ES2305534T3 - Vidrio mesoporoso como nucleante para la crstalizacion molecular. - Google Patents

Abstract

Un método para facilitar la cristalización de una macromolécula que comprende el paso de añadir un vidrio mesoporoso a una muestra de cristalización en el que el vidrio mesoporoso comprende poros con diámetros entre 4 nm y 100 nm y tiene un área superficial de al menos 50 m2 /g.

Description

Vidrio mesoporoso como nucleante para la cristalización macromolecular.

La presente invención se refiere al uso de un nuevo nucleante en la cristalización de macromoléculas y a métodos de cristalizar macromoléculas como, por ejemplo, proteínas, usando el nuevo nucleante.

Hasta la fecha, la nucleación de vidrios ha sido facilitada principalmente por siembra, epitaxia, superficies cargadas o medios mecánicos (Stura, E.A. In Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. (ed Bergfors, T.M.) (InternationalUniversity Line, La Jolla; 1999); McPherson, A. & Shlichta, P. Science 239, 385-387 (1988); Sanjoh,A. & Tsukihara, T. J. Cryst. Growth 196, 691-702 (1999); Sanjoh, A., Tsukihara, T. y Gorti, S. J. Crystal Growth232 618-628 (2001); Visuri, K. et al. Bio/Technology 8,547-549 (1990)). La nucleación de vidrios es el primer paso necesario en el proceso de cristalización y su influencia en este proceso es decisiva. Consecuentemente, la habilidad de controlarlo tiene una importancia crucial en los experimentos de cristalización. La nucleación presenta una barrera de energía libre que debe ser superada de un modo particular, diferente de las condiciones de sobresaturación que posteriormente hacen del crecimiento de vidrio un proceso energéticamente favorable (Feher, G. & Kam, Z. Methods Enzymol. 114, 77-112 (1985)). La formación de núcleos en el grueso de una solución es un proceso estocástico en el que las moléculas de proteínas interactúan hasta formar un agregado de tamaño crítico. Cualquier entorno que favorezca una mayor concentración local de macromoléculas proporcionará un potencial punto de nucleación y podrá reducir la barrera energética para la nucleación.

Proyectos piloto de genómica estructural muestran un índice de éxito de alrededor del 10% en pasar de réplica a estructura. Se ha descubierto que la etapa que limita este índice es la producción de vidrios apropiados para cristalografía con rayos X (p. ej. the Human Proteome Structural Genomics pilot project; Brookhaven National Laboratory, The Rockefeller University y Albert Einstein College of Medicine: http://proteome.bnl.gov/progress.html). En la actualidad es primordial encontrar métodos que ayuden a superar este escollo.

El objetivo último sería encontrar un nucleante "universal" que pudiera favorecer la cristalización de una amplia gama de proteínas bajo una amplia gama de condiciones. Previamente se han acometido estudios con el fin de descubrir nucleantes introduciendo sustancias candidatas de manera controlada en experimentos de cristalización (McPherson y Schlichta Science 239, 385-387 (1988); Chayen, N.E., Radcliffe, J.W. & Blow, D.M. Protein Sci. 2, 113-118 (1993); Blow, D.M., Chayen, N.E., Lloyd, L.F. & Saridakis, E. Protein Sci. 3, 1638-1643 (1994); Malkin, A.J., Cheung, J y McPherson, A. (1993) J. Crystal Growth 126 544-554 (en relación con "Mcpherson Beads" -latex beads/partículas de látex "Partículas McPherson")). Algunos han tenido éxito con proteínas individuales pero por ahora ninguno ha resultado ser de uso general. Otros diversos intentos de inducir a la nucleación en superficies irregulares o rugosas, o superficies de composición especial, se han revelado así mismo inefectivos de forma general (Chayen, N.E. & Saridakis, E. J. Cryst. Growth 232, 262-264 (2001).

Sakamoto et al. Nature 408, 449-453 (2000) y Dusastre Nature 408:417 (2000) describen métodos para caracterizar materiales mesoporosos y dan a conocer las estructuras de algunos materiales mesoporosos. Se sugiere que éstos resultan útiles en varias áreas de la química como la catálisis y la filtración molecular, pero no se alude a su uso para la nucleación de vidrio.

Hemos descubierto que vidrios mesoporosos con unas características particulares son útiles como nucleantes en la cristalización. Se considera que los vidrios mesoporosos tienen poros que atrapan macromoléculas, por ejemplo moléculas proteicas, y las impulsan a nuclear y formar vidrios.

Un primer aspecto de la invención revela un método para facilitar la cristalización de una macromolécula que comprende el paso de añadir vidrio mesoporoso a la muestra de cristalización, vidrio mesoporoso que contiene unos poros con diámetros entre 4 nm y 100 nm y posee un área de superficie de al menos 50 m^{2}/g.

En determinadas realizaciones, el vidrio mesoporoso contiene poros con diámetros entre 4 nm y 70 u 80 nm, 4 nm y 40 nm, o 7 nm y 40 nm. En la realización descrita en el Ejemplo 2, donde el vidrio mesoporoso tiene poros con diámetros entre 7 y 40 nm, el tamaño modal de poro es 11,2 nm y el tamaño medio de poro es 16 nm.

Las distribuciones del tamaño de poro están calculadas usando la técnica estándar en el campo, i.e. a partir de los datos isotérmicos de absorción y desorción de gas (por ejemplo, N_{2} o He) usando el método BJH (Barrett EP, Joyney LG, Halenda PP. Jof Am. Chem. Soc. 1951; 73: 373-380), como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Utilizando este método, menos del 10%, 5% o 2% (por número) de los poros se sale del intervalo de tamaño especificado, sea, por ejemplo, un intervalo entre 4 nm y 100 nm. El tamaño del poro puede mostrar una amplia distribución gaussina en el intervalo en cuestión. Se considera que un intervalo de tamaños de poro proporciona unas buenas propiedades de nucleación; se considera que una estrecha distribución de tamaños de poro, en la que por ejemplo más del 80, 85 ó 90% de los poros tengan un tamaño de poro dentro del intervalo entre X nm y (X + 10 nm) o (X + 5 nm), donde X se encuentra en un intervalo de tamaño específico, no proporcionará propiedades de nucleación igual de buenas.

Tal como se emplea aquí, el término "vidrio mesoporoso" incluye un vidrio con poros sin orden y de tamaños irregulares cuyos diámetros pueden variar entre unos pocos nanómetros y decenas o cientos de nanómetros. El vidrio puede ser la fusión de uno o más óxidos de silicio, boro y fósforo, con uno o más óxidos de sodio, magnesio, calcio o potasio, y opcionalmente carbonato de sodio o de calcio. De forma alternativa, y preferiblemente, el vidrio mesoporoso con poros sin orden y de tamaños irregulares cuyos diámetros pueden oscilar entre unos pocos nanómetros y decenas o cientos de nanómetros, pueden fabricarse creando un gel mediante precursores alcóxidos de SiO_{2} como tetrametilortosilicato (TMOS) o tetraetilortosilicato (TEOS) hidrolizado con H_{2}O y un catalizador (como HNO_{3} o HF) para hacer vidrio de sílice (SiO_{2}) mesoporoso o hidrolizado con H_{2}O y un catalizador en combinación con precursores alcóxidos de P_{2}O_{5}, como trietoxilortofosfato (TEP, OP (OC_{2}H_{5})_{3}), o precursores de nitrato de CaO, como Ca(NO_{3})_{2}, o percursores de Na_{2}O, como citrato de sodio. Ejemplos incluyen SiO_{2}, CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaOP_{2}O_{5}-SiO_{2}. Los mesoporos aparecen en el vidrio derivado del sol-gel cuando se está estableciendo la red tridimensional durante la gelificación y son mantenidos siguiendo una técnica de secado controlado bien conocida por los expertos en la técnica y descrita en Hench (1997) Curr Opin Solid State Mater Science 2, 604-610, Li et al (1991) J Appl Biomaterials 2, 231-239, Hench y West (1990) Chem Rev 90, 33-72.

Los poros del vidrio mesoporoso útiles en la presente invención tienen diámetros de entre 4 nm y 100 nm (o de otros intervalos en algunas realizaciones, como se ha señalado anteriormente), determinados utilizando un método de análisis por absorción de gas convencional, como se describe en Coleman & Hench(2000) A gel-derived mesoporous silica reference material for surface analysis by gas sorption.1: Textural features Ceramics International 26, 171-178. Por ejemplo, los tamaños de poro pueden calcularse a partir de los datos de desorción de un gas estándar (por ejemplo, N_{2}) usando el método BJH (cf. Ejemplo 2 y [5]). El vidrio mesoporoso puede ostentar una heterogénea muestra de tamaños de poro. El material puede tener poros cilíndricos abiertos, determinados por isotermas de absorción/desorción de gas (por ejemplo, N_{2}), como es sabido por los expertos en la técnica y como se describe en el Ejemplo 2. El bucle de histéresis puede ser del tipo H1 (Sing KSW, Everett DH, Haul RAW. Pure y Appl. Chem. 1985; 57: 603-619), el cual indica que el material contiene principalmente poros cilíndricos abiertos e interconectados que no están cerrados en la superficie.

El vidrio mesoporoso de uso en el método de la invención puede tener un área de superficie de al menos 250 m^{2}/g, 200 m^{2}/g, 150 m^{2}/g, 100 m^{2}/g, o al menos 50 m^{2}/g. El área de superficie será preferiblemente menor de 300 m^{2}/g. En una realización, el área de superficie está entre 150 m^{2}/g y 100 m^{2}/g. El área de superficie del vidrio mesoporoso es una medida tanto del tamaño del poro como del número de poros, y puede incrementarse o reducirse durante el procedimiento sol-gel, como podrán saber los expertos en la técnica y como se describe en Hench, L.L. (1998) Sol-Gel Silicas, Hayes Publishing Co, New York, and in Iler, R.K. (1979) The Chemistry of Silica, J Wiley & Sons, New York. El área de superficie del vidrio mesoporoso puede calcularse utilizando una isoterma de absorción de gas (por ejemplo N_{2}), como se describe más adelante en el Ejemplo 2, o cualquier otro método de análisis de superficie equivalente.

Los vidrios mesoporosos que pueden ser de particular utilidad en el método de la invención se revelan en el Ejemplo 1 y en Cook et al (2000) Bioceramics, 13, 625 -628; Sepulveda et al (2002) J Biomed Mater Res. 59, 340-8; Pereira & Hench (1996) J Sol-gel Sci Tech 7, 59-68; Li et al (1992) Chem Proc Adv Mater 56, 627-633; Lenza et al (2002) J Mater Sci, Mat in Med 13, 837-892; Orefice et al (2001) J Biomed Mater Res 55, 460-467.

Se entenderá que cuando empleamos el término "macromolécula" estamos incluyendo cualquier molécula superior a 1 kDa. Preferiblemente la macromolécula será una macromolécula biológica como un ácido nucleico, y más preferiblemente la macromolécula será un polipéptido. Preferiblemente el polipéptido comprenderá al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos, y más preferiblemente al menos 75, 100, 200, 500 ó 1000 aminoácidos.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para facilitar la cristalización de una macromolécula que comprende el paso de añadir a la muestra de cristalización un vidrio mesoporoso de la composición SiO_{2}, CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2}, donde cada uno de los átomos de Ca, P, Si o Na dentro de las composiciones puede ser sustituido por un átomo apropiado elegido entre B, Al, Ti, Mg o K, y, opcionalmente, la composición podrá también incluir elementos pesados para acentuar el contraste de difracción de rayos X, como por ejemplo Ag, Au, Cr, Co, Sr, Ba, Pt, Ta u otro átomo con un número atómico superior a 20.

En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el vidrio mesoporoso tendrá la composición SiO_{2}, CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2}.

CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} son vidrios mesoporosos bioactivos que se han considerado útiles para la regeneración ósea (Saravanapavan y Hench (2001) J Biomed Mater Res. 54, 608-18; Sepulveda et al (2002) J Biomed Mater Res. 59, 340-8 Cook et al (2000) Bioceramics, 13, 625 - 628). La composición Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} es también bioactiva y se describe en detalle en Hench & West (1996) Life Chem Prep 13, 187-241. La respuesta bioactiva de unión a hueso del vidrio mesoporoso de SiO_{2} ha sido descrita por Hench & Walker (1979) en la Patente de EE.UU. nº 4171544.

El Ejemplo 1 demuestra la aptitud de los vidrios mesoporosos como nucleantes para facilitar la cristalización de macromoléculas.

Mediante "sustituido por un átomo apropiado" queremos decir que el átomo elegido entre la selección que se ofrece tiene la misma valencia que el átomo sustituido, p. ej. Mg por Ca, K por Na; alternativamente, átomos de valencia múltiple como P pueden sustituirse por Si en las redes del vidrio.

Es preferible que el vidrio mesoporo que se usa en el segundo aspecto de la invención comprenda poros con diámetros entre 200 nm, 150 nm o 100 nm y 2, 4, 7, 10, o 20 nm. Aún más preferiblemente, los diámetros de los poros y su distribución serán como se ha indicado arriba en relación al primer aspecto de la invención. Así, en realizaciones del segundo aspecto de la invención el vidrio mesoporoso que se usa en el método comprenderá poros con diámetros entre 4 nm y 100 nm o 7 nm y 40 nm, medidos utilizando métodos convencionales, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2.

En relación al primer o el segundo aspecto de la invención, la distribución de las dimensiones de los poros del vidrio mesoporoso que se usa en el método de la invención tiene una desviación estándar de al menos 5 nm, 10 nm o 15 nm.

Por lo general, el vidrio mesoporoso que se usa en el segundo aspecto de la invención se distingue por una distribución no uniforme de los tamaños de los poros dentro del mismo. Por tanto, es preferible que los poros del vidrio mesoporoso no tengan un tamaño uniforme y presenten una alta variabilidad en cuanto al tamaño de los poros.

En una realización adicional de los métodos de la invención, el vidrio mesoporos tiene poros interconectados. Por ejemplo, los poros pueden incluir poros cilíndricos abiertos, como se describe en el Ejemplo 2.

Tal como se emplea aquí, el término "poros interconectados" incluye un vidrio mesoporoso en el que al menos algunos poros están interconectados de modo que los contenidos de un poro o cavidad son accesibles para uno o más poros o cavidades adyacentes o conectados y, como poros abiertos, interseccionan con la superficie.

Por lo general, la naturaleza interconectada de los poros es compartida por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%,50%, 60% o 70% de los poros del vidrio mesoporoso. Preferiblemente, el vidrio mesoporoso tiene una clasificación de poros H1 como se describe en Sing et al (1985) Pure and Appl Chem 57, 603-619, i.e. el vidrio mesoporoso contiene primordialmente poros cilíndricos abiertos que están interconectados.

La porosidad de CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} y Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} puede modificarse usando una técnica de espumado. Por ejemplo, el CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} no espumado tiene un área de superficie de 146,4 m^{2}/g mientras un CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} poco espumado tiene un área de superficie de 239,6 m^{2}/g (Sepulveda et al (2002) J Biomed Mater Res. 59, 340-8). El espumado altera también el tamaño de poro medio y la naturaleza tridimensional de los poros y genera poros muy grandes de 100 \mum o mayores además de los mesoporos. Por tanto, el vidrio mesoporoso de composición CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} puede fabricarse usando las técnicas descritas en Sepulveda et al (2002) J Biomed Mater Res. 59, 340-8 o según se describe en Pereira & Hench (1996) J Sol-Gel Sci and Tech 7, 59-68 o Li et al (1992) Chem Proc Adv Mater 56, 627-633, con el fin de generar una sustancia porosa que tenga un área de superficie apropiada para su utilización en la invención, con unas dimensiones medias de tamaño de poro apropiadas para usarse en la invención, y una variabilidad en las dimensiones medias de tamaño de poro y con un poros interconectados apropiados para su uso en la invención.

En la cristalización de macromoléculas se ha experimentado previamente con materiales como las partículas de Sephadex^{TM}, zeolitas y polvos de aluminio y pero éstos han resultado ser inefectivos como nucleantes de uso general (Chayen, N.E. & Saridakis, E. J. Cryst. Growth 232, 262-264 (2001)). El Sephadex^{TM} consiste una red producida mediante el reticulado de material sustituyente. Este reticulado crea poros de forma efectiva, cuyo tamaño está determinado por el grado o tipo de reticulado. Debe tenerse en cuenta que el Sephadex^{TM} y la arena no están incluidos dentro de la presente definición de "vidrio mesoporoso". Una diferencia entre el material poroso útil en la presente invención y el Sephadex^{TM} es que los poros de cada tipo dado de perlas de Sephadex tienen un tamaño quasi-uniforme. Como se ha dicho antes, el vidrio mesoporoso útil en la presente invención comprende poros de tamaños variables, según se ha explicado arriba; el material tiene un diámetro medio de poro generado por una considerablemente amplia distribución gaussiana de tamaño de poro. De ahí que la distribución de dimensión de poro en el material poroso sea más amplia que la de las dextrinas reticuladas.

Debe observarse que el tamaño medio conveniente para una determinada aplicación puede depender del tamaño de la macromolécula que se va a cristalizar. Por ejemplo, conjuntos macromoleculares más grandes (i.e. con un tamaño mayor de 5 nm o 10 nm o 15 nm de radio de Stokes) como las cápsidas víricas, etc. pueden requerir poros más grandes (i.e. poros con un tamaño medio superior a 10 nm o 20 nm o 50 nm en cualquier plano) que el tamaño de poro requerido por los conjuntos macromoleculares más pequeños de los métodos de la invención, como por ejemplo con un radio de Stokes de 5 nm o menos.

En una realización preferida de los métodos de la invención, la cristalización de la macromolécula es inducida en un nivel crítico de supersaturación más bajo que el obtenido cuando no se añade vidrio mesoporoso a la muestra.

En una realización preferida adicional o alternativa, las condiciones de la muestra de cristalización comprenden estados de supersaturación que son favorables para el crecimiento vítreo, pero inadecuados o insuficientes para la nucleación espontánea. Tales condiciones son un medio de maximizar las posibilidades de obtener vidrios durante la selección inicial de las condiciones de cristalización y proporcionan un medio para cultivar vidrios en estados metaestables en el que un crecimiento más lento y la ausencia de un exceso de nucleación secundaria proporcionan a menudo un cultivo de vidrios de difracción mejores y más grandes.

Determinar qué nivel de supersaturación es inadecuado o insuficiente para la nucleación espontánea es algo bien conocido en la técnica de cristalización. El nivel de supersaturación puede ser determinado instalando filtros que cubran una gama de condiciones entre las condiciones que producen espontáneamente vidrios/microcristales.

Preferiblemente la invención proporciona un método para facilitar la cristalización de una macromolécula según el primer o el segundo aspecto de la invención que comprende el paso de romper el vidrio mesoporoso en piezas de dimensiones submilimétricas antes de añadir el vidrio mesoporoso a la muestra de cristalización.

Preferiblemente, el vidrio mesoporoso se prepara de novo en piezas de dimensiones submilimétricas deformando la red del gel y agitando al mismo tiempo.

Preferiblemente, el vidrio mesoporoso se ha de convertir en piezas o fragmentos que no sean mayores de 200 \mum, 150 \mum o 100 micrómetros en ninguna dimensión, más preferiblemente que no sean mayores de 75 \mum o 50 \mum, y aún más preferiblemente que no sean mayores de 25 \mum en ninguna dimensión. Más preferiblemente, ninguna dimensión de las piezas será mayor de 10 micrómetro. Ventajosamente, las piezas del vidrio mesoporoso se asemejan a un polvo fino. La conversión de vidrio mesoporoso en fragmentos puede lograrse usando una cortadora de diamante o
de SiC.

Con "fracturar" queremos decir que el material inicial es convertido en fragmentos o piezas más pequeños. Se puede fracturar por medio de cualquier técnica adecuada, incluyendo el corte con un escalpelo o medios mecánicos (usando por ejemplo una cortadora de diamante) o romper el trozo grande en trocitos pequeños usando unas pinzas. Por lo general, el vidrio mesoporoso útil en la presente invención no puede romperse manualmente en piezas suficientemente pequeñas. La superficie es mecánicamente frágil, por lo que es preferible pulir o triturar con cargas reducidas (por ejemplo con vibración). Debe notarse que para ser útiles como nucleantes en la cristalización, los fragmentos o piezas tienen que ser de tal forma que la red de poros dentro del vidrio mesoporoso quede al descubierto. En otras palabras, los poros han de ser accesibles para las moléculas con un tamaño apropiado (i.e., las que sean más pequeñas que el tamaño de los poros) cuando dichas moléculas entran en contacto con ellos. En consecuencia, los fragmentos o piezas de vidrio mesoporoso no se cerrarán exteriormente en ningún sentido por el procedimiento de fracturación.

El método de fracturación puede ser manual o mecánico o bien hacerse con una máquina a motor.

Un tercer aspecto de la invención es un método para determinar la estructura de una macromolécula que comprende los pasos de (i) cristalizar la macromolécula en presencia de un vidrio mesoporoso como queda definido en relación con el primer y el segundo aspecto de la invención, y (ii) analizar la estructura del vidrio producido en el paso (i).

Los materiales porosos útiles o preferidos en el tercer aspecto de la invención son los que se han definido detalladamente con anterioridad. Preferiblemente, el material poroso se produce como se ha descrito arriba. El material puede combinarse en cualquier orden con los componentes de la muestra de cristalización. Preferiblemente, el material se añadirá antes de que comience la nucleación o crecimiento de la cristalización.

La nucleación puede detectarse mediante cualquier medio adecuado; ya sea directamente, por ejemplo, usando un microscopio, o indirectamente, por ejemplo determinando las características de dispersión lumínica como se describe en Rosenberger et al J. Cryst. Growth 129:1-12 (1993); Saridakis et al Acta Cryst D 58, 1597-1600 (2002).

Los métodos de análisis de la estructura vítrea de un vidrio son bien conocidos en la técnica y se describen en detalle en Drenth, J. Principles of protein X-ray crystallography. Springer-Verlag, New York, 1994.

Un cuarto aspecto de la invención es una cámara apropiada para cristalizar una macromolécula en donde dicha cámara comprende (al menos en parte) un vidrio mesoporoso como el definido en relación con el primer y el segundo aspecto de la invención. La cámara puede fabricarse con el vidrio mesoporoso (al menos parcialmente; por ejemplo en forma de injerto), o el vidrio mesoporoso puede constituir un recubrimiento de la cámara (i.e. en una parte de la cámara que no esté hecha de vidrio mesoporoso). Debe observarse que el vidrio mesoporoso estará en una parte de la cámara que esté en contacto con la muestra de cristalización, al menos al comienzo del ensayo de cristalización.

Con "cámara apropiada para la cristalización" incluimos una cámara en una placa de cristalización o placa de cristalización multipocillo, o una cámara individual, como bien conocerán los expertos en la técnica. Por ejemplo, el cubreobjetos del que queda suspendida una gota en la cristalización "de gota colgante" (o en el que una gota puede posarse, en una cristalización "de gota posante") puede fabricarse o recubrirse con vidrio mesoporoso.

Las cámaras pueden fabricarse o recubrirse con el vidrio mesoporoso por medio de un procedimiento similar al que se describe en Roethen et al (2002) Biomaterials 23, 3871-3878. El recubrimiento puede ser un recubrimiento continuo o bien un recubrimiento con partículas del vidrio mesoporoso.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una fibra, malla o película que comprende un vidrio mesoporoso como se define en relación con el primer y el segundo aspecto de la invención. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de dicha fibra, malla o película como nucleante de la cristalización, por ejemplo en el método de la invención. La fibra puede ser una fibra hecha de un material diferente que esté recubierto con un vidrio mesoporoso (bien como una capa continua, bien con partículas de vidrio mesoporoso). Los vidrios crecen sobre la fibra, que puede extraerse lentamente por solución y entonces permitir un crecimiento continuo. Así, la fibra para nucleante es capaz de utilizarse en un procedimiento continuo.

El recubrimiento puede realizarse usando, por ejemplo, un método similar al que describen Stamboulin et al (2002) Adv Eng Met 105-109 y Roether et al (2002) Biomaterials 23, 3871-3878, pero sin limitarse a él.

Un quinto aspecto de la invención proporciona un uso en la cristalización de una macromolécula de un vidrio mesoporoso como queda definido en relación con el primer o el segundo aspecto de la invención o de una cámara como se define en el cuarto aspecto de la invención.

Las macromoléculas preferidas y los vidrios apropiados y preferidos están descritos arriba.

Los vidrios mesoporosos según se definen en relación con el primer y el segundo aspecto de la invención no han sido contemplados con anterioridad como nucleantes para la cristalización macromolecular. Su utilidad en la nucleación puede deberse a la capacidad de las macromoléculas de cristalizarse, encontrar un poro de un tamaño adecuado, ser retenidas por los poros y, como resultado, asociarse con otras macromoléculas similares. La retención de las macromoléculas en un poro forma una concentración local apropiada para la nucleación.

Un sexto aspecto de la invención proporciona un kit de partes que comprenden un agente de cristalización y un vidrio mesoporoso como el definido en relación con el primer o el segundo aspecto de la invención, o una cámara como la que se define en el quinto aspecto de la invención.

El almacenamiento de los nucleantes de vidrio mesoporoso preferiblemente debe hacerse en presencia de un polvo desecante indicador estándar.

Con "agente de cristalización" incluimos uno cualquiera o más de una gama de precipitadores como polímeros y solventes orgánicos y agentes de cristalización como sales. Ejemplos específicos de precipitadores apropiados incluyen polietilenoglicol 400, polietilenoglicol 4000, dihidrógeno-fosfato monosódico y sulfato de amonio.

Debe apreciarse que los kits de la invención son apropiados para todos los métodos de cristalización, incluyendo los métodos por microlotes, de gota colgante por difusión de vapor, gota posante, gota sandwich y cristalización libre por difusión de superficie. También sería posible insertar el nucleante de vidrio en gotas gelificadas.

Los kits de la invención pueden comprender además placas de cristalización o láminas y/o filtros o cámaras de cristalización. Cuando el kit comprende además placas de cristalización, es preferible que las placas sean placas multipocillo, lo cual sería particularmente apropiado para un sistema de análisis de alto rendimiento.

En una realización preferida de este aspecto, el kit comprende además aceite para recubrir la muestra de cristalización. Aceites apropiados incluyen parafina como la que está disponible de Hampton Research, CA 92677-3913 USA, número de catálogo HR3-411.

En una realización alternativa, el kit puede ser uno apropiado para el escrutinio de la cristalización de macromoléculas. En esta realización, el kit puede además incluir uno cualquiera o más de una gama de búferes (que pueden cubrir una variedad de valores de pH) y/o una cualquiera o más de una gama de sales. Los búferes y sales apropiados son bien conocidos en la técnica de la cristalización e incluyen, como búferes, Na-HEPES pH 7.5 y tris hidrocloruro pH 7.5, y, como sales, sulfato de amonio 0,2 M y trihidrato de acetato de sodio 0,2 M. Ventajosamente, el kit puede incluir adicionalmente filtros y placas de cristalización multipocillo.

Un séptimo aspecto de la invención proporciona un método automatizado para cristalizar una macromolécula consistente en añadir al ensayo de cristalización un vidrio mesoporoso como se ha definido en el primer y el segundo aspecto de la invención usando un sistema de dispensación automatizado.

Vidrios apropiados y preferidos son los que se han descrito anteriormente.

Ventajosamente, la cristalización es parte de una selección u optimización para las condiciones de cristalización.

El vidrio mesoporoso puede estar preparado para administrarlo al ensayo a través de cualquier medio apropiado. Preferiblemente, el vidrio mesoporoso está en forma de pequeños fragmentos de no más de 10 micrómetros en ninguna de sus dimensiones. En una realización preferida, el vidrio mesoporoso se prepara como se ha descrito arriba.

Debe observarse que el vidrio mesoporoso puede ser añadido como un único gránulo, partícula o pieza o bien puede añadirse suspendido en un líquido. Es difícil garantizar, o bien esto conlleva un grado de error tan alto que no es aceptable, que en un ensayo automatizado se dispense una sola partícula de tan solo 10 micrómetros de tamaño y no se añadan o bien ninguna partícula o bien demasiadas. Claramente, por tanto, una ventaja del método en el que el vidrio mesoporoso se añade en suspensión es que se puede manipular el vidrio mesoporoso con más facilidad, especialmente de forma automática mediante un sistema automatizado de suministro de líquido. La formación de una suspensión de partículas de vidrio mesoporoso en un líquido para dispensar un volumen concreto de líquido que incluya al menos 1 pieza o fragmento del vidrio mesoporoso, pero no demasiadas piezas o fragmentos, facilitaría el paso de añadir el fragmento a la muestra de cristalización.

De ahí que en una realización preferida de este aspecto de la invención, el vidrio mesoporoso sea dispensado como una suspensión mediante un sistema automatizado de dispensación de líquido.

En la técnica de cristalización de proteínas se conocen sistemas automatizados de dispensación de líquido, y un ejemplo es el sistema IMPAX producido por Douglas Instruments, Hungerford, Reino Unido. En este sistema a través de una misma boquilla pueden dispensarse en una sola gota de muestra diversos componentes de la muestra de cristalización que provienen de depósitos separados. De forma apropiada, el sistema automatizado útil en este aspecto de la invención es programable para que en la gota de cristalización puedan dispensarse unos volúmenes y concentraciones de líquido o suspensión determinados.

El ensayo de cristalización puede consistir en cualquier método apropiado, incluyendo microlotes (Chayen et al (1990) Appl. Cryst. 23:297; Chayen et al (1992) J. Crystal Growth 122:176) y difusión de vapor. El método de microlotes puede alterarse según lo descrito en D'Arcy et al (1996) J. Crystal Growth 168: 175-180 para usar una mezcla de silicio y aceite de parafina sobre la muestra de cristalización. Para mantener el nivel de supersaturación apropiado para el crecimiento del vidrio y que no induce nucleación, es preferible que el aceite a utilizar sea uno que no permita difusión apreciable de las moléculas de agua a la interfaz entre aceite y aire y, por tanto, que no fomente la concentración de los componentes de la muestra de cristalización. De modo que es preferible que el aceite sea una parafina ramificada en la escala C20+ y no un fluido de silicio (tal como un polímero de unidades de dimetilsiloxano).

Un octavo aspecto de la invención proporciona un vidrio obtenible u obtenido por el método del primero, el segundo o el octavo aspecto de la invención.

Como queda indicado arriba, es probable que el uso de vidrio mesoporoso en el material de cristalización haga que la macromolécula que se va a cristalizar nuclee dentro de la red de poros del material, y no en la superficie del vidrio mesoporoso. Consecuentemente, el vidrio resultante puede incluir un vidrio mesoporoso dentro de la estructura cristalina en sí del vidrio producido. Este vidrio puede ser distinto de los vidrios obtenidos con medios alternativos (como por ejemplo, usando una superficie mineral para inducir la nucleación), ya que el nucleante puede constituir una parte integral del vidrio en vez de una parte periférica.

Un aspecto más de la invención proporciona un uso para sistema automatizado de dispensación de líquido en el método del séptimo aspecto de la invención, en el que el vidrio mesoporoso a dispensar está en forma de suspensión.

Un "sistema automatizado de dispensación de líquido" incluye cualquier sistema automatizado de dispensación de líquido apropiado que sea capaz de dispensar un volumen de suspensión del material poroso que esté entre 2 nl y 1 ml, por ejemplo, entre 2 nl y 50 ó 20 nl, por ejemplo 5 nl o 10 nl (para ensayos con volumen bajo/flujo alto) o entre 0,05 ó 0,1 \mul y 1 ml (para ensayos con volúmenes más grandes). Preferiblemente el sistema es como el que se describe arriba.

La fibra, malla o película de la invención también puede usarse en un sistema automatizado.

La invención será explicada ahora más detalladamente con la ayuda de las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.

Quedan incorporados aquí por referencia los documentos aludidos.

Figura 1: Vidrios de alfa-curstacianina (de caparazón de langosta) cultivados en partículas de gel vítreo bioactivo CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2}. Los vidrios miden aprox. 140 x 80 x 40 \mum.

Figura 2: Isotermas de absorción de N_{2} para polvos de vidrio 58S (mesoporoso) y 45S5 (control).

Figura 3: Distribuciones de tamaños de poro de vidrios 58S y 45S5.

Figura 4: Diagrama esquemático de una sección transversal del vidrio mesoporoso (no nucleante) que posee una estrecha distribución de tamaños de poro.

Figura 5: Diagrama esquemático de un vidrio mesoporoso nucleante con una amplia distribución de diámetros de poro, de 7 a 40 nm.

Ejemplo 1

Método para cristalizar crustacianina usando vidrio mesoporoso CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} como nucleante

Los materiales ensayados como nucleantes eran partículas de gel vítreo bioactivo CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2}. Uno (58S) presenta una distribución de poros como la descrita en el Ejemplo 2, y el otro (45S5; control) no presenta poros detectables, como se describe en el Ejemplo 2.

El vidrio mesoporoso nucleante CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} (58S) fue preparado por hidrolización de teraetilortosilicato (TEOS) con H_{2}O en presencia de HNO_{3} como catalizador. El precursor de P2O5 fue trietoxilortofosfato (TEP) y el precursor de CaO fue Ca(NO3)2.4H_{2}O. El gel fue puesto a secar a 60ºC y 130ºC y estabilizado a 100ºC para eliminar el agua de los poros y las superficies de los poros.

El vidrio bioactivo 45S5 fue preparado fundiendo SiO_{2}, P_{2}O_{5}, CaCO_{3} and Na_{2}CO_{3} en un crisol de platino a 1350ºC y templando con agua el vidrio fundido para hacer una frita que a continuación se tritura para formar las partículas no porosas.

La proteína empleada (alfa-crustalcianina) por la noche tiende a producir lluvia de vidrios en desorden. Se ensayó si, usando los nucleantes vítreos, podrían obtenerse vidrios unitarios más grandes en condiciones de baja supersaturación, los cuales producirían si no gotas claras.

Se establecieron dos conjuntos de gotas de control: (1) En condiciones de supersaturación que producen la lluvia de vidrios. (2) En condiciones de baja supersaturación (i.e. menor concentración de precipitante o lo que se denomina condiciones metaestables).

Otras gotas del mismo preparado de proteínas fueron puestas en las mismas condiciones que (2) pero un conjunto de gotas contenía el vidrio mesoporoso CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} (añadido a la gota en 1 ó 2 gránulos), mientras que al otro conjunto de gotas no se la habían añadido gránulos de vidrio mesoporoso. El control (1), como se esperaba, produjo lluvias de vidrios durante la noche. El control (2) permaneció claro indefinidamente.

Las gotas que contenían el nucleante poroso produjeron vidrios individuales grandes después de 2-3 días. Figura 1.

Las gotas que contenían el vidrio bioactivo (no poroso) 45S5 se mantuvieron claras como si no se les hubiera añadido nucleante.

Los métodos usados fueron difusión de vapor y microlotes con gotas de 2 \mul en cada caso. Los ensayos se incubaron a 10 y 4ºC. Las condiciones de supersaturación que dieron lugar a los vidrios por la noche fueron:

proteína 20 mg/ml 15% PEG éter monometilo 0.1 M MES buffer pH 6.5 y cloruro de zinc 10 mM.

Las condiciones metaestables en las que se insertaron los nucleantes fueron:

proteína 20 mg/ml 12,5% PEG éter monometilo 0.1 M MES buffer pH 6.5 y cloruro de zinc 10 mM.

Métodos de caracterización del vidrio Adsorción de N_{2}

La adsorción de gas ejecutada usando gas N_{2} en un sistema de absorción de gas Autosorb AS6B-KR Quantachrome de seis puertos. El instrumentó determinó las isotermas volumétricamente por medio de un método estático discontinuo a 77 K (manual de Quantachrome N2 Adsorption. Autosorb 6®, Quantachrome Corp. USA, 1997). Como gas adsortivo se usó N_{2} con un área transversal de 0,162 nm^{2} (Lowell y Shields Powder Surface Area and Porosity 1984).

Se proporcionan otros detalles en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2

Medición de las características de los poros Adsorción de N_{2}

La absorción de gas ejecutada usando gas N_{2} en un sistema de absorción de gas Autosorb AS6B-KR Quantachrome de seis puertos. El instrumentó determinó las isotermas volumétricamente por medio de un método estático discontinuo a 77,4 K [1]. Como gas adsortivo se usó N_{2} con un área molecular transversal de 0,162 nm^{2} [2].

Antes de la adsorción de N_{2} todas las muestras fueron desgasificadas (i.e. exponiendo los monolitos a una presión al vacío inferior a 1 Pa a temperatura elevada) a 100ºC durante la noche (aprox. 16-20 horas). Esto se hizo para eliminar de las superficies de la muestra gases adsorbidos físicamente, en particular, el vapor de agua [2]. Las áreas de superficie específicas se determinaron con respecto a las masas de las muestras desgasificadas.

Cada isoterma comprendía un mínimo de de 20 puntos de adsorción y 20 de desorción medidos en equilibrio. Para el cálculo del área superficial BET se usaron al menos 4 puntos de adsorción en la escala de presión relativa 0,05 <P/P_{0} <0,30 (donde P_{0} es la presión de vapor saturado) [3] [4]. Se comprobó en cada caso que la pendiente y la ordenada en el origen de la recta de regresión de los puntos BET fuera positiva y que los coeficientes correlativos de regresión lineal no fueran inferiores a 0,99991 [1]. Se obtuvieron tres isotermas de cada composición para asegurar que los datos fueran representativos. A partir de la cantidad de nitrógeno tomada por la muestra en una escala de presión relativa de 0,994 < P/P_{0} < 0,999 se pudo calcular el volumen de poro específico [1]. Las distribuciones del tamaño de poro se calcularon usando el método BJH con los datos de desorción [5].

Resultados - Adsorción de N_{2} Isotermas

Las isotermas mostradas en la Figura 2 son las que se obtuvieron para el vidrio derivado de fusión 45S5 y para los polvos de vidrio de sol-gel. El vidrio derivado de fusión mostró una adsorción muy reducida, formación principalmente en una sola capa seguida de saturación, revelando unos niveles insignificantes de porosidad. Por el contrario, la isoterma de la muestra de 58S corresponde al Tipo IV de la clasificación IUPAC, que indica que los adsorbentes porosos poseen poros con un radio en la escala de 20 a 500 \ring{A} (diámetro en la escala de 4 a 100 nm) (i.e. las muestras son mesoporoas) [3]. La histéresis en la zona multicapa de la isoterma está asociada a la condensación capilar de N_{2} durante el llenado y vaciado de los mesoporos de la estructura. El bucle de histéresis observado aquí es del tipo H1 [3]. Esto indica que los materiales analizados contenían poros cilíndricos abiertos.

En la Figura 3 se representa la distribución de tamaño de poro en los geles vítreos, calculada usando el model BJH [5] en la rama de desorción de la isoterma N_{2}.

Resumen

1

Referencias

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[2]. Lowell S, Shields JE. Powder Surface Area and Porosity. Chapman and Hall 1984.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

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Claims (23)

1. Un método para facilitar la cristalización de una macromolécula que comprende el paso de añadir un vidrio mesoporoso a una muestra de cristalización en el que el vidrio mesoporoso comprende poros con diámetros entre 4 nm y 100 nm y tiene un área superficial de al menos 50 m^{2}/g.

2. Un método para facilitar la cristalización de una macromolécula que comprende el paso de añadir a la muestra de cristalización un vidrio mesoporoso de la composición SiO_{2}; CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2},

donde cada uno de los átomos de Ca, P, Si o Na de las composiciones pueden ser sustituidos por un átomo apropiado elegido entre B, Al, Ti, Mg o K,

y, opcionalmente, la composición puede incluir también elementos pesados como Ag, Au, Cr, Co, Sr, Ba, Pt, Ta u otro átomo con un número atómico superior a 20 para realzar el contraste de difracción de rayos X.

3. Un método según la Reivindicación 2 en el que el vidrio mesoporoso es de la composición SiO_{2}; CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2} o Na_{2}O-CaO-P_{2}O_{5}-SiO_{2}.

4. Un método según las Reivindicaciones 2 ó 3 en el que el vidrio mesoporoso comprende poros con diámetros entre 2 nm y 200 nm.

5. Un método según la Reivindicación 4 en el que el diámetro de los poros tiene una desviación estándar de al menos 10 nm.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el vidrio mesoporoso tiene poros interconectados que interseccionan con la superficie del vidrio.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la cristalización de la macromolécula es inducida a un nivel crítico de supersaturación inferior al alcanzado cuando no se añade el vidrio mesoporoso a la muestra.

8. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones de 1 a 7 que comprende el paso de fracturar el vidrio mesoporoso en piezas de dimensiones submilimétricas antes de añadir el vidrio mesoporoso a la muestra de cristalización.

9. Un método según la Reivindicación 8 en el que las piezas no miden más de 200 micrómetros en ninguna de sus dimensiones.

10. Un método según la Reivindicación 9 en el que las piezas no miden más de 100 micrómetros en ninguna de sus dimensiones.

11. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones de 8 a 10 en el que la fractura se hace cortando con un escalpelo o por medios mecánicos (cortadora de diamante), o bien rompiendo una pieza grande en piezas pequeñas usando unas pinzas o triturando con una pequeña carga.

12. Un método para determinar la estructura de una macromolécula que comprende los pasos de:

(1)

cristalizar la macromolécula en presencia de un vidrio mesoporoso como se ha definido en la Reivindicación 1 ó 2; y

(2)

analizar la estructura cristalina del vidrio producido en el paso (1).

13. Una cámara apropiada para cristalizar una macromolécula, o bien una fibra, película o malla, en la que dicha cámara, fibra, película o malla comprende un vidrio mesoporoso como el definido en relación con las Reivindicaciones 1 ó 2.

14. Una cámara, fibra, película o malla según la Reivindicación 13 en la que el vidrio mesoporoso forma un recubrimiento en la cámara, fibra, película o malla.

15. Uso de un vidrio mesoporoso como se define en relación con la Reivindicación 1 ó 2, o de una cámara, fibra, película o malla según las Reivindicaciones 13 ó 14 en la cristalización de una macromolécula.

16. Un kit de partes que comprende un agente de cristalización y un vidrio mesoporoso como se define en relación con las Reivindicación 1 ó 2 o una cámara como se define en la Reivindicación 13 ó 14.

17. Un método automatizado para cristalizar una macromolécula que comprende la adición de un vidrio mesoporoso como se define en relación con las Reivindicaciones 1 ó 2 a un ensayo de cristalización usando un sistema de dispensación automatizado.

18. Un método según la Reivindicación 17 en el que la cristalización se hace en una selección u optimización.

19. Un método según la Reivindicación 17 ó 18 en el que el vidrio mesoporoso es añadido como una suspensión en un líquido.

20. Un método según las Reivindicaciones de 1 a 3 ó 12 o de 17 a 19, o bien un uso según la Reivindicación 13, o bien un kit según una cualquiera de las Reivindicaciones de 14 a 16 en el que el vidrio mesoporoso como se define en relación con las Reivindicaciones 1 ó 2 es preparado según el método de una cualquiera de las Reivindicaciones de 8 a 11.

21. Un método según las Reivindicaciones de 1 a 3 ó 12 o de 17 a 19, o bien un uso según la Reivindicación 13, en el que la macromolécula es una macromolécula biológica.

22. Un método o uso según la Reivindicación 21 en el que la macromolécula es una proteína.

23. Uso de un sistema automatizado de dispensación de líquido para dispensar un vidrio mesoporoso poroso según el método de la Reivindicación 19.