ES2307333T3 - Receptor del activador del plasminogeno tipo urocinasa como diana para el diagnostico de micrometastasis. - Google Patents
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Abstract
Uso de una molécula marcada para preparar una composición para el diagnóstico y la obtención de imágenes in vivo de una o más lesiones metastásicas en un sujeto humano; en el que dichas lesiones metastásicas son micrometástasis; y en el que dicha molécula se selecciona del siguiente grupo de moléculas polipeptídicas que se unen específicamente al receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa: i) un anticuerpo a un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa; ii) una parte de dicho anticuerpo que contiene el dominio de unión del mismo; y iii) un péptido, derivado de péptido o análogo de péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
Description
Receptor del activador del plasminógeno tipo
urocinasa como diana para el diagnóstico de micrometástasis.
La presente invención se refiere al uso de
moléculas que pueden unirse específicamente a un receptor del
activador del plasminógeno tipo urocinasa (uPAR) como reactivos de
diagnóstico para la detección de micrometástasis.
La metástasis y la invasión de células
cancerígenas es un proceso de múltiples etapas que implica varios
procesos independientes (Liotta, 1986, Cancer Res.
46:1-7; Liotta et al., 1991, Cell
64:327-336; Mundy, 1997, Cancer
80(9):1546-1556). La metástasis, el
crecimiento de tumores secundarios en sitios distantes de un tumor
primario, es la causa principal de fallos del tratamiento contra el
cáncer.
Los mecanismos reguladores implicados en las
metástasis difieren de los que producen la formación tumoral. De
hecho, las células metastásicas parecen ser fisiológicamente
diferentes que las células tumorales. Por ejemplo, las células
metastásicas difieren en la expresión de genes tales como el oncogén
ras, serina-treonina cinasas, tirosina cinasas y
p53 así como difieren en la transducción de señales (para revisión
véase Liotta et al., 1991, Cell
64:327-336).
Antes de la metástasis, la expansión de un tumor
implica angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos
(Folkman et al., 1989, Nature 339:58-61). Se
ha demostrado que los tumores inducen la angiogénesis a través de
diversos factores solubles (Folkman et al., 1987, Science
235:442-447; Pepper et al., 1990, J. Cell
Biol. 111:743-755). La angiogénesis es un proceso de
múltiples etapas que proviene de las células endoteliales
microvasculares. Las células endoteliales que se encuentran en los
vasos originales se estimulan para degradar la membrana basal
endotelial, migran hacia el estroma perivascular e inician un brote
capilar (Liotta et al., 1991, Cell
64:327-336). El brote capilar se expande
posteriormente y adopta una estructura tubular. La proliferación
endotelial conduce a la extensión de los túbulos microvasculares,
que se convierten en bucles y luego en una red circulatoria en
funcionamiento. La salida de las células endoteliales del vaso
original implica la migración celular y la degradación de la matriz
extracelular (ECM) de una manera similar a la invasión de células
cancerígenas de la ECM (Liotta et al., 1991, Cell
64:327-336).
La invasión de células cancerígenas implica
interacciones de las células cancerígenas con la ECM, una estructura
reticular densa de colágeno y elastina incrustada en una sustancia
base de tipo gel compuesta por proteoglicanos y glicoproteínas. La
ECM consiste en la membrana basal y su estroma intersticial
subyacente. La invasión tumoral implica: (1) desprendimiento de las
células cancerígenas de su ubicación original; (2) unión a la ECM;
(3) degradación de la ECM; y (4) locomoción en la ECM (para
revisión véase Liotta, 1986, Cancer Res. 46:1-7).
Tras el desprendimiento de las células cancerígenas, las células
migran sobre la ECM y se adhieren a componentes de la ECM tales
como laminina, colágeno de tipo IV y fibronectina por medio de
receptores de la superficie celular. Se ha demostrado que las
moléculas de adhesión celular, tales como integrina, median en la
unión de células cancerígenas a las células endoteliales vasculares
y a las proteínas de la matriz (Mundy, 1997, Cancer
80(9):1546-1556). Entonces, la célula
cancerígena unida secreta enzimas hidrolíticas o induce que las
células huésped secreten enzimas que degradan localmente la matriz.
La lisis de la matriz se produce en una región sumamente localizada
próxima a la superficie de la célula cancerígena, en la que la
cantidad de enzima activa supera los inhibidores de proteinasa
naturales presentes en el suero, en la matriz, o los secretados por
células normales en los alrededores (Liotta et al., 1991,
Cell 64: 327-336). Se ha observado una asociación
positiva con la agresividad tumoral para diversas clases de enzimas
degradantes, incluyendo: heparinasas,
tiol-proteinasas (incluyendo catepsinas B y L),
metaloproteinasas (incluyendo colagenasas, gelatinasas y
estromelisinas) y serina proteinasas (incluyendo activador del
plasminógeno tipo urocinasa y plasmina).
Durante la etapa de locomoción de la invasión,
las células cancerígenas migran a través de la membrana basal y el
estroma a través de la zona de la proteolisis de la matriz.
Entonces, las células cancerígenas entran en los capilares
tumorales (que surgen como una consecuencia de factores angiogénicos
específicos) y alcanzan la circulación general por medio de estos
capilares. Tras desplazarse hasta sitios distantes del organismo,
las células cancerígenas intravasadas se adhieren a y se extravasan
a través del endotelio vascular e inician una nueva formación
tumoral, es decir, formando en primer lugar una masa de células que,
por medio del proceso de angiogénesis, se convierte en un tumor
vascularizado.
Por tanto, la metástasis no un proceso simple,
al azar, sino más bien es un proceso de múltiples etapas que
depende de las propiedades específicas de las células tumorales y
factores de apoyo en el entorno del sitio metastásico.
En el proceso metastásico están implicadas un
gran número de diferentes moléculas. Dos ejemplos de tales moléculas
son uPA y su receptor, uPAR, que han estado implicadas en el
aspecto de invasión de células tumorales del proceso metastásico.
Durante la invasión del cáncer, el uPAR se une al uPA liberado de
las células del estroma o cancerígenas circundantes. La unión del
uPA a su receptor centra la acción proteolítica en la superficie de
las células cancerígenas. El uPA convierte al plasminógeno
enzimáticamente inactivo en la serina proteasa, plasmina. La
plasmina degrada muchas proteínas de la ECM tales como fibronectina,
vitronectina y fibrina facilitando de ese modo la degradación de la
ECM, la invasión, la proliferación de células cancerígenas y la
metástasis (Schmitt et al., 1997, Thrombosis and Haemostasis
78(1):285-296). La plasmina también puede
catalizar la activación de las formas zimógenas de varias
metaloproteinasas.
Estudios han demostrado que los anticuerpos
anti-uPA disminuyen la invasión de células tumorales
y/o la metástasis de las células de líneas de células tumorales
cultivadas trasplantadas en modelos animales (para revisión véase
Andreasen et al., 1997, Int. J. Cancer
72:1-22).
Se han llevado a cabo varios estudios para
examinar el efecto terapéutico de las sustancias que interaccionan
con los componentes de la ruta de activación del plasminógeno. La
manipulación de la ruta de activación del plasminógeno ha dado como
resultado menores tasas de crecimiento tumoral (Jankun et
al., patente estadounidense número 5.679.350 (inyección de un
medicamento acoplado a PAI-1 o
PAI-2); Dan\phi et al., patente
estadounidense número 5.519.120 (inyección de anticuerpos
anti-uPA o anti-uPAR); y Xing y
Rabbani, 1996, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 37:90 (Resumen nº
626) (inyección de anticuerpos anti-uPAR)). Estos
estudios indican que el uPAR desempeña un papel en las fases
iniciales de la metástasis, es decir, la invasión de células
tumorales.
Hallazgos clínicos han demostrado que niveles
elevados de uPA, y del activador del plasminógeno,
PAI-1, en el tejido de tumor primario están
asociados a un mal pronóstico de varios cánceres, incluyendo cáncer
de mama, de cuello de útero, de ovario, de estómago, de colon, de
pulmón, cerebral, de riñón, de vejiga y del tejido blando (para
revisión véase Schmitt et al., 1997, Thrombosis and
Haemostasis 78(1):285-296; Andreasen et
al., 1997, Int. J. Cancer 72:1-22). En menor
grado, niveles elevados de uPAR pueden indicar también un mal
pronóstico (Schmitt et al., Thrombosis and Haemostasis
78(1):285-296).
Mientras que la detección de marcadores de
enfermedad metastásica en el sitio de tumor primario puede ser útil
para el pronóstico, y el diseño de modalidades terapéuticas, no
existe actualmente ningún sistema fiable para la detección de
micrometástasis en un paciente (información que sería extremadamente
importante para clasificar las fases de enfermedad y diseñar un
enfoque clínico apropiado). Aunque los tumores metastásicos se
derivan de células del tumor primario, las características
fisiológicas y de crecimiento de los tumores metastásicos están
considerablemente alteradas, y no necesitan expresar los mismos
marcadores de superficie que las células de tumor parental. De
hecho, la incapacidad de diagnosticar y obtener imágenes de
metástasis, particularmente micrometástasis, in vivo,
continua siendo un obstáculo principal para el tratamiento
satisfactorio del cáncer.
La práctica quirúrgica actual recurre comúnmente
a la observación visual y a la palpación en combinación con
protocolos determinados por zonas que establecen la magnitud de la
resección de tejido. Por tanto, el tejido eliminado durante la
cirugía incluye no sólo el tejido que el cirujano sospecha que es
neoplásico, sino también incluye una cantidad de tejido sano tomado
debido a que las zonas y los márgenes tumorales precisos no pueden
determinarse fácilmente por el cirujano. Además, el tejido
metastásico aislado distal con respecto al tumor primario con
frecuencia no puede detectarse fácilmente mediante los métodos
usados comúnmente. Por consiguiente, existe una gran necesidad en
la técnica de métodos sensibles para detectar y localizar de manera
fiable micrometástasis in vivo.
La presente invención se refiere a medios para
el diagnóstico y la obtención de imágenes de micrometástasis usando
moléculas marcadas que se unen específicamente al receptor del
activador del plasminógeno de tipo urocinasa, particularmente para
detectar y obtener imágenes de metástasis in vivo. La
presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento no
esperado del solicitante, de que pueden usarse anticuerpos dirigidos
frente a uPAR para detectar no sólo tumores primarios in
vivo sino que pueden usarse para detectar u obtener imágenes de
micrometástasis y metástasis en sitios distales con respecto al
tumor primario. Los tumores metastásicos, aunque provienen de
células del tumor primario, tienen sus características fisiológicas
y de crecimiento considerablemente alteradas y no necesitan
expresar los mismos marcadores de superficie que los tumores
primarios parentales. Antes del descubrimiento del solicitante, el
uPA y el uPAR se habían asociado solamente a tumores primarios que
mostraban propiedades metastásicas. Además, se cree que el uPA y el
uPAR están implicados en las etapas tempranas del proceso
metastásico, es decir, en la movilización de células fuera de un
tumor primario. Por tanto, fue bastante sorprendente descubrir que
las células distales con respecto al tumor primario, que participan
en el establecimiento de nuevos tumores (es decir, por medio de
unión (no movilización) expansión celular, angiogénesis, etc.)
pueden detectarse usando uPA o uPAR como marcador.
La presente solicitud se refiere a la
reivindicación 1.
La invención es tal como se da a conocer en las
reivindicaciones, y el principio de la invención se ilustra
realizando ejemplos que demuestran la biodistribución del uPAR in
vivo, y muestran la acumulación preferente de los anticuerpos
frente a uPAR en lesiones metastásicas en modelos animales.
Figura 1. Secuencia de aminoácidos del dominio
de unión a receptor de los residuos 7-33 del uPA
humano (Appella et al., 1987, J. Biol. Chem.
262(10):4437-4440).
Figura 2. Secuencia de aminoácidos del dominio
de unión a receptor de los residuos 12-32 de uPA
humano (Appella et al., 1987, J. Biol. Chem.
262(10):4437-4440).
Figuras 3A, B. Caracterización de IgG frente a
ruPAR mediante inmunofluorescencia. (A) Se hicieron crecer células
Mat B-III hasta una confluencia del 70% sobre
portaobjetos de vidrio y se incubaron con 10 \mug/ml de IgG de
conejo preinmunitaria o (B) con 10 \mug/ml de IgG frente a ruPAR.
Tras la incubación con un anticuerpo secundario de IgG
anti-conejo conjugado con FITC (X 20) se analizaron
las células para determinar la inmunofluorescencia.
Figura 4. Inhibición dependiente de la dosis de
la invasión de células Mat Ly Lu y Mat B-III
mediante IgG anti ruPAR. Se hicieron crecer células Mat Ly Lu y Mat
B-III en cultivo y se añadieron al compartimento
superior de una cámara de Boyden con 50 ó 100 \mug/ml de IgG
frente a ruPAR. Tras 24 horas, se contó el número de células que
migraron hacia el aspecto inferior del filtro de la cámara de
Boyden. Se calculó el porcentaje de inhibición de invasión celular
tomando el número de células que invadieron tras el tratamiento con
50 ó 100 \mug/ml de IgG preinmunitaria como el 100%. Los
resultados son la media \pm DE de cuatro de tales experimentos.
La inhibición significativa en la invasión celular de las células
control se representa mediante asteriscos (*P<0,05).
Figuras 5A, B. Efecto de IgG frente a ruPAR y
uPAR sobre la unión de ^{125}I-IgG frente a ruPAR
en células Mat Ly Lu y Mat
B-III-uPAR. Se incubaron (A) Mat Ly
Lu y (B) Mat B-III-uPAR con
^{125}I-IgG frente a ruPAR, con o sin
concentraciones crecientes de proteína de ruPAR. Se muestra el % del
cambio en la unión de ^{125}I-IgG frente a ruPAR
tras la incubación con diferentes concentraciones de uPAR de rata
recombinante en comparación con las células control. Los resultados
son la media \pm DE de cuatro experimentos. La inhibición
significativa en la unión de las células control se representa
mediante asteriscos (*P<0,05).
Figura 6. Transcurso de tiempo de la captación
de ^{125}I-IgG frente a ruPAR por los tumores
primarios in vivo. Se monitorizó la captación de la
radioactividad en tumores Mat
B-III-uPAR en ratas Fischer hembra
a diversos puntos de tiempo tras la inyección intravenosa de IgG
frente a ruPAR preinmunitaria marcada con ^{125}I. Los datos
representan el % promedio de DI/g de 5 animales \pm DE de dos de
tales experimentos.
Figura 7. Captación de IgG frente a ruPAR
marcada con ^{125}I en sitios de tumor Mat B-III
primario y metastásico. En el día 10 posterior a la inoculación con
células Mat B-III-uPAR en ratas
Fischer, se les inyectó a los animales IgG preinmunitaria marcada
con ^{125}I o IgG frente a ruPAR. Tras 12 horas, se determinó la
biodistribución de ^{125}I-IgG frente a ruPAR en
diferentes tejidos normalmente no afectados (suprarrenales,
musculares, cardiaco); sitios de metástasis tumorales (hígado,
bazo, riñón, pulmones, ganglios linfáticos); y tumores primarios.
Los resultados representan el % de DI/g de 6 animales en cada grupo
\pm DE de tres de tales experimentos.
Figura 8. Captación de IgG frente a HuPAR
marcada con ^{125}I en tumores primarios y lesiones metastásicas
en ratones con tumor. Se establecieron xenoinjertos de tumor de
células de próstata humana en ratones Balb/c nu/nu. Cinco semanas
posteriores a la inoculación con células tumorales, se les inyectó a
los animales IgG frente a huPAR preinmunitaria marcada conI. Tras
12 horas, se determinó la biodistribución de
^{125}I-IgG frente a huPAR en diferentes tejidos
examinados incluyendo: tejido normal (corazón); sitios de metástasis
tumorales (hígado, bazo, riñón, pulmones, ganglios linfáticos); y
tumores primarios. Se calculó la biodistribución y se expresó como
el % de dosis inyectada/gramo de tejido (% de DI/g).
Figura 9. Efecto de la IgG
anti-uPAR sobre el volumen de tumor primario in
vivo. Se implantaron células de adenocarcinoma mamario de rata
Mat B-III-uPAR en la almohadilla
adiposa mamaria de ratas Fischer hembra. Desde el día 1 hasta el
día 7 posterior a la inoculación con células tumorales, los animales
recibieron IgG de conejo preinmunitaria (50-100
\mug/ml/día) o IgG anti-ruPAR (100 \mug/día).
Durante de 2 a 3 semanas posteriores a la inoculación con células
tumorales, se midió el tamaño de tumor primario en dos dimensiones
mediante calibres y se calculó el volumen tumoral.
La presente invención se refiere al uso de una
molécula marcada para preparar una composición para la obtención de
imágenes y el diagnóstico in vivo de una o más lesiones
metastásicas en un sujeto humano;
en el que dichas lesiones metastásicas son
micrometástasis; y
en el que dicha molécula se selecciona del
siguiente grupo de moléculas polipeptídicas que se unen
específicamente al receptor del activador del plasminógeno de tipo
urocinasa:
- i)
- un anticuerpo frente a un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa;
- ii)
- una parte de dicho anticuerpo que contiene el dominio de unión del mismo; y
- iii)
- un péptido, derivado de péptido o análogo de péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
La utilización de la expresión "un uPAR"
indica que incluso si la parte polipeptídica del uPAR en una especie
puede ser igual para todos los uPAR, existe una pluralidad de uPAR.
Por ejemplo, la parte de hidrocarburo del mecanismo de unión
superficial del uPAR puede ser diferente. Además, algunas células,
por ejemplo, las células cancerígenas, pueden tener diferentes
uPAR.
La invención se refiere al uso de ciertas
moléculas que tienen especificidad de unión por uPAR para la
detección, diagnóstico o monitorización in vivo, de
micrometástasis. Ha de inyectársele al sujeto la molécula que tiene
especificidad de unión por uPAR. Tras un tiempo suficiente para
permitir la distribución y la acumulación in vivo, pueden
obtenerse imágenes del sujeto. Puede usarse una variedad de métodos
para detectar material marcado acumulado in vivo, incluyendo
pero sin limitarse a técnicas de obtención de imágenes radiológicas,
por ejemplo, de rayos X, exploración por TAC y obtención de
imágenes por resonancia magnética (IRM), sonografía y tomografía por
emisión de positrones (TEP).
En el presente documento se describen medios
para la producción de moléculas que pueden reconocer específicamente
uno o más epítopos de uPAR o epítopos de variantes conservadas o
fragmentos de péptido de un uPAR, incluyendo, pero sin limitarse a,
anticuerpos, derivados (incluyendo, pero sin limitarse a fragmentos)
y análogos de los mismo, y péptidos y miméticos de péptido.
Tales moléculas de unión a uPAR pueden usarse,
por ejemplo, en la detección de uPAR en una muestra biológica y
pueden utilizarse, por tanto, como parte de una técnica de
diagnóstico mediante la que los sujetos pueden someterse a prueba
para determinar niveles anómalos de uPAR. Según una realización de
la invención, una molécula de unión a uPAR se une específicamente
al uPAR humano.
Tales moléculas de unión a uPAR pueden incluir,
pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales (Acm), anticuerpos humanizados o quiméricos,
anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos
F(ab')_{2}, fragmentos producidos mediante una biblioteca
de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id) y fragmentos de unión a epítopo de
cualquiera de los anteriores.
Pueden usarse diversos procedimientos conocidos
en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente
a una proteína de uPAR o fragmento de la misma. Para la producción
de anticuerpo policlonal, pueden inmunizarse diversos animales
huésped mediante inyección con la proteína de uPAR nativa, o una
versión sintética, o fragmento de la misma, incluyendo, pero sin
limitarse a conejos, ratones, ratas, pollos, etc. Pueden usarse
diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica,
dependiendo de la especie huésped, e incluyendo, pero sin limitarse
a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales
como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones
de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y
adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos hacia una secuencia de proteína de uPAR, puede usarse
cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de
anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por
ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por
Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), así
como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B
humanas (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4, 72), y la
técnica del VEB-hibridoma para producir anticuerpos
monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas
77-96).
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison, et
al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81,
6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature
312, 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature,
314, 452-454) mediante corte y empalme de los genes
a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad a
antígeno apropiada junto con genes a partir de una molécula de
anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo
quimérico es una molécula en la que diferentes partes se derivan de
diferentes especies animales, tales como aquéllas que tienen una
región variable derivada de un Acm murino y una región constante de
inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Cabilly et al.,
patente estadounidense número 4.816.567; y Boss et al.,
patente estadounidense número 4.816397).
Además, se han desarrollado técnicas para la
producción de anticuerpos humanizados. (Véase, por ejemplo, Queen,
patente estadounidense número 5.585.089 y Winter, patente
estadounidense número 5.225.539. Una región variable de cadena
pesada o ligera de inmunoglobulina consiste en una región de
"entramado" interrumpida por tres regiones hipervariables,
denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). La
magnitud de la región de entramado y las CDR se han definido de
manera precisa (véase, "Sequences of Proteins of Inmunological
Interest", Kabat, E. et al., Departamento de salud y
servicios humanos de los EE.UU. (U.S. Department of Health and
Human Services) (1983)). En resumen, los anticuerpos humanizados son
moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más
CDR de la especie no humana y una región de entramado de una
molécula de inmunoglobulina humana.
Alternativamente, las técnicas descritas para la
producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense
4.946.778; Bird, 1988, Science 242, 423-426;
Huston, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
5879-5883; y Ward, et al., 1989, Nature 334,
544-546) pueden adaptarse para producir anticuerpos
de cadena sencilla frente a uPAR. Los anticuerpos de cadena
sencilla se forman mediante la unión de fragmentos de cadena ligera
y pesada de la región por medio de un puente de aminoácido, dando
como resultado un polipéptido de cadena sencilla.
Los fragmentos de anticuerpo que reconocen
epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas.
Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: los
fragmentos F(ab')_{2}, que pueden producirse mediante
digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos
Fab, que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los
fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente, pueden construirse
bibliotecas de expresión de Fab (Huse, et al., 1989,
Science, 246, 1275-1281) para permitir una
identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la
especificidad deseada.
En una realización de la invención, las
moléculas de unión a uPAR incluyen péptidos, derivados y análogos
de los mismos y miméticos de péptido. En realizaciones particulares
de la invención, los péptidos o miméticos de péptido se seleccionan
para imitar las siguientes secuencias de uPA humano:
VPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNC (SEQ ID NO: 1) y DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN
(SEQ ID NO: 2).
En una realización específica, los métodos de la
invención usan derivados y análogos de uPA, en particular
fragmentos de uPA y derivados de tales fragmentos, que comprenden
uno o más dominios de una proteína de uPA.
En otra realización específica, los métodos de
la invención usan una proteína, fragmento, análogo o derivado de
uPA que se expresa como una producto de proteína quimérica o de
fusión (que comprende la proteína, el fragmento, el análogo o el
derivado unido por medio de un enlace peptídico a una secuencia de
proteína heteróloga (de una proteína diferente)). Una realización
específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un
fragmento de uPA de al menos seis aminoácidos.
Pueden producirse péptidos, derivados y análogos
de los mismos y miméticos de péptido que se unen específicamente a
uPAR mediante diversos métodos conocidos en la técnica, pero sin
limitarse a síntesis en fase sólida o mediante disolución
(Nakanishi et al., 1993, Gene 137:51-56;
Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154;
Neurath, H. et al., Eds., The Proteins, Vol. II, 3ª Ed.,
páginas 105-237, Academic Press, Nueva York, NY
(1976). Por ejemplo, un péptido correspondiente a una parte de una
proteína de uPA que comprende el dominio deseado o la unión a un
receptor, puede sintetizarse mediante el uso de un sintetizador de
péptidos. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no
clásicos o análogos de aminoácido químicos como una sustitución o
adición en una secuencia de uPA. Los aminoácidos no clásicos
incluyen pero no se limitan a los isómeros D de los aminoácidos
comunes, ácido \alpha-aminoisobutírico, ácido
4-aminobutírico, hidroxiprolina, sarcosina,
citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina,
t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina,
\beta-alanina, aminoácidos de diseño tales como
\beta-metil aminoácidos,
C\alpha-metil aminoácidos y
N\alpha-metil aminoácidos.
Los péptidos de uPA pueden aislarse y
purificarse mediante métodos convencionales incluyendo cromatografía
(por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y en
columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad
diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la
purificación de péptidos.
Las propiedades funcionales pueden evaluarse
usando cualquier ensayo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a,
sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas
tales como radioinmunoanálisis, ELISA (ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos
inmunorradiométricos, inmunoensayos in situ (usando
marcadores radioisotópicos, enzimáticos o de oro coloidal, por
ejemplo), inmunotransferencias de tipo Western, ensayos de
inmunofluorescencia y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. Por
ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio
específico de un uPAR, se pueden someter a ensayo los hibridomas
generados para detectar un producto que se una a un fragmento de
uPAR que contiene dicho dominio. En una realización, la unión a
anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo. En la
técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un
inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente
invención.
La producción y el uso de derivados y análogos
relacionados con uPA están dentro del alcance de la presente
invención. En una realización específica, el derivado o análogo es
funcionalmente activo, es decir, puede mostrar una o más
actividades funcionales asociadas a una proteína de uPA de tipo
natural, de longitud completa. Como un ejemplo, pueden usarse tales
derivados o análogos que tienen la antigenicidad deseada, por
ejemplo, en inmunoensayos de diagnóstico tal como se describió en
la sección 5.2. Los derivados o análogos de uPA pueden someterse a
prueba para determinar la actividad deseada mediante procedimientos
conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a los
ensayos descritos anteriormente. En una realización específica,
pueden examinarse bibliotecas de péptidos para seleccionar un
péptido con la actividad deseada; tal examen puede llevarse a cabo
sometiendo a ensayo, por ejemplo, para determinar la unión a
uPAR.
En particular, pueden prepararse derivados de
uPA alterando las secuencias de uPA mediante sustituciones,
adiciones o deleciones para proporcionar moléculas funcionalmente
equivalentes. Los derivados de uPA de la invención incluyen, pero
no se limitan a, aquéllos que contienen, como secuencia primaria de
aminoácidos, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de un
péptido de uPA que incluye secuencias alteradas en las que se
sustituyen residuos dentro de la secuencia por residuos de
aminoácido funcionalmente equivalentes dando como resultado un
cambio silencioso. Por ejemplo, puede sustituirse uno o más residuos
de aminoácido dentro de la secuencia por otro aminoácido de una
polaridad similar que actúe como un equivalente funcional, dando
como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un
aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros
miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo,
los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina,
isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.
Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos
cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e
histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen
ácido aspártico y ácido glutámico.
Se incluyen fragmentos de proteína de uPA u
otros derivados o análogos que se modifican de manera diferencial
durante o tras la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación,
acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante
grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica,
unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc.
Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse
a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a
escisión química específica mediante bromuro de cianógeno,
tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4};
acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica
en presencia de tunicamicina; etc.
En el presente documento se describen métodos
para marcar de manera detectable moléculas que pueden reconocer
específicamente uno o más epítopos de uPAR o epítopos de los
fragmentos de péptido o variantes conservadas de un uPAR. Los
métodos de marcado y detección empleados en el presente documento
pueden ser, por ejemplo, tales como los descritos en Harlow y Lane
(Harlow, E. y Lane, D., 1988, "Antibodies:
A-Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), que se incorpora
al presente documento como referencia en su totalidad.
Uno de los modos en los que el mimético de
péptido o anticuerpo específico de uPAR puede marcarse de manera
detectable es uniendo el mismo a una enzima, tales moléculas
marcadas pueden usarse en un inmunoensayo enzimático tal como ELISA
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). La enzima que se une al
anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente
un sustrato cromogénico, de manera tal que se produce un resto
químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios
espectrofotométricos, fluorimétricos o por medios visuales. Las
enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable los
anticuerpos, derivados y análogos de los mismos, y péptidos
incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa
estafilocócica, delta-5-esteroide
isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura,
alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa fosfato
isomerasa, peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa,
glucosa oxidasa, betagalactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede conseguirse
mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico
para la enzima. La detección también puede conseguirse mediante
comparación visual de la magnitud de la reacción enzimática de un
sustrato en comparación con patrones preparados de manera
similar.
Para su uso en los medios de detección de la
invención, las moléculas se marcan preferiblemente con un
radioisótopo, incluyendo, pero sin limitarse a: ^{125}I,
^{131}I o ^{99m}Tc. Tales péptidos y anticuerpos pueden
detectarse en ensayos in vitro usando un radioinmunoanálisis
(RIA) o una radiosonda. El isótopo radioactivo puede detectarse por
medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de
centelleo o mediante autorradiografía.
También es posible marcar los anticuerpos,
derivados y análogos de los mismos, y péptidos con un compuesto
fluorescente. Cuando el péptido marcado de manera fluorescente se
expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede
detectares entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos
de marcado fluorescente usados más comúnmente se encuentran
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina,
aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.
Los anticuerpos, derivados y análogos de los
mismos, y péptidos también pueden marcarse de manera detectable
usando metales de emisión de fluorescencia tales como ^{152}Eu, u
otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse a
los anticuerpos, derivados y análogos de los mismos, y péptidos
usando grupos quelantes metálicos tales como ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA).
Los anticuerpos, derivados y análogos de los
mismos, y péptidos también pueden marcarse de manera detectable
mediante acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La
presencia de los péptidos con etiqueta quimioluminiscente se
determina entonces detectando la presencia de la luminiscencia que
surge durante el transcurso de una reacción química. Ejemplos de
compuestos de marcado quimioluminiscente particularmente útiles son
luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal
de acridinio y éster de oxalato.
Igualmente, puede usarse un compuesto
bioluminiscente para marcar los anticuerpos, derivados y análogos de
los mismos, y péptidos de la presente invención. La
bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en
sistemas biológicos en la que una proteína catalítica aumenta la
eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una
proteína bioluminescente se determina detectando la presencia de
luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para los
fines de marcado son luciferina, luciferasa y ecuorina.
Las moléculas que se determina que se unen
específicamente a uPAR pueden administrarse a un paciente a dosis
eficaces de manera diagnóstica para detectar metástasis. Una dosis
eficaz de manera diagnóstica se refiere a la cantidad de la
molécula suficiente para dirigir un diagnóstico a una célula que
contiene uPAR sobre su superficie de modo que la célula pueda
detectarse usando métodos comúnmente disponibles en la técnica, por
ejemplo, tal como se describió en la sección 5.4.1
anteriormente.
La toxicidad y la eficacia de diagnóstico de
tales moléculas pueden determinarse mediante procedimientos
farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales
experimentales, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis
letal para el 50% de la población).
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de
cultivos celulares y estudios animales pueden usarse en la
formulación de una gama de dosificación para su uso en seres
humanos. Por ejemplo, pueden usarse los sistemas de modelo animal
descritos en los ejemplos 7 y 8 para someter a ensayo para
determinar dosis eficaces para visualizar lesiones metastásicas
usando las molécula marcadas. La dosificación de tales compuestos se
encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones
en circulación con poco o nada de toxicidad. La dosis precisa que
ha de emplearse en la formulación dependerá de la vía de
administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse
según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para la
administración intravenosa son generalmente de aproximadamente 1,0
a 20 microgramos de compuesto por kilogramo de peso corporal. Los
niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante
cromatografía líquida de alta resolución.
Las composiciones farmacéuticas para su uso
según la presente invención pueden formularse de una manera
convencional usando uno o más vehículos o excipientes
fisiológicamente aceptables.
Los medios de administración incluyen pero no se
limitan a vías intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e
intradérmica. La administración puede ser sistémica o local. En una
realización específica, es deseable administrar las composiciones
farmacéuticas de la invención localmente mediante inyección directa
en el sitio (o anterior sitio) de un tumor maligno o tejido
metastásico.
En una realización preferida, la composición se
formula según procedimientos habituales tales como una composición
farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres
humanos. Normalmente, las composiciones para la administración
intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril.
Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un
agente de solubilización y un anestésico local tal como lignocaína
para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente,
los componentes se suministran o bien por separado o bien mezclados
juntos. Cuando la composición ha de administrarse mediante infusión,
puede administrarse con un bote de infusión que contiene solución
salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición
se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla
de solución salina o agua estéril de modo que los componentes
puedan mezclarse antes de la administración.
También se describe un kit o paquete
farmacéutico que comprende uno o más envases llenos con uno o más de
los componentes de las composiciones farmacéuticas usadas en la
invención.
Pueden usarse péptidos y miméticos de péptido,
anticuerpos, derivados y análogos de los mismos, marcados que se
unen específicamente a un uPAR para fines de diagnóstico para
detectar, diagnosticar o monitorizar metástasis. En una realización
preferida, las moléculas de la invención pueden usarse para fines de
diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar
micrometástasis.
Las metástasis pueden detectarse en muestras del
paciente o en el paciente. El paciente es un animal y
preferiblemente es un ser humano.
El diagnóstico puede llevarse a cabo mediante:
a) administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una
molécula marcada que se une específicamente al receptor de
urocinasa; b) retraso de la detección durante un intervalo de
tiempo tras la administración para permitir que la molécula marcada
se concentre preferiblemente en cualquier lesión metastásica en el
sujeto para que la molécula marcada no unida se aclare hasta el
nivel inicial; c) detección del nivel inicial; y d) detección de la
molécula marcada en el sujeto, de modo que la detección de la
molécula marcada por debajo del nivel inicial indica la presencia de
una lesión mestastásica. El nivel inicial puede determinarse
mediante diversos métodos incluyendo: medición de la cantidad de
molécula marcada en el tejido que normalmente no expresa uPAR, por
ejemplo, músculo, o bien en el sujeto que se está diagnosticando o
bien en un segundo sujeto que no está bajo sospecha de tener tejido
metastásico; o comparación de la cantidad de molécula marcada
detectada con un valor patrón determinado previamente para un
sistema particular.
Dependiendo de varias variables, incluyendo el
tipo de marcador usado y el modo de administración, el intervalo de
tiempo tras la administración para permitir que la molécula marcada
se concentre preferiblemente en cualquier lesión metastásica en el
sujeto y para que la molécula marcada no unida se aclare hasta el
nivel inicial es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12
horas. En otra realización el intervalo de tiempo tras la
administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días. La
monitorización de la metástasis puede llevarse a cabo repitiendo el
método para diagnosticar la metástasis, por ejemplo, un mes tras el
diagnóstico inicial, seis meses tras el diagnóstico inicial, un año
tras el diagnóstico inicial, etc.
La presencia de la molécula marcada puede
detectarse en el paciente usando métodos conocidos en la técnica
para la exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo
de marcador usado. Los expertos podrán determinar el método
apropiado para detectar un marcador particular. Los métodos y
dispositivos que pueden usarse en la invención incluyen pero no se
limitan a: tomografía computerizada (TC), exploración de todo el
cuerpo tal como tomografía por emisión de positrones (TEP),
obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) y
sonografía.
En una realización específica, la molécula se
marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un
instrumento quirúrgico que responde a la radiación (Thurston et
al., patente estadounidense 5.441.050). En otra realización, la
molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el
paciente usando un instrumento de exploración que responde a la
fluorescencia.
La invención proporciona un tratamiento de
diversos cánceres mediante la administración de un compuesto
terapéutico (denominado en el presente documento "agente
terapéutico"). Tales agentes terapéuticos incluyen pero no se
limitan a: anticuerpos, derivados y análogos de los mismos, y
péptidos y miméticos de péptido que se unen específicamente a un
uPAR (tal como se describe en las reivindicaciones). Para un ejemplo
ilustrativo, véase la sección 9 y la tabla 1.
En una realización preferida, un compuesto
citotóxico o citoestático, incluyendo, pero sin limitarse a:
saporina, ricina de cadena A, toxina del cólera de cadena A, un
antibiótico, un antimetabolito, se acopla al agente terapéutico.
6.
Ejemplo
(No parte de la
invención)
Los experimentos descritos a continuación
demuestran la capacidad del anticuerpo frente a ruPAR para unirse
específicamente a uPAR, y para bloquear la invasión de células
cancerígenas a través de la membrana basal.
Se obtuvo la línea celular de cáncer de próstata
de rata Dunning R3227 Mat Ly Lu del Dr. T. J. Isaacs (Escuela de
Medicina Johns Hopkins, Baltimore, MD). Se obtuvo la línea celular
de cáncer de mama de rata Mat B-III de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD). Se desarrollaron células
Mat B-III que sobreexpresaban uPAR (Mat
B-III-uPAR) tal como se describe en
Xing y Rabbani, 1996, Int. J. Cancer 67: 423-429,
incorporado al presente documento como referencia en su totalidad.
Se mantuvieron las células en medio RPMI 1640 o en medio McCoy's 5A
complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), glutamina 2 mM,
penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 ng/ml (Gibco, Grand
Island, NY). Se hicieron crecer las células en condiciones
convencionales de cultivo tisular a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contenía CO_{2} al 5% en frascos de 75 cm^{2}
o placas de cultivo tisular de seis pocillos (Archbarou et
al., 1994, Cancer Res. 54:2372-2377; Xing y
Rabbani, 1996, Int. J. Cancer 67: 423-429).
Se aisló el ADNc de longitud completa que
codifica para uPAR de rata (r) a partir de una biblioteca de ADNc
de osteoblastos de rata (Rabbani et al., 1994, FEBS Letters
338:69-74). Una digestión de restricción con Pst I
de ADNc de ruPAR dio como resultado la liberación de un ADNc de 271
pb que codificaba los aminoácidos 25-114 de uPAR de
rata que se subclonó en la orientación sentido en el vector de
expresión pTrcHis A (Invitrogen, San Diego, CA). Se confirmó
adicionalmente la orientación y la inserción en marco del ADNc de
ruPAR mediante análisis de secuencia de nucleótidos. Se expresó la
proteína de ruPAR recombinante y luego se purificó en una columna
de proteína G comercialmente disponible según las instrucciones del
fabricante. Se confirmó la secuencia de aminoácidos del ruPAR
recombinante usando el sistema de microsecuenciación integrado PI
2090E (Beckman Instruments, Mississauga, ONT.) en el Sheldon
Biotechnology Centre, Universidad McGill.
Se inmunizaron conejos con ruPAR en múltiples
sitios (8-10) por vía subcutánea usando adyuvante
incompleto de Freund (Sigma, St. Louis, MO) a intervalos de 4
semanas y se les extrajo sangre 10 días tras cada inmunización. Se
obtuvo el antisuero empleado en este estudio tras la tercera
administración de refuerzo. Se purificó la fracción de
inmunoglobulina (IgG) a partir de antisuero frente a ruPAR usando
proteína A-Sepharose CL-4B
(Pharmacia, LKB Bale D'Urfe, Quebec) según las instrucciones del
fabricante.
Se examinó la capacidad de esta IgG específica
de especie frente a ruPAR para reconocer proteína de ruPAR endógena
en células cancerígenas Mat Ly Lu y en Mat B-III. Se
cultivaron en placa células (5 x 10^{4} células) en cámaras de
cultivo tisular Lab Tek (Nunc, Naperville, IL) y se dejaron crecer
hasta una confluencia del 70-80%. Entonces se
incubaron las células suero de cabra al 30% (Sigma, St. Louis, MO)
durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS que
contenía BSA al 1%. Secuencialmente, se incubaron las células con
IgG de conejo primaria frente a ruPAR e IgG de cabra
anti-conejo conjugada con isotiocianato de
fluoresceína (FITC). Se tomaron imágenes a un aumento de 25 X
usando un microscopio MC-63 de Zeiss.
Se sometió a prueba la capacidad de IgG frente a
ruPAR para bloquear la invasividad de las células Mat Ly Lu y Mat
H-III-uPAR mediante cámaras Boyden
de dos compartimentos (Transwell, Costar, EE.UU.) y Matrigel de
membrana basal (Becton Dikinson Labware) (Xing y Rabbani, 1996, Int.
J. Cancer 67: 423-429). Se recubrieron filtros de
policarbonato de ocho (8) \mum de tamaño de poro con Matrigel de
membrana basal (45 \mug/filtro) y se secaron bajo una cubierta de
protección de cultivo tisular. Entonces se reconstituyó Matrigel
añadiendo 0,1 ml de medio de cultivo libre de suero a la cámara
superior e incubando durante 90 min. Tras la eliminación del medio,
se añadieron células (5 x 10^{4}) en 0,1 ml de medio de cultivo
complementado con 10 \mug/ml de IgG anti-ruPAR o
10 \mug/ml de IgG preinmunitaria a la cámara superior y se
colocaron en una cámara inferior llenada previamente con 1,0 ml de
medio libre de suero complementado con 5 \mug/ml de fibronectina
(Sigma, St Louis, MO), y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Al
final de la incubación, se eliminó el medio y se fijaron las
células paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,5% en tampón
fosfato 0,1 M pH 7,4 a temperatura ambiente durante 30 min. Tras
lavar con PBS se tiñeron todos los filtros con azul de toluidina al
0,05%. Se montaron los filtros sobre portaobjetos de vidrio y se
examinaron las células con un microscopio óptico. Se seleccionaron
aleatoriamente diez campos con un aumento de 100X y se calculó el
número medio de células.
Se marcaron cien microgramos de IgG
preinmunitaria o IgG frente a ruPAR con 1 mCi de ^{125}I usando el
método de cloramina T, produciendo una actividad específica de 0,8
- 1,0 \muCi/\mug de proteína (Rabbani et al., 1992, J.
Biol. Chem. 267:14151-14156). Se separó el ^{125}I
libre de las IgG marcadas sobre una columna de filtración en gel
Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) que se
equilibró y eluyó con solución salina tamponada con fosfato que
contenían albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA).
Se cultivaron en placa células Mat Ly Lu y Mat
B-III-uPAR en placas de 24 pocillos
(30.000 y 80.000 células respectivamente) y se dejaron crecer hasta
una confluencia del 70%. Tras una privación de suero durante una
hora, se trataron las células con glicina 50 mM y NaCl 10 mM PH.0
durante 3 min. Entonces se incubaron las células durante 1 hora a
37ºC en un volumen final de 300 \mul que contenía medio libre de
suero, BSA 1 mg/ml, Hepes 20 mM PH 7,4,
^{125}I-IgG frente a ruPAR (100.000 cpm), con o
sin concentraciones crecientes de competidor (proteína de ruPAR).
Se paró la reacción de unión lavando cuatro veces con solución
salina equilibrada de Hanks helada, y se retiraron las células con
1 ml de NaOH 0,6 N para la posterior determinación de la
radioactividad (Rabbani et al., 1992, J. Biol. Chem.
267:14151-14156; Xing y Rabbani, 1996, Int. J.
Cancer 67: 423-429).
El análisis estadístico se realizó mediante un
análisis de varianza de una vía o mediante la prueba de Student.
Se examinó mediante inmunofluorescencia la
capacidad de la IgG frente a ruPAR para reconocer el receptor de
superficie celular para uPA, expresado abundantemente por las
células MatB-III. Las células control incubadas con
10 \mug/ml de IgG de conejo preinmunitaria no mostraron ninguna
unión al ruPAR tal como se evaluó mediante inmunofluorescencia
(figura 3A). Por el contrario a esto, 10 \mug/ml de IgG frente a
ruPAR mostraron una reacción de fluorescencia en células
MatB-III-uPAR (figura 3B). Se
observó este complejo anticuerpo-receptor sobre la
superficie celular en la que se informa que se expresa uPAR. Se
obtuvieron resultados similares con la IgG frente a ruPAR en células
Mat Ly Lu.
Se examinó adicionalmente el papel de la región
NH_{2}-terminal de uPAR en la unión al ligando y
en la invasividad celular en células Mat Ly Lu y en células
MatB-III-uPAR usando un ensayo de
invasión en Matrigel. Tras 24 horas de incubación, tanto las
células Mat Ly Lu como las células MatB-III pudieron
penetrar la membrana basal. La incubación de estas células en
presencia de 50-100 \mug/ml de IgG de conejo
preinmunitaria no produjo ninguna inhibición significativa en la
capacidad de invasión de estas células de cáncer de mama o de
próstata de rata (figura 4). Por el contrario, se redujo
significativamente el número de células que invadían a través de
membrana basal en comparación con las células control tratadas con
IgG de conejo preinmunitaria (figura 4). Se encontró que estos
efectos eran dependientes de la dosis, ya que 50 \mug/ml o 100
\mug/ml de IgG inhibieron la invasión celular en el 40% y el 80%
respectiva-
mente.
mente.
\vskip1.000000\baselineskip
7.
Ejemplo
La especificidad de unión y la biodistribución
de anticuerpo frente ruPAR marcado in vivo se describen en
la subsecciones a continuación. Estos resultados mostraron que el
anticuerpo anti-uPAR marcado acumulado en tejidos
que son sitios comunes de metástasis tumorales antes de las
metástasis podría detectarse macroscópicamente. Estos experimentos
también demostraron que el ruPAR no marcado inhibe la unión
^{125}I-IgG frente a ruPAR de una manera
dependiente de la dosis. Se observó que el anticuerpo frente a ruPAR
marcado se concentraba en tumores primarios de una manera
dependiente del tiempo. Además, se demostró la capacidad del
anticuerpo frente a ruPAR para unirse preferiblemente en el tumor
primario y, sorprendentemente, en lesiones metastásicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ratas Fischer hembra endogámicas
que pesaban 200-250 g de Charles River, Inc. (St.
Constant, Canadá). Antes de la inoculación, se lavaron con tampón
de Hank las células tumorales Mat
B-III-uPAR hechas crecer en medio
que contenía suero y se tripsinizaron durante cinco minutos.
Entonces se recogieron las células en tampón de Hank y se
centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Se resuspendieron los
sedimentos celulares (1 x 10^{6} células) en 200 \mul de
solución salina y se inyectaron usando jeringuillas de insulina de
un ml en la almohadilla adiposa mamaria de ratas anestesiadas con
etanol/Somnotal (MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario).
Para los estudios de biodistribución, en el día
10 posterior a la inoculación de células tumorales, se les inyectó
a los animales IgG preinmunitaria marcada con ^{125}I o IgG frente
a ruPAR (25 \mug, 25 \muCi) a través de inyección en la vena de
la cola. En un experimento separado, en el día 15 posterior a la
inoculación de células tumorales, se les inyectó a los animales a
través de la vena de la cola el material marcado. Se sacrificaron
los animales 0,5-96 horas tras la inyección. Se
extirparon los tumores primarios del sitio de inoculación de
células tumorales (almohadilla adiposa mamaria) y se contó la
radioactividad. Alternativamente, 12 horas tras la inyección de IgG
preinmunitaria radiomarcada o IgG frente a ruPAR, se extirparon los
tumores primarios y diversos órganos (corazón, hígado, bazo,
pulmones, riñones y ganglios linfáticos) y se monitorizó la
captación de radioactividad total en estos órganos usando un
contador gamma. Se calculó la biodistribución de
^{125}I-IgG frente a ruPAR y se expresó como el %
de dosis inyectada/gramo de tejido (% de DI/g) de
^{125}I-IgG frente a ruPAR - IgG preinmunitaria
marcada con ^{125}I (Folli et al., 1994, Cancer Res.
54:2643-2649).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad de IgG frente a ruPAR
para interferir con la capacidad funcional de uPAR en un ensayo de
unión al receptor. Se determinó la unión total de
^{125}I-IgG frente a ruPAR a células Mat Ly Lu y
Mat B-III-uPAR. La adición de
diferentes concentraciones (0,1-2,0 mg) de uPAR de
rata recombinante no marcado inhibió la unión de
^{125}I-IgG frente a ruPAR de una manera
dependiente de la dosis tanto en las células Mat Ly Lu (figura 5A)
como en las células Mat B-III (figura 5B). Se
observó una disminución dependiente de la dosis similar en la unión
^{125}I-IgG frente a ruPAR tras la adición de
diferentes concentraciones de IgG frente a ruPAR no marcada en
comparación con IgG de conejo preinmunitaria en sus células
tumorales.
Para examinar la especificidad y el transcurso
de tiempo de ^{125}I-IgG frente a ruPAR, se
marcaron tanto la IgG preinmunitaria como la IgG frente a ruPAR con
^{125}I y se inyectaron a través de la vena de la cola en ratas
Fischer hembra con tumor Mat
B-III-uPAR (a los 15 días
posteriores a la inoculación de células tumorales). Se sacrificaron
los animales a intervalos cronometrados (0,5-96
horas). Se extirparon los tumores primarios y se contó la captación
de ^{125}I. El % de DI/g de IgG frente a ruPAR más alto fue en los
animales con tumor tras 12 horas de la inyección de
^{125}I-IgG, tiempo tras el que el % de DI/g
disminuyó durante hasta 96 horas (figura 6).
Se les inyectó a los animales con tumor (día 10
posterior a la inoculación de células tumorales) a través de la
vena de la cola ^{125}I-IgG frente a uPAR y se
sacrificaron 12 horas tras la inyección con el material de uPAR
marcado. Se examinó la acumulación de marcador en: (1) tejidos
normales (músculo, corazón); (2) tejidos que son sitios comunes de
metástasis tumoral (hígado, bazo, riñón, pulmones, ganglios
linfáticos); y (3) tumores primarios. Se observaron cantidades
mínimas de radioactividad en el músculo, mientras que los niveles de
^{125}I fueron ligeramente más altos en el corazón debido a la
presencia de sangre que mostraba una alta radioactividad. Por el
contrario a esto, se observaron niveles significativamente más altos
del % de DI/g de IgG frente a ruPAR en hígado, bazo, riñón,
pulmones, ganglios linfáticos y en el tumor primario (figura 7).
Aunque se detectó material marcado en tumor
primario y lesiones metastásicas de los animales sacrificados en el
día 10 posterior a la inoculación de células tumorales (figura 7),
no se observó ninguna metástasis macroscópica. Sin embargo, se
observaron metástasis tumorales macroscópicas en los animales
sacrificados el día 15 tras la inoculación de células tumorales.
Estos resultados sugieren que la captación específica de
^{125}I-IgG frente a ruPAR por las células
tumorales Mat B-III-uPAR, ya
presentes en estos sitios en el día 10, se convirtieron más tarde
en metástasis macroscópicas hacia el día 15.
\vskip1.000000\baselineskip
8.
Ejemplo
(No parte de la
invención)
El siguiente ejemplo demuestra la capacidad de
^{125}I-IgG frente a uPAR humano (h) para
reconocer uPAR en la superficie celular y concentrarse
preferiblemente en tumor primario y lesiones metastásicas in
vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcaron la IgG frente a uPAR humano
monoclonal (nº 3936, American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) o la
IgG de ratón no específica usando el método de Iodogen produciendo
una actividad específica de 0,6 - 0,9 mCi/mg. En resumen, se
añadieron 100 \mug de IgG al recipiente recubierto previamente con
10 \mug de Iodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, I1.) según las
instrucciones del fabricante. Se dejó avanzar la reacción durante 15
minutos a temperatura ambiente. Se separó el ^{125}I libre de las
IgG marcadas usando una columna de filtración en gel Sephadex G25
(Pharmacia, Uppsula, Suecia) equilibrada previamente con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero
bovino al 0,1% (BSA).
Se establecieron xenoinjertos de tumor en
ratones (Balb/c nu/nu) desnudos de 4-6 semanas de
edad mediante inyección subcutánea de 2 x 10^{6} células de
cáncer de próstata humanas (PC-3) por ratón. Antes
de la inyección, se lavaron con HBSS las células hechas crecer en
medio que contenía suero y se tripsinizaron durante 5 minutos.
Entonces se recogieron las células en medio y se centrifugaron a
1500 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en 200 \mul de
solución salina.
Cinco semanas tras la inoculación de células
tumorales, se inyectaron las IgG marcadas con ^{125}I por vía
intravenosa a través de la vena de la cola lateral, en los ratones
con tumor. Se sacrificaron los animales tras 12-24
horas, y se extirparon el tumor primario y diversos órganos
(corazón, hígado, bazo, pulmones, riñón, ganglios linfáticos y
sangre). Se determinó la radioactividad total usando un contador
gamma. Se calculó la biodistribución y se expresó como el % de
dosis inyectada/gramo de tejido (% de DI/g).
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar la especificidad de la IgG frente
a huPAR, se marcaron la IgG preinmunitaria y el anticuerpo
monoclonal frente a uPAR humano, 3936, con ^{125}I y se inyectaron
en la vena de la cola de ratones Balb/c nu/nu normales y ratones
Balb/c nu/nu con xenoinjertos de tumor de células de próstata
humanas (PC-3).
Se examinó el % de DI/g de
^{125}I-IgG frente a huPAR en (1) tejido normal
(corazón); (2) tejidos que son sitios comunes de metástasis
(hígado, bazo, riñón, pulmones, ganglios linfáticos); y (3) tumores
primarios. Los niveles de radioactividad eran ligeramente altos en
el corazón debido a la presencia de sangre que mostraba una alta
captación de la molécula radioactiva (figura 8A). Por el contrario,
se observaron niveles significativamente más altos del % de DI/g en
el tumor primario y en los tejidos metastásicos, particularmente en
el pulmón.
\newpage
9.
Ejemplo
(No parte de la
invención)
El siguiente ejemplo demuestra la capacidad de
IgG anti-uPAR para inhibir la tasa de crecimiento de
tumores primarios e inhibir la formación y el crecimiento de
lesiones metastásicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ratas Fischer hembra endogámicas
que pesaban 200-250 g de Charles River, Inc. (St.
Constant, Canadá). Antes de la inoculación, se lavaron con tampón
de Hank las células tumorales Mat
B-III-uPAR hechas crecer en medio
que contenía suero y se tripsinizaron durante cinco minutos.
Entonces se recogieron las células en tampón de Hank y se
centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Se resuspendieron los
sedimentos celulares (1 x 10^{6} células) en 200 \mul de
solución salina y se inyectaron usando jeringuillas de insulina de
un ml en la almohadilla adiposa mamaria de ratas anestesiadas con
etanol/Somnotal (MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario).
Se les inyectó a los animales con tumor
50-100 \mug/día de IgG frente a ruPAR por vía
subcutánea en la almohadilla adiposa mamaria desde el día 1 hasta
el día 7 posterior a la inoculación de células tumorales. Los grupos
control de animales con tumor recibieron o bien solución salina
normal o bien 50-100 \mug/día de IgG de conejo
preinmunitaria como control.
Se monitorizaron todos los animales para
determinar el desarrollo de los tumores durante 2-3
semanas posteriores a la inoculación de células tumorales. Se midió
el tamaño tumoral en los animales control y de experimentación en
dos dimensiones mediante calibres y se calculó el volumen tumoral
(Haq et al., 1993, J. Clin. Invest.
91:2416-2422). Se sacrificaron los animales control
que recibieron IgG preinmunitaria y los animales de experimentación
a los que se les inyectó IgG frente a ruPAR en el día 10 o en el día
15 posterior a la inoculación de células tumorales y se evaluó la
presencia de metástasis macroscópicas en diversos tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad de IgG
anti-ruPAR para inhibir la tasa de crecimiento de
los tumores primarios. La inyección de IgG de conejo preinmunitaria
en animales con tumor no dio como resultado ninguna diferencia
significativa en el crecimiento tumoral. Por el contrario, la
inyección de IgG anti-ruPAR desde el día 1 hasta el
día 7 posterior a la inoculación de células tumorales dio como
resultado una disminución significativa en el volumen tumoral en
estos animales de experimentación (figura 9). Esta disminución en el
volumen tumoral era más pronunciada en las últimas fases (día 15 -
día 21), en las que los animales control seguían mostrando un
aumento lineal en el crecimiento tumoral, mientras que los animales
de experimentación que recibieron IgG frente a ruPAR no sólo
mostraron una disminución en el volumen tumoral sino también
demostraron una regresión en el crecimiento tumoral en comparación
con las fases más tempranas (día 9 - día 14) del desarrollo tumoral
(figura 9).
Para determinar los efectos de IgG frente a
ruPAR sobre la metástasis tumoral, se sacrificaron los animales
control con tumor a los que se les inyectó IgG de conejo
preinmunitaria y los animales de experimentación que recibieron IgG
frente a ruPAR el día 15 posterior a la inoculación de células
tumorales. Los animales control desarrollaron de manera
reproducible grandes metástasis tumorales macroscópicas en los
ganglios linfáticos axilares, retroperitoneales y mesentéricos.
También se observaron pruebas de metástasis tumoral ocasional en
hígado y bazo (tabla 1). Por el contrario, los animales con tumor
que recibieron IgG frente a ruPAR mostraron focos metastásicos
significativamente más pequeños en los ganglios linfáticos
retroperitoneales y mesentéricos, sin ninguna prueba de metástasis
tumoral en hígado o bazo (tabla 1).
La presente invención no se limita en su alcance
por las realizaciones específicas descritas en el presente
documento, que están propuestas como simples ilustraciones de los
aspectos individuales de la invención. De hecho, diversas
modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas
en el presente documento serán evidentes para los expertos en la
técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos
adjuntos.
<110> Rabbani y Hart
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RECEPTOR DEL ACTIVADOR DEL
PLASMINÓGENO TIPO UROCINASA COMO DIANA PARA EL DIAGNÓSTICO DE
METÁSTASIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
9471-003-228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/06588
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
23-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/046.106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-03-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Uso de una molécula marcada para preparar una
composición para el diagnóstico y la obtención de imágenes in
vivo de una o más lesiones metastásicas en un sujeto humano;
en el que dichas lesiones metastásicas son
micrometástasis; y
en el que dicha molécula se selecciona del
siguiente grupo de moléculas polipeptídicas que se unen
específicamente al receptor del activador del plasminógeno de tipo
urocinasa:
- i)
- un anticuerpo a un receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa;
- ii)
- una parte de dicho anticuerpo que contiene el dominio de unión del mismo; y
- iii)
- un péptido, derivado de péptido o análogo de péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicha obtención de imágenes es la obtención de imágenes de todo el
cuerpo.
3. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que
dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano.
5. Uso según la reivindicación 3, en el que
dicho anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal 3936.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
quimérico.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
de cadena sencilla o un anticuerpo
anti-idiotípico.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha parte de dicho anticuerpo es
un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2} o un fragmento
de unión a epítopo.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho péptido, derivado de péptido
o análogo de péptido comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 2:
DCLNG GTCVS NKYFS NIHWC N.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que
dicho péptido, derivado de péptido o análogo de péptido comprende la
secuencia de aminoácidos:
DCLNG GTCVS NKYFS NIHWC NC.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que
dicho péptido, derivado de péptido o análogo de péptido comprende
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1:
VPSNC DCLNG GTCVS NKYFS NIHWC NC.
13. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 10, 11 y 12, en el que dicho péptido, derivado de
péptido o análogo de péptido comprende uno o más dominios de una
proteína de uPA.
14. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que dicha molécula es una proteína
de activador del plasminógeno de tipo urocinasa, o un fragmento,
análogo o derivado de una proteína de activador del plasminógeno de
tipo urocinasa, unida por medio de un enlace peptídico a una
secuencia de proteína heteróloga.
15. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, en el que dicha molécula comprende uno o
más de los siguientes como sustituto o adición en la secuencia de
aminoácidos de dicha molécula: un isómero D de un aminoácido común,
ácido alfa-aminoisobutírico, ácido
4-aminobutírico, hidroxiprolina, sarcosina,
citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina,
t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina,
beta-alanina, un beta-metil
aminoácido, un C-alfa-metil
aminoácido y un N-alfa-metil
aminoácido.
16. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha molécula marcada está
marcada con un radioisótopo.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que
dicho radioisótopo se selecciona del grupo que consiste en
^{99m}TC, ^{125}I y ^{131}I.
18. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha molécula marcada está
marcada con un compuesto fluorescente.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que
dicho compuesto fluorescente se selecciona del grupo que consiste
en isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina,
ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído,
fluorescamina y ^{152}Eu.
20. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha molécula marcada está
marcada con un compuesto quimioluminiscente o compuesto
bioluminiscente.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que
dicho compuesto quimioluminiscente se selecciona del grupo que
consiste en luminol, éster de acridinio teromático de isoluminol,
imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.
22. Uso según la reivindicación 20, en el que
dicho compuesto bioluminiscente se selecciona del grupo que consiste
en luciferina, luciferasa y ecuorina.
23. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha molécula marcada está
marcada con una enzima.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que
dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en malato
deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica,
delta-5-esteroide isomerasa, alcohol
deshidrogenasa de levadura, alfa glicerofosfato deshidrogenasa,
triosa fosfato isomerasa, peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina,
asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa,
ribonucleasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa y acetilcolinesterasa.
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