI), o la composición farmacéutica que contiene los
mismos pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos
modulados por el complejo de
TCF4-\beta-catenina-CBP,
del que se cree que es responsable de iniciar la sobreexpresión de
células cancerosas relacionada con la vía de señalización de Wnt.
De esta manera, otro aspecto del presente invento es proporcionar un
método para el tratamiento de trastornos modulados por el complejo
de TCF4 - \beta-catenina - CBP usando los
compuestos que tienen la fórmula general (I), especialmente el
compuesto de fórmula general (VI).
Además, puesto que el tratamiento del cáncer
está también estrechamente relacionado con la inducción de apoptosis
en células cancerosas en un sujeto, el presente invento también se
dirige a un método para inducir apoptosis en células cancerosas
utilizando los compuestos de fórmula general (I), especialmente el
compuesto de fórmula general (VI).
Se ha conocido de la técnica previa que el
5-FU (fluorouracilo;
5-fluoro-2,4(1H,
3H)-pirimidinadiona) puede inducir apoptosis en
células de cáncer oral en cultivo (D. Tong et al., Oral
Oncology 36, 2000, 236-241). Además, se sabe
también que el cáncer de colon presenta sensibilidad al
5-FU (D. Arango et al., Cancer Research 61,
2001, 4910-4915). Por lo tanto, en el presente
invento, se prepara la combinación de 5-FU, que
tiene una actividad anticancerosa establecida, y los compuestos de
fórmula (I), especialmente el compuesto de fórmula general (VI) del
presente invento, y se examina frente a líneas celulares SW480. Como
resultado, se ha hallado que la combinación de 5-FU
con los compuestos del presente invento, especialmente el compuesto
de TCF4, presenta un acusado efecto inhibidor del crecimiento de
células cancerosas, tales como las células SW480.
Por lo tanto, aún otro aspecto del presente
invento es proporcionar un método para tratar el cáncer, que
comprende administrar a un sujeto unas cantidades seguras y
eficaces del compuesto que tiene la fórmula (I) de la Reivindicación
1, especialmente el compuesto de fórmula general (VI), junto con
otro agente anticanceroso tal como 5-FU.
Se ha mostrado que los compuestos del presente
invento inhiben la expresión de survivina.
Blanc-Brude et al., Nat. Medicine 8: 987
(2002), han mostrado que la survivina es un regulador crítico de la
apoptosis de células de músculo liso, que es importante en el
remodelado patológico de la pared de los vasos. En consecuencia,
otro aspecto del presente invento proporciona un método para tratar
o prevenir la reestenosis asociada con la angioplastia, que
comprende administrar una cantidad segura y eficaz de un compuesto
mimético de giro inverso del presente invento a un sujeto que lo
necesita. En una realización, el invento trata la reestenosis; es
decir, la administración de un compuesto mimético de giro inverso
del presente inverso a un sujeto que padece reestenosis consigue
una reducción de la gravedad, la extensión, el grado, etc. de la
reestenosis. En otra realización, el invento evita la reestenosis;
es decir, la administración de un compuesto mimético de giro
inverso del presente invento a un sujeto del que se prevé que
desarrolle una reestenosis nueva o adicional consigue una reducción
de la gravedad, la extensión, el grado, etc. previstos de la
reestenosis. Opcionalmente, el sujeto es un sujeto mamífero.
Se ha mostrado que los compuestos del presente
invento inhiben la transcripción de
TCF/\beta-catenina. Rodova et al., J.
Biol. Chem. 277: 29.577 (2002), han mostrado que el promotor de
PKD-1 es una diana de la vía de
\beta-catenina/TCF. En consecuencia, otro aspecto
del presente invento proporciona un método para tratar o prevenir
la enfermedad del riñón poliquístico, que comprende administrar una
cantidad segura y eficaz de un compuesto mimético de giro inverso
del presente invento a un sujeto que lo necesita. En una
realización, el invento trata la enfermedad del riñón poliquístico;
es decir, la administración de un compuesto mimético de giro
inverso del presente invento a un sujeto que padece la enfermedad
del riñón poliquístico consigue una reducción de la gravedad, la
extensión, el grado, etc. de la enfermedad del riñón poliquístico.
En otra realización, el invento previene la enfermedad del riñón
poliquístico; es decir, la administración de un compuesto mimético
de giro inverso del presente invento a un sujeto del que se prevé
que desarrolle una enfermedad nueva o adicional del riñón
poliquístico consigue una reducción de la gravedad, la extensión, el
grado, etc. previstos de la enfermedad del riñón poliquístico.
Opcionalmente, el sujeto es un sujeto mamífero.
Se ha mostrado que los compuestos del presente
invento inhiben la expresión de la señalización de Wnt. Hanai et
al., J. Cell Biol. 158: 529 (2002), han mostrado que la
endostatina, un conocido factor antiangiogénico, inhibe la
señalización de Wnt. En consecuencia, otro aspecto del presente
invento proporciona un método para tratar o prevenir la enfermedad
de la angiogénesis aberrante, que comprende administrar una cantidad
segura y eficaz de un compuesto mimético de giro inverso del
presente invento a un sujeto que lo necesita. En una realización,
el invento trata la enfermedad de la angiogénesis aberrante; es
decir, la administración de un compuesto mimético de giro inverso
del presente invento a un sujeto que padece la enfermedad de la
angiogénesis aberrante consigue una reducción de la gravedad, la
extensión, el grado, etc. de la enfermedad de la angiogénesis
aberrante. En otra realización, el invento previene la enfermedad de
la angiogénesis aberrante; es decir, la administración de un
compuesto mimético de giro inverso del presente invento a un sujeto
del que se prevé que desarrolle una enfermedad nueva o adicional de
la angiogénesis aberrante consigue una reducción de la gravedad, la
extensión, el grado, etc. previstos de la enfermedad de la
angiogénesis aberrante. Opcionalmente, el sujeto es un sujeto
mamífero.
Se ha mostrado que los compuestos del presente
invento inhiben la expresión de la señalización de Wnt. Sen et
al., P.N.A.S. (USA) 97: 2791 (2000), han mostrado que mamíferos
con artritis reumatoide presentan una expresión aumentada de Wnt y
Fz en el tejido sinovial de los afectados con artritis reumatoide.
En consecuencia, otro aspecto del presente invento proporciona un
método para tratar o prevenir la enfermedad de la artritis
reumatoide, que comprende administrar una cantidad segura y eficaz
de un compuesto mimético de giro inverso del presente invento a un
sujeto que lo necesita. En una realización, el invento trata la
enfermedad de la artritis reumatoide; es decir, la administración
de un compuesto mimético de giro inverso del presente invento a un
sujeto que padece la enfermedad de la artritis reumatoide consigue
una reducción de la gravedad, la extensión, el grado, etc. de la
enfermedad de la artritis reumatoide. En otra realización, el
invento previene la enfermedad de la artritis reumatoide; es decir,
la administración de un compuesto mimético de giro inverso del
presente invento a un sujeto del que se prevé que desarrolle una
enfermedad nueva o adicional de la artritis reumatoide consigue una
reducción de la gravedad, la extensión, el grado, etc. previstos de
la enfermedad de la artritis reumatoide. Opcionalmente, el sujeto es
un sujeto mamífero.
Se ha mostrado que los compuestos del presente
invento inhiben la expresión de la señalización de Wnt. Uthoff et
al., Int. J. Oncol. 19: 803 (2001), han mostrado que se produce
una suprarregulación diferencial de "disheveled" y Fz
(moléculas de la vía de Wnt) en los pacientes con colitis ulcerosa
(en comparación con los pacientes con enfermedad de Crohn). En
consecuencia, otro aspecto del presente invento proporciona un
método para tratar o prevenir la colitis ulcerosa, que comprende
administrar una cantidad segura y eficaz de un compuesto mimético
de giro inverso del presente invento a un sujeto que lo necesita. En
una realización, el invento trata la colitis ulcerosa; es decir, la
administración de un compuesto mimético de giro inverso del presente
invento a un sujeto que padece colitis ulcerosa consigue una
reducción de la gravedad, la extensión, el grado, etc. de la
colitis ulcerosa. En otra realización, el invento previene la
colitis ulcerosa; es decir, la administración de un compuesto
mimético de giro inverso del presente invento a un sujeto del que se
prevé que desarrolle una colitis ulcerosa nueva o adicional
consigue una reducción de la gravedad, la extensión, el grado, etc.
previstos de la colitis ulcerosa. Opcionalmente, el sujeto es un
sujeto mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos no restrictivos ilustran
el compuesto, la composición y los métodos de uso de este
invento.
\newpage
Ejemplo 1 de
Preparación
Se ajustaron un tapón de vidrio y un tubo de
calcio a un matraz de fondo redondo y dos bocas de 2 l de capacidad.
Se añadió una disolución de sulfato de
metil-hidrazina (20 g, 139 milimoles) en THF (300
ml) y se añadió una disolución de DiBoc (33 g, 153 milimoles) en
THF. Se añadió gota a gota durante 2 horas una disolución acuosa
saturada de bicarbonato sódico (500 ml) a través de un embudo de
adición, con agitación enérgica. Después de 6 horas, se añadió
lentamente una disolución de Fmoc-Cl (39 g, 153
milimoles) en THF. La suspensión resultante fue agitada durante 6
horas a 0ºC. Se sometió la mezcla a extracción con acetato de etilo
(EA; del inglés, ethyl acetate) (500 ml) y se
conservó la capa orgánica. La disolución fue secada con sulfato
sódico y fue sometida a evaporación in vacuo. Se llevó a cabo
la siguiente operación sin purificación alguna.
Se ajustaron un tapón de vidrio y un tubo de
calcio a un matraz de fondo redondo y dos bocas de 1 l de capacidad.
Se añadió una disolución de la mezcla de reacción en MeOH (300 ml)
y se añadió lentamente HCl concentrado (30 ml, 12 N) a través de un
embudo de adición, con agitación magnética en un baño de
hielo-agua, y se agitó la mezcla durante la noche.
Se sometió la mezcla a extracción con EA (1000 ml) y se conservó la
capa orgánica. La disolución fue secada con sulfato sódico y fue
sometida a evaporación in vacuo. El residuo fue purificado
por cristalización en n-hexano y EA para obtener el
producto (32,2 g, 83%).
Resonancia magnética nuclear (NMR; del inglés,
nuclear magnetic resonance) de ^{1}H
(DMSO-D6), \delta: 7,90\sim7,88 (d, J = 6 Hz,
2H), 7,73\sim7,70 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,44\sim7,31 (m, 4H),
4,52\sim4,50 (d, J = 6 Hz, 2H), 4,31\sim4,26 (t, J = 6 Hz, 1H),
2,69 (s, 1H).
A un matraz de fondo redondo y dos bocas, de 1 l
de capacidad, se ajustaron un tapón de vidrio y un refrigerante de
reflujo conectado a un tubo de calcio. Se añadió una disolución de
N-Fmoc-N'-metil-hidrazina
(20 g, 75 milimoles) en tolueno (300 ml). Se añadió lentamente una
disolución de bromoacetato de t-butilo (22 g, 111
milimoles) en tolueno (50 ml). Se añadió lentamente Cs_{2}CO_{3}
(49 g, 149 milimoles). Se añadió lentamente NaI (11 g, 74
milimoles), con agitación enérgica. Se agitó la mezcla de reacción
durante 1 día a la temperatura de reflujo. Se filtró la mezcla y se
sometió la capa orgánica a extracción con acetato de etilo (EA; 500
ml). La disolución fue secada con sulfato sódico y fue sometida a
evaporación in vacuo. El producto fue purificado por
cromatografía con una disolución de hexano:EA = 2:1 para obtener el
producto (19,8 g, 70%).
^{1}H-NMR (CDCl_{3}),
\delta: 7,78\sim7,75 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,61\sim7,59 (d, J = 6
Hz, 2H), 7,43\sim7,26 (m, 4H), 4,42\sim4,40 (d, J = 6 Hz, 2H),
4,23 (ancho, 1H), 3,57 (s, 2H), 2,78 (s, 3H), 1,50 (s, 9H).
A un matraz de fondo redondo y dos bocas, de 1 l
de capacidad, se ajustaron un tapón de vidrio y un refrigerante de
reflujo conectado a un tubo de calcio. Se añadió el éster
t-butílico del ácido
(N-Fmoc-N'-metil-hidrazino)-acético
(20 g, 52 milimoles). Se añadió lentamente una disolución de HCl
(150 ml, disolución 4 M en dioxano), con agitación enérgica en un
baño de hielo-agua. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiental durante 1 día. La disolución fue
completamente concentrada bajo presión reducida a 40ºC. Se añadió
una disolución acuosa saturada de NaHCO_{3} (100 ml) y se lavó la
capa acuosa con éter dietílico (100 ml). Se añadió lentamente, gota
a gota, HCl concentrado a 0ºC (pH de 2-3). Se
sometió la mezcla a extracción y se conservó la capa orgánica (500
ml, MC). La disolución fue secada con sulfato sódico y fue sometida
a evaporación in vacuo. El residuo fue purificado por
recristalización en n-hexano y acetato de etilo para
obtener el producto (12 g, 72%).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}), \delta: 12,38 (s, 1H), 8,56
(ancho, 1H), 7,89\sim7,86 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,70\sim7,67 (d, J
= 9 Hz, 2H), 7,43\sim7,29 (m, 4H), 4,29\sim4,27 (d, J = 6 Hz,
2H), 4,25\sim4,20 (t, J = 6 Hz, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,56 (s,
3H).
Ejemplo 2 de
Preparación
Se disolvió carbazato de metilo (50 g, 0,55
moles) en DMF (300 ml) y luego se añadieron bromoacetato de etilo
(68 ml, 0,555 moles) y carbonato potásico (77 g, 0,555 moles) al
recipiente de reacción. Se calentó la mezcla a 50ºC durante 5
horas. Una vez que se hubo completado la reacción, la mezcla fue
filtrada, diluida con EtOAc y lavada con salmuera (3 veces). El
producto crudo fue purificado en una columna (eluyente: Hex/EtOAc =
4/1). Producto: 72 g (aceite incoloro).
Se disolvieron el éster etílico (10 g, 0,05
moles), carbonato potásico (6,9 g, 0,05 moles) y bromuro de R_{3}
(14,1 g, 0,06 moles) en DMF (200 ml) y se calentó la mezcla a 50ºC
durante 5 horas. Una vez que se hubo completado la reacción, la
mezcla fue filtrada, diluida con EA y lavada con salmuera (3 veces).
El producto crudo fue purificado por cromatografía (eluyente:
Hex/EtOAc = 4/1).
Se disolvió el éster etílico alquilado (9,5 g,
0,03 moles) en THF/agua (1/1, ml) y se añadió una disolución 2 N de
NaOH (28,3 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla a temperatura ambiental
durante 2 horas. Una vez que no se hubo detectado el éster de
partida por UV, la disolución fue diluida con EA y fue luego
separada. La capa acuosa fue acidificada hasta un pH de 3\sim4
mediante HCl 1 N, y el compuesto fue extraído mediante DCM (3
veces). Las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre
MgSO_{4} y fueron sometidas a evaporación para obtener un sólido
amarillo.
Este compuesto fue preparado de acuerdo con un
procedimiento bibliográfico (Cheguillaume et al., Synlett
2000, 3, 331).
Se pusieron la resina bromoacetálica (60 mg,
0,98 milimoles/g) y una disolución de bencilamina en DMSO (2,5 ml,
2 M) en un vial con tapón de rosca. Se sacudió la mezcla de reacción
a 60ºC durante 12 h usando una estufa giratoria (Robbins
Scientific). La resina se recogió por filtración y se lavó con DMF y
luego con DCM.
Se añadió una disolución de
Fmoc-alanina (4 equivalentes), HATU (PerSeptive
Biosystems, 4 equivalentes) y DIEA (4 equivalentes) en NMP
(Advanced ChemTech) a la resina. Una vez que se hubo sacudido la
mezcla de reacción durante 4 horas a temperatura ambiental, la
resina fue recogida por filtración y fue lavada con DMF y DCM y
luego con DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF a la resina.
Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 8
minutos a temperatura ambiental, la resina fue recogida por
filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió una disolución de
N^{\beta}-Moc-N^{\alpha}-bencil-hidrazinoglicocola
(4 equivalentes), HOBT (Advanced ChemTech, 4 equivalentes) y DIC (4
equivalentes) en DMF a la resina anteriormente preparada. Una vez
que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 3 horas a
temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue
lavada con DMF y DCM y luego con MeOH. La resina fue secada in
vacuo a temperatura ambiental.
Se trató la resina con ácido fórmico (2,5 ml)
durante 18 horas a temperatura ambiental. Una vez que se hubo
separado la resina por filtración, el producto de filtración fue
condensado bajo presión reducida para obtener el producto en forma
de aceite.
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}), \delta (ppm): 1,51 (d, 3H), 2,99 (m, 1H), 3,39 (d,
1H), 3,69 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 3,82 (s, 3H), 4,02 (d, 1H), 4,24
(d, 1H), 4,39 (d, 1H), 4,75 (d, 1H), 5,14 (q, 1H), 5,58 (dd, 1H),
7,10-7,38 (m, 10H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó rápidamente una mezcla bifásica,
enfriada con hielo, de éster
9H-fluoren-9-ilmetílico
del ácido
N-metil-hidrazina-carboxílico
(107 mg, 0,4 milimoles) en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} y 15 ml de
disolución acuosa saturada de NaHCO_{3} mientras se añadía de una
sola vez una disolución 1,93 M de fosgeno en tolueno (1,03 ml, 2
milimoles). La mezcla de reacción fue agitada durante 30 minutos,
la fase orgánica fue recogida y la fase acuosa fue sometida a
extracción con CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas combinadas
fueron secadas sobre MgSO_{4}, filtradas y concentradas bajo
presión reducida para obtener 128 mg (97%) del cloruro de carbamoilo
en forma de sólido espumoso (advertencia: el vapor de fosgeno es
muy tóxico. El fosgeno ha de usarse en una campana de extracción).
Este producto fue utilizado en la síntesis en fase sólida siguiente
sin una purificación ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron la resina bromoacetálica (30 mg,
0,98 milimoles/g) y una disolución de bencilamina en DMSO (1,5 ml, 2
M) en un vial con tapón de rosca. Se sacudió la mezcla de reacción a
60ºC durante 12 horas utilizando una estufa giratoria (Robbins
Scientific). La resina se recogió por filtración y se lavó con DMF y
luego con DCM.
Se añadió una disolución de
Fmoc-alanina (3 equivalentes), HATU (PerSeptive
Biosystems, 3 equivalentes) y DIEA (3 equivalentes) en NMP (Advanced
ChemTech) a la resina. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de
reacción durante 4 horas a temperatura ambiental, la resina fue
recogida por filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con
DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF a la resina.
Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 8 minutos
a temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue
lavada con DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió una disolución del cloruro de
N'-Fmoc-N-metil-hidrazinocarbonilo
(5 equivalentes) obtenido en la operación (1) anterior y DIEA (5
equivalentes) en DCM a la resina anteriormente preparada. Una vez
que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 4 horas a
temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue
lavada con DMF, DCM y DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF (10 ml para 1
g de la resina) a la resina. Una vez que se hubo sacudido la mezcla
de reacción durante 8 minutos a temperatura ambiental, la resina fue
recogida por filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con
DMF.
Se trató la resina con una mezcla de isocianato
de bencilo (4 equivalentes) y DIEA (4 equivalentes) en DCM durante 4
horas a temperatura ambiental. La resina fue luego recogida por
filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con MeOH. La resina
fue secada in vacuo a temperatura ambiental.
Se trató la resina con ácido fórmico durante 14
horas a temperatura ambiental. Una vez que se hubo separado la
resina por filtración, el producto de filtración fue condensado bajo
presión reducida para obtener el producto en forma de aceite.
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}), \delta (ppm): 1,48 (d, 3H), 2,98 (s, 3H), 3,18 (m,
1H), 3,46 (m, 1H), 4,37-4,74 (m, 5H), 5,66 (dd, 1H),
6,18 (m, 1H), 7,10-7,40 (m, 10H).
\newpage
El compuesto del título se prepara de acuerdo
con un procedimiento igual al del Ejemplo 2.
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}), \delta (ppm): 1,48 (d, 3H), 2,99 (s, 3H), 3,03 (s,
3H), 3,38 (m, 1H), 3,53 (dd, 1H), 4,36 (dd, 1H), 4,52 (q, 1H), 4,59
(dd, 1H), 5,72 (dd, 1H), 6,19 (t ancho, 1H),
7,10-7,38 (m, 5H).
Se pusieron la resina bromoacetálica (30 mg,
0,98 milimoles/g) y una disolución de
naftilmetil-amina en DMSO (1,5 ml, 2 M) en un vial
con tapón de rosca. Se sacudió la mezcla de reacción a 60ºC durante
12 horas utilizando una estufa giratoria (Robbins Scientific). La
resina se recogió por filtración y se lavó con DMF y luego con
DCM.
Se añadió una disolución de
Fmoc-Tyr(OBut)-OH (3
equivalentes), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 equivalentes) y DIEA
(3 equivalentes) en NMP (Advanced ChemTech) a la resina. Una vez que
se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 4 horas a temperatura
ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue lavada con
DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF a la resina.
Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 8 minutos
a temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue
lavada con DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió una disolución de cloruro de
N'-Fmoc-N-metil-hidrazinocarbonilo
(5 equivalentes) y DIEA (5 equivalentes) en DCM a la resina
anteriormente preparada. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de
reacción durante 4 horas a temperatura ambiental, la resina fue
recogida por filtración y fue lavada con DMF, DCM y DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF (10 ml para 1
g de la resina) a la resina. Una vez que se hubo sacudido la mezcla
de reacción durante 8 minutos a temperatura ambiental, la resina fue
recogida por filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con
DMF.
Se trató la resina con una mezcla de isocianato
de bencilo (4 equivalentes) y DIEA (4 equivalentes) en DCM durante 4
horas a temperatura ambiental. La resina fue luego recogida por
filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con MeOH. La resina
fue secada in vacuo a la temperatura ambiental.
Se trató la resina con ácido fórmico durante 14
horas a temperatura ambiental. Una vez que se hubo separado la
resina por filtración, el producto de filtración fue condensado bajo
presión reducida para obtener el producto en forma de aceite.
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}), \delta (ppm): 2,80-2,98 (m, 5H),
3,21-3,37 (m, 2H), 4,22-4,52 (m,
2H), 4,59 (t, 1H), 4,71 (d, 1H), 5,02 (dd, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,51
(d, 1H), 6,66 (t, 2H), 6,94 (dd, 2H), 7,21-8,21 (m,
12H).
Se pusieron la resina bromoacetálica (60 mg,
0,98 milimoles/g) y una disolución de naftil-amina
en DMSO (2,5 ml, 2 M) en un vial con tapón de rosca. Se sacudió la
mezcla de reacción a 60ºC durante 12 horas utilizando una estufa
giratoria (Robbins Scientific). La resina se recogió por filtración
y se lavó con DMF y luego con DCM.
Se añadió una disolución de
Fmoc-Tyr(OBut)-OH (4
equivalentes), HATU (PerSeptive Biosystems, 4 equivalentes) y DIEA
(4 equivalentes) en NMP (Advanced ChemTech) a la resina. Una vez que
se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 4 horas a
temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue
lavada con DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió piperidina al 20% en DMF a la resina.
Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 8
minutos a temperatura ambiental, la resina fue recogida por
filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con DMF.
Se añadió una disolución de
N^{\beta}-Fmoc-N^{\alpha}-bencil-hidrazinoglicocola
(4 equivalentes), HOBT (Advanced
ChemTech; 4 equivalentes) y DIC (4 equivalentes) en DMF a la resina anteriormente preparada. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 3 horas a temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue lavada con DMF y luego con, DCM.
ChemTech; 4 equivalentes) y DIC (4 equivalentes) en DMF a la resina anteriormente preparada. Una vez que se hubo sacudido la mezcla de reacción durante 3 horas a temperatura ambiental, la resina fue recogida por filtración y fue lavada con DMF y luego con, DCM.
Se añadió piperidina al 20% en DMF (10 ml para 1
g de la resina) a la resina. Una vez que se hubo sacudido la mezcla
de reacción durante 8 minutos a temperatura ambiental, la resina fue
recogida por filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con
DMF.
Se trató la resina con una mezcla de isocianato
de bencilo (4 equivalentes) y DIEA (4 equivalentes) en DCM durante
4 horas a temperatura ambiental. La resina fue luego recogida por
filtración y fue lavada con DMF y DCM y luego con MeOH. Una vez que
se hubo secado la resina in vacuo a temperatura ambiental, se
trató la resina con ácido fórmico (2,5 ml) durante 18 horas a
temperatura ambiental. La resina fue separada por filtración, y el
producto de filtración fue condensado bajo presión reducida para
obtener el producto en forma de aceite.
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}), \delta (ppm): 2,73 (s, 3H), 3,13 (d, 1H),
3,21-3,38 (m, 3H), 3,55 (d, 1H), 3,75 (t, 1H), 4,22
(dd, 1H), 4,36 (dd, 1H), 4,79 (d, 1H), 5,22 (t, 1H), 5,47 (m, 2H),
6,68 (d, 2H), 6,99 (d, 2H), 7,21-8,21 (m, 12H).
Espectrometría de masas (m/z; ionización por electropulverización):
564,1 (MH^{+}), 586,3 (MNa^{+}).
Se llevaron a cabo un bioensayo para la medición
de la IC_{50} frente a células SW480 y una prueba de citotoxicidad
sobre las líneas celulares mediante los métodos siguientes. El
compuesto de ensayo fue el preparado en el Ejemplo 4:
Se transfectaron células SW480 con el uso del
reactivo de transfección Superfect^{TM} (Qiagen, 301307). Las
células fueron tratadas brevemente con tripsina 1 día antes de la
transfección y fueron sembradas en placas de 6 pocillos (5 x
10^{5} células/pocillo) para que presentaran una confluencia de
50-80% el día de la transfección.
Se diluyeron cuatro microgramos (TOPFlash) y un
microgramo (pRL-null) de DNAs en 150 \mul de medio
exento de suero y se añadieron 30 \mul del reactivo de
transfección Superfect^{TM}. Se incubó la mezcla de
DNA-Superfect a temperatura ambiental durante 15
minutos y luego se añadió 1 ml de DMEM-suero bovino
fetal (FBS) al 10% a este complejo y se incubó la mezcla durante 3
horas adicionales. Mientras se formaban los complejos, las células
eran lavadas dos veces con disolución salina tamponada con fosfato
(PBS) sin antibióticos.
Los complejos de DNA-reactivo de
transfección Superfect^{TM} fueron aplicados a las células antes
de realizar una incubación a 37ºC y en CO_{2} al 5% durante 3
horas. Después de la incubación, se añadió medio de recuperación
con FBS al 10% para llevar el volumen final a 1,18 ml. Después de 3
horas de incubación, se recolectaron las células y se volvieron a
sembrar en placas de 96 pocillos (3 x 10^{4} células/pocillo).
Después de una incubación durante la noche a 37ºC y en CO_{2} al
5%, las células fueron tratadas con el compuesto de ensayo durante
24 horas. Finalmente, se examinó la actividad por medio del ensayo
de la luciferasa (Promega, E1960).
En la Figura 1 se ilustran los resultados de la
medición de la IC_{50} del anterior compuesto para células
SW480.
Mediante el ensayo de la sulforrodamina B se
midió el efecto inhibitorio del compuesto anterior sobre el
crecimiento de las células enumeradas más adelante. Se sembraron
células SW480 en 100 \mul de medio, en cada pocillo de una placa
de 96 pocillos, y se dejó que se unieran las células durante 24
horas. Se añadió el compuesto a los pocillos para producir las
deseadas concentraciones finales y se incubaron las placas a 37ºC
durante 48 horas. Luego se fijaron las células mediante la adición
lenta de 100 \mul de ácido tricloroacético frío (4ºC) al 10% a
cada pocillo, lo que fue seguido de una incubación a 4ºC durante 1
hora. Las placas fueron lavadas cinco veces con agua desionizada y
dejadas secar al aire. Luego se tiñeron las células mediante la
adición de 100 \mul de disolución de SRB [SRB al 0,4%
(peso/volumen) en ácido acético al 1% (volumen/volumen)] a los
pocillos durante 15 minutos. Tras la tinción, las placas fueron
lavadas rápidamente cinco veces con ácido acético al 1% para
eliminar todo colorante no unido y fueron dejadas secar al aire. El
colorante unido fue solubilizado con Tris-base (10
milimoles/l; pH de 10,5) antes de la lectura de las placas. Se leyó
la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 515 nm con un
lector de placas de Molecular Device. Se expresó la inhibición del
crecimiento como viabilidad relativa (% del testigo) y se calculó la
GI_{50} a partir de curvas de
concentración-respuesta después de una
transformación "log/probit".
Se apreciará que, aunque se han descrito aquí
realizaciones específicas del invento con fines de ilustración, se
pueden hacer diversas modificaciones sin apartarse del espíritu ni
el alcance del invento. En consecuencia, el invento no está limitado
salvo por las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos del invento que reproducen la
estructura secundaria de regiones de giro inverso de péptidos y
proteínas biológicamente activos pueden inhibir la expresión de
survivina, la transcripción de TCF/\beta-catenina
y la expresión de la señalización de Wnt. Por lo tanto, el presente
invento puede proporcionar una composición farmacéutica y/o un uso
en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un
sujeto mamífero, para tratar el cáncer en combinación con otros
agentes antineoplásicos, para uso en el tratamiento o la prevención
de enfermedades tales como la reestenosis asociada con angioplastia,
la enfermedad del riñón poliquístico, la enfermedad de la
angiogénesis aberrante, la enfermedad de la artritis reumatoide y la
colitis ulcerosa.
Claims (13)
1. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula
general (VI):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{a} es un grupo arilo
bicíclico que tiene de 8 a 11 miembros anulares, que puede tener de
1 a 3 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre,
y R_{b} es un grupo arilo monocíclico que tiene de 5 a 7 miembros
anulares, que puede tener de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre
nitrógeno, oxígeno y azufre, y el anillo arílico del compuesto puede
tener uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste
en los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo
C_{1-12} y alcoxilo
C_{1-12}.
2. El compuesto de la Reivindicación 1, en que
R_{a} es un grupo naftilo, quinoleinilo o isoquinoleinilo, y
R_{b} es fenilo, piridilo o piperidilo, todos los cuales pueden
estar sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del
grupo que consiste en los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo
C_{1-12} y alcoxilo
C_{1-12}.
3. El compuesto de la Reivindicación 1, en que
R_{a} es naftilo y R_{b} es fenilo, que pueden estar sustituidos
con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en
los grupos haluro, hidroxilo, ciano, alquilo
C_{1-12} y alcoxilo
C_{1-12}.
4. Un compuesto seleccionado entre:
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5. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo con
la Reivindicación 5, para uso en un método para inhibir el
crecimiento de una célula tumoral en un sujeto mamífero, método que
comprende administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o
la composición a una célula tumoral.
7. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación
6, en que la célula tumoral es una célula colorrectal.
8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo con
la Reivindicación 5, para uso en un método para tratar el cáncer,
método que comprende administrar a un sujeto una cantidad segura y
eficaz del compuesto o la composición en combinación con otro agente
antineoplásico seleccionado entre 5-FU, taxol,
cisplatina, mitomicina C, tegafur, raltitrexed, capecitabina e
irinotecán.
9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo con
la Reivindicación 5, para uso en un método para tratar o prevenir la
reestenosis asociada con una angioplastia, método que comprende
administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o la
composición a un sujeto que lo necesita.
10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo
con la Reivindicación 8, para uso en un método para tratar o
prevenir la enfermedad del riñón poliquístico, método que comprende
administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o la
composición a un sujeto que lo necesita.
11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo
con la Reivindicación 5, para uso en un método para tratar o
prevenir la enfermedad de la angiogénesis aberrante, método que
comprende administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o
la composición a un sujeto que lo necesita.
12. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo
con la Reivindicación 5, para uso en un método para tratar o
prevenir la enfermedad de la artritis reumatoide, método que
comprende administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o
la composición a un sujeto que lo necesita.
13. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica de acuerdo
con la Reivindicación 5, para uso en un método para tratar o
prevenir la enfermedad de la colitis ulcerosa, método que comprende
administrar una cantidad segura y eficaz del compuesto o la
composición a un sujeto que lo necesita.
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