ES2307936T3 - Un nuevo metodo para el diagnostico y pronostico de enfermedades malignas. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para determinar un estadío neoplásico de una célula, que comprende cuantificar la cantidad de nucleolina en membrana plasmática en la célula.
Description
Un nuevo método para el diagnóstico y pronóstico
de enfermedades malignas.
El invento está basado en el descubrimiento de
una correlación entre la expresión de una nucleolina celular en
membrana plasmática y la presencia y agresividad de células
neoplásicas. Así, el invento está dirigido hacia la detección y
prognosis de estados premalignos y enfermedades y trastornos
malignos.
Estar bien preparado para la batalla genera
éxito; cuando el enemigo es el cáncer, una detección temprana tiene
como resultado una mayor probabilidad de que la intervención médica
sea exitosa. En estadíos tempranos, los tratamientos pueden con
frecuencia ser dirigidos sólo hacia los tejidos afectados,
disminuyendo los efectos secundarios. Si no son detectadas a
tiempo, las células cancerígenas pueden metastatizar y distribuirse
a través de todo el cuerpo. El pronóstico en este caso es más
directo, y los tratamiento médicos son con frecuencia aplicados
sistémicamente, matando no sólo células cancerígenas, sino también
grandes cantidades de células sanas.
Una característica de una célula cancerígena es
la proliferación descontrolada. Las células cancerígenas pueden
también exhibir aberraciones morfológicas y funcionales. Las células
cancerígenas pueden mostrar una morfología celular menos
organizada; por ejemplo, perdiendo la organización estructural y de
organelos asimétrica (polaridad celular) que permite una función
celular apropiada. Los contactos célula-célula y
célula-sustrato, especificidades que son también
necesarias para las funciones normales, están con frecuencia
moduladas o perdidas. Funcionalmente, las células pueden llevar a
cabo algunas, en caso que se den, funciones silvestres, o pueden
tener funciones normales exageradas, desreguladas, tales como
secreción hormonal. Tales células retroceden a estadíos de
desarrollo tempranos, apareciendo menos diferenciadas que sus
células de origen silvestres (es decir, normales).
Las células cancerígenas también con frecuencia
expresan proteínas erróneas o mal dirigidas hacia compartimentos
celulares inapropiados. La expresión de las proteínas puede estar
elevada o disminuida; incluso proteínas normalmente no expresadas
mediante un tipo celular específico pueden ser expresadas por su
homólogo transformado. La expresión errónea de proteínas puede
tener una plétora de efectos celulares aguas abajo, incluyendo
cambios drásticos en la composición de membrana, la formación de
organelos, o la fisiología. Una dirección de proteína hacia la
diana errónea (y otras moléculas, tales como lípidos, etc) también
contribuyen a la pérdida de la polaridad celular.
La detección del crecimiento celular es
complicada debido a una variedad de factores, incluyendo la
expresión errónea de proteínas y la diferenciación celular. Por
ejemplo, los cánceres pueden proceder gradualmente, estando
presentes sólo en cantidades pequeñas que son difíciles de detectar.
Un método diagnóstico común es el uso de ciertas proteínas como
"marcadores" para distinguir células cancerígenas a partir de
las células sanas. Por ejemplo, los diagnósticos de cáncer de
próstata usan con frecuencia el antígeno específico de próstata
(PSA). Estos ensayos requieren que un marcador sea definido, que se
disponga de agentes de detección, y que estén fácilmente
disponibles. Sin embargo, un marcador que esté presente en muchos,
sino en la mayoría, de los cánceres aún tiene que ser definido. Tal
marcador facilitaría notablemente el diagnóstico.
El documento de patente WO 00/61597 describe la
actividad antiproliferativa de los oligonucleótidos ricos en G, y
su uso para la unión de la nucleolina.
Hovanessian A. G. y otros, Experimental Cell
Research, Vol. 261, No 2, Diciembre 2000, páginas
312-328, describe la expresión en la superficie
celular de la nucleolina asociada con el citoesqueleto de
actina.
El presente invento proporciona un método in
vitro para determinar un estado neoplásico de una célula, que
comprende cuantificar la cantidad de nucleolina en la membrana
plasmática en la célula.
El presente invento también proporciona un
método in vitro para detectar carcinoma de pulmón en un
sujeto, que comprende: cuantificar la presencia de nucleolina en la
superficie de las células de pulmón en una muestra a partir de un
sujeto.
En un primer aspecto, el invento está dirigido a
los métodos para determinar un estado celular neoplásico, que
comprende cuantificar la cantidad de nucleolina en la membrana
plasmática de una célula, incluyendo células de mamífero, tales
como las humanas; la célula puede también ser lisada. La nucleolina
de la membrana plasmática es detectada usando un agente
anti-nucleolina, tal como anticuerpos u
oligonucleótidos anti-nucleolina, incluyendo los de
las secuencias de SEQ ID Nºs: 1-7;
9-17; 19-31.
En otro aspecto, el invento se refiere a métodos
para detecta carcinoma de pulmón de células pequeñas en un sujeto,
que comprende tomar una muestra que contenga células de pulmón a
partir de un sujeto; y cuantificar la cantidad de nucleolina en la
membrana plasmática en las células. Las muestras incluyen esputos;
los sujetos pueden ser humanos.
En otro aspecto más, el invento está dirigido a
métodos para diagnosticar tumores, células premalignas o malignas,
que comprende tomar una muestra a partir de un sujeto que comprende
células, enviar la muestra a un centro de ensayo, determinar el
estado neoplásico de las células mediante detección de nucleolina en
membrana plasmática.
La Fig. 1 muestra la tinción nuclear de la
nucleolina en diversas líneas celulares. Se muestran las
micrografías de inmunofluorescencia (B, D, F, H) y las de contraste
de fase en paralelo (A, C, E, G). Las líneas celulares que fueron
analizadas fueron: células de cáncer de próstata DU145 (A, B),
células de cáncer de mama
MDA-MB-231 (C, D), células de
cáncer cervical HeLa (E, F) y células normales de piel HS27 (G, H).
Un anticuerpo anti-nucleolina fue usado; las
células fueron permeabilizadas antes de la tinción para permitir el
acceso del anticuerpos a los compartimentos citoplasmático y
nuclear.
La Fig. 2 muestra la tinción de la nucleolina en
la membrana plasmática en las líneas celulares mostradas en la
Figura 1. Se muestran las micrografías de inmunofluorescencia (B, D,
F, H) y las de contraste de fase en paralelo (A, C, E, G). Las
líneas celulares que fueron analizadas fueron: células de cáncer de
próstata DU145 (A, B), células de cáncer de mama
MDA-MB-231 (C, D), células de cáncer
cervical HeLa (E, F) y células normales de piel HS27 (G, H). Un
anticuerpo anti-nucleolina fue usado; las células no
fueron permeabilizadas antes de la tinción, permitiendo al
anticuerpo acceso sólo a la membrana plasmática.
La Fig. 3 muestra las tasas de proliferación
comparativas de las líneas celulares como se muestran por un ensayo
MTT. Cuadrado, DU145; rombos, HeLa; círculos, HS27. Aunque las
células MDA-MB-231 no fueron
incluidas en este experimento, las tasas de proliferación para
estas cuatro líneas celulares se ha determinado que es DU145 >
MDA-MB-231 > HeLa > HS27.
Obsérvese que las líneas celulares con altos niveles de nucleolina
en la membrana plasmática se corresponden con las de más rápida
proliferación (DU145 y HeLa; véase la Figura 2).
La Fig. 4 muestra imágenes de contraste de fases
(B, D) e imágenes de inmunofluorescencia (A, C) de un espécimen
embebido en parafina extraído de un paciente con carcinoma de
células escamosas de la cabeza y el cuello. El espécimen fue teñido
para la detección de nucleolina en la membrana plasmática y una
contratinción con yoduro de propidio para mostrar los núcleos
celulares. Imágenes (C) y (D) muestran las imágenes (A) y (B)
superpuestas con marcas para mostrar mejor la tinción de la
nucleolina. El área 1 abarcada por la línea blanca incluye una
tinción de nucleolina intensa, mientras que las áreas fuera de 1
muestran poco 3 o nada de señal 2.
La Fig. 5 muestra el contraste de fases (B, D) e
imágenes de inmunofluorescencia (A, C) de líneas celulares de
cáncer de pulmón de células pequeñas (NCI-H82) y
células no pequeñas (NCI-H1299) colocadas sobre una
placa para microscopio usando un cytospinner. Las muestras fueron
teñidas para detectar nucleolina en membrana plasmática y una
contratinción con yoduro de propidio para mostrar los núcleos
celulares. Las células con membranas plasmáticas excepcionalmente
bien teñidas están marcadas mediante asteriscos (*).
La Fig. 6 muestra imágenes de contraste de fase
(B, D, F) e inmunofluorescencia (A, C, E) de sangre periférica (A,
B) o médula ósea (C, D y E, F) a partir de sujetos humanos. Las
muestras fueron teñidas para detectar nucleolina en la membrana
plasmática y contrateñidas con yoduro de propidio para mostrar los
núcleos celulares. Las células altamente teñidas para nucleolina
están marcadas con un asterisco (*); éstas fueron sólo observadas
en aquellos pacientes que presentaban carcinomas (A, B y C, D),
mientras que las células de un paciente sano no mostraron ninguna
tinción de nucleolina en membrana plasmática (E, F).
El invento está basado en el descubrimiento de
una correlación entre la expresión de nucleolina en membrana
plasmática y la presencia y agresividad de las células
neoplásicas.
El invento proporciona composiciones y métodos
para la detección de células neoplásicas, tales como células
malignas y premalignas, usando un antígeno neoplásico que está
ampliamente expresado, nucleolina. Sin embargo, la expresión de
nucleolina es insuficiente para indicar malignidad (la nucleolina se
encuentra en toda célula nucleada); pero la localización de la
nucleolina sobre la superficie celular sí es indicativa. Mientras
que cantidades crecientes de nucleolina nuclear, como se visualiza
mediante tinción de plata, ha sido usada como una herramienta de
diagnóstico para el cáncer, el descubrimiento inesperado que la
nucleolina encontrada sobre la superficie celular correlaciona con
un fenotipo premaligno o maligno puede facilitar el diagnóstico y el
pronóstico del cáncer.
Las ventajas de usar nucleolina localizada en la
superficie incluyen:
(1) Precisión mejorada. Ensayos que detectan la
nucleolina en la membrana plasmática identifican con mayor precisión
el fenotipo maligno comparado con la tinción de plata para
nucleolina nuclear.
(2) Especificidad. La nucleolina en membrana
plasmática no se observa normalmente en la membrana plasmática de
la mayoría de las células silvestres (sanas). Así, a diferencia de
muchos otros ensayos diagnósticos que requieren analizar la
cantidad de un marcador, la detección de nucleolina en membrana
plasmática puede ser usada cualitativamente. Un tipo de ensayo más
"si-no" a prueba de errores es por tanto
factible. Este aspecto también permite ensayar tanto en células
únicas como en muestras de tejidos.
(3) Amplia aplicabilidad. Muchos cánceres
diferentes pueden ser detectados examinando en busca de nucleolina
en membrana plasmática.
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(4) Multifuncional. Los métodos son pronósticos
así como también diagnósticos: la tasa de proliferación celular
correlaciona típicamente con niveles de nucleolina en membrana
plasmática.
Mientras que se investigaba la actividad
antiproliferativa de oligonucleótidos ricos en guanosina no
antisentido (GROs) en células cancerígenas, se encontró que tales
GROs antiproliferativos unen nucleolina para ejercer sus efectos
(Bates y otros, 1999; Millar y otros, documento de patente WO
00/61597, 2000). La nucleolina (Bandman y otros, documento de
patente norteamericana Nº 5,932,475, 1999) es una proteína
abundante, no ribosomal del nucleolo, el sitio de transcripción
génica ribosomal y empaquetado del ARN preribosómico. Esta
fosfoproteína de 707 amino-ácidos tiene una estructura en
multidominio que consiste en un extremo N-terminal
de tipo histona, un dominio central que contiene cuatro motivos de
reconocimiento de ARN y un extremo C terminal rico en
glicina/arginina y tienen un peso molecular aparente de 110 KDa. Su
estructura en múltiples dominios refleja las funciones notablemente
diversas de esta proteína de múltiples facetas (Ginisty y otros,
1999; Srivastava y Pollard, 1999; Tuteja y Tuteja, 1998). La
nucleolina ha sido implicada en muchos aspectos fundamentales de
supervivencia y proliferación celular. Mejor entendido es el papel
de la nucleolina en la biogénesis de ribosomas. Otras funciones
pueden incluir el transporte nucleocitoplasmático, citoquinesis,
nucleogénesis y apoptosis.
La síntesis de nucleolina ha sido correlacionada
con tasas de división celular (proliferación celular) aumentadas;
los niveles de nucleolina son por tanto mayores en células tumorales
comparadas con la mayoría de células normales (Tuteja y Tuteja,
1998). La nucleolina es una de las proteínas de la región
organizadora nuclear (NOR) cuyos niveles, como se miden mediante
tinción de plata, son evaluados por los patólogos como un marcador
de proliferación celular y un indicador de malignidad (Derenzini,
2000).
También presentes en la membrana plasmática en
unos pocos tipos celulares, tales como linfocitos y células
ductales recolectoras de la médula interior, se ha hipotetizado que
la nucleolina funciona como un receptor (por ejemplo, Callebaut y
otros, 1998; Sorokina y Kleinman, 1999) Sin embargo, el papel de la
nucleolina de membrana plasmática no está bien entendido. Además,
no está claro si la nucleolina de membrana plasmática es idéntica a
la proteína nucleolar, o si representa una isoforma diferente o una
proteína de tipo nucleolina. Sin embargo, la expresión de la
nucleolina de membrana plasmática es específica de células
neoplásicas (tales como malignas o premalignas); así, no se
necesita saber la función de la nucleolina de membrana plasmática
para propósitos de diagnóstico y pronóstico.
Un neoplasma es un crecimiento tisular anormal
que resulta de las células neoplásicas, las células que proliferan
más rápidamente y de modo incontrolada que las células normales. Los
neoplasmas, normalmente desestructurados estructuralmente parcial o
completamente, carecen de una coordinación funcional con el tejido
normal correspondiente. Los neoplasmas normalmente forman una masa
tisular distinta que puede ser bien benigna (tumor) o maligna
(cáncer).
Las células cancerígenas invaden tejidos
circundantes, pueden metastatizar a sitios distantes, y es probable
que sean recurrentes tras un intento de eliminarlos, causando la
muerte de un sujeto si no son tratadas adecuadamente. Además de la
desorganización estructural, las células cancerígenas involucionan
normalmente a estadíos más primitivos o indiferenciados
(anaplasia), aunque morfológica y bioquímicamente, pueden aún
exhibir muchas funciones de las células silvestres
correspondientes. Los carcinomas son cánceres derivados de
epitelios; los sarcomas son derivados de tejidos conectivos.
Los cánceres pueden ser más o menos agresivos.
El fenotipo agresivo de una célula cancerígena se refiere a la tasa
de proliferación y la capacidad para formar tumores y metastatizar
en ratones desnudos (nude). Los cánceres agresivos proliferan más
rápidamente, forman tumores y metastatizan más fácilmente que los
tumores no agresivos.
El término "estadío neoplásico" se refiere
a tres estados: normal, premaligno y maligno. "Normal" se
refiere a un crecimiento o célula que es clínicamente normal
(sana). "Premaligno" se refiere a un crecimiento o célula que
va camino de volverse maligna, pero que al tiempo del exámen, no
sería clasificada como maligna mediante métodos convencionales.
"Maligno" se refiere a una célula o crecimiento que tiene al
menos una de las siguientes propiedades: invasiva localmente,
crecimiento destructivo y metástasis.
Los oligonucleótidos está disponibles de modo
que se unen específicamente a polipéptidos, tales como nucleolinas.
Ejemplos de tales son los GROs, que son oligonucleótidos ricos en
guanosina.
Las características de los GROs incluyen:
- (1)
- tener al menos un motivo GGT
- (2)
- tener preferiblemente de 4 a 100 nucleótidos, aunque los GROs que tienen muchos mas nucleótidos son posibles
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- (3)
- que tengan modificaciones químicas para mejorar la estabilidad.
GROs especialmente útiles forman estructuras en
cuarteto G, como se indica mediante un perfil térmico reversible de
desnaturalización/renaturalización a 295 nm (Bates y otros, 1999).
GROs preferidos compiten también con un oligonucleótido telomérico
para la unión a una proteína celular diana en un ensayo de
desplazamiento de movilidad electroforética (Bates y otros,
1999).
Otros oligonucleótidos pueden tener una
especificidad elevada por la nucleolina.
Un "agente antinucleolina" se une a la
nucleolina. Ejemplos incluyen anticuerpos antinucleolina y ciertos
oligonucleótidos.
Las siguientes realizaciones son dadas como
ejemplos de diversos modos de poner en práctica el invento. Muchos
modos diferentes de poner en práctica el invento son también
posibles.
En todas las realizaciones, el principio
subyacente es el de diferenciar específicamente la nucleolina de
membrana plasmática de la nucleolina nuclear. La nucleolina de
membrana plasmática, como ha sido descubierta por los solicitantes,
correlaciona con células que están en un estadío neoplásico; además,
la cantidad de nucleolina en membrana plasmática también indica la
agresividad de estas células; esto es, cuanto más elevada es la
expresión de nucleolina en membrana plasmática, más agresivas son
las células. Diversas técnicas permiten al usuario diferenciar
entre nucleolina nuclear y en membrana plasmática. Las técnicas de
detección, en las que los reactivos para detectar la nucleolina
tienen acceso exclusivo a las porciones extracelulares de la célula
(y por consiguiente a la nucleolina de membrana plasmática celular),
o las técnicas bioquímicas, en las que bien las proteínas en la
membrana plasmática y/o bien las proteínas de superficie son
separadas de los otros componentes y compartimentos celulares, son
también útiles.
En una realización, la nucleolina es detectada
directamente en la superficie celular. Una célula es aislada a
partir de un sujeto y la membrana plasmática es detectada usando un
agente que une nucleolina. Las células pueden ser aisladas mediante
cualquier técnica conocida. Una célula aislada puede comprender una
muestra tisular más grande que contiene células que no son
neoplásicas. Los métodos de detección usan anticuerpos
antinucleolina que unen epítopos de nucleolina extracelular; estos
anticuerpos pueden ser marcados directamente o cuando están unidos,
ser detectados indirectamente. Otros agentes de detección de
nucleolina en membrana plasmática útiles incluyen GROs que unen
específicamente nucleolina. Procedimientos útiles, tales como
separación celular activada por fluorescencia (FACS) o
inmunofluorescencia, emplean marcajes fluorescentes, mientras que
otras técnicas citológicas, tales como técnicas histoquímicas,
inmunohistoquímicas y otras técnicas microscópicas (microscopía
electrónica (EM), inmuno-EM) usan diversas otras
etiquetas, bien colorimétricas o radiactivas. Los diversos
reactivos pueden ser ensamblados en kits.
En otra realización, las células son aisladas a
partir de un sujeto y extraídas. Las membranas plasmáticas y/o
proteínas plasmáticas son entonces aisladas (tales como mediante una
extracción diferencial, o ruptura celular física diferencial,
centrifugación diferencial de células extraídas con detergentes,
etc.), y entonces la nucleolina es detectada en las membranas
aisladas usando un agente que une la nucleolina. En general, las
técnicas útiles para detectar la nucleolina incluyen aquellas en las
que el extracto es colocado sobre un sustrato, y el sustrato es
incubado con un agente que detecta nucleolina. Ejemplos de tales
técnicas incluyen transferencias de puntos (dot blots) de
polipéptidos y transferencias Western, biochips, arrays de
proteínas, etc.. Otros formatos de detección incluyen los ensayos
inmunoadsorbentes unidos a enzimas (ELISAs) en sus manifestaciones
de varios niveles (Ausubel y otros, 1987). En realizaciones en las
que las moléculas de superficie de la membrana plasmática están
separadas físicamente de la mayoría de los otros componentes y
compartimentos celulares, los agentes de unión a nucleolina no
necesitan reconocer específicamente ninguna porción extracelular de
nucleolina. Los diversos reactivos pueden ser ensamblados en
kits.
En una realización adicional, los métodos del
invento son dirigidos para detectar cáncer de pulmón, tales como
carcinomas de pulmón de células pequeñas. La expresión de nucleolina
en membrana plasmática es útil para la detección y pronóstico.
En otra realización más, los métodos para tratar
células en un estadío neoplásico incluyendo células cancerígenas y
tumorales son proporcionados, usando la nucleolina en membrana
plasmática que actúa como un indicador. La administración de
anticuerpos anti nucleolina, que pueden ser conjugadas a una toxina
u otros medios para estimular la muerte celular o incurrir en
necrosis celular, da como resultado la eliminación de células que
expresan nucleolina en membrana plasmática.
Las muestras celulares o titulares son recogidas
a partir de un sujeto. El sujeto es un vertebrado, más
preferiblemente un mamífero, tal como un mono, perro, gato, conejo,
vaca, cerdo, cabra, oveja, caballo, rata, ratón, cobaya, etc.; y
más preferiblemente un humano. Cualquier técnica para recoger las
células deseadas puede ser empleada, incluyendo biopsias, cirugía,
raspados (parte interna del carrillo, piel, etc.) y extracción de
sangre. Cualquier herramienta apropiada puede ser usada para llevar
a cabo tales tareas. No es necesario aislar la población de ensayo
(es decir, las células que han de ser ensayadas para detectar su
estadío neoplásico) de las células y tejidos (material
contaminante) que no van a ser ensayadas, excepto en algunos casos
usando métodos bioquímicos que incluyen la extracción. En este
último caso, la población de ensayo no necesita ser completamente
aislada del material contaminante, pero debería ser predominante o
ser fácilmente distinguible (por ejemplo, morfológicamente
(estructuralmente, marcadores específicos) o bioquímicamente).
Para aquellos métodos que analizan carcinoma de
pulmón, la recogida de esputo es una muestra atractiva y fácilmente
obtenible. El término "esputo" como se usa aquí se refiere a
material expectorado hecho de saliva y desechos provenientes de las
vías respiratorias. El esputo es un material altamente complejo que
tiene un estructura gelatinosa pronunciada.
Para la recogida de esputo, Byrne y otros,
(Byrne, 1986) sugirió que el paciente recoja el material, generado
por varias toses profundas, en un contenedor con una tapa.
Alternativamente, el esputo puede ser recogido usando una
broncoscopia (Kim y otros, 1982). Dispositivos o agentes específicos
pueden ser usados para facilitar la recogida de esputo (Babees y
otros, documento de patente 6.325.785, 2001; King y Speert,
documento de patente 6.339.075, 2002; Rubin y Newhouse, documento
de patente norteamericana 5.925,334, 1999). Otros métodos de
recogida de esputos están también disponibles.
En algunos casos, cultivar las células recogidas
es deseable para aumentar su cantidad de modo que la detección de
la nucleolina en membrana plasmática sea facilitada. Medios y
condiciones adecuadas para generar cultivos primarios son bien
conocidos. La selección de los medios y las condiciones de cultivo
varían dependiendo del tipo celular y pueden ser empíricamente
determinadas. Por ejemplo, células de músculo esqueléticos, de
hueso, neuronas, de piel, de hígado y células madres embrionarias
son hechas crecer en medio que difiere en sus contenidos
específicos. Más aún, los medios para un tipo celular pueden diferir
significativamente de laboratorio a laboratorio y de institución a
institución. Para mantener las células en división, se añade suero,
tal como suero de ternera fetal (FCS) (también conocido como suero
bovino fetal (FBS)), al medio en cantidades relativamente grandes,
5%-30% en volumen, dependiendo de la célula o del tipo tisular.
Otros sueros incluyen suero de ternera neonata (NCS), suero de
ternera bovina (BCS), suero bovino adulto (ABS), suero de caballo
(HS), suero humano, de pollo, de cabra, porcino, de conejo y de
oveja. Los remplazamientos de suero pueden también ser usados, tales
como un proceso controlado de remplazamiento de suero tipo (CPSR;
1ó 3) o fluido embrionario bovino. Factores de crecimiento
purificado específico o cócteles de múltiples factores de
crecimiento pueden también ser añadidos o a veces sustituidos por
suero. Factores específicos u hormonas que promueven la
proliferación o supervivencia celular pueden también ser
usados.
Ejemplos de medios de cultivo adecuados incluyen
Medio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), Medio Eagle Modificado
de Dublecco (DMEM), Medio Eagle Esencial Mínimo (MEM), Medio Eagle
Basal (BME), Medio de Clic, Medio Leibovitz L-15,
Medio 5 A de McCoy, Medio Esencial Mínimo de Glasgow (GMEM), Medio
NCTC 109, Medio de Williams E, RPMI-1640, y Medio
199. Un medio especialmente desarrollado para un tipo/línea celular
en particular o función celular, por ejemplo Medio de crecimiento
de riñón bovino Madin-Carby, Medio de Mantenimiento
de riñón bovino Madin-Darby, medios de hibridomas
diversos, medio basal endotelial, medio basal de fibroblasto, medio
basal de queratinocitos, y medio basal de melanocitos son también
conocidos. Si se desea, un medio con niveles reducidos o libres de
proteínas y/o medio libre de suero y/o químicamente definido, medios
libre de componentes animales pueden ser usados, por ejemplo, CHO,
Medio de terapia génica o Medio libre de suero QBSF (Sigma Chemical
Co.; St. Louis, MO), Mezcla nutriente DMEM F-12
HAM, MCDB (105, 110, 131, 151, 153, 201 y 302), NCTC 135, Ultra DOMS
PF o HL-1 (ambos de BioWhittaker; Walkersville,
MD), pueden ser usados.
El medio puede ser suplementado con una variedad
de factores de crecimiento, citoquinas, suero, etc., dependiendo de
las células que van a ser cultivadas. Ejemplos de factores de
crecimiento adecuados incluyen: factor de crecimiento básico de
fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de
crecimiento transformante (TGFa y TGFb) factores de crecimiento
derivados de plaquetas (PDGFs), factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF),
insulina, eritropoyetina (EPO), y factor estimulante de colonias.
Ejemplos de aditivos hormonales adecuados son estrógeno,
progesterona, testosterona o glucocorticoides tales como
dexametazona. Ejemplos de aditivos a medios de citoquinas son
interferones, interleuquinas o factores de necrosis
tumorales-a (TNFa). Disoluciones salinas pueden ser
también añadidas al medio, incluyendo disolución de Alseverr,
Fosfato tamponado salino de Dulbecco (DPBS), Disolución salina
equilibrada de Earle, Disolución salina equilibrada de Gey (GBSS),
Disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS), Disolución salina A
de Puck, y Disolución salina de Tyrode. Si es necesario, aditivos y
componentes de cultivo en diferentes condiciones de cultivo pueden
ser optimizadas, ya que pueden alterar las respuestas celulares, la
duración de la actividad y otras características que afectan la
bioactividad. Además, la superficie sobre la que las células son
hechas crecer pueden ser recubiertas con una variedad de sustratos
que contribuyen a la supervivencia, crecimiento y/o diferenciación
de las células. Estos sustratos incluyen pero no se limitan a,
laminina, matriz-EHS, colágenos,
poli-L-lisina,
poli-D-lisina, poliornitina y
fibronectina. Cuando se desean cultivos tridimensionales, los geles
de matriz extracelular pueden ser usados tales como colágeno,
EHS-matriz, o gelatina (colágeno desnaturalizado).
Las células pueden ser hechas crecer por encima de tales matrices,
o pueden ser incorporadas en los mismos geles.
Si se desea, los medios pueden ser
adicionalmente suplementados con reactivos que limitan la acidosis
de los cultivos, tal adición de tampón al medio (tal como ácido
N,N-bis(2-hidroxietilo)-2-aminoetanosulfónico
(BES),
bis(2-hidroxietil)amino-tris
(hidroximetil)metano (BIS-Tris), ácido
N-(20hodrixietil)piperazina-N'3-propanosulfónico
(EPPS o HEPPS), gliciclina, ácido
N-2-hidroxietilpiperazina-N'2-etanosulfónico
(HEPES), ácido 3-(N-morfolino) propano sulfónico
(MOPS), Piperazina-N,N'bis (ácido
2-etanosulfónico)(PIPES), bicarbonato sódico, ácido
3-(N-tris(hidroximetil)-metil-amino)-2-hidroxi-propano
sulfónico) TAPSO, ácido
(N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico
(TES), N-tris(hidroximetil)
metil-glicina (Tricina), tris
(hidroximetil)-aminometano (Tris), etc.). Cambios
frecuentes en medio y cambios en el CO_{2} suministrado (con
frecuencia aproximadamente 5%) la concentración puede ser también
usada para controlar la acidosis.
Los gases para cultivos son típicamente
alrededor de 5% de dióxido de carbono y el nitrógeno restante, pero
opcionalmente pueden contener cantidades variables de óxido nítrico
(comenzando en valores tan bajos como 3 ppm), monóxido de carbono y
otros gases, tanto inertes como biológicamente activos. Las
concentraciones de dióxido de carbono oscilan típicamente alrededor
de 5% pero pueden variar entre 2-10%. Tanto el óxido
nítrico como el monóxido de carbono, cuando es necesario, son
administrados típicamente en cantidades muy pequeñas (es decir, en
el intervalo de ppm), determinado empíricamente o a partir de la
bibliografía. La temperatura a la cual las células crecerán puede
ser determinada empíricamente, aunque la temperatura de cultivo
estará normalmente en el intervalo fisiológico normal del animal a
partir del cual se han aislado las células.
La nucleolina puede ser detectada a nivel de
proteínas en las células, secciones titulares, células cultivadas y
extractos de los mismos. Los métodos inmunoquímicos para detectar la
expresión de proteínas son bien conocidas e incluyen, pero no se
limitan a, transferencia Western, purificación por inmunoafinidad,
ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia en
punto (dot plot) o en ranura, radioinmunoensayo (RIA), detección
inmunohistoquímica, tinción inmunocitoquímica, y citometría de
flujo. Los procedimientos comunes e instrucciones usando
anticuerpos han sido bien definidos (por ejemplo, Harlow y Lane,
1988; Harlow y Lane, 1999). Anticuerpos seleccionados que son
útiles para detectar nucleolina en membrana plasmática son mostrados
en la Tabla 1.
Si se desean anticuerpos antinucleolina en
membrana plasmática adicionales, se pueden producir usando métodos
bien conocidos (Harlow y Lane, 1988; Harlow y Lane, 1999). Por
ejemplo, (pAbs) pueden ser generados en un hospedante mamífero por
una o más inyecciones de un inmunógeno, tal como un dominio
extracelular de nucleolina expresada en superficie, y, si se desea,
un adyuvante. Típicamente, el inmunógeno (y adyuvante) es inyectado
en un mamífero mediante una inyección subcutánea o intreperitoneal.
El inmunógeno puede incluir componentes tales como polipéptidos
(aislados, no aislados, o producidos de modo recombinante), las
células o fracciones celulares. Ejemplos de adyuvantes incluyen el
adyuvante completo de Freund y el Lípido A sintético
monofosforilado-dicorinomicolato de trehalosa
(MPL-TDM). Para mejorar las respuestas inmunes, un
inmunógeno puede ser conjugado a un polipéptidos que es
inmunogénico en el hospedante, tal como la hemocianina de lapa
cerradura (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina o
inhibidor de tripsina de soja. Alternativamente, fosfoanticuerpos
pueden ser producidos en pollos, produciendo moléculas de IgY
(Schade y otros, 1996).
Los anticuerpos monoclonales pueden también ser
producidos inmunizando un hospedador o linfocitos de un hospedador,
recogiendo los linfocitos secretadores (o potencialmente
secretadores) de anticuerpos, fusionando esos linfocitos a células
inmortalizadas (por ejemplo células de mieloma), y seleccionado esas
células que secretan el anticuerpo monoclonal deseado (Goding,
1996). Si se desea, los anticuerpos monoclonales pueden ser
purificados a partir del medio de cultivo o fluidos ascíticos
mediante procedimientos convencionales tales como proteína A
sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel,
diálisis, precipitación por sulfato amónico o cromatografía de
afinidad (Harlow y Lane, 1988; Harlow y Lane, 1999).
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos
y fragmentos o derivados de los mismos. Por ejemplo, cuando se
ensayan células vivas, usando fragmentos Fab se eliminará el
entrecruzamiento, previniendo así que las células endociten los
anticuerpos unidos.
Una aproximación usando anticuerpos para
detectar la presencia de un anticuerpo incluirán una o más, si no
todas, las siguientes etapas:
- (1)
- preparar la entidad a ser ensayada para detectar nucleolina en membrana plasmática lavándola con tampón o agua
- (2)
- bloquear sitios de unión de anticuerpo no específicos
- (3)
- Aplicar el anticuerpo (por ejemplo nucleolina)
- (4)
- Detectar el anticuerpos unido, bien vía un anticuerpo secundario marcado de modo detectable que reconoce el anticuerpo primario o un marcaje detectable que ha sido unida directamente a, o asociada con, el anticuerpo unido (antinucleolina).
Los sustratos pueden ser lavados con cualquier
disolución que no interfiera con la estructura del epítopo.
Tampones comunes incluyen salino y tampones biológicos, tales como
bicina, tricina y Tris.
Sitios de unión no específicos son bloqueados
aplicando una disolución proteica, tal como albúmina de suero
bovina (BSA; desnaturalizada o nativa), proteínas de la leche, o en
los casos en que el reactivo de detección es un anticuerpo
secundario, suero normal o inmunoglobulinas de animales hospedadores
no inmunizados cuya especie es del mismo origen que el anticuerpo
de detección. Por ejemplo, un procedimiento usando un anticuerpos
secundario hecho en cabras emplearía suero de cabra normal
(NGS).
El sustrato se hace después reaccionar con el
anticuerpo de interés. El anticuerpo puede ser aplicado en cualquier
forma, tal como fragmentos Fab y derivados de los mismos,
anticuerpo purificado (por afinidad, precipitación, etc.),
sobrenadantes de cultivos de hibridomas, ascitos, suero o
anticuerpos recombinantes expresados en las células recombinantes.
El anticuerpo puede ser diluido en tampón o medio, con frecuencia
con una proteína vehículo tal como la disolución usada para
bloquear los sitios de unión no específicos, la concentración de
anticuerpo útil es normalmente determinada empíricamente. En
general, los sueros policlonales, anticuerpos policlonales y
ascitos pueden ser diluidos 1:50 a 1:200.000, con más frecuencia
1:200 a 1:500. Los sobrenadantes de hibridomas pueden ser diluidos
1:0 a 1:10, o pueden ser concentrados por diálisis o precipitación
con sulfato amónico (o cualquier otro método que conserve los
anticuerpos de interés pero que elimine parcialmente el componente
líquido y preferiblemente otras moléculas pequeñas, tales como
sales) y diluidos si es necesario. La incubación con anticuerpos
puede ser llevada a cabo en tan sólo 20 minutos a 37ºC, de 2 a 6
horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC), u 8 horas o
más a 4ºC
Para detectar un complejo
antígeno-anticuerpo, un marcaje puede ser usado. El
marcaje puede ser acoplado al anticuerpo de unión, o a un segundo
anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo, y es incubado con la
muestra tras la incubación del anticuerpo primario y lavado
intensivo. Marcajes adecuados incluyen restos fluorescentes, tales
como isotiocianato de fluoresceína; diclorotriazina de fluoresceína
y análogos flurados de fluoresceína; ácido de naftofluoresceína
carboxílico y su éster succinimidilo; carboxirodamina 6G; derivados
de piridiloxazol; Cy2, 3 y 5; ficoeritrina; especies fluorescentes
de succinimidil ésteres, ácidos carboxílicos, isotiocianatos,
cloruros de sulfonilo, y cloruros de dansilo, incluyendo éster
succinimidil de ácido propiónico, y succinimidil ésteres de ácido
pentanoico; ésteres succinimidil de carboxitetrametilrodamina;
succinimidil éster de rodamina roja X; cloruro de sulfonilo Texas
Red; éster de succinimidil de Texas Red-X; éster
tetrafluorofenol de sodio Texas Red X; tinciones de Texas Red;
tetrametilrodamina; lisamina rodamina B; tetrametilrodamina;
tetrametilrodamina isotiocianato, naftofluoresceína, derivados de
cumarina; pirenos; derivados de piridiloxazol, tinciones dapoxilo;
tinciones de Cascade Blue y Yellow; isotiocianatos de benzofurano;
tetrafluorofenoles de sodio;
4,4-difluor-4-bora-3A,4A-diazo-s-indaceno.
Marcajes adecuados adicionales incluyen restos enzimáticos, tales
como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano; restos
radioactivos, incluyendo marcajes de ^{35}S y ^{135}I; sistemas
de detección basados en biotina-avidina (o
estreptavidina)(con frecuencia acoplados con sistemas enzimáticos o
con señales de oro); y partículas de oro. En el caso de los
sistemas de detección basados en enzimas, la enzima es hecha
reaccionar con un sustrato apropiado, tal como
3,3'-diaminobenzidina (DAB) para peroxidasa de
rábano; preferiblemente, los productos de reacción son insolubles.
Las muestras marcadas con oro, si no están preparadas para análisis
ultraestructurales, pueden ser hechas reaccionar químicamente para
potenciar la señal del oro; esta aproximación es especialmente
deseable para microscopía de luz visible. La elección del marcaje
depende de la aplicación, la resolución deseada y los métodos de
observación deseados, para marcajes fluorescentes, el fluoróforo es
excitado con la longitud apropiada y la muestra observada usando un
microscopio, microscopio de confocal, o máquina de FACS. En el caso
del marcaje radioactivo, las muestras son puestas en contacto con
películas de autoradiografía, y la película es revelada;
alternativamente, la autoradiografía puede ser también lograda
usando aproximaciones ultraestructurales. Alternativamente, la
radioactividad puede ser cuantificada usando un contador de
centelleo.
Las aproximaciones basadas en citología:
La expresión de proteínas por las células o
tejidos puede ser calculada mediante inmunolocalización de un
antígeno. Generalmente, las células o tejidos son conservados
mediante fijación, expuestas a un anticuerpo que reconoce el
epítopo de interés, tal como una nucleolina, y el anticuerpo unido
visualizado.
Cualquier célula, línea celular, tejido, o
incluso un organismo entero es apropiada para fijación. Las células
pueden ser cultivadas in vitro como cultivos primarios,
líneas celulares, o cultivadas a partir de un tejido y separadas
mecánicamente o enzimáticamente. Los tejidos pueden ser de cualquier
órgano, vegetal o animal, y pueden ser cultivados después o
previamente a la fijación. La fijación, si se desea, puede ser
mediante cualquier método conocido, los requerimientos son que la
proteína a ser detectada no se vuelva irreconocible por el agente
de unión, que con mucha frecuencia será un anticuerpo. Los fijadores
apropiados incluyen peryodato de lisina paraformaldehído,
formalina, paraformaldehído, metanol, ácido
acético-metanol, glutaraldehído, acetona, fijadora
de Karnovsky, etc. La elección del fijador depende de variables
tales como la proteína de interés, las propiedades de un reactivo
de detección particular (tal como un anticuerpo), el método de
detección (fluorescente, enzimático) y el método de observación
(microscopía de epifluorescencia, microscopía de confocal,
microscopía de luz visible, microscopía electrónica, etc.). La
muestra es normalmente primero lavada, con mucha frecuencia con un
tampón biológico, previamente a la fijación. Los fijadores son
preparadas en la disolución o en tampones biológicos; muchos
fijadores son preparados inmediatamente previamente a aplicar a la
muestra. Los tampones biológicos adecuados incluyen salino (por
ejemplo, tampón fosfato salino), ácido
N-(carbamoilmetil)-2-aminoetanosulfónico
(ACES), ácido
N-2-acetamido-2-iminodiacético
(ADA), bicina, bis-tris, ácido
3-ciclohexilamino-2-hidroxil-1-propanosulfónico
(CAPSO), etanolaminas, glicina, ácido
N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico
(HEPES), ácido
2-N-morfolinoetanosulfónico (MES),
ácido 3-N-morfolinopropanosulfónico
(MOPS), ácido
3-N-morfolino-2-hidroxi-propanosulfónico
(MOPSO), piperazina-N,N'-bis (ácido
2-etanosulfónico)(PIPES), tricina, trietanolamina,
etc. Un tampón apropiado es seleccionado según la muestra que esté
siendo analizada, el pH apropiado, y los requerimientos del método
de detección. Un tampón útil es el tampón fosfato salino (PBS). Tras
la fijación, la muestra puede ser almacenada en un fijador,
preferiblemente fresco, o temporalmente o indefinidamente, a una
temperatura entre alrededor de 4ºC a alrededor de 22ºC.
Tras la fijación de 5 minutos a una semana,
dependiendo del tamaño de la muestra, el espesor de la muestra, y
la viscosidad del fijador, la muestra es lavada en tampón. Si la
muestra es espesa o se desean secciones, la muestra puede ser
embebida en una matriz adecuada. Para crioseccionado, la sacarosa es
infundida, y embebida en una matriz, tal como OCT Tissue Tek
(Andwin Scientific; Canoga Park, CA) o gelatina. Las muestras pueden
ser también embebidas en cera parafina, o resinas adecuadas para
microscopía electrónica, tal como basados en epóxido (Araldita,
Polybed 812, Durcupan ACM, Quetol, Supr., o mezclas de las mismas;
Polysciencies, Warrington, PA), acrilatos (London Resins (LR
blanca, LR dorada), Lowicryls, Unicryls; Polysciences),
metilacrilatos (JB-4, OsteoBed; Polysciences),
melamina (Nanoplast; Polysciences) y otros medios, tales como DGD,
Immuno-Bed (Polysciences) y después polimerizadas.
Las resinas que son especialmente apropiadas incluyen resinas
hidrofílicas (tales como Lowicryls, London Resins, Durcupan
hidrosoluble, etc.) puesto que son menos propensas a desnaturalizar
la proteína de interés durante la polimerización y no repelerán las
disoluciones de anticuerpos. Cuando están embebidas en cera o
resina, las muestras son deshidratadas haciéndolas pasar a través de
una serie de concentraciones de etanol o metanol; en algunos casos,
otros disolventes pueden ser usados, tales como óxido de
polipropileno. El embebido puede tener lugar después que la muestra
ha sido hecha reaccionar con los agentes de detección, o muestras
pueden ser primero embebidas, seccionadas (vía microtomo, criotomo,
o ultramicrotomo), y después las secciones se hacen reaccionar con
los reactivos de detección. En algunos casos, el material embebido
puede ser parcial- o completamente eliminado antes de la detección
para facilitar el acceso del antígeno.
En algunos casos, el(los)
epítopo(s) de nucleolina al cual se une el anticuerpo puede
no quedar disponible debido a la fijación. Los métodos de retirada
del antígeno pueden ser usados para hacer el antígeno disponible
para la unión del anticuerpo. Muchos recursos son disponibles
(revisados en, por ejemplo, McNicol y Richmond, 1998; Robinson y
Vandre, 2001; Shi y otros, 2001). Los métodos comunes incluyen usar
calor suministrado por los autoclaves, microondas, agua o tampones
calientes, ollas a presión, y otras fuentes de calor. Con frecuencia
las fuentes de calor son usadas en secuencia; las muestras deben
con frecuencia estar en disolución (por ejemplo, tratamientos de
microondas). El tratamiento de detergentes puede también
desenmascarar antígenos, tales como dodecil sulfato sódico (SDS,
0,25% a 1%) y otros detergentes desnaturalizantes. Los métodos
químicos incluyen álcalis fuertes (tales como NaOH), inmersión
prolongada en agua, urea, ácido fórmico y refinación en sulfato de
zinc-formalina. En otros casos, el tratamiento con
enzimas proteolíticas modificarán el antígeno tal que esté
disponible para el anticuerpo. Cualquier número de proteasas puede
ser usado, tal como tripsina. Estos métodos pueden ser combinados
para lograr los resultados óptimos. La elección del método de
retirada del antígeno dependerá de la muestra, la sustancia en la
que esté embebida (si se da el caso), y el anticuerpo
antinucleolina.
Especialmente en los casos de detección basada
en inmunofluorescencia o productos enzimáticos, señales de fondo
debido a fijador residual, entrecruzamiento proteico, precipitación
proteica o enzimas endógenas pueden ser apagadas, usando por
ejemplo, cloruro amónico o borohidruro sódico o una sustancia para
desactivar o deplecionar enzimas endógenas que puedan llevar a
confusión, tales como peróxido de hidrógeno que actúa sobre las
peroxidasas. Para detectar proteínas intracelulares en muestras que
no van a ser diseccionadas, las muestras puede ser permeabilizadas.
Los agentes de permeabilización incluyen detergentes, tales como
t-octilfenoxipolietoxietanoles,
polioxietilensor-bitanos, y otros agentes, tales
como lisinas, proteasas, etc.
Sitios de unión no específicos son bloqueados
aplicando una disolución proteica, tal como albúmina de suero
bovina (BSA; desnaturalizada o nativa), proteínas de la leche, o
preferiblemente en el caso en que el reactivo de detección es un
anticuerpo, suero normal o IgG de un animal hospedador no inmunizado
cuya especie es la misma y es del mismo origen del anticuerpo de
detección.
Los métodos para realizar citometría de flujo
son bien conocidos (Orfao y Ruiz-Arguelles, 1996).
Debido a que la nucleolina de membrana plasmática está siendo
ensayada, la permeabilización celular que permite el acceso a los
compartimentos citoplasmáticos no es deseable. Tras la recogida, las
células son preparadas como una suspensión de célula única; las
células son entonces incubadas con un anticuerpo antinucleolina
normalmente tras el bloqueo de los sitios de unión inespecíficos.
Preferiblemente, el anticuerpo antinuclolina es marcado con un
marcador fluorescente. Si el anticuerpo no está marcado con un
marcador fluorescente, un segundo anticuerpo que es inmunoreactivo
con el primer anticuerpo y contiene un marcador flurorescente es
usado. Tras suficiente lavado para asegurar que el exceso de
anticuerpos no unidos son eliminados, las células están listas para
citometría de flujo.
En estas aproximaciones, se desea primero aislar
las proteínas de la membrana plasmática a partir de otros
compartimentos celulares. Esto puede ser hecho en un número
cualquiera de maneras, tales como una extracción celular simple,
extracción diferencial o ruptura mecánica seguida por separación de
compartimentos celulares en gradientes (tales como sacarosa o
polidextrano) mediante centrifugación, extracción seguida por
inmunoselección apropiada de los compartimientos celulares con
anticuerpos específicos de membrana plasmática, etc. Un ejemplo de
tal aproximación está descrita en Naito y otros (1988) y Yaho y
otros (1996b). Reactivos de extracción son bien conocidos. Por
ejemplo, disolventes tales como metanol pueden ser ocasionalmente
usados. Más probablemente, detergentes tales como
t-octilfenoxipolietoxietanol (también conocido como
polietilenglicol tert-octilfeniléter) son
particularmente útiles para extracciones simples. También son útiles
los glucopiranósidos, maltopiranósidos, maltósidos, ésteres de
polioxietileno, otros éteres de polioxietileno, sales de ácido
algínico, caprílico, cólato 1-decanosulfónico,
desoxicólico, dioctil sulfosuccinato,
1-dodecanosulfónico, glicocólico, glicodesoxicólico,
1-heptanosulfónico,
1-hexanosulfónico,
n-lauroilsacrosina, lauril sulfato (por ejemplo
SDS), 1-nonanosulfónico,
1-octanosulfónico,
1-pentanosulfónico, taurocólico y taurodesoxicólico;
7-etil-2-metil-4-undecilsulfato
sódico, y 2-etilhexilsulfato sódico. Otros
detergentes útiles incluyen
(3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato,
(3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio-2-hidroxi-1-propanosulfonato,
N-decil-, N-dodecil-,
N-hexadecil-, N-octadecil-,
N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amino-1-propanosulfonatos
y fosfa-tidilcolina. Menos útil, pero puede ser útil
en algunos casos, son los bromuros de alquiltrimetilamonio, cloruro
de benzalconio, cloruro de benzetonio, bromuro de
bencildi-metildodecilamonio, cloruro de
bencildimetilhexadecil-amonio, bromuro de
dietildimetiletilamonio, cetilpiridinio, bromuro de decametonio,
bromuro de dimetildioctadecil-amonio, cloruro de
metilbenzetonio, cloruro de metil-tiroctilamonio, y
N, N', N'-polioxietileno
(10)-N-sebo-1,3-diaminopropano.
Los diferentes reactivos de extracción pueden ser usados solos o en
combinación; pueden ser preparados en disoluciones acuosas simples
o tampones adecuados.
El polietilenglicol
ter-octilfeniléter es
particular-mente útil para la extracción diferencial
aprovechando el bajo punto de evaporación para separar las
proteínas de membrana de las proteínas solubles en dos fases
diferentes.
Los tampones de extracción pueden contener
inhibidores de proteasas, tales como aprotinina, benzamidina,
antipaina, pepstatina y yodoacetamida.
Los extractos son entonces ensayados para
detectar la expresión de nucleolina. Para aquellas técnicas que
separar la membrana plasmática superficial de otros componentes
celulares (especialmente el núcleo), los agentes de detección de
nucleolina no necesitan ser específicos para los epítopos de
nucleolina de membrana plasmática extracelular.
Diversos tipos de ensayos inmunoadsorbentes
unidos a enzimas (ELISAs) para detectar la expresión proteica son
conocidos, y estos son aplicables a la detección de nucleolina.
Sin embargo otros ensayos de tipo ELISA
incluyen radioinmunoensayos y otros ensayos de unión de anticuerpos
unidos a ligandos no enzimáticos. En estos ensayos, las proteínas de
superficie celular son los principales componentes en las
preparaciones celulares.
La técnica de ELISA sandwich de doble anticuerpo
es especialmente útil. El protocolo básico para un ELISA sandwich
de doble anticuerpo es como sigue: Una placa es recubierta con
anticuerpos antinucleolina (captura de anticuerpos). Las placa es
entonces lavada con un agente de bloqueo, tal como BSA, para
bloquear la unión inespecífica de proteínas (anticuerpos o
antígenos) para la placa de ensayo. La muestra de ensayo es entonces
incubada sobre la placa recubierta con los anticuerpos de captura.
La placa es entonces lavada, incubada con anticuerpos
antinucleolina, lavada de nuevo, e incubada con conjugados marcados
con anticuerpos específicos y la señal detectada
apropiadamente.
apropiadamente.
En otros ELISAs, proteínas o péptidos son
inmovilizados sobre una superficie seleccionada, la superficie
exhibida puede tener afinidades por proteínas, tales como los
pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno
especialmente tratada. Tras lavarla para eliminar material
incompletamente adsorbido, se desearía generalmente unir o recubrir
con una proteína inespecífica que es conocida por ser
antigénicamente neutra con anticuerpos antinucleolina, tales como
BSA o caseína, en el fondo del pocillo. Esta etapa permite bloquear
los sitios de adsorción inespecífica sobre la superficie
inmovilizadora y reducir así el ruido causado por la unión
inespecífica de anticuerpos sobre la superficie. Cuando los
anticuerpos fueron creados en un animal conjugando un polipéptido
con una proteína (por ejemplo, BSA), una proteína diferente es
normalmente usada como un agente de bloqueo, debido a la
posibilidad de la presencia de anticuerpos frente a la proteína de
unión en la composición de anticuer-
pos.
pos.
Tras la unión de la nucleolina al pocillo, el
recubrimiento con un material no reactivo, y lavando para eliminar
el material no unido, la superficie inmovilizadora es puesta en
contacto con una composición de anticuerpos antinucleolina en una
manera propicia para la formación de un complejo inmune
(antígeno/anticuerpo). Tales condiciones incluyen diluir la
composición de anticuerpo con diluyentes tales como BSA, g globulina
bovina (BGG) y PBS/Polioxi-etilénsorbitano
monolaureato. Estos agentes añadidos también asisten en la reducción
de señal de fondo inespecífica. Se deja entonces incubar la
composición de anticuerpos en capas por ejemplo de 2 a 4 horas a
25ºC a 37ºC. Tras incubación, la superficie de contacto con la
composición de anticuerpo es lavada a modo de eliminar el material
no inmunoacomplejado. Un procedimiento de lavado incluye lavar con
una disolución de PBS/polioxietilén-sorbitan
monolaureato o de tampón borato.
Tras la formación de inmunocomplejos entre la
muestra de ensayo y el anticuerpo es subsiguientemente lavado, se
detecta la formación de inmunocomplejos usando un segundo anticuerpo
que tiene especificidad para el anticuerpos antinucleolina. Para la
detección, el anticuerpos secundario es asociado con un marcaje
detectable, tal como una enzima o una molécula fluorescente. Un
número de inmunoensayos son tratados en las patentes norteamericanas
Nos 5,736.348, 5,192.660, y 4,474,892.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de transferencia Western son bien
conocidos. Generalmente, una muestra proteica es sometida a
electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil
sulfato sódico (SDS-PAGE) en condiciones tales para
dar lugar a una separación apropiada de proteínas en la muestra.
Las proteínas son entonces transferidas a una membrana (por
ejemplo, nitrocelulosa, nilón, etc.) a modo de mantener las
posiciones relativas de las proteínas entre sí.
Proteínas marcadas de modo visible de peso
molecular conocido pueden ser incluidas en un carril del gel. Estas
proteínas sirven como control para asegurar una transferencia
adecuada de las proteínas a la membrana, así como marcadores de
peso molecular para determinar el peso molecular relativo de otras
proteínas en la membrana. Alternativamente, proteínas marcadoras no
marcadas (o en algunos casos poco frecuentes, proteínas no
marcadoras) son detectadas tras la transferencia con Brilliant Blue
(G o R; Sigma; St Louis, MO) otras tinciones para proteínas. Tras
la transferencia de proteínas, la membrana es sumergida en una
disolución de bloqueo para impedir la unión inespecífica del
anticuerpo primario.
El anticuerpo primario, por ejemplo,
antinucleolina, puede ser marcado y la presencia y peso molecular
del antígeno puede ser determinado detectando el marcaje en una
localización específica en la membrana. Sin embargo, el anticuerpo
primario puede no ser marcado, y la membrana es además hecha
reaccionar con un anticuerpo secundario marcado. Este anticuerpo
secundario es inmunoreactivo con el anticuerpo; por ejemplo, el
anticuerpo secundario puede ser uno frente a inmunoglobulinas de
conejo y marcada con fosfatasa alcalina. Un aparato y métodos para
realizar transferencias Western como se describen en el documento de
patente norteamericana Nº 5,567.595.
La expresión de proteínas puede ser determinada
y cuantificada aislando antígenos usando inmunoprecipitación. Los
métodos de inmunoprecipitaciones son descritos en el documento de
patente norteamericana Nº 5.629.197. La inmunoprecipitación implica
la separación del componente antigénico diana de una mezcla compleja
y es usada para discriminar o aislar pequeñísimas cantidades de
proteínas. Para el aislamiento de proteínas de superficie celular,
sales no iónicas son usadas con frecuencia.
Por ejemplo, una inmunoprecipitación a partir de
células completas puede ser realizada como sigue. Las células son
extraídas con uno o más detergentes (véase a continuación) tales,
como, por ejemplo 1% t-octilfenoxipolietoxietano/SDS
0,1%/NaCl 150 mM en 20 mM de tampón Tris, pH 8,6. Tras la
extracción, que puede ser ayudada mediante agitación, restos
celulares insolubles son eliminados usando una centrífuga. El
anticuerpo antinucleolina es añadido a los extractos, y después
las muestras son incubadas de 30 minutos hasta toda la noche a 4ºC.
Proteína A de Staphylococcus aureus o producida de manera
recombinante o proteína G de Staphylococcus de grupo C
conjugadas a sefarosa o bolas de tris-acrilo y luego
añadidas. En estos casos cuando el anticuerpo
anti-nucleolina no se une bien a Proteína A, los
anticuerpos de IgG que reconocen anticuerpos de los animales en los
que el anticuerpo antinucleolina fue hecho son añadido
simultáneamente. Las muestras son entonces incubadas con una
agitación suave durante alrededor de 2 horas a 4ºC. Las bolas o
células bacterianas, ahora unidas a los complejos
antígeno-anticuerpo, son intensamente lavadas,
normalmente primero con bien la disolución de extracción o un
tampón de elevada salinidad, después un tampón sin sales o agua para
eliminar proteínas unidas de modo no específico y moléculas de
detergente residual. Tras eliminar el tampón residual, las bolas son
incubadas con un tampón, tales como tampón de muestras de
electroforesis, y luego sometidas a 95ºC durante 3-5
minutos para eluir proteínas unidas a partir de las bolas. Las
muestras están entonces listas para análisis y detección de
nucleolina.
Otros métodos:
Las células que expresan nucleolina en membrana
plasmática pueden ser fácilmente aisladas mediante "panning"
(cribado) en placas de plástico recubiertas con anticuerpos
anti-anticuerpo (Wysocki y Sato, 1978). El panning
tiene muchas ventajas sobre otros procedimientos de inmunoselección:
es rápido, eficaz (10^{7} células pueden ser fácilmente cribadas
en dos placas de plástico de 60-mm en 30 minutos), y
barato.
En general, una suspensión de célula única es
marcada con un anticuerpo anti-nucleolina, y
entonces es incubada sobre un sustrato recubierto con un anticuerpo
secundario (con los sitios de unión específicos bloqueados). Tras 1
a 3 horas de incubación a temperatura ambiente, las células no
adherentes son eliminadas mediante lavado. En esta realización, las
células unidas indican que la nucleolina es expresada en la membrana
plasmática, indicando una célula neoplásica.
GROs y otros oligonucleótidos que reconocen y
unen nucleolina (Bates y otros, 1999; Millar y otros, documento de
patente WO 00/61597, 2000; Xu y otros, 2001) pueden ser usados
mayormente del mismo modo que los anticuerpos. Ejemplos de ensayos
adecuados son dados a continuación. En algunos casos, incorporar los
GRO nucleótidos en secuencias de ácidos nucleicos más largas pueden
ser ventajosas; por ejemplo, para facilitar la unión de un GRO de
ácido nucleico a un sustrato sin desnaturalizar el sitio de unión a
nucleolina.
GROs útiles que unen nucleolina (y tienen
también la propiedad biológica de inhibir el crecimiento celular
cancerígeno) han sido descritas (Bates y otros, 1999; Millar y
otros, documento de patente WO 00/61597, 2000; Xu y otros, 2001).
Estos incluyen los mostrados en la Tabla 2. GROs testigo son útiles
para detectar niveles de señal
ruido.
ruido.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
Los procedimientos indicados anteriormente para
los ensayos de localización con base inmunológica (tales como
inmunofluorescencia o FACS) son también aplicables a aquellos
ensayos en los que el reactivo de detección es un GRO de unión a
nucleolina. Las modificaciones incluyen aquellas que impiden la
unión inespecífica, usando ADN desnaturalizado, tal como esperma de
salmón en lugar de una proteína tal como BSA. Para la detección,
marcajes similares como los descritos anteriormente son también
útiles siempre que los GRO puedan ser derivatizados con el marcaje
de algún modo. Para este propósito, los sistemas de marcaje de
ácidos nucleico avidina-biotina son especialmente
convenientes, como son las digoxigeninas (Ausubel y otros, 1987). La
síntesis de nucleótidos biotinilados ha sido descrita (Langer y
otros, 1981). La biotina, una vitamina hidrosoluble, puede unirse
covalentemente a la posición C5 del anillo de pirimidina vía un
brazo de unión de alquilamina; la biotina se une de modo no
covalente a la avidina o estreptavidina, las cuales pueden ser
fácilmente marcadas. Alternativamente, la biotina es añadida a los
oligonucleótidos durante la síntesis mediante el acoplamiento al
5'-hidroxilo del nucleótido terminal. La
Digoxigenina-11-dUTP puede ser
incorporada en el ADN mediante protocolos de traducción de mella o
síntesis facilitada por oligonucleótidos al azar. La digoxigenina es
detectada usando anticuerpos antidigoxigenina marcadas. Los
sistemas de digoxigenina convenientes están comercialmente
disponibles (Roche Molecular Biochemicals; Indianápolis, IN). Un
ejemplo de un procediimniento usando oligonucleótidos para detectar
y localizar proteínas ha sido descrito por Davis y otros, 1998.
Los GROs pueden también ser usados de una manera
similar como los anticuerpos para detectar nucleolina en
aproximaciones bioquímicas, como se describe anteriormente. Por
ejemplo, experimentos de transferencia tipo "Southwestern"
pueden ser realizados con GROs (Bates y otros, 1999; Miller y otros,
documento de patente 00/61597, 2000). Después que las células han
sido extraídas apropiadamente (por ejemplo, diferencialmente para
separar las proteínas de la membrana plasmática de las proteínas
intracelulares), las proteínas son sometidas a electroforesis en
geles de poliacrilamida y transferidas a un sustrato, tal como una
membrana de polivinilidén difluoruro. Las proteínas son
desnaturalizadas y renaturalizadas lavándolas durante 30 minutos a
4ºC con guanidinio 6M-HCl, seguida por tres lavados
en 3M, 1,5 M y 0,75 M de guanidinio-HCl en HEPES 25
mM (pH 7,9)/KCl 4 mM/MgCl_{2} 3 mM). Tras bloquear los sitios de
unión inespecíficos con leche desnatada al 5% en tampón HEPES, el
GRO marcado es hibridado durante 2 horas a 4ºC en tampón de unión
HEPES suplementado con NDM 0,25%, NP-40 0,05%, 400
ng/ml de ADN de esperma de salmón y 100 ng/ml de una secuencia de
oligonucleótidos mezclada no relacionada, tal como tcgagaaaaa
ctctcctctc cttccttcct ctcca; SEQ ID Nº: 17. Tras lavar con tampón de
unión HEPES, la señal es detectada
apropiadamente.
apropiadamente.
Otros métodos:
Un chip es un array de regiones que contienen
moléculas inmovilizadas, separadas mediante regiones que no
contienen moléculas o moléculas inmovilizadas a una densidad mucho
más baja. Por ejemplo, un chip de proteínas puede ser separado
aplicando anticuerpos de unión a nucleolina; un chip de tipo
"aptámero" puede ser preparado aplicando GROs de unión a
nucleolina. Las regiones restante son dejadas al descubierto o
cubiertas con moléculas inertes. Los arrays pueden ser lavados para
eliminar todo excepto los polipéptidos o ácidos nucleicos
específicamente inmovilizados. Además, los chips pueden también ser
preparados que contiene múltiples anticuerpos de unión a nucleolina
(Tabla 1), los ácidos nucleicos (tales como GROs; Tabla 2), o ambos,
y pueden contener anticuerpos y/o ácidos nucleicos testigo que no
son reactivos con la nucleolina. Tal array permitiría la
confirmación del ensayo simultánea, la duplicación y los controles
internos.
Las proteínas, tales como anticuerpos
antinucleolina, pueden ser inmovilizados en soportes sólidos
mediante reacciones químicas simples, incluyendo la condensación de
las aminas con ácidos carboxílicos y la formación de disulfuros.
Esta inmovilización covalente de proteínas en sustratos inertes
puede impedir señales de ruido elevadas debido a adsorción
inespecífica. Los sustratos derivatizados con otras moléculas, tales
como biotina, son también útiles cuando la proteína a ser
inmovilizada es derivatizada con avidina o estreptavidina o
vice-versa. En algunos casos infrecuentes,
especialmente cuando secuencias de ácidos nucleicos que codifican
para el anticuerpo antinucleolina están disponibles, polipéptidos
de fusión que comprenden anticuerpos antinucleolina pueden ser
ventajosos para la inmovilización en un sustrato.
La superficie puede ser cualquier material al
que un agente de unión a nucleolina puede ser inmovilizado. Por
ejemplo, la superficie puede ser metal, vidrio, cerámica, polímero,
madera o tejido biológico. La superficie puede incluir un sustrato
de un material dado y una capa o capas de otro material sobre una
porción o la superficie entera del sustrato. Las superficies pueden
ser cualquiera de las superficies comunes para cromatografía de
afinidad, tales como las usadas para inmovilización de glutatión
para la purificación de polipéptidos de fusión GST. Las superficies
para cromatografía de afinidad incluyen, por ejemplo, sefarosa,
agarosa, poliacrilamida, poliestireno y dextrano. La superficie no
necesita ser sólida, pero puede ser un coloide, una arcilla mineral
exfoliada, una monocapa lipídica, una bicapa lipídica, un gel, o un
material poroso.
El método de inmovilización deseable controla la
posición del agente de unión a nucleolina en la superficie; por
ejemplo, permitiendo las porciones de unión al antígeno de
anticuerpos no unidos al sustrato, mientras que las porciones de no
unión al antígeno son ligadas al sustrato. Controlando la posición
de los ligando reactivos individuales, se pueden producir patrones
o arrays de los ligandos. Las porciones de la superficie que no son
ocupadas por el reactivo de unión a la nucleolina no permiten la
adsorción inespecífica de polipéptidos o polinucleótidos.
En esta realización, una muestra de un sujeto,
por ejemplo, sangre, es pasada sobre un chip que contiene moléculas
de unión a nucleolina. Un dispositivos biosensor, tal como una
máquina que detecta cambios en la superficie de un plasmón de
resonancia, es entonces usadas para detectar nucleolina unida. Chips
de BIAcore (Uppsala, Suecia) sirven como ejemplos de chips y
máquinas de detección útiles.
Los métodos diagnósticos pueden ser además
utilizados para identificar sujetos que tengan, o estén en riesgo
de desarrollar, una neoplasia en un estadío temprano del desarrollo
de la enfermedad, puesto que la expresión en superficie de la
nucleolina puede ser detectada más temprano que con métodos
convencionales. Los ensayos pronósticos pueden ser usados para
identificar un sujeto que tenga o esté en riesgo de desarrollar una
neoplasia, tal como un sujeto que tiene una historia familiar de
neoplasias dañinas, especialmente cáncer. Un método para
identificar tal individuo incluiría una muestra de ensayo obtenida a
partir de un sujeto y ensayar para detectar la localización en
superficie celular de nucleolina.
En otra realización, detectar nucleolina en
membrana plasmática y después evaluar bien cualitativa o bien
cuantitativamente la cantidad de nucleolina (normalmente de modo
indirecto a través de la señal generada a partir de las moléculas
de nucleolina unidas) puede indicar la tasa de proliferación
celular, puesto que los niveles de nucleolina en membrana
plasmática correlacionan con las tasas de proliferación celular.
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Ejemplo
1
Este ejemplo ilustra un procedimiento que tiene
la nucleolina nuclear, o sólo la nucleolina en membrana
plasmática.
Las células de la líneas celulares DU145 (cáncer
de próstata humano), MDA-MB-231
(cáncer de mama humano), HeLa (cáncer cervical humano) y HS27
(fibroblastos de piel normal)(todos disponibles de la ATCC;
Manassas, VA) fueron liberadas de los sustratos de cultivo con
tripsina, resuspendidas en suspensiones de células únicas y
colocadas sobre portaobjetos de microscopía. Los portaobjetos
sembrados con células fueron incubados a 37ºC hasta que estuvieron
bien unidas, como se ensaya mediante inspección visual usando un
microscopio. Tras lavar las células unidas una vez con PBS durante
2 minutos, se fijaron en formaldehído 4%/PBS durante al menos 15
minutos a 22ºC. Para la tinción de nucleolina nuclear las células
son permeabilizadas con Tritón X-100 al 1%
previamente a ponerlas en contacto con el anticuerpo. Tras lavar dos
veces con PBS, lavados de 5 minutos, los sitios de unión
inespecíficos fueron bloqueados durante 15-60
minutos con NGS 1%/PBS a 22ºC, y luego incubadas con anticuerpos
antinucleolina de ratón diluidas en NGS 1%/PBS o PBS/Tween
(0,05%-0,1%) durante 1 hora hasta toda la noche a 4ºC. Las muestras
fueron lavadas cuatro veces, durante 5 minutos cada una con PBS, y
luego incubadas con anticuerpos de cabra anti
fosfo-anticuerpo de ratón marcado con anticuerpos
secundarios marcados con FITC diluidas en PBS durante 1 hora a
22ºC. Tras lavar de nuevo cuatro veces con PBS durante 5 minutos
cada uno, las muestras fueron montadas en medio de montaje Mowiol
(preparado como sigue: 9 ml/glicerol y 3,36 g Mowiol
40-88 fueron agitadas durante 1 h a 22ºC. Después, 9
ml de agua fueron entonces añadidos, y la agitación continuada
durante 2 h a 22ºC. Tris (0,2 M, pH 8,5; 18 ml) fue entonces
añadido, y la disolución incubada durante 6 horas a 50ºC hasta que
los sólidos estuvieron casi completamente disueltos. Tras la
centrifugación a 5000 x g, la fase líquida fue usada para montar),
observadas al microscopio, y fotografiadas.
Las Figuras 1 y 2 muestran tinción de nucleolina
nuclear (Figura 1) y de membrana plasmática (Figura 2) en las
diversas líneas celulares. Se muestran las inmunofluorescencias
(Figuras 1 y 2; paneles B, D, F, H) y micrografías de contraste de
fases paralelas (Figuras 1 y 2; paneles A, C, E, G); células DU 145
son mostradas en A y B, células
MDA-MB-231 son mostradas en C y D;
las células HeLa son mostradas en E y F; y las células HS27 son
mostradas en G y H. todas las líneas celulares muestran tinción de
nucleolina nuclear (Figuras 1A, 1C, 1E y 1G). Obsérvese que cuando
las células no son permeabilizadas, restringiendo así el acceso de
los anticuerpos a la superficie de la membrana plasmática, la línea
celular de piel normal, HS27, es completamente negativa para la
tinción de membrana plasmática (Figura 2H) mientras que las células
cancerígenas muestran una tinción fuerte (Figuras 2B, 2D, 2F y 2H).
La tinción de nucleolina en membrana plasmática es así un método
superior para el diagnóstico y pronóstico comparado con la
nucleolina nuclear o NORs de tinción de plata.
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Ejemplo
2
Este experimento demuestra que las líneas
celulares con altos niveles de nucleolina en membrana plasmática
corresponde con aquellos con la proliferación más rápida.
Dos líneas celulares, DU145 y HeLa, y una línea
celular normal, HS27, fueron ensayadas en lo que respecta a su tasa
de proliferación y comparadas. El tiempo de duplicación celular es
calculado determinando la densidad celular a intervalos regulares
usando el ensayo MTT (basado en la capacidad de las células vivas de
reducir bromuro de 3-(van de Loosdrecht y otros,
1994)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) en formazan; (van
de Loosdrecth y otros, 1994)), y confirmado contando las células
usando la exclusión de azul de tripán.
La figura 3 muestra las tasas de proliferación
comparativas de DU145 (cuadrados), HeLa (rombos) y HS27 (círculos)
medidas por el ensayo MTT. Hasta tres días de cultivo, las tasas de
crecimiento fueron similares, pero después de los 3 días, las
células HeLa y DU145 aumentaron a una tasa más rápida que la de las
células HS27 normales. Aunque
MDA-MB-231 no fue incluida en este
experimento, se ha determinado que la tasa de proliferación es
DU145> MDA-MB-231>HeLa>
HS27. Nótese que las líneas celulares con altos niveles de
nucleolina en membrana plasmática (véase la Figura 2) corresponde
con las de proliferación más rápida (DU 145 y HeLa).
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Ejemplo
3
Este ejemplo proporciona una técnica adecuada
para detectar y localizar la nucleolina en una muestra fijada que
ha sido embebida.
Las secciones de células fijadas y embebidas en
cera parafina y ancladas en portaobjetos para microscopía fueron
lavadas en tres cambios de xileno (de 2 minutos cada uno) para
eliminar la parafina, hidratadas en alcohol graduado (series de
100%, 95% y 70%; 2 minutos cada uno), y colocadas en PBS durante 5
minutos. La recuperación de antígeno usó la aproximación de
retirada de antígenos a baja temperatura (LTAR; (Shi y otros, 1997;
Shi y otros, 2001)): Tras la digestión con tripsina 0,1%-EDTA (v/v)
(Invitrogen corp; Carlsbad, CA) diluida en PBS durante 15 minutos a
37ºC/CO_{2} 5%, las muestras fueron lavadas con agua desionizada e
incubadas en tampón citrato 10 mM (pH 6) durante 2 horas a 80ºC.
Tras enfriar, los portaobjetos fueron lavados con agua desionizada
y después con
PBS.
PBS.
Los sitios de unión inespecíficos fueron
bloqueados mediante incubación en BSA al 3% en PBSA durante 30
minutos a 22ºC. Las muestras fueron entonces incubadas con 4 mg/ml
de anticuerpo monoclonal antinucleolina de ratón (Santa Cruz)
diluidas en PBS/NGS 1% a 4ºC durante toda la noche. Las muestras
fueron entonces llevadas a 22ºC, lavadas cuatro veces con PBS
durante 5 minutos, y luego hechas reaccionar con anticuerpo de cabra
conjugado con Alexa 488 anti IgG de ratón (Molecular Probes;
Eugene, OR) y 2 mg/ml de yoduro de propidio diluido en PBS/NGS 1%
durante 1 hora a 22ºC. Tras lavar cuatro veces con PBS durante 5
minutos, las muestras fueron montadas en medio de montaje Mowiol y
observadas en un microscopio de fluorescencia.
La Figura 4 muestra los resultados de tal
experimento. Una muestra clínica de un carcinoma de células
escamosas de la cabeza y el cuello fue preparada y ensayada para
detectar nucleolina en membrana plasmática. La señal de nucleolina
en membrana plasmática fue relegada a células neoplásicas malignas.
La figura 4A muestra la señal de inmunofluorescencia obtenida de
ensayar para la detección de nucleolina; los núcleos son
contrateñidos con una tinción intercalante del ADN. La figura 4
muestra una micrografía de contraste de fases paralela. Las figuras
4C y 4D son duplicados de las figuras 4A y 4B, excepto en que se han
añadido marcas para indicar mejor las áreas de tinción. En la
región 1, la señal es fuerte sobre las células (señal débil en
relación con la tinción nuclear en la Fig. 4A); estas células están
en un tejido organizado de manera poco compacta y están empaquetada
de manera menos densa, sugiriendo que son malignas. En la región 2,
las células normales (como se delinea mediante células bien
empaquetadas y tejido organizado), no muestran señal de nucleolina
en membrana plasmática.
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Ejemplo
4
Este ejemplo demuestra que las células de
carcinoma de pulmón pueden ser fácilmente identificadas tiñendo
nucleolina de membrana plasmática.
NCI-H1299 (carcinoma de pulmón
de células no pequeñas aisladas de nódulos linfáticos de H.
sapiens; (Giaccone y otros, 1992; Lin y Chang, 1996)) y
NCI-H82 (células de carcinoma de pulmón de células
pequeñas, H. sapiens, (Carney y otros, 1985; Little y otros,
1983; Takahashi y otros, 1989)) las células fueron liberadas de los
sustratos de cultivo con tripsina, resuspendidas en suspensiones de
células únicas y colocadas sobre portaobjetos de microscopía. Las
células fueron incubadas a 37ºC hasta que estuvieron bien unidas
como se comprueba mediante inspección visual usando un microscopio.
Tras lavar las células una vez con PBS durante 2 minutos, se fijaron
en formaldehído 4%/PBS durante al menos 15 minutos a 22ºC. Tras
lavarlas dos veces con PBS, 5 minutos/lavado, los sitios de unión
inespecíficos fueron bloqueados durante 15-60
minutos con NGS 1%/PBS a 22ºC, y luego incubadas con anticuerpos
antinucleolina de ratón durante 1 hora hasta toda la noche a 4ºC.
Las muestras fueron lavadas cuatro veces, 5 minutos cada una con
PBS y luego incubadas con anticuerpo secundario de cabra anti
anticuerpos de ratón marcado con FITC diluido en PBS con yoduro de
propidio (para teñir los núcleos) durante 1 hora a 22ºC. Tras lavar
de nuevo durante 4 horas con PBS durante 5 minutos cada uno, las
muestras fueron montadas en medio de montaje Mowiol, observadas al
microscopio y fotografiadas.
La figura 5 muestra células entera ensayadas
para la presencia de nucleolina en membrana plasmática de las dos
líneas celulares de cáncer de pulmón, NCI-H82
(Figura 5A; una imagen de contraste de fase paralela es mostrada en
5B) y NCI-H1299 (Figura 5C; una imagen de contraste
de fase paralela es mostrada en 5D). En ambas líneas celulares, la
tinción de nucleolina en membrana plasmática es fuerte; ejemplos de
células bien teñidas son denotadas por un asterisco (*) en las
figuras 5A y 5C.
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Ejemplo
5
Para ensayar la factibilidad de usar este nuevo
método para ensayar nucleolina en membrana plasmática para
diagnosticar tumores, célula premalignas y malignas, especímenes
clínicos de sujetos sanos y aquellos que sufren de un cáncer fueron
recogidas. Las muestras de sangre periférica, médula ósea y muestras
de biopsias de tumores fueron obtenidas y teñidas para detectar
nucleolina en membrana plasmática como se describe en el Ejemplo 4.
La Figura 6 muestra el contraste de fases (B, D, F) e imágenes
inmunofluorescentes (A, C, E) de sangre periférica (A, B) o médula
ósea (C, D y E, F). Células con tinción fuerte de nucleolina en
membrana plasmática son marcadas con un asterisco (*); éstas fueron
vistas solamente en aquellos pacientes que sufren carcinomas (A, B
y C, D), mientras que las células de un paciente sano no mostaron
ninguna tinción en membrana plasmática
(E, F).
(E, F).
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Ejemplo
6
(Vaticinado)
Treinta y tres líneas celulares de carcinoma de
pulmón son analizadas, la mayoría disponibles a partir de la
colección americana de cultivos tipo (Manassas, VA). El tiempo de
duplicación celular es calculado determinando la densidad celular a
intervalos regulares usando el ensayo MTT y confirmado contando las
células usando la exclusión de azul de tripan. En cada experimento
las células HeLa (Gey y otros, 1952) son incluidas como un testigo
interno. Cada valor es determinado a partir de al menos dos
experimentos independientes con muestras triplicadas. Para
determinar los niveles de nucleolina en membrana nuclear y
plasmática, dos métodos son implementados. Primero, los extractos
nucleares y de membrana plasmática son preparados a partir de cada
línea celular usando métodos que han sido descritos (Ausubel y
otros, 1987; Bates y otros, 1999; Yao y otros, 1996a). Brevemente,
las células son recogidas y resuspendidas en un tampón hipotónico,
después se deja que se hinchen en hielo durante varios minutos. Las
células son lisadas usando un homogeneizador Dounce, y los núcleos
son recogidos mediante centrifugación. Los núcleos son
resuspendidos en un tampón de elevada salinidad para extraer las
proteínas nucleares; la sal es entonces eliminada mediante diálisis.
Las proteínas de membrana plasmática puede ser aislada a partir de
la fracción s-100 y son separadas a partir de las
proteínas citosólicas y otros orgánulos mediante centrifugación a
través de un gradiente de sacarosa. Los extractos nucleares y de
membrana plasmática a partir de diferentes células son analizados
mediante análisis de transferencia Western (Ausubel y otros, 1987)
usando un anticuerpo anti nucleolina (Santa Cruz) seguido por
visualización quimoluminiscente. Los niveles de nucleolina son
entonces cuantificados mediante densitometría de la señal resultante
captada en una película de rayos X y normalizada a la intensidad de
los extractos de Hela testigos. La segunda aproximación para
determinar los niveles de nucleolina implica la detección
inmunofluorescente en líneas celulares de nucleolina. Las células
son ensayadas para su expresión en superficie de nucleolina en
paralelo con células DU 145 (Mickey y otros, 1977; Stone y otros,
1978) como testigo positivo, las células HS27 como un testigo
negativo y las células Hela como referencia (véase la Figura 2).
Las células son fotografiadas y ordenadas en orden del grado de
señal, que puede ser también cuantificado (usando sistemas que usan
software e imágenes para cuantificar píxeles; en este caso
videoimágenes son usadas) o cualitativamente evaluadas. Los datos
son entonces sometidos a análisis estadísticos para demostrar
correlaciones con el grado de proliferación celular (tasas elevadas
de proliferación celular indican células cancerígenas más agresivas)
con la intensidad de la señal de nucleolina a través de la muestra
completa y dentro de los subgrupos.
\newpage
Ejemplo
7
(Vaticinado)
En este ejemplo, las biopsias de pacientes,
muestras de esputos y tejido de pulmón diseccionado son ensayados
para detectar nucleolina en membrana plasmática, y estos resultados
son comparados con otros diagnósticos y marcadores pronósticos para
cáncer de pulmón, utilizando especímenes clínicos archivados y
rutinarios para este estudio
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Los especímenes que incluyen biopsias
bronquiales, muestras de esputos, y tejido de pulmón diseccionado
son obtenidas a partir de sujetos humanos, tanto sanos como de
quienes sufren cáncer de pulmón y cada muestra codifica de tal modo
que al tiempo de ensayar para detectar y observar la nucleolina la
muestra de origen es desconocida.
El ensayo de estas muestras usando técnicas
inmunohistoquímicas es entonces implementado. Por ejemplo,
nucleolina de membrana plasmática es ensayada con uno o más
anticuerpos anti-nucleolina seleccionados de la
Tabla 1, una señal generada a partir de un anticuerpos secundarios
marcados con un fluoróforo, y las muestras observadas y
fotografiadas. Los testigos apropiados incluyen ensayar con el
anticuerpo secundario solo, ensayar sin anticuerpos, ensayar con
suero preinmune solo, y ensayar con un anticuerpo conocido que no
reacciona con los tipos celulares a ser analizados. Para facilitar
la visualización y la determinación de la localización, las células
pueden ser contrateñidas con Hoechst 33258 o yoduro de propidio
(para visualizar los núcleos) y/o con faloidina o falicidina
marcada fluorescentemente (para visualizar el citoesqueleto de
actina). Las muestras son observadas, enumeradas (la señal en
superficie indica la expresión de nucleolina en membrana plasmática)
y documentadas.
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 23
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\hskip0,8cm
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<210> 24
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 24
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<210> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 25
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\hskip0,8cm
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 26
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\hskip0,8cm
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<211> 28
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<212> ADN
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<220>
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\newpage
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<212> ADN
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 29
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\hskip0,8cm
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<210> 30
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
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<400> 30
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\hskip0,8cm
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<210> 31
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 31
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\hskip0,8cm
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<210> 32
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<211> 29
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\newpage
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<400> 32
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\hskip0,8cm
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 33
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<211> 6
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<220>
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<223> oligonucleótido sintético
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<400> 34
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<211> 7
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<211> 11
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<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 37
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<223> oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (26)
1. Un método in vitro para determinar un
estadío neoplásico de una célula, que comprende cuantificar la
cantidad de nucleolina en membrana plasmática en la célula.
2. El método de la Reivindicación 1, en el que
la cuantificación comprende cuantificar un complejo de
nucleolina-agente antinucleolina.
3. El método de la Reivindicación 1 ó 2, en el
que la célula es de mamífero.
4. El método de la Reivindicación 3, en el que
la célula es de mono, perro, gato, conejo, vaca, cerdo, cabra,
cobaya, ratón, rata u oveja.
5. El método de la Reivindicación 3, en el que
la célula es de humano.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la célula es lisada.
7. El método de la Reivindicación 2, en el que
el agente antinucleolina es una anticuerpo monoclonal.
8. El método de la Reivindicación 7, en el que
el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal de ratón
p7-1A4, sc-8031,
sc-9893, sc-9892, 4E2 o 3G4B2.
9. El método de la Reivindicación 2, en el que
el agente anti-nucleolina es un oligonucleótido que
une nucleoli-
na.
na.
10. El método de la Reivindicación 9, en el que
el oligonucleótido es un oligonucleótido rico en guanosina.
11. El método de la Reivindicación 10, en el que
el nucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en las SEQ ID Nºs: 1-7;
9-17; 19-30 o 31.
12. El método de la Reivindicación 11, en el que
el complejo es cuantificado cuantificando la fluorescencia, una
enzima, o la radioactividad.
13. Un método in vitro según cualquiera
de las reivindicaciones, en el que dicha cuantificación es llevada
a cabo usando un kit que comprende un agente antinucleolina y una
muestra testigo.
14. El método de la Reivindicación 13, en el que
el kit contiene además un segundo agente que detecta un complejo
nucleolina-antinucleolina.
15. El método de la Reivindicación 14, en el que
el agente antinucleolina es un anticuerpo antinucleolina, y el
segundo agente es un anticuerpo secundario marcado.
16. El método de la Reivindicación 15, en el que
el marcaje es al menos una enzima, fluoróforo, radioisótopo o
partícula de oro.
17. El método de la Reivindicación 16, en el que
el agente antinucleolina comprende biotina, y el segundo agente
comprende avidina y estreptavidina.
18. El método de la Reivindicación 16, en el que
el agente antinucleolina comprende digoxigenina, y el segundo
agente comprende un anticuerpo antidigoxigenina marcado.
19. El método de la Reivindicación 16, en el que
el kit comprende además al menos un miembro seleccionado a partir
del grupo que consiste en un fijador, un tampón, material plástico,
suero, albúmina sérica, leche desnatada, membranas e
instrucciones.
20. El método de la Reivindicación 16, en el que
el agente antinucleolina está marcado.
21. El método de la Reivindicación 20, en el que
el marcaje es al menos una enzima, fluoróforo, radioisótopo y
partículas de oro.
22. Un método in vitro para detectar
carcinoma de pulmón en un sujeto, que comprende: cuantificar la
presencia de nucleolina en la superficie de células de pulmón en
una muestra del sujeto.
23. Un método in vitro para diagnosticar
células pre-malignas o malignas, que comprende
determinar el estadío neoplásico de células mediante el método de
la Reivindicación 1, en el que la muestra comprende células de
pulmón de un sujeto, habiendo sido dicho sujeto enviado a un centro
de ensayos.
24. El método de la Reivindicación 22 ó 23, en
el que el sujeto es humano.
25. El método de la Reivindicación 22 ó 23, en
el que la muestra es esputo.
26. El método de la Reivindicación 25, en el que
el diagnóstico es diagnosticar carcinoma de pulmón de células
pequeñas.
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