ES2308575T3 - Identificacion y utilizacion de los miarn implicados en la diferenciacion de celulas procedentes de una leucemia mieloide. - Google Patents
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Abstract
Utilización, para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de la leucemia mieloide, de una molécula de ácidos nucleicos que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos elegida entre el ARN precursor miR23a/24-2 (SEQ ID NO: 13), una secuencia derivada que presenta una identidad de al menos el 80% con dicho ARN, una secuencia complementaria de dicho ARN y una secuencia derivada que presenta una identidad de al menos el 80% con dicha secuencia complementaria.
Description
Identificación y utilización de los miARN
implicados en la diferenciación de células procedentes de una
leucemia mieloide.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para identificar agentes terapéuticos para el
tratamiento de la leucemia mieloide, a un procedimiento para
identificar los miARN implicados en la diferenciación de células
leucémicas mieloides y a la utilización de miARN o de secuencias
complementarias a los miARN para fabricar un medicamento destinado
al tratamiento de la leucemia mieloide.
El término "silenciamiento por ARN" se
refiere a los mecanismos de represión de la expresión de un gen
mediados por un ARN y que utilizan interacciones específicas de
secuencia. En las plantas y los animales, existen principalmente
dos vías distintas de regulación
post-transcripcional de la expresión génica que
utilizan dos tipos diferentes de ARN pequeños.
Por una parte, están los siARN (ARN de
interferencia cortos) que son ARN pequeños de doble hebra (ARNdb) de
21 a 26 nucleótidos (nt) de longitud y que actúan como mediadores
específicos de secuencia para la degradación de ARNm durante el
mecanismo de ARN de interferencia (iARN). En la Drosophila, estos
siARN se obtienen de ARNdb por la acción de una enzima de tipo
ARNasa III denominada DICER. Los siARN formados se asocian entonces
al complejo proteico RISC (Complejo Silenciador Inducido por ARN)
que posee una actividad endonucleasa. El complejo RISC/siARN
formado puede cortar de forma específica las moléculas de ARN
citoplasmático que presentan una identidad de secuencia con el
siARN presente en el complejo. En las plantas y los animales, este
mecanismo juega un papel defensivo importante. Este mecanismo,
mediante la represión de la proliferación de los elementos
transponibles, está implicado igualmente en el mantenimiento de la
integridad del genoma.
Por otra parte, están igualmente los miARN
(micro ARN) que son ARN pequeños con una hebra extremadamente
conservados durante la evolución y que tienen una longitud de
aproximadamente 20 nucleótidos. Los miARN se generan como los
siARN, a saber, a partir de un precursor de doble hebra madurado por
la enzima DICER. Un mismo ARN precursor codifica varios miARN. Así,
los miARN miR-19b, miR-92,
miR-17, miR-18,
miR-19a, miR-19b,
miR-20 y miR-91 están codificados
por el mismo ARN precursor. Asimismo, los miARN
miR-23, miR-24 y
miR-27 están igualmente codificados por un mismo
ARN precursor Sin embargo, los miARN presentan no obstante un
determinado número de diferencias con los siARN. Así, los miARN son
moléculas con una hebra mientras que los siARN son moléculas de
doble hebra. Aunque el miARN miR-196 sea capaz de
escindir el ARNm Hox8 (YEKTA et al., Science, vol. 304, p:
594-596, 2004; MANSFIELD, Nat. Genet., vol.
36(10), p: 1079-83, 2004), la mayor parte de
los miARN animales no inducen la escisión endonucleótica de los ARN
diana. Por el contrario, los miARN animales inhiben en general la
traducción de los ARN diana hibridando con su secuencia 3'UTR
(región no traducida) mediante un mecanismo todavía desconocido
(para una revisión, véase BARTEL D.P., Cell, vol. 116, p:
281-297, 2004). Por ello, los miARN animales, a
diferencia de los miARN vegetales, presentan una homología de
secuencia parcial con sus dianas que podría justificar las
diferencias de su modo de acción. Finalmente, a diferencia de los
siARN, los miARN no parecen estar implicados en los mecanismos de
defensa sino más bien de desarrollo y, más particularmente, de
diferenciación. En efecto, la expresión de un miARN específico
(miR-181) en las células madre hematopoyéticas en
cultivo e in vivo aumenta la fracción de los linfocitos B,
lo que sugiere una implicación de este miARN en la diferenciación
de las células hematopoyéticas en linfocito B (CHEN et al.,
Science, vol. 303 (5654p, p: 83-6). Una indicación
indirecta de la importancia de los miARN en los procesos de
desarrollo en los animales lo proporciona una parada de la
embriogénesis, asociada a defectos precoces de los procesos de
diferenciación, en ratones en los que se ha mutado el gen que
codifica DICER (BERSTEIN et al., Nat. Genet., vol. 35, p:
215-7, 2003). A partir de estas diferentes
observaciones, se ha propuesto un modelo del mecanismo de desarrollo
en el que, para cada tipo celular particular y en un estadio de
desarrollo determinado, un conjunto de miARN específicos influye en
la expresión de una fracción determinada del transcriptoma (BARTEL
D.P., 2004, citado anteriormente).
Debido al vínculo entre la expresión de los
miARN y los procesos de diferenciación, el perfil de expresión de
los miARN durante la cancerogénesis suscita actualmente un interés
creciente. Así, se ha demostrado que el miARN let-7
está subexpresado en los cánceres de pulmón humanos y su
sobreexpresión en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón
inhibe el crecimiento celular in vitro (TAKAMIZAWA et
al., Cancer Res., vol. 64, p: 3753-3756,
2004).
La leucemia está calificada como cáncer de la
sangre y se caracteriza por una proliferación de los leucocitos. La
leucemia puede ser aguda y conllevar la muerte del paciente en
algunas semanas o algunos meses. Esta enfermedad puede evolucionar
en una forma linfocitaria o en una forma mieloide según el origen de
las células. La forma linfocitaria resulta de una
hiperproliferación de los progenitores implicados en la vía de
diferenciación linfoide, mientras que la forma mieloide resulta de
una hiperproliferación de los progenitores implicados en la vía de
diferenciación mieloide. En lo que se refiere más particularmente a
las leucemias mieloides, éstas se tratan con una combinación de
diversos agentes farmacológicos que permiten la diferenciación y la
apoptosis consecutiva de las células cancerosas. Sin embargo,
aparecen frecuentemente fenómenos de resistencia al tratamiento que
disminuyen otro tanto las oportunidades de curación del
paciente.
La leucemia aguda mieloide de tipo 3 (LAM3) o
también leucemia aguda promielocitaria (LAP) representa cerca del
10% de los casos de leucemia aguda mielocitaria. Las células
cancerosas procedentes de LAM3 se caracterizan por un bloqueo de la
granulopoyesis (vía de diferenciación de los granulocitos) en el
estadio promielocito (DE THE y CHELBIALIX, Oncogene, vol. 20, p:
7136-9, 2001). Las células bloqueadas en un estadio
precoz de diferenciación continúan proliferando y se acumulan en la
médula ósea. A veces, esta acumulación de células se extiende a la
circulación sanguínea periférica provocando la mayoría de las veces
la muerte de los pacientes por coagulación intravascular
diseminada. A nivel molecular, la translocación cromosómica
t(15;17) está asociada específicamente a este tipo de
leucemia y conduce a la síntesis de una proteína de fusión entre el
receptor \alpha del ácido retinoico (RAR\alpha) y la proteína
PML. Esta proteína de fusión, denominada
PML-RAR\alpha, interfiere negativamente con el
RAR\alpha. Esta interferencia conlleva un bloqueo de la
diferenciación de las células en el estadio promielocito. El
tratamiento clínico de esta leucemia utiliza agentes que inducen la
diferenciación celular (BENOIT et al., Oncogene, vol. 20, p:
7161-7177, 2001). Uno de los agentes terapéuticos
anticancerosos más utilizados para el tratamiento de la LAM3 es el
ácido retinoico todo trans o ATRA. El ATRA permite la
remisión de la enfermedad restaurando la diferenciación de las
células leucémicas y conlleva de forma consecutiva su muerte por
apoptosis. Sin embargo, como para las demás leucemias mieloides,
aparecen fenómenos de resistencia que muestran los límites de la
utilización de ATRA solo en la terapia anticancerosa. Actualmente,
se están estudiando diferentes combinaciones para desarrollar
protocolos más eficaces.
Consecuentemente, existe una necesidad urgente
de identificar nuevas moléculas que presentan una acción terapéutica
frente a las leucemias mieloides, de nuevos protocolos de
tratamiento eficaces y además de evaluar la eficacia de un
tratamiento en un paciente que padece leucemia mieloide.
De forma inesperada, los inventores han podido
demostrar que la diferenciación de células cancerosas procedentes
de una leucemia mieloide está acompañada de una modificación de la
expresión de los miARN y, en particular, que la diferenciación de
células cancerosas procedentes de una leucemia mieloide aguda de
tipo 3 (LAM3) está acompañada de una modificación de la expresión
de los miARN miR23a (SEQ ID NO: 9, AUCACAUUGCCAGGGAUUUCCA), miR27a
(SEQ ID NO: 11, UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC) y miR24-2
(SEQ ID NO: 12, TGGCTCAGTTCAG
CAGGAAC) codificados por un mismo ARN precursor (véase la figura 1) de secuencia SEQ ID NO: 13 (figura 2).
CAGGAAC) codificados por un mismo ARN precursor (véase la figura 1) de secuencia SEQ ID NO: 13 (figura 2).
Respecto a la implicación de los miARN en los
procesos de diferenciación durante la embriogénesis, la correlación
existente entre la expresión de los miARN y la diferenciación de las
células derivadas de la leucemia mieloide sugiere que los miARN
están implicados igualmente en el mecanismo de diferenciación de las
células derivadas de la leucemia mieloide.
Los inventores han podido confirmar esta
implicación de los miARN en el mecanismo de diferenciación de las
células derivadas de la leucemia mieloide y ponen de manifiesto la
inhibición de esta diferenciación en respuesta a una sobreexpresión
del ARN precursor de secuencia SEQ ID NO: 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Consecuentemente, la presente invención tiene
por objeto un procedimiento in vitro para identificar agentes
terapéuticos o combinaciones de agentes terapéuticos eficaces para
inducir la diferenciación de células leucémicas mieloides,
caracterizado porque comprende las etapas de:
i) poner en cultivo células procedentes de una
leucemia mieloide,
ii) adición de al menos un compuesto al medio de
cultivo de dicha línea celular,
iii) análisis de la evolución del nivel de
expresión de al menos un miARN codificado por el ARN precursor de
secuencia SEQ ID NO: 13 entre las etapas (i) y (ii),
iv) identificación de los compuestos o
combinaciones de compuestos que conllevan una modificación del nivel
de expresión de dicho miARN entre las etapas (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa (i) de poner en cultivo células
procedentes de una leucemia mieloide puede efectuarse según las
técnicas muy conocidas por el experto en la técnica. Los protocolos
para poner el cultivo que se pueden utilizar en el procedimiento
según la invención están descritos principalmente en BENOIT et
al. (2001, citado anteriormente).
Según un modo de realización preferido, el
procedimiento según la invención permite identificar agentes
terapéuticos o combinaciones de agentes terapéuticos eficaces para
tratar una leucemia mieloide asociada a un bloqueo de la
granulopoyesis y, particularmente, para tratar una leucemia mieloide
asociada a un bloqueo en el estadio promielocito tal como la LAM3.
Las células utilizadas en el procedimiento de la invención pueden
obtenerse de una leucemia mieloide aguda asociada a un bloqueo de
la granulopoyesis y, particularmente, de una leucemia mieloide
asociada a un bloqueo de las células en el estadio promielocito tal
como la LAM3.
Ventajosamente, las células utilizadas pueden
ser las células de la línea celular NB4 o una línea celular
derivada de ésta última, pudiendo elegirse dicha línea derivada
entre las líneas celulares NB4-LR1 y
NB4-LR2 (RUCHAUD et al., 1994, citado
anteriormente). Un protocolo para poner en cultivo la línea celular
NB4 o sus líneas derivadas se describe principalmente en BENOIT
et al. (2001, citado anteriormente).
\newpage
La línea promielocitaria humana NB4 se ha
aislado a partir de una extracción de médula ósea de una paciente
que padece una leucemia aguda promielocitaria (BENOIT et al.,
2001, citado anteriormente). Estas células portan la translocación
t(15;17) y tienen la capacidad de diferenciarse en
granulocitos neutrófilos bajo el efecto de ATRA.
Las líneas NB4-LR1 y
NB4-LR2, que se derivan de la línea NB4, presentan
una resistencia a la diferenciación inducida por ATRA. Para la
línea NB4-LR1, si la respuesta transcripcional de
ATRA se mantiene, su diferenciación necesita un tratamiento
conjunto ATRA/AMPc. El estudio de este mecanismo de resistencia ha
permitido identificar una alteración de las vías de señalización de
membrana en esta línea que conlleva un bloqueo de los procesos de
maduración engranados normalmente por ATRA. Para la línea celular
NB4-LR2, sus células expresan una proteína
PML-RAR\alpha que está truncada en su parte
RAR\alpha. Esta mutación que está localizada en el dominio de
unión al ácido retinoico de PML-RAR\alpha hace que
estas células sean insensibles a ATRA y a una mezcla ATRA/AMPc. La
restauración de la diferenciación necesita la cooperación entre las
vías de señalización de los rexinoides, tal como F R 11237 o B M S
749 (agonistas estrictos de RXR (receptor nuclear del retinoide X)
y AMPc. Como el RAR\alpha no es funcional, es igualmente posible
utilizar el ácido retinoico 9-cis, agonista a la
vez de RAR y de RXR, para inducir diferenciación dependiente de
RXR.
Ventajosamente además, las células que se ponen
en cultivo en la etapa i) pueden proceder de una extracción,
principalmente de una extracción sanguínea, de una persona que
padece leucemia mieloide. Los protocolos para poner en cultivo
dichas células son muy conocidos por el experto en la técnica y se
describen principalmente en LANOTTE et al. (Blood, vol. 77,
p: 1080-1086, 1991).
Según un modo de realización preferido de la
invención, el o los compuestos que pueden utilizarse en la etapa
(ii) del procedimiento según la invención pueden ser de cualquier
naturaleza, principalmente proteica, glucídica o lipídica. El
experto en la técnica puede así ensayar sencillamente y rápidamente
en el procedimiento según la invención los compuestos que él
considera que podrían presentar un efecto sobre la diferenciación de
las células procedentes de una leucemia mieloide.
Según otro modo de realización preferido de la
invención, el o los compuestos utilizados en la etapa (ii) del
procedimiento según la invención pueden ser agentes terapéuticos
utilizados en el tratamiento de otras enfermedades y, más
particularmente, en el tratamiento de otros cánceres. El experto en
la técnica puede así ensayar sencillamente y rápidamente en el
procedimiento según la invención los agentes terapéuticos conocidos
en el tratamiento de otras patologías y que él considera que podrían
presentar un efecto sobre la diferenciación de las células
procedentes de una leucemia mieloide.
Según otro modo de realización preferido de la
invención, el o los compuestos utilizados en la etapa (ii) del
procedimiento según la invención pueden ser agentes terapéuticos
utilizados en el tratamiento de la leucemia mieloide. El
procedimiento según la invención permite determinar las dosis y/o
las combinaciones óptimas de agentes terapéuticos para obtener una
diferenciación de las células. Como ejemplo de dichos agentes
terapéuticos, se pueden citar principalmente AMPc, arsénico,
interferones, TNF, ácido retinoico y los derivados de los
retinoides, tal como ATRA y los rexinoides.
El compuesto añadido en la etapa (ii) del
procedimiento según la invención puede añadirse directamente al
medio de cultivo celular a una concentración que puede estar
comprendida entre 1 pM y 1 M, preferentemente entre 1 nM y 100 mM y
de manera particularmente preferida entre 100 nM y 1 mM.
La etapa (iii) puede efectuarse según las
técnicas de análisis conocidas por el experto en la técnica. Por
ejemplo, esta etapa puede utilizar la técnica de transferencia
northern, de protección con RNasa, de RT-PCR
cuantitativa o utilizar microchips de ADN que integran los
oligonucleótidos complementarios a los miARN. Preferentemente, esta
etapa de análisis puede utilizar la técnica de transferencia
northern según el protocolo descrito en LLAVE et al. (Plant
Cell., vol. 14, p: 1605-1619, 2002). Para aplicar
dicho análisis, los ARN de las células que se ponen en cultivo en
la etapa (i), antes y después de la adición de un agente terapéutico
en la etapa (ii), pueden extraerse según las técnicas de extracción
conocidas por el experto en la técnica. En particular, las tomas de
células pueden efectuarse diariamente. Los ARN purificados pueden
depositarse en un gel de electroforesis. Después de la migración
del gel de electroforesis y de la transferencia de los ARN a una
membrana, la membrana puede hibridarse con una sonda marcada, fría
(biotina, etc.) o radiactiva (P^{32}, P^{33}, etc.), que
presenta una secuencia complementaria en todo o en parte con el ARN
precursor de secuencia SEQ ID NO: 13 o con al menos un miARN
codificado por este precursor. La secuencia de la sonda presenta una
longitud superior o igual a 10 nucleótidos, preferentemente a 15
nucleótidos y de manera particularmente preferida a 20 nucleótidos.
La secuencia de la sonda es complementaria en todo o en parte a la
secuencia del ARN precursor SEQ ID NO: 13, preferentemente a la
secuencia de al menos un miARN codificado por este precursor y de
manera particularmente preferida a al menos un miARN elegido entre
miR23a (SEQ ID NO: 9), miR27a (SEQ ID NO: 11) y
miR24-2 (SEQ ID NO: 12). Después de la hibridación
y lavado de la membrana, la señal de hibridación correspondiente al
miARN analizado puede cuantificarse según las técnicas muy
conocidas por el experto en la técnica, principalmente utilizando
un phosphoimager®. La señal de hibridación obtenida con una sonda
complementaria a este miARN puede normalizarse con la señal de
hibridación obtenida con una sonda complementaria a un transcrito
expresado de forma constitutiva en las células, tal como el ARN
28S. El valor normalizado obtenido para cada extracción corresponde
al nivel de expresión del miARN en las células para cada
condición
ensayada.
ensayada.
Según un modo de realización particular del
procedimiento según la invención, las células utilizadas en la
etapa (i) pueden transfectarse previamente utilizando las técnicas
conocidas por el experto en la técnica con una construcción que
contiene un gen informador, tal como el gen de la GFP y
potencialmente un gen de resistencia, tal como un gen de
resistencia a la higromicina o a la neomicina. El gen informador
contiene además al menos una secuencia complementaria en todo o en
parte a la secuencia del ARN precursor SEQ ID NO: 13,
preferentemente a al menos una secuencia de un miARN codificado por
este precursor y, de manera particularmente preferida, a al menos
un miARN elegido entre miR23a (SEQ ID NO: 9), miR27a (SEQ ID NO: 11)
y miR24-2 (SEQ ID NO: 12). Ventajosamente, dichas
secuencias complementarias tienen una longitud comprendida entre 10
y 100 nucleótidos, preferentemente entre 15 y 50 nucleótidos y, de
manera particularmente preferida, entre 18 y 25 nucleótidos. Los
protocolos que permiten la obtención de dicha construcción son
conocidos por el experto en la técnica; un protocolo como éste está
descrito principalmente para los siARN en MANSFIELD et al.
(2004, citado anteriormente). La utilización de dicha construcción
permite simplificar considerablemente el análisis del nivel de
expresión de los diferentes miARN ya que no necesita la extracción
de los ARN. En efecto, se ha demostrado que un miARN animal es
capaz de inducir la escisión de un ARN cuando éste último presenta
una secuencia perfectamente complementaria al miARN. La expresión
del gen informador, principalmente GFP, está condicionada a la
expresión del miARN del que está presente una secuencia
complementaria en la secuencia que codifica el gen informador. Así,
según si el agente terapéutico induce una disminución o un aumento
del ARN precursor o de al menos un miARN codificado por éste, se
observará un aumento o una disminución de la expresión del gen
informador, respectivamente. El seguimiento de la expresión del gen
informador podrá hacerse según las técnicas conocidas por el
experto en la técnica y principalmente en el caso de GFP siguiendo
la emisión de fluorescencia de las células transfectadas.
La etapa (iv) consiste en la identificación de
los compuestos o de las combinaciones de compuestos que conllevan
un aumento y/o una disminución del nivel de expresión del ARN
precursor SEQ ID NO: 13 o de al menos un miARN codificado por este
precursor, preferentemente de un miARN elegido entre miR23a (SEQ ID
NO: 9), miR27a (SEQ ID NO: 11) y miR24-2 (SEQ ID
NO: 12).
Según un modo de realización particular de la
invención, la etapa (iv) consiste en la identificación de los
compuestos o de las combinaciones de compuestos que conllevan una
disminución del nivel de expresión de al menos uno de dichos miARN.
En este modo de realización, la disminución del nivel de expresión
de al menos uno de dichos miARN puede aparecer entre el día
siguiente a la adición del agente terapéutico (D1) y el cuarto día
de tratamiento (D4).
Un segundo procedimiento descrito más adelante
se refiere a un procedimiento in vitro para identificar los
miARN asociados a la diferenciación de las células derivadas de una
leucemia mieloide, caracterizado porque comprende las etapas
de:
i) poner en cultivo una línea celular procedente
de una leucemia mieloide,
ii) adición, en el medio de cultivo, de al menos
un compuesto que induce la diferenciación de dicha línea
celular,
iii) análisis de la evolución del nivel de
expresión de al menos un miARN o de un precursor de miARN entre las
etapas (i) y (ii),
iv) identificación de los miARN que presentan
una variación de su perfil de expresión durante la
diferenciación.
La etapa de poner en cultivo (i) las células
procedentes de una leucemia mieloide puede efectuarse como se ha
descrito anteriormente.
El procedimiento descrito permite identificar
los miARN cuya expresión está asociada a la diferenciación de
células derivadas de una leucemia mieloide asociada a un bloqueo de
la granulopoyesis de dichas células, preferentemente asociada a un
bloqueo en el estadio promielocito tal como la LAM3.
Ventajosamente, la línea celular procedente de
una leucemia mieloide asociada a un bloqueo de la granulopoyesis
puede ser la línea celular NB4 o las líneas derivadas de ésta,
principalmente las líneas NB4-LR1 y
NB4-LR2 descritas anteriormente. La puesta en
cultivo de dichas líneas celulares puede efectuarse como se describe
en BENOIT et al. (2001, citado anteriormente).
La etapa (ii) de adición de compuestos que
inducen la diferenciación puede utilizar agentes terapéuticos que
se utilizan actualmente en el tratamiento del cáncer y,
preferentemente, en el tratamiento de la leucemia mieloide. Como
ejemplo de agentes terapéuticos que pueden utilizarse en la etapa
(ii) del procedimiento según la invención, se pueden citar
principalmente AMPc, arsénico, interferones, TNF, ácido retinoico y
los derivados de los retinoides, tal como ATRA, rexinoides. El
agente terapéutico utilizado puede añadirse directamente al medio
de cultivo celular a una concentración comprendida entre 1 pM y 1 M,
preferentemente entre 1 nM y 100 mM y, de manera particularmente
preferida, entre 100 nM y 1 mM.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los compuestos inductores de la diferenciación
para la línea NB4 pueden elegirse entre ATRA y una mezcla ATRA/AMPc.
Para obtener una diferenciación de dichas células, la concentración
de ATRA utilizada puede estar comprendida entre 1 nM y 1 mM,
preferentemente entre 10 nM y 100 \muM, de manera particularmente
preferida entre 100 nM y 10 \muM. El ATRA también puede
utilizarse en combinación con AMPc presente a una concentración
comprendida entre 100 nM y 100 mM, preferentemente 1 \muM y 10
mM, de manera particularmente preferida entre 10 \muM y 1 mM.
Según un segundo modo de realización preferido
de la invención, un compuesto inductor de la diferenciación para la
línea NB4-LR1 puede ser una mezcla ATRA/AMPc. Las
concentraciones preferidas para estos agentes terapéuticos son las
mismas que las descritas anteriormente.
Un compuesto inductor de la diferenciación para
la línea NB4-LR2 puede ser una mezcla
AMPc/rexinoides, tal como una mezcla AMPc/F R 11237 o AMPc/B M S
749 o una mezcla AMPc/ácido retinoico 9-cis. Para
obtener una diferenciación de dichas células, la concentración de
rexinoides, tal como F R 11237 o AMPc/B M S 749 o de ácido
retinoico 9-cis puede estar comprendida entre 1 nM y
1 mM, preferentemente entre 10 nM y 100 \muM, de manera
particularmente preferida entre 100 nM y 10 \muM. Las
concentraciones preferidas para el AMPc son las mismas que las
descritas anteriormente.
La etapa (iii) de análisis puede efectuarse como
se ha descrito anteriormente, pero utilizando como sonda las
secuencias complementarias a la secuencia de al menos un miARN. Las
secuencias de los miARN se describen principalmente en la solicitud
WO 03/029459 o en el sitio de internet
http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/
index.shtml.
index.shtml.
Como control interno, se podrá utilizar una
sonda complementaria en todo o en parte a la secuencia del ARN
precursor SEQ ID NO: 7 (véase la figura 3), preferentemente a al
menos un miARN codificado por este precursor y, de manera
particularmente preferida, a al menos un miARN elegido entre
miR-17 (SEQ ID NO: 1), miR-18 (SEQ
ID NO: 2), miR-19a (SEQ ID NO: 3),
miR-19b (SEQ ID NO: 4), miR-20 (SEQ
ID NO: 5), miR-91 (SEQ ID NO: 8) y
miR-92 (SEQ ID NO: 6).
La etapa (iv) consiste en la identificación de
los miARN que presentan una variación de su perfil de expresión
durante la diferenciación de la línea celular utilizada.
Según un modo de realización preferido, la etapa
(iv) consiste en la identificación de los miARN que presentan un
perfil de expresión idéntico o similar a al menos un miARN
codificado por el ARN precursor SEQ ID NO: 7, preferentemente a al
menos un miARN elegido entre miR-17 (SEQ ID NO: 1),
miR-18 (SEQ ID NO: 2), miR-19a (SEQ
ID NO: 3), miR-19b (SEQ ID NO: 4),
miR-20 (SEQ ID NO: 5), miR-91 (SEQ
ID NO: 8) y miR-92 (SEQ ID NO: 6).
Por miARN que presenta un perfil de expresión
idéntico al de al menos un miARN codificado por el ARN precursor
SEQ ID NO: 7, se entiende un miARN en el que las variaciones del
nivel de expresión siguen la misma cinética y con la misma amplitud
que las de al menos un miARN codificado por el ARN precursor SEQ ID
NO: 7 durante la diferenciación de las células de la línea celular
utilizada y principalmente de las células de la línea celular NB4 o
de una línea celular derivada de ésta.
Por miARN que presenta un perfil de expresión
similar al de al menos un miARN codificado por el ARN precursor SEQ
ID NO: 7, se entiende un miARN en el que las variaciones del nivel
de expresión siguen una cinética desfasada algunos días,
típicamente un día o dos, y/o con una amplitud superior o inferior a
las variaciones del nivel de expresión de al menos un miARN
codificado por el ARN precursor SEQ ID NO: 7 durante la
diferenciación de las células de la línea celular NB4 o de una
línea celular derivada.
Según un modo de realización preferido del
procedimiento descrito, los miARN identificados presentan un aumento
de su nivel de expresión en respuesta a la adición de un agente
terapéutico inductor de la diferenciación, tal como ATRA o una
mezcla ATRA/AMPc, entre el día del tratamiento (D0) y el cuarto día
de tratamiento (D4), preferentemente entre el primer y el tercer
día de tratamiento con dicho agente terapéutico.
Los miARN identificados presentan una
disminución de su nivel de expresión en respuesta a la adición de un
agente terapéutico inductor de la diferenciación, tal como ATRA,
entre el segundo (D2) y el cuarto día de tratamiento (D4) con dicho
agente terapéutico.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a la utilización, para fabricar un medicamento destinado al
tratamiento de la leucemia mieloide, de una molécula de ácidos
nucleicos elegida entre el ARN precursor miR23a/24-2
(SEQ ID NO: 13), una secuencia derivada de dicho ARN, una secuencia
complementaria a dicho ARN y una secuencia derivada de dicha
secuencia complementaria.
Ventajosamente, dicho medicamento es una
molécula de ácidos nucleicos elegida entre una secuencia
complementaria del ARN precursor miR23a/24-2 (SEQ
ID NO: 13) y una secuencia derivada de dicha secuencia
complementaria.
Según otro modo de realización preferido de la
invención, la invención tiene por objeto la utilización, para
fabricar un medicamento destinado al tratamiento de la leucemia
mieloide, de al menos una molécula de ácidos nucleicos que presenta
una secuencia elegida entre:
i) la secuencia de miR23a (SEQ ID NO: 9), una
secuencia derivada de miR23a, la secuencia complementaria de
miR23a, una secuencia derivada de dicha secuencia
complementaria,
\global\parskip1.000000\baselineskip
ii) la secuencia de miR27a (SEQ ID NO: 11), una
secuencia derivada de miR27a, la secuencia complementaria de
miR27a, una secuencia derivada de dicha secuencia
complementaria,
iii) la secuencia de miR24-2
(SEQ ID NO: 12), una secuencia derivada de miR24-2,
la secuencia complementaria de miR24-2 y una
secuencia derivada de dicha secuencia complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, dicho medicamento comprende una
molécula de ácidos nucleicos elegida entre una secuencia
complementaria de miR23a (SEQ ID NO: 9), de miR27a (SEQ ID NO: 11)
y de miR24-2 (SEQ ID NO: 12) y las secuencias
derivadas de dichas secuencias complementarias.
Preferentemente, la invención tiene por objeto
la utilización de al menos una de dichas moléculas de ácidos
nucleicos, para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de
una leucemia mieloide asociada a un bloqueo de la granulopoyesis, y
de manera particularmente preferida a un bloqueo en el estadio
promielocitos, tal como la LM3.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden
utilizarse en forma de una hebra o de doble hebra, preferentemente
en forma de una hebra. Los ácidos nucleicos pueden seleccionarse
entre ADN, ARN o los ácidos nucleicos modificados tales como los
ribonucleótidos o los desoxirribonucleótidos que presentan un grupo
azúcar o un grupo carbonado modificado.
Las moléculas de ARN o de ADN utilizadas en la
presente invención pueden contener igualmente uno o varios
nucleótidos modificados, es decir, un ribonucleótido o
desoxirribonucleótido natural sustituido por un análogo sintético
de un nucleótido. Dichos análogos de nucleótidos pueden estar
localizados, por ejemplo, en el extremo 3' ó 5' de la molécula de
ácido nucleico.
Los análogos sintéticos de los nucleótidos
preferidos se seleccionan entre los ribonucleótidos que presentan
un grupo azúcar o grupo carbonado modificado. Preferentemente, los
ribonucleótidos que presentan un grupo azúcar modificado presentan
un grupo 2'-OH reemplazado por un grupo seleccionado
entre un átomo de hidrógeno, un halógeno, un grupo OR, R, SH, SR,
NH_{2}, NHR, NR_{2} o CN, en el que R es un grupo alquilo,
alquenilo, o alquinilo de 1 a 6 carbonos y el halógeno es flúor,
cloro, bromo o yodo. Preferentemente, los ribonucleótidos que
presentan un grupo carbonado modificado tienen su grupo fosfoéster
unido al ribonucleótido adyacente que está reemplazado por un grupo
modificado tal como un grupo fosfotioato. Sin embargo, es posible
igualmente utilizar los ribonucleótidos que presentan un núcleo
purina o pirimidina modificado. Como ejemplos de dichos núcleos
modificados, se citarán principalmente las uridinas o las citidinas
modificadas en la posición 5, tales como
5-(2-amino)propil uridina y
5-bromo uridina, las adenosinas y guanosinas
modificadas en la posición 8, tal como 8-bromo
guanosina, los nucleótidos desnitrogenados, tal como
7-deaza-adenosina, los nucleótidos
N y O-alquilados, tal como N6-metil
adenosina. Igualmente, estas diferentes modificaciones pueden
combinarse.
Las moléculas de ácido nucleico utilizadas en la
presente invención pueden obtenerse por métodos de síntesis química
o por métodos de biología molecular, principalmente por
transcripción a partir de matrices de ADN o de plásmidos aislados a
partir de microorganismos recombinantes. Preferentemente, esta etapa
de transcripción utiliza ARN polimerasas de fago tales como la ARN
polimerasa T7, T3 o SP6.
Por secuencia derivada, se entiende una
secuencia que presenta una identidad de al menos el 80%,
preferentemente de al menos el 90% y de manera particularmente
preferida de al menos el 95% con una secuencia de referencia. La
determinación de una identidad de secuencia se efectúa según la
fórmula siguiente:
I =
n/L
Donde I representa la identidad en porcentaje
(%), n es el número de nucleótidos idénticos entre una secuencia
dada y una secuencia de miARN dada y L es la longitud de la
secuencia. Los nucleótidos A, C, G y U pueden corresponder a
ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y/o análogos de nucleótidos,
como los análogos sintéticos de nucleótido. Además, los nucleótidos
pueden estar sustituidos por nucleótidos que forman uniones de
hidrógeno análogas con una secuencia nucleica complementaria. Así,
el nucleótido U puede estar sustituido por un nucleótido T.
Las moléculas de ácidos nucleicos utilizadas
para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de la leucemia
mieloide tienen preferentemente una longitud comprendida entre 15 y
100 nucleótidos, preferentemente entre 18 y 80 nucleótidos y de
manera particularmente preferida entre 18 y 30 nucleótidos. En el
caso de las moléculas de miARN maduras, presentan una longitud
comprendida entre 19 y 24 nucleótidos y más particularmente de 21,
22 ó 23 nucleótidos. Ventajosamente, la secuencia complementaria a
un miARN presenta una longitud comprendida entre 19 y 24
nucleótidos. Sin embargo, es posible utilizar la secuencia derivada
de un precursor de miARN de una longitud comprendida entre 50 y 90
nucleótidos, la mayoría de las veces entre 60 y 80 nucleótidos,
pero que también puede presentar una longitud superior a 100
nucleótidos.
La administración de las moléculas de ácidos
nucleicos puede efectuarse por los métodos de transferencia de
genes conocidos por el experto en la técnica.
Los métodos comunes de transferencia de genes
incluyen el fosfato de calcio, DEAE-Dextrano,
electroporación, microinyección, métodos virales y liposomas
catiónicos (GRAHAM y VAN DER EB, Virol., vol. 52, p: 456, 1973;
McCUTHAN y PAGANO, J. Natl. Cancer Inst., vol. 41, p: 351, 1968; CHU
et al., Nucl. Acids Res., vol. 15, p. 1311; FRALEY et
al., J. Biol. Chem., vol. 255, p: 10431, 1980; CAPECCHI et
al., Cell, vol. 22, p: 479, 1980; FELGNER et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, p: 7413, 1988).
Las moléculas de ácidos nucleicos a administrar
pueden estar en la forma de una disolución, principalmente de una
disolución inyectable, de una crema, de un comprimido o de una
suspensión. El soporte puede ser cualquier soporte farmacéutico.
Preferentemente, se utilizará un soporte capaz de mejorar la entrada
de las moléculas de ácidos nucleicos a las células. Dichos soportes
incluyen principalmente los liposomas, preferentemente los
liposomas catiónicos.
Una cantidad eficaz de las moléculas de ácidos
nucleicos a administrar a un paciente la puede determinar
sencillamente un experto en la técnica. Como ejemplo, una cantidad
eficaz de las moléculas de ácidos nucleicos está comprendida entre
0,001 mg y 10 g/kg del paciente a tratar, preferentemente entre 0,01
mg y 1 g/kg y de manera particularmente preferida entre 0,1 y 100
mg/kg.
Los ejemplos siguientes se proporcionan como
ilustración y no pretenden limitar el alcance de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de la línea celular NB4 y de la
línea celular NB4-LR1, resistente a la maduración
por ATRA solo, se cultivaron como se describe en LANOTTE et
al. (1991, citado anteriormente) y en RUCHAUD et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 91, p: 8428-8432,
1994). Las células se trataron durante 4 días en presencia de 1
\muM de ácido retinoico todo trans (ATRA,
SIGMA-ALDRICH) solo o con la adición de 100 \muM
de un análogo de AMPc
(8-CPT-AMPc-SIGMA-ALDRICH).
La proliferación celular se determinó
diariamente por contaje de las células utilizando un contador de
células (BECKMAN COULTER FRANCIA SA) del día 0, después de la
adición del agente terapéutico, al día 4. Los resultados muestran
que los diferentes tratamientos inducen una disminución de la
proliferación.
Paralelamente, la evolución de la diferenciación
se determinó diariamente durante el tratamiento. La diferenciación
granulocítica se evaluó simultáneamente según criterios morfológicos
y bioquímicos. El análisis morfológico se efectuó después de una
tinción de May-Grünwald. El análisis bioquímico se
efectuó por un ensayo de coloración basado en la reducción de NBT
(azul de nitro tetrazolio) que permite medir la capacidad oxidativa
de las células maduras para reducir el colorante NBT. A este
efecto, 0,5 a 1 x 10^{5} células se centrifugaron durante 5 min a
190 g, el sedimento celular se recogió en 200 \mul de tampón
salino fosfato (PBS) con NBT (SIGMA ALDRICH, 1 mg/ml) y PMA (Forbol
12-miristato-13-acetato,
SIGMA, 10^{-7}M) y se incubó 20 minutos a 37ºC. Las células se
recogieron en láminas por centrifugación Cytospin® y se observaron
con microscopio de contraste de fase. Se examinó un mínimo de 200
células por lámina bajo microscopio óptico y se calculó un
porcentaje de diferenciación sobre la base del número de células
NBT positivas. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla I
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que el
co-tratamiento ATRA/AMPc permite obtener una
diferenciación de las células NB4 y NB4-LR1. En
cambio, sólo las células de la línea celular NB4 se diferencian en
presencia de ATRA solo. La figura 4 muestra un ejemplo de
coloración de células NB4 con NBT antes y después de tres días de
tratamiento con ATRA. Se observa claramente el cambio de morfología
de las células resultante de su diferenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
En una primera serie de experimentos, se evaluó
la expresión de diferentes miARN durante la diferenciación de las
células NB4 en presencia o en ausencia de ATRA. Se determinó
principalmente la expresión de los miARN siguientes:
Entre estos miARN, algunos pertenecen a un mismo
precursor, así (A) los miARN miR-19b,
miR-92, miR-17,
miR-18, miR-19a,
miR-19b, miR-20,
miR-91 y miR-92, (B) los miARN
miR15a y miR16 y (C) los miARN miR23a, miR27a y
miR24-2 (véase la figura 1). Un modelo plantea que
dichos miARN generados a partir de un mismo ARN precursor presentan
un mismo perfil de expresión (LEE et al., Embo J., vol. 21,
p: 4663-4670, 2002).
Los ARN totales se extrajeron de las células de
las líneas celulares NB4 tratadas o no con 1 \muM de ATRA en los
mismos intervalos de tiempo que en el ejemplo 1 y utilizando el kit
Tri-Reagent® (SIGMA) según las instrucciones del
fabricante. El análisis por northern de los ARN de bajo peso
molecular se efectuó como se describe en LLAVE et al. (2002,
citado anteriormente). Todos los experimentos de northern se
efectuaron en duplicado. Los oligonucleótidos de ADN
complementarios a las secuencias de los miARN analizados se marcaron
en su extremo con ATP \gamma-P^{32} utilizando
la polinucleótido quinasa T4 (NEW ENGLAND BIOLABS) según las
instrucciones del fabricante.
La figura 5 muestra el perfil de expresión de
los diferentes miARN analizados en las células NB4 después de 0, 1,
2, 3 y 4 días de tratamiento. La cantidad de ARN en cada pocillo se
controló por coloración del gel con bromuro de etidio y
visualización de los ARN ribosómicos (ARNr) bajo luz UV.
Los resultados muestran que la inducción de la
diferenciación de las células NB4 en presencia de ATRA induce una
modificación de la expresión de numerosos miARN (véase la figura 5).
Además, resulta que los miARN que pertenecen a un mismo precursor
presentan efectivamente un perfil de expresión similar en el
tiempo.
De forma más detallada, los resultados obtenidos
muestran una modulación del nivel de expresión de los miARN
miR-19b, miR-23a y
miR-92 durante la diferenciación de las células NB4
en respuesta al tratamiento con ATRA. En el caso de
miR-23a, su nivel de expresión aumenta con el tiempo
en respuesta al tratamiento con ATRA.
El perfil de expresión de
miR-19b y de miR-92 difiere del de
miR-23. Este perfil de expresión corresponde a un
primer aumento del nivel de expresión de miR-19b y
miR-92, inmediatamente después del tratamiento (D0)
con un máximo de expresión en el tercer día de tratamiento.
Finalmente, el nivel de expresión de miR-19b y de
miR-92 cae entre el 3^{er} y 4º día de tratamiento
(entre D3 y D4) cuando se completa la diferenciación de los
granulocitos (véase la tabla I). Además, el nivel de expresión de
miR-19b y de miR-92 en el 4º día de
tratamiento es inferior a su nivel de expresión en las células no
tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para establecer formalmente la correlación entre
la expresión de los diferentes miARN identificados y la
diferenciación en granulocitos, las células de las líneas celulares
NB4 y NB4-LR1 se cultivaron en presencia o en
ausencia de ATRA como se ha descrito en el ejemplo 1.
Se efectuaron experimentos de northern según el
protocolo descrito en el ejemplo 2. Los diferentes experimentos de
northern se realizaron con sondas complementarias a los miARN
miR-23a, miR-17,
miR-18, miR-19a,
miR-19b, miR-20,
miR-23 y miR-92.
Los resultados obtenidos muestran que el perfil
de expresión de miR-23 es similar en las células NB4
y NB4-LR1 en respuesta a un tratamiento con ATRA
(véanse las figuras 5 y 6). En cambio, no se observa ningún aumento
de la expresión de miR-23a en el caso de un
tratamiento de las células NB4-LR2 con ATRA.
En cambio, los resultados han mostrado que los
diferentes miARN miR-17, miR-18,
miR-19a, miR-19b,
miR-20 y miR-92, que están
codificados por un mismo ARN precursor, presentan un perfil de
expresión diferente entre las células NB4 y NB4-LR1
en respuesta al tratamiento con ATRA.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar la correlación entre la expresión
de los diferentes miARN y principalmente miR-17,
miR-18, miR-19a,
miR-19b, miR-20 y
miR-92 y la diferenciación en granulocitos, las
células de las líneas celulares NB4 y NB4-LR1 se
cultivaron en presencia o en ausencia de ATRA/AMPc como se ha
descrito en el ejemplo 1. Después de un
co-tratamiento ATRA/AMPc, se restaura la
diferenciación de las células de la línea celular
NB4-LR1 en granulocitos.
Se efectuaron experimentos de northern según el
protocolo descrito en el ejemplo 2. Los diferentes experimentos de
northern se realizaron con sondas complementarias a los miARN
miR-17, miR-18,
miR-19a, miR-19b,
miR-20 y miR-92.
Los resultados han mostrado que el perfil de
expresión de estos diferentes miARN es idéntico entre las células
NB4 y NB4-LR1 en respuesta al
co-tratamiento ATRA/AMPc. Sin embargo, el perfil de
expresión de estos miARN difiere del observado en las células NB4
en respuesta al tratamiento con ATRA solo. En respuesta al
co-tratamiento ATRA/AMPc, los miARN
miR-17, miR-18,
miR-19a, miR-19b,
miR-20 y miR-92 muestran un efecto
máximo de expresión en el 2º día de tratamiento, después una
disminución importante de su nivel de expresión entre el 2º y el
3^{er} día de tratamiento y finalmente su nivel de expresión
inicial se restablece entre el 3^{er} y el 4º día de
expresión.
La inducción y la caída consecutiva del nivel de
expresión de los miARN miR-17,
miR-18, miR-19a,
miR-19b, miR-20 y
miR-92 se produce por lo tanto de manera más precoz
en respuesta al co-tratamiento ATRA/AMPc (respecto
al tratamiento con ATRA solo), al igual que la diferenciación de las
células NB4 en granulocitos (véase la tabla I).
Los resultados obtenidos confirman, por lo
tanto, la correlación entre la expresión de determinados miARN y
principalmente los miARN miR-17,
miR-18, miR-19a,
miR-19b, miR-20 y
miR-92 y la diferenciación de las células NB4 y
NB4-LR1 en granulocitos. Además, la cinética
diferente de la expresión de los miARN estudiados entre el
tratamiento con ATRA y el co-tratamiento ATRA/AMPc
puede justificarse por la cinética diferente de diferenciación
entre los dos tratamientos. Finalmente, la cinética de la expresión
de los miARN miR-17, miR-18,
miR-19a, miR-19b,
miR-20 y miR-92 muestra, por lo
tanto, sucesivamente una inducción de su expresión con el inicio de
la diferenciación y una inhibición de su expresión al final de la
diferenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la posible implicación de
algunos de los miARN analizados en la granulopoyesis, las secuencias
genómicas que codifican el ARN precursor de secuencia SEQ ID NO: 7
que codifica los miARN miR17/92 (véase la figura 3, la secuencia
complementaria de la secuencia que codifica el ARN precursor de
secuencia SEQ ID NO: 7 se representa en la figura 8, SEQ ID NO:
10), el ARN precursor de secuencia SEQ ID NO: 13 que codifica los
miARN miR23a/24-2 y el ARN precursor de secuencia
SEQ ID NO: 16 (véase la figura 7) que codifica los miARN miR16/15a
se clonaron en posición 5' respecto al sitio interno de entrada
ribosomal (IRES) del vector MIE (MSCV IRES EGFP (proteína verde
fluorescente amplificada), SYSTEMIX) como se describe en CHANGCHUN
et al. (Blood, vol. 94(2), p:
793-802, 1999). La producción de sobrenadantes que
contienen los diferentes retrovirus MIE- miARN (conteniendo MIE
principalmente la secuencia genómica SEQ ID NO: 10 bajo el control
de un promotor pol II) en la línea celular Bosc 23 (PEAR et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90,
p8392-8396, 1993) se efectuó como se describe en
LAVAU et al. (EMBO J., vol. 16, p: 4226-4237,
1997). Las células de la línea celular NB4 se infectaron con los
diferentes retrovirus seleccionados según el protocolo descrito en
CHANGCHUN et al. (1999, citado anteriormente).
Las células de la línea celular NB4 infectadas
con el vector MIE solo o con los diferentes vectores
MIE-miARN se cultivan como se ha descrito en el
ejemplo 1 en presencia o en ausencia de ATRA.
La evolución de la diferenciación se determinó
diariamente para los diferentes cultivos como se ha descrito en el
ejemplo 1.
Los resultados muestran que a diferencia de las
células infectadas con los vectores MIE solo,
MIE-miR17/miR92 y miR15a/16, los cuales se
diferencian al cabo de cuatro días de cultivo en presencia de ATRA,
las células infectadas con el vector
MIE-miR23a/miR24-2 no se diferencian
en las mismas condiciones (véanse las figuras 9 y 10).
Con el fin de confirmar la sobreexpresión de los
miARN en las células NB4 infectadas, se efectuaron experimentos de
northern según el protocolo descrito en el ejemplo 2. Los diferentes
experimentos de northern se realizaron con sondas complementarias a
los miARN miR-23a, miR16 y
miR-92.
Los resultados confirman que las células
infectadas con los vectores MIE- miARN presentan un nivel de
expresión para los miARN codificados por el vector MIE- miARN
utilizado para infectarlas (véase la figura 11).
Consecuentemente, y de forma inesperada, los
resultados sugieren que los miARN miR23a, miR27a y
miR24-2 están implicados potencialmente en la
diferenciación de las células NB4 en presencia de ATRA y más
precisamente que estos miARN regulan "negativamente" la vía de
diferenciación de la granulopoyesis en las células NB4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar individualmente la implicación
de los diferentes miARN codificados por el precursor
miR23a/24-2 en la granulopoyesis inducida por ATRA,
la secuencia genómica que codifica el ARN precursor de secuencia SEQ
ID NO: 13 que codifica los miARN miR23a/24-2, así
como diferentes construcciones que presentan una deleción para uno
o dos miARN codificados por este último (\Delta24\Delta27,
\Delta24, \Delta23\Delta24, \Delta23, \Delta23\Delta27
y \Delta27) se clonaron en posición 5' respecto al sitio interno
de entrada ribosomal (IRES) del vector MIE como se ha descrito
anteriormente.
Las células de la línea celular NB4 se
infectaron con estos diferentes vectores retrovirales, se
seleccionaron según el protocolo descrito en el ejemplo 5 y se
cultivaron como se ha descrito en el ejemplo 1 en presencia o en
ausencia de ATRA.
La evolución de la diferenciación se determinó
diariamente para los diferentes cultivos como se ha descrito en el
ejemplo 1.
Los resultados muestran que sólo el vector que
integra el precursor completo miR23a/24-2 permite
bloquear la diferenciación de las células NB4 en presencia de ATRA
(véase la figura 12). Los experimentos de transferencia northern
efectuados según el protocolo descrito anteriormente muestran que
los vectores que codifican los precursores truncados
miR23a/24-2 permiten sin embargo obtener la
sobreexpresión de los miARN efectivamente codificados por estos
últimos (véase la figura 13).
Consecuentemente, la expresión coordinada de los
miARN miR23a, miR27a y miR24-2 es necesaria para
obtener un bloqueo de la diferenciación de las células NB4 en
presencia de ATRA.
Con el fin de determinar si el precursor
completo miR23a/24-2 es necesario para la inhibición
de la diferenciación de las células NB4 en presencia de ATRA, las
células NB4 se co-infectaron con el vector MIE solo
o con los vectores MIE-\Delta23\Delta27 y
MIE-\Delta24 simultáneamente.
Los resultados muestran que la complementación
en trans de los diferentes miARN del precursor
miR23a/24-2 no permite bloquear la diferenciación
de las células NB4 en presencia de ATRA (véase la figura 14). Sin
embargo, los experimentos de northern efectuados sobre las células
infectadas según el protocolo descrito anteriormente muestran que
los diferentes miARN miR23a, miR27a y miR24-2 están
sobreexpresados en las células infectadas simultáneamente con los
vectores MIE-\Delta23\Delta27 y
MIE-\Delta24 (véase la figura 15).
En conclusión, y de forma inesperada, estos
experimentos muestran que la expresión de los miARN miR23a, miR27a
y miR24-2 simultáneamente y a partir de un mismo
precursor es necesaria para inhibir la diferenciación de las
células NB4 en presencia de ATRA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron oligonucleótidos modificados
químicamente (LNA®-DNA, PROLIGO) y de secuencia complementaria a
miR23a, miR27a y miR24-2. Estos oligonucleótidos
modificados están compuestos de análogos de nucleótidos que
contienen un puente 2'-O, 4'-C
metileno que permite mejorar tanto la estabilidad del
oligonucleótido obtenido como los rendimientos de hibridación de
éste.
Las células de las líneas celulares NB4 o
NB4-LR1 se transfectaron con los oligonucleótidos
sintetizados según el protocolo descrito en MEISTER et al.
(RNA, vol. 10(3), p: 544-50, 2004).
Las células de las líneas celulares NB4 y
NB4-LR1, transfectadas o no con un oligonucleótido
complementario a los miARN miR23a, miR27a y
miR24-2, se cultivan como se ha descrito en el
ejemplo 1 en presencia o en ausencia de ATRA o de una mezcla
ATRA/AMPc.
La evolución de la diferenciación se determinó
diariamente para los diferentes cultivos como se ha descrito en el
ejemplo 1.
Paralelamente, se efectuaron experimentos de
northern según el protocolo descrito en el ejemplo 2. Los diferentes
experimentos de northern se realizaron con sondas complementarias a
los miARN miR23a, miR27a y miR24-2.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Centre National de la Recherche
Scientifique (CNRS)
\hskip1.05cmVOINNET, Olivier
\hskip1.05cmLECELLIER,
Charles-Henri
\hskip1.05cmSAUMET, Anne
\hskip1.05cmLANOTTE, Michel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de miARN en el
tratamiento de la leucemia mieloide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 36661/PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 04/11725
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-11-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión PatentIn 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 23
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 23
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip1cm6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 22
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip1cm7
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<210> 6
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<211> 22
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 980
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 20
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip1cm10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 980
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
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\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 22
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
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\hskip1cm14
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<210> 13
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<211> 950
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 22
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\hskip1cm16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 22
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 21
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\hskip1cm20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 22
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip1cm21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Utilización, para fabricar un medicamento
destinado al tratamiento de la leucemia mieloide, de una molécula
de ácidos nucleicos que tiene una longitud de al menos 15
nucleótidos elegida entre el ARN precursor
miR23a/24-2 (SEQ ID NO: 13), una secuencia derivada
que presenta una identidad de al menos el 80% con dicho ARN, una
secuencia complementaria de dicho ARN y una secuencia derivada que
presenta una identidad de al menos el 80% con dicha secuencia
complementaria.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho medicamento comprende una molécula
de ácidos nucleicos elegida entre una secuencia complementaria del
ARN precursor miR23a/24-2 (SEQ ID NO: 13) y una
secuencia derivada de dicha secuencia complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque dicho
medicamento comprende una molécula de ácidos nucleicos que presenta
una secuencia elegida entre:
i) la secuencia de miR23a (SEQ ID NO: 9), una
secuencia derivada de miR23a, la secuencia complementaria de
miR23a, una secuencia derivada de dicha secuencia
complementaria,
ii) la secuencia de miR27a (SEQ ID NO: 11), una
secuencia derivada de miR27a, la secuencia complementaria de
miR27a, una secuencia derivada de dicha secuencia
complementaria,
iii) la secuencia de miR24-2
(SEQ ID NO: 12), una secuencia derivada de miR24-2,
la secuencia complementaria de miR24-2 y una
secuencia derivada de dicha secuencia complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque dicho medicamento comprende una molécula
de ácidos nucleicos elegida entre una secuencia complementaria de
miR23a (SEQ ID NO: 9), de miR27a (SEQ ID NO: 11) y de
miR24-2 (SEQ ID NO: 12) y las secuencias derivadas
de dichas secuencias complementarias.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para fabricar un medicamento destinado al
tratamiento de una leucemia mieloide asociada a un bloqueo de la
granulopoyesis.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las secuencias
de ácidos nucleicos tienen una longitud comprendida entre 15 y 100
nucleótidos.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque las moléculas de
ácidos nucleicos se eligen entre las moléculas de ADN y de ARN.
8. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las moléculas de
ácidos nucleicos contienen uno o varios nucleótidos
modificados.
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque las moléculas de
ácidos nucleicos están en forma de una hebra o de doble hebra.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento in vitro para
identificar agentes terapéuticos o combinaciones de agentes
terapéuticos eficaces para inducir la diferenciación de células
leucémicas mieloides, caracterizado porque comprende las
etapas de:
i) poner en cultivo células procedentes de una
leucemia mieloide,
ii) adición de al menos un compuesto al medio de
cultivo de dicha línea celular,
iii) análisis de la evolución del nivel de
expresión de al menos un miARN codificado por el ARN precursor de
secuencia SEQ ID NO: 13 entre las etapas (i) y (ii),
iv) identificación de los compuestos o
combinaciones de compuestos que conllevan una modificación del nivel
de expresión de dicho miARN entre las etapas (i) y (ii).
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la etapa (iii) consiste en el análisis
del nivel de expresión de al menos un miARN elegido entre
miR-23a (SEQ ID NO: 9), miR-27a (SEQ
ID NO: 11) y miR-24-2 (SEQ ID NO:
12).
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la etapa (iv) consiste en la
identificación de los compuestos o combinaciones de compuestos que
modulan el nivel de expresión de al menos un miARN elegido entre
miR-23a (SEQ ID NO: 9), miR-27a (SEQ
ID NO: 11) y miR-24-2 (SEQ ID NO:
12).
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la etapa (iv) consiste en la
identificación de los compuestos o combinaciones de compuestos que
disminuyen el nivel de expresión de al menos un miARN elegido entre
miR-23a (SEQ ID NO: 9), miR-27a (SEQ
ID NO: 11) y miR-24-2 (SEQ ID NO:
12).
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el compuesto
es un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque el agente terapéutico se elige entre
AMPc, arsénico, interferones, TNF, rexinoides, ácido retinoico y
los derivados de los retinoides.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque la etapa (iii)
de análisis utiliza la técnica de transferencia northern.
17. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 16, caracterizado porque las células
que se ponen en cultivo en la etapa (i) proceden de una leucemia
mieloide asociada a un bloqueo de la granulopoyesis.
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