ES2827011T3 - Terapia de intervalos para el tratamiento de la pérdida de visión en seres humanos con glaucoma - Google Patents

Abstract

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), para su uso en la prevención y/o el tratamiento del glaucoma en un sujeto que lo necesita, en el que dicho péptido se administra a diario durante un primer periodo de al menos un (1) día en al menos una dosis terapéuticamente eficaz, seguido de un segundo periodo de al menos una (1) semana en la que el péptido no se administra, seguido de la repetición de dicho primer periodo durante al menos un (1) día en el que dicho péptido se administra a diario.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de intervalos para el tratamiento de la pérdida de visión en seres humanos con glaucoma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos para su uso en la prevención y el tratamiento de trastornos oculares, en particular el glaucoma, a través de la modulación de los efectos tóxicos de derivados del p-amiloide (Ap).

Antecedentes de la invención

Ciertos estudios han demostrado que el glaucoma es la segunda causa principal de ceguera en EE. UU. [Leske M.C., The epidemiology of open-angle glaucoma: a review, Am. J. Epidemiology, 1983, 118:166-191]. La correlación patológica del glaucoma es la degeneración progresiva de las células ganglionares retinianas ("retinal ganglion cells", RGC) y sus axones que forman el nervio óptico.

La clasificación del glaucoma incluye los siguientes tipos diferentes: glaucoma de ángulo cerrado primario, glaucoma de ángulo abierto secundario, glaucoma inducido por esteroides, glaucoma traumático, síndrome de dispersión pigmentaria, síndrome de pseudoexfoliación, glaucoma de ángulo cerrado secundario, glaucoma neovascular, uveitis y glaucoma y otras patologías oculares no especificadas.

De modo similar, la degeneración macular es un trastorno que implica una patología de la retina que también se ha atribuido a la aparición del p-amiloide y que conduce a una pérdida progresiva de la visión, que conduce, por último, a la ceguera.

En el pasado, la definición de glaucoma incluía un aumento de la presión intraocular (''intraocular pressure", IOP) por encima de un intervalo normal. Sin embargo, muchos individuos con una IOP claramente elevada no desarrollan glaucoma, y hasta 50 % de los pacientes con glaucoma no presentan una IOP aumentada.

Las medicaciones disponibles en la actualidad para el tratamiento del glaucoma pertenecen a varias clases farmacológicas, que incluyen bloqueantes p-adrenérgicos, agonistas colinérgicos, inhibidores de la anhidrasa carbónica y agonistas de alfa2. Todos funcionan con un mecanismo mediante el cual se disminuye la IOP. Estas terapias existentes generalmente se administran como colirios. Pueden administrarse hiperosmóticos por vía intravenosa para un tratamiento de emergencia. Además, se aplica la terapia con láser y estrategias quirúrgicas en casos especiales.

Independientemente de la terapia, después de 20 años de seguimiento de pacientes con glaucoma, la ceguera relacionada con glaucoma alcanza 27 % al menos en un ojo y 9 % en ambos ojos [Hattenhauer M.G., Johnson D.H., Ing H.H., et al., The probability of blindness from open-angle glaucoma, Ophthalmology, 1998, 105:2099-2104]. Por tanto, existe una necesidad médica no cubierta de estrategias de tratamiento alternativas. En particular para pacientes con daños glaucomatosos progresivos con IOP normalizada, es necesaria una terapia que se centre en las células ganglionares retinianas que se están degenerando.

Existen diferentes teorías con respecto a la causa de la degeneración de las células ganglionares retinianas, que incluyen mecanismos mecánicos, vasculares y excitotóxicos. Tan solo en fechas recientes, se ha descubierto que el p-amiloide (Ap) se colocaliza con células ganglionares retinianas moribundas [McKinnon S.J., Glaucoma: Ocular Alzheimer's disease?, Front Biosci., 2003, 8:1140-1156; Yoneda S., Hara H., Hirata A., Fukushima M., Inomata Y., Tanihara H., Vitreous fluid levels of beta-amyloid(1-42) and tau in patients with retinal diseases, Jpn. J. Ophthalmol., 2005, 49(2):106-108]. Estudios en animales han demostrado que, en particular, los oligómeros del péptido Ap1-42 solubles son toxinas muy potentes para las células ganglionare retinianas [Dahlgren K.N., Manelli A.M., Stine W.B. Jr., Baker L.K., Krafft G.A., LaDu M.J., Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability, J. Biol. Chem., 2002, 277(35):32046-32053; Guo L., Salt T.E., Luong V., Wood N., Cheung W., Maass A., Ferrari G., Russo-Marie F., Sillito A.M., Cheetham M.E., Moss S.E., Fitzke F.W., Cordeiro F., Targeting amyloid-p in glaucoma treatment, PNAS 2007, 104 (33):13444-13449].

Están desarrollándose múltiples tratamientos potenciales dirigidos a Ap. El mecanismo común de estas estrategias consiste en contrarrestar los efectos perjudiciales del Ap, evitando su formación (por ejemplo, inhibidores de APP secretasa), neutralizando el Ap a través de anticuerpos, o interfiriendo con la agregación del Ap. Este último mecanismo cada vez suscita más interés dentro de la comunidad científica, puesto que los datos procedentes de modelos animales demuestran claramente los efectos beneficiosos de los inhibidores de la agregación de Ap o de los moduladores de la agregación de Ap sobre la neurotoxicidad inducida por Ap.

La inhibición de las especies de agregación de Ap neurotóxicas ha demostrado reducir la degeneración glaucomatosa de células ganglionares retinianas [Guo, et al., PANS, 2007, 13444]. Los inhibidores usados en estos experimentos animales fueron anticuerpos de Ap y rojo Congo. Estos agentes solo son herramientas de investigación farmacológica y no son apropiados para el tratamiento de seres humanos por diversas razones.

Sería una ventaja proporcionar nuevos métodos para la prevención y el tratamiento de trastornos oculares, en particular el glaucoma y la degeneración macular, y composiciones farmacéuticas para realizar dicha prevención y tratamiento de estos. Según el conocimiento científico actual, se administran inhibidores de la agregación de Ap o moduladores de la agregación de Ap de forma continua a lo largo de largos periodos de tiempo para provocar un efecto neuroprotector terapéuticamente pertinente. Se entiende que la interrupción de la terapia (incluso tan solo durante un corto periodo de tiempo) conduce a una situación que, en ausencia del inhibidor/modulador, la agregación neurotóxica se reanuda inmediatamente y la enfermedad avanza (potencialmente, de una manera más agresiva que antes). Se postula el mismo paradigma para la terapia de otras enfermedades asociadas con Ap, tal como se mencionó anteriormente.

Además, el tratamiento de trastornos oculares asociados con Ap, tales como el glaucoma o la degeneración macular, a menudo requiere unas vías de dosificación que implican etapas desagradables, tales como inyecciones intravítreas. Por consiguiente, es necesario mejorar el cumplimiento por parte del paciente y su bienestar general. Una ventaja evidente para los pacientes sería que los efectos neuroprotectores puedan lograrse mediante una terapia de intervalos, que se caracteriza por una primera dosis eficaz, seguida de unas dosis "de refuerzo" con la posibilidad de que existan periodos sin fármaco intermedios, en lugar de un régimen de dosificación estrictamente continuo. Por supuesto, este programa de dosificación, no obstante, debería asegurar el mejor resultado clínico posible de la terapia.

La solicitud internacional PCT n.° PCT/EP2008/006888 indica que los moduladores de la agregación de Ap pueden producir un efecto neuroprotector terapéuticamente pertinente en el tratamiento del glaucoma.

Con la presente invención, se ha descubierto que una terapia de intervalos que emplea dichos moduladores de la agregación de Ap puede ser una estrategia eficaz para el tratamiento del glaucoma y la degeneración macular. Además, se ha determinado que el tratamiento de intervalos puede evitar la recurrencia del glaucoma en pacientes con unos efectos del tratamiento suficientes o estables, mediante la administración de una dosis reducida de un modulador de la agregación de Ap. Un beneficio asociado con dicho tratamiento consiste en una exposición al fármaco significativamente reducida, en particular una reducida exposición crónica, al mismo tiempo que el efecto terapéutico sigue siendo suficiente. Además, aumenta la comodidad de la dosificación para los pacientes y, con ello, influye positivamente en su cumplimiento.

Otras necesidades en la técnica que son abordadas por la invención serán evidentes en lo sucesivo, y otras necesidades serán evidentes para los expertos en la técnica.

Sumario de la invención

Por tanto, lo que los inventores creen que comprende su invención puede resumirse, entre otras formas, con las siguientes frases:

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), para su uso en la prevención y/o el tratamiento del glaucoma en un sujeto que lo necesita, en el que dicho péptido se administra a diario durante un primer periodo de al menos un (1) día en al menos una dosis terapéuticamente eficaz, seguido de un segundo periodo de al menos una (1) semana en la que el péptido no se administra, seguido de la repetición de dicho primer periodo durante al menos un (1) día en el que dicho péptido se administra a diario.

Dicho péptido para su uso, en el que la administración de la dosis terapéuticamente eficaz del péptido durante el primer periodo continúa durante al menos una semana.

Dicho péptido para su uso, en el que la administración de la dosis terapéuticamente eficaz del péptido durante el primer periodo continúa durante un mes como máximo.

Dicho péptido para su uso, en el que el segundo periodo es de al menos un (1) mes, o al menos 2 meses.

Dicho péptido para su uso, en el que el segundo periodo es de 3 meses como máximo, o de 6 meses como máximo, o de 1 año como máximo.

Dicho péptido para su uso, en el que el segundo periodo es de tres (3) a seis (6) meses.

Dicho péptido para su uso, en el que el péptido está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Dicho péptido para su uso, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en forma de varias dosis individuales administradas dentro de un periodo de tiempo que consiste en uno (1) o más días. Dicho péptido para su uso, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra a diferentes potencias de dosis seleccionadas de un ajuste ascendente o descendente de la dosis.

Dicho péptido para su uso, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en una formulación de liberación inmediata.

Dicho péptido para su uso, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en una formulación de liberación modificada.

Dicho péptido para su uso, en el que el péptido se administra en combinación en el primer y/o segundo periodo con una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un agente farmacéutico adicional que es eficaz para tratar o prevenir al menos un trastorno óptico.

Dicho péptido para su uso, en el que dicho al menos un agente farmacéutico adicional es una medicación administrada para tratar enfermedades oculares y contiene al menos un agente seleccionado de fármacos antiglaucoma, antibióticos, fármacos antiinflamatorios, esteroides, fármacos antialérgicos y fluido de lágrimas artificiales.

Dicho péptido para su uso, en el que dicho al menos un agente farmacéutico adicional se selecciona de acetazolamida, diclofenamida, carteolol, timolol, metipranolol, betaxolol, pindolol, levobunolol, brimonidina, clonidina, pilocarpina, carbacol, dipivefrina, apraclonidina, brinzolamida, dorzolaminda, bimatoprost, travaprost, latanoprost, clortetraciclina, ciprofloxacina, ofloxacina, ácido fusidínico, gentamicina, kanamicina, levofloxacina, lomefloxacina, oxitetraciclina, natamicina, azidanfenicol, cloranfenicol, tobramicina, eritromicina, polimixina-B, acaclovir, trifluridina, betametasona, dexametasona, fluorometolona, hidrocortisona, prednisolona, rimexolona, cromoglicato, azelastina, lodoxamida, emedastina, nedocromilo, levocabastina, olopatadina, cetotifeno, hipromelosa, carbómero, hialuronato, carmelosa, hipromelosa, povidona, hietelosa, poli(alcohol vinílico), dexpantenol, tetrizolina, troxerutina, tramazolina, nafazolina, xilometazolina, fenilefrina y antazolina.

Descripción detallada de la invención

Con respecto a la primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz, dicha administración también puede consistir en varias dosis individuales (generalmente 1-10) administradas dentro de un periodo de tiempo corto (generalmente 1-7 días). Además, en la situación en la que se administran varias dosis, estas pueden variar en su potencia de dosificación. Se pretende que dicha variación pueda incluir un ajuste ascendente o descendente de la dosis, dependiendo del fármaco y de su tolerabilidad.

En particular con respecto al tratamiento de trastornos ópticos, la vía de la primera dosis puede ser diferente de la vía para la segunda dosis. Por ejemplo, la primera dosis puede administrarse mediante inyección intravítrea y la segunda dosis puede administrarse por vía tópica.

El segundo periodo será, con frecuencia, un periodo de tiempo más largo que el primer periodo. Por ejemplo, el primer periodo puede ser un día y el segundo periodo puede ser una o más semanas, o uno o más meses; o el primer periodo será una semana y el segundo periodo será dos o más semanas, o uno o más meses. A menudo, el segundo periodo será igual o menor que un año.

La presente invención aborda las limitaciones de la terapia convencional para los trastornos ópticos y proporciona una terapia farmacéuticamente aceptable para tratar con eficacia la pérdida de visión en seres humanos con glaucoma y otros trastornos oculares degenerativos. El mecanismo subyacente es la prevención o la inversión de la pérdida de células ganglionares retinianas mediante el bloqueo de los efectos tóxicos de especies de Ap neurotóxicas concretas.

Las sustancias representativas descritas para la presente terapia se diseñaron, en un primer momento, para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por la formación de fibrillas de amiloides, tales como la diabetes de tipo II y enfermedades priónicas [Porat Y., Mazor Y., Efrat S., Gazit E., Inhibition of islet amyloid polypeptide fibril formation: A potential role for heteroaromatic interactions, Biochemistry, 2004, 43:14454-14462], y enfermedades degenerativas del cerebro, que incluyen la demencia de Alzheimer [GAZIT, E., solicitud publicada de EE. UU. n.° US2006/0234947 A1]. De modo más específico, Gazit indica que péptidos de cadena corta que, según cabe suponer, comprenden aminoácidos modificados, tales como ácido aminoisobutírico, tienen aplicación en la alteración de la formación de especies de Ap tóxicas mediante su interacción con procesos de reconocimiento molecular y autoensamblaje de las fibrillas de amiloides [Gazit, 2006]. Los inventores han determinado que estas sustancias muestran efectos terapéuticos en otro sistema de órganos diferente del cerebro, concretamente, los ojos (solicitud internacional PCT n.° PCT/EP2008/006888). Estas sustancias muestran un efecto terapéutico en la prevención y el tratamiento de la pérdida de células ganglionares retinianas en modelos animales de glaucoma. Comparados con agentes conocidos, los anticuerpos de Ap y rojo Congo, estas sustancias tienen las siguientes ventajas:

• Son moléculas pequeñas que pueden producirse de modo barato a gran escala.

• Pueden administrarse con facilidad a los pacientes, por vía oral (por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas) o local (por ejemplo, colirios, cremas para los ojos, depósitos de liberación lenta intraoculares).

• Son bien toleradas.

• Tienen propiedades farmacocinéticas sencillas.

También pueden utilizarse otras sustancias en los métodos de la presente invención. El péptido 12-mero D-pep (QSHYRHISPAQV) también es representativo de péptidos más grandes activos en los presentes métodos (Wiesehan, K., Stohr, J., Nagel-Steger, L., van Groen, T., Riesner, D. y Willbold, D. (2008), Inhibition of cytotoxicity and amyloid fibril formation by a D-amino acid peptide that specifically binds to Alzheimer's disease amyloid peptide, Protein Eng. Des. Sel., 21: 241-246). Otras especies peptídicas, que incluyen el análogo N-metilado doble del polipéptido de amiloides de los islotes ("islet amyloid polypeptide", IAPP) IAPP-GI, pueden utilizarse en los presentes métodos. (Rezaei-Ghaleh N., Andreetto E., Yan L.M., Kapurniotu A., Zweckstetter M., Interaction between amyloid beta peptide and an aggregation blocker peptide mimicking islet amyloid polypeptide, PLoS One, 2011,6(5):e20289.

Además, los inventores han determinado que el mecanismo de acción de estos compuestos se caracteriza por la formación de ensamblajes inocuos del propio compuesto más la proteína de Ap. En fotografías de microscopía de fuerza atómica, estos ensamblajes aparecen como agregados de proteínas de Ap voluminosos. Estos agregados son inertes y no tóxicos para las neuronas. El ensamblaje de estos agregados de Ap voluminosos no tóxicos se produce con mucha rapidez y, por tanto, se evita la agregación de los monómeros de Ap para producir oligómeros similares a lámina p altamente estructurados y patológicos, con lo cual conduce, en último término, a un beneficio terapéutico para los pacientes.

Hasta la fecha, se creía que son necesarios unos niveles continuos de moduladores de la agregación de Ap para asegurarse de que no se formen oligómeros de Ap tóxicos. Sin embargo, la presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que también pueden lograrse efectos de tratamiento beneficiosos sin niveles continuos de moduladores de la agregación de Ap. De hecho, es suficiente administrar una primera dosis eficaz del modulador de la agregación de Ap para iniciar la formación de agregados de Ap voluminosos no tóxicos. De modo sorprendente, después de la primera iniciación de esa vía, esta se convierte en la vía principal de procesamiento de Ap en el organismo y, durante cierta cantidad de tiempo, sigue siendo la vía principal incluso después de que los moduladores de la agregación ya no estén presentes. Esto significa que los moduladores de la agregación de Ap, según se describieron anteriormente, cuando se aplican a intervalos, actúan para iniciar un proceso que después es autónomo. Tras haberse formado los agregados de Ap voluminosos no tóxicos, estos actúan como "imanes" biológicos para retirar el Ap soluble automáticamente del organismo. En esta situación, el procesamiento de Ap se redirige hacia la formación rápida de agregados de Ap voluminosos no tóxicos incluso en ausencia de los agentes farmacológicos. Esta desintoxicación continua de los niveles elevados de Ap es la razón subyacente para el efecto del tratamiento neuroprotector.

Los métodos que comprenden la administración de estas sustancias pueden aplicarse al tratamiento de pacientes con diversos tipos de trastornos oculares, que incluyen todas las formas del glaucoma, tal como se mencionó anteriormente, y el síndrome de dispersión pigmentaria, síndrome de pseudoexfoliación, glaucoma de ángulo cerrado secundario, glaucoma neovascular, uveitis, degeneración macular relacionada con el envejecimiento, retinopatía diabética, neuropatía óptica degenerativa y otras patologías oculares que se caracterizan por una pérdida progresiva de visión que conducen, en último término, a la ceguera, conocidos por los expertos en la técnica. Estos trastornos tienen en común una disminución progresiva de la visión de los ojos relacionada con un proceso degenerativo de la retina o el nervio óptico. El tratamiento es posible en todos los estadios del avance de la enfermedad, incluyendo estadios muy tempranos como profiláctico. Los efectos clínicos pueden ser dobles, el primero es una mejora aguda en la visión en los pacientes que ya padecen una degeneración glaucomatosa, y el segundo es el frenado o la detención del agravamiento progresivo de la visión. Incluso los pacientes que sufren ceguera en uno o dos ojos relacionada con el glaucoma pueden recobrar la visión hasta cierto grado.

Los presentes métodos comprenden opcionalmente administrar preparaciones que contienen estas sustancias a ciertos intervalos de tiempo. Esto conduce a la formación de agregados de Ap voluminosos no tóxicos como centros de condensación adicionales para Ap soluble (dosificación "de refuerzo"). Dependiendo del tipo y del estadio del tratamiento de la enfermedad subyacente, son posibles ciclos de algunos días a varios meses. Comparados con los regímenes de tratamiento continuos conocidos, las terapias de intervalos de la invención tienen las siguientes ventajas:

• Un intervalo de tratamiento con una dosificación del fármaco solo cada dos días hasta varias veces al año es una mejora evidente en la comodidad y la calidad de vida de los pacientes, comparado con una dosificación necesaria tan a menudo como varias veces diarias hasta una vez diaria como mínimo. Esto es así independientemente de la vía de dosificación y del tipo de enfermedad asociada a Ap.

• Con la terapia de intervalos también mejora el cumplimiento por parte del paciente. Cuanto más a menudo tengan que administrarse medicación los pacientes, más molestos están con el tratamiento y simplemente omiten ciertos momentos de dosificación. Con un mejor cumplimiento por parte del paciente, el beneficio del tratamiento mejora.

• El régimen de tratamiento de la invención reduce significativamente la exposición global al fármaco. Una exposición reducida significa un riesgo reducido de efectos adversos. Por tanto, la tolerabilidad y el perfil de seguridad pueden aumentar notablemente sin pérdida de los efectos beneficiosos del tratamiento.

• La dosis total de compuesto que se va a aplicar por paciente se reduce, lo cual disminuye notablemente el coste de producción.

Los presentes métodos opcionalmente comprenden administrar al menos un agente farmacéutico adicional que es conocido en la técnica por ser eficaz en el tratamiento de trastornos oculares. Esta administración puede incluirse según el régimen terapéutico preferido de dicho al menos un agente farmacéutico adicional, independientemente del presente régimen de tratamiento de intervalos. Estos agentes adicionales pueden seleccionarse de la clase general de fármacos antiglaucoma, que incluye los mencionados anteriormente, antibióticos virostáticos, esteroides, fármacos antialérgicos, lágrimas artificiales y otros fármacos usados para el tratamiento local y sistémico del ojo. Los fármacos antiglaucoma representativos incluyen acetazolamida, diclofenamida, carteolol, timolol, metipranolol, betaxolol, pindolol, levobunolol, brimonidina, clonidina, pilocarpina, carbacol, dipivefrina, apraclonidina, brinzolamida, dorzolaminda, bimatoprost, travaprost, y latanoprost. Los antibióticos representativos usados para infecciones oculares son clortetraciclina, ciprofloxacina, ofloxacina, ácido fusidínico, gentamicina, kanamicina, levofloxacina, lomefloxacina, oxitetraciclina, natamicina, azidanfenicol, cloranfenicol, tobramicina, eritromicina y polimixina-B. Los virostáticos representativos incluyen acaclovir y trifluridina. Los esteroides representativos incluyen betametasona, dexametasona, fluorometolona, hidrocortisona, prednisolona y rimexolona. Los fármacos antialérgicos representativos incluyen cromoglicato, azelastina, lodoxamida, emedastina, nedocromilo, levocabastina, olopatadina y cetotifeno. Las lágrimas artificiales representativas incluyen hipromelosa, carbómero, hialuronato, carmelosa, hipromelosa, povidona, hietelosa, poli(alcohol vinílico) y dexpantenol. Otros productos terapéuticos oculares de uso habitual representativos son tetrizolina, troxerutina, tramazolina, nafazolina, xilometazolina, fenilefrina, antazolina.

Los siguientes péptidos, según se describen en la solicitud publicada de EE. UU. n.° US2006/0234947 A1, son representativos de péptidos de cadena corta que, según cabe suponer, comprenden aminoácidos modificados, tales como ácido aminoisobutírico, descritos por Gazit, que se analizaron anteriormente: D-Phe-D-Phe-D-Pro (SEC ID NO:1), Aib-D-Phe-D-Asn-Aib (SEC ID NO:2), D-Phe-D-Asn-D-Pro (SEC ID NO:3), Aib-Asn-Phe-Aib (SEC ID NO:4), Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEC ID NO:5), Tyr-Tyr (SEC ID NO:6), D-Phe-D-Phe-D-Pro (SEC ID NO:7), Aib-D-Phe-D-Asn-Aib (SEC ID NO:8), Aib-Asn-Phe-Aib (SEC ID NO:9), Tyr-Tyr (SEC ID NO:10), Tyr-Tyr-NH²(SEC ID NO:11), Aib-Phe-Phe (SEC ID NO:12), Asn-Tyr-Aib (SEC ID NO:13), Asn-Tyr-Pro (SEC ID NO:14), ácido p-aminoisobutírico (Aib)-D-Pro-D-Tyr-D-Asn (SEC ID NO:15), D-Tyr-Aib (SEC ID NO:16), D-Pro-D-Tyr (SEC ID NO:17), D-Tyr-D-Pro (SEC ID NO:18), Asn-Tyr-Tyr-Pro (SEC ID NO:19), Tyr-Tyr-Aib (SEC ID NO:20), Aib-Tyr-Tyr (SEC ID NO:21), Aib-Tyr-Tyr-Aib (SEC ID NO:22), D-Asn-Tyr-Tyr-D-Pro (SEC ID NO:23), Pro-Tyr-Tyr (SEC ID NO:24), Tyr-Tyr-Pro (SEC ID NO:25), Pro-Tyr-Tyr-Pro (SEC ID NO:26), D-Tyr-D-Tyr (SEC ID NO:27), D-Pro-Aib (SEC ID NO:28), D-Phe-D-Pro (SEC ID NO:29), D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), D-Trp-D-Pro (SEC ID NO:31), D-Phe-Pro (SEC ID NO:32), y Pro-D-Phe (SEC ID NO:33). A menos que se indique lo contrario, el resto Aib significa ácido a-aminoisobutírico.

El término "análogo" o "derivado" se emplea en la presente en el sentido farmacéutico convencional, para indicar una molécula que se parece, desde el punto de vista estructural, a una sustancia activa del presente método (tal como D-Trp-Aib), pero que se ha modificado de una manera dirigida y controlada para reemplazar uno o más sustituyentes específicos de la molécula referente por un sustituyente alternativo, generando con ello una molécula que es similar, desde el punto de vista estructural, a la molécula referente. La síntesis y la selección de análogos (por ejemplo, usando análisis estructurales y/o bioquímicos) para identificar versiones ligeramente modificadas de una sustancia conocida que puedan tener rasgos mejorados o sesgados (tales como una mayor potencia y/o selectividad por un tipo de receptor diana específico, mayor capacidad para penetrar las barreras hematoencefálicas de mamíferos, menos efectos secundarios, etc.) es una estrategia de diseño de fármacos que es muy conocida en la química farmacéutica.

Además, mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica, pueden crearse análogos y derivados de las sustancias de la invención que tengan una mejor eficacia terapéutica para controlar la toxicidad del p-amiloide (Ap), concretamente, una mayor potencia y/o selectividad por un tipo de receptor diana específico, mayor o menor capacidad para penetrar las barreras hematoencefálicas de mamíferos (por ejemplo, mayor o menor tasa de permeación de la barrera hematoencefálica), menos efectos secundarios, etc.

Debido a su alto grado de actividad y su baja toxicidad, que juntos presentan un índice terapéutico muy favorable, las sustancias de la invención pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, el cuerpo de un animal vivo (que incluye un ser humano) que lo necesita, para el tratamiento, el alivio o la mejora, la paliación o la eliminación de una indicación o trastorno que es susceptible a ello, o que es representativo de una indicación o trastorno indicado en otro punto de esta solicitud, opcionalmente al mismo tiempo, de modo simultáneo o junto con uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en especial y opcionalmente en forma de una composición farmacéutica de ellos, por vía oral, rectal o parental (que incluye intravenosa, intraocular y subcutánea) o, en algunos casos, incluso tópica (que incluye colirios, cremas para los ojos y formulaciones de depósitos de liberación lenta intraoculares), en una dosis eficaz. Los intervalos de dosificación adecuados incluyen 1-1000 miligramos diarios, como alternativa 10-500 miligramos diarios, y opcionalmente 50-500 miligramos diarios, dependiendo, como siempre, del modo exacto de administración, de la forma en que se administran, de la indicación a la cual se dirige la administración, del sujeto implicado y del peso corporal del sujeto implicado, y de la preferencia y experiencia del médico o veterinario encargado.

La expresión "terapéuticamente eficaz" aplicada a una dosis o una cantidad se refiere a la cantidad de una sustancia o composición farmacéutica que es suficiente para producir una actividad deseada tras su administración a un cuerpo animal vivo (que incluye un cuerpo humano) que lo necesita. El término "tratar" se emplea en la presente para indicar un alivio en al menos un síntoma de una enfermedad en un sujeto. Dentro del significado de la presente invención, el término "tratar" también indica detener, retrasar la aparición (es decir, el periodo antes de la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad.

La expresión "farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en conexión con las composiciones de la invención, se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de dichas composiciones que son fisiológicamente tolerables y que no producen generalmente reacciones adversas cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). La expresión "farmacéuticamente aceptable" también puede significar aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea reconocida en general para su uso en mamíferos y, más en concreto, en seres humanos.

Las sustancias de la presente invención pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Las "sales farmacéuticamente aceptables" se refieren a las sales que poseen la eficacia biológica y las propiedades del compuesto de origen y que no son biológicamente indeseables o indeseables de otro modo. La naturaleza de la sal o isómero no es crucial, con la condición de que no sea tóxica y de que no interfiera sustancialmente con la actividad farmacológica deseada.

El término "vehículo" aplicado a las composiciones farmacéuticas de la invención se refiere a un diluyente, excipiente, o portador con el que se administra una sustancia activa (tal como D-Trp-Aib). Estos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua, disoluciones salinas, disoluciones de dextrosa acuosas, disoluciones de glicerol acuosas, y aceites, que incluyen los que se originan del petróleo, de animales, vegetales o de origen sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de A.R. Gennaro, 20a edición.

El término "aproximadamente" significa habitualmente dentro del 20 %, como alternativa dentro del 10 %, incluyendo dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. Como alternativa, en especial en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un logaritmo (es decir, un orden de magnitud), que incluye dentro de un factor de dos de un valor dado.

Según la presente invención, la forma de dosificación de la sustancia activa puede ser un sólido, un semisólido o una formulación líquida según lo siguiente.

La sustancia activa de la presente invención puede administrarse por vía oral, tópica, parenteral o mucósica (por ejemplo, por vía bucal, mediante inhalación o por vía rectal) en formulaciones de dosificaciones unitarias que contengan vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. En otra realización para la administración a sujetos pediátricos, la sustancia activa puede formularse como un líquido aromatizado (por ejemplo, aroma de menta). La sustancia activa puede administrarse por vía oral en forma de una cápsula, un comprimido o similares, o como un semisólido o una formulación líquida (véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, de A.R. Gennaro).

Para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, la sustancia activa puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, tales como agentes ligantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol y otros azúcares reductores y no reductores, celulosa microcristalina, sulfato de calcio, o difosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o sílice, ácido estérico, estearilfumarato de sodio, behenato de glicerilo, estearato de calcio y similares); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio), agentes colorantes y aromatizantes, gelatina, edulcorantes, gomas naturales y sintéticas (tales como goma arábiga, tragacanto o alginatos), sales tamponantes, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares.

Los comprimidos pueden revestirse con una disolución de azúcar concentrada que puede contener, por ejemplo, goma arábiga, gelatina, talco, dióxido de titanio y similares. Como alternativa, los comprimidos pueden revestirse con un polímero que se disuelve en un disolvente orgánico que se volatiliza con facilidad o una mezcla de disolventes orgánicos. En realizaciones específicas, la sustancia activa se formula en comprimidos de liberación inmediata ("immediate-release", IR) o de liberación modificada ("modified-release", MR). Las formas de dosificación sólidas de liberación inmediata permiten la liberación de todo o de la mayor parte del ingrediente activo a lo largo de un periodo de tiempo corto, tal como de 60 minutos o menos, y permiten la absorción rápida del fármaco. Las formas de dosificación sólidas de liberación modificada permiten la liberación sostenida de la sustancia activa a lo largo de un periodo largo de tiempo para intentar mantener unos niveles en plasma terapéuticamente eficaces a lo largo de intervalos largos de tiempo similares y/o modificar otras propiedades farmacocinéticas de la sustancia activa.

Para la formulación de cápsulas de gelatina blanda, las sustancias activas pueden mezclarse, por ejemplo, con un aceite vegetal o polietilenglicol. Las cápsulas de gelatina dura pueden contener gránulos de las sustancias activas usando los excipientes mencionados anteriormente para comprimidos, por ejemplo, lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones (por ejemplo, almidón de patata, almidón de maíz o amilopectina), derivados de celulosa o gelatina. También pueden introducirse líquidos o semisólidos del fármaco en las cápsulas de gelatina dura.

Las composiciones de la invención también pueden introducirse en microesferas o microcápsulas, por ejemplo, fabricadas a partir de poli(ácido glicólico/ácido láctico) ("polyglycolic acid/lactic acid", PGLA) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.814.344; 5.100.669 y 4.849.222; publicaciones PCT n.os WO 95/11010 y WO 93/07861). Pueden usarse polímeros biocompatibles para lograr la liberación controlada de una sustancia activa, que incluyen, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico), poli-épsilon caprolactona, poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros en bloque anfipáticos o reticulados de hidrogeles.

También puede usarse una formulación de la sustancia activa en un semisólido o una forma líquida. La sustancia puede constituir entre 0,1 y 99 % en peso de la formulación, de modo más específico entre 0,5 y 20 % en peso para formulaciones previstas para inyección, y entre 0,2 y 50 % en peso para formulaciones adecuadas para la administración oral.

En una realización de la invención, la sustancia activa se administra en una formulación de liberación modificada. Las formas de dosificación de liberación modificada proporcionan un medio para mejorar el cumplimiento por parte del paciente y para asegurar una terapia eficaz y segura reduciendo la incidencia de reacciones adversas del fármaco. Comparado con las formas de dosificación de liberación inmediata, las formas de dosificación de liberación modificada pueden usarse para prolongar la acción farmacológica después de la administración, y para reducir la variabilidad en la concentración en plasma de un fármaco a través del intervalo de dosificación, eliminando o reduciendo con ello los picos agudos.

Una forma de dosificación de liberación modificada puede comprender un núcleo revestido con una sustancia activa o que la contiene. El núcleo después se reviste con un polímero modificador de la liberación en el cual se dispersa la sustancia activa. El polímero modificador de la liberación de disgrega gradualmente, liberando la sustancia activa a lo largo del tiempo. Por tanto, la capa más externa de la composición frena de modo eficaz y, con ello, regula la difusión de la sustancia activa a través de la capa de revestimiento cuando la composición se expone a un entorno acuoso, concretamente, el tracto gastrointestinal. La tasa neta de difusión de la sustancia activa principalmente depende de la capacidad del fluido gástrico para penetrar la capa de revestimiento o matriz y de la solubilidad de la propia sustancia activa.

En otra realización de la invención, la sustancia activa se formula en una formulación líquida oral. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma, por ejemplo, de disoluciones, jarabes, emulsiones o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse de modo adecuado para proporcionar una liberación controlada o pospuesta del compuesto activo.

Para la administración oral en forma líquida, la sustancia activa puede combinarse con vehículos inertes farmacéuticamente aceptables no tóxicos (por ejemplo, etanol, glicerol, agua), agentes suspensores (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles), agentes emulgentes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados), conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo, o ácido sórbico) y similares. También pueden añadirse agentes estabilizantes, tales como antioxidantes (BHA, BHT, galato de propilo, ascorbato de sodio, ácido cítrico) para estabilizar las formas de dosificación. Por ejemplo, las disoluciones pueden contener de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 20 % en peso de la sustancia activa, siendo el resto azúcar y una mezcla de etanol, agua, glicerol y propilenglicol. Opcionalmente, dichas formulaciones líquidas pueden contener agentes colorantes, agentes aromatizantes, sacarina y carboximetilcelulosa como agente espesante u otros excipientes.

En otra realización, una dosis terapéuticamente eficaz de la sustancia activa se administra en una disolución oral que contiene un conservante, un edulcorante, un solubilizante y un disolvente. La disolución oral puede incluir uno o más tampones, aromas o excipientes adicionales. En otra realización, se añade un aroma de menta u otro aroma a la formulación líquida oral de la sustancia activa.

Para la administración mediante inhalación, la sustancia activa puede administrarse de modo conveniente en forma de una presentación de pulverizado en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosimétrica. Las cápsulas y cartuchos fabricados, por ejemplo, con gelatina para su uso en un inhalador o un insuflador pueden formularse para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Pueden prepararse disoluciones para aplicaciones parenterales mediante inyección en una disolución acuosa de una sal farmacéuticamente aceptable hidrosoluble de las sustancias activas, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 10 % en peso. Estas disoluciones también pueden contener agentes estabilizantes y/o agentes tamponantes, y pueden proporcionarse de modo conveniente en diversas ampollas de unidades de dosificación.

Las formulaciones de la invención pueden administrarse por vía parenteral, es decir, mediante administración intraocular, intravenosa (i.v.), intracerebroventricular (i.c.v.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), subdérmica (s.d.), o intradérmica (i.d.), mediante inyección directa a través, por ejemplo, de una inyección en embolada o una infusión continuar. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes del uso.

La dosis terapéuticamente eficaz óptima puede determinarse de modo experimental, tomando en consideración el modo exacto de administración en el que se administra el fármaco, la indicación a la cual se dirige la administración, el sujeto implicado (por ejemplo, peso corporal, salud, edad, sexo, etc.), y la preferencia y experiencia del médico o veterinario encargado.

Las unidades de dosificación para la aplicación rectal pueden ser disoluciones o suspensiones, o pueden prepararse en forma de supositorios o enemas de retención que comprenden las sustancias de la invención mezcladas con un base grasa neutra, o cápsulas rectales de gelatina que comprenden las sustancias activas mezcladas con aceite vegetal o aceite de parafina.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones de la invención pueden ser determinadas mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en animales de experimentación, por ejemplo, mediante la determinación de la DL50 (la dosis letal para 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción DL50/DE50. Se prefieren las composiciones que muestran grandes índices terapéuticos.

Las dosis eficaces adecuadas de la sustancia activa de la invención en el tratamiento terapéutico de seres humanos son de aproximadamente 0,01-10 mg/kg de peso corporal en la administración peroral, y de 0,001-10 mg/kg de peso corporal en la administración parenteral.

La duración del tratamiento puede ser a corto plazo, por ejemplo, varias semanas (por ejemplo, 8-14 semanas), o a largo plazo hasta que el médico encargado considere que ya no son necesarias posteriores administraciones.

La sustancia activa de la presente invención puede administrarse como una monoterapia, o en combinación con otra sustancia recetada para el tratamiento de un trastorno óptico asociado con una toxicidad del p-amiloide (Ap) o, de modo más específico, el glaucoma.

El término "combinación", aplicado a las sustancias activas, se emplea en la presente para definir una única composición farmacéutica (formulación) que comprende dos sustancias activas (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende una sustancia activa como se describe en la presente y otra sustancia recetada para el tratamiento de un trastorno óptico asociado con la toxicidad del p-amiloide (Ap) o, de modo más específico, el glaucoma) o dos composiciones farmacéuticas distintas, y cada una comprende una sustancia activa (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende una sustancia activa de la presente invención u otra sustancia recetada para el tratamiento de un trastorno óptico asociado con la toxicidad del p-amiloide (Ap) o, de modo más específico, el glaucoma), para ser administradas conjuntamente.

Dentro del significado de la presente invención, la expresión "administración conjunta" se emplea para indicar la administración de una sustancia activa como se describe en la presente y una segunda sustancia activa (por ejemplo, otra sustancia recetada para el tratamiento de un trastorno óptico asociado con una toxicidad del p-amiloide (Ap) o, de modo más específico, el glaucoma) simultáneamente en una composición, o simultáneamente en diferentes composiciones, o de manera secuencial. Sin embargo, para que la administración secuencial se considere "conjunta", una sustancia activa como se describe en la presente y la segunda sustancia activa deben administrarse separadas por un intervalo de tiempo que siga permitiendo el efecto beneficioso resultante para tratar un trastorno óptico asociado con una toxicidad del p-amiloide (Ap) en un mamífero. La invención incluye dicha estrategia de administración de combinación, en la que los moduladores de la agregación de Ap se administran a dosis terapéuticamente eficaces, dosis terapéuticamente subeficaces o no se administran durante días específicos de dicha terapia "de combinación".

Las sustancias experimentales de la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento del glaucoma y también de la disfunción de las RGC relacionada con el envejecimiento, puesto que también se ha sugerido un papel del Ap en este último trastorno. Además, pueden esperarse unos efectos terapéuticos sinérgicos plausibles de un tratamiento combinado con agentes que disminuyen la presión intraocular que se emplean en la actualidad en el glaucoma, así como futuras terapias propuestas, tales como antioxidantes, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la NO sintasa, neurotrofinas y antiapoptóticos.

La presente invención proporciona aplicaciones nuevas, valiosas y sorprendentes y usos para las sustancias en los métodos de la presente invención, así como nuevas composiciones farmacéuticas de estas, que poseen al menos una de las características y/o ventajas descritas en la presente.

Las composiciones farmacéuticas representativas preparadas mezclando la sustancia activa con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado incluyen comprimidos, cápsulas, disoluciones para inyección, formulaciones orales líquidas, formulaciones en aerosol, formulaciones de TDS, y formulaciones de nanopartículas, para producir así medicamentos para un uso oral, inyectable o tópico, también según lo anterior. Farmacología - resumen

El método para usar las sustancias activas de la presente invención y sus composiciones farmacéuticas se caracteriza por unas propiedades ventajosas e impredecibles exclusivas, que hacen que el "contenido como un todo", según se reivindica en la presente, no sea obvio. Por tanto, los métodos y las composiciones farmacéuticas han mostrado, en procedimientos de ensayos fiables y aceptados de modo convencional, las siguientes propiedades y características valiosas.

Ejemplo farmacológico 1

Métodos

En un modelo experimental de glaucoma, se produce un aumento en la expresión de la proteína precursora de amiloide (''amyloid precursor protein", APP) y una apoptosis probablemente relacionada en las células ganglionares retinianas (RGC) [McKinnon, S. J., Lehman, D. M., Kerrigan-Baumrind, L. A., Merges, C. A., Pease, M. E., Kerrigan, D. F., Ransom, N. L., Tahzib, N. G., Reitsamer, H. A., Levkovitch-Verbin, H., Quigley, H. A., y Zack, D. J., Caspase activation and amyloid precursor protein cleavage in rat ocular hypertension, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., abril de 2002, 43(4):1077-1087]. Además, la inyección de Ap1-42 induce la apoptosis en RGC. La interferencia con la vía de APP-Ap, tal como la aplicación ocular de un anticuerpo, la inhibición de la actividad p-secretasa o la inhibición de la oligomerización, evita, al menos temporalmente, la apoptosis de RGC en el glaucoma que se produce por un aumento en la presión ocular (Guo, et al., 2007).

Procedimiento experimental

En el modelo del agutí oscuro macho, el glaucoma se produce mediante la inyección de una disolución salina hipertónica en las venas epiesclerales de un ojo para inducir un aumento en la presión ocular (hipertensión ocular crónica, ''chronic ocular hypertension", OHT), mientras que el otro ojo actúa como control [Morrison J.C., Moore C.G., Deppmeier L.M., Gold B.G., Meshul C.K., Johnson E.C., A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage, Exp Eye Res., 1997, 64(1): 85-96]. En los grupos de tratamiento (N = 4-8 por grupo), se inyectan diversas dosis de sustancias de la presente invención por vía intravítrea (en 5 pl de volumen) en el momento de la inducción del glaucoma y, en algunos grupos, la administración continúa durante los siguientes 7 días para observar si este tratamiento extendido produce una mayor eficacia. Se evalúa el grado de apoptosis de RGC a las 3 semanas y a las 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular crónica (OHT) en cada animal mediante oftalmoscopía de láser de barrido confocal dinámica y anexina V marcada de modo fluorescente. Los animales se sacrificaron después de 3 y 6 semanas, y sus ojos se enuclean y se fijan en paraformaldehído al 4 % durante la noche. Después, las retinas se separan para evaluar los cambios relacionados con la apoptosis, por ejemplo, según se visualizan con el kit de anexina V FITC kit (BD Biosciences, Franklin Lakes, EE. UU.) [Cordeiro, M. F., Guo, L., Luong, V., Harding, G., Wang, W., Jones, H. E., Moss, S. E., Sillito, A. M., y Fitzke, F. W., 2004, Real-time imaging of single nerve cell apoptosis in retinal neurodegeneration, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101, 13352-13356; Kietselaer, B. L., Hofstra, L., Dumont, E. A., Reutelingsperger, C. P., y Heidendal, G. A., 2003, The role of labeled Annexin A5 in imaging of programmed cell death. From animal to clinical imaging, Q. J. Nucl. Med., 47, 349-361], o TUNEL (marcaje de extremos de mella de dUTP) [Roche, kit de detección de la muerte celular in situ, marcado con fluoresceína] [Szydlowska K., Kaminska B., Baude A., Parsons C. G., Danysz W., 2007, Neuroprotective activity of selective mGlu1 and mGlu5 antagonists in vitro and in vivo, Eur. J. Pharmacol., 554, 18-29]. En los animales tratados con las sustancias experimentales de la presente invención, se produce una disminución en la apoptosis de RGC al menos en uno de los momentos ensayados.

En otro experimento, se tratan ratas sistémicamente (s.c.) y el experimento se repite como se indicó anteriormente. El objetivo de este estudio es verificar si la administración sistémica produce unas concentraciones suficientemente elevadas en el ojo. Por tanto, además, se analizan las concentraciones de las sustancias de la presente invención en el espacio vítreo del ojo. En los animales tratados sistémicamente con las sustancias experimentales, se produce una disminución en la apoptosis de RGC al menos en uno de los momentos ensayados, y se detectan concentraciones significativas de las sustancias experimentales en el espacio vítreo del ojo.

El experimento se repite como se describió anteriormente, excepto que la sustancia se aplica (s.c.) una vez 24 h antes de la inducción del glaucoma. Los estudios demuestran que, en el momento en que se induce el glaucoma, la concentración de la sustancia aplicada al ojo es insignificante. De modo sorprendente, a este tratamiento le sigue una disminución en la pérdida de RGC frente al control, cuando se evalúa en un momento concreto, por ejemplo, después de 3 semanas.

Experimento in vitro 1

Además, se verifican los efectos de las sustancias experimentales sobre la toxicidad en células RGC in vitro. El Ap se preagrega durante 1 -7 días con una sustancia experimental (300, 100, 30, 10, 3, 1,0,3 pM) o vehículo, y después parte de esta disolución se añade a un cultivo de RGC primarias durante 48 horas para producir una concentración final de Ap = 1 pM. Durante esta incubación, las células se mantienen en un incubador a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de CO2. Después, se verifica la apoptosis/necrosis usando el kit de anexina V FITC V kit (BD Biosciences, Franklin Lakes, EE. UU.) y, opcionalmente, con yoduro de propidio [Szydlowska et al., 2007].

Experimento in vitro 2

Como alternativa, los efectos de las sustancias experimentales sobre la toxicidad en células ganglionares retinianas (RGC) pueden verificarse in vitro usando el potencial de membrana de RGC registrado mediante la técnica de fijación de parche en membrana perforada, como se describe a continuación. Esta técnica permite controlar el potencial de membrana de la célula durante mucho tiempo, puesto que la diálisis del citoplasma se reduce mediante las perforaciones en la membrana formadas por el antibiótico. Con ello, la membrana es permeable solo a cationes pequeños.

El Ap se prepara a partir de Ap1-42 liofilizado de Bachem (cod. H-1368, número de lote 1030255) que se disuelve en HFIP (Sigma Aldrich) a una concentración de 1 mg/ml. En los experimentos, la concentración de Ap normalmente se ajusta a 50 nM. El Ap se usa después de 90 minutos de incubación a 36 °C y, en cualquier caso, dentro de 2 horas desde el momento en que fue diluido en la disolución de baño fisiológica.

Las RGC se aíslan a partir de retinas de ratón neonatal (P5-P6). Se usa el procedimiento estandarizado ofrecido por el kit Miltenyi Biotec para aislar las RGC. Al final de cuatro días en cultivo, las RGC se identifican mediante la presencia de una protuberancia larga que representa el axón.

Antes del registro mediante la fijación de parche en membrana, el medio de cultivo que baña las células se sustituye por una disolución de registro externa (NaCl 140 mM, KCl 2,5, CaCl21,8, MgCl20,5, glucosa 10, Hepes 10, pH 7,4). Los experimentos de fijación de parche en membrana se realizan usando el antibiótico gramicidina (Sigma Aldrich) diluido en una disolución intracelular (KCl 140 mM, NaCl 10, MgCl22, CaCl2 0,1, glucosa 10, Hepes 10, pH 6,9) a una concentración final de 5 pg/ml. Esta disolución se usa para rellenar la pipeta del parque para abrir poros en la membrana durante un "procedimiento de fijación de parche en membrana perforada". A dicha concentración de gramicidina, se obtiene el acceso eléctrico a la célula después de aproximadamente 5-10 minutos.

En primer lugar, se mide el potencial en reposo de las RGC en condiciones control. El aparato de perfusión con tubo en forma de U fabricado a medida se dirige hacia la célula bajo observación, y se logra un cambio completo en la disolución que perfusiona la célula ganglionar retiniana en menos de 1 segundo.

Se evalúa la acción de los siguientes compuestos (por ejemplo, ácido (E)-(R)-5-amino-6-(1H-indol-3-il)-2,2-dimetilhex-3-enoico, (R)-2-amino-N-(1-amino-2-metil-1-oxopropan-2-il)-3-(1H-indol-3-il)propanamida y ácido (R)-3-((2-amino-3-(1H-indol-3-il)-2,2-dimetiyl-hex-3-enoico, D-Trp-Aib (SEC ID NO:30)) sobre células ganglionares retinianas estimuladas con beta-amiloide como se ha descrito anteriormente. Un ejemplo de los efectos protectores de D-Trp-Aib se ilustra en la figura 1. Figura 1A - Células ganglionares retinianas (RGC) aisladas despolarizadas preincubadas durante 90 minutos a 36 °C con Ap1-4250 nM - las flechas muestran el momento de aplicación de Ap1-42. Después de un tiempo variable, de entre 2 y 10 minutos, el potencial en reposo de las células se mueve hacia potenciales más positivos. En la figura 1B es evidente que el efecto despolarizante de AB1-42 de Ap1-42 se evita mediante una coincubación con D-Trp-Aib 1 pM (90 minutos a 36 °C). La figura 1C ilustra el promedio del potencial en reposo de RGC bajo condiciones control, en Ap 50 nM, y a dos concentraciones diferentes de D-Trp-Aib. La diferencia entre las condiciones control (-59,4 ± 2,8 mV) y la estimulación con Ap (35,6 ± 1,8 mV) es muy significativa (n = 5, p = 0,01). No se encuentra una diferencia significativa entre la aplicación de Ap y de Ap más D-Trp-Aib 0,5 pM (-39,3 ± 1,8 mV). Sin embargo, el promedio del potencial de membrana en reposo de RGC estimuladas con Ap 50 nM más D-Trp-Aib 1 pM (-48,9 ± 2,4 mV) es estadísticamente diferente del control (n = 5, p = 0,05), de la estimulación solo con Ap (n = 5, p = 0,05) y de Ap más D-Trp-Aib 0,5 pM (n = 5, p = 0,05). Estos resultados demuestran que D-Trp-Aib protege frente a la toxicidad de Ap1-42.

Estos datos sugieren en gran medida que las sustancias experimentales de la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento del glaucoma y también de la disfunción de las RGC relacionada con el envejecimiento, puesto que también se ha sugerido un papel del Ap en este último trastorno [Guo, et al., 2007]. Además, pueden esperarse unos efectos terapéuticos sinérgicos plausibles de un tratamiento combinado con agentes que disminuyen la presión intraocular que se emplean en la actualidad en el glaucoma, así como futuras terapias propuestas, tales como antioxidantes, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la NO sintasa, neurotrofinas y agentes antiapoptóticos [Hartwick A. T., 2001, Beyond intraocular pressure: neuroprotective strategies for future glaucoma therapy, Optom. Vis. Sci., 78, 85-94].

Ejemplo farmacológico 2

Procedimiento experimental

Método para producir agregados voluminosos sintéticos

Se suspendió Ap1-42 (n.° de orden 62-0-80, lote Y11042T1, American Peptide Company, Sunnyvale, CA 94086, EE. UU.) en HFIP al 100 % (Sigma Aldrich) hasta aproximadamente 1 mg/ml (2 mg disueltos en 2 ml de HFIP) y se agitó a 37 °C durante 1,5 horas en viales Eppendorf sellados herméticamente. Esto permitió que se enfriase hasta la temperatura ambiente, y después la disolución se dividió en partes alícuotas y se retiró e1HFIP mediante evaporación usando un Speedvac durante aproximadamente 30 minutos. Tras secarse, el Ap1-42 se conservó a -20 °C. El Ap1-42 se disuelve en DMSO anhidro (Sigma Aldrich) hasta una concentración de 100 veces la requerida en PBS (es decir, 10 mM para 100 pM) con la ayuda de un baño de agua ultrasónico con/sin D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) (es decir, para una proporción 10:1, D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) 100 mM para Ap1-42 10 mM). Esta disolución después se diluye inmediatamente en PBS hasta una concentración final de Ap 100 pM en DMSO al 1 %. Se dejó que estas disoluciones se agregasen a temperatura ambiente durante diversos tiempos (por ejemplo, 1 hora, 1 día, 1 semana) antes de usarse.

Después de la agregación en PBS, las disoluciones se diluyeron en serie en PBS en 10 veces y después se "recargaron" con Ap1-42 para retirar D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) pero manteniendo la concentración total de Ap1-42. Esta etapa de transferencia de la semilla de Ap1-42 se repite al menos 4 veces, de modo que la concentración final residual de D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) es 10.000 veces menor que la concentración de partida (por ejemplo, 1 pM se reduce a 0,1 nM).

La disolución resultante contiene principalmente especies oligoméricas/semillas en el caso de Ap1-42 por sí solo, pero también semillas de Ap1-42 no tóxicas/desintoxicantes en el caso de disoluciones tratadas con D-Trp-Aib (SEC ID NO:30). Se usan los agregados de Ap voluminosos no tóxicos limpios y exentos superficialmente de D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) como agente activo para experimentos in vitro o animales, tal cual o tras otra dilución.

El procedimiento es igualmente aplicable para obtener agregados voluminosos usando cualquiera de los otros moduladores de la agregación de Ap descritos en la presente, por ejemplo, usando ácido (E)-(R)-5-amino-6-(1H-indol-3-il)-2,2-dimetil-hex-3-enoico, (R)-2-amino-N-(1 -amino-2-metil-1 -oxopropan-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)propanamida y ácido (R)-3-((2-amino-3-(1 H-indol-3-il)-2,2-dimetiyl-hex-3-enoico.

Método para producir agregados voluminosos a partir de medio acondicionado de células productoras

El medio acondicionado de células productoras de Ap se incuba con concentraciones apropiadas de diversos moduladores de la agregación de Ap, concretamente D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), ácido (E)-(R)-5-amino-6-(1H-indol-3-il)-2,2-dimetil-hex-3-enoico, (R)-2-amino-N-(1 -amino-2-metil-1 -oxopropan-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)propanamida y ácido (R)-3-((2-amino-3-(1H-indol-3-il)-2,2-dimetiyl-hex-3-enoico, y otros. Después de varias horas de incubación, la proteína de Ap y el respectivo modulador de la agregación de Ap forman agregados de Ap voluminosos no tóxicos como se describió anteriormente. Estos agregados de Ap voluminosos no tóxicos se separan mediante ultracentrifugación diferencial/lavado (u otras técnicas adecuadas, tales como la dilución en serie) hasta que todo el D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) que pueda eliminarse (u otro modulador de la agregación de Ap) se retira mediante enjuagado. Se usan los agregados de Ap voluminosos no tóxicos limpios y exentos superficialmente de D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) como agente activo para experimentos in vitro o animales, tal cual o tras otra dilución.

Método para confirmar los efectos protectores de agregados de Ap voluminosos no tóxicos sin D-Trp-Aib (SEC ID NO:30)

Se obtienen cortes transversales de hipocampo (350 pM de espesor) a partir de ratones adultos (2 meses) que han sido anestesiados con éter y decapitados. El cerebro se retira rápidamente y se preparan los cortes en disolución de Ringer enfriada en hielo usando un cortador vibroslicer. Todos los cortes se colocan en una cámara de mantenimiento durante al menos 60 min y después se trasladan a una cámara de superfusión para los registros extracelulares o de células completas. El caudal de la disolución a través de la cámara es de 1,5 ml/min. La composición de la disolución es de NaCl 124 mM, KCl 3 mM, NaHCO3 26 mM, CaCl2 2 mM, MgSO4 1 mM, D-glucosa 10 mM, y NaH2PO4 1,25 mM, burbujeada con una mezcla de 95 % de O2-5 % de CO2, y que tiene un pH final de 7,3. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.

Se obtienen los registros extracelulares de los potenciales postsinápticos excitatorios de campo ("field excitatory postsynaptic potentials", fEPSP) a partir de la región dendrítica de la región CA1 del hipocampo usando micropipetas de vidrio (1-2 PM) rellenas con una disolución de superfusión. Los registros se amplifican, se filtran (3 kHz), y se digitalizan (9 kHz). Los fEPSP amplificados y NMDA-EpSC se filtran (3 kHz), se digitalizan (15 kHz) y se miden y se representan gráficamente en línea usando el programa informático "LTP-program". Se toman mediciones de la pendiente de fEPSP entre 20 y 80 % de la amplitud pico. Las pendientes de fEPSP se normalizan con respecto al periodo de control de 30 min antes de la estimulación tetánica.

Para la inducción de la potenciación a largo plazo ("long-term potentiation", LTP), se aplican pulsos de acondicionamiento de estimulación de alta frecuencia (100 Hz; 4-5 V) a la vía colateral-comisural de Schaffer. Se realizan registros en la línea de base estable durante al menos 30 minutos antes de la aplicación de los estímulos tetánicos. Se prepara el Ap1-42 como se describe en "Método para producir agregados voluminosos sintéticos" con o sin D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) y se añade a la disolución de baño (produciendo una concentración final de Ap1-42 de 50-100 nM), 90 min antes de la inducción de LTP.

Tal como se ilustra en la figura 2, la estimulación tetánica produce una fuerte LTP bajo condiciones control. Una incubación previa con Ap1-42 50 nM agregado bajo condiciones de dilución en serie sin D-Trp-Aib provoca una fuerte inhibición de la LTP. El Ap1-4250 nM agregado tras las condiciones de "siembra" con una dilución en serie de D-Trp-Aib (concentración de partida de D-Trp-Aib = 1 |uM, concentración final de D-Trp-Aib = 0,1 nM) produce significativamente menos inhibición de LTP (ensayo de la t de Student de dos colas desapareado, p = 0,0184). Estos resultados demuestran el efecto tóxico de Ap1-42 sobre fEPSP y la correspondiente protección que surge de la administración de los agregados voluminosos sintéticos.

Tratamiento con agregados voluminosos

En el modelo de glaucoma del agutí oscuro macho, según se describió anteriormente, los agregados voluminosos no tóxicos, tales como agregados de Ap voluminosos no tóxicos sin D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), pueden aplicarse mediante inyección intravítrea para proporcionar efectos beneficiosos de larga duración sobre la disminución de la apoptosis de RGC.

Ejemplo farmacológico 3

Utilizando el modelo de glaucoma en rata indicado en el ejemplo farmacológico 1 (modelo de Morrison), se induce el glaucoma mediante la aplicación de una disolución salina hipertónica a la vena epiescleral del ojo. Esto conduce a un aumento duradero de la presión intraocular como consecuencia de la neurodegeneración asociada con Ap de las células ganglionares retinianas. Los agregados de Ap voluminosos no tóxicos limpios y exentos superficialmente de D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) (producidos como se describió anteriormente) se inyectan por vía intraocular en los ojos de las ratas y, con ello, se reduce significativamente la apoptosis inducida por Ap de células ganglionares retinianas. Otros experimentos en animales demostraron que la aplicación intermitente de D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) u otros moduladores de la agregación de Ap en intervalos de tiempo de 3 días hasta 4 semanas (e incluso más largos) protege frente a la toxicidad de Ap con la misma eficacia que un tratamiento continuo y trabajoso con varias aplicaciones diarias.

Ejemplo farmacológico 4

En otro estudio en animales con ratas glaucomatosas (procedimiento descrito anteriormente, modelo de Morrison), se aplica D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) 3 días antes de la inducción del glaucoma (una única inyección s.c.). Aunque D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) (semivida de 1-2 horas en ratas) ya no puede detectarse en el animal en el momento de la inducción del glaucoma, sí proporciona un potente efecto neuroprotector para las células ganglionares retinianas. La explicación de este descubrimiento inesperado es que el pretratamiento con D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) conduce a la formación de agregados de Ap voluminosos no tóxicos (según cabe suponer, microagregados de Ap voluminosos no tóxicos) consisten en D-Trp-Aib (SEC ID NO:30) y Ap fisiológico que permanece de modo ubicuo a bajas concentraciones. Estos agregados de Ap voluminosos no tóxicos actúan aislando el Ap tóxico después de la inducción del glaucoma, incluso aunque se libere Ap a mayores concentraciones.

La función del modulador de Ap es coherente a través de diferentes vías de aplicación, que incluyen oral, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular (incluyendo los depósitos de liberación lenta, "depot"), subconjuntival, tópica (por ejemplo, colirios, geles, implantes, lentes de contacto modificadas, etc.) y otras formulaciones farmacéuticas.

Basándose en el resultado positivo de los modelos prototípicos descritos anteriormente para las enfermedades neurodegenerativas asociadas con Ap, puede concluirse que el nuevo mecanismo neuroprotector es eficaz también en otras enfermedades asociadas con Ap, en particular la degeneración macular del ojo (AMD).

Conclusiones

En conclusión, a partir de lo anterior, es evidente que la presente invención proporciona aplicaciones nuevas, valiosas y sorprendentes y usos para las sustancias en los métodos de la presente invención, así como nuevas composiciones farmacéuticas de estas, que poseen las anteriores características y ventajas enumeradas más específicamente.

El mayor orden de actividad de los métodos descritos para usar las sustancias activas de la presente invención y sus composiciones, según se evidencia por los ensayos presentados, es indicativo de utilidad. Sin embargo, no se ha completado la evaluación clínica en seres humanos. Se entenderá claramente que la distribución y comercialización de cualquier sustancia o composición que se encuentre dentro del alcance de la presente invención para un uso en seres humanos por supuesto debe implicar la aprobación previa por las agencias gubernamentales, tales como U.S. Federal Food and Drug Administration, que son responsables para pronunciarse sobre estas cuestiones y autorizarlas.

Las composiciones farmacéuticas representativas preparadas mezclando opcionalmente la sustancia activa con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado incluyen comprimidos, cápsulas, disoluciones para inyección, formulaciones orales líquidas, formulaciones en aerosol, formulaciones de TDS, y formulaciones de nanopartículas, para producir así medicamentos para un uso oral, inyectable o tópico, también según lo anterior.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. - Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos D-Trp-Aib (SEC ID NO:30), para su uso en la prevención y/o el tratamiento del glaucoma en un sujeto que lo necesita, en el que dicho péptido se administra a diario durante un primer periodo de al menos un (1) día en al menos una dosis terapéuticamente eficaz, seguido de un segundo periodo de al menos una (1) semana en la que el péptido no se administra, seguido de la repetición de dicho primer periodo durante al menos un (1) día en el que dicho péptido se administra a diario.

2. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que la administración de la dosis terapéuticamente eficaz del péptido durante el primer periodo continúa durante al menos una semana o durante un mes como máximo.

3. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el segundo periodo es de al menos un (1) mes, o al menos 2 meses.

4. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el segundo periodo es de 3 meses como máximo, o de 6 meses como máximo, o de 1 año como máximo.

5. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el segundo periodo es de tres (3) a seis (6) meses.

6. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en forma de varias dosis individuales administradas dentro de un periodo de tiempo que consiste en uno (1) o más días.

7. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra a diferentes potencias de dosis seleccionadas de un ajuste ascendente o descendente de la dosis.

8. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en una formulación de liberación inmediata.

9. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, se administra en una formulación de liberación modificada.

10. - El péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido se administra en combinación en el primer y/o segundo periodo con una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un agente farmacéutico adicional que es eficaz para tratar o prevenir al menos un trastorno óptico, en el que dicho al menos un agente farmacéutico adicional se selecciona de acetazolamida, diclofenamida, carteolol, timolol, metipranolol, betaxolol, pindolol, levobunolol, brimonidina, clonidina, pilocarpina, carbacol, dipivefrina, apraclonidina, brinzolamida, dorzolaminda, bimatoprost, travaprost, latanoprost, clortetraciclina, ciprofloxacina, ofloxacina, ácido fusidínico, gentamicina, kanamicina, levofloxacina, lomefloxacina, oxitetraciclina, natamicina, azidanfenicol, cloranfenicol, tobramicina, eritromicina, polimixina-B, acaclovir, trifluridina, betametasona, dexametasona, fluorometolona, hidrocortisona, prednisolona, rimexolona, cromoglicato, azelastina, lodoxamida, emedastina, nedocromilo, levocabastina, olopatadina, cetotifeno, hipromelosa, carbómero, hialuronato, carmelosa, hipromelosa, povidona, hietelosa, poli(alcohol vinílico), dexpantenol, tetrizolina, troxerutina, tramazolina, nafazolina, xilometazolina, fenilefrina y antazolina.