ES2308813T3 - Mutacion en el gen conexina 26 responsable de la sordera prelingual no-sindromica y metodo de deteccion. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido purificado que tiene una secuencia del gen Conexina 26 SEQ ID No. 8 que contiene una eliminación específica de una guanosina en la posición 30 o de 38 bp comenzando en la posición 30, posición 1 siendo la primera base del codón iniciador.
Description
Mutación en el gen conexina 26 responsable de la
sordera prelingual no-sindrómica y método de
detección.
La presente invención hace referencia a una
mutación responsable de sordera autosómica prelingual
no-sindrómica y un método para la detección de este
defecto sensorial hereditario en individuos homocigotos y
heterocigotos. La invención también concierne más en particular una
eliminación específica de al menos un oligonucleótido en el gen de
la conexina 26 (Cx 26) y específicamente en una región rica en
guanosina, notablemente entre el nucleótido 27 y 32. La invención
también se encuentra dirigida al uso de polinucleótido, o
fragmentos del mismo, por ejemplo como herramientas útiles para la
detección in vitro de una mutación de un gen perteneciente a
la familia de gen
Cx26.
Cx26.
La sordera prelingual profunda o severa afecta a
un niño de cada cien en países desarrollados (Morton NE.
Epidemología genética de problemas auditivos. En Genetics of
hearing impairment. (The New York Acad Sci, New York, 1991;
630: 16-31). Supone un mayor impedimento debido a
que impide la adquisición de la lengua.
De acuerdo con estudios realizados en una
población de Estados Unidos de niños con sordera prelingual no
sindrómica (aislada) y en los cuales se ha excluido una causa
ambiental obvia, se estima que dos tercios de los casos tienen una
base genética (Marazita ML, Ploughman LM, Rawlings B, Remington E,
Arnos KS, Nance WE. Los estudios epidemiológicos genéticos de
sordera de temprana aparición en la población con edad escolar de
Estados Unidos. Am J Med Genet 1993; 46: 486-91).
Estas formas son principalmente sensorineural y son casi
exclusivamente monogénicas. El principal modo de herencia es el
autosómico recesivo (DFNB), que incluye del 72% al 85% de los
casos, aumentando esta cifra hasta el 90% cuando únicamente se
tiene en cuenta la sordera profunda.
La sordera prelingual autosómica recesiva es
conocida por ser elevadamente heterogénea genéticamente. Las cifras
del número de loci DFNB varias de treinta a cien (Petit C. Pérdida
de audición autosómica recesiva no-sindrómica. En
Genetic and Hearing Impairment. Martini A, Read AP, Stephens D, eds
(Whurr, London) 1996; 197-212), para una revisión),
de los cuales catorce han sido trazados hasta ahora hasta los
cromosomas humanos (Petit C. Genes responsables de la sordera
hereditaria humana: sinfonía de cientos. Nature Genet 1996; 14:
385-91) para revisión, (Verhoeven K, Van Camp G,
Govaerts PJ, et al. Un gen para la pérdida de audición
autosómica dominante no-sindrómica (DFNAl2) traza
un mapa hasta el cromosoma 11 q22-24. Am J Hum
Genet 1997; 60: 1168-74 y Campbell DA, McHale DP,
Brown KA, et al. Un nuevo locus para la pérdida de audición
autosómica recesiva no-sindrómica sensorineural
(DFNB16) traza un mapa hasta el cromosoma humano
15g21-q22. J Med Genet 1997; en prensa).
La mayoría de las familias que asisten a
clínicas en busca de asesoramiento genético consiste en pacientes
con una audición normal con un único hijo sordo que desean saber el
riesgo de recurrencia del defecto. En la mayor parte de los casos,
dado al gran papel de causas ambientales de sordera prelingual,
normalmente ni siquiera es posible reconocer si la pérdida de
audición es de origen genético. El asesoramiento genético en dichas
familias se mejoraría en gran medida si se pudiera detectar
mutaciones DFNB. En este aspecto, la elevada heterogeneidad
genética de la condición representa un obstáculo importante.
Tras la identificación inicial del locus DFNB1
en 13g11 en una gran familia tunecina consanguínea (Guilford P, Ben
Arab S, Blanchard S, et al. Una forma
no-sindrómica de sordera recesiva neurosensorial
traza un mapa hacia la región pericentromérica del cromosoma 13q.
Nature Genet 1994; 6:24-8), se llevaron a cabo dos
estudios sobre familias de Nueva Zelanda/Australia (Maw MA,
Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al. La
contribución del locus DFNB1 a la sordera neurosensorial en una
población caucasiana. Am J Hum Genet 1995; 57:
629-35), y en familias italianas/españolas
(Gasparini P, Estivill X, Volpini V, et al. Enlace de DFNB1
con sordera autosómica recesiva neurosensorial
no-sindrómica. Eur J Hum Genet 1997;
5:83-8) sugiriendo que este locus puede ser un
principal contribuyente a la sordera prelingual en estas
poblaciones, a pesar de que los resultados individuales obtenidos
en estas familias no fueron significativos debido al pequeño tamaño
de estas familias.
Recientemente, el gen Cx26, que codifica una
proteína de unión de huecos, conexina 26, ha demostrado estar
debajo de la sordera DFNB1. Se han presentado dos sustituciones
diferentes C\rightarrowA que dan como resultado los codones de
parada prematuros en tres familias de Pakistán consanguíneas unidas
por DFNB1 (Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al.
Mutaciones de conexina 26 en sordera sensorineural
no-sindrómica hereditaria. Nature 1997;
387:80-3). Estas dos sustituciones se identificaron,
respectivamente, en el codón 77 y en el codón 24. Este resultado
ha ofrecido la oportunidad para evaluar directamente esta
hipótesis.
Las dificultades presentadas en el asesoramiento
genético para sordera prelingual no-sindrómica
debido a la inhabilidad para distinguir sordera genética y no
genética en las familias que tenían un único hijo sordo fueron una
de las razones que llevaron a los inventores a asumir una
caracterización del espectro y prevalencia de mutaciones presentes
en el gen Cx26 en 35 familias de diferentes partes del mundo con
sordera prelingual autosómica recesiva.
\newpage
La determinación de una mutación en el gen Cx26
ha hecho notablemente posible el uso de una sonda de detección como
herramienta para la identificación de una forma específica de
sordera autosómica prelingual no-sindrómica, y más
en particular el papel útil de una mutación recientemente
identificada 30delG (una eliminación G en posición 30; siendo la
posición 1 la primera base del codón iniciador) en tales familias.
Esta invención establece que la contribución predominantemente del
locus DFNB1 es el resultado esencialmente de la mutación 30delG.
Ahora se cree que el 30delG representa aproximadamente tres cuartos
de todas las mutaciones recesivas DFNB1.
Por lo tanto, la invención pretende proporcionar
un polinucleótido purificado que posee una cadena de nucleótidos
correspondientes a una secuencia mutada, que de forma salvaje
codifica un polipéptido implicado en un defecto sensorial
hereditario. El polinucleótido purificado mutado presenta una
mutación responsable de sordera prelingual
no-sindrómica.
La invención también proporciona
oligonucleótidos que comprenden de 15 a 50 nucleótidos consecutivos
del polinucleótido purificado mutado que son útiles como
imprimadores o como sondas.
Además, la invención ayuda a aportar un método y
un kit par a la detección del defecto sensorial hereditario para
individuos homocigotos y heterocigotos.
De acuerdo con la invención, el polinucleótido
purificado que tiene una cadena de nucleótidos correspondientes a
una secuencia mutada, que codifica de forma salvaje un polipéptido
implicado en un defecto sensorial hereditario, presenta una
mutación responsable de la sordera prelingual
no-sindrómica seleccionada del grupo consistente en
una eliminación específica de al menos un nucleótido.
Por mutación, de acuerdo con la invención, se
entiende una eliminación específica de una guanosina en posición 30
o de 38 pb que comienzan en posición 30 (siendo la posición 1 la
primera base del codón iniciador del gen Conexina 26 (SEQA ID NO:
8)). Por consiguiente, una secuencia mutada significa una secuencia
de polinucleótido que contiene al menos una de la mencionada
mutación.
Una cadena de nucleótidos, de acuerdo con la
invención, significa un polinucleótido, que codifica no
necesariamente un polipéptido, pero que presenta entre 27 y 2311
nucleótidos unidos entre sí.
Una realización preferente de una eliminación
específica es una eliminación de guanosina en posición 30, también
llamada ``mutación 30delG. Otra realización preferente de la
eliminación específica es una eliminación 38 bp que comienza en la
posición 30.
La invención también incluye polinucleótido
purificado, que se hibridiza de manera específica con cualquiera de
los polinucleótidos que se han descrito anteriormente bajo las
siguientes condiciones rigurosas: a baja temperaturas entre 23ºC y
37ºC, en la presencia de 4 x búfer SSC, 5 x solución de Denhardt,
0.05% SDS, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. (1 x SSC
corresponde a 0.15 M NaCl y 0.05 M citrato sódico; 1 x solución de
Denhardt corresponde a 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirrolidona y
0.02% de albúmina de suero bovino).
Los imprimadores de oligonucleótido pueden
seleccionarse del siguiente grupo:
- Una primera pareja:
| 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC | (SEQ ID No. 9)-3'; y |
| 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA | (SEQ ID No. 10) 3'; y |
\vskip1.000000\baselineskip
- Una segunda pareja:
| 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCC | |
| \hskip0.3cm CCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC | (SEQ ID No. 14)-3'; y |
| 5' ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA | (SEQ ID No. 14)-3'. |
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos útiles como sonda se
seleccionan del siguiente grupo:
| 5'-AGACGATCCTGGGGTGTGAACAAA | (SEQ ID No. 5)-3' |
| 5'-ATCCTGGGGGTGTGA | (SEQ ID No. 6)-3' |
| 5'-AGACGATCCTGGGGGCTACCGTCCTC | (SEQ ID No. 7)-3'. |
\newpage
Además, la invención incluye un método para la
detección de un defecto sensorial hereditario, es decir, una
sordera prelingual autosómica no-sindrómica, para
individuos homocigotos y heterocigotos en una muestra biológica que
contiene ADN, consistiendo en los siguientes pasos:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con un imprimador de oligonucleótido tal y como se ha definido anteriormente, habiéndose sometido a hibridización de manera opcional el ADN contenido en la muestra y bajo condiciones que permiten la hibridización de los imprimadores con el ADN contenido en la muestra biológica;
- b)
- amplificar el ADN;
- c)
- revelar los productos de amplificación;
- d)
- detectar la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
El paso d) del método arriba descrito puede
consistir en Polimorfismo de Conformación de Cadena Sencilla
(SSCP), una secuencia con Electroforesis en Gel Desnaturalizante en
Gradiente (DGGE) (Smith, L.M., Sanders, J.Z., Kaiser, R.J.,
detección fluorescente en análisis automatizado de secuencia ADN.
Nature 1986; 321:674-9); una sonda de captura para
hibridización molecular o electroforesis con gel gradiente de
temperatura (TGGE).
El paso c) del método arriba descrito puede
consistir en la detección de productos amplificados con una sonda
de oligonucleótido tal y como se ha descrito anteriormente.
De acuerdo con la invención, una muestra
biológica puede ser una muestra de sangre extraída de personas que
sufren cualquier tipo de sordera con uno de los siguientes
criterios: sordera neurosensorial o mezclada aislada, avanzada o
no, en cualquier grado de severidad, que concierna un caso familiar
o esporádico, o individuos expuestos a ruido, o individuos que
sufran una baja acústica, o individuos susceptibles a transportar
una anomalía en el gen, o de un embrión para diagnóstico
antenatal.
Otro objetivo de la invención consiste en un
método para la detección de un defecto sensorial hereditario, la
sordera prelingual no sindrómica autosómica, para individuos
homocigotos y heterocigotos en una muestra biológica que contiene
ADN, y que consiste en los siguientes pasos:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con una sonda de oligonucleótido de acuerdo con la invención, habiéndose sometido a hibridización de manera opcional el ADN contenido en la muestra y bajo condiciones que permiten la hibridización de los imprimadores con el ADN contenido en la muestra biológica; y
- b)
- detectar el híbrido formado entre la sonda de oligonucleótido y el ADN contenido en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
El paso b) del método arriba descrito puede
consistir en Polimorfismo de Conformación de Cadena Sencilla
(SSCP), una secuencia con Electroforesis en Gel Desnaturalizante en
Gradiente (DGGE) o en amplificación y secuencia.
La invención también incluye un kit para la
detección de un defecto sensorial hereditario, la sordera
prelingual no sindrómica autosómica, para individuos homocigotos y
heterocigotos, consistiendo dicho kit en:
- a)
- oligonucleótidos de acuerdo con la invención;
- b)
- los reagentes necesarios para llevar a cabo la amplificación de ADN; y
- c)
- un componente que haga posible determinar la longitud de los fragmentos amplificados o detectar una mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención se describirá con más detalle
mediante referencia a los dibujos en los cuales:
La Figura 1 representa los resultados de la
electroforesis de gel gradiente de temperatura para la detección de
mutantes en los cuales:
Rutas 1 y 2: ADN para pacientes normales.
Rutas 3 y 4: ADN para paciente homocigotos con
mutación 30delG.
Rutas 5 y 6: ADN para paciente
heterocigotos.
Ruta 7: Control PCR sin ADN.
Ruta 8: Fragmento PCR amplificado de un ADN
normal e hibridizado con fragmento de ADN estándar que alberga la
mutación 30delG.
Ruta 9: Fragmento PCR amplificado de un ADN
homocigoto mutante e hibridizado con fragmento de ADN normal
estándar que alberga la guanina 30.
\vskip1.000000\baselineskip
La sordera prelingual no sindrómica (aislada) es
el defecto sensorial hereditario más frecuente en niños. La
herencia es en la mayoría de los casos autosómica recesiva. Varias
docenas de genes pueden estar implicados pero solamente dos de
ellos, DFNB1 y DFNB2, han sido identificados hasta la fecha.
(Kelsell, D.P., et al, Mutaciones de Conexina 26 en sordera
hereditaria no sindrómica sensorineural. Nature 1997;
387:80-3; Liu, X-Z, et al.
Mutaciones en el gen miosina VIIA provoca sordera recesiva no
sindrómica, Nature Genet 1997; 16:188-90; y Weil,
D., et al., La sordera recesiva autosómica aislada, DFNB2, y
el síndrome Usher 1B son defectos alélicos de la
miosina-VIIIA. Nature Genet 1997;
16:191-3). Se realizó una búsqueda de mutaciones en
el gen que codifica conexina 26, Cx26, que recientemente ha
demostrado ser la responsable de DFNB1. El análisis de la mutación
de Cx26 se llevó a cabo mediante amplificación PCR sobre ADN
genómico y la secuencia del único exón codificador.
Se estudiaron treinta y cinco familias afectadas
de varias regiones geográficas, principalmente de Francia, Nueva
Zelanda y Australia, Túnez y el Líbano. Se pudieron clasificar en
cuatro categorías: (1) familias consanguíneas teniendo cada una de
ellas un significante enlace con el locus DFNB1; (2) familias
pequeñas no consanguíneas en las que el análisis de enlace fue
compatible con la participación de DFNB1; y (3) familias pequeñas
en las que no se asumió ningún análisis de enlace.
La primera categoría consiste en seis familias
grandes que viven en regiones geográficamente aisladas. Cinco eran
de Túnez, dos del norte y tres del sur. La unión con el locus DFNB1
en las dos familias del norte de Túnez (familias 20 y 60) ya había
sido previamente señalado (Guilford P, Ben Arab S, Blanchard S,
et al., Una forma no sindrómica de sordera recesiva
neurosensorial traza un mapa hacia la región pericentromérica de
cromosoma 13q. Nature Genet 1994; 6:24-8); las tres
familias del sur de Túnez (S15, S19 y ST) y la familia del Líbano
(LH) comprenden un total de tres, cinco, dos y cinco niños sordos,
respectivamente, siendo la sordera de grado severo o profundo. Los
matrimonios fueron entre primos carnales (S15, ST y LH) y entres
primos carnales y segundos (S19). Los análisis de unión de estas
seis familias dieron como resultado puntuaciones que oscilaron
entre 2.5 a 10 con marcadores polimórficos de la región DFNB1
(D13S175, D13S141, D13S143 y D13S115).
La segunda categoría de pacientes comprende
siete familias de Nueva Zelanda con al menos dos hermanos (familias
51, 1160, 1548, 1608, 1773, 1873, 1877) y una familia de Australia
(9670). La familia 1608 fue atípica en el sentido en el que dos
hermanos que compartían el mismo marcador haplotipo DFNB1 tenían
una sordera de leve a moderada (severa a elevada frecuencia), con
el hijo de uno de ellos siendo profundamente sordo. En la familia
1873, los padres no relacionados (individuos II.2 y II.3) eran
sordos al igual que sus dos hijos, y por lo tanto hemos considerado
esto como dos familias, siendo nueve el total de familias
independientes. Aparte de las familias 1608 y 1873, ningún padre
respondió a ninguna anomalía auditiva. Estas nueve familias
mostraron congregación entre sordera y marcadores polimórficos de
la región DFNB1 con resultados individuales máximos que oscilaban
entre 0.6 y 1.2. Diez familias adicionales en el estudio original
de Maw et al. (Maw MA, Allen-Powell DR,
Goodey RJ, et al. La Contribución de locus DFNB1 a la
sordera neurosensorial en una población Caucasiana. Am J Hum Genet
1995; 57:629-35) habían demostrado ninguna
congregación y otra familia congregante no había sido testada para
mutaciones Cx26. Las familias neozelandesas fueron todas de origen
caucásico con ninguna mezcla polinésica conocida. De acuerdo con
los nombres familiares de los antecedentes, la proporción ancestral
entre las familias reflejó que la población general caucásica de
Nueva Zelanda era predominantemente de patrimonio
anglo-céltico y una pequeña fracción de Europa
continental debido a la migración. No se reconoció ni consanguinidad
parenteral ni enlaces entre cualquiera de las familias. En el caso
de Australia, el padre era del Norte de Irlanda y la madre de
Yorkshire, Inglaterra.
La tercera categoría se compuso por diecinueve
familias que vivían en Francia y dos que vivían en Nueva Zelanda,
cada una de ellas con al menos dos hijos que presentaban sordera de
severa a profunda. Ningún padre presentó anomalía auditiva, excepto
la madre en la familia P16, y el padre en la familia P17 que tenía
pérdida auditiva moderada y progresiva a elevada frecuencia. Cinco
de estas familias tenían ancestros extranjeros en el Líbano (familia
P3), Turquía (familia P4), Portugal (familia P9), Algeria (familia
P14) y Polonia (padre en la familia P16). En dos de las familias
(P7 y P14), los padres estaban distanciadamente relacionados.
\newpage
La amplificación del exón codificador de Cx26
PCR se llevó a cabo sobre el ADN genómico empleando un conjunto de
imprimadores que permitieron la amplificación de toda la secuencia
codificadora del gen Cx26, que consiste en un único exón
codificador (Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al.
Mutaciones de Conexina 26 en sordera hereditaria no sindrómica
sensorineural. Nature 1997; 387; 80-3). Las
secuencias de los imprimadores fueron las siguientes:
| 5'-TCTTTTCCAGACGAAACCGCC | (SEQ ID No. 1)-3' y |
| 5'-TGAGCAGGGTTGCCTCATC | (SEQ ID No. 2)-3'. |
Las condiciones PCR fueron: 35 ciclos de 95ºC, 1
min; 58ºC, 1 min; 72ºC, 2 min. El producto PCR obtenido fue 777 bp
en longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de los productos PCR se llevó a
cabo tal y como se ha descrito anteriormente (Smith LM, Sanders JZ,
Kaiser RJ, et al., la detección fluorescente en análisis de
secuencia de ADN automatizado, Nature 1986;
321:674-9) usando el método exterminador de cadena
dideoxi en un secuenciador de ADN de Applied Biosystems ABI373 con
dideoxinucleótidos fluorescentes. Los imprimadores empleados fueron
los mismos que los de la amplificación PCR más dos imprimadores
internos:
| 5'-GACACGAAGATCAGCTGCAG | (SEQ ID No. 3)-3' y |
| 5'-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG | (SEQ ID No. 4)-3'. |
\vskip1.000000\baselineskip
En estas familias la participación de locus
DFNB1 podía demostrarse mediante análisis de unión. En cuatro de
las cinco familias de Túnez (S15, S19, 20 y 60) y en la familia
libanesa (LH), se detectó la misma mutación en todos los niños
afectados en ambos alelos Cx26, es decir, una eliminación de una
guanosina (G) en una secuencia de seis que se extienden de la
posición 30 a la 35 (siendo la posición 1 la primera base del codón
iniciador) (Tabla 1). Esta mutación es referida a partir de este
momento como mutación 30delG de acuerdo con la nomenclatura
propuesta por Beaudet y Tsui (Beaudet AL, Tsui L-C.
Una nomenclatura sugerida para las mutaciones que designan, Hum
Mutation 1993; 2: 245-8)). Crea un cambio de
estructura que da como resultado un codón prematuro de parada en la
posición 38 de nucleótido. La mutación que se segrega en la quinta
familia de Túnez (ST) fue identificada como una trasversión G a T
en la posición de nucleótido G39 creando un codón prematuro de
parada (GAG->TAG) en el codón 47, y fue designado como E47X. En
cada familia, se descubrió que los padres con audición normal eran
heterocigotos por la mutación correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
En estas familias, el análisis de segregación ya
había sido previamente presentado como compatible con la
participación del locus DFNB1 (Maw MA, Allen-Powell
DR, Goodey RJ, et al. La contribución del locus DFNB1 a la
sordera neurosensorial en una población caucásica. Am J Hum Genet
1995; 57: 629-35). Los individuos sordos de cinco
de las nueve familias (51, 1160, 1608 (III.20), 1873 (II.3) y 1987)
fueron homocigotos para la mutación 30delG. Los niños sordos de la
familia 1773 fueron heterocigotos para 30delG. El individuo sordo
11.2 de la familia 1873 (ver "sujetos" en la Tabla 1) era
heterocigoto para una eliminación de 38bp que comenzaba en la
posición G30 del nucleótido, con la designación 30del38. No se
detectó ninguna otra mutación en los niños sordos de la familia
1773 y el individuo sordo (II.2) en la familia 1873. Sin embargo,
en la último individuo, ya había sido observada previamente una
eliminación del marcador polimórfico inmediatamente próximo al gen
Cx26 (locus D13S175) (Maw MA, Allen-Powell DR,
Goodey RJ, et al. La contribución del locus DFNB1 a la
sordera neurosensorial en una población caucásica. Am J Hum Genet
1995; 57: 629-35), lo que podría indicar que una
recolocación de ADN ha dañado o afectado el funcionamiento del otro
alelo Cx26 del gen en cis. En la familia 9670, se observó una
heterocigosidad compuesta para una mutación sin sentido (R184P) y
una eliminación en la estructura de único codón (delE138) en
hermanos afectados. Únicamente en una familia (1548) no se detectó
una mutación Cx26. Los resultados están resumidos en la Tabla
1.
Diecinueve familias (P1 a 17, L14190 y L13131)
que vivían en Francia y dos en Nueva Zelanda (familias 1885 y 2254)
fueron estudiadas. En estas familias, no se había estudiado la
congregación de la sordera con marcadores polimórficos. Los niños
sordos de seis de las veintiuna familias (P1 , P3, P5, P9, P10 y
P16) resultaron ser homocigotos para la mutación 30delG. En cinco
familias adicionales (P6, P11, P14, P17 y 1885), los niños sordos
fueron heterocigotos para esta mutación; no se detectó ninguna otra
mutación en estas familias. En las diez familias restantes, no se
encontró ninguna mutación en el gen Cx26.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda de captura para hibridización molecular
(ver, por ejemplo, D. Chevrier et al. La cuantificación de
producto PCR mediante procedimientos de hibridización no
radioactivos empleando un nucleótido covalentemente enlazado con
micropozos. Molecular and Cellular Probes 1993; 7:
187-197 y D. Chevrier et al. Detección
rápida de subespecies I de Salmonella mediante PCR combinado con
hibridización no radioactiva empleando oligonucleótido
covalentemente inmovilizados sobre una microplaca. FEMS Immunology
and Medical Microbiology 1995; 10: 245-252 cada uno
de los cuales se incorpora como referencia) permite una detección
específica de la mutación 30delG. La técnica ha sido adaptada para
permitir un rápido diagnóstico de sordera prelingual no sindrómica
provocada por la mutación 30delG. La técnica proporciona ciertas
ventajas en un sentido clínico debido a que emplea moléculas
estables y no radioactivas, puede automatizarse de manera sencilla
y se adapta de manera adecuada para análisis a gran escala.
Empleando imprimadores designados para la
amplificación PCR, la región de interés en el gen Cx26 se amplifica
a partir de la muestras genómicas de ADN. Las secuencias de
imprimador son las siguientes.
| CONN3: | 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC | (SEQ ID No. 9)-3' |
| CONN4: | 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA | (SEQ ID No. 10) 3' |
PCR se lleva a cabo con los imprimadores CONN3
(SEQ ID No. 9) y CONN4 (SEQ ID No. 10) (1 \mum cada uno), una
alícuota del ADN a ser analizado (2 \mul, 100-300
ng), 1.5 mM MgCl_{2}, 200 \muM dNTP, y polimerasa Taq. El
programa de amplificación consiste en los siguientes pasos: 1)
95ºC, 5 min; 2) adición de enzima, 95ºC, 1 min; 3) 60ºC, 1 min
(rango de rampa o elevación = 0.25ºC/segundo; 4) 72ºC, 1 min; 5)
repetir pasos 2 a 4 durante 40 ciclos; y 6) 72ºC, 10 min. Los
productos PCR fueron verificados mediante una rápida electroforesis
de gel.
El producto PCR amplificado contiene bien la
secuencia normal o la secuencia mutante de Cx26. Para distinguir
entre la secuencia normal y la mutante se designan dos sondas de
captura. Las secuencias para estas dos sondas de captura son las
siguientes:
Para la detección de secuencia normal:
| CONN6: | 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTG | (SEQ ID No. 11)-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de secuencia mutante:
| CONN7: | 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTGA | (SEQ ID No. 12)-3'. |
Cada sonda de captura debe tener 22 nucleótidos
de longitud. Además, para ser eficiente, la sonda de captura debe
incluir un espaciador A_{7} en su extremo 5' y una región de
hibridización de 15 bases. Dicha sonda de captura es capaz de
diferenciar de manera específica la secuencia mutante de la
secuencia normal. Por consiguiente, CONN6 (SEQ ID No. 11) se
designa para hibridizarse específicamente con la secuencia normal,
mientras que CONN7 (SEQ ID No. 12) se designa para hibridizarse
específicamente con la secuencia mutante.
Antes de unir la sonda de captura con una placa
de microtítulo, se fosforilizan en sus extremos 5'. La
fosforilación se lleva a cabo a cabo durante una hora a 37ºC en
presencia de 20 nmoles de oligonucleótidos CONN6 (SEQ ID No. 11) o
CONN7 (SEQ ID No. 12), 100 \muM ATP, 10 unidades de
polinucleótido quinasa T4 en 200 \mul de búfer (50 mM
Tris-HCl pH 7.4; 10 mM MgCl_{2}; 5 mM
ditiotreitol; y 1 mM espermidina). La mezcla se calienta durante 10
minutos a 68ºC para desactivar el polinucleótido quinasa T4, a
continuación el oligonucleótido se precipita añadiendo 145 \mul
de 10 M CH_{3}COONH_{4}, 15 MI de H_{2}O, y 800 \mul de
etanol helado. Tras una incubación de 30 minutos en hielo, la
mezcla se centrifuga durante 20 minutos a 12,000 x g a 4ºC. La bola
resultante se lava con 500 \mul de etanol helado (70%) y se
disuelve en 800 \mul de búfer TE. La concentración de
oligonucleótido fosforilizado se determina mediante densidad óptica
a 260 nm.
Antes de unir los oligonucleótidos
fosforilizados con las microplacas, se desnaturalizan sometiéndolos
a calor a 95ºC durante 10 minutos y rápidamente se enfrían en hielo
para evitar la formación de estructura secundaria. 500 ng de CONN6
(SEQ ID No. 11) o CONN7 (SEQ ID No. 12) y 1 \mul de 1 M
1-metilimidazola, pH 7, se añade a cada pozo de una
microplaca, que se mantiene en hielo. El volumen total de cada pozo
se ajusta a 70 \mul con agua destilada, antes de añadir 30 \mul
de una solución fría de
1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(167 mM). La microplaca se cubre y se incuba durante 5 horas a
50ºC en una incubadora (Thermomix® de Labsystems). Tras la
incubación de 5 horas, la microplaca se lava tres veces con una
solución caliente (50ºC) de 0.4 N NaOH que contenía 0.25% SDS. La
microplaca se incuba durante 5 minutos con la misma solución
caliente y se vuelve a lavar con NaOH/SDS caliente (50ºC).
Finalmente, la microplaca se lava cinco veces con búfer TE. La
microplaca cubierta puede mantenerse varios meses a 4ºC, si los
pozos están rellenos con búfer TE.
Las secuencias amplificadas de las muestras de
ADN genómico se incuban con una sonda de detección biotinilada en
las microplacas cubiertas. A diferencia de las sondas de captura,
que son específicas de alelo, la sonda de detección puede
hibridizarse tanto con las secuencias normales como con las
secuencias normales. La secuencia para la sonda de detección
es:
| CONN12: | 5'-CAGCATTGGAAAGATCTGGCTCA | (SEQ ID No. 13)-3'. |
Las secuencias amplificadas y la sonda de
detección, que es biotinilada en su extremo 5', se desnaturalizan
directamente en las microplacas añadiendo sucesivamente a cada
pozo: 95 \mul de agua, 5 \mul de reacción PCR, 40 \mul de
sonda biotinilada (SEQ ID No. 13) en 22 mM diluido en agua, y 14
\mul 1 N NaOH. Después de 10 minutos, se añaden 21 \mul de 1 M
NaH_{2}PO_{4} y 1% Sarkosul a cada pozo para conseguir un
volumen total de 175 \mul por pozo. La concentración final de la
sonda de detección es 5 nM. La microplaca se cubre y se incuba
durante la noche a 40ºC en una incubadora ((Thermomix® de
Labsystems) y a continuación se lava de manera de manera exhaustiva
(5 veces) con TBS-Tween para retirar el exceso de
sonda biotinilada (SEQ ID No. 13).
Se emplea un método inmunoenzimático para
detectar la sonda hibridizada. Cada pozo recibe 100 \mul del
conjugado (Extravidina-fosfatasa alcalina, Sigma
E-2636) diluido 1/4000 en TBS-BSA
Tween. La microplaca se cubre y se incuba durante una hora a 25ºC.
Tras la incubación, la microplaca se lava 5 veces con
TBS-Tween. A continuación se añaden 200 \mul del
sustrato (7.5 mg
para-nitro-fenil-fosfato
en 20 ml del siguiente búfer: 1 M dietanolamina pH 9.8 que contiene
1 mM MgCl_{2}) precalentado (37ºC) a cada pozo. La microplaca se
cubre y se incuba durante 3 horas a 37ºC. La absorbancia se mide a
405 mm para determinar la señal específica y a 630 mm para
determinar el ruido de fondo.
Se calcula el radio de hibridización (R) entre
la señal obtenida con la sonda CONN6 (SEQ ID No. 11) (secuencia
normal) y la obtenida con la sonda CONN7 (SEQ ID No. 12) (secuencia
mutante). Los valores R calculados se emplean para determinar los
genotipos de la muestra de ADN de la siguiente manera: homocigoto
para la secuencia normal Cx26 (R \geq 2), heterocigoto para la
mutación 30delG (0.5 < R < 2), y homocigotos para la mutación
30delG (R < 0.5). El rango de radio de hibridización (R) puede
modificarse ligeramente cuando el número de muestras aumenta. La
siguiente tabla representa un ejemplo de resultados obtenidos con
39 muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La electroforesis con gel gradiente de
temperatura (TGGE) permite la detección de cualquier tipo de
mutación, incluyendo las eliminaciones, inserciones y
sustituciones, que está en el interior de una región deseada de un
gen. (Ver, por ejemplo, D. Reiner et al. Electroforesis con
gel gradiente de temperatura de ácidos nucleicos: Análisis de
transiciones conformacionales, variaciones secuenciales e
interacciones proteína-ácido nucleico. Electrophoresis 1989; 10:
377-389; E. P. Lessa y G. Applebaum técnicas de
análisis para detectar variación alélica en secuencias de ADN.
Molecular Ecology 1993; 2: 119-129 y A. L.
Bórresen-Dale et al. Electroforesis con gel
gradiente de temperatura en el Sistema D code^{TM}.
Bio-Rad US/EG Boletín 2133; toda la descripción de
cada publicación aquí se incorpora como referencia). Sin embargo,
TGGE no permite determinar precisamente el tipo de mutación y su
localización.
Tal y como se ha descrito anteriormente en la
técnica de hibridización molecular, la región de interés en el gen
Cx26 se amplifica en primer lugar a partir de las muestras
genómicas de ADN mediante PCR. Las secuencias de imprimación son
las siguientes:
| CONN2: | 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCC | |
| \hskip0.4cm CGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC | (SEQ ID No. 14)-3' | |
| CONN4: | 5' ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA | (SEQ ID No. 10)-3' |
PCR se lleva a cabo con 1 mM del imprimador
CONN2 (SEQ ID No. 14), que tiene una abrazadera GC en su extremo
5', y 1 \muM del imprimador CONN4 (SEQ ID No. 10), una alícuota
de ADN a ser analizado (2 \mul, 100-300 ng), 1.5
mM MgCl_{2}, 200 \muM dNTP, y polimerasa Taq. El programa de
amplificación consiste en los siguientes pasos: 1) 95ºC, 5 min; 2)
adición de enzima, 95ºC, 1 min; 3) 60ºC, 1 min (rango de rampa o
elevación = 0.25ºC/segundo; 4) 72ºC, 1 min; 5) repetir pasos 2 a 4
durante 40 ciclos; y 6) 72ºC, 10 min.
Analizar estos fragmentos de amplificación PCR
mediante TGGE puede diferenciar entre muestras de homocigotos
(normales o mutante) que producen una única banda sobre un gel, y
muestras de heterocigotos, que producen tres bandas. Sin embargo,
diferenciar entre muestras que son de homocigotos para la secuencia
normal y muestras genómicas que son de homocigotos para los
mutantes 30delG requiere un paso adicional.
Para diferenciar muestras de homocigotos
normales de las muestras de homocigotos mutantes se mezcla una
alícuota del producto amplificado PCR con bien una muestra conocida
normal de homocigoto o con una muestra conocida mutante 30delG de
homocigoto y se analiza para la formación de heterodúplex. Si el
producto amplificado PCR deriva de una muestra normal de homocigoto
no formará un heterodúplex con la muestra conocida mutante 30delG
de homocigoto. Por otra parte, si el producto amplificado PCR
deriva de una muestra mutante de homocigoto, formará un
heterodúplex con la muestra conocida normal de homocigoto. Par
promover la formación de heterodúplex en estas mezclas, se
desnaturalizan a 95ºC durante 5 minutos, y a continuación tiene
lugar el paso de renaturalización a 60ºC durante 45 minutos.
Los fragmentos PCR de la amplificación inicial y
aquellos que están sometidos a los pasos adicionales de
calentamiento para permitir la formación de heterodúplex se
analizan en un gel 10% poliacrilamida que contiene 7 M urea. Como
modo de ejemplo, se preparan 30 ml de gel combinando los siguientes
ingredientes:
- 12.6 g urea
- 0.75 mL 50x TAE
- 7.5 ml archilamida:bisacrilamida (37.5:1) a
40%
- agua para conseguir un volumen de 30 ml
- 30 \mul Temed (añadido
extemporáneamente)
- 300 \mul presulfato de amonio 10% (añadido
extemporáneamente)
Tras añadir Temed y presulfato de amonio, se
vierte el gel entre dos placas de cristal (Dcode Universal Mutation
Detection System® de BIORAD) y se deja que polimerice durante una
hora.
Se mezcla una alícuota (7.5 \mul) de la mezcla
PCR con 7.5 \mul de 2x solución de muestra (2 mM EDTA pH 8; 70%
glicerol; 0.05% xileno cianol; 0.05% bromofenol azul), y se
introduce en un pozo con gel. La electroforesis se realiza durante
4-5 horas a 150V en búfer 1.25X TAE con un
gradiente de temperatura que oscila entre 61ºC y 62ºC a una
velocidad de 0.2ºC por hora. Tras la electroforesis el gel se incuba
durante 6 minutos en 1.25X TAE que contiene 25 \mug/ml de bromuro
de etidio. El exceso de bromuro de etidio se retira mediante un
lavado de 20 minutos en 1.25X TAE, y los fragmentos de ADN se
visualizan con un transiluminador UV.
Un resultado típico TGGE se representa en la
Figura 1. El ADN amplificado de pacientes homocigotos (normales o
mutantes) produce únicamente una banda. El ADN amplificado de
pacientes heterocigotos da como resultado tres diferentes
fragmentos en el gel de poliacrilamida. La banda más intensa, que
migra más rápidamente, corresponde a ambos homodúplexes, que no
pueden separarse en este gel. Las otras dos bandas, que migran más
despacio, corresponden a ambos tipos de homodúplexes.
El ADN de pacientes homocigotos normales puede
diferenciarse del ADN de pacientes homocigotos mutantes analizando
los fragmentos PCR que fueron sometidos a las condiciones que
permitieron la formación de heterodúplex. Los heterodúplexes se
forman cuando el fragmento amplificado de PCR de un genoma
homocigoto normal se mezcla con secuencias de un genoma homocigoto
conocido y mutante, o cuando el fragmento amplificado de PCR de un
genoma homocigoto mutante se mezcla con secuencias de un genoma
homocigoto conocido y normal. Estos heterodúplexes son visibles
mediante análisis TGGE. Como consecuencia, el ADN de pacientes
homocigotos normales y mutantes puede diferenciarse fácilmente
mediante esta técnica empleando imprimadores descritos en el
presente estudio.
En todas la familias DFNB1 conocidas (6/6), en
todas excepto una (8/9) de las familias putativamente unidas
mediante DFNB1, y en aproximadamente la mitad (11/21) de las
familias no testadas para la unión DFNB1, se detectó una mutación
en Cx26. Además, de los 44 cromosomas considerados independientes en
los cuales un alelo mutante Cx26 fue identificado o inferido, 33
(75%) resultaron llevar la misma eliminación de una guanosina, G,
en la posición 30 (30delG).
Las mutaciones Cx26 representan una causa
principal de sordera prelingual heredada de manera recesiva y
podrían estar implicadas en aproximadamente la mitad de los casos
en las poblaciones examinadas. Además, una mutación específica,
30delG, representa la mayoría (aproximadamente tres cuartas partes
en nuestras series) de los alelos mutantes de Cx26.
Este gen conexina 26 de tipo salvaje publicado
en LEE S.W et al (1992) J. Cell Biol. 118:
1213-1221 tiene la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otro gen conexina 26 de tipo salvaje tiene la
siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID No. 8). El ATG subrayado en
las secuencias corresponde al codón de inicio. El residuo de
guanina "G", que está en negrita, marca el fin de la región
rica en guanosina entre los nucleótidos 27 y 32, ambos
incluidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis aquí indicado hace referencia a
niños sordos de varias familias excepto de la familia 1873 (ver
pacientes y métodos).
* moderada en un oído, severa en el otro
oído.
** pérdida moderada de audición en la madre
(severa a altas frecuencias), *** pérdida leve de audición en el
padre, que es portador heterocigoto para la mutación 30delG.
Orígenes geográficos: (Alg) Algeria, (Aust)
Australia, (Fr) Francia, (Leb) Líbano, (NZ) Nueva Zelanda, (Pol)
Polonia, (Por) Portugal, (nTu) Norte de Túnez, (sTu) Sur de Túnez,
(Tur) Turquía.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Institut Pastes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28 rue du docteur Roux
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: París
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75015
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (33)145688093
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33)140613017
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: un polinucleótido mutado correspondiente a una mutación responsable e sordera prelingual no sindrómica en el gen conexina 26 y método para detectar este defecto hereditario
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #125 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- INFORMACIÓN DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: US 055 863
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-AUG-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TIPO DE MOLÉCULAS: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARAR SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2314 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Kiang, D T
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- PUBLICACIÓN: Gene
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- NUMERO: 199
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 165-171
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2312 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Lee, S W
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- PUBLICACIÓN: J. Cell Biol.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- NÚMERO: 118
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 1213-1221
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un polinucleótido purificado que tiene una
secuencia del gen Conexina 26 SEQ ID No. 8 que contiene una
eliminación específica de una guanosina en la posición 30 o de 38
bp comenzando en la posición 30, posición 1 siendo la primera base
del codón iniciador.
2. Un polinucleótido purificado que se hibridiza
bajo rigurosas condiciones de manera específica con un
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un oligonucleótido útil como una sonda, que
tiene una secuencia seleccionada del grupo consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un par de oligonucleótidos que son:
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un par de oligonucleótidos que son:
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método para la detección de un defecto
sensorial hereditario, la sordera autosómica prelingual
no-sindrómica, para individuos homocigotos y
heterocigotos en una muestra biológica que contiene ADN, que
consiste en los siguientes pasos:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con imprimadores de parejas de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, habiéndose sometido a hibridización de manera opcional el ADN contenido en la muestra y bajo condiciones que permiten la hibridización de los imprimadores con el ADN contenido en la muestra biológica;
- b)
- amplificar el ADN;
- c)
- revelar los productos de amplificación; y
- d)
- detectar la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de la reivindicación 6, donde en el
paso d) la mutación se detecta mediante una de las siguientes
técnicas:
- polimorfismo de conformación de cadena
sencilla (SSCP); o
- electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente (DGGE); o
- secuenciación; o
- electroforesis con gel gradiente de
temperatura (TGGE).
\vskip1.000000\baselineskip
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6
ó 7, donde el paso c) comprende la detección de productos
amplificados con una sonda de oligonucleótido de acuerdo con la
reivindicación 3.
\newpage
9. Un método para la detección de un defecto
sensorial hereditario, la sordera autosómica prelingual
no-sindrómica, para individuos homocigotos y
heterocigotos en una muestra biológica que contiene ADN, que
consiste en los siguientes pasos:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica con una sonda de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, habiéndose sometido a hibridización de manera opcional el ADN contenido en la muestra y bajo condiciones que permiten la hibridización de los imprimadores con el ADN contenido en la muestra biológica; y
- b)
- detectar el híbrido formado entre la sonda de oligonucleótido y el ADN contenido en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El método de acuerdo con las
reivindicaciones 6 a 9, donde antes del paso a), el ADN contenido
en la muestra biológica se amplifica empleando un par de
imprimadores.
11. El método de las reivindicaciones 6 a 8,
donde el paso d) además comprende los siguientes pasos:
- a)
- incubar los productos de amplificación con una sonda etiquetada de detección que se hibridiza tanto con la secuencia normal de Conexina 26 como con la secuencia mutante 30delG y una primera sonda de captura que se hibridiza con dicha secuencia normal de Conexina 26 pero que no se hibridiza con dicha secuencia mutante 30delG;
- b)
- incubar los productos de amplificación con dicha sonda etiquetada de detección y una segunda sonda de captura que se hibridiza con dicha secuencia mutante 30delG pero que no se hibridiza con dicha secuencia normal de Conexina 26;
- c)
- hibridizar los productos de amplificación con dicha sonda de detección y con dicha primera y segunda sonda de captura; y
- d)
- comparar la señal de hibridización obtenida de dicha primera sonda de captura con la señal de hibridización obtenida de dicha segunda sonda de captura.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El método de la reivindicación 11, donde en
el paso a) la muestra biológica se pone en contacto con el par de
imprimadores de oligonucleótido tal y como se reivindica en la
reivindicación 5.
13. El método de la reivindicación 11 ó 12,
donde dicha primera sonda de captura es
5'-AAAAAAAATCCTGGG
GGGTGTG (SEQ ID No. 11)-3' y dicha segunda sonda de captura es 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTGA (SEQ ID No. 12)- 3'.
GGGTGTG (SEQ ID No. 11)-3' y dicha segunda sonda de captura es 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTGA (SEQ ID No. 12)- 3'.
14. El método de las reivindicaciones 11 a 13,
donde dicha sonda de detección es
5'-CAGCATTGGAAAGATCTG
GCTCA (SEQ ID No. 13)-3'.
GCTCA (SEQ ID No. 13)-3'.
15. El método de las reivindicaciones 11 a 14,
donde dicha sonda de detección está etiquetada de manera no
radioactiva.
16. El método de la reivindicación 15, donde
dicha sonda de detección está etiquetada con biotina.
17. El método de las reivindicaciones 11 a 16,
donde las mencionadas sondas primera y segunda de captura están
unidas a una microplaca.
18. El método de la reivindicación 6, donde en
el paso a) la muestra biológica entra en contacto con el par de
imprimadores de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación
5.
19. El método de la reivindicación 18 que además
incluye entre los pasos b) y c):
- \quad
- incubar el ADN amplificado bien con una primera secuencia de nucleótido de una muestra conocida y normal de Conexina 26 o una segunda secuencia de nucleótido de una muestra conocida y mutante de Conexina 26; e
- \quad
- hibridizar el ADN amplificado bien con dicha primera secuencia de nucleótido o con dicha segunda secuencia de nucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
20. El método de la reivindicación 18 ó 19,
donde el paso d) comprende el análisis del ADN hibridizado para
diferenciar entre ADN de individuos homocigotos con Conexina 26
normal y ADN de individuos homocigotos con Conexina 26 mutante.
21. Un kit para la detección de un defecto
sensorial hereditario, la sordera autosómica prelingual
no-sindrómica, para individuos homocigotos y
heterocigotos, comprendiendo dicho kit:
- a)
- oligonucleótidos de acuerdo con la invención;
- b)
- los reagentes necesarios para llevar a cabo la amplificación de ADN; y
- c)
- un componente que haga posible determinar la longitud de los fragmentos amplificados o detectar una mutación.
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