ES2307505T3

ES2307505T3 - Utilizacion de ligandos receptores de erbb en el tratamiento de la diabetes.

Info

Publication number: ES2307505T3
Application number: ES00921827T
Authority: ES
Inventors: Xiaojian Huang; Timothy Andrew Stewart
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-04-05
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2020-04-05
Also published as: WO2000059525A2; US20080031880A1; EP1165113A2; US20060029605A1; WO2000059525A3; JP2002541117A; DE60039160D1; AU4209300A; CA2368017A1; ATE397959T1; DK1165113T3; PT1165113E; IL145674A0; IL145674A; JP4794049B2; EP1165113B1

Abstract

Utilización de heregulina en la preparación de un medicamento para tratar la disfunción pancreática en un mamífero, mediante la inducción o estimulación de la diferenciación o proliferación de las células precursoras beta o la proliferación de las células beta maduras.

Description

Utilización de ligandos receptores de ErbB en el tratamiento de la diabetes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de heregulina en medicamentos para tratar la diabetes y otras condiciones asociadas a la disfunción pancreática.

Antecedentes de la invención La familia del receptor y ligando de ErbB

La transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular se encuentra regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteína tirosina quinasas son enzimas que catalizan dicho proceso. Los receptores proteína tirosina quinasa se cree que dirigen el crecimiento celular mediante la fosforilación de tirosinas estimulada por ligando de sustratos intracelulares. La familia de receptores de ErbB pertenece a la superfamilia de receptores de tirosina quinasa subclase I e incluye cuatro receptores diferentes, incluyendo el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbB1), ErbB2 (HER2 o p185 neu), ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4 o tiro2).

Se ha implicado causalmente EGFR o ErbB1 en tumores malignos humanos y, en particular, se ha observado la expresión incrementada de este gen en carcinomas más agresivos de mama, vejiga, pulmón y estómago. Se ha informado de que la expresión incrementada de EGFR con frecuencia se asocia a la producción incrementada de ligando de EGFR, factor alfa de crecimiento transformante (TGF-alfa), por parte de las mismas células tumorales, resultando en la activación del receptor a través de una ruta estimuladora autocrina [Baselga et al., Pharmac. Ther. 64:127-154, 1994]. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR, o los ligandos del mismo TGF-alfa y EGF, han sido evaluados como agentes terapéuticos en el tratamiento de dichos tumores malignos [ver, por ejemplo, Baselga et al., supra; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007, 1984; Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905, 1995].

El segundo miembro de la subfamilia de clase I, p185^{neu}, fue identificado originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratados químicamente. El gen neu (también denominado erbB2 y HER2) codifica un receptor proteína tirosina quinasa de 185 kDa. La amplificación y/o sobreexpresión del gen ErbB2 humano se correlaciona con un mal pronóstico en cánceres de mama y ováricos [Slamon et al., Science 235:177-182, 1987; y Slamon et al., Science 244:707-712, 1989; patente US nº 4.968.603]. La sobreexpresión de ErbB2 ha sido observada en muchos carcinomas, incluyendo carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon y vejiga. De acuerdo con lo anterior, Slamon et al., en la patente US nº 4.968.603, describen y reivindican diversos ensayos diagnósticos para determinar la amplificación o expresión de gen ErbB2 en células tumorales.

Los anticuerpos dirigidos contra los productos de los genes p185^{neu} de rata y ErbB2 humano han sido descritos. Por ejemplo, Drebin et al., Cell 41:695-706, 1985; Meyers et al., Methods Enzym. 198:277-290, 1991; y patente WO nº 94/22478 describe anticuerpos dirigidos contra el producto génico de rata p185^{neu}. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9:1165-1172, 1989, describen la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que se caracterizaron utilizando la línea de células de tumor mamario humano SKBR3. También se ha informado de otros anticuerpos anti-ErbB2 en la literatura [ver, por ejemplo, patentes US nº 5.821.337 y nº 5.783.186, patente WO nº 94/00136; Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937, 1991; McKenzie et al., Oncogene 4:543-548, 1989; Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369, 1991; Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362, 1990; Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408, 1993; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776, 1992; Hancock et al., Cancer Research 51:4575-4580, 1991; Shawver et al., Cancer Research 54:1367-1373, 1994; Arteaga et al., Cancer Research 54:3758-3765, 1994; Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167, 1992].

También se ha descrito un gen relacionado adicional, denominado erbB3 o HER3 (ver la patente US nº 5.183.884 y nº 5.480.968; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197, 1989; solicitud de patente EP nº 44.961A1, y Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904, 1993). Kraus et al. (1989) descubrieron la presencia de niveles marcadamente elevados de ARNm de erbB3 en determinadas líneas de células de tumor mamario humano, indicando que erbB3, al igual que erbB1 y erbB2, podrían desempeñar un papel en tumores malignos humanos. Además, Kraus et al., supra (1993) han demostrado que la activación dependiente de EGF del dominio catalítico de ErbB3 de un receptor quimérico EGFR/ErbB3 resultó en una respuesta proliferativa en células NIH-3T3 transfectadas. En la actualidad se cree que ello es el resultado de ErbB1 o ErbB2 endógenos en las NIH-3T3. Además, dichos investigadores demostraron que algunas líneas de células de tumor mamario humano muestran una elevación significativa de la fosforilación de tirosinas de ErbB3 de estado estable, indicando también que este receptor podría desempeñar un papel en los tumores malignos humanos. Otros han explorado el papel de erbB3 en el cáncer. Se ha encontrado que se encuentra sobreexpresado en los cánceres de mama [Lemoine et al., Br. J. Cancer 66:1116-1121, 1992], gastrointestinal [Poller et al., J. Pathol. 168:275-280, 1992; Raj-kumer et al., J. Pathol. 170:271-278, 1993, y Sanidas et al., Int. J. Cancer 54:935-940, 1993] y pancreático [Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273, 1992; Friess et al., Clinical Cancer Research 1:1413-1420, 1995].

\newpage

La subfamilia de clase I de receptores proteína tirosina quinasa de factor de crecimiento epidérmico se ha extendido adicionalmente para incluir el receptor ErbB4 [ver la solicitud de patente EP nº 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750, 1993, y Plowman et al., Nature 366:473-475, 1993]. Plowman et al. encontraron que la expresión incrementada de ErbB4 se encontraba estrechamente correlacionada con determinados carcinomas de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas mamarios. Los procedimientos diagnósticos para la detección de las condiciones neoplásicas humanas (especialmente los cánceres de mama) que evalúan la expresión de ErbB4 se describen en la solicitud de patente EP nº 599.274.

Se han descrito en la literatura diversos ligandos que se unen y/o activan dichos receptores ErbB. Entre los ligandos se incluyen los polipéptidos denominados EGF [Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621, 1972], TGF-alfa [Marquardt et al., Science 223:1079-1082, 1984], anfiregulina [Shoyab et al., Science 243:1074-1076, 1989; Kimura et al., Nature 348:257-260, 1990; Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557, 1991], EGF ligante de heparina (HB-EGF) [Higashiyama et al., Science 251:936-939, 1991], betacelulina [Shing et al., Science 259:1604-1607, 1993] y epiregulina [Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500, 1995]. ErbB1 se une a seis ligandos diferentes: factor de crecimiento epidérmico (EGF), TGF-alfa, anfiregulina, HB-EGF, betacelulina y epiregulina [ver también, por ejemplo, Groenen et al., Growth Factors 11:235-257, 1994].

Una familia de proteínas heregulina resultante del procesamiento de un único gen son los ligandos de ErbB3 y de ErbB4. Tal como se comenta adicionalmente después, la familia de la heregulina incluye NDFs, GGFs y ARIA [Groenen et al., Growth Factors 11:235-257, 1994; Lemke, Molec. & Cell. Neurosc. 7:247-257, 1994; Lee et al., Pharm. Rev. 47:51-85, 1995]. Se han identificado ligandos adicionales de ErbB: la neuregulina-2 (NRG-2), que se informa que se une a ErbB3 o a ErbB4 [Chang et al., Nature 387:509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997] y la neuregulina-3, que se une a ErbB4 [Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567, 1997]. HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se unen a ErbB4.

Aunque EGF y TGF-alfa no se unen a ErbB2, EGF estimula ErbB1 y ErbB2 para formar un heterodímero, que activa a ErbB1 y resulta en la transfosforilacion de ErbB2 en el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación aparentemente activa la ErbB2 tirosina quinasa. De manera similar, cuando ErbB3 se coexpresa con ErbB2, se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de romper el complejo [Sliwkowsky et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665, 1994]. Además, la afinidad de ErbB3 para la heregulina se incrementa a un estado de afinidad superior cuando se coexpresa con ErbB2 [Levi et al., J. Neuroscience 15:1329-1340, 1995; Morrisey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:1431-1435, 1995, y Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996 con respecto al complejo proteico ErbB2-ErbB3]. ErbB4, al igual que ErbB3, forma un complejo de señalización activo con ErbB2 [Carraway et al., Cell 78:5-8, 1994].

Holmes et al. aislaron y clonaron una familia de activadores polipéptido del receptor ErbB2 que denominaron heregulina-alfa (HRG-alfa), heregulina-betaI (HRG-betaI), heregulina-beta2 (HRG-beta2), heregulina-beta2-oide (HRG-beta2-oide) y heregulina-beta3 (HRG-beta3) [ver Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; patentes WO nº 92/20798 y US nº 5.367.060]. El polipéptido de 45 kDa, HRG-alfa, fue purificado del medio condicionado de la línea celular de cáncer mamario humano MDA-MB-231. Estos investigadores demostraron la capacidad de los polipéptidos heregulina purificados de activar la fosforilación de tirosinas del receptor ErbB2 en células de tumor mamario MCF7. Además, se ilustró la actividad mitogénica de los polipéptidos heregulina sobre las células SK-BR-3 (que expresan niveles elevados del receptor ErbB2).

Aunque las heregulinas son sustancialmente idénticas en los primeros 213 residuos aminoácidos, se clasifican en dos tipos principales, alfa y beta, basándose en dos dominios variantes similares a EGF que difieren en las partes C-terminales de los mismos. Sin embargo, estos dominios similares a EGF son idénticos en el espaciado de los seis residuos cisteína contenidos en los mismos. Basándose en la comparación de las secuencias de aminoácidos, Holmes et al. encontraron que, entre la primera y la sexta cisteínas en el dominio similar a EGF, HRGs eran similares al 45% al factor de crecimiento similar a EGF ligante de heparina (HB-EGF), idénticos al 35% a la anfiregulina (AR), idénticos al 32% a TGF-alfa e idénticos al 27% a EGF.

El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF), que es el equivalente en la rata de la HRG humana, fue descrito por primera vez por Peles et al., Cell 69:205-216, 1992, y Wen et al., Cell 69:559-572, 1992. Al igual que los polipéptidos HRG, NDF presenta un dominio de homología de inmunoglobulina (Ig) seguido de un dominio similar a EGF y carece de un péptido de señal N-terminal. Posteriormente, Wen et al., Mol. Cell. Biol. 14(3):1909-1919, 1994, llevaron a cabo la "clonación exhaustiva" para extender la familia de NDFs. Este trabajo reveló seis pro-NDFs fibroblásticos diferentes. Adoptando la nomenclatura de Holmes et al., los NDFs se clasifican como polipéptidos alfa o beta basándose en las secuencias de los dominios similares a EGF. Estos investigadores concluyeron que se generan diferentes isoformas de NDF mediante procesamiento alternativo y llevan a cabo diferentes funciones específicas de tejido. Ver también las patentes EP nº 505.148, WO nº 93/22424, y WO nº 94/28133 referentes a
NDF.

Falls et al., Cell 72:801-815, 1993, describen otro miembro de la familia de la heregulina que denominan polipéptido de actividad inductora de receptor acetilcolina (ARIA). El polipéptido ARIA derivado de pollo estimula la síntesis de receptores acetilcolina musculares. Ver también la patente WO nº 94/08007. ARIA es una heregulina de tipo I con un dominio EGF de tipo beta.

Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993, identificaron varias proteínas derivadas de bovino que se denominan factores de crecimiento glial (GGFs). Estos GGFs comparten el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF con las demás proteínas heregulina indicadas anteriormente, aunque también presentan un dominio kringle aminoterminal. Los GGFs generalmente no presentan la región espaciadora glucosilada completa entre el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF. Únicamente uno de los GGFs, GGFII, posee un péptido de señal N-terminal. Ver también las patentes WO nº 92/18625, nº 94/00140, nº 94/04560, nº 94/26298 y nº 95/32724, referentes a los GGFs y a los usos de los mismos.

Ho et al., J. Biol. Chem. 270(4):14523-14532, 1995, describen otro miembro de la familia de la heregulina denominado factor derivado de neurona sensorial y motora (SMDF). Esta proteína presenta un dominio similar a EGF característico de todos los polipéptidos heregulina aunque un dominio N-terminal diferente. La diferencia estructural principal entre SMDF y los demás polipéptidos heregulina es que SMDF carece de dominio similar a Ig y del espaciador "gluco" característico de todos los demás polipéptidos heregulina. Otra característica del SMDF es la presencia de dos tramos de aminoácidos hidrofóbicos próximos al extremo N-terminal.

Aunque los polipéptidos heregulina se identificaron por primera vez basándose en su capacidad de activar el receptor ErbB2 (ver Holmes et al., supra), se ha descubierto que determinadas células ováricas que expresan neu y fibroblastos transfectados por neu, no se unen ni se entrecruzan con NDF, ni responden a NDF, experimentando entonces la fosforilación de las tirosinas (Peles et al., EMBO J. 12:961-971, 1993). Lo anterior indica que otro componente celular resultaba necesario para proporcionar una capacidad de respuesta completa frente a la heregulina. Carraway et al. demostraron posteriormente que ^{125}I-rHRG \beta 1_{177-244} se unía a fibroblastos NIH-3T3 transfectados establemente con ErbB3 bovino y no a células parentales no transfectadas. Por consiguiente, los investigadores sugirieron que ErbB3 es un receptor de HRG y que media en la fosforilación de residuos tirosina intrínsecos, así como en la fosforilación del receptor ErbB2 en células que expresan ambos receptores. Carraway et al., J. Biol. Chem. 269(19):14303-14306, 1994, Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665, 1994, encontraron que las células transfectadas únicamente con ErbB3 mostraban afinidades reducidas para la heregulina, mientras que las células transfectadas con ErbB2 y ErbB3 mostraban afinidades más elevadas.

Dicha observación se correlaciona con la "comunicación cruzada de receptores" descrita anteriormente por Kokai et al., Cell 58:287-292, 1989; Stem et al., EMBO J. 7:995-1001, 1988, y King et al., 4:13-18, 1989. Estos investigadores encontraron que la unión de EGF a ErbB1 resultaba en la activación del dominio de quinasa de ErbB1 y la fosforilación cruzada de p185^{HER2}. Se cree que lo anterior es el resultado de la heterodimerización del receptor inducida por ligando y la fosforilación cruzada concomitante de los receptores en el heterodímero [Wada et al., Cell 61:1339-1347, 1990].

De manera similar, Plowman y colaboradores han estudiado la activación de p185^{HER4}/p185^{HER2}. Expresaron
p185^{HER2} solo, p185^{HER4} solo o los dos receptores conjuntamente en linfocitos T humanos y demostraron que la heregulina era capaz de estimular la fosforilación de tirosinas de p185^{HER4}, aunque sólo podía estimular la fosforilación de p185^{HER2} en células que expresaban ambos receptores [Plowman et al., Nature 336:473-475, 1993].

Otros papeles biológicos de los ligandos de receptor ErbB

Varios grupos han investigado otro papel o papeles biológicos de diversos ligandos de ErbB. Por ejemplo, se ha informado que la betacelulina muestra actividad estimuladora del crecimiento en células vasculares de músculo liso y en células epiteliales de pigmento retiniano [Shing et al., supra]. Falls et al., supra, encontraron que ARIA desempeña un papel en la diferenciación de miotubos, afectando a la síntesis y a la concentración de los receptores neurotransmisores en las células musculares post-sinápticas de neuronas motoras. Corfas y Fischbach demostraron que ARI también incrementa el número de canales del sodio en el músculo [Corfas y Fischbach, J. Neuroscience 13(5):2118-2125, 1993]. También se ha demostrado que GGFII es mitogénico para los mioblastos humanos quiescentes subconfluyentes y que la diferenciación de mioblastos humanos clonales en la presencia continua de GGFII resulta en un mayor número de miotubos tras seis días de diferenciación [Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462, 18D. 540, 1994]. Ver también la patente WO nº 94/26298, publicada el 24 de noviembre de 1994.

Holmes et al., supra, encontraron que HRG ejerce un efecto mitogénico sobre las líneas celulares mamarias (tales como SK-BR-3 y MCF-7). También se ha informado de la actividad mitogénica de GGFs sobre las células de Schwann [ver, por ejemplo, Brockes et al., J. Biol. Chem. 255(18):8374-8377, 1980; Lemke y Brockes, J. Neurosci. 4:75-83, 1984; Brockes et al., J. Neuroscience 4(1):75-83, 1984; Brockes et al., Ann. Neurol. 20(3):317-322, 1986; Brockes, J., Methods in Enzym. 147:217-225, 1987, y Marchionni et al., supra].

Pinkas-Kramarski et al. encontraron que NDF aparentemente se expresa en neuronas y en células gliales en cultivos embrionarios y adultos de cerebro de rata y en cultivos primarios de células cerebrales de rata, y sugirieron que podría actuar como factor de supervivencia y de maduración para los astrocitos [Pinkas-Kramarski et al., PNAS USA 91:9387-9391, 1994]. Meyer y Birchmeier, PNAS, USA 91:1064-1068, 1994, analizaron la expresión de la heregulina durante la embriogénesis del ratón y en el animal perinatal utilizando la hibridación in situ y experimentos de protección frente a ARNasa. Ver también Meyer et al., Development 124(18):3575-3586, 1997. De manera similar, Danilenko et al., Resumen 3101, FASEB 8(4-5):A535, 1994, y Danilenko et al., Journal of Clinical Investigation 95(2):842-851, 1995, encontraron que la interacción de NDF y del receptor ErbB2 resulta importante en la dirección de la migración epidérmica y en la diferenciación durante la reparación de heridas.

Ram et al., Journal of Cellular Physiology 163:589-596, 1995, evaluaron la actividad mitogénica de NDF sobre la línea celular epitelial mamaria humana inmortalizada MCF-10A. Danilenko et al., J. Clin. Invest. 95:842-851, 1995, investigaron si NDF influía sobre la migración epidérmica en un modelo in vivo de reparación de herida de grosor parcial profunda por excisión. Se informó que no se habían producido diferencias estadísticamente significativas en los queratinocitos basales y superbasales proliferantes entre las heridas de control y las heridas tratadas con rhNDF-\alpha_{2}. Marikovsky et al., Oncogene 10:1403-141, 1995, estudiaron las respuestas proliferativas de una línea celular continua aneuploide de BALB/MK de queratinocitos y evaluaron los efectos de las isoformas \alpha y \beta de NDF sobre los queratinocitos epidérmicos.

El papel o papeles potenciales que los diversos ligandos de ErbB podrían desempeñar en la proliferación y diferenciación de las células pancreáticas también ha sido informada por diversos investigadores. Las células de islotes (también denominados islotes de Langerhans) en el páncreas es conocido que producen las hormonas insulina y glucagón. Dichas células de islotes se cree que derivan de células madre en el endotelio pancreático ductular fetal [Pictet y Rutter, "Development of the embryonic pancreas", Endocrinology, Handbook of Physiology, 1972. American Physiological Society, Washington D.C., páginas 25 a 66]. En particular, durante el desarrollo, el páncreas forma un sistema de túbulos compuesto de una única capa de células no diferenciadas, que después podría diferenciarse en células ductales, células acinares o células de islotes [ver, por ejemplo, LeDouarin, Cell 53:169-171, 1998; Teitelman, Recent Prog. Hormone Res. 47:259-297, 1991].

Existen varios tipos diferentes de células de islotes que pueden identificarse histológicamente, incluyendo células denominadas células alfa y células betal. La insulina es sintetizada en el islote pancreático por las células beta. En diversas circunstancias, las células de islotes beta pueden segregar cantidades insuficientes de insulina, conduciendo finalmente a niveles anormalmente elevados de glucosa en la sangre (una condición con frecuencia denominada hiperglucemia). Se consigue el control de la producción de insulina a nivel celular en las célula beta mediante mecanismos reguladores que operan a los niveles transcripcional, traduccional y post-traduccional [Sjoholm, J. Int. Med. 239:211-220, 1996]. La insulina presenta una diversidad de actividades biológicas en mamíferos, algunos específicos de tejido. Por ejemplo, la insulina puede incrementar la producción de leche en la glándula mamaria, estimular la síntesis de grasa en el hígado, estimular el transporte de la glucosa al tejido muscular y estimular el crecimiento de los tejidos conectivos.

La deficiencia de insulina en mamíferos puede resultar en condiciones patológicas graves. Por ejemplo, en la diabetes de tipo I, el páncreas típicamente produce poco o nada de insulina. La diabetes de tipo I se caracteriza de manera general como una enfermedad autoinmunológica mediada por células T en la que las células beta pancreáticas típicamente se han destruido. La enfermedad habitualmente afecta a niños y adolescentes, pero puede producirse a cualquier edad. Se han propuesto diversos desencadenantes ambientales, por ejemplo determinados virus o componentes de la dieta, que inician el proceso autoinmunológico [Akerblom et al., Diabetes/Metabolism Review 14:31-67, 1998]. La susceptibilidad o resistencia a la diabetes de tipo 1 también puede depender de la constitución genética del individuo [Tisch et al., Cell 85:291-297, 1996]. Para una revisión general, ver Rabinovitch et al., Prevention and Treatment of Diabetes and Its Complications 82:739-755, 1998.

En la condición conocida como diabetes de tipo II, el páncreas generalmente produce algo de insulina, pero la cantidad secretada resulta insuficiente para que el mamífero mantenga niveles de glucosa fisiológicamente aceptables. La diabetes de tipo II es el tipo más común de diabetes y afecta a millones de individuos, muchos de los cuales no son conscientes de que presentan la condición. Este tipo de diabetes se caracteriza habitualmente por tres defectos separados aunque interrelacionados. Un individuo afectado puede presentar uno o la totalidad de estos defectos y diversos grados. Estos defectos son la resistencia a la insulina, la secreción alterada de insulina y la liberación inapropiada de glucosa por parte del hígado.

Todavía otra forma de diabetes se denomina diabetes gestacional. Este tipo de diabetes es típicamente una condición diabética que se diagnostica inicialmente en el individuo durante el embarazo y que se resuelve tras el parto.

Las complicaciones adicionales de dichas condiciones diabéticas son diversas y entre ellas se incluyen daños de pequeño calibre y de gran calibre de los vasos sanguíneos y daños a nervios periféricos, que a su vez pueden incrementar los riesgos de ataque cardíaco, ictus, ceguera e insuficiencia renal.

Diversos investigadores han informado sobre los efectos de polipéptidos particulares EGF, heregulina y relacionados con la heregulina, sobre las células de los islotes. En la patente WO nº 95/19785, publicada el 27 de julio de 1995, se describen procedimientos para tratar la diabetes mellitus, en la que se administra una combinación de ligando de receptor gastrina/CCK y ligando de receptor EGF (por ejemplo TGF-alfa) en cantidades suficientes para producir la diferenciación de células precursoras de los islotes pancreáticos en células secretoras de insulina maduras. La patente WO nº 95/19785 enseña que el polipéptido TGF-alfa no es capaz de estimular la diferenciación de las células precursoras de islotes al administrarlo solo.

En la patente WO nº 97/17086, publicada el 15 de mayo de 1997, se informa que proteínas betacelulina particulares eran capaces de estimular la diferenciación de una línea celular pancreática, AR42J (células de rata derivadas de un tumor pancreático inducido químicamente) en células beta productoras de insulina. En la solicitud de patente WO nº 97/17086, también se informa que otros miembros de la familia de la heregulina, tales como EGF, TGF-alfa y FGF, no consiguen inducir eficazmente dicha diferenciación en las células AR42J [ver también Ishiyama et al., Diabetologia 41:623-628, 1998; Mashima et al., J. Clin. Invest. 97:1647-1654, 1996]. Las proteínas betacelulina sometidas a ensayo en dichos experimentos, aunque mostraban cierta actividad de diferenciación en las células AR42J, no presentaban actividad (proliferativa) de factor de crecimiento [Ishiyama et al., supra].

Los efectos de dichos ligandos sobre otras líneas celulares de insulinoma pancreático también se han descrito en la literatura. Huotari et al. informaron de que la betacelulina mostraba un efecto mitogénico sobre las células INS-1 in vitro, mientras que EGF- TGF-alfa y TGF-beta eran inactivos [Huotari et al., Endocrinology 139:1494-1499, 1998]. Se informó además que ni la betacelulina, ni EGF, ni TGF-alfa ni TGF-beta afectaban al contenido de insulina de las células INS-1. La betacelulina no presentaba ningún efecto mitogénico sobre las células RINm5F, mientras que EGF y TGF-alfa eran ligeramente mitogénicos [Huotari et al., supra].

Watada et al. han investigado algunos de los factores de transcripción que se cree que resultan importantes para la expresión de genes de la insulina en las células de los islotes [Watada et al., Diabetes 45:1826-1831, 1996]. En particular, Watada et al. examinaron el factor de transcripción PDX-1, un factor que se ha encontrado que aparece antes de la insulina durante la ontogenia del páncreas del ratón, y la expresión del cual se limita a las células beta pancreáticas en el animal adulto. Se introdujo el gen PDX-1 en células \alphaTC1.6 y se observaron los cambios en el patrón de expresión génica al tratar las células con diversos factores de crecimiento. Watada et al. informaron de que la betacelulina era capaz de inducir las expresiones endógenas de insulina y de glucoquinasa en las células \alphaTC1.6 que expresaban PDX-1, pero que los factores de crecimiento TFG-alfa, TFG-\beta, EGF, IGF-I y bFGF no presentaban dicho efecto.

La patente WO nº 96/30403 sugirieron que la neuregulina podría desempeñar un papel en la supervivencia y funcionamiento de las células retinianas, y propone la utilización de la neuregulina en el tratamiento de la retinopatía diabética.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y usos para tratar la disfunción pancreática, particularmente la diabetes, en mamíferos. La invención se basa, en parte, en la identificación de los ligandos del receptor ErbB positivos en diversos ensayos para la expresión o secreción de insulina o la expresión de factores de transcripción o marcadores únicos para células beta pancreáticas. De esta manera, los ligandos del receptor ErbB indicados en la presente invención se cree que resultan fármacos útiles para el tratamiento de condiciones asociadas a la deficiencia de insulina.

En una realización, la invención proporciona un uso para tratar condiciones en mamíferos asociadas con la disfunción pancreática, y particularmente para tratar condiciones en mamíferos asociadas con el funcionamiento alterado de las células beta. En una realización preferente, la condición bajo tratamiento es la diabetes, y todavía más preferentemente, la diabetes de tipo I. El uso incluye administrar en un mamífero que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de heregulina. Opcionalmente, los procedimientos de tratamiento comprenden exponer células beta madura o células precursoras beta a una cantidad eficaz de ligando de receptor ErbB ex vivo. Las células tratadas ex vivo seguidamente pueden administrarse en el mamífero utilizando técnicas de trasplante adecuadas.

En otra realización, la invención proporciona procedimientos para inducir o estimular la proliferación de células beta precursoras o maduras. Entre los procedimientos se incluyen exponer células precursoras beta o células beta maduras a una cantidad eficaz de heregulina.

La invención proporciona además procedimientos para inducir o estimular la diferenciación de células precursoras beta. En los procedimientos, las células precursoras beta o los tejidos no diferenciados que contienen dichas células precursoras se exponen a una cantidad eficaz de heregulina.

La invención también proporciona una composición que comprende heregulina, betacelulina y un portador. Preferentemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Se proporcionan procedimientos para preparar dichas composiciones e incluyen mezclar una cantidad eficaz del ligando de receptor ErbB con el portador.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados del ensayo descrito en el Ejemplo 1, que examina el efecto de los ligandos del receptor ErbB, HB-EGF ("rh.HB-EGF"), heregulina ("rh.HRG"), anfiregulina ("rh.AR"), EGF ("rh.EGF"), TGF-alfa ("rh.TGF-a") y betacelulina ("rh.BTC") sobre la expresión de diversos marcadores (señalados en la figura) en cultivo de células pancreáticas fetales murinas primarias.

La figura 2 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de HB-EGF sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 3 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de la heregulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 4 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de la anfiregulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 5 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de EGF sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 6 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de TGF-alfa sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 7 muestra un diagrama de columnas que ilustra el efecto (medido como factor de cambio de la expresión) de la betacelulina sobre la expresión de los marcadores RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, Glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL-1, amilasa, somatostatina y Cytoker 19.

La figura 8 muestra secciones representativas (a 20X) a través del tejido pancreático de un animal de tipo salvaje no tratado (a) y de un animal de tipo salvaje (b), heregulina (+/c) (c), ErbB2 (+/-) (d) y ErbB3 (+/-) que había recibido tratamiento de heregulina. Las secciones proceden de animales que habían recibido tratamiento de heregulina durante 14 días excepto en el caso del animal tratado con heregulina (-/-), que se dosificó únicamente durante 5 a 6 días. La presencia de hiperplasia ductal (mostrada con flechas) era más evidente en los grupos de animales de tipo salvaje y ErbB2 y ErbB3 (+/-), posiblemente reflejando la exposición más larga a la heregulina.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

La expresión "receptor ErbB" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un receptor proteína quinasa que pertenece a la familia del receptor ErbB y típicamente, en su forma de secuencia nativa, comprende un dominio extracelular, que puede unirse a uno o más ligandos de ErbB (definidos posteriormente), un dominio transmembranal lipofílico, un dominio intracelular tirosina quinasa y un dominio de señalización carboxilo-terminal que presenta uno o más residuos tirosina que pueden encontrarse fosforilados. La expresión "receptor ErbB" incluye receptores polipéptido de secuencia nativa y variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. El receptor ErbB puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos. Entre los receptores ErbB contemplados por la invención sin incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los receptores EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4.

Los términos "ErbB1" y "EGFR" se refieren al receptor que se da a conocer en, por ejemplo, Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914, 1987, incluyendo formas mutantes de origen natural del mismo, tales como el mutante por deleción mencionado en Humphrey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4207-4211, 1990. ErbB1 se refiere al gen codificante de la proteína ErbB1.

Los términos "ErbB2" y "HER2" se refieren al receptor mencionado, por ejemplo, en Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6497-6501, 1985, y Yamamoto et al., Nature 319:230-234, 1986 (número de acceso X03363 de GenBank). El término erbB2 se refiere al gen codificante de ErbB2 humano y neu se refiere al gen codificante de p185^{neu} de rata.

Los términos "ErbB3" y "HER3" se refiere al receptor dado a conocer, por ejemplo, en las patentes US nº 5.183.884 y nº 5.480.968, así como Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9193-9197, 1989.

Los términos "ErbB4" y "HER4" se refieren al receptor que se da a conocer, por ejemplo, en la solicitud de patente EP nº 599.274, Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750, 1993, y Plowman et al., Nature 366:473-475, 1993.

La expresión "heterodímero ErbB" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un oligómero asociado no covalentemente que comprende por lo menos dos receptores ErbB diferentes. Dichos complejos pueden formarse en el caso de que una célula que expresa los dos receptores se expone a uno o más ligandos de ErbB y puede aislarse mediante inmunoprecipitación y analizarse mediante SDS-PAGE, tal como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665, 1994. Entre los ejemplos de dichos heterodímeros se incluyen los complejos EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 y ErbB3-ErbB4.

Las expresiones "ligando de receptor ErbB" y "ligando de ErbB" se refiere a un polipéptido que se une a uno o más receptores ErbB y/o que activa los mismos. La expresión "ligando de ErbB" incluye ligandos polipéptidos de secuencia nativa y variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. El ligando de ErbB puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos. Preferentemente, para la utilización en los procedimientos dados a conocer en la presente invención, el ligando de ErbB se prepara mediante procedimientos recombinantes. La unión de un ligando de ErbB candidato a uno o más receptores ErbB puede determinarse con facilidad utilizando ensayos conocidos, tales como aquellos descritos en la patente WO nº 98/35036, publicada el 13 de agosto de 1998. La activación de un receptor ErbB se refiere a la transducción de señales (por ejemplo, la causada por un dominio de quinasa intracelular de un receptor ErbB que fosforila residuos tirosina en el receptor ErbB o en un sustrato polipéptido) mediada por la unión de ligando de ErbB a un heterodímero ErbB que comprende el receptor ErbB de interés. Generalmente, lo anterior implica la unión de un ligando de ErbB a un heterodímero ErbB que activa un dominio quinasa de uno o más de los receptores ErbB en el heterodímero y resulta de esta manera en la fosforilación de residuos tirosina en uno o más de los receptores, y/o la fosforilación de residuos tirosina en uno o más polipéptidos sustrato adicionales. La fosforilación de los receptores ErbB puede cuantificarse utilizando diversos ensayos de fosforilación de tirosinas, incluyendo aquellos descritos en la patente WO nº 98/35036, publicada el 13 de agosto de 1998.

Los ligandos de ErbB contemplados por la invención incluyen los polipéptidos a los que se hace referencia posteriormente y que se mencionan en, por ejemplo, las revistas y patentes siguientes:

: betacelulina [Shing et al., Science 259:1604-1607, 1993; Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173, 1993];

: heregulina (HRG), un polipéptido ligando de ErbB codificado por el producto del gen heregulina tal como se da a conocer en la patente US nº 5.641.689 o Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993. Se encuentra comprendido dentro del alcance de HRG tal como se utiliza dicho término en la presente invención: heregulina-alfa, heregulina-beta1, heregulina-beta2 y heregulina-beta3 [Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; patente US nº 5.641.869], NDF [Peles et al., Cell 69:205-216, 1992], ARIA [Falls et al., Cell 72:801-815, 1993], proteínas de factor de crecimiento GGF [Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993; SMDF [Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532, 1995, y gamma-heregulina [Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997].

Un polipéptido "de secuencia nativa" se refiere a un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de origen natural. Dicho polipéptido de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos. La expresión "secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo formas procesadas alternativamente) y variantes alélicas de origen natural.

La expresión "variante de ligando de ErbB" o "variante de ligando de receptor ErbB" se refiere a un polipéptido ligando diferente del ligando de ErbB de secuencia nativa que se une a uno o más receptores ErbB y/o que activa uno o más receptores ErbB, y que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% con el polipéptido de secuencia nativa respectiva, más preferentemente de por lo menos 90%, y todavía más preferentemente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 95%. Entre las variantes de ligando de receptor ErbB se incluyen fragmentos del ligando de secuencia nativa y que presentan una secuencia consecutiva de por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30 ó 40 residuos aminoácidos de la secuencia nativa del ligando, variantes de secuencia de aminoácidos en las que se ha insertado un residuo aminoácido en posición N-terminal o C-terminal respecto a la secuencia, o en el interior de la misma, o de un fragmento de la misma tal como se ha definido anteriormente, y variantes de secuencia de aminoácidos en las que uno o más residuos han sido sustituidos por otro residuo. Entre las variantes de ligando de ErbB de incluyen aquéllas que contienen mutaciones predeterminadas mediante, por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida o por PCR, y derivadas de diversas especies animales, tales como el conejo, la rata, porcinos, primates no humanos, equinos, murinos y ovinos.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia del polipéptido ligando ErbB, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Son conocidos por el experto en la materia. Los procedimientos de alineación de secuencias y de determinación de la identidad de secuencias conocidos por el experto en la materia pueden llevarse a cabo sin experimentación innecesaria, y puede realizarse el cálculo de los valores de % de identidad con certidumbre. Por ejemplo, la alineación puede llevarse a cabo utilizando programas informáticos disponibles, tales como WU-BLAST-2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996] y Align 2 [de autor Genentech Inc., y presentado en la US Copyright Office el 10 de diciembre de 1991]. Puede llevarse opcionalmente la alineación utilizando parámetros por defecto fijados en los programas de software informático.

La expresión "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido tal como HRG que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente del ambiente natural del mismo. Son componentes contaminantes del ambiente natural del mismo materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y entre dichos materiales pueden incluirse proteínas, hormonas y otras sustancias. En las realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1) hasta más de 95% en peso de proteína según determinación mediante el procedimiento de Lowry u otro procedimiento validado de determinación de proteínas, y más preferentemente más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante la utilización del mejor secuenciador de aminoácidos disponible comercialmente hasta la fecha de presentación de la presente solicitud, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido no se encontrará presente. Entre los polipéptidos aislados se incluyen un polipéptido de una especie en un cultivo celular recombinante de una especie diferente, debido a que el polipéptido en estas circunstancias carecerá de polipéptidos de la fuente. Sin embargo, habitualmente el polipéptido aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glucoproteínas que presentan las mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno especifico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son producidas, por ejemplo, a niveles reducidos por el sistema linfático y a niveles incrementados por lo mielomas.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos ligantes de antígeno idénticos denominados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales presenta un único sitio de unión de antígeno y un fragmento "Fc" residual, el nombre del cual refleja la capacidad del mismo de cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')_{2} que presenta dos sitios de unión de antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan, definiendo un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente las seis regiones hipervariables proporcionan especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o medio Fv que comprenda únicamente tres regiones hipervariables específicas de un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque con menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' en la adición de unos cuantos residuos del extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron en forma de pares de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre los mismos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden clasificarse en dos tipos claramente diferenciados denominados kappa y lambda basándose en las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de los mismos.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidos.

El término "anticuerpo" en la presente invención se utiliza en el sentido más amplio y específicamente abarca a los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos con la condición de que muestren la actividad agonística deseada que se comenta en la presente solicitud.

La expresión "fragmentos de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio de unión de antígeno o dominio variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv: diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una cadena y anticuerpos multiespecíficos formadas a partir de fragmentos de anticuerpo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpo, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas fágicas de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991 y en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como de fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad agonística deseada [patente US nº 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984].

Los formas "humanizadas de anticuerpos no humanos" (por ejemplo murinos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Mayoritariamente los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor son sustituidas por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que presenta la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen con los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente de dos dominios variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad de las regiones hipervariables corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986, Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Bio. 2:593-596, 1992.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una cadena" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un línker polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L}, que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión de antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante la utilización de un línker excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los dominios con dominios complementarios en otra cadena y la creación de dos sitios de unión de antígeno. Se describen diacuerpos más completamente en, por ejemplo, las patentes EP nº 404.097 y WO nº 93/11161, y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

La expresión "anticuerpos lineales", tal como se utiliza en toda la presente solicitud, se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos F_{v} en tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forman un par de regiones de unión de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

La expresión "anticuerpo agonista de receptor ErbB" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo contra uno o más receptores ErbB que se une y/o activa uno o más receptores ErbB. La unión y/o activación de un receptor ErbB puede determinarse utilizando ensayos conocidos, tal como se describe en la presente invención.

La expresión "célula beta madura" se refiere a una célula epitelial diferenciada que, en un estado fisiológico normal, es capaz de responder a cambios en la concentración de glucosa (entre aproximadamente 2 mM y 20 mM) mediante la secreción de insulina. La célula beta madura puede caracterizarse adicionalmente por la expresión de insulina, glucoquinasa y/o PDX-1.

La expresión "célula precursora beta" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una célula epitelial capaz de dividirse y diferenciarse en una célula beta madura. La célula precursora beta puede caracterizarse adicionalmente por la expresión de los marcadores génicos PDX-1 y/o Pax4 y la falta de expresión de marcadores génicos de origen no epitelial (tal como la vimentina).

Los términos "tratar", "terapia" y "tratamiento" se utilizan en el sentido más amplio e incluyen la prevención (profilaxis), moderación, reducción y curación de las condiciones indicadas en la presente invención. La expresión "una cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de ligando de ErbB o anticuerpo agonista de receptor ErbB que estimula o induce la proliferación de células beta maduras o células precursoras beta in vitro y/o in vivo, o que estimula o induce la diferenciación in vitro y/o in vivo de células precursoras beta.

La administración "en combinación" con uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

La expresión "disfunción pancreática" se refiere de manera general a una o más condiciones en mamíferos que se producen como resultado de una reducción o pérdida de masa de células beta. La disfunción pancreática puede caracterizarse más particularmente, por ejemplo, por niveles deficientes de insulina en el mamífero, medios deficientes de secreción de insulina en el mamífero o en forma de síndrome metabólico. La disfunción pancreática puede deberse, por ejemplo, a la insuficiente diferenciación de células precursoras beta en células beta maduras o la destrucción de células beta que puede producirse en, por ejemplo, la insulitis o la enfermedad autoinmunológica.

Los términos "diabetes" y "diabetes mellitus" se utilizan en un sentido amplio y se refieren generalmente a la condición o síndrome en mamíferos asociado a la insulina como diabetes insulinodependiente (también denominado diabetes de tipo I o IDDM), diabetes no insulino-dependiente (también denominada diabetes de tipo II o NIDDM), diabetes gestacional, diabetes relacionada con la malnutrición (MRD) y la diabetes de aparición en la madurez del joven (también denominada MODY).

El término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, perros, caballos, gatos, etc. Preferentemente el mamífero es el ser humano.

II. Procedimientos y composiciones de la invención

Los solicitantes han descubierto que diversos ligandos de receptor ErbB alteran eficazmente la expresión de factores o marcadores de transcripción de células pancreáticas, descritos en más detalle posteriormente. Generalmente, las células precursoras (o relativamente no diferenciadas) se identifican por la presencia o ausencia de marcadores celulares específicos y funcionalmente por la capacidad respectiva de las mismas de diferenciarse en el tipo celular apropiado. La definición de marcador para las células precursoras beta se deriva, por lo menos en parte, a partir de una caracterización histológica de su origen y de los factores de transcripción que resultan necesarios para la formación pancreática. Edlund, Diabetes 47:1817-1823, 1998; Bouwens, J., Pathology 184:234-239, 1998, y Sander et al., J. Mol. Med. 75:327-340, 1997, proporcionan revisiones del desarrollo del tejido pancreático y comentarios de marcadores de células pancreáticas, particularmente la expresión de los diversos marcadores de factor de transcripción y el papel de dichos marcadores como indicios de etapas del desarrollo y función de las células pancreáticas.

En la actualidad se cree que por lo menos un subconjunto de células epiteliales ductulares en mamíferos es capaz de dar lugar a células endocrinas funcionales (tanto en el páncreas fetal durante la embriogénesis como durante la vida adulta) y de esta manera, los precursores razonablemente se esperaría que expresasen, por ejemplo, la citoqueratina 19, un marcador asociado a las células epiteliales ductales pancreáticas.

El factor de transcripción PDX-1 típicamente se expresa en un subconjunto de células endodérmicas del tubo digestivo en mamíferos y se considera que la apariencia temporal y espacial de estas células apoya que estas células sean células precursoras pancreáticas tempranas. Además, la inactivación genética de PDX-1 puede conducir a la ausencia de páncreas o de tejido pancreático en mamíferos. Por consiguiente, razonablemente es previsible que las células precursoras beta expresen PDX-1. La ausencia de los factores de transcripción Pax4, Pax6 y/o NeuroD puede conducir a la ausencia de células beta maduras y de islotes maduros, y por lo tanto de manera similar, las células precursoras beta razonablemente es previsible que expresen uno o la totalidad de estos marcadores.

La insulina, el transportador de glucosa de tipo 2 (glut2), el factor de transcripción ISL1 y la glucoquinasa (GLK) se expresan en células beta maduras. También pueden expresarse a nivel reducido en las células precursoras beta, debido a que estas células se comprometen a diferenciarse en el fenotipo de célula beta madura. En el islote maduro, cada tipo de célula endocrina expresa únicamente una de las hormonas principales: las células beta expresan insulina, las células alfa expresan glucagón y las células delta expresan somatostatina. En contraste, una célula precursora de islote puede expresar los genes codificantes de más de una hormona de islote. Por consiguiente, las células precursoras beta también pueden expresar glucagón y somatostatina. El gen codificante de la proteína ribosómica RPL19 se expresa en la mayoría de tipos celulares y puede utilizarse, tal como se describe en los Ejemplos, para representar cambios en el número celular.

Se cree que la utilización de ligandos de receptor ErbB o de anticuerpos agonistas de receptor ErbB para inducir la proliferación o el crecimiento de las células beta maduras resultará beneficioso para incrementar la secreción de insulina en el mamífero. La expansión de la masa de células beta puede constituir un medio importante para compensar la pérdida o disfunción de las células beta que se producen, por ejemplo, en la diabetes. Debido a que las células precursoras beta aparentemente también se encuentran presentes en toda la infancia y la adultez en los mamíferos, también se cree que la utilización de ligandos de receptor ErbB o de anticuerpos agonistas de receptor ErbB para inducir o estimular la diferenciación de dichas células precursoras en células beta madura resultará útil en el tratamiento de condiciones asociadas a la deficiencia de insulina.

A. Preparación de ligandos de ErbB

El ligando de ErbB (así como el receptor ErbB, que puede utilizarse por ejemplo como inmunógeno para preparar anticuerpos agonistas) puede prepararse mediante diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo procedimientos de síntesis in vitro de polipéptidos o en cultivo celular recombinante utilizando sistemas de huésped-vector, tales como los descritos posteriormente.

Opcionalmente, se utilizan células huésped de mamífero y dichos huéspedes pueden contener o no contener sistemas post-traduccionales para procesar pre-prosecuencias de ligando de ErbB en el modo habitual. Si las células huésped contienen dichos sistemas, resultará posible recuperar fragmentos subdominios naturales a partir de los cultivos. En caso contrario, el procesamiento correcto puede conseguirse mediante la transformación de los huéspedes con el enzima o enzimas requeridos o mediante el suministro de los mismos en un procedimiento in vitro. Sin embargo, no resulta necesario transformar células con los genes prepro- o estructurales completos de un polipéptido seleccionado en caso de que se desee producir únicamente fragmentos de las secuencias. Por ejemplo, puede ligarse un codón de inicio al extremo 5' del ADN codificante de un polipéptido ligando de ErbB, este ADN se utiliza para transformar células huésped y el producto se expresa directamente como forma con Met N-terminal (si se desea, la Met extránea puede eliminarse in vitro o con desmetionilasas N-terminales endógenas). Alternativamente, el ligando de ErbB puede expresarse como fusión con una secuencia de señal reconocida por la célula huésped, que procesa y secreta el ligando de ErbB maduro, tal como se describe adicionalmente después. Las variantes de secuencia de aminoácidos de ligando de ErbB de secuencia nativa pueden producirse de la misma manera.

1. Aislamiento de ADN

El ADN codificante de ligando de ErbB puede obtenerse a partir de cualquier biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee ARNm de ligando de ErbB y para expresarlo a un nivel detectable. De esta manera, puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica un gen de ligando de ErbB.

Pueden cribarse bibliotecas con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. Para las bibliotecas de expresión de ADNc, entre las sondas adecuadas se incluyen los anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen y se unen específicamente al ligando; los oligonucleótidos de aproximadamente 20 a 80 bases de longitud que codifican una parte conocida o sospechada de ADNc de ligando de ErbB de la misma especie o de una especie diferente, y/o ADNcs complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o un gen similar. Entre las sondas apropiadas para cribar las bibliotecas de ADN genómico se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, oligonucleótidos, ADNcs o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o un gen similar; y/o ADNs genómicos homólogos o fragmentos de los mismos. El cribado de ADNc o de una biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándares, tal como se describe en los capítulos 10 a 12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Un medio alternativo para aislar el gen codificante del ligando de ErbB es utilizar metodología de reacción en cadena de polimerasa (PCR), tal como se describe en la sección 14 de Sambrook et al., supra. Este procedimiento requiere la utilización de sondas oligonucleótidas que se hibridarán con el ligando de ErbB. Se describen posteriormente las estrategias para la selección de los oligonucleótidos.

Otro procedimiento alternativo para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente utilizando uno de los procedimientos descrito en Engels et al., Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 28:216-734, 1989. Entre estos procedimientos se incluyen los procedimientos de triéster, de fosfito, de fosforamidita y de H-fosfonato, la PCR y otros procedimientos de autocebador y síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos. Estos procedimientos pueden utilizarse si se conoce la secuencia de ácidos nucleicos completa del gen, o si la secuencia del ácido nucleico complementaria de la cadena codificante se encuentra disponible, o alternativamente, si la secuencia de aminoácidos diana es conocida, pueden inferirse secuencias de ácido nucleico potenciales utilizando residuos codificantes conocidas y preferentes de cada residuo aminoácido.

Un procedimiento opcional es utilizar secuencias oligonucleótidas seleccionadas cuidadosamente para cribar bibliotecas de ADNc procedentes de diversos tejidos. Las secuencias oligonucleótidas seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente inequívocas para minimizar los falsos positivos. La secuencia o secuencias actuales de nucleótidos pueden basarse, por ejemplo, en secuencias o regiones de nucleótidos conservadas o altamente homólogas o regiones de ligando de ErbB. Los oligonucleótidos pueden encontrarse degenerados en una o más posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados puede resultar de particular importancia en el caso de que se cribe una biblioteca de una especie en la que la utilización preferente de codones en dicha especie no es conocida. El oligonucleótido debe marcarse de manera que pueda detectarse tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. El procedimiento preferente de marcaje es utilizar ATP marcado con ^{32}P utilizando polinucleótido quinasa, tal como es bien conocido de la técnica, para marcar radioactivamente el oligonucléotido. Sin embargo, pueden utilizarse otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, aunque sin limitación, la biotinilación o el marcaje enzimático.

2. Variantes de secuencia de aminoácidos

Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de ligandos de receptor ErbB mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN, o mediante síntesis in vitro del ligando polipéptido deseado. Entre dichas variantes se incluyen, por ejemplo, deleciones o inserciones o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del ligando de ErbB de secuencia nativa. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo final, con la condición de que éste posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traduccionales, por ejemplo cambiar el número de posición de sitios de glucosilación, alterar las características de anclaje a membrana, alterar la localización intracelular del polipéptido mediante inserción, deleción u otro tipo de afección de la secuencia líder del polipéptido de secuencia nativa, o modificar la susceptibilidad del mismo al corte proteolítico.

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En el diseño de las variantes de secuencia de aminoácidos de un ligando de ErbB, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las características del polipéptido que debe modificarse. Los sitios para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo mediante (1) sustitución en primer lugar con elecciones conservativas de aminoácidos y después con elecciones más radicales dependiendo de los resultados alcanzados, (2) delecionar el residuo diana, o (3) insertar residuos de otros ligandos de receptor contiguos en el sitio localizado.

Un procedimiento útil para identificar determinados residuos o regiones del polipéptido que son localizaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por escaneo de alaninas", tal como se describe en Cunningham y Wells (Science 244:1081-1085, 1989). En esta referencia, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo residuos con carga, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituye con un aminoácido neutro o de carga negativa (más preferentemente alanina o polialanina), afectando la interacción de los aminoácidos con el ambiente acuoso circundante en el interior o exterior de la célula. Aquellos dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones seguidamente se refinan mediante introducción de variantes adicionales u otras variantes en o para los sitios de sustitución. De esta manera, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos no se encuentre predeterminado, no resulta necesario que la naturaleza de la mutación per se se encuentre predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, puede llevarse a cabo escaneo de alaninas o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de ligando de ErbB expresadas cribarse para la combinación óptima de actividad deseada.

Existen dos variables principales en la construcción de variantes de secuencia de aminoácidos: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Éstas son variantes de la secuencia nativa, y pueden representar alelos de origen natural o formas mutantes predeterminadas que se han preparado mutando el ADN con el fin de conseguir un alelo o una variante que no se encuentra en la Naturaleza. En general, la localización y la naturaleza de la mutación seleccionada dependerá de la característica que debe modificarse.

Las deleciones de secuencia de aminoácidos generalmente son de entre aproximadamente 1 y 30 residuos, más preferentemente de entre aproximadamente 1 y 10 residuos, y típicamente entre aproximadamente 1 y 5 son contiguos. El número de deleciones consecutivas puede seleccionarse con el fin de conservar la estructura terciaria del polipéptido en el dominio afectado, por ejemplo entrecruzamiento con cisteínas, lámina beta-plegada o hélice alfa.

Entre las inserciones de secuencia de aminoácidos se incluyen las fusiones aminoterminales y/o carboxilo-terminales de longitud comprendida entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia puede encontrarse comprendidas generalmente entre aproximadamente 1 y 10 residuos, más preferentemente entre 1 y 5, y más preferentemente entre 1 y 3. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un ligando de ErbB con un residuo metionilo N-terminal (un artefacto de la expresión directa de ErbB en cultivo celular recombinante bacteriano) y la fusión de una secuencia de señal N-terminal heteróloga con el extremo N-terminal del ligando de ErbB para facilitar la secreción del ligando de ErbB maduro de las células huésped recombinantes. Dichas secuencias de señal generalmente se obtienen, y por lo tanto son homólogas, de la especie de célula huésped pretendida. Entre las secuencias adecuadas se incluyen STII, tPA o lpp para E. coli, factor alfa para levaduras, y señales víricas, tal como gD de virus herpes, para las células de mamífero.

Entre las demás variantes por inserción de ligando de ErbB se incluyen la fusión con el extremo N-terminal o C-terminal del ligando de ErbB de un polipéptido inmunogénico, por ejemplo polipéptidos bacterianos tales como beta-lactamasa o un enzima codificado por el locus trp de E. coli, o proteína de levadura, albúmina de suero bovino y polipéptidos quimotácticos. Se encuentran contempladas las fusiones C-terminales de ECD de ligando de ErbB con proteínas que presentan una vida media prolongada, tal como regiones constantes de inmunoglobulina (u otras regiones de inmunoglobulina), albúmina o ferritina, tal como se describe en la patente WO nº 89/02922, publicada el 6 de abril de 1989.

Otro grupo de variantes son las variantes de sustitución de aminoácido. En estas variantes por lo menos un residuo aminoácido en el polipéptido ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Entre los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional se incluyen sitios identificados como el sitio o sitios activos del polipéptido, y sitios en los que los aminoácidos presentes en los ligandos de ErbB de diversas especies son sustancialmente diferentes en términos de volumen de cadena lateral, carga y/o hidrofobicidad.

Las sustituciones no conservativas suponen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del polipéptido que son homólogas a otros ligandos de receptor o, más preferentemente, en las regiones no homólogas de la molécula.

En una realización, cualquier residuo metionilo diferente del residuo metionilo de partida de la secuencia de señal o cualquier residuo localizado a menos de aproximadamente tres residuos en posición N-terminal o C-terminal respecto a cada uno de dichos residuos metionilo, se sustituye por otro residuo o se deleciona. Alternativamente, se insertan aproximadamente 1 a 3 residuos contiguos a dichos sitios.

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Cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del ligando de ErbB también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para prevenir el entrecruzamiento aberrante.

Puede prepararse ADN codificante de variantes de secuencia de aminoácidos del ligando de ErbB mediante una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, aunque sin limitación, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o la preparación de mutagénesis (sitio-dirigida) mediada por oligonucleótidos, mutagénesis por PCR y mutagénesis por inserción de casete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante. Estas técnicas pueden utilizar ácido nucleico (ADN o ARN) o ácido nucleico complementario a dicho ácido nucleico.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento opcional para preparar variantes por sustitución, deleción e inserción. Esta técnica es conocida de la técnica, tal como se describe en Adelman et al., DNA 2:183, 1983. Brevemente, se altera el ADN mediante hibridación de un oligonucleótido codificante de la mutación deseada con un molde de ADN, en el que el molde es la forma de cadena única de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativa. Tras la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que de esta manera incorporará el cebador oligonucleótido y codificará la alteración seleccionada en el ADN.

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo presentará 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios al molde en ambos lados del nucleótido o nucleótidos codificantes de la mutación. Ello garantiza que el oligonucléotido se hibridará correctamente con la molécula de molde de ADN de cadena única. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas de la técnica, tales como las descritas en Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:L5765, 1978.

También puede generarse un molde de ADN de cadena única mediante desnaturalización de plásmido de ADN de doble cadena utilizando técnicas estándares.

Para la alteración de la secuencia de ADN nativa (por ejemplo para generar variantes de secuencia de aminoácidos), el oligonucleótido se hibrida con el molde de cadena única bajo condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade un enzima polimerizador de ADN, habitualmente el fragmento klenow de la ADN polimerasa I, para sintetizar la cadena complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. De esta manera se forma una molécula heterodúplex en la que una cadena de ADN codifica la forma mutada del polipéptido, y la otra cadena (el molde original) codifica la secuencia no alterada nativa del polipéptido. Esta molécula heterodúplex seguidamente se transforma en una célula huésped adecuada, habitualmente un procariota, tal como E. coli JM 101. Tras cultivar las células, se siembran en placas de agarosa y se criban utilizando el cebador oligonucleótido marcado radioactivamente con ^{32}P-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. A continuación, la región mutada se elimina y se introduce en un vector apropiado para la producción de proteínas, generalmente un vector de expresión del tipo utilizado típicamente para la transformación de un huésped apropiado.

El procedimiento descrito en el párrafo anterior puede modificarse de manera que se cree una molécula homodúplex en la que ambas cadenas del plásmido contienen la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido de cadena única se hibrida con el molde de cadena única, tal como se ha descrito anteriormente. Se combina un mezcla de tres desoxirribonucleótidos: desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxiribotidimidina (dTTP) con una tio-desoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que puede obtenerse de Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo de molde-oligonucleótido. Tras la adición de la ADN polimerasa a dicha mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión con endonucleasa de restricción. Tras cortar la cadena molde del heterodúplex de doble cadena con un enzima de restricción apropiado, la cadena molde puede digerirse con nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada pasada la región que contiene el sitio o sitios que deben mutagenizarse. A continuación, la reacción se detiene, dejando una molécula que sólo es parcialmente de cadena única. Seguidamente, se forma un homodúplex de ADN de doble cadena utilizando ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP y ADN ligasa. A continuación, esta molécula de homodúplex puede transformarse en una célula huésped adecuada, tal como E. coli JM101, tal como se ha indicado anteriormente.

Puede generarse de varias maneras ADN codificante de variantes con más de un aminoácido que debe sustituirse. Si los aminoácidos se encuentra próximos entre sí en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos se encuentran situados a cierta distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), resulta más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. Por el contrario, puede utilizarse uno de entre dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que debe sustituirse. A continuación, los oligonucleótidos se hibridan con el ADN molde de cadena única simultáneamente, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones deseadas de aminoácidos.

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El procedimiento alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es tal como se ha descrito para los mutantes únicos: se utiliza ADN de tipo salvaje para el molde, se hibrida un oligonucleótido codificante de la primera sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas con dicho molde, generándose la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido codificante de la sustitución o sustituciones de aminoácidos adicionales deseadas seguidamente se hibridan con dicho molde y la cadena resultante de ADN ahora codifica mutaciones de la primera y de la segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en un tercera ronda de mutagénesis, y de esta manera sucesivamente.

La mutagénesis por PCR también resulta adecuada para preparar variantes de aminoácidos. Aunque el comentario siguiente se refiere a ADN, se entiende que la técnica también resulta aplicable a ARN. La técnica de PCR generalmente se refiere al procedimiento siguiente (ver Erlich, supra, capítulo por R. Higuchi, páginas 61 a 70). En el caso de que se utilicen cantidades reducidas de ADN molde como material de partida en una PCR, pueden utilizarse cebadores de secuencia ligeramente diferente respecto a la región correspondiente en un ADN molde, con el fin de generar cantidades relativamente grandes de un fragmento específico de ADN que difiere de la secuencia molde únicamente en las posiciones en las que los cebadores difieren del molde. Para la introducción de una mutación en un plásmido de ADN, se diseña uno de los cebadores para que se solape con la posición de la mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un tramo de secuencia de la cadena opuesta del plásmido, aunque esta secuencia puede encontrarse situada en cualquier sitio a lo largo del plásmido de ADN. Resulta preferente, sin embargo, que las secuencias del segundo cebador se encuentren situadas a menos de 200 nucleótidos de la secuencia del primero, de manera que al final resulte fácil de secuenciar la región amplificada completa de ADN unida por los cebadores. La amplificación por PCR utilizando un par de cebadores tal como la que se acaba de describir resulta en una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones.

Si la proporción de molde a material de producto es extremadamente reducida, la amplia mayoría de fragmentos de producto ADN incorporan la mutación o mutaciones deseadas. Este material de producto se utiliza para sustituir la región correspondiente del plásmido que sirvió como molde de PCR utilizando tecnología estándar de ADN. Pueden introducirse mutaciones en posiciones separadas simultáneamente utilizando un segundo cebador mutante o llevando a cabo una segunda PCR con diferentes cebadores mutantes y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes simultáneamente al fragmento de vector en una ligación de tres (o más) partes.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis por inserción de casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al. (Gene 34:315, 1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende ADN que debe mutarse. El codón o codones en el ADN que debe mutarse se encuentran identificados. Debe existir un único sitio de restricción de endonucleasa en cada lado del sitio o sitios de mutación identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, pueden generarse utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótido anteriormente descrita para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN. Tras introducir los sitios de restricción en el plásmido, éste se corta en estos sitios para linearizarlo. Se sintetiza utilizando procedimientos estándar un oligonucleótido de doble cadena codificante de la secuencia de ADN entre los sitios de restricción pero que contiene la mutación o mutaciones deseadas. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y después se hibridan entre sí utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de doble cadena se denomina casete. Este casete se diseña para que presente extremo 3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de manera que puede ligarse directamente con el plásmido.

Pueden utilizarse cualquiera de dichos procedimientos y técnicas para preparar o identificar las variantes de ligando de ErbB útiles en la presente invención. En particular, se hace referencia a la patente WO nº 98/35036, que da a conocer diversas variantes de heregulina que pueden resultar útiles en la presente invención.

3. Inserción de ADN en un vehículo de clonación

Se inserta el ADNc o ADN genómico codificante del polipéptido nativo o variante en un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. Se encuentran disponibles muchos vectores, y la selección del vector apropiado dependerá de: 1) si debe utilizarse para la amplificación del ADN o para la expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN que debe insertarse en el vector, y 3) la célula huésped que debe transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de la función del mismo (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped con la que es compatible. Entre los componentes del vector generalmente se incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.

(i) Componente de secuencia de señal

En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que se inserta en el vector. El ADN nativo se cree que codifica una secuencia de señal en el extremo aminoterminal (extremo 5' del ADN codificante del polipéptido) del polipéptido que se corta durante el procesamiento post-traduccional del polipéptido. Por ejemplo, puede secretarse de la célula ligando nativo de ErbB, aunque permanece alojado en la membrana debido a que contiene un dominio transmembrana y una región citoplasmática en la región carboxi-terminal del polipéptido. De esta manera, en una versión soluble secretada del ligando de ErbB, el dominio carboxilo-terminal de la molécula, que incluye el dominio transmembranal, habitualmente se deleciona. Esta variante truncada de ligando de ErbB puede secretarse de la célula, con la condición de que el ADN codificante de la variante truncada codifique una secuencia de señal reconocida por el huésped.

El polipéptido seleccionado puede expresarse no sólo directamente, sino también en forma de una fusión con un polipéptido heterólogo, preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que presente un sitio de corte específico en el extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que se inserta en el vector. Se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención los ligandos de ErbB en los que la secuencia de señal nativa ha sido delecionada y sustituida por una secuencia de señal heteróloga. La secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una secuencia que resulte reconocida y procesada, es decir, cortada por una peptidasa de señal, en la célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del ligando nativo de ErbB, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, de penicilinasa, de lpp o de enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal de ligando nativo de ErbB puede sustituirse por los líderes de invertasa de levadura, de factor alfa o de fosfatasa ácida. En la expresión de células de mamífero, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden resultar adecuadas otras secuencias de señal de mamífero.

(ii) Componente origen de replicación

Los vectores tanto de expresión como de clonación generalmente contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2m resulta adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente el componente origen de replicación no resulta necesaria para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 típicamente puede utilizarse únicamente debido a que contiene el promotor temprano).

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir son capaces de replicación en por lo menos una clase de organismos, pero pueden transfectarse en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y después se transfecta el mismo vector en células de levadura o de mamífero para la expresión.

También puede amplificarse ADN mediante inserción en el genoma huésped. Esto se consigue fácilmente utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo mediante inclusión en el vector de una secuencia de ADN que es complementaria a la secuencia presentes en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector resulta en la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del ADN codificante del polipéptido seleccionado. El ADN puede amplificarse mediante PCR y transfectarse directamente en las células huésped sin ningún componente de replicación.

(iii) Componente gen de selección

Los vectores de expresión y de clonación deben contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que: (a) proporcionan resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen codificante de la D-alanina racemasa para los Bacillus.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que no se transforman con éxito con un gen heterólogo expresan una proteína que proporciona resistencia a fármaco y que de esta manera el régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209:1422, 1980) o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413, 1985). Los tres ejemplos proporcionados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariótico para proporcionar resistencia al fármaco G418 apropiado, a neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o a higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquéllas que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico, tales como la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se sitúan bajo presión selectiva que sólo los transformantes adaptados específicamente para sobrevivir en virtud de que han incorporado el marcador. La presión selectiva se impone cultivando los transformantes en condiciones bajo las que la concentración de agente selectivo en el medio se modifica sucesivamente, conduciendo de esta manera a la amplificación de tanto el gen de selección como el ADN que codifica el polipéptido seleccionado. La amplificación es el procedimiento por el que los genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas en sucesivas generaciones de células recombinantes.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR en primer lugar se identifican mediante el cultivo de la totalidad de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada, en el caso de que se utilice DHFR de tipo salvaje, es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. A continuación, las células transformadas se exponen a niveles incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, de múltiples copias del otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN codificante de ligando de ErbB. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado de otra manera, por ejemplo ATCC nº CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógeno si se utiliza, por ejemplo, un gen DHFR mutante que es altamente resistente a Mtx (patente EP nº 117.060). Alternativamente, pueden seleccionarse células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN codificantes del polipéptido seleccionado, proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable, tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo canamicina, neomicina o G418 (ver la patente US nº 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para la utilización en la levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979, o Tschemper et al., Gene 10:157, 1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo la ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12, 1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura entonces proporciona un ambiente eficaz para detectar la transformación a partir del crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC nº 20.622 o nº 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se encuentra operablemente ligado al ácido nucleico codificante del polipéptido. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas corriente arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente a una distancia comprendida entre aproximadamente 100 y 1.000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de una secuencia particular de ácido nucleico, tal como ligando de ErbB, al que se encuentran operablemente ligados. Dichos promotores típicamente se clasifican en dos grupos, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles incrementados de transcripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo la presencia o la ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. En la actualidad son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una diversidad de potenciales células huésped. Estos promotores se encuentran operablemente ligadas a ADN codificante de ligando de ErbB mediante eliminación del promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia de promotor aislada en el vector. Tanto la secuencia promotora de ligando nativo de ErbB como muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN de ligando de ErbB. Sin embargo, resultan preferentes los promotores heterólogos, debido a que generalmente permiten una mayor transcripción y rendimientos más elevados de ligando de ErbB expresado en comparación con el promotor de ligando nativo de ErbB.

Entre los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas promotores de \beta-lactamasa y de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978, y Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), fosfatasa alcalina, un sistema de promotor triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980 y patente EP nº 36.776), tPA (patente US nº 5.641.655) y promotores híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983). Sin embargo, resultan adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Las secuencias nucleótidas de los mismos han sido publicadas, permitiendo de esta manera que el experto en la materia las ligue operablemente a ADN codificante del polipéptido seleccionado (Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980) utilizando línkers o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para la utilización en los sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN codificante.

Entre las secuencias promotoras adecuadas para la utilización con los huéspedes levadura se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otros enzimas glucolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968, y Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), tales como enolasa gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman et al., patente EP nº 73.657A. Los intensificadores de levadura también se utilizan ventajosamente con promotores de levadura.

Son conocidas las secuencias promotoras para los eucariotas. Prácticamente la totalidad de los genes eucarióticos presentan una región rica en AT localizados aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia situada 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucarióticos es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poliA al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión de mamífero.

La transcripción génica a partir de vectores en células huésped de mamífero puede encontrarse controlada por promotores obtenidos de genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferentemente virus 40 del simio (SV40), por promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, por promotores de choque térmico y por el promotor normalmente asociado a la secuencia de ligando de ErbB, con la condición de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente en forma de fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación del virus SV40 (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Mulligan y Berg, Science 209:1422-1427, 1980; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402, 1981). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente en forma de un fragmento de restricción HindIII (Greenaway et al., Gene 18:355-360, 1982). Se da a conocer un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino en la patente US nº 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la patente US nº 4.601.978. Ver también Gray et al., Nature 295:503-508, 1983, sobre la expresión de ADNc codificante de interferón inmune en células de mono; Reyes et al., Nature 297:598-601, 1982, sobre la expresión de ADNc de interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781, 1982, sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células renales de mono CV-1, fibroblastos embrionarios de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga de virus del sarcoma de Rous como promotor.

(v) Componente elemento intensificador

La transcripción de un ADN codificante de un polipéptido seleccionado de la presente invención por eucariotas superiores con frecuencia se incrementa mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de una longitud aproximada de entre 100 y 300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando la transcripción del mismo. Los intensificadores son relativamente independientes respecto a la orientación y la posición, y se han encontrado en orientación 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993, 1981) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3:1108, 1983) respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell 33:729, 1983), así como dentro de la secuencia codificante misma (Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4:1293, 1984). En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se utiliza un intensificador procedente de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus (ver también Yaniv, Nature 297:17-18, 1982) sobre elementos intensificadores para la activación de los promotores eucarióticos. El intensificador puede insertarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto al ADN de ligando de ErbB, aunque preferentemente se localiza en un sitio 5' respecto al promotor.

(vi) Componente terminador de transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles comúnmente de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los ADNs o ADNcs eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm codificante del polipéptido. Las regiones no traducidas 3' también incluyen sitios de terminación de transcripción.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente y las secuencias codificantes y de control deseadas utilizan técnicas de ligación estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se corta, adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis de confirmación de las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan las mezclas de ligación para transformar E. coli K12 cepa 294 (ATCC nº 31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan a partir de la resistencia a ampicilina o a tetraciclina, en caso apropiado. Se preparan los plásmidos de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.

Resultan particularmente útiles en la práctica de la presente invención los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADNs clonados, así como el cribado rápido de dichos polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los sistemas de expresión transitoria resultan particularmente útiles en la invención para los fines de identificar análogos y variantes útiles. Dicho sistema de expresión transitoria se describe en la patente US nº 5.024.939.

Otros procedimientos, vectores y células huéspedes adecuados para la adaptación a la síntesis del polipéptido seleccionado en cultivo celular recombinante de vertebrado se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; Levinson et al., patentes EP nº 117.060 y nº 117.058.

4. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar los vectores de la presente invención son las células procarióticas, de levadura o eucarióticas superiores indicadas anteriormente. Entre los procariotas adecuados se incluyen las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo E. coli, Bacillus, tales como B. subtilis, especies de Pseudomonas, tales como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium o Serratia marcescans. Un huésped de clonación E. coli preferente es E. coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque resultan adecuadas otras cepas, tales como E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y E. coli W3110 (ATCC nº 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos. Preferentemente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Alternativamente, resultan adecuados los procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, resultan huéspedes adecuados los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o las levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente utilizado de entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, se encuentran disponibles comúnmente varios otros géneros, especies y cepas, y resultan útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981; patente EP nº 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985), huéspedes de Kluyveromyces (patente US nº 4.943.529), tales como, por ejemplo, K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737, 1983), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans y K. marxianus, Yarrowia (patente EP nº 402.226), Pichia pastoris (patente EP nº 183.070), Sreekrishna et al., LT. Basic Microbiol. 28:265-278, 1988; Candida, Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979) y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente WO nº 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985).

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de actividades complejas de procesamiento y de glucosilación. En principio, puede trabajarse con cualquier cultivo celular de eucariotas superiores, de cultivo de células de vertebrado o de invertebrado. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas de huéspedes, tales como células huésped de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et al., en: Genetic Engineering, Set low. J.K. et al., editores, vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), páginas 277 a 279, y Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985). Se encuentran disponibles para el público una diversidad de dichas cepas víricas, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse como el virus de la presente memoria según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN codificante del ligando de ErbB se transfiere a la célula vegetal huésped de manera que resulta transfectada y expresará, bajo condiciones apropiadas, ADN de ligando de ErbB. Además, se encuentran disponibles secuencias reguladoras y de señal compatibles con células vegetales, tales como las secuencias de promotor de nopalina sintasa y de señal de poliadenilación (Depicker et al., Mol. Appl. Gen. 1:561, 1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región corriente arriba del gen 780 de ADN-T son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en células vegetales en tejido vegetal que contiene ADN recombinante (ver la patente EP nº 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

Sin embargo, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrado y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores, 1973). Son ejemplos de líneas de células huésped de mamífero, la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC nº CRL 1651), la línea renal embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), células renales de hámster neonato (BHK, ATCC nº CCL 10), células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células renales de mono (CV 1 ATCC nº CCL 70), células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC nº CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC nº CCL 2), células renales caninas (MDCK, ATCC nº CCL 34), células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC nº CRL 1442), células pulmonares humanas (W138, ATCC nº CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL51), células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982), células MRC 5, células FS4 y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferentes son células 293 renales embrionarias humanas y ováricas de hámster chino.

Las células huésped se transfectan y preferentemente se transforman con los vectores de expresión o de clonación anteriormente indicados de la presente invención y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la incorporación de un vector de expresión por parte de una célula huésped, exprese de hecho o no cualquier secuencia codificante. El experto ordinario en la materia conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo CaPO_{4} y electroporación. La transfección con éxito generalmente se reconoce cuando se produce dentro de la célula huésped cualquier indicación del funcionamiento de dicho vector.

El término "transformación" se refiere a la introducción de ADN en un organismo de manera que el ADN resulte replicable, en forma de elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra, generalmente se utiliza para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Se utiliza la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transformación de determinadas células vegetales, tal como se describe en Shaw et al., Gene 23:315, 1983 y en la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, resulta preferente el procedimiento descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al., supra. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero han sido descritos por Axel en la patente US nº 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de protoplasto.

5. Cultivo de células huésped

Las células procarióticas utilizadas para producir el ligando de ErbB se cultivan en medios adecuados, tal como se describe de manera general en Sambrook et al., supra.

Las células huésped de mamífero se utilizan para producir el ligando de ErbB pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo 30 (MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Sigma) resultan adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meh. Enz. 58:44, 1979, Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255, 1980, patente US nº 4.767.704, nº 4.657.866, nº 4.927.762 o nº 4.560.655, patentes WO nº 90/03430, nº 87/001956, patentes US nº Re. 30.985, US nº 5.122.469, puede utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según resulte necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente energética equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que resultarían conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquéllas utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

Las células huésped a las que se hace referencia en la presente exposición abarcan células en cultivo in vitro, así como células que se encuentran dentro de un animal huésped.

Se contempla adicionalmente que el ligando de ErbB pueda producirse mediante recombinación homóloga, o mediante procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen ADN codificante del polipéptido actualmente utilizado en el campo. Por ejemplo, se inserta un elemento promotor/intensificador potente, un supresor o un elemento exógeno modulador de la transcripción en el genoma de la célula huésped pretendida en proximidad y orientación suficientes para influir sobre la transcripción del ADN codificante del polipéptido deseado.

6. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern convencional, transferencia northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), la transferencia por puntos (análisis de ADN) o la hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Pueden utilizarse diversos marcajes, más comúnmente isótopos radioactivos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también pueden utilizarse otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos que pueden marcarse con una amplia diversidad de marcajes, tales como radionucleidos, fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo en el sitio donde el dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que, tras la formación de dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Alternativamente, la expresión génica puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivos celulares o de líquidos corporales, con el fin de cuantificar directamente la expresión del producto génico. En las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido de la reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado en el sitio donde los marcajes habitualmente son detectables visualmente, tales como los marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible adecuada para la utilización en la presente invención se describe en Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75:734-738, 1980.

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de líquidos pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un ligando de ErbB nativo o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención, tal como se describe adicionalmente a continuación.

7. Purificación de los polipéptidos

El ligando de ErbB puede recuperarse a partir de una fracción de membrana celular. Alternativamente, se recupera del medio de cultivo en forma de polipéptido soluble un fragmento o subdominio soluble expresado que ha sido cortado proteolíticamente o truncado. El polipéptido puede recuperarse de los lisados de células huésped cuando se expresa directamente sin una señal secretoria.

En el caso de que un ligando de ErbB se exprese en una célula recombinante que no sea de origen humano, el ligando de ErbB se encuentra completamente libre de proteínas o de polipéptidos de origen humano. Sin embargo, resulta deseable purificar ligando de ErbB a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes con el fin de obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas respecto al ligando de ErbB. Como primera etapa, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para eliminar los residuos celulares particulados. A continuación, se separan la membrana y las fracciones solubles de proteína. Seguidamente puede purificarse ligando de ErbB a partir de la fracción soluble de proteínas (requiriendo la presencia de una proteasa) y a partir de la fracción de membrana del lisado de cultivo, dependiendo de si el ligando de ErbB se encuentra unido a membrana. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: el fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice, sefarosa con heparina o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato amónico y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Las variantes de polipéptido en las que han sido delecionados, insertados o sustituidos residuos se recuperan de la misma manera que el polipéptido nativo, teniendo en cuenta cualquier cambio sustancial de propiedades ocasionado por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de ligando de ErbB con otra proteína o polipéptido, por ejemplo un antígeno bacteriano o vírico, facilita la purificación: para adsorber la fusión puede utilizarse una columna de inmunoafinidad que contenga el anticuerpo contra el antígeno. Pueden utilizarse columnas de inmunoafinidad, tales como una columna de ligando anti-ErbB policlonal de conejo, para adsorber variante de ligando de ErbB mediante la unión de la misma a por lo menos un epítopo inmunológico remanente. También puede resultar útil un inhibidor de proteasa, tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales. El experto en la materia apreciará que los procedimientos de purificación adecuados para el polipéptido nativo pueden requerir modificaciones para adaptarse a los cambios en el carácter de las variantes o tras la expresión en cultivo celular recombinante.

8. Modificaciones covalentes de los polipéptidos

Las modificaciones covalentes de los ligandos de ErbB se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Tanto la secuencia nativa como las variantes de secuencia de aminoácidos opcionalmente se modifican covalentemente. Un tipo de modificación covalente comprendido dentro del alcance de la presente invención es un fragmento de ligando de ErbB. Los fragmentos de ligando de ErbB, tales como aquellos que presentan hasta aproximadamente 40 residuos aminoácidos, se preparan convenientemente mediante síntesis química o mediante corte enzimático o químico del polipéptido ligando de ErbB de longitud completa o el polipéptido variante de ligando de ErbB. Se introducen en la molécula otros tipos de modificación covalente del ligando de ErbB haciendo reaccionar los residuos aminoácidos diana de los ligandos de ErbB con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N-terminales o C-terminales.

Los residuos cisteinilo más comúnmente se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, proporcionando derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidilo se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a un pH comprendido entre 5,5 y 7,0 debido a que este agente es relativamente específico de la cadena lateral histidilo. El bromuro de parabromofenacilo también resulta útil: la reacción preferentemente se lleva a cabo en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y aminoterminales se hacen reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes presenta el efecto de revertir la carga de los residuos lisinilos. Entre otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen amino se incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los residuos arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de los residuos arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como el grupo amino épsilon de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo puede llevarse a cabo, con interés particular en la introducción de marcajes espectrales en los residuos tirosilo mediante reacción con compuestos diazonio aromático o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosilo se yoduran utilizando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para la utilización en radioinmunoensayo, resultando adecuado el procedimiento de la cloramina T descrito anterior-
mente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R))-N=C=N-R)), en la que R y R)) son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)-carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)-carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil para entrecruzar ligando de ErbB con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua. Entre los agentes de entrecruzamiento utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidilo, tales como 3.3.1-maleimidas ditiobis(succinimidilpropionato) y bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1.8-octano. Los agentes derivatizantes, tales como propioimidato de metil-3-((p-azidofenil)ditio) rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas se utilizan matrices insolubles en agua reactivas, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos indicados en las patentes US nº 3.969.287, nº 3.691.016, nº 4.195.128, nº 4.247.642, nº 4.229.537 y nº 4.330.440.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan formando los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones levemente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos se encuentra comprendida dentro del alcance de la presente invención.

Entre otras modificaciones se incluyen la hidroxilación de prolina y de lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-mino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86, 1983), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

El ligando de ErbB opcionalmente se fusiona con un polipéptido heterólogo respecto al ligando de ErbB. El polipéptido heterólogo opcionalmente es una secuencia de anclaje, tal como la que se encuentra en una proteína de cubierta fágica, tal como las proteínas de los genes III y VIII del fago M13. Estos polipéptidos heterólogos pueden acoplarse covalentemente a polipéptido ligando de ErbB mediante cadenas laterales o mediante los residuos terminales.

El ligando de ErbB también puede modificarse covalentemente mediante la alteración de su patrón nativo de glucosilación. Uno o más sustituyentes carbohidrato en estas realizaciones se modifican mediante adición, eliminación o variación de los componentes monosacárido en un sitio dado, o mediante modificación de los residuos en el ligando de ErbB a medida que dichos sitios de glucosilación se añaden o se delecionan.

La glucosilación de polipéptidos típicamente es N-ligada u O-ligada. El término "N-ligado" se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glucosilación. La glucosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

Se añaden sitios de glucosilación a ligando de ErbB mediante alteración de su secuencia de aminoácidos para que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente indicadas (para los sitios de glucosilación N-ligadas). La alteración también puede realizarse mediante la adición o la sustitución por uno o más residuos serina o treonina en el ligando de ErbB (para los sitios de glucosilación O-ligados). Para mayor facilidad, el ligando de ErbB preferentemente se altera mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN codificante del ligando de ErbB en bases preseleccionadas, de manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

El acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al ligando de ErbB incrementa el número de sustituyentes carbohidrato. Estos procedimientos resultan ventajosos en el aspecto de que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que sea capaz de glucosilación N-ligada u O-ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares pueden unirse a: (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como aquellos de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como aquellos de la serina, la treonina o la hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como aquellos de la fenilalanina, la tirosina o el triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente WO nº 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259 a 306, 1981).

Los grupos carbohidrato presentes en un ligando de ErbB también se eliminan químicamente o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el corte de la mayoría o de la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar ligante (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), aunque dejando el polipéptido intacto. La desglucosilación química se describe en Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987) y en Edge et al. (Anal. Biochem. 118:131, 1981). Los grupos carbohidrato se eliminan del ligando de ErbB mediante una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas mencionadas por Thotakura et al. (Meth. Enzymol. 138:350, 1987).

La glucosilación también resulta suprimida por la tunicamicina, tal como describen Duksin et al. (J. Biol. Chem. 257:3105, 1982). La tunicamicina bloquea la formación de los enlaces N-glucósido proteicos.

El ligando de ErbB también puede modificarse uniendo el ligando de ErbB a diversos polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337. Un modo preferente de incrementar la vida media circulante in vivo del ligando de ErbB no unido a membrana es conjugándolo a un polímero que proporcione una vida media prolongada, tal como polietilenglicol (PEG) (Maxfield et al., Polymer 16:505-509, 1975; Bailey, F.E. et al., en: Non-ionic Surfactants (Schick, M.J., editor), páginas 794-821, 1967; Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys. 7:175-186, 1984; Katre, N.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1487-1491, 1987; Goodson, R. et al., BioTechnology 8:343-346, 1990). La conjugación a PEG también se ha informado que reduce la inmunogenicidad y la toxicidad (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252:3578-3581, 1977).

El ligando de ErbB también puede encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante polimerización interfacial (por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas poli-(metilmetacri-
lato), respectivamente), en sistemas coloidales de administración de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., editor, 1980.

B. Preparación de anticuerpo anti-receptor ErbB

Entre los anticuerpos contemplados para la utilización en la presente invención se incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. Preferentemente, los anticuerpos utilizados en los procedimientos de la invención comprenden anticuerpos agonistas de receptor ErbB que inducen o estimulan la proliferación de células precursoras beta o células beta maduras, o que inducen o estimulan la diferenciación de las células precursoras beta.

Los anticuerpos policlonales preferentemente se cultivan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante (es decir, un receptor ErbB) y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies que deben inmunizarse, por ejemplo la hemocianina de lapa americana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación mediante residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante residuos lisina), glutaraldehído y anhídrido succínico.

Los animales pueden inmunizarse contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación, pro ejemplo 100 g o 5 g de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales reciben un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutáneas en múltiples sitios. Siete a 14 días después, los animales se sangran y el suero se somete a ensayo para el título de anticuerpos. Los animales reciben refuerzos hasta que el título alcanza un valor de saturación. Preferentemente, el animal recibe refuerzos con el conjugado del mismo antígeno, aunque conjugado con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante en forma de fusiones de proteínas. Además, convenientemente se utilizan agentes agregantes, tales como alúmina, con el fin de incrementar la respuesta inmunológica.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (patente US nº 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco, tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, para inducir que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse los linfocitos in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59 a 103, Academic Press, 1986).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil-transferasa (HG-PRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, que soportan la producción estable de alto nivel de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferentes son las líneas de mieloma murino, tales como aquéllas derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, y las células SP-2 o X63-AgB-653, disponible de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma crecen se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras la identificación de las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y se cultivan mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59 a 103, Academic Press, 1986). Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de tumores ascites en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, líquido ascites, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales se aísla con facilidad y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Tras el aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células ováricas de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteína inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.

Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos pueden identificarse mediante cribado de los sobrenadantes de cultivo para anticuerpo que se une a uno o más receptores ErbB. Esto se consigue rutinariamente mediante inmunoensayos convencionales utilizando preparaciones de receptor soluble o mediante FACS utilizando receptor unido a célula y anticuerpo candidato marcado. Los anticuerpos agonistas de receptor ErbB preferentemente son anticuerpos que activan la fosforilación del receptor ErbB, que puede determinarse utilizando ensayos conocidos de la técnica de fosforilación de tirosinas. Determinados anticuerpos agonistas de uno o más receptores ErbB han sido descritos anteriormente, por ejemplo por Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2569-2573, 1990, y Defize et al., EMBO J. 5:1187-1192, 1986.

Las líneas celulares híbridas pueden mantenerse en cultivo in vitro en medio de cultivo celular. Las líneas celulares de la presente invención pueden seleccionarse y/o mantenerse en una composición que comprende la línea celular continua en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). De hecho, tras establecer la línea celular de hibridoma, puede mantenerse en una diversidad de medios nutricionalmente adecuados. Además, las líneas celulares híbridas pueden almacenarse y conservarse en cualquiera de varias maneras convencionales, incluyendo la congelación y el almacenamiento en nitrógeno líquido. Las líneas celulares congeladas pueden revivirse y cultivarse indefinidamente reanudando la síntesis y secreción de anticuerpo monoclonal. El anticuerpo secretado se recupera del sobrenadante del cultivo de tejidos mediante procedimientos convencionales, tales como la precipitación, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad o similar. Los anticuerpos indicados en la presente invención también se recuperan de cultivos celulares de hibridoma mediante procedimientos convencionales para la purificación de IgG o IgM, según sea el caso utilizado hasta el momento para purificar estas inmunoglobulinas a partir de plasma agrupado, por ejemplo procedimientos de precipitación con etanol o con polietilenglicol.

Pueden utilizarse anticuerpos humanos. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante la utilización de hibridomas humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985). Los anticuerpos quiméricos (Cabilly et al., patente US nº 4.816.567, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604, 1984; Takeda et al., Nature 314:452, 1985) que contienen una región variable murina y una región constante humana de actividad biológica apropiada (tal como la capacidad de activar el complemento humano y de mediar en la ADCC) se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención, al igual que los anticuerpos humanizados producidos mediante procedimientos convencionales de injertación de CDR (Riechmann et al., Nature 332:333-327, 1988; patente EP nº 0328404 A1; patente EP nº 02394000 A2).

Las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de regiones ligantes de antígeno de moléculas de anticuerpo (fragmentos Fab o de regiones variables) que evitan la generación de anticuerpos monoclonales también se encuentran comprendidas dentro de la práctica de la presente invención. Una técnica extrae moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpo a partir de células del sistema inmunológico obtenidas de un sujeto inmunizado, las transcribe en ADN complementario (ADNc) y clona el ADNc en un sistema de expresión bacteriano y selecciona las características de unión deseadas. El procedimiento de Scripps/Stratagene utiliza un sistema de vector de bacteriófago lambda que contiene una secuencia líder que causa que la proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana celular bacteriana y la pared celular) o que resulte secretada.

Pueden generarse y cribarse rápidamente un gran número de fragmentos Fab funcionales con el fin de identificar aquellos que se unen a los receptores con las características deseadas. Alternativamente, los anticuerpos pueden prepararse mediante las técnicas de expresión fágica descritas en Hoogenboom, Tibtech febrero 1997 (vol. 15); Neri et al., Cell Biophysics 27:47-61, 1995; Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-55, 1994, y Sonderlind et al., Immunol. Rev. 130:109-124, 1992, y las referencias indicadas en las mismas, así como la técnica de expresión fágica monovalente descrita en Lowman et al., Biochem. 30:10832-10838, 1991.

C. Composiciones y procedimientos terapéuticos

Los ligandos de receptor ErbB o anticuerpos agonistas de receptor ErbB pueden utilizarse para inducir o estimular la proliferación de células beta maduras o de células beta precursoras. Los ligandos de receptor ErbB o anticuerpos agonistas de receptor ErbB también pueden utilizarse para inducir o estimular la diferenciación de las células beta precursoras. En particular, se hace referencia a la utilización de ligandos de ErbB en los procedimientos, posteriormente.

Entre los usos de la invención se incluyen usos para el tratamiento de la disfunción pancreática en mamíferos. Un procedimiento preferente es un procedimiento para tratar la diabetes, e incluso más preferentemente, la diabetes de tipo I. Se contempla que pueda administrarse un ligando de receptor ErbB en forma de agente terapéutico único en el tratamiento del mamífero que necesita dicho tratamiento. Alternativamente, puede administrarse un ligando de ErbB en combinación con uno o más ligandos de ErbB diferentes del primero. Por ejemplo, puede administrarse en el mamífero una combinación de heregulina y betacelulina. SE contempla además que los ligandos de receptor de ErbB se administren en combinación con otras terapias o agentes útiles para tratar la disfunción pancreática, o los síntomas asociados con dicha disfunción pancreática, tales como insulina, sulfonilurea, ciclosporina u otros agentes inmunosupresores conocidos, tiozolidenodionas y metformina.

Pueden prepararse composiciones, tales como formulaciones farmacéuticamente aceptables, para el almacenamiento mediante la mezcla del ligando de receptor ErbB que presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluir tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol (PEG).

El ligando de receptor ErbB que debe utilizarse para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, previamente o posteriormente a la liofilización y reconstitución. El ligando opcionalmente se almacena en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas que contienen el ligando o ligandos de receptor ErbB generalmente se introducen en un recipiente que presenta una abertura de acceso estéril, pro ejemplo una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración habitualmente será de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección o infusión mediante administración intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, aerosol de polvos o líquido, o mediante medios de liberación sostenida, tal como se indica posteriormente. El ligando de receptor ErbB seleccionado puede administrarse continuamente mediante infusión o mediante inyección de bolo. Se contempla que el ligando de receptor ErbB se administre en el mamífero mediante una cánula, tal como mediante la inserción de un dispositivo de cánula en el páncreas o en tejido pancreático. El dispositivo de cánula también puede utilizarse para administrar el ligando de receptor de ErbB en el mamífero a través de la arteria celíaca. La utilización de un dispositivo de cánula para la administración de agente terapéutico es conocida de la técnica y puede conseguirse utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia.

Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el ligando de receptor ErbB, matrices que se encuentra en la forma de productos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietilmetacrilato), tal como describen Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981, y Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982, o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patentes US nº 3.773.919 y EP nº 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., supra), copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glucólico, tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glucólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente EP nº 133.988). Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glucólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. En el caso de que las proteínas encapsuladas permanezcan en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la utilización de aditivos apropiados y el desarrollo de composiciones de matriz de polímero específicas.

Entre las composiciones de liberación sostenida también se incluye ligando de receptor ErbB atrapado en liposomas. Pueden prepararse liposomas que contienen el ligando seleccionado mediante procedimientos conocidos per se: patente DE nº 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; patentes EP nº 52.322, EP nº 36.676, EP nº 88.046, EP nº 143.949, EP nº 142.641, solicitud de patente japonesa nº 83-118008; patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545 y EP nº 102.324. Habitualmente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200 a 800 angstroms) en el que el contenido de lípidos es superior a aproximadamente 30 moles % colesterol, ajustando la proporción seleccionada para optimizar la terapia. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se dan a conocer en la patente US nº 5.013.556.

La cantidad eficaz de ligando de ErbB que debe utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del paciente, por ejemplo de la severidad de la disfunción pancreática. Puede resultar necesario para el terapeuta titular la dosis y modificar la vía de administración según resulte necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg, y hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores indicados anteriormente. Típicamente, el médico clínico administrará el polipéptido o polipéptidos seleccionados hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto deseado. La determinación de la dosificación y programación se encuentra dentro de los conocimientos rutinarios de la técnica. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas experimentales in vitro o de modelos animales. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales, por ejemplo mediante ensayo de los niveles de péptido c, ensayo de tolerancia a la glucosa o análisis sanguíneo de los niveles de glucosa.

La invención también proporciona procedimientos de tratamiento ex vivo de las células de mamífero utilizando ligando de ErbB. Este tratamiento ex vivo puede resultar útil para tratar, por ejemplo, las células precursoras beta en cultivo y posteriormente trasplantar las células tratadas en un mamífero que necesita dicho tratamiento utilizando técnicas de trasplante apropiadas. Opcionalmente, el trasplante es un trasplante autólogo en el que se extirpan las propias células del mamífero, se tratan en cultivo con ligando de ErbB y después se trasplantan de vuelta en el mismo mamífero.

En los procedimientos, pueden obtenerse de un mamífero células o uno o más tejidos que contienen células beta maduras o células precursoras beta (tal como mediante la realización de un procedimiento quirúrgico o de biopsia) y preferentemente se obtienen asépticamente. El número de células o la cantidad de tejido necesaria para el cultivo in vitro pueden determinarse empíricamente. A continuación, las células o tejidos se sitúan en un plato o placa adecuado de cultivo celular o de tejidos y se exponen a uno o más ligandos de ErbB. Típicamente el ligando de ErbB se añade al cultivo celular a una concentración aproximada de entre 0,1 y aproximadamente 100 nM, preferentemente de entre aproximadamente 1 y 50 nM. Si se desea, las células pueden cultivarse durante varias generaciones con el fin de expandir suficientemente la población de células beta. Diversos medios de cultivo celular conocidos de la técnica resultarán adecuados para el cultivo in vitro, incluyendo F10 de Ham, MEM, RPMI 1640 y DMEM. Estos medios se encuentran disponibles de Sigma (St. Louis, MO) y de GIBCO (Gran Island, NY). Típicamente, el medio de cultivo contiene componentes tales como carbohidratos (por ejemplo glucosa), aminoácidos esenciales, vitaminas, ácidos grasos, elementos traza y, opcionalmente, suero de una fuente mamífero. Las condiciones de cultivo celular deben resultar adecuadas para provocar la proliferación y/o diferenciación de las células beta.

Las células o tejido o tejidos tratados pueden formularse, si se desea, en un portador, tal como aquellos indicados anteriormente. Las células o tejido o tejidos tratados seguidamente pueden infusionarse o trasplantarse en un mamífero receptor utilizando técnicas conocidas de la técnica. El mamífero receptor puede ser el mismo individuo que el mamífero donador, o puede ser otro mamífero heterólogo. La "cantidad eficaz" de las células o tejido o tejidos tratados que deben trasplantarse en el mamífero dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del paciente. Se encuentra comprendido dentro de los conocimientos ordinarios del practicante determinar la dosis de administración y modificar los medios de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Pueden administrarse dosis únicas o múltiples de las células o tejido o tejidos tratados en el mamífero receptor. Puede resultar deseable determinar intervalos de dosis aproximados in vitro o en modelos animales, a partir de los cuales pueden extrapolarse intervalos de dosis para pacientes humanos. En los procedimientos en los que deben trasplantarse células o tejido o tejidos heterólogos en el mamífero receptor, agentes inmunosupresores conocidos de la técnica, tales como ciclosporina, también se administran típicamente en el mamífero receptor.

Posteriormente al trasplante de las células tratadas en el mamífero, se contempla que la administración adicional o continuada de uno o más ligandos de ErbB en el mamífero in vivo resulte útil para incrementar adicionalmente, por ejemplo, la secreción de insulina por parte de las células beta. Dicha administración adicional o continuada de ligando de ErbB puede conseguirse utilizando las composiciones y procedimientos descritos anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se sometieron a ensayo cultivos primarios de células pancreáticas fetales murinas con diversos ligandos de ErbB y se examinó la expresión de diversos marcadores o de insulina.

Se diseccionaron páncreas de 14 embriones de ratones CD1 (Charles River Laboratories). A continuación, los páncreas se digirieron con 1,37 mg/ml de colagenasa/dispasa (Boehringer Mannheim) en F12/DMEM (Gibco) a 37ºC durante 40 a 60 minutos. Tras la incubación, la digestión se neutralizó con un volumen igual de BSA al 5% y después las células se lavaron una vez con RPMI1640 (Gibco).

El día 1, las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos que habían sido prerecubiertas con 20 microgramos/ml de laminina (Boehringer Mannheim) en PBS. Las células de páncreas de 1-2 embriones se distribuyeron en cada pocillo en medio de cultivo primario (RPMI1640 que contenía 10 microgramos/ml de insulina-rh (Genentech, Inc.), 50 microgramos/ml de aprotinina, 60 microgramos/ml de extracto de pituitaria bovina (BPE) (Pel-Freeze), 100 ng/ml de gentamicina, a 1:1.000 en 10 ml de PBS, 10 microgramos/ml de transferrina (Sigma), 10 ng/ml de EGF (BRL), 10 microlitros de triyodotironina 5 x 10^{-9} M (Sigma), 100 microlitros de etanolamina 10 nM (Sigma) y, a 1:1.000 y en 10 ml de EtOH 200 grados prueba, 2 microlitros de hidrocortisona 1 nM (Sigma), 100 microlitros de progesterona 10 nM (Sigma) y 500 microlitros de forscolina 1 micromolar (Calbiochem). A continuación, los cultivos celulares se incubaron a 37ºC.

El día 2, se separó el medio de cultivo primario y las células unidas se lavaron con RPMI1640. A continuación, se añadieron dos ml de medio mínimo (RPMI1640 que contenía 10 microgramos/ml de transferrina, 1 microgramo/ml de insulina, 100 ng/ml de gentamicina, 50 microgramos/ml de aprotinina, 1 microgramo/ml de BPE), junto con los ligandos de receptor ErbB siguientes (formas humanas recombinantes): EGF, HG-EGF, TGF-alfa, anfiregulina, beta-celulina y heregulina. El polipéptido heregulina (Genentech, Inc.) consistía del dominio EGF únicamente (HRG-beta 1 177-244). Los otros ligandos consistían del polipéptido humano de longitud completa y se adquirieron de R & D Systems. Los ligandos respectivos se añadieron a los cultivos a cuatro concentraciones diferentes: 200 ng/ml, 100 ng/ml, 20 ng/ml y 4 ng/ml.

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El día 4, se extrajeron los medios de los pocillos, se preparó ARNm de las células y se sometieron a ensayo para el nivel de expresión de los marcadores identificados en la figura 1. Los marcadores se describen adicionalmente en Edlung, Diabetes 45:1817-1823, 1998, y en Bouwens, J. Pathology 184:234-239, 1998, y las referencias citadas en los mismos. Las lecturas de ARNm se utilizaron para indicar los cambios en el número de células que expresaban los diversos marcadores respecto al precursor o al fenotipo maduro. La expresión de marcadores se analizó mediante PCR-RT cuantitativa en tiempo real [Gibson et al., Genome Research 6:986-994, 1996]. Se determinó que un ligando de ErbB era positivo si resultaba en un incremento de la expresión del marcador relevante.

Se muestran los resultados en la figura 1. Tal como se muestra, se determinó la expresión de los marcadores siguientes: RPL19, NeuroD, Pax4, PDX-1, insulina, glut2, GLK, Pax6, glucagón, ISL1, amilasa, somatostatina, citoqueratina 19. Los resultados observados para cada uno de los ligandos respectivos también se ilustran gráficamente en los diagramas de columnas en las figuras 2 (HB-EGF), 3 (heregulina), 4 (anfiregulina), 5 (EGF), 6 (TGF-alfa) y 7 (betacelulina).

La totalidad de los ligandos de ErbB sometidos a ensayo alteró la expresión de uno o más de los marcadores. La totalidad de los ligandos excepto la heregulina produjo más de una duplicación de la expresión de PDX-1 a lo largo de una exposición de 48 horas al ligando. La totalidad de los ligandos excepto la betacelulina produjo un incremento de más de dos veces en la expresión de Pax4, y en la presencia de la todos excepto la heregulina, se produjo un incremento de más de dos veces en la expresión de insulina. Ninguno de los ligandos sometidos a ensayo incrementó la expresión de amilasa, y la anfiregulina, el EGF y el TGF-alfa de hecho redujeron el nivel de expresión del marcador amilasa.

Ejemplo 2

Se crearon ratones heterocigóticos (+/-) para heregulina, ErbB2 o ErbB3 mediante técnicas de manipulación dirigida de genes, resultando en la pérdida de una copia génica funcional y una reducción asociada de la proteína diana. A continuación, se examinó la actividad in vivo de la heregulina en las líneas de ratón heterocigótico y en ratones de tipo salvaje (gestantes y no gestantes).

Los ratones quiméricos se generaron mediante direccionamiento génico, descrito en Erickson et al., Development 124:4999-5011, 1997. Los ratones se aparearon con cepas de ratón C57BL/6J y Balb/C sin observar diferencias en la respuesta de heregulina sobre el nivel de fondo de la cepa o del retrocruzamiento. Se trataron ratones de 8 a 12 semanas de edad de cada genotipo, con un peso medio de 20 g cada uno, con una administración sistémica sostenida durante 14 días de heregulina-beta 1 humana recombinante (aminoácidos 177 a 244) utilizando bombas ALZA [Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992]. Los grupos genotípicos que recibían la heregulina consistían de 6 hembras y 6 machos cada uno. Los grupos de control de cada genotipo (2 hembras y 3 machos) recibieron PBS (Gibco). Se llenaron bombas miniosmóticas ALZA (modelo 2002; tasa de bombeo: 0,5 microlitros/hora; duración: 14 días; volumen del reservorio: 200 microlitros) siguiendo las instrucciones del fabricante, diluyendo la heregulina en PBS y las dosis se administraron a los animales a una dosis de 0,75 mg/kg/día o 1,0 mg/kg/día. Las bombas se almacenaron a 4ºC durante la noche en PBS previamente a la implantación estéril. Los animales se anestesiaron con quetamina, 75 a 80 mg/kg, xilazina, 7,5 a 15 mg/kg y acepromazina, 0,75 mg/kg, administrados intraperitonealmente. La bomba llena, con el portal de administración en primer lugar, se insertó en un bolsillo subcutáneo a lo largo de la espalda. Los animales se alojaron individualmente y se observaron diariamente. Cualquier animal moribundo se sacrificó inmediatamente y se le realizó una necropsia.

Los animales supervivientes se sacrificaron y se les realizó una necropsia el día 14. Se fijó el tejido de los órganos en formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente durante la noche seguido de almacenamiento en etanol al 70%. Para la inclusión en parafina, los tejidos se deshidrataron a través de una serie gradada de alcoholes, seguido de salicilato de metilo e infiltración durante la noche en Paraplast a 57ºC. Se cortaron secciones seriadas de 6 micrómetros y se fijaron a portaobjetos recubiertos con polilisina previamente a la tinción de hematoxilina/eosina y el análisis histológico.

La tolerancia al tratamiento de heregulina variaba dependiendo del genotipo. La mortalidad difería entre los genotipos (p<0.001), presentando los grupos animales heregulina (+/-) la mortalidad más elevada (12/12=100%), los grupos animales ErbB2 y ErbB3 (+/-) la mortalidad más baja (1/12=8%) y presentando el grupo de tipo salvaje una mortalidad intermedia (7/12=58%). No se observó diferencia aparente de mortalidad según sexo. Tanto los animales de tipo salvaje como heregulina (+/-) que recibieron tratamiento de heregulina mostraron lagrimeo, deshidratación, encorvamiento, pelaje alborotado, una temperatura corporal reducida y eran notablemente hipoactivos. Los animales de tipo salvaje y los heregulina (+/-) aparentemente también presentaban regiones abdominales agrandadas. Los animales de control que recibían PBS sobrevivieron el periodo completo de 14 días sin signos clínicos.

El páncreas presentaba una apariencia bastante normal en los ratones tratados no supervivientes de tipo salvaje y heregulina (+/-) en la necropsia, con ectasia ductal limitada e hiperplasia mínima, reflejando probablemente el corto tiempo de exposición de los animales a la heregulina administrada (5 a 6 días) (ver las figuras 8(b) y 8(c)). En contraste, en los animales ErbB2 y ErbB3 (+/-) que recibieron tratamiento durante el periodo completo de 14 días, se produjo una hiperplasia ductal y proliferación pronunciadas en los conductos pancreáticos principales en la necropsia, con presencia de células inflamatorias en el lumen de los conductos (ver las figuras 8(d) y 8(e)). El daño a las células acinares no era generalizado, aunque los niveles de amilasa se encontraban incrementados en muchos animales.

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Referencias citadas en la descripción

La presente lista de referencias citada por el solicitud se proporciona únicamente para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se tenido gran cuidado durante la compilación de las referencias, no pueden excluirse que se hayan producido errores u omisiones y la EPO se exime de toda responsabilidad a este respecto.

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Claims

1. Utilización de heregulina en la preparación de un medicamento para tratar la disfunción pancreática en un mamífero, mediante la inducción o estimulación de la diferenciación o proliferación de las células precursoras beta o la proliferación de las células beta maduras.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el medicamento es para tratar la diabetes en un mamífero.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha heregulina está destinada a la administración en combinación con betacelulina.

4. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicha diabetes es la diabetes de tipo I.

5. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicho medicamento se formula para la administración en dicho mamífero utilizando una cánula.

6. Procedimiento de preparación de un medicamento para tratar la disfunción pancreática, que comprende las etapas de exponer, in vitro, células beta maduras o células precursoras beta de un mamífero donador a una cantidad eficaz de heregulina con el fin de inducir o estimular la diferenciación o la proliferación de dichas células precursoras beta o la proliferación de dichas células beta maduras y posteriormente formular dichas células beta maduras o células precursoras beta para la administración en un mamífero receptor in vivo.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho mamífero donador y dicho mamífero receptor son el mismo mamífero.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho mamífero donador y dicho mamífero receptor son mamíferos diferentes.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dichas células beta maduras o dichas células precursoras beta se formulan para la administración en combinación con un agente inmunosupresor.

10. Procedimiento para estimular o inducir la proliferación de células precursoras beta o células beta maduras, in vitro, que comprende exponer dichas células precursoras beta o dichas células beta maduras a una cantidad eficaz de heregulina.

11. Procedimiento para estimular o inducir la diferenciación de células precursoras beta en células beta maduras, in vitro, que comprende exponer dichas células precursoras beta a una cantidad eficaz de heregulina.

12. Composición que comprende una cantidad eficaz de heregulina y de betacelulina, y un portador farmacéuticamente aceptable.