ES2309300T3 - Derivado de expermidina para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas cronicas. - Google Patents
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Abstract
El uso de un compuesto que tiene la fórmula general (I) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad neurodegenerativa crónica: (Ver fórmula)
Description
Derivado de expermidina para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas crónicas.
La presente invención se refiere al tratamiento
de afecciones o enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de
Huntington y esclerosis múltiple, usando compuestos
neuroprotectores. La invención también se refiere a la protección o
tratamiento de daño o enfermedades resultantes de la producción de
superóxido o la producción de peroxinitrito.
En tejidos afectados por estados bajos de
oxígeno tales como isquemia e hipoxia prolongada, que pueden estar
asociados o no con hipoglucemia, se encuentra daño neuronal en
grados variables. La isquemia se produce normalmente como resultado
de un acontecimiento agudo, por ejemplo infarto de miocardio,
accidente cerebrovascular o lesión craneal por traumatismo. Durante
el infarto de miocardio, el daño sufrido se limita sustancialmente a
los tejidos cardiacos y se han desarrollado ciertos tratamientos. En
el accidente cerebrovascular o la lesión craneal por traumatismo, el
daño neuronal resulta de los efectos de la isquemia de más larga
duración en el cerebro. La intensidad de la isquemia depende de la
naturaleza del accidente cerebrovascular o lesión, pero,
invariablemente, hay daño cerebral. El documento WO99/31049 se
refiere a los efectos de la isquemia sobre el cerebro tales como
los que se producen en pacientes con accidente cerebrovascular o
como un resultado de lesión craneal, y da a conocer ciertos agentes
neuroprotectores y su uso en el tratamiento de daño neuronal
provocado por acontecimientos isquémicos agudos tales como accidente
cerebrovascular y lesión craneal.
Al contrario que el daño neuronal que se produce
como resultado de acontecimientos isquémicos agudos, tales como
infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o lesión craneal, la
presente invención se refiere a los efectos de afecciones o
enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como enfermedad de
Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), corea de Huntington
(HC), esclerosis múltiple (MS) y esclerosis lateral amiotrófica
(ALS).
Las causas subyacentes de estas enfermedades
neurodegenerativas son complejas y parecen ser multifactoriales. En
cada caso, la muerte de células neuronales apoptótica o necrótica
puede resultar de uno o más mecanismos incluyendo compromiso
metabólico, excitotoxicidad y estrés oxidativo. Varios estudios
apuntan hacia el estrés oxidativo como el principal factor causante
de una variedad de enfermedades neurodegenerativas crónicas
incluyendo AD, PD y ALS (por ejemplo, véase: Sayre et al.,
(2001), Curr. Med. Chem, 8(7), 721-38; Bains
et al., (1997), Brain Res. Rev., 25, 335-358;
Alexi et al. (2000), Progress in Neurobiol., 60,
409-470).
El estrés oxidativo se produce cuando el
equilibrio normal entre acontecimientos oxidativos y mecanismos de
defensa antioxidativos está afectado, por la pérdida de agentes
reductores y/o antioxidantes o bien por el aumento en los niveles de
especies oxidantes. El estrés oxidativo se ha atribuido a las
acciones de radicales libres sumamente tóxicos, incluyendo especies
reactivas de óxido (ROS) tales como el anión superóxido
(*O_{2}^{-}) y el radical hidroxilo (*OH), y especies reactivas
de nitrógeno (RNS) derivadas de la reacción de óxido nítrico (NO)
con superóxido o peróxido, tal como peroxinitrito (*ONOO^{-}).
La muerte celular excitotóxica está provocada
por la activación excesiva de receptores glutamato por glutamato y
agonistas glutamatérgicos tales como NMDA y otros aminoácidos
excitadores (EAA). Varios estudios sugieren también que el estrés
oxidativo puede actuar como un mediador en la muerte de células
neuronales inducida excitotoxicamente. Por ejemplo, se ha mostrado
para ambos NMDA y kainato (un agonista de receptor distinto de NMDA)
que la activación de receptores de EAA aumenta el daño por radicales
libres a lípidos, y que este daño puede prevenirse mediante
tratamiento simultáneo con antioxidantes.
El compromiso metabólico puede estar provocado
por accidente cerebrovascular, asfixia, hipoglucemia y ciertos
venenos que interfieren con la respiración mitocondrial. La
disfunción mitocondrial y la resultante depleción de ATP y la
pérdida de capacidad de tamponamiento de calcio intracelular puede
provocar un aumento en la producción de radicales libres reactivos
con oxígeno y nitrógeno, llevando a estrés oxidativo.
Por tanto, no sólo se entiende el estrés
oxidativo por radicales libres como el factor primario de muerte de
células neuronales en varias enfermedades neurodegenerativas
crónicas, sino que también puede mediar estímulos excitotóxicos y
compromiso metabólico. Además, también puede producirse la
interacción inversa, ya que el estrés oxidativo mediante radicales
libres puede iniciar rutas excitotóxicas y provocar disfunción
metabólica.
Los inventores han descubierto ahora que el
compuesto
L-arginil-3,4-espermidina,
dado a conocer anteriormente en el documento WO99/31049 para el
tratamiento de daño neuronal provocado por acontecimientos
isquémicos agudos tales como accidente cerebrovascular y lesión
craneal, puede usarse para tratar afecciones o enfermedades
neurodegenerativas crónicas en las que el daño está provocado o
mediado por radicales libres y por excitotoxicidad, tales como
enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), corea de
Huntington (HC), esclerosis múltiple (MS) y esclerosis lateral
amiotrófica (ALS).
Más específicamente, los inventores han
descubierto sorprendentemente que el compuesto
L-arginil-3,4-espermidina,
dado a conocer anteriormente en el documento WO99/31049, es
neuroprotector frente a la muerte de células neuronales inducida por
radicales libres en un modelo in vitro de lesión inducida por
radicales libres, y es neuroprotector frente a la muerte celular
mediada por EAA en un modelo in vitro de lesión
excitotóxica.
Además, los inventores han mostrado que
L-arginil-3,4-espermidina
es neuroprotectora frente a muerte celular en un modelo in
vitro de lesión isquémica. Este modelo in vitro de lesión
isquémica (privación de oxígeno y glucosa) es incluso más intenso
que los modelos de hipoxia (privación de oxígeno) in vitro y
de isquemia in vivo usados en el documento WO99/31049.
Sorprendentemente, los inventores han descubierto que
L-arginil-3,4-espermidina
es neuroprotectora frente al ataque mucho más grave de lesión
isquémica in vitro no solamente cuando se administra
inmediatamente después de la lesión, sino incluso cuando la
administración se retrasa hasta 60 minutos después de lesión.
En estudios anteriores, tal como se da a conocer
en el documento WO99/31049, los inventores han descubierto que la
administración de
L-arginil-3,4-espermidina
no afecta a la tensión arterial, a la frecuencia cardiaca ni a la
respiración, ni da como resultado función motora adversa.
Los documentos WO93/12777 y WO91/00853 dan a
conocer que compuestos de poliamina, incluyendo un compuesto (R) que
se refiere a arginil-3,4-espermidina
racémica, son útiles como reguladores del canal de ión calcio y por
tanto podrían tener posibles usos como fármacos prototípicos.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona el uso de un compuesto que tiene la
fórmula general (I) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo,
para la fabricación de un medicamento para tratar una afección o
enfermedad neurodegenerativa crónica:
La invención también proporciona el uso de un
compuesto que tiene la fórmula general (I) y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo para la fabricación de un medicamento para
tratar o proteger de daño o de enfermedades resultantes de la
producción de superóxido.
La invención también proporciona el uso de un
compuesto que tiene la fórmula general (I) y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo para la fabricación de un medicamento para
tratar o proteger de daño o de enfermedades resultantes de la
producción de peroxinitrito.
Las afecciones o enfermedades neurodegenerativas
crónicas que pueden tratarse según la invención son aquellas en las
que la degeneración o la muerte de células neuronales está mediada
por radicales libres, en particular por ROS incluyendo el anión
superóxido (*O_{2}^{-}), tanto provocada por estrés oxidativo,
estímulo excitotóxico o disfunción metabólica, como por cualquier
combinación de estos factores. Por tanto, las afecciones o
enfermedades neurodegenerativas crónicas tratables según la
invención incluyen AD, PD, HC, MS y ALS, en particular AD, PD y
HC.
Sin pretender quedar ligado a un mecanismo o
teoría en particular, se cree que el compuesto usado según la
invención funciona como un eliminador biológico, inactivando,
consumiendo, extinguiendo, neutralizando o reduciendo radicales
libres y ROS.
El compuesto usado según la presente invención
se prepara preferiblemente forma sustancialmente pura. Por
sustancialmente puro se quiere decir un compuesto que, en
condiciones de HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución)
no se muestra que tenga ningún, o ninguna cantidad significativa de,
contaminantes detectables por el mismo. Los niveles traza de
contaminantes pueden ser aceptables en ciertas circunstancias y
tales circunstancias puede determinarse por el experto en ese
momento. En general, los niveles de contaminante deben ser
inferiores al 1%, y de manera preferible sustancialmente inferiores
al 1%, por ejemplo inferiores al 0,1%, posiblemente de tan sólo el
0,001%. En la alternativa, se prefiere que el compuesto no sea
tóxico, lo que significa que el compuesto no debe mostrar ningún
nivel inaceptable de toxicidad en las dosificaciones en las que se
aplica. Preferiblemente, no debe mostrar ninguna toxicidad en
absoluto.
Independientemente de lo anterior, el compuesto
definido anteriormente es útil para tratar afecciones o enfermedades
neurodegenerativas crónicas, basándose en las pruebas en el
hipocampo, tal como se describe a continuación.
El compuesto neuroprotector descrito en el
presente documento puede administrarse a pacientes como un
profiláctico con el fin de prevenir la aparición de una enfermedad
neurodegenerativa crónica. Además o como alternativa, el compuesto
puede aplicarse tras la aparición de una enfermedad
neurodegenerativa crónica, pero se apreciará que es preferible
administrar el compuesto lo antes posible, con el fin de evitar
tanta degeneración neuronal como sea posible. En la mayoría de las
circunstancias será deseable administrar dosis repetidas al menos
mientras que el paciente continúe mostrando síntomas de la
enfermedad.
Los procedimientos adecuados de administración
son generalmente mediante inyección, con el fin de lograr el
resultado deseado lo antes posible, pero no se limitan a esta vía.
Por tanto, se prefiere particularmente la inyección intravenosa pero
en algunas circunstancias puede ser preferible administrar el
compuesto directamente en el líquido cefalorraquídeo.
La dosis del compuesto de la presente invención
variará dependiendo de muchos factores, incluyendo la edad, el peso
corporal y el estado general del paciente, así como el modo,
frecuencia y vía de administración. Sin embargo, generalmente se
recomienda una dosis desde 0,01 mg/kg de peso corporal hasta 50
mg/kg de peso corporal, prefiriéndose más una dosis desde 0,05 mg/kg
de peso corporal hasta 20 mg/kg de peso corporal. Esto puede
administrarse en una dosis única o en dosis divididas, más
preferiblemente en un ciclo de dosis periódicas, por ejemplo
diarias, semanales o mensuales.
Preferiblemente, el compuesto se usa o se
administra en una cantidad eficaz para proporcionar una
concentración en el intervalo de 0,3 microM a 300 microM, más
preferiblemente en el intervalo de 3 microM a 300 microM.
L-arginil-3,4-espermidina
("L-Arg3,4"):
El compuesto de la presente invención puede
prepararse mediante una variedad de procedimientos que, en sí
mismos, se conocen bien en la técnica, por ejemplo tal como se da a
conocer en el documento WO99/31049.
La preparación de un compuesto de la invención a
modo de ejemplo, así como la actividad neuroprotectora, se ilustran
en los ejemplos no limitativos adjuntos:
Fármacos: kainato, NMDA, glutamato, AMPA
y
6,7-dinitroquinoxalin-2,3(1H,4H)-diona
(DNQX) se adquirieron de Sigma (RU). DNQX se almacenó a temperatura
ambiente en DMSO a 40 mM. Todos los demás fármacos se prepararon
como disoluciones acuosas.
Productos químicos y reactivos: yoduro de
propidio (PI) se adquirió de Molecular Probes (Eugene, O).
Dimetilsulfóxido (DMSO), glucosa y glutamina se adquirieron de
Sigma. Los insertos de cultivo Millicell CM se adquirieron de
Millipore (RU). La resina de poliestireno
1N-Dde-8N-Mmt-espermidin-4-il)-carbonil-Wang
se adquirió de Novabiochem (Suiza), y el
Fmoc-Arg(Boc)_{2}-OH
de Bayer (RU). Todos los demás productos químicos y reactivos se
obtuvieron a partir de fuentes comerciales excepto la
L-arginil-3,4-espermidina
("L-Arg3,4") que se sintetizó tal como se
indica a continuación.
Se sintetizó sal de ácido trifluoroacético de
L-Arg3,4 tal como sigue:
Se hinchó resina de poliestireno
(1N-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil-8N-monometoxitritil-espermidina-4-il)-carbonil-Wang
(0,279 g, carga de 0,42 mmoles g^{-1}, 0,12 mmoles) en N,
N-dimetilformamida (DMF). Luego se drenó el
disolvente y se añadió hidrazina al 2% en DMF (4 ml). Se centrifugó
la mezcla resultante durante 5 min. Se drenó la disolución y se
repitió la hidrazinólisis dos veces más. Entonces se lavó la resina
con DMF (x 3), DCM (x 3) y dietil éter (x 3). Una prueba de
ninhidrina cualitativa fue positiva.
Entonces de hinchó la resina en DMF y se drenó
el disolvente. Se agitaron una disolución de
9-fluorenilmetoxicarbonil-arginin-(terc-butiloxicarbonil)_{2}-OH
(0,142 g, 0,24 mmoles, 0,24 M) e hidrato de
N-hidroxibenzotriazol (0,037 g, 0,24 mmoles, 0,24 M)
en diclorometano (DCM) (0,6 ml) y DMF (0,4 ml) a temperatura
ambiente durante 10 min., se añadió diisopropilcarbodiimida (38
\mul, 0,24 mmoles) y se agitó la disolución resultante durante 10
min. adicionales. Entonces se añadió la mezcla de reacción a la
resina húmeda y se centrifugó durante 2,5 h. Se drenó la disolución
y se lavó la resina con DMF (x 3), DCM (x 3) y dietil éter (x 3).
Una prueba de ninhidrina cualitativa fue negativa.
Se hinchó la resina en DMF y se drenó el
disolvente. Se añadió una disolución de piperidina al 20% en DMF (4
ml) y se centrifugó la mezcla de reacción durante 10 min. Se drenó
la disolución y se repitió el tratamiento con piperidina. Se lavó la
resina con DMF (x 3), DCM (x 3) y dietil éter (x 3). Una prueba de
ninhidrina cualitativa fue positiva.
A la resina seca se le añadió una disolución del
97,5% de ácido trifluoroacético (TFA) y el 2,5% de
triisopropilsilano (4 ml), y se dejó reposar la mezcla de reacción
durante 3 h. Luego se drenó el disolvente y se lavó la resina con
TFA (2 x 1 ml). Se evaporaron a vacío las fases ácidas combinadas.
Se disolvió el residuo en TFA (0,4 ml) y se precipitó en dietil éter
enfriado con hielo. Se centrifugó la mezcla y se eliminó el
disolvente mediante decantación. Se lavó el sedimento con dietil
éter, se centrifugó la mezcla y se decantó de nuevo el disolvente.
Entonces se secó el residuo a vacío durante la noche. Se disolvió el
residuo en TFA (0,4 ml) y se repitió la precipitación en dietil
éter. Entonces se disolvió la muestra en agua y acetonitrilo y se
liofilizó. Esto se repitió una vez más dando
L-Arg3,4 como un sólido
naranja-marrón pegajoso (0,061 g, 20%
L-Arg3,4 en masa). Se cuantificó el compuesto
mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear de 1H con
fenol como un patrón interno.
Se realizaron los experimentos usando
L-Arg3,4 tal como se sintetizó según el ejemplo
1:
Se prepararon cultivos de cortes de hipocampo
organotípicos según procedimientos establecidos (Pringle et
al. (1997), Brain Res., 755, 36-46). En resumen,
se decapitaron crías de rata Wistar (8-11 días de
edad) y se disecaron rápidamente los hipocampos en solución salina
equilibrada de Gey enfriada con hielo (Gibco Life Technologies,
Paisley, RU) complementada con 4,5 mg ml^{-1} de glucosa. Se
separaron los cortes y se sembraron en placas en insertos de cultivo
Millicell CM (4 por pocillo) y se mantuvieron a 37ºC y CO_{2} al
5% durante 14 días. El medio de mantenimiento estaba constituido por
el 25% de suero de caballo inactivado por calor, el 25% de solución
salina equilibrada de Hank (HBSS) y el 50% de medio mínimo esencial
con sales de Earle añadidas (MEM, ICN Biomedicals, Basingstoke, RU)
complementado con glutamina 1 mM y 4,5 mg ml^{-1} de glucosa. Se
cambió el medio cada 3-4 días.
Se realizó la isquemia experimental o privación
de oxígeno y glucosa tal como se describió anteriormente (Pringle
et al. (1996), Stroke, 27,2124-2130). En
resumen, se transfirieron los cultivos a medios libres de suero
(SFM, 75% de MEM, 25% de HBSS complementado con glutamina 1 mM y 4,5
mg ml^{-1} de glucosa) que contenía 5 \mug ml^{-1} del
colorante de exclusión fluorescente yoduro de propidio (PI). Se
dejaron equilibrar los cultivos en SFM durante 30 min. antes de la
formación de imágenes, con o sin L-Arg3,4. Se
detectó la fluorescencia de PI usando un microscopio invertido
Leica, tal como se describe a continuación. Cualquier cultivo en el
que se detectó la fluorescencia de PI en esta fase se excluyó del
estudio adicional. Se indujo la isquemia transfiriendo los cultivos
a medios libres de glucosa (MEM con sales de Earl sin glucosa y
complementado con glutamina 1 mM) saturados con el 95% de N_{2} y
el 5% de CO_{2}. Entonces se sellaron las placas de cultivo (sin
tapas) dentro de una cámara hermetizada
(Billups-Rothenberg, Del Mar, CA) gasificada con el
95% de N_{2} y el 5% de CO_{2} a 10 l min.^{-1} durante 10
min. antes sellarse y se puso a 37ºC durante 50 min. Al final de la
isquemia, se devolvieron los cultivos a SFM + PI normóxicos, con o
sin compuesto en las concentraciones indicadas, y se colocó de nuevo
en la incubadora durante 24 h.
Se realizó la lesión excitotóxica tal como se
describió anteriormente (Pringle et al. (1997), Brain Res.,
755, 36-46) con LArg3,4 presente antes, durante y
después de la lesión en cultivos tratados. Se transfirieron los
cultivos a SFM + PI con o sin L-Arg3,4 300 \muM y
se dejaron equilibrar durante 30 min. antes de la formación de
imágenes. Se excluyó cualquier cultivo que mostró fluorescencia de
PI. Entonces se cambió el medio por SFM + PI más un agonista de
receptor de glutamato (glutamato 10 mM, NMDA 10 \muM, AMPA 10
\muM, o bien kainato 10 \muM) durante 3 h. Tras la exposición,
se cambiaron de nuevo los medios por SFM + PI que contenían
L-Arg3,4 300 \muM. Entonces se colocaron de nuevo
los cultivos en la incubadora hasta que se evaluaron para determinar
la muerte celular en la región indicada de la capa celular piramidal
24 h tras la exposición.
Se realizó la lesión mediada por radicales
libres tal como se describió anteriormente con
L-Arg3,4 presente antes, durante y después de la
lesión en cultivos tratados (Wilde et al., (1997, J.
Neurochem., 69, 883-886). En resumen, se
transfirieron los cultivos a SFM + PI con o sin
L-Arg3,4 300 \muM y se dejaron equilibrar durante
30 min. antes de la formación de imágenes. Cualquier cultivo en el
que se detectó la fluorescencia de PI en esta fase se excluyó del
estudio adicional. Se disolvió duroquinona (DQ) en DMSO a una
concentración de disolución madre de 100 mM que entonces se diluyó
1:1000 en SFM para una concentración de trabajo final de 100 \muM
(concentración de DMSO final del 0,1%). Se inició la lesión por
radicales libres transfiriendo los cultivos a SFM complementado con
duroquinona 100 \muM durante 3 h. Al final de la exposición, se
colocaron de nuevo los cultivos en SFM + PI, con o sin compuesto, y
se colocaron en la incubadora durante 24 h.
Se evaluó el daño neuronal tal como se describió
anteriormente (Pringle et al. (1996), Stroke, 27,
2124-2130; Pringle et al. (1997), Brain Res.,
755, 36-46). Se capturaron imágenes de transmisión
de luz antes de la inducción de la lesión y se registraron imágenes
de fluorescencia de PI al final del periodo de recuperación tras la
lesión de 24 h. Se capturaron todas las imágenes en un microscopio
de epifluorescencia invertido DM-IRBE Leica (Milton
Keynes, RU) equipado con una lámpara de Hg de 100 W y óptica de
rodamina convencional (excitación 510-560 nm; espejo
dicroico 620 nm; emisión > 590 nm). Se adquirieron las imágenes
con una lente 5X NA 0,12 y una camera digital Hamamatsu enfriada y
se digitalizaron a una resolución de 12 bit para su análisis en
OpenLab 2.1 (Improvision, Coventry, RU) ejecutado en un Macintosh
G4/400. Se determinó el área de la capa celular CA1 o CA3 a partir
de la imagen de transmisión y se midió el área de fluorescencia de
PI en esas capas celulares usando la función de corte de densidad en
OpenLab. Se expresó el daño neuronal como un porcentaje del área en
la que se detectó la fluorescencia de PI por encima del umbral
dentro de una capa celular dividida por el área total de esa capa
celular. Se calculó la protección como la diferencia entre el daño
para un pocillo dado y el daño promedio en controles no tratados
dividido entre el daño promedio en controles no tratados. Se
compararon los grupos frente a grupos control correspondientes
usando la prueba de la t de Student bilateral con la significación
indicada como * para P < 0,05, y ** para P < 0,01. Se
presentan los datos como media \pm e. e. de la media.
Todos los procedimientos con animales para
producir cortes de hipocampo agudos se aprobaron por el Home Office.
Se anestesiaron profundamente ratas Sprague-Dawley
macho de 250 g con halotano y se decapitaron. Se extirpó rápidamente
el cerebro, y se retiraron mediante disección los hipocampos y
entonces se cortaron en cortes transversales de 300 \mum de
espesor en un Vibratome (Leica, Milton Keynes, RU) en disolución de
corte fría (en mM: sacarosa 189, KCI 2,5, NaHCO_{3} 26,
NaH_{2}PO_{4} 1,2, glucosa 10, MgCl_{2} 5, CaCl_{2} 0,1)
equilibrada con el 5% de CO_{2} y el 95% de O_{2}. Se
transfirieron los cortes a aCSF (en mM: glucosa 10, NaCl 125, KCI 5,
NaHCO_{3} 26, MgCl_{2} 1, NaH_{2}PO_{4} 1,25, CaCl_{2} 2,
sacarosa 10) a temperatura ambiente, se burbujearon con el 5% de
CO_{2} y el 95% de O_{2}, durante al menos 1 h antes de su
uso.
Entonces se transfirieron los cortes a una
cámara de perfusión sumergida (volumen de 2 ml) para los registros
electrofisiológicos y se perfundieron a 10 ml min.^{-1} a 25ºC con
aCSF equilibrado con el 5% de CO_{2} y el 95% de O_{2}, y se
dejaron equilibrar durante 1 h antes de se iniciar las
manipulaciones. Se aplicaron los compuestos experimentales mediante
perfusión en baño. Se aplicó L-Arg3,4 a 300 \muM y
se aplicó DNQX a concentración final de 10 \muM. Se diluyó DNQX a
partir de una disolución madre de 40 mM en DMSO (DMSO final del
0,025%). Se estimularon las colaterales de Schaffer de CA3 a
voltajes desde 0 V hasta 30 V con un estimulador de voltaje
constante (Digitimer, Hertfordshire, RU) mediante un electrodo de
estimulación de par trenzado de cables de acero inoxidable
recubierto con poliimida (Plastics One, Roanoke, VA). Se registraron
respuestas potenciales de campo con un amplificador Axopatch 200B
(Axon Instruments, Foster City, CA) en el modo de abrazadera de
corriente rápida mediante un electrodo de vidrio cargado con KCl 2 M
(2-5 M\Omega) en la capa celular piramidal CA1. Se
filtraron las respuestas a 2 kHz, se digitalizaron a 20 kHz con un
Digidata 1320A (Axon Instruments), y se almacenaron en un disco duro
con el programa Clampex 8.1 (Axon Instruments) ejecutado en un PC
Pentium III de Dell. Se analizaron los datos en Clampfit 8.1 (Axon
Instruments).
Se generaron las curvas de
estímulo-respuesta (E/R) a partir de los estímulos
desde 0 V hasta 30 V en incrementos de 2 V. Se aplicó la perfusión
en baño de L-Arg3,4 300 \muM en aCSF durante 10
min. con un estímulo submáximo aplicado cada minuto para monitorizar
la transmisión sináptica. Se generó una segunda curva de E/R antes
de cambiar la perfusión de nuevo a aCSF simple. Se aplicó un
estímulo submáximo cada minuto durante el periodo de lavado de 15
min. tras lo cual se generó una tercera curva de E/R. Entonces se
inició una perfusión de DNQX 10 \muM hasta que se eliminó
completamente la respuesta al estímulo submáximo lo que siempre se
producía en el plazo de 10 min. El aumento del estímulo hasta el
máximo (30 V) no generó una respuesta, y por tanto, no se generaron
curvas de E/R en presencia de DNQX. En Clampfit, se ajustaron las
curvas de E/R a una función sigmoidea de la forma:
en la que R es la magnitud de la
respuesta provocada, R_{max} es la respuesta máxima, V_{50} es
el voltaje que produces una respuesta semimáxima, S es el voltaje de
estímulo, y m es proporcional a la pendiente de la región lineal del
sigmoideo. Se compararon los datos mediante ANOVA
unilateral.
Se ha utilizado hidroetidina (HEt) para
controlar de modo fluorescente la producción de superóxido en
cultivos neuronales primarios [Bindokas et al., (1996),
Carriedo et al. (1998)]. Se preparó una disolución madre de
HEt en DMSO burbujeado con N_{2} (10 mg ml^{-1}) que entonces se
dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC. Se usaron la alícuotas
solamente una vez antes de desecharse. Se emplearon dos paradigmas
experimentales separados para someter a prueba el efecto de
L-Arg3,4 sobre la producción de superóxido en
respuesta a la estimulación con NMDA o bien con AMPA.
Para los experimentos con AMPA, se cargaron
cultivos de cortes organotípicos con 1 \mug ml^{-1} de HEt en
solución salina tamponada con HEPES (HSS) (en mM): glucosa 10, NaCl
144, KCl 5, HEPES 10, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 2, pH 7,4, durante 30
minutos en la oscuridad. Todas las disoluciones posteriores
contenían HEt para prevenir una disminución de la señal debido a
depleción de indicador. Se adquirieron las imágenes una vez por
minuto durante la duración del experimento en el mismo sistema tal
como se describió anteriormente para la evaluación de la muerte
celular. Se produjo un registro de 10 minutos de la producción de
referencia de superóxido antes de se cambiar la disolución de baño
por HBSS + HEt que contenía AMPA 10 \muM, de nuevo durante 10
minutos. Tal como se mostró anteriormente, la estimulación de
receptores de glutamato con AMPA lleva a un aumento en la producción
de superóxido [Bindokas et al., (1996), Carriedo et
al. (1998)]. Entonces se cambió la disolución de baño por HBSS +
HEt que contenía ambos AMPA 10 \muM y L-Arg3,4 300
\muM durante 10 minutos para someter a prueba el efecto de
L-Arg3,4 sobre la producción de superóxido. En
experimentos control separados, se incubó L-Arg3,4
300 \muM en HSS con cortes para determinar si afectaba a la
producción de referencia de superóxido por sí misma.
Entonces se analizaron las imágenes adquiridas a
partir de los experimentos con AMPA con el paquete de análisis de
imagen OpenLab. Se trazó una región de interés alrededor de la capa
celular piramidal CA1 porque era la capa celular que produjo el
mayor aumento en fluorescencia en respuesta a activación con AMPA.
En cada imagen, dentro de la región de interés, e se calculó el
valor de píxel promedio en unidades arbitrarias (UA) para producir
un registro de valores de intensidad de fluorescencia a lo largo del
tiempo. Entonces se realizó una regresión lineal en los datos para
calcular la tasa de producción de superóxido como cambio de
intensidad a lo largo del tiempo (unidades arbitrarias por minuto,
UA min.^{-1}) para cada uno de los tratamientos. Se presenta los
datos como media \pm d.e. Entonces se compararon las tasas de
producción de superóxido mediante ANOVA seguido por comparaciones
múltiples a posteriori con correcciones de Bonferroni con
significación indicada como * para P<0,05 y * * para
P<0,01.
Se representan los resultados en las figuras 2 a
7.
Una hora de isquemia generó una
neurodegeneración reproducible en la capa celular piramidal en
cultivos de corte de hipocampo de aproximadamente el 38 \pm 2% tal
como se determina mediante tinción con PI. La muerte celular en
cultivos control no tratados de experimentos de isquemia
individuales no fueron estadísticamente diferentes (P = 0,70), y,
por tanto, los controles isquémicos se combinaron en un único grupo
(figura 2: "Control") (n =113). La incubación de cultivos en
L-Arg3,4 300 \muM antes, durante y después de la
isquemia dio como resultado una reducción significativa de la
neurodegeneración (figura 2: "PDP") hasta el 23 \pm 4% (39%
protección, P < 0,01, n = 34).
Para determinar el intervalo de tiempo efectivo
tras la lesión, se retrasó la administración de
L-Arg3,4 hasta después de la finalización de la
isquemia y se aplicó a 0 min., 10 min., 30 min. y 60 min. después de
la lesión. La aplicación retrasada de L-Arg3,4 300
\muM disminuyó significativamente la muerte celular en comparación
con los controles 0 min., 10 min. y 60 min. después de la lesión
(figura 2) reduciendo el daño hasta el 23 \pm 3% (40% de
protección, P < 0,01, n = 36), 15 \pm 2% (59% de protección, P
< 0,01, n = 24), y 26 \pm 3% (30% de protección, P < 0,05, n
= 31), respectivamente. A pesar de que el daño se redujo hasta el 28
\pm 4% a 30 min. después de la lesión, el 26% de protección no
alcanzó significación estadística (P < 0,08, n = 25).
Se sometió a prueba la dosis eficaz después de
la lesión para determinar la neuroprotección frente a la isquemia
con concentraciones de L-Arg3,4 oscilando entre 300
nM y 300 \muM. Se eligió inicialmente una dosis de 300 \muM para
todos los estudios basándose en los datos anteriores en un modelo de
lesión hipóxica que indicaban que 300 \muM era una dosis óptima.
Los controles no tratados de experimentos separados no fueron
significativamente diferentes (P = 0,9) con un daño agregado del 34
\pm 9% y se combinaron en un único grupo (figura 3:
"Control") (n = 47). A 300 nM, L-Arg3,4 no
redujo el daño, sin embargo, a 3 \muM, 30 \muM y 300 \muM, el
compuesto redujo el daño hasta el 19 \pm 5% (43% de protección, P
< 0,06, n = 14), 11 \pm 3% (67% de protección, P < 0,05, n =
8), y 23 \pm 3% (32% de protección, P < 0,05, n = 36),
respectivamente en comparación con el grupo no tratado (figura
3).
La administración de L-Arg3,4
300 \muM redujo significativamente la muerte celular en la capa
celular CA1 generada mediante Glut 10 mM (figura 4) desde el 21
\pm 3% de daño en controles (n = 23) hasta el 13 \pm 3% en
cultivos tratados (41% de protección, P < 0,05, n = 23)
sugiriendo que podría ser un antagonista de receptor de glutamato.
Para determinar si sus acciones fueron específicas de subtipo de
receptor de glutamato, se sometió a prueba L-Arg3,4
frente a NMDA 10 \muM, AMPA 10 \muM y kainato 10 \muM en
experimentos separados que produjeron muerte celular regionalmente
específica. La administración de L-Arg3,4 300 \muM
redujo significativamente la muerte celular en CA1 generada
mediante NMDA 10 \muM (figura 4) desde el 25 \pm 3% de daño en
controles (n = 42) hasta el 16 \pm 2% en cultivos tratados (38% de
protección, P < 0,05, n = 43) o 10 \muM AMPA (figura 4) desde
el 41 \pm 5% de daño en controles (n = 21) hasta el 19 \pm 4% en
cultivos tratados (53% de protección, P < 0,01, n = 22). Además,
L-Arg3,4 300 \muM redujo significativamente la
muerte celular en CA3 debida a kainato 10 \muM (figura 4:
"KA") desde el 27 \pm 6% de daño en controles ( n = 21) hasta
el 11 \pm 4% en cultivos tratados (61% de protección, P < 0,05,
n = 24).
La aplicación de baño de
L-Arg3,4 300 \muM no afectó a simple vista a las
respuestas provocadas de los cortes de hipocampo agudo. Las
respuestas provocadas individuales de un único corte antes, durante
y después de la aplicación de L-Arg3,4 mostró que el
compuesto no tenía ningún efecto sobre las respuestas provocadas
(figura 5A). Esta falta de efecto estaba en contrate con el efecto
de DNQX 10 \muM que bloqueó completamente la respuesta provocada
(figura 5B). El pico de populación de un único corte a un estímulo
submáximo no se vio afectado por la infusión de
L-Arg3,4 ni por su lavado. Sin embargo, en el mismo
corte, DNQX 10 \muM eliminó toda la transmisión en el plazo de 5
minutos (figura 5B). Las curvas de E/R para un corte antes, durante
y después de L-Arg3,4 no se vieron afectadas por la
aplicación de baño de L-Arg3,4 300 \muM (figura
5C). Todas las curvas de E/R se ajustaron a una función sigmoidea de
modo que se pudieron hacer comparaciones entre curvas de E/R
agregadas (tabla 1). Ninguno de los parámetros se vio
significativamente afectado por la infusión de
L-Arg3,4 tal como se determinó por un ANOVA
unilateral para cada parámetro.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración de L-Arg3,4
300 \muM redujo significativamente la muerte celular en la capa
celular piramidal CA1 provocada por una incubación durante 3 h en
duroquinona 100 \muM (figura 6), indicando que se extinguen los
radicales libres. Se redujo la lesión desde el 40 \pm 5% en
controles no tratados (n = 21) hasta el 21 \pm 5% en cultivos
tratados (protección del 46%, P < 0,05, n = 21).
Además de bloquear el daño mediado por radicales
libres, también se demostró que L-Arg3,4 reduce
significativamente la producción de radicales superóxido mediante
AMPA implicando que el compuesto tiene un efecto directo sobre la
producción de radicales libres.
Se midió fluorescentemente de manera fiable con
HEt la producción de superóxido tal como se describe en Bindokas
et al. (1996) y Carriedo et al. (1998). En los
experimentos de estimulación con AMPA, se midió que la producción de
referencia de superóxido era de 2,06 \pm 1,60 UA min.^{-1} (n =
16) y no se vio afectada por L-Arg3,4 300 \muM,
2,55 \pm 2,02 UA min.^{-1} ( P>0,6, datos no mostrados). La
estimulación de receptores de glutamato mediante AMPA 10 \muM
aumentó significativamente la tasa de producción de superóxido
aproximadamente 5 veces hasta 10,65 \pm 3,70 UA min.^{-1} (n =
18, P<0,001, figura 7). La adición posterior de
L-Arg3,4 300 \muM, en presencia continua de AMPA
10 \muM redujo significativamente la tasa de producción de
superóxido en aproximadamente la mitad hasta 5,07 \pm 1,94 UA
min.^{-1} en comparación con la tasa con AMPA solo (n = 4,
P<0,01), a pesar de que esta tasa aún era significativamente
elevada a partir de la referencia (P<0,01).
Los modelos de cultivos de corte de hipocampo
organotípicos son preparaciones ideales para la búsqueda de fármacos
novedosos porque permiten la rápida exploración de un gran número de
compuestos. Estas preparaciones de cultivo tiene la ventaja añadida
sobre otros sistemas in vitro de mantener varias similitudes
clave con modelos in vivo incluyendo neurodegeneración
retrasada y vulnerabilidad selectiva de capa celular piramidal CA1 o
bien CA3 dependiendo del paradigma y de la intensidad de la
lesión.
Los inventores han ampliado los resultados
anteriores obtenidos con un modelo de hipoxia para un paradigma de
lesión de isquemia in vitro más intenso (privación de oxígeno
y glucosa) y se ha mostrado que L-Arg3,4 previene
significativamente la pérdida celular de CA1 tras 1 h de isquemia
(figura 2). Para determinar el intervalo terapéutico disponible para
L-Arg3,4, se retrasó la administración durante hasta
60 min. después de la isquemia y, sorprendentemente, todavía era
neuroprotector. Este intervalo terapéutico es más de dos veces más
largo que para MK-801, D-APV o
dextrometorfano que pierden eficacia si la administración se retrasa
durante 30 min. en modelos de excitotoxicidad (Hartley & Choi,
(1989), J Pharmacol. Exp. Ther., 250, 752-758),
sugiriendo que es improbable que el mecanismo de acción de
L-Arg3,4 sea a nivel del receptor de NMDA.
Dada la implicación bien establecida de
glutamato en las secuelas patofisiológicas de isquemia, se sometió a
prueba si la L-Arg3,4 era neuroprotectora frente a
la muerte celular mediada por EAA. L-Arg3,4 previno
significativamente la muerte celular debida a la toxicidad por
glutamato, NMDA, AMPA y kainato.
Dada su similitud estructural con espermidina
(figura 1(i)), L-Arg3,4 puede actuar en el
sitio de poliamina de receptor de NMDA. La L-Arg3,4
(figura 1(ii)) no potencia la activación del receptor de NMDA
porque no agravó la neurotoxicidad mediada por NMDA en los estudios,
y por tanto, probablemente no interacciona con el sitio de poliamina
en el receptor de NMDA.
En nuestros experimentos,
L-Arg3,4 no afectó a la transmisión sináptica en
ningún modo tal como se determina por la medición de respuestas de
campo provocadas en cortes de hipocampo agudos (figura 5)
reafirmando que no interacciona con canales de calcio sensibles a
voltaje (VSCC). Esta ausencia de efecto estaba en claro contraste
con el efecto de DNQX 10 \muM que suprimió toda transmisión
sináptica en el plazo de 10 min. de exposición indicando que
L-Arg3,4 no altera la transmisión mediada por
receptores no de NMDA.
Su ausencia de efectos electrofisiológicos en
combinación con su capacidad de prevenir la muerte celular
excitotóxica y la isquémica por ambos agonistas de receptor de NMDA
y no de NMDA sugiere que L-Arg3,4 actúa aguas abajo
del receptor y/o activación de canal. Su intervalo terapéutico muy
largo también sugiere que puede dirigirse a un nexo de las secuelas
patológicas que es común a estos modelos de muerte celular
especialmente dado que los antagonistas de NMDA tienen un intervalo
terapéutico mucho más corto inferior a 30 min. en modelo de
excitotoxicidad (Hartley & Choi, (1989), J Pharmacol. Exp.
Ther., 250, 752-758).
Para someter a prueba la hipótesis de que la
protección proporcionada por L-Arg3,4 se debía a su
capacidad de reaccionar con ROS, se lesionaron cultivos mediante
incubación en duroquinona 100 \muM que genera específicamente
superóxido mediante alteración de la cadena de transporte de
electrón de la mitocondria (Wilde et al., (1997), J.
Neurochem., 69, 883-886). Sorprendentemente,
L-Arg3,4 protegió significativamente frente a la
lesión mediada por radicales libres sugiriendo que puede extinguir
ROS (figura 6).
En resumen, los inventores han estudiado el
mecanismo de acción neuroprotector de L-Arg3,4, que
previene la muerte celular en un modelo deisquemia in vitro.
Sorprendentemente, la administración retrasada de
L-Arg3,4 tras la isquemia (hasta 60 min.) también
fue neuroprotectora. Este intervalo terapéutico extremamente largo
in vitro está en contraste con antagonistas de NMDA, tales
como MK-801, que pierden la eficacia tan sólo 15
min. después de la lesión (Hartley & Choi, (1989), J Pharmacol.
Exp. Ther., 250, 752-758). El compuesto previene la
muerte celular debida a glutamato pero no fue específico del subtipo
de receptor ya que también previno la muerte celular debida a NMDA,
AMPA y kainato. El compuesto no inhibió la transmisión sináptica, y
por tanto, no es probable que sea antagonista directo de receptores
de glutamato o VSCC al contrario que un compuesto estructuralmente
similar, sFTX-3,3 (figura 1(iii)). LArg3,4
también previno la muerte celular mediada por superóxido. Ya que no
afecta a la transmisión sináptica, L-Arg3,4 puede
engendrar menos efectos secundarios perjudiciales que los compuestos
terapéuticos experimentales anteriores.
Claims (6)
1. El uso de un compuesto que tiene la fórmula
general (I) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, para la
fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad
neurodegenerativa crónica:
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
la afección o enfermedad neurodegenerativa crónica se selecciona de
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de
Huntington, esclerosis múltiple y esclerosis lateral
amiotrófica.
3. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el compuesto se usa o se administra en
una cantidad eficaz para proporcionar una concentración en el
intervalo de 0,3 \muM a 300 \muM.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
el compuesto se usa o se administra en una cantidad eficaz para
proporcionar una concentración en el intervalo de 3 \muM a 300
\muM.
5. El uso de un compuesto según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la fabricación de un
medicamento para tratar o proteger de daño o de enfermedades
resultantes de la producción de superóxido.
6. El uso de un compuesto según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la fabricación de un
medicamento para tratar o proteger de daño o de enfermedades
resultantes de la producción de peroxinitrito.
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