ES2308971T3 - Reovirus para el tratamiento de transtornos poliferaticos celulares. - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad eficaz de un reovirus recombinante obtenida a partir de dos o más tipos de reovirus con fenotipos patogénicos diferentes, de manera que el reovirus recombinantes contiene diferentes determinantes antigénicos obtenidos de los dos o más virus de diferente fenotipo patogénico para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno proliferativo mediado por el ras en un mamífero en unas condiciones que dan lugar a la lisis sustancial de las células proliferantes.

Description

Reovirus para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares.

Fundamento de la invención Campo de la invención

La presente invención concierne al uso del reovirus recombinante tal como se enumera en la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar los trastornos proliferativos mediados por el protoncogén Ras en un mamífero.

Referencias

Las siguientes publicaciones, solicitudes de patentes y patentes se mencionan en esta solicitud:

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Última tecnología

La proliferación celular normal es regulada por un equilibrio entre los protoncogenes que promueven el crecimiento y los genes oncoinhibidores que impiden el crecimiento. La oncogenia puede ser causada por alteraciones genéticas en el genoma que producen la mutación de aquellos elementos celulares que rigen la interpretación de las señales celulares, como la potenciación de la actividad protoncogénica o la inactivación de la oncoinhibición. Se cree que la interpretación de estas señales influye definitivamente en el crecimiento y la diferenciación de una célula, y que la mala interpretación de estas señales puede dar lugar al crecimiento neoplásico (neoplasia).

Se cree que la alteración genética del protoncogén Ras contribuye aproximadamente un 30% en todos los tumores (Wiessmuller, L., y Wittinghofer, F. (1994), Celular Signaling 6(3):247-267; Barbacid, M (1987) A Rev. Biochem. 56, 779-827). El papel que tiene el Ras en la patogénesis de los tumores humanos es específico del tipo de tumor. En la mayoría de tumores malignos humanos se encuentran mutaciones en el propio Ras, y se encuentran muy representados en el cáncer pancreático (80%), en los carcinomas colorrectales esporádicos (40-50%), en los adenocarcinomas pulmonares humanos (15-24%), en los tumores tiroideos (50%) y en la leucemia mieloidea (30%) (Mills, NE y cols. (1995) Cancer Res, 55:1444; Chaubert, P. y cols. (1994). Am. J. Path. 144:767: Bos, J. (1989) Cancer Res. 49:4682). La activación del Ras se ha demostrado también en los elementos de señalización mitogéna retrógrada, en particular por las cinasas receptoras de la tirosina (RTKs). Estos elementos retrógrados, si se amplifican o sobremanifiestan, dan lugar en definitiva a una elevada actividad del Ras por la actividad de transducción de la señal del Ras. Los ejemplos de esto incluyen la hiperexpresión de PDGFR en ciertas formas de gliobastomas, así como en c-erbB-2/neu en el cáncer de mama (Levitzki, A. (1994) Eur. J. Biochem. 226:1; James, P.W., et al.(1994) Oncogene 9:3601; Bos, J. (1989) Cancer Res. 49:4682).

Los métodos corrientes de tratamiento para la neoplasia incluyen cirugía, quimioterapia y radiación. La cirugía se utiliza habitualmente como el principal tratamiento para los estadios prematuros del cáncer; sin embargo, muchos tumores no pueden ser extirpados por completo por un medio quirúrgico. Además, el crecimiento metastático de los neoplasmas puede impedir la cura completa del cáncer por cirugía. La quimioterapia implica la administración de compuestos que presentan una actividad antitumoral, como los agentes alquilantes, antimetabolitos y antibióticos antitumorales. La eficacia de la quimioterapia a menudo se ve limitada por unos graves efectos secundarios, que incluyen las náuseas, los vómitos, la depresión de la médula ósea, la lesión renal, y la depresión del sistema nervioso central. La terapia de la radiación se basa en una mayor capacidad de las células normales, en contraste con las células neoplásicas, para repararse ellas mismas después del tratamiento con la radiación. No obstante, la radioterapia no puede ser utilizada para tratar muchos neoplasmas, debido a la sensibilidad del tejido que rodea el tumor. Además, ciertos tumores han mostrado resistencia a la radioterapia y ello puede depender del estado oncogénico o antioncogénico de la célula (Lee, J.M. y cols (1993) PNAS 90:5742-5746; Lowe, S.W. y cols. (1994) Science, 266:807-810; Raybaud-Diogene, H. y cols. (1997) J. Clin. Oncology, 15(3):1030-1038). En Science vol. 282, 1998,1332-4 se revela el uso del reovirus en el tratamiento de tumores en ratones. A la vista de los inconvenientes asociados al medio habitual para el tratamiento del crecimiento neoplásico, todavía existe la necesidad de mejores métodos para el tratamiento de la mayoría de tipos de cánceres.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de un reovirus tal como se define en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno proliferativo mediado por el Ras en un mamífero perteneciente al grupo de perros, gatos, ovejas, cabras, terneros, caballos, cerdos, humanos y primates no humanos, donde el virus se administra a las células proliferantes en una cantidad eficaz en unas condiciones que dan lugar a la lisis sustancial de las células proliferantes. El reovirus puede ser un reovirus característico de los mamíferos o aviar. El reovirus puede haber sido modificado de manera que se haya extraído el cápside externo, el virión se encuentre envuelto en un liposoma o micela o bien se hayan mutado las proteínas del cápside externo. El reovirus puede ser administrado en una sola dosis o en múltiples dosis. El trastorno proliferativo puede ser un neoplasma. Los neoplasmas sólidos y hematopoyéticos pueden ser dirigidos.

También se ha propuesto el uso de un reovirus tal como se ha definido en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma mediado por el Ras en un ser humano, donde el reovirus se administra al neoplasma en una cantidad suficiente para dar una oncolisis sustancial de las células neoplásicas.

También se ha propuesto el uso de un reovirus tal como se ha definido en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para inhibir la metástasis de un neoplasma en un mamífero, donde el reovirus se administra al mamífero en una cantidad suficiente para producir la lisis sustancial de las células neoplásicas.

También se ha propuesto el uso de un reovirus tal como se ha definido en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar un posible neoplasma mediado por el Ras en un mamífero, donde básicamente todo el neoplasma es extirpado quirúrgicamente y el virus es administrado en una cantidad eficaz en o cerca del punto quirúrgico dando lugar a la oncolisis de cualquier célula neoplásica remanente.

Otras configuraciones de la invención son tal como se indican en las reivindicaciones.

Las composiciones farmacéuticas de la invención proporcionan un medio eficaz para tratar la neoplasia, sin los efectos secundarios asociados a otras formas de la terapia del cáncer. Además, debido a que se sabe que el reovirus no está asociado a la enfermedad, se reducen a un mínimo todas las cuestiones de seguridad asociadas a la administración deliberada de un virus.

Lo mencionado y otros objetivos, características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción más precisa de las configuraciones preferidas de la invención, tal como lo indican los dibujos adjuntos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 es una representación de la base molecular de la oncolisis del reovirus, en la cual el reovirus usurpa la célula huésped Ras que señala la vía.

Figura 2 es una representación gráfica de los efectos en el tiempo del serotipo 3 activo (círculos abiertos) o inactivado (círculos cerrados) del reovirus (cepa Dearing) en el tamaño de los tumores THC-11 murinos que crecen en los ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Los valores representados equivalen a la media de la medición junto con el error estándar de la media.

Figura 3 es una representación gráfica de los efectos en el tiempo del serotipo 3 activo (círculos abiertos) o inactivado (círculos cerrados) del reovirus (cepa Dearing) en el tamaño de los xenoinjertos U-87 del glioblastoma humano que crece en los ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Los valores representados equivalen a la media de la medición junto con el error estándar de la media.

Figura 4 es una representación gráfica de los efectos en el tiempo del serotipo 3 del reovirus activo (círculos abiertos, cuadrados abiertos) o inactivado (círculos cerrados, cuadrados cerrados) del reovirus (cepa Dearing) en el tamaño de los xenoinjertos U-87 del glioblastoma humano bilateral inyectado/tratado (círculos abiertos y cerrados) o no tratado (cuadrados abiertos y cerrados) que crece en los ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Los valores representados equivalen a la media de la medición junto con el error estándar de la media.

Figura 5 es una representación gráfica de los efectos en el tiempo del serotipo 3 activo (círculos abiertos) o inactivado (círculos cerrados) del reovirus (cepa Dearing) en el tamaño de los tumores de ratón C3H de células transformadas en los ratones C3H inmunocompetentes.

Figura 6 es una representación gráfica de los efectos en el tiempo del serotipo 3 activo (círculos abiertos) o inactivado (círculos cerrados) del reovirus (cepa Dearing) en el tamaño de los tumores de ratón C3H de células transformadas que crecen en los ratones C3H inmunocompetentes previamente expuestos (cuadrados abiertos) o no expuestos (círculos abiertos) al reovirus.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere al uso de un reovirus tal como se define en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno proliferativo mediado por el Ras en un mamífero.

El nombre reovirus (virus huérfano respiratorio y entérico) es un acrónimo descriptivo que sugiere que estos virus, aunque no se asocian a ninguna enfermedad conocida en los humanos, se pueden aislar tanto del tracto respiratorio como del entérico (Sabin, A.B. (1959), Science 130:966). El término "reovirus" se refiere a todos los virus clasificados en el género reovirus.

Los reovirus son virus con un genoma del ARN segmentado, de cadena doble. Los viriones miden de 60 a 80 nm de diámetro y poseen dos cubiertas externas concéntricas, cada una de las cuales es icosahédrica. El genoma consiste en un ARN de doble cadena con 10-12 segmentos discretos y un tamaño total de genoma de 16-27 kbp. Los segmentos individuales de ARN varían en tamaño. Se han recuperado tres tipos de reovirus distintos pero relacionados de diferentes especies. Los tres tipos comparten un antígeno común que fija el complemento.

El reovirus humano consta de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o T1L), tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos son fácilmente identificables sobre la base de ensayos de neutralización y de inhibición de la hemaglutinina (Sabin, A.B. (1959), Science 130:966; Fields, B.N. y cols. (1996). Fundamental Virology, 3rd Edition, Lippincott-Raven; Rosen L. (1960) Am. J. Hyg. 71:242; Stanley, N.F. (1967) Br. Med. Bull. 23: 150).

Aunque el reovirus no se sabe que esté asociado a ninguna enfermedad en particular, muchas personas han estado expuestas al reovirus hasta que llegan a la edad adulta (es decir, menos del 25% en niños <5 años a más del 50% en personas de 20-30 años de edad (Jackson G.G. y Muldoon R.L. (1973) J. Infect. Dis. 128:811; Stanley N.F. (1974) In: Comparative Diagnosis of Viral Diseases, editado por Kurstak y K. Kurstak, 385-421, Academia Press, New York).

Para los reovirus de mamíferos, la señal de reconocimiento de la superficie celular es el ácido siálico (Amstrong, G.D. y cols. (1984) Virology 138:37; Gentsch, J.R.K. y Pacitti, A.F. (1985), J. Virol. 56:356; Paul R.W. y cols. (1989) Virology 172:382-385). Debido a la naturaleza ubicua del ácido siálico, el reovirus se une eficazmente a una multitud de estirpes celulares y como tal puede dirigirse a una multitud de tejidos diferentes; sin embargo, existen diferencias significativas en la susceptibilidad a la infección por reovirus entre las estirpes celulares.

Tal como aquí se describe, los solicitantes han descubierto que las células que resisten la infección por el reovirus son sensibles a la infección por el reovirus cuando son transformadas por un gen en la vía del Ras. La "resistencia" de las células a la infección por el reovirus indica que la infección de las células con el virus no daba lugar a una producción vírica significativa. Las células que son "sensibles" son aquellas que demuestran una inducción de los efectos citopáticos, la síntesis vírica de proteínas, y/o la producción de virus. La resistencia a la infección por el reovirus resultaba ser del nivel del traslado genético, antes que en una transcripción prematura: mientras se producían transcritos víricos, las proteínas víricas no mostraban expresión alguna. Sin limitarse a una teoría, se piensa que la transcripción del gen vírico en las células resistentes se correlacionaba con la fosforilación de una proteína celular de aproximadamente 65 kDa, definida para ser una proteína cinasa activada por el ARN de doble cadena (PKR), que no se observaba en las células transformadas. La fosforilación de la PKR llevaba a la inhibición del traslado. Cuando la fosforilación era eliminada por la 2-aminopurina, un conocido inhibidor de la PKR, se producía el incremento drástico de la síntesis proteínica del reovirus en las células no transformadas. Además, un modelo de ratón con grave inmunodeficiencia combinada (SCID) en el cual los tumores se creaban en los flancos traseros izquierdo y derecho revelaba que el reovirus reducía de forma significativa el tamaño del tumor cuando se inyectaba directamente en el tumor del lado derecho; además, la reducción significativa en el tamaño del tumor también se observaba en el tumor del lado izquierdo al que no se había inyectado directamente el reovirus, lo que indicaba que la capacidad oncolítica del reovirus era sistémica además de local.

Estos resultados indicaban que el reovirus utiliza la maquinaria de la vía del Ras de la célula huésped para descender la PKR y así producirla. La figura 1 muestra la usurpación de la vía que señala el Ras de la célula huésped por el reovirus. Tal como se observa en la figura 1, tanto para las células no transformadas (resistentes al reovirus) como para las células transformadas por el Ras, Sos o EGFR (sensibles al reovirus), el enlace vírico, la interiorización, el no recubrimiento y la transcripción prematura de los genes víricos se llevaban a cabo de una forma normal. En el caso de células no transformadas, las estructuras secundarias en los transcritos víricos prematuros estimulan inevitablemente la fosforilación de la PKR, activándola, llevando a la fosforilación del factor de iniciación del traslado elF-2\alpha, y de ahí a la inhibición del traslado del gen vírico. En el caso de células transformadas por EGFR, Sos o Ras, la etapa de fosforilación de la PKR es obstaculizada o invertida por el Ras o uno de sus elementos en dirección 3, garantizando con ello el traslado del gen vírico. La acción del Ras (o de un elemento en dirección 3) puede ser imitada por el uso de la 2-aminopurina (2-AP), que promueve el traslado del gen vírico (y de ahí la infección por el reovirus) en las células no transformadas por la fosforilación de la PKR bloqueante.

La implantación de células tumorales humanas en los ratones con SCID se conoce como un sistema modelo bien conocido para verificar la efectividad de varios agentes antitumorales en los seres humanos. Con anterioridad se ha demostrado que los productos farmacéuticos eficaces contra los tumores humanos implantados en ratones con SCID pueden predecir su efectividad contra los mismos tumores en los seres humanos.

En base a estos descubrimientos, los solicitantes han desarrollado composiciones para tratar los trastornos proliferativos mediados por el Ras en los mamíferos. Los mamíferos representativos incluyen perros, gatos, ovejas, cabras, caballos, cerdos, primates no humanos y seres humanos. En una configuración preferida, el mamífero es un ser humano.

El reovirus es administrado a células mediadas por el Ras que proliferan en el mamífero. Los tipos representativos del reovirus humano que se pueden utilizar incluyen el tipo 1 (Por ejemplo, cepa Lang o TL1); tipo 2 (por ejemplo, cepa Jones o T2J); y tipo 3 (por ejemplo, cepa Dearing o cepa Abney, T3D o T3A); también se pueden utilizar otras cepas de reovirus. En una configuración preferida, el reovirus es reovirus humano serotipo 3, más preferiblemente, el reovirus es reovirus humano serotipo 3, cepa Dearing. Alternativamente, el reovirus puede ser un reovirus mamífero no humano (por ejemplo, reovirus de primate no humano; como el reovirus de babuino; equino; o reovirus canino), o bien un reovirus no mamífero (por ejemplo, reovirus aviar). Se puede utilizar una combinación de diferentes serotipos y/o diferentes cepas e reovirus, como reovirus de diferentes especies de animales.

El reovirus puede ser de aparición natural o modificada. El reovirus es de "aparición natural" cuando puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado de forma intencionada por los seres humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente de campo", es decir, proceder de un paciente humano.

El reovirus puede ser modificado pero seguir siendo capaz de infectar en una reacción lítica una célula mamífera que tiene una vía de Ras activa. El reovirus puede ser pretratado química o bioquímicamente, por ejemplo, por tratamiento con una proteasa, como la quimotripsina o la tripsina) previamente a la administración a las células proliferantes. El pretratamiento con una proteasa extrae la capa exterior o el cápside del virus y puede incrementar la capacidad infecciosa del virus. El reovirus puede estar revestido de una liposoma o micela (Chandron and Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein mu1 y mu1C is blocked by alkyl sulfat detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology 72(1):467-75 (1998)) para reducir o impedir una respuesta inmunitaria de un mamífero que ha desarrollado una inmunidad frente al reovirus. Por ejemplo, el virión puede ser tratado con quimotripsina en presencia de micelas formando concentraciones de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva partícula subvirión infecciosa.

En la presente invención, el reovirus es un reovirus recombinante de dos o más tipos de reovirus con diferentes fenotipos patógenos, de manera que contiene diferentes determinantes antigénicos que reducen o impiden una respuesta inmunitaria por parte de un mamífero previamente expuesto a un subtipo de reovirus. Dichos viriones recombinantes pueden ser generados por la co-infección de células mamíferas con diferentes subtipos de reovirus con la incorporación resultante de diferentes proteínas de revestimiento a los cápsides del virión resultante.

El reovirus puede ser modificado por la incorporación de proteínas de revestimiento mutadas, como por ejemplo \sigma1, al cápside externo del virión. Las proteínas pueden ser mutadas por sustitución, inserción o cancelación. La sustitución incluye la inserción de diferentes aminoácidos en el lugar de los aminoácidos nativos. Las inserciones incluyen la inserción de residuos aminoácidos adicionales en la proteína en uno o más lugares. Las cancelaciones incluyen anulaciones de uno o más residuos de aminoácidos en la proteína. Dichas mutaciones pueden ser generadas por métodos conocidos. Por ejemplo, la mutagénesis del gen dirigida al punto del oligonucleótido que codifica una de las proteínas revestidas podría dar lugar a la generación de la proteína de revestimiento mutante deseada. La expresión de las proteínas mutadas en las células mamíferas infectadas por el reovirus in vitro como las células COS1 dará lugar a la incorporación de la proteína mutada a la partícula de virión del reovirus (Turner y Duncan, "Site directed mutagénesis of the C-terminal portion of reovirus protein sigmal: evidence for a conformation-dependent receptor binding domain" Virology 186(1):219-27 (1992); Duncan et al., "Conformational and functional análisis of the C-terminal globular head of the reovirus cell attachment protein" Virology 182(2):810-9 (1991); Mah y cols., "The N-terminal quarter of reovirus cell attachment protein sigma 1 possesses intrinsic virion-anchoring function" Virology 179(1):95-103 (1990)).

El reovirus es preferiblemente un reovirus modificado para reducir o eliminar una reacción inmunitaria al reovirus. Dichos reovirus modificados se denominan "reovirus inmunoprotegidos". Dichas modificaciones podrían incluir el envasado del reovirus en un liposoma, una micela u otro vehículo para enmascarar el reovirus del sistema inmunitario mamífero. Alternativamente, el cápside externo de la partícula viral del reovirus puede ser retirado ya que las proteínas presentes en el cápside externo son el principal determinante de las respuestas celulares.

Un "trastorno proliferativo" es cualquier desorden celular en el cual las células proliferan más rápidamente que el crecimiento normal del tejido. Por consiguiente, una "célula proliferante" es una célula que prolifera más rápidamente que las células normales. El trastorno proliferativo incluye pero no se limita a los neoplasmas. Un neoplasma en un crecimiento anormal del tejido, que generalmente forma una masa distinta, que crece por proliferación celular más rápidamente que el crecimiento normal del tejido. Los neoplasmas presentan una ausencia total o parcial de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal. Se pueden clasificar mayoritariamente en tres tipos principales. Los neoplasmas malignos que proceden de las estructuras epiteliales y se denominan carcinomas, los neoplasmas malignos que se originan a partir de tejidos conjuntivos como los músculos, cartílagos, grasas o huesos denominados sarcomas, y los tumores malignos que afectan a las estructuras hematopoyéticas (estructuras que conciernen a la formación de células sanguíneas) que incluyen componentes del sistema inmunitario, se denominan leucemias y linfomas. Un tumor es el crecimiento neoplásico de la enfermedad del cáncer. Tal como aquí se utiliza, un "neoplasma", conocido también como un "tumor", pretende englobar los neoplasmas hematopoyéticos así como los neoplasmas sólidos. Otros trastornos proliferativos incluyen pero no se limitan a la neurofibromatosis.

Al menos algunas de las células del trastorno proliferativo presentan una mutación en la cual el gen Ras (o un elemento de la vía que señala el Ras) se activa, directa (por ejemplo, por una mutación activante en Ras) o indirectamente (por ejemplo, por activación de un elemento en dirección 5 en la vía del Ras). La activación de un elemento en dirección 5 en la vía Ras incluye, por ejemplo, la transformación con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o Sos. Un trastorno proliferativo que da lugar, al menos en parte, por la activación del Ras, a un elemento en dirección 5 del Ras, o bien se hace referencia aquí a un "trastorno proliferativo mediado por el Ras" si se trata de un elemento en la vía de señalización del Ras.

Un neoplasma que es particularmente sensible al tratamiento por los métodos de la invención es el cáncer pancreático, debido a la prevalencia de los neoplasmas mediados por el Ras asociados al cáncer pancreático. Otros neoplasmas que son especialmente sensibles al tratamiento por los métodos de la invención incluyen el cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central (por ejemplo, neuroblastoma y glioblastoma), cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer adrenal, cáncer hepático, linfoma y leucemia. Un trastorno proliferativo que es especialmente sensible al tratamiento por los métodos de esta invención incluye la neurofibromatosis 1 debido a la activación de la vía del Ras.

La "administración a una célula proliferante o neoplasma" indica que el reovirus es administrado de manera que entra en contacto con las células proliferantes o del neoplasma (aquí llamadas "células neoplásicas"). La vía por la cual se administra el reovirus, así como la fórmula, el soporte o el vehículo, dependerán de la localización así como del tipo de neoplasma. Se pueden emplear una amplia variedad de vías de administración. Por ejemplo, para un neoplasma sólido que es accesible, el reovirus puede ser administrado mediante inyección directa en el neoplasma. Para un neoplasma hematopoyético, por ejemplo, el reovirus puede ser administrado por vía intravenosa o intravascular. Para los neoplasmas que no son fácilmente accesibles en el cuerpo, como las metástasis o los tumores cerebrales, el reovirus se administra de manera que puede ser transportado de forma sistémica a través del cuerpo del mamífero y de ese modo llegar al neoplasma (por ejemplo, por vía intratecal, intravenosa o intramuscular). De un modo alternativo, el reovirus puede ser administrado directamente a un neoplasma sólido único, donde luego se transportará de forma sistémica a través del cuerpo a las metástasis. El reovirus puede ser administrado por vía subcutánea, intraperitoneal, tópica (por ejemplo, para el melanoma), oral (por ejemplo, para el neoplasma oral o esofágico), rectal (por ejemplo, para el neoplasma colorrectal), vaginal (por ejemplo, para el neoplasma cervical o vaginal), nasal o por spray de inhalación (por ejemplo, para el neoplasma pulmonar).

El reovirus se puede administrar por vía sistémica a los mamíferos comprometidos desde el punto de vista inmunitario o bien que no han desarrollado una inmunidad frente a los epítopos del reovirus. En dichos casos, el reovirus administrado sistémicamente, por ejemplo, por inyección intravenosa, contactará con las células proliferantes produciendo la lisis de las células.

Los mamíferos inmunocompetentes previamente expuestos a un subtipo de reovirus pueden haber desarrollado una inmunidad celular o humoral a este subtipo de reovirus. Sin embargo, se ha descubierto que la inyección directa del reovirus en un tumor sólido en los mamíferos inmunocompetentes produce la lisis de las células.

Por otro lado, cuando el reovirus se administra de forma sistémica a mamíferos inmunocompetentes, los mamíferos pueden producir una respuesta inmunitaria al reovirus. Dicha respuesta inmunitaria se puede evitar si el reovirus es de un subtipo hacia el cual el mamífero no ha desarrollado inmunidad o bien el reovirus se ha modificado de manera que se ha inmunoprotegido, por ejemplo, por la digestión de la proteasa del cápside externo o el envasado en una micela.

Alternativamente, se ha contemplado en principio que la inmunocompetencia del mamífero ante el reovirus puede ser suprimida mediante la administración conjunta de fármacos conocidos y capaces de inhibir el sistema inmunitario en general (Cuff y cols., "Enteric reovirus infection as a probe to study inmunotoxicity of the gastrointestinal tract" Toxicological Sciences 42(2):99-108 (1998)) o de forma alternativa con la administración de anticuerpos anti-antireovirus. La inmunidad humoral del mamífero frente al reovirus puede verse reducida o abolida temporalmente por la administración intravenosa de inmunoglobulina no específica.

Se observa que el reovirus se puede administrar a mamíferos inmunocompetentes inmunizados frente al reovirus junto con la administración de anticuerpos anti-antireovirus. "Anticuerpos anti-antireovirus" son anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos anti-reovirus. Dichos anticuerpos pueden fabricarse siguiendo métodos conocidos. Ver por ejemplo "Anticuerpos: Un manual del laboratorio" E. Harlow y D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Dichos anticuerpos antireovirus se pueden administrar antes, al mismo tiempo o justo después de la administración del reovirus. Preferiblemente se administra una cantidad efectiva de anticuerpo anti-antireovirus durante tiempo suficiente para reducir o eliminar una respuesta inmunitaria por parte del mamífero al reovirus administrado.

El término "lisis sustancial" significa que al menos un 10% de las células proliferantes son lisadas, más preferiblemente un 50% y más preferiblemente al menos un 75% de las células son lisadas. El porcentaje de lisis puede ser determinado para las células tumorales midiendo la reducción en el tamaño del tumor en el mamífero o bien la lisis de las células tumorales in vitro.

Un "mamífero que se sospecha que presenta un trastorno proliferativo" significa que el mamífero puede tener un tumor o trastorno proliferativo o bien que se le ha diagnosticado un tumor o trastorno proliferativo o bien ha sido previamente diagnosticado con un tumor o trastorno proliferativo, se ha extirpado quirúrgicamente el tumor o prácticamente todo el tumor y se sospecha que el mamífero alberga algunas células tumorales residuales.

Esta invención incluye también las composiciones farmacéuticas que contienen, como el principio activo, uno o más de los reovirus asociados con "portadores o excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico". Al preparar las composiciones de esta invención, el principio activo/reovirus se mezcla normalmente con un excipiente, se diluye mediante un excipiente o se encierra en dicho portador que puede presentarse en forma de cápsula, bolsa, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico sirve como diluyente, se puede presentar en estado sólido, semi-sólido o líquido, actuando como un vehículo, soporte o medio para el principio activo. Por consiguiente, las composiciones se pueden presentar en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, pastillas, bolsitas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), pomadas que contienen, por ejemplo, hasta un 10% en peso de compuesto activo, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos envasados de forma estéril.

Algunos ejemplos de los excipientes apropiados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe y celulosa de metilo. Las fórmulas pueden incluir además: agentes lubricantes como el talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; conservantes como los benzoatos de metilo e hidroxipropilo; endulzantes y aromatizantes. Las composiciones de la invención se pueden formular para permitir para permitir la liberación rápida, mantenida o retardada del principio activo después de su administración al paciente empleando procedimientos conocidos.

Para preparar las composiciones sólidas como los comprimidos, el principio activo/reovirus principal se mezcla con un excipiente farmacéutico hasta formar una composición sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención. Al referirnos a estas composiciones de preformulación como mezclas homogéneas, significa que el principio activo se dispersa por toda la composición de manera que ésta se subdivide fácilmente en formas de dosificación igualmente eficaces como comprimidos, pastillas y cápsulas.

Los comprimidos o las pastillas o píldoras de la presente invención pueden estar revestidos o bien compuestos de algún medio que permita una forma de dosificación de acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido puede constar de un componente de dosificación interno y externo, estando este último en forma de envuelta sobre el anterior. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o se retarde su liberación. Se pueden utilizar una variedad de materiales para las capas o revestimientos entéricos, que incluirán una serie de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con dichos materiales como lacas, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

Las formas líquidas a las cuales se pueden incorporar las composiciones nuevas de la presente invención para la administración por vía oral o por inyección incluyen soluciones acuosas, jarabes adecuadamente aromatizados, suspensiones en agua o aceite, y emulsiones aromatizadas con aceites comestibles como aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares.

Las composiciones para la inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos o orgánicos aceptables desde el punto de vista farmacéutico, o bien mezclas de los mismos y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico tal como los aquí descritos. Preferiblemente las composiciones se administran por vía oral o por vía respiratoria nasal para el efecto local o sistémico. Las composiciones en los disolventes preferiblemente aceptables desde el punto de vista farmacéutico pueden estar nebulizadas por el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden ser inhaladas directamente por el dispositivo nebulizante o el dispositivo nebulizante se puede acoplar a una mascarilla de quirófano o a una máquina de respiración de presión positiva intermitente. La solución, suspensión o las composiciones en polvo se pueden administrar, preferiblemente por vía oral o nasal, por dispositivos que administren la dosis de forma apropiada.

Otra formulación preferida empleada en los métodos de la presente invención emplea dispositivos para el suministro transdérmico ("parches"). Dichos parches transdérmicos se pueden usar para permitir la infusión continua o discontinua del reovirus de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y el uso de parches transdérmicos para el suministro de agentes farmacéuticos es bien conocido. Ver, por ejemplo, la patente 5.023.252, que aquí se incorpora por referencia. Dichos parches pueden ser creados para el suministro continuo, pulsátil o por demanda de los agentes farmacéuticos.

Otras fórmulas adecuadas para su uso en la presente invención se pueden hallar en Remington's Pharmaceutical Sciences.

El reovirus o la composición farmacéutica que comprende el reovirus puede ser envasada en los paquetes adecuados que disponen del material necesario para el envasado en los recipientes adecuados. Se ha observado que los paquetes pueden incluir también antineoplásicos y/o anticuerpos anti-antireovirus.

El reovirus es administrado en una cantidad que es suficiente para tratar el trastorno proliferativo (por ejemplo, una "cantidad eficaz"). Un trastorno proliferativo se "trata" cuando la administración del reovirus a las células proliferantes da lugar a la lisis de las células proliferantes. Esto puede dar lugar a una reducción en el tamaño del neoplasma, o bien una eliminación completa del neoplasma. La reducción en el tamaño del neoplasma o la eliminación del neoplasma es causada generalmente por la lisis de las células neoplásicas ("oncolisis") por el reovirus. Preferiblemente, la cantidad eficaz es aquella cantidad capaz de inhibir el crecimiento de las células tumorales. Preferiblemente, la cantidad eficaz oscila entre 1,0 pfu/kg de peso corporal y 10^{15} pfu/kg de peso corporal, más preferiblemente entre 10^{2} pfu/kg peso corporal y 10^{13} pfu/kg de peso corporal. Por ejemplo, para el tratamiento de un humano, aproximadamente se pueden usar 10^{2} a 10^{17} unidades de formación de placas del reovirus (PFU), dependiendo del tipo, tamaño y número de tumores presentes. La cantidad eficaz se determina sobre una base individual y se puede basar, al menos en parte, en la consideración del tipo de reovirus; la vía de administración elegida, el tamaño, la edad, el sexo del individuo; la gravedad de los síntomas del paciente; el tamaño y otras características del neoplasma y similares. La evolución de la terapia puede durar desde varios días a varios meses o hasta que se consiga reducir la enfermedad.

El reovirus puede ser administrado en una dosis única, o en múltiples dosis (es decir, más de una dosis). Las dosis múltiples pueden administrarse simultáneamente o de forma consecutiva (por ejemplo, durante un periodo de días o semanas). El reovirus también se puede administrar a más de un neoplasma en el mismo individuo.

Las composiciones se formulan preferiblemente en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosis entre 10^{2} pfus y 10^{13} pfus de reovirus. El término "formas de dosificación unitarias" se refiere a unidades discretas físicamente, adecuadas como dosis unitarias para seres humanos y otros mamíferos, conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada de reovirus que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado, junto a un excipiente farmacéutico apropiado.

Se ha descubierto que el reovirus es eficaz para el tratamiento de los neoplasmas sólidos en los mamíferos inmunocompetentes. La administración de reovirus no modificado directamente en el neoplasma da lugar a la oncolisis de las células neoplásicas y a una reducción en el tamaño del tumor.

Se ha observado que el reovirus puede ser administrado junto con una cirugía o extirpación del neoplasma. Por lo tanto, se dispone de métodos para el tratamiento de un neoplasma sólido que comprenda la extirpación quirúrgica del neoplasma y la administración de un reovirus en o cerca de la localización del neoplasma.

Se ha observado que el reovirus puede ser administrado junto con o además de la terapia de la radiación.

Se ha observado que el reovirus de la presente invención puede ser administrado junto o con compuestos antineoplásicos. Los agentes antineoplásicos son compuestos que pueden inhibir el crecimiento de los tumores. Dichos agentes incluyen pero no se limitan al 5-fluorouracilo, la mitomicina C, el metotrexato, la hidroxiurea, la ciclofosfamida, dacarbazina, mitoxantrona, antraciclina (Epirubicina y DOxorubicina), anticuerpos a los receptores, como la herceptina, etopsida, pregnasoma, compuestos de platino como el carboplatino y el cisplatino, taxanos como el taxol y taxóteros, terapias hormonales como el tamoxifeno y anti-estrógenos, interferones, inhibidores de aromatasa, agentes progestacionales y análogos del LHRH.

Preferiblemente, el reovirus se administrará en ausencia de 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU). Por ejemplo, el 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU) no es administrado al mamífero ni antes, ni durante ni después de que el mamífero reciba el reovirus.

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Utilidad

Los reovirus de la presente invención se pueden utilizar para tratar los trastornos proliferativos mediados por el Ras en un mamífero, para reducir o eliminar las metástasis, para tratar las metástasis. Pueden ser utilizados junto con tratamientos conocidos para el cáncer que incluyen la cirugía, quimioterapia y radiación.

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Ejemplos aportados con fines informativos

En los ejemplos siguientes, todas las temperaturas están en grados Celsius (a menos que se indique lo contrario) y todos los porcentajes son porcentajes en peso (a menos que se indique lo contrario).

En los ejemplos siguientes, las abreviaciones siguientes tienen el significado siguiente. Si no se define una abreviación, es que tiene el significado en general aceptado:

\muM= micromolar

mM= milimolar

M = molar

ml= mililitro

\mul= microlitro

mg= miligramo

\mug= microgramo

PAGE= electroforesis de gel de poliacrilamida

rpm= revoluciones por minuto

FBS= suero bovino fetal

DTT= ditiotreitol

SDS= dodecilsulfato sódico

PBS= solución salina tamponada de fosfato

DMEM= medio de Tagle modificado de Dulbecco

\alpha-MEM= medio de Tagle alfa-modificado

\beta-ME= beta-mercaptoetanol

MOI= multiplicidad de la infección

PFU= unidades que forman placas

MAPK= cinasa de MAP

phosph-MAPK= cinasa de MAP fosforilada

HRP= peroxidasa de rábano picante

PKR= cinasa proteínica activada por ARN de cadena doble

RT-RCP= reacción en cadena de la trascriptasa-polimerasa invertida

GAPDH= Glíceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa

EGFR= receptores del factor de crecimiento epidérmico

MEK Kinase= cinasa regulada por la señal extracelular activada por el mitógeno

DMSO= dimetilsulfóxido

SCID= inmunodeficiencia combinada grave

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Métodos generales Células y virus

Las células parentales NIH-3T3 y las células NIH-3T3 transinfectadas por los oncogenes Harvey-ras(H-ras) y EJ-ras fueron un generoso regalo del Dr. Douglas Faller (Universidad de Boston, Facultad de Medicina). Las células NIH-3T3 junto con sus homólogos (designados TNIH#5) fueron un generoso regalo del Dr. Michael Karin (Universidad de California, San Diego). El Dr. H.-J.Kung (Case Western Reserve University) donó amablemente las células parentales NIH-3T3 junto con las células NIH-3T3 transinfectadas por el oncogén ev-erbB (designado THC-11). Las células 2H1, un derivado de la línea de fibroblastos de murino C3H 10T 1/2, que contiene el gen Harvey-ras bajo el control transcripcional del promotor de metalotioneina-I de ratón, eran obtenidas por el Dr. Nobumichi Hozumi (Mount Sinai Hospital Research Institute). Estas células 2H1 son transformantes del ras que expresan el oncogén del H-ras en presencia de ZnSO_{4} 50 \muM. Todas las estirpes celulares crecen en un medio de Tagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene un 10% de suero bovino fetal (FBS).

Las células tet-myc de NIH-3T3 fueron obtenidas por el Dr. R.N. Johnston (Universidad de Calgary) y crecieron en un DMEM que contenía un 10% de FBS inactivado por el calor y antibióticos en presencia o ausencia de 2 \mug/ml de tetraciclina (Helbing, C.C. y cols., Cancer Res. 57:1255-1258 (1997)). En presencia de tetraciclina, la expresión del gen c-myc humano se ve reprimida. La retirada de la tetraciclina produce una elevación de la expresión del c-myc de hasta 100 veces en estas células, lo que representa también un fenotipo transformado.

Los fibroblastos de embrión de ratón PKR^{+/-} y PKRº/º (MEFs) fueron obtenidos por el Dr. B.R.G. Williams (the Cleveland Clinic FOundation) y crecieron en \alpha-MEM que contenía suero bovino fetal y antibióticos tal como se ha descrito (Yang, Y.L. y cols. EMBO J. 14:6095-6106 (1995). Der, S.D. y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3279-3283 (1997)).

La cepa Dearing del serotipo 3 de reovirus utilizada en estos estudios se propagaba en los cultivos de suspensión de las células L y se purificaba de acuerdo con Smith (Smith. R.E. y cols., (1969) Virology, 39:791-800) con la excepción de que el \beta-mercaptoetanol (\beta-ME) se omitía del tampón de extracción. El reovirus etiquetado con (^{35}S) metionina crecía y se purificaba tal como han descrito McRae y Joklik (McRae, M.A. y Joklik, W.K. (1978) Virology, 89:578-593). El cociente partícula/PFU para el reovirus purificado era habitualmente de 100/1.

Análisis inmunofluorescente de la infección por el reovirus

Para los estudios inmunofluorescentes, las células NIH-3T3, TNIH#5, H-ras, EJ-ras, 2H1 (+/- ZnSO_{4}) y las células THC-11 crecían en los cubreobjetos, y se infectaban con reovirus en una multiplicidad de la infección (MOI) de unas 10 células PFU por aplicación del agente portador (solución salina tamponada de fosfato, PBS) a las células de modo idéntico a la administración del virus a las células. A las 48 posteriores a la infección, las células se fijaban en una mezcla de etanol/ácido acético (20/1) durante 5 minutos, luego se rehidrataban con lavados secuenciales en un 75%, 50% y 25% de etanol, seguidos de cuatro lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células fijadas y rehidratadas se exponían entonces al anticuerpo primario (suero tipo 3 antireovirus policlonal de conejo diluido 1/100 en PBS) (antisuero preparado por inyección de conejos con serotipo 3 del reovirus en el adyuvante completo de Freund, y posteriores hemorragias) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de los tres lavados con PBS, las células se exponían al anticuerpo secundario (IgG de cabra anticonejo (molécula entera)-conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma ImmunoChemicals F-0382) diluido 1/100 en PBS que contiene un 10% de suero de cabra y un 0,005% de Azul de Evans) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las células fijadas y tratadas se lavaban tres veces más con PBS y luego una vez con agua doblemente destilada, se secaban y colocaban en portaobjetos en un 90% de glicerol que contenía 0,1% de fenilendiamina, y se visualizaban con un microscopio Zeis Axiophot en el que estaba montada la cámara Carl Zeiss (el aumento de todas las imágenes era de 200X).

Detección de la actividad de MAP cinasa (ERK)

El equipo de anticuerpos PhosphoPlus p44/42 MAP cinasa (Thr202/Tyr204) (New England Biolabs) se utilizaba para la detección de cinasa MAP en lisados celulares de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los cultivos monocapa subconfluentes se lisaban con el tampón de muestra que contiene SDS recomendado, y se sometían a SDS-PAGE, seguido por una electrotransferencia en papel de nitrocelulosa. Luego la membrana se analizaba con el anticuerpo primario (MAPK anti-total o MAPK anti-fosfo), seguido del anticuerpo secundario conjugado (HRP) de peroxidasa de rábano picante, tal como se ha descrito en el manual de instrucciones del fabricante.

Radiomarcaje de las células infectadas por los reovirus y preparación de lisados

Las monocapas confluentes de las células NIH-3T3, TNIH#5, H-ras, EJ-ras, 2H1 (+/- ZnSO_{4}) y las células THC-11 se infectaban con el reovirus (MOI-10 PFU/célula). A las 12 horas posteriores a la infección, los medios se reemplazaban por DMEM libre de metionina que contiene 10% de FBS dializado y 0,1 mCi/ml de (^{35}S) metionina. Tras una incubación a 37ºC durante 36 horas, las células se lavaban en solución salina tamponada de fosfato (PBS) y se lisaban en el mismo tampón que contiene un 1% de Triton X-100, 0,5% de deoxicolato sódico y EDTA 1 mM. Luego los núcleos se retiraban a una velocidad de centrifugación lenta y los sobrenadantes se almacenaban a -70ºC hasta su uso.

Preparación de extractos citoplásmicos para los ensayos in vitro de cinasa

Las monocapas confluentes de las diversas estirpes celulares crecían en placas de cultivo celular de 96 pocillos. En el momento apropiado de la posinfección los medios se aspiraban y las células se lisaban con un tampón que contiene HEPES 20 mM (pH 7,4), KCl 120 mM, MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40, 2 \mug/ml de leupeptina y 50 \mug/ml de aprotinina. Luego se retiraban los núcleos mediante una centrifugación a baja velocidad y se almacenaban los sobrenadantes a -70ºC hasta su uso.

Los extractos citoplásmicos se normalizaban para concentraciones proteínicas previamente a su uso en el método de microvaloración proteínica Bio-Rad. Cada reacción de cinasa in vitro contenía 20 \mul de extracto celular, 7,5 \mul de tampón de reacción (HEPES 20 mM (pH 7,4), KCl 120 mM, MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 1 mM y un 10% de glicerina) y 7,0 \mul de mezcla de ATP (1,0 \muCi(\gamma^{-32}P)ATP en 7 \mul de tampón de reacción), y se incubaba durante 30 minutos a 37ºC (Mundschau, L.J., y Faller, D.V., J. Biol. Chem., 267:23092-23098 (1992)). Inmediatamente después de la incubación, los extractos marcados se llevaban a ebullición en el tampón de muestra SDS Laemmii o bien se precipitaban con perlas de agarosa-poli (l) poli(C) o bien se inmunoprecipitaban con un anticuerpo anti-PKR.

Precipitación de agarosa poli (l) poli(C)

A cada mezcla de reacción de cinasa in vitro, se añadían 30 \mul de un compuesto acuoso tipo 6 de Ag poli (l) poli(C)
al 50% (Pharmacia LKB Biotechnology), y la mezcla se incubaba a 4ºC durante 1 h. Las perlas de Ag poli (l) poli(C)
con las proteínas absorbidas, marcadas se lavaban luego cuatro veces con tampón de lavado (HEPES 20 mM(pH 7,5); KCl 90 mM, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 2 mM, 10% de glicerina) a temperatura ambiente y se mezclaban con 2 veces de tampón de muestra SDS Laemmli. Las perlas se hervían luego durante 5 minutos y las proteínas liberadas se analizaban mediante SDS-PAGE.

Reacción en cadena de la polimerasa

Las células en varios momentos de la posinfección se incubaban y suspendían en TNE helado (Tris 10 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, EDTA 1 Mm) al cual luego se añadía NP-40 hasta una concentración final del 1%. Después de 5 minutos, los núcleos se trituraban y el ARN se extraía del sobrenadante utilizando el procedimiento del fenol: cloroformo. Cantidades similares de ARN celular total de cada muestra se sometían luego al RT-RCP (Wong,H.,et al., (1994) Anal. Biochem., 223; 251-258) utilizando cebadores de hexanucleótidos aleatorios (Pharmacia) y RTase (GIBCO-BRL) conforme al protocolo del fabricante. El ADNc de la etapa RT-RCP se sometía luego a la amplificación selectiva del reovirus s1 usando los cebadores 5'-AATTCGATTTAGGTGACACACTATAGCTATTGGTCGGATG-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-CCCTTTTGACAGTGATGCTCCGTTATCACTCG-3' (SEQ ID NO: 2) que amplifican un fragmento de 116 bp previsto. Estas secuencias procedían de la secuencia S1 determinada con anterioridad (Nagata, L., y cols. (1984) Nucleic Acid Res., 12:8699-8710). Los cebadores GAPDH (Wong y cols., (1994) Anal. Biochem., 223:251-258), el 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGT
GAAGAC-3' (SEQ ID NO: 4) se utilizaban para amplificar un fragmento 306bp GAPDH que servía como un RCP y como control de carga del gel. La amplificación selectiva del sl y GAPDH del ADNc se realizaba usando TaqADN polimerasa (GIBCO-BRL) conforme al protocolo del fabricante usando un sistema GeneAmp RCP de Perkin Elmer 9600. La RCP se llevaba a cabo durante 28 ciclos de forma que cada uno de ellos consistía en una etapa desnaturalizante de 30 segundos a 97ºC, una etapa de recocido a 55ºC durante 45 segundos, y una etapa de polimerización durante 60 segundos a 72ºC. Los productos de la RCP se analizaban por electroforesis mediante un gel de agarosa al 2% impregnado de TAEbromuro de etidio y se fotografiaban bajo luz ultravioleta con una Polaroid de 57 film.

Inmunoprecipitación y análisis por SDS-PAGE

La inmunoprecipitación de los lisados celulares infectados por el reovirus marcado ^{35}S con suero del serotipo 3 del anti-reovirus se llevaba a cabo tal como se ha descrito (Lee, P.W.K. y cols. (1981) Virology, 108:134-146). La inmunoprecipitación de los lisados celulares marcados con ^{32}P con un anticuerpo anti-PKR (de Dr. Michale Mathews, Cold Spring Harbor) se llevaba a cabo de un modo similar. Los inmunoprecipitados se analizaban mediante SDS-PAGE discontinuo según el protocolo de Laemmli (Laemmli, U.K.,(1970) Nature, 227:680-685).

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Ejemplo 1 Productos intermedios activados en la vía de señalización del Ras. Aumento de la eficacia de la infección por el reovirus

Se ha demostrado con anterioridad que las células 3T3 y sus derivados que carecen de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son pobremente infectados por el reovirus, mientras que las mismas células transformadas con EGFR o v-erb B son altamente sensibles tal como indican los efectos citopáticos, la síntesis proteínica vírica, y el consumo de virus (Strong, J.E. y cols., (1993) Virology, 197:405-411; Strong, J.E. and Lee, P.W.K., (1996) J. Virol., 70:612-616).

Para determinar si los mediadores en dirección 3' de la vía de transducción de la señal EGFR pueden estar implicados, se analizaban una serie de estirpes NIH-3T3 derivadas, transformadas con oncogenes activados de forma constitutiva en dirección 3' del EGFR, para controlar su sensibilidad relativa respecto a la infección del reovirus. De interés particular eran los productos intermedios en la vía señalizadota del ras (revisados por Barbacid, M. Annu. Rev. Biochem., 56:779-827 (1987); Cahill, M.A. y cols., Curr. Biol., 6:16-19 (1996). Para investigar la vía que indica el Ras, las estirpes celulares parentales NIH 3T3 y las estirpes NIH 3T3 transinfectadas con versiones activadas de oncogenes Sos (Aronheim, A. et al., (1994) Cell, 78:949-961) o bien de ras (Mundschau, L.J. and Faller, D.V., (1992) J. Biol. Chem, 267: 23092-23098) se exponían a los reovirus y se comparaba su capacidad para promover la síntesis proteínica viral.

La detección de proteínas víricas se llevaba a cabo inicialmente usando microscopía inmunofluorescente tal como se ha descrito antes. Los resultados indicaban que mientras las células NIH 3T3 adoptaban una morfología típicamente difusa, extendida con una inhibición destacada del contacto, las células transformadas crecían todas como células en forma de eje con menor inhibición del contacto. Al comparar las estirpes celulares parentales no infectadas con las estirpes celulares transformadas, se ponía de manifiesto que la morfología de las células era bastante diferente con la transformación. Al retarlas con el reovirus, quedaba claro que la NIH 3T3 parental era pobremente infectada (<5%), independientemente de la fuente de la estirpe NIH 3T3 parental. En contraste con ello, las estirpes celulares transinfectadas mostraban una inmunofluorescencia relativamente pronunciada tras 48 horas de posinfección (datos no mostrados).

Para demostrar que la síntesis proteínica vírica era más eficaz en las estirpes celulares transformadas por el Sos o el Ras, las células se etiquetaban continuamente con (^{35}S)-metionina entre las 12 y 48 h de la posinfección y las proteína se analizaban mediante la electroforesis de gel de dodecilsulfato-poliacrilamida sódico (SDS-PAGE), tal como se ha descrito.

Los resultados indicaban claramente que los niveles de síntesis proteínica vírica eran significativamente más superiores en las células transformadas por Sos o Ras que en las células NIH 3T3 parentales. Las identidades de las bandas víricas se confirmaban mediante la inmunoprecipitación de las proteínas marcadas con anticuerpos anti-reovirus policlonales. Puesto que las células NIH 3T3 y sus homólogas transformadas mostraban niveles comparables de síntesis proteínica celular y tiempos de duplicado (datos no mostrados), la diferencia observada en el nivel de síntesis proteínica vírica no se podía deber a las diferencias intrínsecas en las velocidades de crecimiento o eficacias de traslación para estas estirpes celulares.

El destino a largo plazo de las células de NIH-3T3 consistía en controlarlas durante 4 semanas. Crecían de forma normal y parecían sanas, sin signos de infección lítica o persistente; no se podía detectar ningún virus en el medio transcurrido este tiempo (no se muestran datos).

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Ejemplo 2 Infección incrementada, debida a los oncogenes activados y no a la transformación a largo plazo o al estado transformado generalizado de la célula

Para determinar si las diferencias en la susceptibilidad pueden ser el resultado de los efectos a largo plazo de la transformación, o bien el resultado del encogen propiamente activado, se analizaba la sensibilidad de una línea celular que expresa un gen Harvey-ras (c-H-ras) celular inducible por el zinc hacia la capacidad de infección del reovirus, tal como se ha descrito antes. Estas células, denominadas 2HI, procedían de la estirpe celular C3H 10T1/2 que se ve infectada pobremente por el reovirus (no se muestran datos) y llevan el gen c-H-ras bajo el control del promotor de metalotionina I de ratón (Trimble, W.S. et al. (1986) Nature, 321: 782-784).

Las células eran tratadas en simulacro o bien pretratadas con ZnSO_{4} 50 \muM 18 horas antes de la infección o simulacro de infección (administración de agente portador), y posteriormente se procedía al análisis inmunofluorescente indirecto de estas células al cabo de 48 horas.

Los resultados (no mostrados) demostraban que las células no inducidas eran infectadas ligeramente (<5%) mientras que las inducidas durante solo 18 horas eran mucho más sensibles (>40%). La síntesis proteínica vírica incrementada en las células 2H1 inducidas por el ZN se confirmaba luego mediante el etiquetado metabólico de las células con (^{35}S) metionina seguido del análisis mediante SDS-PAGE de las proteínas específicas del virus (no mostrado).

En base a estas observaciones, el aumento de la eficacia de la infección por el reovirus en las células transformadas es un resultado directo del producto(s) del oncogén activado, y no debido a otros factores como la aneuploidia a menudo asociada a la transformación a largo plazo, o bien otras mutaciones acumuladas que pueden ser adquiridas en un estado crónicamente transformado (por ejemplo, p53 o activación myc).

Para demostrar además que la susceptibilidad a la infección por un reovirus no es un resultado de la transformación per se (es decir, un resultado del estado transformado de la célula huésped), se examinaban las células NIH-3T3 que contienen un gen c-myc humano controlado por la tetraciclina (células tet-myc) (Helbing, C.C. y cols., Cancer Res. 57:1255-1258 (1997)). Estas células normalmente se mantienen en tetraciclina (2 \mug/ml) lo que reprime la expresión del c-myc. La retirada de tetraciclina en unas condiciones de crecimiento normal (10% de suero bovino fetal) lleva a la acumulación de la proteína c-Myc y las células presentan un fenotipo transformado. Nosotros descubrimos que estas células eran incapaces de apoyar el crecimiento del virus en presencia o ausencia de la tetraciclina (datos no mostrados), lo que sugería que la susceptibilidad a la infección por el reovirus no es debida al estado en general transformado de la célula huésped, sino que más bien requiere la transformación específica por los elementos de la vía que señala el Ras.

Un buen indicador de la activación de la vía que señala el Ras es la activación de las cinasas MAP, ERK1 y ERK2 (para una revisión, ver Robinson, M.J. y Cobb, M.H., Curr. Opin. Cell. Biol.9:180-186) (1997)). A este respecto, se ha descubierto que en comparación con las células no transformadas, las células transformadas por el Ras tienen una actividad del ERK1/2 muy superior (datos no mostrados): Además, un examen de una serie de estirpes celulares de cáncer humano ha revelado una correlación excelente entre el nivel de actividad del ERK1/2 y la sensibilidad a la infección por el reovirus (data no mostrados) aunque el ERK1/2 propiamente no parece tener ningún papel. Las células L de ratón y las células HeLa humanas, en las cuales crece el reovirus muy bien, manifiestan ambas una elevada actividad ERK1/2 (datos no mostrados)

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Ejemplo 3 Transcriptos víricos generados pero no trasladados en células NIH 3T3 resistentes al reovirus

También se identificaba la etapa en la cual la infección por el reovirus es bloqueada en células NIH 3T3 no sensibles. Puesto que el enlace del virus y la internalización del virus para las células no sensibles eran comparables a lo observado para las células sensibles (Strong, J.E. et al.,(1993) Virology, 197: 405-411), se investigaba la transcripción de los genes víricos.

Las cantidades relativas de transcriptos S1 de reovirus generadas en las células NIH 3T3 y en las células transformadas por el Ras durante las 12 primeras horas de infección se comparaban después de la amplificación de estos transcriptos por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se ha descrito antes. Los resultados demostraban que los índices de acumulación de los transcriptos S1 en las dos estirpes celulares eran similares, al menos hasta 12 horas después de la infección. Se obtenían datos similares cuando se comparaban los índices de acumulación de otros transcriptos de reovirus (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que el bloque de infecciones en las células no sensibles no se encuentra al nivel de la transcripción de los genes víricos, sino más bien, al nivel de traslación de los transcriptos.

Posteriormente, el nivel de transcriptos víricos presente en las células NIH-3T3 no transformadas decrecía de forma significativa mientras los transcriptos en las células transformadas seguían acumulándose (datos no mostrados). La incapacidad de estos transcriptos para ser trasladados a las células NIH-3T3 contribuía probablemente a su degradación. Tal como se esperaba, el nivel de transcriptos víricos en las células L infectadas era al menos comparable al de las células transformadas por Ras infectadas (datos no mostrados).

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Ejemplo 4 Una proteína de 65 kDa es fosforilada en células NIH 3T3 tratadas por el reovirus pero no en células transformadas infectadas por el reovirus

Debido a que los transcriptos víricos eran generados pero no trasladados en las células NIH 3T3, se investigaba si la cinasa proteínica activada por el ARN de cadena doble, PKR, es activada (fosforilada) en estas células (por ejemplo, por los transcriptos S1 mRNA que han demostrado ser activadores potentes del PKR (Bischoff, J.R. y Samuel, C.E., (1989) Virology, 172:106-115), el cual en cambio lleva a la inhibición de la traslación de los genes víricos. El corolario de dicho escenario sería que en el caso de las células transformadas, se evita la activación, permitiendo que tenga lugar la síntesis proteínica vírica.

Las células de NIH 3T3 y las células transformadas por el Ras o v-erbB (denominadas THC-11 y H-ras, respectivamente) se trataban con el reovirus (es decir, se infectaban) o se infectaban como simulacro (como antes) y a las 48 horas del tratamiento, se sometían a reacciones de la cinasa in-vitro, seguidas de un análisis autoradiográfico.

Los resultados demostraban claramente que existía una clara migración de la fosfoproteína a aproximadamente 65 kDA, el tamaño esperado del PKR, solamente en las células NIH 3T3 y solamente después de su exposición al reovirus. Esta proteína no se marcaba en los lisados de las estirpes celulares transformadas no infectadas o de las estirpes celulares transformadas infectadas. En lugar de ello, resultaba que se marcaba una proteína que migraba a aproximadamente 100 kDa en las estirpes celulares transformadas después de la infección vírica. Esta proteína estaba ausente tanto en los lisados de la preinfección como de la posinfección de la estirpe celular NIH 3T3, y no era una proteína del reovirus porque no reaccionaba con un suero anti-reovirus que precipitaba todas las proteínas del reovirus (datos no mostrados). Una proteína de 100 kDa similar también se podía hallar en las reacciones de la cinasa in vitro marcadas con ^{32}P de los lisados de la posinfección de las estirpes celulares transformadas por el Sos (datos no mostrados).

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Que los intermedios en la vía que señala el Ras eran los responsables de la falta de fosforilación de la proteína 65 KDa se confirmaba luego mediante el uso de células 2H1 que contenían un oncogén del Ras inducible por Zn. Las células 2H1 no inducidas (relativamente resistentes a la infección por el reovirus, tal como se ha indicado antes) eran capaces de producir la fosfoproteína 65kDA solamente después de su exposición al virus. Sin embargo, las células 2H 1 sometidas a la inducción por Zn del oncogén Ras mostraban una alteración significativa de la producción de esta fosfoproteína. Este trastorno coincidía con el incremento de la síntesis vírica. Estos resultados eliminaban pues la posibilidad de que la inducción de la fosfoproteína 65 kDa fuera un acontecimiento específico del NIH 3T2, y establecían claramente el papel del Ras para prevenir (o invertir) la inducción de la producción de esta fosfoproteína. Las células 2H 1 inducidas por el Zn no producían la fosfoproteína observada en las células H-Ras transformadas crónicamente, infectadas.

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Ejemplo 5 La inducción de la fosforilación de la proteína 65 kDa requiere una transcripción vírica activa

Puesto que la producción de fosfoproteína 65 kDa se producía únicamente en las células que eran resistentes a la infección por el reovirus, y solamente después de que las células se expusieran al reovirus, se investigaba si se requería una transcripción vírica activa para la producción de la fosfoproteína 68kDa. El reovirus se trataba con radiación UV para inactivar su genoma previamente a la administración del reovirus a las células NIH 3T3. Para el tratamiento con rayos UV, el reovirus se suspendía en DMEM hasta una concentración de aproximadamente 4x10^{8} PFU/ml y se exponía a luz UV de onda corta (254 nm) durante 20 minutos. El virus inactivado por los rayos UV ya no era infeccioso debido a la falta de efectos citopáticos en los fibroblastos L-929 del ratón y a la carencia de síntesis proteínica vírica por los métodos de etiquetado de la (^{35}S)-metionina previamente descritos. Dicho tratamiento UV abolía la transcripción del gen vírico, tal como se analiza por RCP, y de ahí la infección vírica (datos no mostrados). Luego las células se incubaban durante 48 horas, y los lisados se preparaban y sometían a etiquetaje con ^{32}P in vitro como antes. Los resultados indicaban que las células NIH 3T3 infectadas con el reovirus no tratado producían una banda prominente de 65 kDa marcado con ^{32}P, que no se hallaba en las células no infectadas. Las células expuestas al reovirus tratado con rayos UV se comportaban de forma similar a las células de control no infectadas, manifestando escasa fosforilación de la proteína 65 kDa. Por consiguiente, la inducción de la fosforilación de la fosfoproteína 65 kDa no se debe a los ARNds presentes en el reovirus de entrada; sino más bien requiere la transcripción de novo de los genes víricos, en armonía con la identificación de la fosfoproteína 65 kDa como PKR.

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Ejemplo 6 Identificación de la fosfoproteína 65 kDa como PKR

Para determinar si la fosfoproteína 65kDa era PKR, se realizaba un experimento de enlace de la dsRNA en el cual las perlas de poli(l)-poli(c) agarosa se añadían a los lisados marcados con ^{32}P, tal como se ha descrito antes. Tras la incubación durante 30 minutos a 4ºC, se lavaban las perlas y las proteínas enlazadas se liberaban y analizaban por SDS-PAGE. Los resultados indicaban que la 65 kDa fosfoproteína producida en la posinfección de los lisados celulares NIH 3T3 era capaz de enlazarse al dsRNA; dicho enlace es una característica propia del PKR. EN contraste con ello, la fosfoproteína 100 kDa detectada en la estirpe celular infectada transformada por el H-Ras no se enlazaba a la poli(l)-
poli(c)agarosa. La 65 kDa fosfoproteína era también inmunoprecipitable con un anticuerpo específico del PKR (aporta-
do por el Dr. Mike Mathews, Cold Spring Harbor Laboratory) lo que conformaba que se trataba ciertamente de PKR.

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Ejemplo 7 Resultados de la inactivación o anulación del PKR en la infección incrementada de las células no transformadas

Si la fosforilación del PKR es responsable de la suspensión de la traslación génica vírica en las células NIH-3T3, y una de las funciones de los productos del oncogén activados en las células transformadas es la prevención de este episodio de fosforilación, entonces la inhibición de la fosforilación del PKR en las células NIH-3T3 por otros medios (por ejemplo, fármacos) debería dar lugar al incremento de la síntesis proteínica vírica, y por tanto a la infección en estas células. Para verificar esta idea, se utilizaba la 2-aminopurina. Este fármaco ha demostrado poseer una actividad inhibidora relativamente específica hacia la autofosforilación del PKR (Samuel, C.E. y Brody M., (1990) Virology, 176:106-113; Hu,Y. y Conway. T.W (1993), J. Interferon Res., 13:323-328). De acuerdo con ello, las células NIH 3T3 se exponían a 2-aminopurina 5 mM al mismo tiempo que al reovirus. Las células se marcaban con metionina (^{35}S) entre 12 y 48 h después de la infección, y los lisados se cultivaban y analizaban mediante SDS-PAGE.

Los resultados demostraban que la exposición a la 2-aminopurina daba lugar a un nivel significativamente superior de síntesis proteínica vírica en las células NIH 3T3 (no mostrado). El incremento era especialmente pronunciado después de la inmunoprecipitación de los lisados con un suero anti-reovirus. Estos resultados demuestran que la fosforilación del PRK conduce a la inhibición de la traslación del gen vírico, y que la inhibición de esta fosforilación libera el bloque de traslación. Por lo tanto, los productos intermedios en la vía de señalización del Ras regulan negativamente la expresión del PKR, conduciendo a una infección elevada de las células transformadas por el Ras.

El interferon beta, conocido por inducir la expresión del PKR, resultaba ser capaz de reducir de forma significativa la replicación del reovirus en las células transformadas por el Ras (datos no mostrados).

Un método más directo para definir el papel del PKR en la infección por el reovirus es a través del uso de las células que carecen de PKR. De acuerdo con ello, los fibroblastos del embrión primario del PKR^{+/+} de tipo natural y PKR^{^{o}/^{o}} (Yang, Y.L. et al. EMBO J. 14:6095-6106 (1995)) se comparaban en cuanto a términos de sensibilidad a la infección por el reovirus. Los resultados indicaban claramente que las proteínas del reovirus se sintetizaban a un nivel significativamente superior en las células de PKR^{^{o}/^{o}} que en las células de PKR^{+}/^{+}. Estos experimentos demuestran que la inactivación o anulación del PKR aumentaba la sensibilidad de la célula huésped frente a la infección por el reovirus del mismo modo que la transformación por el Ras o los elementos de la vía de señalización del Ras, aportando con ello un fuerte respaldo al papel de los elementos de la vía señalizadora del Ras en la regulación negativa del PKR.

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Ejemplo 8 La inactivación del PKR en las células transformadas no implica el MEK

Las cinasas de tirosina receptoras como las EGFR son conocidas por estimular las cinasa reguladas por la señal extracelular o activadas por el mitógeno (ERK1/2) a través del Ras (ver Robinson, M.J. y Cobb, M.H., Curr. Opin. Cell. Biol. 9:180-186 (1997)). Esta estimulación requiere la fosforilación del ERK1/2 por parte de la cinasa regulada por la señal extracelular activada por el mitógeno, la cinasa MEK, la cual es propiamente activada (fosforilada) por el Raf, una cinasa serina-treonina en dirección 3 del Ras. Para determinar si se requería actividad de MEK para la inactivación del PKR en las células transformadas, se estudiaba el efecto del inhibidor MEK recientemente identificado PF98059 (Dudley, D.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7686-7689 (1995); Waters, S.D. et al., J. Biol. Chem. 270: 20833-20886 (1995)) en las células transformadas por el Ras infectadas.

Las células H-Ras transformadas crecían hasta una confluencia del 80% y se oinfectaban con el reovirus en un MOI de aproximadamente 10 p.f.u/célula. El PD98059 (Calblochem) disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO), se aplicaba a las células al mismo tiempo que el virus (concentración final del PD98059 era de 50 \muM). Las células de control recibían un volumen equivalente de DMSO. Las células se marcaban con ^{35}S-metionina entre 12 y 48 horas después de la infección. Luego se preparaban los lisados, se inmunoprecipitaban con el suero serotipo 3 anti-reovirus policlonal y se analizaban por SDS-PAGE.

Los resultados (datos no mostrados) indicaban que el PD98059, en una concentración que inhibía eficazmente la fosforilación del ERK1/2, no inhibía la síntesis proteínica del reovirus en las células transformadas. Por el contrario, el tratamiento con PD98059 provocaba un ligero aumento de la síntesis proteínica vírica en estas células; el motivo de ello se está investigando. De acuerdo con la falta de inhibición de la síntesis proteínica vírica en la presencia de PD98059, el PKR en estas células se mantenía no fosforilado (datos no mostrados). Tal como se esperaba, el PD98059 no tenía ningún efecto en la fosforilación del PKR inducida por el reovirus en las células NIH-3T3 no transformadas (datos no mostrados): Estos resultados indicaban que el MEK y el ERK1/2 no están implicados en la activación del PKR.

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Ejemplo 9 Capacidad oncolítica in vivo del reovirus

Un modelo de tumor anfitrión (SCID) de la inmunodeficiencia grave combinada se utilizaba para evaluar la eficacia de usar el reovirus para la reducción del tumor. Los ratones SCID machos y hembras (Charles River, Canada) se inyectaban con fibroblastos de ratón de NIH3Te transformado con v-erbB (denominados células THC-11) en dos puntos subcutáneos en los flancos traseros. En un primer ensayo, se utilizaba un bolo de inyección de 2,3x10^{5} células en 100 \mul de PBS estéril. En un segundo ensayo, se utilizaba un bolo de inyección de 4,8x10^{6} células en 100 \mul de PBS estéril. Los tumores palpables eran evidentes aproximadamente a las dos a tres semanas de la inyección.

Se inyectaba reovirus serotipo tres (cepa Dearing) en la masa tumoral del lado derecho (la "masa tumoral tratada") en un volumen de 20 \mul en una concentración de 1,0x10^{7} unidades formadoras de placa (PFU)/ml. La masa tumoral del lado izquierdo ("la masa tumoral no tratada") se dejaba sin tratar. Los ratones se observaban durante un periodo de siete días tras la inyección con el reovirus. Las mediciones del tamaño del tumor se efectuaban cada dos días utilizando compás calibrador y el peso de los tumores se medía tras sacrificar los animales. Todos los ratones se sacrificaban al séptimo día. Los resultados se muestran en la tabla 1.

TABLA 1 Masa tumoral después del tratamiento con el reovirus

1

La masa tumoral media tratada era el 47% de la masa tumoral no tratada en el ensayo 1, y el 31,6% de la masa tumoral no tratada en el ensayo 2. Estos resultados indicaban que los tumores tratados con el virus eran básicamente más pequeños que los tumores no tratados y que puede existir un efecto sistémico adicional del virus en la masa tumoral no tratada.

Experimentos similares se realizaban usando la introducción unilateral de células tumorales. Los ratones SCID se inyectaban por vía subcutánea y unilateral en el flanco trasero con fibroblastos de ratón NIH 3T3 transformados por v-erbB (células THC-11). Después de dos semanas se establecían tumores palpables (área media 0,31 cm^{2}). A ocho animales se les administró una única inyección intratumoral de 1,0 x 10^{7} PFUs de reovirus serotipo 3 (cepa Dearing) en solución salina tamponada con fosfato (PBD). Los tumores de control (n=10) se inyectaron con cantidades equivalentes de virus inactivado por UV. El crecimiento tumoral fue seguido durante 12 días, y en ese tiempo no se administró ningún tratamiento adicional.

Los resultados, mostrados en la figura 2, indicaban que el tratamiento de estos tumores con una sola dosis de reovirus activo (círculos abiertos) daba lugar a una represión dramática del crecimiento del tumor el día trece (punto final), cuando los tumores en los animales de control inyectados con una dosis única de reovirus no activado (círculos cerrados) excedían la carga tumoral aceptable. Este experimento se repetía varias veces y resultaba ser muy reproducible lo que demostraba la eficacia del reovirus para reprimir el crecimiento tumoral.

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Ejemplo 10 Capacidad oncolítica in vivo del reovirus frente a las estirpes celulares derivadas del cáncer de mama humano

También se llevaban a cabo estudios in vivo usando células de carcinoma de mama humano en un modelo de ratón SCID. Los ratones SCID hembras se inyectaban con 1x10^{6} células de MDA-MB468 de carcinoma de mama humano en dos puntos subcutáneos, que se encontraban en ambos flancos traseros. Los tumores palpables eran evidentes a las dos a cuatro semanas de la inyección. El reovirus serotipo tres no diluido (cepa Dearing) se inyectaba en la masa tumoral del lado derecho en un volumen de 20 \mul en una concentración de 1,0 x 10^{7} PFU/ml. Se obtenían los resultados siguientes:

TABLA 2 Masa tumoral después del tratamiento con el reovirus

2

Aunque estos estudios eran preliminares, quedaba claro que el tamaño de los tumores en los animales tratados con el reovirus era sustancialmente inferior al de los animales no tratados. Sin embargo, el tamaño de los tumores en el lado derecho (tratado) de los animales tratados con el reovirus era ligeramente mayor en promedio al lado izquierdo (no tratado). Esto era inesperado pero puede explicarse por la composición de la masa escogida por las células inflamatorias con la fibrosis posterior, así como por el hecho de que estos tumores fueran originalmente mayores en promedio en el lado derecho que en el izquierdo. La composición histológica de las masas tumorales está siendo investigada. Estos resultados también respaldan el efecto sistémico que el reovirus tiene en el tamaño del tumor no tratado en el portaobjetos contralateral de la inyección del reovirus.

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Ejemplo 11 Sensibilidad de los tumores humanos adicionales a la oncolisis por el reovirus

A la vista de los resultados in vivo presentados antes, la capacidad oncolítica observada en la células murinas se investigaba en las estirpes celulares derivadas de los tumores humanos adicionales.

Células y virus

Todas las estirpes celulares crecían en un medio de Tagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS).

La cepa Dearing del reovirus serotipo 3 utilizada en estos estudios se propagaba en los cultivos de suspensión de las células L y se purificaba de acuerdo con Smith (Smith, R.E. et al.,(1969) Virology, 39:791-800) con la excepción de que el beta-mercaptoetanol (beta-ME) se omitía del tampón de extracción. EL reovirus etiquetado con (^{35}S)-metionina crecía y se purificaba tal como ha descrito McRae y Joklik (McRae M.A. y Joklik, W.K., (1978) Virology, 89:578-593). EL cociente partícula/PFU para el reovirus purificado era típicamente de 100/1.

Efectos citopáticos del reovirus en las células

La monocapas confluentes de las células se infectaban con el reovirus serotipo 3 (cepa Dearing) en una infección (MOI) de aproximadamente 40 unidades de formación de placa (PFU) por célula. Las imágenes se tomaban a las 36 horas de la infección tanto para las células infectadas por el reovirus como para las células infectadas por simulacro.

Análisis inmunofluorescente de la infección por el reovirus

Para los estudios inmunofluorescentes las células crecían en cubreobjetos y se infectaban con reovirus a una velocidad de infección (MOI) de 10 PFU/célula o se infectaban por simulacro tal como se ha descrito antes. En varios momentos posteriores a la infección, las células se fijaban en una mezcla de etanol/ácido acético (20/1) durante 5 minutos, luego se rehidrataban mediante lavados secuencias en un 75%, 50% y 25% de etanol, seguidos de 4 lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células fijadas y rehidratadas se exponían luego al anticuerpo primario (suero tipo 3 anti-reovirus policlonal de conejo diluido 1/100 en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras 3 lavados con PBS, las células se exponían al anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra (molécula entera) conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluido 1/100 en PBS que contiene 10% de suero de cabra y 0,005% de tinción de contraste de azul de Evan) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las células fijadas y tratadas se lavaban 3 veces más con PBS. A ello seguía 1 lavado con agua doblemente destilada, se secaban y se colocaban en los portaobjetos en glicerol del 90% que contenía un 0,1% de fenilendiamina y se visualizaban con un microscopio Zeiss Axiophot montado con una cámara Carl Zeiss (aumento para todas las imágenes de 200).

Infección de las células y cuantificación del virus

Las monocapas confluentes de células que crecían en placas de 24 pocillos se infectaban con reovirus a una velocidad estimada de 10 PFU/célula. Tras una hora de incubación a 37ºC, las monocapas se trataban con DMEM-10% de FBS caliente y luego se incubaban en el mismo medio. En varios momentos posteriores a la infección, se añadía una mezcla de NP-40 y de deoxicolato sódico directamente al medio en las monocapas infectadas hasta unas concentraciones finales del 1% y del 0,5%, respectivamente. Los lisados se cultivaban posteriormente y los productos de los virus se determinaban mediante valoración de la placa en las células L-929.

Radiomarcaje de las células infectadas por el reovirus y preparación de los lisados

Las monocapas confluentes de célula se infectaban con los reovirus (MOI 10 PFU/célula). En varios momentos posteriores a la infección, el medio se reemplazaba por DMEM libre de metionina que contenía un 10% de PBS dializado y 0,1 mCi/ml de (^{35}S) metionina. Tras una incubación adicional de una hora a 37ºC, las células se lavaban en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaban en el mismo tampón que contenía 1% de Triton X-100, 0,5% de deoxicolato sódico y EDTA 1 mM. Los núcleos se retiraban luego por centrifugación a baja velocidad y los sobrenadantes se almacenaban a 70ºC hasta su uso.

Inmunoprecipitación y análisis por SDS-PAGE

La inmunoprecipitación de los lisados celulares infectados por el reovirus marcado con ^{35}S con suero serotipo 3 anti-reovirus se realizaba tal como se ha descrito antes (Lee, P.W.K et al., (1981) Virology, 108:134-146). Los inmunoprecipitados se analizaban mediante SDS-PAGE discontinuo conforme al protocolo de Laemmli (Laemmli, U.K., (1970) Nature, 227: 680-685).

Cáncer de mama

El gen c-erbB-2/neu codifica una proteína transmembrana con una extensa homología al EGFR que se sobreexpresa en un 20-30% de pacientes con cáncer de mama (Yu, D. et al. (1996) Oncogene 13:1359). Puesto que se ha establecido por el presente que la activación por Ras, a través de mutaciones puntuales o a través de elementos en cascada de señalización en dirección 5 del Ras (incluye el homólogo EGFR c-erbB-2/neu), crea en definitiva un entorno acogedor para la replicación del reovirus, se han analizado una secuencia de estirpes celulares derivadas de cánceres de mama humanos para detectar la sensibilidad al reovirus. Las estirpes celulares incluían MDA-MD-435SD (ATCC depósito HTB-129), MCF-7 (ATCC depósito HTB-22), T-27-D (ATCC depósito HTB-133), BT-20 (ATCC depósito HTB-19), HBL-
100 (ATCC depósito HTB-124), MDA-MB-468 (ATCC depósito HTB-132), y SKBR-3 (ATCC depósito HTB-30).

En base a la inducción de los efectos citopáticos, y de la síntesis proteínica vírica medida por el marcaje metabólico radioactivo y la inmunofluorescencia descrita, resultaba que cinco de siete de los cánceres mamarios verificados eran sensibles a la infección por el reovirus: MDA-MB-435S, MCF-7, T-27-D, MDA MB-468, y SKBR-3 eran sensibles a la infección, mientras que BT-20 y HBL-100 no mostraban ninguna infección.

Glioblastoma cerebral

A continuación se han analizado una variedad de estirpes celulares derivadas de los glioblastomas cerebrales humanos. Las estirpes celulares incluían A-172, U-118, U-78, U-563, U-251, U-87 y U-373 (las células eran un regalo generosos del Dr. Wee Yong, Universidad de Calgary).

Seis de siete estirpes celulares de glioblastoma mostraban una sensibilidad a la infección por el reovirus, incluyendo la U-118, U-178, U-563, U-251, U-87 y U-373, mientras que la A-172 no mostraba ninguna infección, según los efectos citopáticos, la inmunofluorescencia y el marcaje con ^{35}S-metionina de las proteínas del reovirus.

Además se estudiaba la estirpe celular del glioblastoma U-87. Para evaluar la sensibilidad de las células U-87 al reovirus, células U-87 (obtenidas del Dr. Wee Yong Universidad de Calgary) se cultivaban hasta una confluencia del 80% y se estimulaban luego con el reovirus a una velocidad de infección (MOI) de 10. En un periodo de 48 horas, se producía un efecto citopático dramático (datos no mostrados). Para demostrar además que la lisis de estas células se debía a la replicación del reovirus, las células se marcaban luego con (^{35}S)metionina durante periodos de tres horas en varios momentos después de la infección y las proteínas se analizaban mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato-poliacrilamida sódica (SDS-PAGE) tal como se ha descrito antes. Los resultados (no mostrados) demostraban claramente la replicación eficaz del reovirus en estas células con la suspensión resultante de la síntesis proteínica a las 24 horas de la infección.

Las células U-87 se introducían también como xenoinjertos tumorales humanos en el flanco trasero de 10 ratones SCID. Las células U-87 se cultivaban en un medio de Tagle modificado de Dulbecco que contenía un 10% de suero fetal bovino, tal como se ha descrito. Las células se cultivaban, lavaban y suspendían en PBS estéril; 2,0x10^{6} células en 100 \mul se inyectaban por vía subcutánea en un punto en el flanco trasero en ratones SCID machos de cinco a ocho semanas de edad (Charles River, Canada). El crecimiento tumoral se medía dos veces por semana durante un periodo de cuatro semanas. Los resultados, que aparecen en la figura 3, demostraban que el tratamiento de los tumores U-87 con una única inyección intratumoral de 1,0x10^{7} PFUs de reovirus vivos (círculos abiertos n=5), daba lugar a una drástica represión del crecimiento del tumor, que incluía la regresión tumoral a la cuarta semana del tratamiento (P=0,008), en comparación con el tratamiento de tumores con una única inyección intratumoral de la misma cantidad de reovirus inactivados por los rayos UV (círculos cerrados, n=5).

La tinción con hematoxilina/eosina (HE) de los microfocos restantes de los tumores tratados con el virus activo, realizada tal como se describe (H. Lyon, Cell Biology, A Laboratory Handbook, J.E. Cells, ed. Academia Press, 1994, p.232) revelaba que la masa tumoral remanente consistía mayoritariamente en estroma normal sin un número apreciable de células tumorales viables, y tampoco existía ninguna evidencia de infiltración de las células tumorales en el músculo esquelético subyacente (datos no mostrados). La necrosis de las células tumorales era debida a la lisis directa por el virus, el mismo mecanismo de sacrificio de las células que por el reovirus in vitro.

Para determinar si se había extendido el virus por debajo de la masa tumoral, se realizaba una microscopía inmunofluorescente usando anticuerpos dirigidos hacia las proteínas del reovirus tal como se ha descrito antes, en las secciones de parafina del tumor y el tejido adyacente. Se observaba que las proteínas específicas del reovirus se confinaban junto a la masa tumoral; no se detectaba tinción vírica en el músculo esquelético subyacente (datos no mostrados). Tal como se esperaba, las proteínas víricas no estaban presentes en los tumores inyectados con el virus inactivado por UV (datos no mostrados). Estos resultados demostraban que la replicación del reovirus en estos animales era altamente específica del tumor con una amplificación vírica solamente en las células U-97 definidas.

Puesto que la mayoría de tumores son altamente vascularizados, era probable que algunos virus pudieran entrar en la corriente sanguínea siguiendo la lisis de las células tumorales infectadas. Para determinar si existía una dispersión sistémica del virus, se recogía sangre de los animales tratados y de control, y se diluía en serie para la valoración posterior de la placa. El virus infeccioso resultaba estar presente en la sangre en una concentración de 1x10^{5} PFU/ml (datos no mostrados).

El elevado grado de especificidad tumoral del virus, combinado con la dispersión sistémica, sugería que el reovirus podía ser capaz de replicarse en los tumores de glioblastoma alejados del tumor inicialmente infectado, tal como se ha demostrado con respecto a las células de cáncer de mama. Para verificar esta hipótesis, los ratones SCID se implantaban bilateralmente con xenoinjertos tumorales humanos U-87 en los puntos del flanco trasero de los animales. Estos tumores se dejaban crecer hasta que medían 0,5x0,5 cm. A los tumores del lado izquierdo se les inyectaba una única dosis (1x10^{7} pfu) de reovirus en los animales tratados (n=5); los animales de control (n=7) eran tratados en simulacro con virus inactivado por UV. Los tumores se volvían a medir dos veces a la semana durante un periodo de tiempo de 4 semanas.

Los resultados que aparecen en la figura 4 demostraban que la inhibición y regresión eventual de las masas tumorales tratadas/inyectadas (círculos) y no tratadas (Cuadrados) se producía solamente en los animales vivos tratados con el reovirus (círculos y cuadrados abiertos), en contraste con los animales tratados con el reovirus pero inactivados (círculos y cuadrados cerrados). El análisis inmunofluorescente posterior revelaba que las proteínas del reovirus estaban presentes tanto en el tumor ipsilateral (tratado) como en el contralateral (no tratado), lo que indicaba que la regresión en el lado no tratado era un resultado de la oncolisis por el reovirus (datos no mostrados).

Carcinoma pancreático

Se analizaba la sensibilidad hacia la infección por el reovirus de las estirpes celulares derivadas del cáncer pancreático. Las estirpes celulares incluían Capan-1 (ATCC depósito HTB-79), BxPC3 (ATCC depósito CRL-1687), MIAPACA-2 (ATCC depósito CRL-1420), PANC-1 (ATCC depósito CRL-1469), AsPC-1 (ATCC depósito CRL-1682) y Hs766T (ATCC depósito HTB-134).

Cinco de estas seis estirpes celulares demostraban sensibilidad a la infección por el reovirus incluyendo Capan-1, MIAPACA-2, PANC-1AsPC-1 y Hs766T, mientras que la BxPC3 mostraba poca infección como indicaban los efectos citopáticos inducidos por el virus, la inmunofluorescencia y el marcaje con ^{35}S. De un modo interesante, cuatro de las cinco estirpes celulares que presentaban sensibilidad a la oncolisis por el reovirus, se ha demostrado que poseen mutaciones transformantes en codón 12 del gen K-ras (Capan 1, MIAPACA-2, PANC-1 y AsPC-1) mientras que a la que carece de sensibilidad (BxPC3) se ha demostrado que carece de dicha mutación (Berrozpe, G., et al., (1994), Int. J. Cancer, 58:185-191). El estado de los otros codones K-ras es actualmente desconocido para la estirpe celular Hs766T.

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Ejemplo 12 Uso del reovirus como un agente oncolítico en los animales inmunocompetentes

Se desarrollaba un modelo de ratón singénico para investigar el uso del reovirus en los animales inmunocompetentes más que en los ratones SCID tal como se ha descrito antes. Los ratones C3H (Charles River) se implantaban por vía subcutánea con 1,0x10^{6} PFU de células C3H transformadas por el ras (un regalo del Dr. Edwards, Universidad de Calgary). Tras establecerse el tumor, los ratones se trataban con una serie de inyecciones intratumorales de reovirus vivos (1,0X10^{8}PFUS) o reovirus inactivados por UV. Después de una serie inicial (seis inyecciones durante nueve días), los animales de prueba recibían un tratamiento de reovirus diluido (1,0x10^{7} PFUs) cada segundo día. Los animales tratados en simulacro recibían una cantidad equivalente de virus inactivado por UV.

La figura 5 demuestra que el reovirus era un agente oncolítico eficaz en estos animales inmunocompetentes. Todos los animales de prueba mostraban regresión de los tumores; 5 de los 9 animales de prueba exhibían una regresión completa del tumor después de 22 días, un momento en el cual los animales de control excedían la carga tumoral aceptable. Además, no aparecían efectos secundarios en los animales tratados con el reovirus.

Para evaluar los efectos de la exposición previa al reovirus con represión y regresión tumoral una mitad de un grupo de prueba se sometía al reovirus (inyección intramuscular de 1,0x10^{8}PFUs, tipo 3 Dearing) antes de determinar el tumor. Dos semanas después, se podían detectar anticuerpos neutralizantes en todos los animales expuestos. Tras determinar el tumor, los animales se trataban con una serie de inyecciones intratumorales de reovirus vivos inactivados por UV, tal como se ha descrito antes.

La figura 6 demuestra que los animales con anticuerpos neutralizantes circulantes frente al reovirus (es decir, aquellos estimulados con un reovirus previamente a la determinación del tumor) exhibían una represión y una regresión tumoral similar a la de los animales en los cuales no había existido previa exposición al reovirus. Por consiguiente, el reovirus puede servir como un agente oncolítico eficaz incluso en los animales inmunocompetentes con previa exposición al reovirus.

Claims (33)

1. Uso de una cantidad eficaz de un reovirus recombinante obtenida a partir de dos o más tipos de reovirus con fenotipos patogénicos diferentes, de manera que el reovirus recombinantes contiene diferentes determinantes antigénicos obtenidos de los dos o más virus de diferente fenotipo patogénico para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno proliferativo mediado por el ras en un mamífero en unas condiciones que dan lugar a la lisis sustancial de las células proliferantes.

2. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno proliferativo mediado por el ras es un neoplasma.

3. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno proliferativo mediado por el ras es una neurofibromatosis.

4. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2, en el que el neoplasma es un neoplasma sólido.

5. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2, en el que el neoplasma es seleccionado del grupo formado por el cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer adrenal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de mama y cáncer del sistema nervioso central y periférico.

6. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que el neoplasma es un cáncer del sistema nervioso central.

7. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que el neoplasma es un cáncer de mama.

8. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2, en el que el neoplasma es un neoplasma hematopoyético.

9. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 4, en el que el medicamento es para la administración por inyección en o cerca del neoplasma sólido.

10. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el medicamento es para la administración por vía intravenosa en el mamífero.

11. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el medicamento es para la administración por vía intraperitoneal en el mamífero.

12. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el mamífero es inmunocompetente.

13. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 12, donde el reovirus está inmunoprotegido.

14. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 13, donde el reovirus está encapsulado en una micela.

15. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 12, donde el reovirus se tiene que administrar con una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-antireovirus.

16. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el mamífero es humano.

17. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde se tienen que administrar aproximadamente 1 a 10^{15} unidades de formación de placas de reovirus/kg de peso corporal.

18. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde el reovirus se tiene que administrar en una sola dosis.

19. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde el reovirus se tiene que administrar en más de una dosis.

20. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2, donde el neoplasma es metastático.

21. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde el medicamento comprende además un antineoplásico.

22. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde el reovirus recombinante se ha modificado para reducir o eliminar una reacción inmunitaria al reovirus envasando el reovirus en un liposoma, una micela u otro vehículo para enmascarar el reovirus del sistema inmunitario de los mamíferos o bien eliminando el cápside externo.

23. El uso de la reivindicación 2, donde el reovirus es tratado con una proteasa previamente a la administración.

24. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, donde el mamífero es humano.

25. El uso de un reovirus recombinantes obtenido de dos o más tipos de reovirus con diferentes fenotipos patogénicos de manera que el reovirus recombinante contiene diferentes determinantes antigénicos obtenidos de dos o más virus de diferente fenotipo patogénico para la fabricación de un medicamento capaz de inhibir la metástasis de un neoplasma en un mamífero, donde el reovirus se tiene que administrar en una cantidad suficiente para producir la lisis sustancial de las células neoplásicas.

26. El uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde el medicamento se tiene que administrar en un punto quirúrgico en una cantidad suficiente para producir la oncolisis sustancial de cualquier célula neoplásica remanente después de la extracción quirúrgica de prácticamente todo el neoplasma.

27. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde el reovirus recombinante se ha generado por la infección conjunta de células mamíferas con diferentes subtipos de reovirus.

28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, donde el reovirus recombinante aparece de forma natural.

29. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, donde el reovirus recombinante aparece de forma no natural.

30. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, donde el reovirus recombinante comprende secuencias de codificación de proteínas de revestimiento variante de aparición natural.

31. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, donde el reovirus recombinante comprende secuencias de codificación de proteínas de revestimiento mutadas.

32. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, donde el reovirus recombinante surge de la recolección de reovirus seleccionados del grupo formado por reovirus del serotipo 1 humano, reovirus del serotipo 2 humano y reovirus del serotipo 3 humano.

33. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, donde se administra más de una cepa de reovirus recombinante.