ES2304874B1 - Procedimiento de deteccion y cuantificacion simultanea de adn proveniente de trigo, cebada, centeno, sus cruces y sus mezclas en alimentos, elementos necesarios para llevarlo a cabo y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección y cuantificación
simultánea de ADN proveniente de trigo, cebada, centeno, sus cruces
y sus mezclas en alimentos, elementos necesarios para llevarlo a
cabo y sus aplicaciones.
La presente invención describe un procedimiento
para la detección y cuantificación de ADN proveniente de trigo,
centeno, cebada, triticale y sus mezclas caracterizado porque es una
detección y cuantificación simultánea de ADN mediante PCR
cuantitativa en tiempo real utilizando los primers o cebadores
específicos de una región conservada en trigo, centeno, cebada y
triticale. El presente método y los reactivos utilizados son útiles
herramientas para la determinación de gluten en alimentos, lo que
permitirá un mejor control sanitario de los alimentos dirigidos a
enfermos celiacos.
Description
Procedimiento de detección y cuantificación
simultánea de ADN proveniente de trigo, cebada, centeno, sus cruces
y sus mezclas en alimentos, elementos necesarios para llevarlo a
cabo y sus aplicaciones.
Esta invención se relaciona, en general, con el
análisis de alimentos para enfermos celiacos y, en particular, se
refiere a un procedimiento para la detección y cuantificación de
gluten en alimentos mediante PCR, elementos necesarios para
llevarlo a cabo y sus aplicaciones. Más concretamente dicho
procedimiento permite la identificación de trigo, cebada y centeno
en alimentos libres del gluten y el control sanitario de los mismos
para el mercado de los enfermos celiacos.
La Enfermedad Celíaca (EC) consiste en una
intolerancia al gluten de carácter permanente. El único tratamiento
médico para esta enfermedad crónica consiste en eliminar de la
dieta aquellos cereales que contienen gluten, como son el trigo, la
cebada, el centeno y todos los productos elaborados a partir de
ellos. Convencionalmente se han venido utilizando métodos
inmunológicos (basados en anticuerpos), tipo ELISA (EnzymeLinked
ImmunoSorbent Assay o inmunoensayo ligado a enzima) o
Western Blot, para detectar/cuantificar el gluten (Skerritt
JH, Hill AS: "Enzyme immunoassay for determination of gluten in
foods: collaborative study". J Asso Off Ana Chem, 1991,
74: 257; Valdés I, García E, Llorente M, Méndez E: "Innovative
approach to low-level gluten determination in foods
using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent
assay protocol". Eur J Gastroenterol Hepatol, 2003, 15:
465-474). Debido a la gran complejidad de los
alimentos, con frecuencia se originan falsos positivos/negativos
por estas técnicas. De aquí se deriva la necesidad de desarrollar
sistemas no inmunológicos complementarios y alternativos que
confirmen los resultados de los métodos inmunológicos. El grupo de
investigación de la Unidad de Gluten (UG) del Centro Nacional de
Biotecnología (CNB-CSIC) ha sido pionero en la
utilización de la Espectrometría de Masas MALDI-TOF
(EM MALDI-TOF) como herramienta no inmunológica
para la detección de gluten en alimentos dietéticos para enfermos
celiacos (Camafeita E, Alfonso P, Mothes T, Méndez E:
"MALDI-TOF mass spectrometric
micro-analysis: the first
non-immunological alternative attempt to quantify
gluten gliadins in food samples". J Mass Spectrom, 1997,
32 (9): 940-7; Méndez E, Valdés I, Camafeita E:
"Analysis of gluten in foods by MALDI-TOF mass
spectrometry". Methods in Molecular Biology, Vol. 146,
New Mass Spectrometric Applications, Chapman JR (ed).
Humana Press: Totowa, NJ, 2000: 355-367; Hernando
A, Valdés I, Méndez E: "New strategy for the determination of
gliadins in maize- or rice-based foods
matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry:
fractionation of gliadins from maize or rice prolamins by acidic
treatment". J Mass Spectrom, 2003, 38:
862-871). Sin embargo, los ingredientes tan
complejos y variados hacen que este sistema no inmunológico no
detecte gluten a niveles inferiores a las 40-50 ppm
(partes por millón), dificultando la confirmación de los datos del
ELISA a niveles bajos.
Recientemente se han desarrollado varios métodos
no inmunológicos de detección (cualitativa y cuantitativa) del ADN
de los cereales que contienen gluten (trigo, cebada y centeno).
Estos métodos están basados en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa o PCR (del inglés, Polymerase Chain Reaction),
técnica de amplificación de ácidos nucleicos utilizada en el
análisis de alimentos para la detección de agentes
infecciosos/toxiinfecciosos, detección de transgénicos o GMOs, y en
la identificación de especies (autentificación). Köppel y
colaboradores utilizaron la PCR combinada con geles de agarosa para
detectar contaminaciones de trigo en alimentos de avena (Hernando
A, Valdés I, Méndez E: "New strategy for the determination of
gliadins in maize- or rice-based foods
matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry:
fractionation of gliadins from maize or rice prolamins by acidic
treatment". J Mass Spectrom, 2003, 38:
862-871). Tres años más tarde se desarrolló el
primer sistema de PCR cuantitativa para la detección simultánea de
contaminaciones de trigo, cebada y centeno en alimentos dietéticos
para enfermos celiacos (Köppel E, Stadler M, Lüthy J, Hübner P:
"Detection of wheat contamination in oats by polymerase chain
reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA)". Z Lebensm Unters Forsch A, 1998, 206:
399-403). Este sistema estaba basado en la PCR
competitiva o QC-PCR (Dahinden I, Buren Mv, Lüthy J:
"A quantitative competitive PCR system to detect contamination
of wheat, barley or rye in gluten-free food for
coeliac patients". Eur Food Res Technol, 2001, 212:
228-233), que también utiliza PCR y geles de
agarosa. Dahinden y colaboradores utilizaron previamente primers
específicos para detectar simultáneamente contaminaciones de trigo,
cebada y centeno en alimentos dietéticos para enfermos celiacos y
desarrollaron el primer sistema de PCR cuantitativa para la
detección simultánea de contaminaciones de trigo, cebada y centeno
en alimentos dietéticos para enfermos celiacos. El sistema estaba
basado en la PCR competitiva o QC-PCR, que utiliza
PCR a punto final y visualiza los productos de amplificación en
geles de agarosa. Como técnica complementaria se utilizó un ELISA
contra las \omega-gliadinas y se analizaron un
total de 15 productos dietéticos "sin gluten". La sensibilidad
del sistema de Dahinden se determinó en 20 pg de ADN de trigo y 2
pg de ADN de cebada/centeno.
Los sistemas que utilizan PCR y geles de agarosa
tienen una serie de inconvenientes: (a) son laboriosos y necesitan
mucho tiempo, (b) el número de muestras que se puede analizar a la
vez es muy limitado, y (c) el bromuro de etidio usado en los geles
es mutagénico y, por lo tanto, no recomendado para laboratorios de
control de calidad (que manejan muchas muestras al día).
En el 2003 se publicaron cuatro sistemas
individuales de PCR cuantitativa en tiempo-real
(Q-PCR), uno para la detección de contaminaciones
de trigo, otro de cebada, otro de centeno y otro de avena (Stüder
E, Rhymer C, Luthy J, Hubner P: "Quantitative competitive PCR for
the detection of genetically modified soybean and maize". Z
Lebensm Unters Forsch, 1998, 207: 207-213).
Estos cuatro sistemas no cuantifican el ADN de estos cereales, sino
que simplemente diferencian si la contaminación es de trigo,
cebada, centeno o avena, a través de la temperatura de
melting (T_{m}) de los productos de amplificación (Trigo
\rightarrow 84,3ºC; Cebada \rightarrow 85,0ºC; Centeno
\rightarrow 81,5ºC; Avena \rightarrow 81,2ºC).
Recientemente se han publicado un par de
sistemas de detección y cuantificación de ADN de trigo y cebada
basados en la tecnología de la Q-PCR y en las
sondas fluorescentes TagMan®. El primer sistema cuantifica
trigo y cebada de forma independiente (Hernández M, Esteve T, Pla
M: "Real-Time Polymerase Chain Reaction based
assays for quantitative detection of barley, rice, sunflower, and
wheat". J Agric Food Chem, 2005, 53:
7003-9) y el segundo sistema cuantifica trigo y
cebada de forma simultánea, con una única pareja de primers
(Ronning SB, Berdal KG, Andersen CB, Holst-Jensen
A: "Novel reference gene, PKABA1, used in a duplex
Real-Time Polymerase Chain Reaction for detection
and quantitation of wheat- and barley-derived
DNA". J Agric Food Chem, 2005, 54: 682-7).
Sin embargo, estos sistemas suelen ser menos sensibles que aquellos
que utilizan otros marcadores de ADN (por ejemplo, el SYBR® Green
I), no siendo adecuado su uso para el análisis de alimentos "sin
gluten" donde suelen existir pequeñas contaminaciones de trigo,
cebada y/o centeno, pero que son suficientes para generar graves
problemas al colectivo celiaco si no son eliminados del mercado
mediante los controles sanitarios adecuados.
Un objeto de la invención lo constituye un
procedimiento para la detección y cuantificación de ADN proveniente
de trigo, centeno, cebada, triticale y sus mezclas, en adelante
procedimiento de la invención, caracterizado porque es una
detección y cuantificación simultánea de ADN en tiempo real y
porque comprende las siguientes etapas:
a) extracción del ADN de una muestra de
alimento, mediante una etapa previa de homogenización de las
muestras, y una etapa propiamente de extracción de ADN de las
muestras que comprende:
- -
- la adición a la muestra homogenizada de los reactivos de extracción en el siguiente orden y cantidades adecuadas: tampón de extracción TNE [Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 1% (w/v)], proteinasa K 20 mg/ml e hidrocloruro de guanidina 5 M,
- -
- agitación durante 10-30 segundos hasta resuspender completamente la muestra,
- -
- calentamiento de la mezcla 30 minutos a 100ºC con agitación (1.400 rpm),
- -
- enfriamiento de las muestras 10 minutos a 4ºC, centrifugación durante 15 minutos a 13.200 rpm/16.000 g a temperatura ambiente, y captura de los sobrenadantes (extractos de ADN de las muestra) para la realización de la siguiente etapa o su conservación a -20ºC para su uso posterior,
b) realización de una PCR cuantitativa en tiempo
real utilizando los primers o cebadores específicos de una región
del intrón del gen cloroplastidial trnL conservada en trigo,
centeno, cebada y triticale; la muestra de ADN a analizar, un
control de ADN de estos cereales, y una curva estándar de ADN de
trigo/cebada/centeno y los controles adecuados, que comprende:
- b.1.-
- preparación de la muestra de reacción de PCR mediante la mezcla de los distintos extractos de ADN, incluido el de la muestra problema, con la solución de reacción de Q-PCR y los primers o cebadores específicos mencionados, y
- b.2.-
- ejecución de la reacción de amplificación del ADN por PCR cuantitativa mediante un sistema que utilice un marcador de doble cadena de ADN, y
c) Análisis de los productos de amplificación
del ADN mediante:
- c.1.-
- Curvas de disociación, y/o
- c.2.-
- Electroforesis en geles de agarosa teñidos con un marcador de ADN que incremente su sensibilidad.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde el sistema de PCR
cuantitativa utiliza un fluoróforo perteneciente al grupo de los
marcadores que se unen al surco menor del ADN de doble cadena.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde los cebadores
específicos utilizados en la PCR de b.1) son los cebadores WBR.F8
(SEQ ID NO1) y WBR.R8 (SEQ ID NO2).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde la reacción de
Q-PCR se llevó a cabo con el siguiente protocolo de
amplificación: 1 ciclo de 10 minuto a 95ºC y 35 ciclos de 15
segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. El registro de la fluorescencia
emitida por el fluoróforo se realizó al final de cada etapa de
hibridación o annealing.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde el marcador que
se utiliza para la tinción de los de geles de agarosa pertenece al
grupo de reactivos que se unen al surco menor del ADN de doble
cadena.
Otro objeto de la invención lo constituye el uso
del procedimiento de la invención para la determinación de gluten
en alimentos.
La invención se enfrenta con el problema de
desarrollar nuevos y más sensibles procedimientos para la detección
e identificación de gluten en alimentos.
El procedimiento proporcionado se basa en que,
aunque no como aportación novedosa única, los inventores han
utilizado una región del ADN conservada entre las distintas
especies de trigo, centeno, cebada y triticale que permite el
diseño de secuencias de ADN útiles para la identificación
simultánea de dicha región en muestras de distinto origen,
preferentemente alimentos, como parte de un procedimiento para la
detección e identificación de alimentos que contienen gluten (ver
Figura 1 y 9). La identificación de ADN de estos cereales está
asociada a la presencia de gluten proveniente de los mismos en los
alimentos analizados, habiéndose observado además por primera vez
que existe una buena correlación entre la cuantificación de ADN y
proteína (Ejemplo 3).
Como una aportación adicional, el método de
extracción de ADN optimizado a partir del SDS/Proteinasa K/
Guanidina, que forma parte del procedimiento de la invención, es más sencillo, rápido, barato y eficiente que el original Köppel y col., 1998) (Ejemplo 1.1). Así, este método de extracción de ADN del procedimiento de PCR-gluten no requiere una etapa de purificación previa al análisis por PCR, con el correspondiente beneficio en la recuperación del ADN (entre el 81 y el 105%, ver Figura 8). Sin embargo, lo más novedoso es que se ha aumentado en un 40% el rendimiento de extracción de ADN del método SDS/Proteinasa K/Guanidina al aumentar la temperatura de incubación de 60ºC (sistema convencional) a 100ºC (Figura 7). En el caso de la harina de trigo duro, y en las condiciones óptimas de incubación (30 minutos a 100ºC), el rendimiento era mayor si se extraía la muestra con 400 \mul de reactivos de extracción en lugar de 800 \mul (Figura 7.A). Sin embargo, en 11 de 22 alimentos analizados, los rendimientos de las muestras extraídas con 800 \mul de reactivos de extracción fueron notoriamente más altos que los obtenidos con 400 \mul (Figura 7B). Conforme a los resultados obtenidos, es más conveniente emplear 800 \mul de reactivos de extracción como volumen de extracción óptimo.
Guanidina, que forma parte del procedimiento de la invención, es más sencillo, rápido, barato y eficiente que el original Köppel y col., 1998) (Ejemplo 1.1). Así, este método de extracción de ADN del procedimiento de PCR-gluten no requiere una etapa de purificación previa al análisis por PCR, con el correspondiente beneficio en la recuperación del ADN (entre el 81 y el 105%, ver Figura 8). Sin embargo, lo más novedoso es que se ha aumentado en un 40% el rendimiento de extracción de ADN del método SDS/Proteinasa K/Guanidina al aumentar la temperatura de incubación de 60ºC (sistema convencional) a 100ºC (Figura 7). En el caso de la harina de trigo duro, y en las condiciones óptimas de incubación (30 minutos a 100ºC), el rendimiento era mayor si se extraía la muestra con 400 \mul de reactivos de extracción en lugar de 800 \mul (Figura 7.A). Sin embargo, en 11 de 22 alimentos analizados, los rendimientos de las muestras extraídas con 800 \mul de reactivos de extracción fueron notoriamente más altos que los obtenidos con 400 \mul (Figura 7B). Conforme a los resultados obtenidos, es más conveniente emplear 800 \mul de reactivos de extracción como volumen de extracción óptimo.
En segundo lugar, en la presente invención se ha
diseñado una única pareja de cebadores o primers que han permitido
el desarrollo y optimización del primer método de detección y
cuantificación simultánea de ADN de trigo, cebada, centeno,
triticale y sus mezclas basado en la tecnología de la PCR
cuantitativa en tiempo-real y en el SYBR® Green I.
De esta manera, este procedimiento simultáneo es capaz de detectar
y cuantificar, en una única reacción de Q-PCR,
contaminaciones de trigo/cebada/centeno/triticale en alimentos,
preferentemente alimentos dietéticos para enfermos celiacos.
Inicialmente, se empleó el bromuro de etidio
como agente intercalante para detectar la cantidad de ADN que se
formaba en cada ciclo de reacción, y con posterioridad se
comenzaron a utilizar el Hoeschst 33258, el SYBR® Green I y el
YOPRO-1. En la actualidad, el SYBR® Green I
es el marcador de ADN más utilizado en Q-PCR, el
cual se une preferentemente al ADN de doble cadena. Al unirse al
ADN de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo de PCR, este
reactivo emite una fluorescencia cuando se ilumina o irradia con
luz o energía electromagnética, proporcional a la concentración de
ADN. Este sistema permite distinguir fácilmente las señales
obtenidas a partir de distintos productos de PCR a partir de sus
distintas temperaturas de melting.
Los cebadores de este procedimiento de
PCR-gluten reconocen una secuencia del intrón del
gen cloroplastidial trnL conservada en el trigo, la cebada, el
centeno y sus cruces. El objetivo de esta etapa fue buscar una
secuencia común entre los genomas de las especies de trigo
(Triticum spp), cebada (Hordeum vulgare) y centeno
(Secale cereale). Entre las secuencias disponibles en las
bases de datos genéticas, se seleccionó el "intrón del gen
cloroplastidial trnL", secuencia utilizada previamente por
Dahinden y colaboradores en 2001 para detectar simultáneamente
contaminaciones de trigo, cebada y centeno en alimentos dietéticos
para enfermos celiacos. Los primers de Dahinden y
colaboradores amplifican una región de unas 200 pares de bases (pb)
localizada al principio de la secuencia del intrón, mientras que
las \sim80 pb de los productos de amplificación del sistema PCR
de la presente invención se localizan al final de la secuencia del
intrón (véase el alineamiento adjunto, Figura 1 y 9).
Los primers de Dahinden podrían ser
utilizados en PCR cuantitativa en tiempo-real
(Q-PCR), pero se necesitaría de un largo proceso de
adaptación y optimización, tanto de los reactivos como de las
condiciones de Q-PCR. De todas formas, no se podría
mejorar la sensibilidad del sistema (20 pg de ADN de trigo y 2 pg
de ADN de cebada/centeno). Por otro lado, el tamaño del producto de
amplificación (200 pb) haría difícil la detección de
contaminaciones de trigo, cebada y centeno en alimentos tratados
con calor, donde las moléculas de ADN suelen estar parcialmente
degradadas y/o fragmentadas, lo cual se resuelve utilizando un
producto de amplificación más pequeño como marcador de gluten.
De esta manera, los cebadores obtenidos tal como
se ha comentado y utilizados en este nuevo procedimiento de
PCR-gluten (por ejemplo, y de forma preferentemente
el cebador WBR.F8 y el cebador WBR.R8, SEQ ID NO1 y SEQ ID NO2,
respectivamente; ver Ejemplo 1) detectan ADN de cereales de trigo,
cebada, centeno y triticale. Por el contrario, no detecta ADN de
otros cereales (avena, maíz, arroz, alforfón, soja y altramuz) lo
que indica la elevada especificidad del sistema descrito en la
presente invención para discriminar aquellos alimentos dietéticos
dedicados a enfermos celiacos. Sin embargo, estos cebadores no
permiten la detección de contaminaciones de trigo, cebada y centeno
en aquellos alimentos en los que el ADN está total o parcialmente
hidrolizado, como es el caso de las cervezas, los siropes, los
extractos de malta, y los cereales para el desayuno.
La sensibilidad de este procedimiento de
PCR-gluten es de 5 picogramos de ADN por reacción,
equivalente a 0,5 nanogramos de ADN por miligramo de muestra. Esta
sensibilidad permite "cuantificar" contaminaciones de trigo,
cebada y centeno en alimentos con niveles de gluten entre las 200 y
las 20 ppm (partes por millón), que es el rango que permite el
Codex Alimentarius en los alimentos dietéticos para enfermos
celiacos. Se diferencian dos zonas o regiones: una de
cuantificación, que va desde 10.000 hasta 5 picogramos, y otra de
detección, por debajo de los 5 picogramos (Figura 2B). La
sensibilidad de los productos de amplificación del procedimiento de
PCR-gluten de la presente invención, visualizados
en geles de agarosa teñidos con SYBR® Green I, permite
"detectar" contaminaciones de trigo, cebada y centeno por
debajo del límite de detección de 0,5 nanogramos de ADN por
miligramo de muestra, equivalente a 20-10 ppm de
gluten.
Adicionalmente, la diferencia de temperaturas de
melting de los productos de amplificación del procedimiento
de PCR-gluten de la presente invención, entre el
trigo/cebada (72,0ºC) y el centeno (72,7ºC), permite discriminar si
una muestra tiene trigo/cebada o tiene centeno.
Otra tercera aportación en el procedimiento de
PCR-gluten descrito en la presente invención es que
se ha elaborado y utilizado por primera vez un estándar de ADN
basado en una mezcla o pool de los ADNs purificados de 33
variedades distintas: 25 de trigo, 4 de cebada y 4 de centeno
(Ejemplo 1, Figura 2A). Mediante diluciones seriadas de este
estándar se elabora la curva de calibrado externa, con la cuál se
cuantifica (de forma absoluta) el ADN de trigo/cebada/centeno
presente en los alimentos. Esto añade robustez al procedimiento
desarrollado y confirma la especificidad del sistema para
identificar ADN de distintas variedades de estos cereales.
Por último, existe una alta correlación entre
los datos de gliadinas (determinados por ELISA-R5)
y ADN (determinados por el procedimiento de
PCR-gluten) en los alimentos no tratados con calor
(Figura 5A). Hay que destacar que esta es la primera vez que se
contrasta la información proporcionada por un método inmunológico
de cuantificación de gluten (ELISA-R5 Sándwich) con
un sistema de cuantificación simultáneo de ADN de trigo, cebada y
centeno basado en la tecnología de la PCR cuantitativa en
tiempo-real. Además, este procedimiento de
PCR-gluten de la presente invención tiene la
ventaja de detectar ADN de trigo, cebada y centeno incluso en
alimentos tratados con calor, a pesar de que el ADN puede estar
parcialmente degradado y/o fragmentado. En estos alimentos la
correlación entre los datos de gliadinas y ADN no es del todo
lineal (Figura 5B).
Se puede concluir que este procedimiento de
PCR-gluten de la presente invención se puede
utilizar como técnica no inmunológica complementaria, por ejemplo
al ELISA-R5 Sándwich, en el análisis de alimentos
dietéticos para enfermos celiacos.
Finalmente, se compararon los resultados
obtenidos mediante el procedimiento de Q-PCR de la
presente invención que identifica la presencia simultánea de trigo,
centeno, cebada y sus cruces, con la realización de los distintos
Q-PCR individuales para cada uno de los cereales
mencionados. Como se puede observar en la Tabla 2, existe una buena
correlación entre los sistemas individuales y el sistema
simultáneo (entre un 83 y un 146%.) Estos resultados son muy buenos
si se tiene en cuenta que las reproducibilidades de los métodos
desarrollados rondan entre el 11,01 y el 15,02% de coeficiente de
variación.
Los sistemas individuales de
Q-PCR de trigo, cebada y centeno son útiles para
analizar muestras de alimentos contaminados con un solo tipo de
cereal. Sin embargo, subestiman el contenido de ADN en aquellas
muestras de alimentos que contienen una mezcla de estos tres
cereales. En la práctica, cuando se analizan muestras de alimentos,
no se conoce la procedencia de la contaminación (si es de trigo,
de cebada, de centeno o de sus mezclas). Por lo tanto, siempre va a
ser necesario el planeamiento del uso inicial de los tres sistemas
individuales.
El sistema simultáneo de Q-PCR
podría llegar a sustituir a los tres sistemas individuales. Este
sistema utiliza un único par de cebadores capaces de detectar y
cuantificar, en una única reacción de Q-PCR,
contaminaciones de trigo, cebada y/o centeno en alimentos, con el
correspondiente ahorro de tiempo y dinero. Sin embargo, con el
sistema simultáneo de Q-PCR no se puede calcular el
porcentaje de contaminación de cada cereal. Por lo tanto, los
sistemas individuales de Q-PCR proporcionan más
información, al cuantificar por separado las cantidades de ADN de
trigo, cebada y centeno.
Por tanto, un objeto de la invención lo
constituye un procedimiento para la detección y cuantificación de
ADN proveniente de trigo, centeno, cebada, triticale y sus
mezclas, en adelante procedimiento de la invención, caracterizado
porque es una detección y cuantificación simultánea de ADN en
tiempo real y porque comprende las siguientes
etapas:
etapas:
\global\parskip0.930000\baselineskip
a) extracción del ADN de una muestra de
alimento, mediante una etapa previa de homogenización de las
muestras, y una etapa propiamente de extracción de ADN de las
muestras que comprende:
- -
- la adición a la muestra homogenizada de los reactivos de extracción en el siguiente orden y cantidades adecuadas: tampón de extracción TNE [Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 1% (w/v)], proteinasa K 20 mg/ml e hidrocloruro de guanidina 5 M,
- -
- agitación durante 10-30 segundos hasta resuspender completamente la muestra,
- -
- calentamiento de la mezcla 30 minutos a 100ºC con agitación (1.400 rpm),
- -
- enfriamiento de las muestras 10 minutos a 4ºC, centrifugación durante 15 minutos a 13.200 rpm/16.000 g a temperatura ambiente, y captura de los sobrenadantes (extractos de ADN de las muestra) para la realización de la siguiente etapa o su conservación a -20ºC para su uso posterior,
b) realización de una PCR cuantitativa en tiempo
real utilizando los primers o cebadores específicos de una región
del intrón del gen cloroplastidial trnL conservada en trigo,
centeno, cebada y triticale; la muestra de ADN a analizar, un
control de ADN de estos cereales, y una curva estándar de ADN de
trigo/cebada/centeno y los controles adecuados, que comprende:
- b.1.-
- preparación de la muestra de reacción de PCR mediante la mezcla de los distintos extractos de ADN, incluido el de la muestra problema, con la solución de reacción de Q-PCR y los primers o cebadores específicos mencionados, y
- b.2.-
- ejecución de la reacción de amplificación del ADN por PCR cuantitativa mediante un sistema que utilice un marcador de doble cadena de ADN, y
c) Análisis de los productos de amplificación
del ADN mediante:
- c.1.-
- Curvas de disociación, y/o
- c.2.-
- Electroforesis en geles de agarosa teñidos con un marcador de ADN que incremente su sensibilidad.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde el sistema de PCR
cuantitativa utiliza un fluoróforo perteneciente al grupo de los
marcadores que se unen al surco menor del ADN de doble cadena.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde los cebadores
específicos utilizados en la PCR de b.1) son los cebadores WBR.F8
(SEQ ID NO1) y WBR.R8 (SEQ ID NO2).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde la reacción de
Q-PCR se llevó a cabo con el siguiente protocolo de
amplificación: 1 ciclo de 10 minuto a 95ºC y 35 ciclos de 15
segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. El registro de la fluorescencia
emitida por el fluoróforo se realizó al final de cada etapa de
hibridación o annealing.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención donde el marcador que
se utiliza para la tinción de los de geles de agarosa pertenece al
grupo de reactivos que se unen al surco menor del ADN de doble
cadena.
Otro objeto de la invención lo constituye una
secuencia de nucleótidos útiles para llevar a cabo la determinación
de gluten mediante PCR tal como se describe en la presente
invención caracterizada porque pertenece al siguiente grupo:
cebador WBR.F8 (SEQ ID NO1) y WBR.R8 (SEQ ID NO2). En este sentido,
otro objeto de la invención lo constituye el uso de las anteriores
secuencias de nucleótidos en la elaboración de un kit de reactivos
para la determinación de gluten en alimentos.
Finalmente, otro objeto de la invención lo
constituye el uso del procedimiento de la invención para la
determinación de gluten en alimentos.
Figura
1
En el alineamiento también aparecen las
correspondientes secuencias de otras especies relacionadas, como
son la Oryza sativa (GENBANK/X15901), el Zea mays
(GENBANK/X86563) o la Avena sativa (GENBANK/X75695). Las
secuencias de los primers del procedimiento de
PCR-gluten (WBR.F8, SEQ ID NO1, y WBR.R8, SEQ ID
NO2) aparecen en negrita.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura
2
(A) Curva de amplificación de la mezcla de los
extractos purificados (1.000 picogramos) de ADN de 33 variedades:
25 de trigo (Triticum spp), 4 de cebada (Hordeum
vulgare) y 4 de centeno (Secale cereale). (B) Curvas de
amplificación de cantidades conocidas del ADN estándar de
trigo/cebada/centeno. En la figura se resaltan dos zonas o
regiones: una de cuantificación (líneas azules) que va desde 10.000
hasta 5 picogramos (pg), y otra de detección (líneas rojas) por
debajo de los 5 pg. NTC: No Template Control (sólo mezcla de
reacción, sin ADN molde).
Figura
3
Las flechas señalan la T_{m} (temperatura de
melting, disociación o fusión) de los productos de
amplificación (72,0ºC para el trigo y la cebada, y 72,7ºC para el
centeno). MW: Marcador de peso molecular (escalera de 25 pb).
Figura
4
Las flechas señalan la T_{m} de los productos
de amplificación (72,0ºC para el trigo/cebada y 72,7ºC para el
centeno). NTC: No Template Control (sólo mezcla de reacción,
sin ADN molde).
Figura
5
Alimentos no tratados (A) y tratados (B) con
calor, contaminados con trigo, cebada y/o centeno.
Figura
6
Figura
7
(A) Comparación de los rendimientos de
extracción de ácidos nucleicos de los métodos PrepMan^{TM}
Ultra, CTAB (del inglés CetylTrimethylAmmonium Bromide:
Bromuro de CetilTrimetilAmonio) y Wizard® sin fase de
purificación, obtenidos a partir de una harina de trigo duro
(Triticum durum, variedad Aldeano). Se probaron distintos
tiempos (10, 30, 60 y 180 min) y temperaturas (60 y 100ºC) de
incubación, y distintos volúmenes de reactivos de extracción (400 y
800 \muL en 20 mg de muestra). (B) Estudio del efecto del volumen
de los reactivos de extracción (400 y 800 \muL en 20 mg de
muestra) sobre el rendimiento del método Wizard® sin fase de
purificación (30 minutos a 100ºC) en alimentos contaminados con
trigo. Los valores están expresados en nanogramos (ng) de ADN de
trigo por miligramo (mg) de muestra y fueron determinados con el
sistema optimizado de Q-PCR de trigo.
Figura
8
Estudio de la recuperación del ADN con el
método Wizard® sin fase de purificación y en las condiciones
óptimas de extracción (20 mg de muestra en 800 \muL de reactivos
de extracción, calentados durante 30 minutos a 100ºC) en alimentos
negativos por ELISA-R5 y Q-PCR de
trigo/cebada/centeno, que fueron contaminados con cantidades
conocidas del estándar de ADN de trigo/cebada/centeno antes del
procedimiento de extracción (directamente sobre las muestras). Las
recuperaciones (y sus correspondientes desviaciones estándar) están
expresadas en tanto por ciento (%). Los niveles de ADN se
cuantificaron con el sistema simultáneo de Q-PCR de
trigo/cebada/centeno.
Figura
9
En el alineamiento también aparecen las
correspondientes secuencias de otras especies relacionadas, como
las de avena (GenBank/X75695), arroz (GenBank/X15901) y maíz
(GenBank/X86563). Las secuencias de los primers del sistema
simultáneo de Q-PCR de trigo/cebada/centeno de la
presente invención (WBR.F8/WBR.R8) aparecen en subrayada entre los
nt 466 y 551, y la secuencia utilizada por Dahinden y colaboradores
(2001) aparece subrayada entre los nt 25 y 226.
Con el procedimiento PCR-gluten
de la invención se han cuantificado contaminaciones de trigo,
cebada y centeno en más de 100 muestras. La mayoría eran productos
dietéticos "sin gluten", de empresas españolas y europeas. No
sólo se han analizado harinas [de avena (Avena sativa), maíz
(Zea mays), arroz (Oryza sativa), soja (Glycine
max), alforfón (Fagopyrum esculentum), altramuz
(Lupinus angustifolius)] sino también alimentos con matrices
complejas, como alimentos ricos en polifenoles (chocolates),
almidones, carnes (hamburguesas y morcillas), caramelos
(Chupa-Chups y gominolas), etc. También se
han analizado productos hidrolizados (cervezas, sirope, etc.) y
tratados con calor (harinas tostadas de maíz y soja, pan, galletas
y copos para el desayuno).
Con todas ellas se llevó a cabo la extracción
del ADN, la cuantificación por PCR cuantitativa en tiempo real del
ADN de trigo, cebada y centeno, y el análisis de las secuencias
amplificadas.
La extracción del ADN de las muestras se llevó a
cabo mediante una etapa previa de homogenización de las muestras
que se ha realizado de forma distinta según fueran muestras sólidas
o líquidas. Las muestras sólidas (granos de cereales, galletas,
copos para el desayuno, etc.) fueron trituradas con la ayuda de un
molinillo de café (MC0360, UFESA). Se cogió la suficiente
cantidad de muestra como para poder ser triturada con facilidad
(\sim50 g).
Las muestras líquidas (por ejemplo, las
cervezas) se agitaron unos segundos (10-30
segundos) con la ayuda de un vortex y se pesaron utilizando una
pipeta automática con punta con filtro. Para pesar líquidos muy
viscosos, como los siropes, se utilizaron puntas con filtro a modo
de espátulas.
Las muestras se almacenaron en tubos de
propileno de 10 ml y, dependiendo del alimento, se conservaron a
4ºC o a temperatura ambiente.
Posteriormente se procedió a la extracción de
ADN de las muestras mediante un protocolo que presenta
modificaciones respecto al descrito por Zimmermann y colaboradores
(Zimmermann A, Lüthy J, Pauli U: "Quantitative and qualitative
evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids
on soya bean food samples". Z Lebensm Unters Forsch A,
1998, 207: 81-90). La más importante consistió en
la eliminación de la fase o etapa de purificación con resinas de
afinidad [columnas Wizard® Plus Minipreps (Promega, Madison,
USA)].
Se pesaron 20 mg de cada muestra homogenizada en
un tubo de 1,5 ml con tapón de rosca y se añadieron, en este orden,
688 \mul de tampón de extracción TNE [Tris-HCl 10
mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 1% (w/v) (BDH, Poole, UK)],
32 \mul de proteinasa K 20 mg/ml (Merck) y 80 \mul de
hidrocloruro de guanidina 5 M (Fluka, Buchs, Suiza). Se agitó unos
segundos con la ayuda de un vortex (10-30 segundos)
hasta resuspender completamente la muestra. Entonces se calentó la
mezcla 30 minutos a 100ºC en un bloque térmico Thermomixer
comfort con agitación (1.400 rpm).
Una vez finalizadas las incubaciones, se dejaron
enfriar las muestras 10 minutos a 4ºC. Luego se centrifugaron los
tubos 15 minutos a 13.200 rpm/16.000 g (temperatura ambiente). Con
una pipeta automática p200, y evitando aspirar parte del
precipitado, se transfirieron los sobrenadantes (extractos de ADN
de las muestra) a nuevos tubos Eppendorf de 0,5 ml y se
almacenaron a -20ºC hasta su uso.
Cada reacción de Q-PCR llevada a
cabo posteriormente contenía 2 \mul de extracto de ADN de la
muestra obtenido anteriormente, diluido 1/5 (20 \mul extracto +
80 \mul H_{2}O milli-Q estéril), y 18 \mul de
mezcla de reacción de Q-PCR.
Varias muestras de alimentos negativas por
ELISA-R5 Sándwich (con contaminaciones de gliadinas
por debajo de las 1,5 ppm) y Q-PCR de
trigo/cebada/centeno (con contaminaciones de ADN por debajo de los
0,5 ng por mg de muestra) se contaminaron con 50 pg del estándar de
ADN de trigo/cebada/centeno (ver más adelante). Posteriormente se
extrajeron los ácidos nucleicos con el método del SDS/Proteinasa
K/Guanidina modificado (800 \mul de buffer de extracción,
100ºC durante 30 minutos) y se calcularon las recuperaciones (en
tanto por ciento) y sus correspondientes desviaciones estándar
(Figura 8). Excepto el alforfón y el chocolate sin gelatina, en el
resto de alimentos se recuperó entre el 81 y el 105% del ADN. Por
lo tanto, este método de extracción es totalmente compatible con el
sistema de Q-PCR de trigo/cebada/centeno.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Para la elaboración del estándar de ADN de trigo
se emplearon las harinas de veinticinco variedades distintas: diez
de trigo duro (Triticum durum var. Anento, Artena, Angre,
Anton, Regallo, Cibeles, Aldeano, Jabato, Araldun y Roqueño) y
quince de trigo blando (Triticum aestivum var. Abanto,
Amiro, Admiral, Festin, Ampuero, Adalid, Ritmo, Bandit, Tambor,
Vivant, Bussard, Apuesto, Recital, Almonte y Amon).
En el caso de los estándares de ADN de cebada y
centeno, se utilizaron las harinas de cuatro variedades de cebada
(Hordeum vulgare var. Alpha, Reinette, Grosso y Hassan) y
cuatro variedades de centeno (Secale cereale var. Mercator,
Macada, Retamar y Petkus).
La extracción del ADN de las treinta y tres
harinas (veinticinco de trigo, cuatro de cebada y cuatro de
centeno) se realizó según se ha descrito anteriormente, mientras
que para la purificación de dichos extractos de ADN se utilizaron
tanto columnas Wizard® Plus Minipreps como CONCERT^{TM}
Rapid Plasmid Miniprep System (Life Technologies). Las columnas
Wizard® tienen un rendimiento de hasta 16 \mug de ácidos
nucleicos y las CONCERT^{TM} de hasta 30 \mug (según las
especificaciones de los fabricantes). La purificación de los
extractos de ADN mediante columnas Wizard se llevó a cabo como se
indica a continuación:
- Se quitó el émbolo de una jeringuilla de 3 ml
y se conectó a una minicolumna. Se añadió 1 ml de resina de
purificación de ADN y, sobre ésta, 500 \mul del extracto de ADN.
Se insertó con cuidado el émbolo en la jeringuilla y se empujó
suavemente toda la mezcla (resina y ADN) a través de la
minicolumna,
- Luego se separó la jeringuilla de la
minicolumna y se quitó el émbolo. Se volvió a conectar la
jeringuilla a la minicolumna y se añadió 2 ml de solución de
lavado. Se insertó el émbolo en la jeringuilla y se empujó
suavemente la solución de lavado a través de la minicolumna,
- Se separó la jeringuilla y se colocó la
minicolumna sobre un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Para secar la
resina, se centrifugó 2 minutos a 10.400 rpm/10.000 g. Se colocó la
minicolumna en un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml, se
añadieron 50 \mul de agua milli-Q estéril
precalentada a 80ºC y se incubó 1 minuto a temperatura ambiente.
Para eluir el ADN se centrifugó 20 seg a 10.400 rpm/10.000 g, y
- Por último, se añadieron 2 \mul de
Ribonucleasa I "A" 1 mg/ml (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a cada
uno de los 50 \mul de ADN purificado y se dejaron 30 minutos a
37ºC.
Por otro lado, la purificación de los extractos
de ADN mediante columnas CONCERT se llevó a cabo como se indica a
continuación:
- Se añadieron 500 \mul del extracto de ADN
dentro del spin cartridge, el cual previamente se había
colocado sobre un tubo de lavado de 2 ml. Se centrifugó el conjunto
(spin cartridge + tubo de lavado) 1 minuto a 11.400
rpm/12.000 g y se desechó el flujo resultante.
- Se añadieron 700 \mul de Tampón de Lavado
(G4) (conteniendo etanol) dentro del spin cartridge. Se
centrifugó 1 minuto a 11.400 rpm/12.000 g y se desechó el flujo. Se
volvió a centrifugar 1 minuto a 11.400 rpm/12.000 g para eliminar
el tampón de lavado residual.
- Se colocó el spin cartridge sobre un
tubo de recuperación de 1,5 ml, se añadieron 75 \mul de tampón TE
directamente en el centro del spin cartridge y se incubó 1
minuto a temperatura ambiente. Para eluir el ADN se centrifugó 1
minuto a 11.400 rpm/12.000 g. Se volvió a repetir este último paso
con otros 75 \mul de tampón TE.
- Por último, se añadieron 6 \mul de
Ribonucleasa I "A" 1 mg/ml a cada uno de los 150 \mul de ADN
purificado y se dejaron 30 minutos a 37ºC.
La concentración y el grado de pureza de los
extractos de ADN purificados a partir de treinta y tres variedades
de trigo, cebada y centeno se determinaron por absorbancia
(Molecular Cloning, 1989) en un espectrofotómetro
BioPhotometer de Eppendorf, utilizando cubetas desechables de
plástico transparente al UV (UVette®, Eppendorf).
Primero se hizo una dilución 1/10 con tampón
Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (10 \mul extracto ADN
purificado + 90 \mul tampón Tris-HCl 10 mM pH
8,0). Después se midieron en el espectrofotómetro las absorbancias
a 260 nm y 280 nm. El aparato proporcionó directamente la pureza y
la concentración de ADN de doble cadena (en \mug/ml) de la
dilución 1/10. Para saber la concentración de partida se multiplicó
este valor por 10 (factor de dilución).
Una vez conocidas las concentraciones de ADN de
los treinta y tres extractos purificados de ADN se ajustaron todos
a 5 ng/\mul con agua milli-Q estéril para preparar
el estándar de ADN basado en la mezcla o pool de los mismos. A
partir de estas diluciones se mezclaron en tubos Eppendorf
de 1,5 ml, y con la ayuda de un vortex (10-30
segundos), los siguientes volúmenes:
\bulletEstándar de ADN de trigo: 50
\mul de cada una de las veinticinco variedades de trigo (50 \mul
x 25 = 1.250 \mul \equiv 1,25 ml).
\global\parskip1.000000\baselineskip
\bulletEstándar de ADN de cebada: 300
\mul de cada una de las cuatro variedades de cebada (300 \mul x
4 = 1.200 \mul \equiv 1,20 ml).
\bulletEstándar de ADN de centeno: 300
\mul de cada una de las cuatro variedades de centeno (300 \mul x
4 = 1.200 \mul \equiv 1,20 ml).
\bulletEstándar de ADN de
trigo/cebada/centeno: 300 \mul del estándar de ADN de trigo +
300 \mul del estándar de ADN de cebada + 300 \mul del estándar
de ADN de centeno (300 \mul x 3 = 900 \mul \equiv 0,90
ml).
A partir de los cuatro estándares de ADN (5
ng/\mul) se hicieron alícuotas de 12 \mul en tubos
Eppendorf de 0,5 ml y se almacenaron a -20ºC para su uso
posterior.
La Figura 2A muestra la curva de amplificación
de la mezcla o pool de los extractos de ADN purificados (1.000
picogramos) de las 33 variedades de trigo, centeno y cebada
descritos. En la actualidad se dispone de una solución stock
concentrada de la mezcla (5 \mug/ml). La curva estándar de
trigo/cebada/centeno se obtuvo a partir de diluciones seriadas del
stock del estándar de ADN (5 ng/\mul) en agua
milli-Q estéril. Consta de cinco puntos: 10.000,
1.000, 100, 10 y 5 pg. Así, mediante estas diluciones seriadas se
elabora la curva de calibrado (Figura 6), la cuál permite
cuantificar contaminaciones de trigo/cebada/centeno en un rango muy
amplio (más de tres órdenes de magnitud). Se diferencian dos zonas
o regiones: una de cuantificación, que va desde 10.000 hasta 5
picogramos (pg), y otra de detección, por debajo de los 5 pg. Esta
sensibilidad permite cuantificar ADN de trigo, cebada y
centeno en alimentos dietéticos para enfermos celiacos con
contaminaciones de gluten entre las 200 y las 20 ppm (partes por
millón).
El objetivo de esta etapa fue buscar una
secuencia común conservada entre los genomas de las especies de
trigo (Triticum spp, tanto Triticum durum como
Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), centeno
(Secale cereale) y sus cruces, como por ejemplo, el
triticale (hibrido entre el trigo y el centeno) que permitiera
posteriormente el diseño y selección de primers, cebadores u oligos
para la amplificación específica de dicha región de ADN a partir de
muestras de alimentos.
Así, se seleccionó el "intrón del gen
cloroplastidial trnL" (Dahinden I, Büren Mv, Lüthy J: "A
quantitative competitive PCR system to detect contamination of
wheat, barley or rye in gluten-free food for
coeliac patients". Eur Food Res Technol, 2001, 212:
228-233). Con el programa informático BLAST®
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) se alinearon las
secuencias del "intrón del gen cloroplastidial trnL" de trigo,
cebada y centeno (GENBANK X75709, X75705 y AF519162,
respectivamente). A partir de una región común presente en los
genomas de las tres especies (Figura 1 y 9) se diseñaron los
cebadores WBR.F8 (SEQ ID NO1) y WBR.R8 (SEQ ID NO2) (Tabla 1) para
obtener los productos de amplificación de trigo, cebada y centeno
(SEQ ID NO3, NO4 y NO5, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores o primers utilizados en este
trabajo (Tabla 1) se diseñaron con la ayuda del software Primer
Express^{TM} v2.0 (Applied Biosystems). Posteriormente
se verificó que cada cebador no formase fácilmente estructuras
secundarias intramoleculares, ni hibridase fácilmente con otra
molécula de cebador idéntica, ni con el otro cebador de la misma
pareja.
Los cebadores fueron sintetizados por
Sigma-Genosys Ltd. (Pampisford, UK). Se
suministraron libres de sales, liofilizados y a -20ºC. Se les dio
un pequeño pulso en una centrífuga de tubos Eppendorf (10
segundos, 13.200 rpm/16.000 g) y se resuspendieron en tampón TE 1x
[Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM] siguiendo las
instrucciones del fabricante, hasta una concentración final de 100
\muM. Para facilitar el proceso se agitaron durante 1 minuto a
1.400 rpm. Por último, se hicieron alícuotas de 100 \mul, que se
conservaron a -70ºC.
Las soluciones stock 10x se prepararon
diluyendo la solución madre (100 \muM) en tampón TE 1x. También
se hicieron alícuotas de 100 \mul, que se conservaron a
-20ºC.
Se utilizaron los reactivos "SYBR® Green
PCR Core Reagents Kit", de Applied Biosystems. Cada reacción
de Q-PCR contenía 2 \mul de extracto de ADN (del
estándar de ADN, de una muestra o de un control) y 18 \mul de
mezcla de reacción [2 \mul de búfer de PCR SYBR® Green 10x, 4
\mul de MgCl_{2} 25 mM, 0,1 \mul de AmpliTagGold 5 U/\mul,
2 \mul de dNTP mix (dATP, dCTP and dGTP, 2,5 mM cada uno; dUTP 5
mM), 2 \mul del primer directo y 2 \mul del primer
reverso (3 \mumol/l cada uno), y 5,9 \muL de agua
milli-Q estéril].
En el caso de n-reacciones, para calcular
el volumen necesario de cada reactivo, se diseñó la hoja de cálculo
"Reactivos.xls" (Microsoft® Excel 2002, Microsoft®, USA).
Para no quedarse sin mezcla de reacción mientras se hacían las
alícuotas (debido a posibles errores en el pipeteo), la hoja de
cálculo aumentaba en un 5% el volumen de mezcla de reacción
necesario.
La afinidad de los cebadores por el ADN molde no
siempre es la misma, por lo tanto hubo que averiguar qué
concentración de cada uno de ellos era la más adecuada para obtener
una mayor y mejor respuesta. Para ello se diseñó una matriz de
oligos, combinando distintas concentraciones del cebador directo
(150, 300 y 600 nM) con el cebador reverso (150, 300 y 600 nM).
Las reacciones de Q-PCR se
llevaron a cabo en placas de policarbonato/polipropileno de 96
pocillos (Semi-skirted colorless twin.tec PCR
plate 96, Eppendorf). Una vez aplicados todos los puntos de la
curva estándar de ADN de trigo, las muestras y los controles, se
sellaron las placas con films adhesivos
(Sigma-Aldrich) y se centrifugaron 2 minutos a
3.700 rpm/2.250 g en una centrífuga con adaptador de placas
(5804, Eppendorf).
Después de centrifugar la placa, se colocó sobre
el bloque térmico del equipo de Q-PCR "ABI
PRISN® 7000 Sequence Detection System" (Applied Biosystems).
A continuación se programó el siguiente protocolo de
amplificación: 1 ciclo de 10 minutos a 95ºC y 35 ciclos de 15
segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. El registro de la fluorescencia
emitida por el SYBR® Green I se realizó al final de cada etapa de
hibridación o annealing. Los resultados se analizaron con el
software ABI PRISM® 7000 SDS v1.1 (Applied Biosystems).
Cuando la mezcla de reacción se calienta desde
la temperatura de hibridación de los cebadores (60ºC) hasta la
temperatura de desnaturalización (95ºC), se alcanza durante unos
segundos los 72ºC (temperatura óptima de la polimerasa AmpliTaq
Gold^{TM}). Este tiempo es suficiente para que la enzima pueda
efectuar la polimerización completa de pequeñas cadenas de ADN,
como es el caso de los productos de amplificación de los sistemas
de Q-PCR desarrollados en este trabajo de
investigación, que tienen unas longitudes comprendidas entre las 50
y las 80 pares de bases. Esto permitió eliminar la etapa de
elongación de los protocolos de amplificación, con el consecuente
ahorro en tiempo (entre 22 y 45 minutos por carrera) y, por lo
tanto, en eficacia.
Con el objetivo de minimizar el riesgo de
contaminaciones cruzadas a partir de productos de amplificación
procedentes de reacciones anteriores, se utilizaron puntas para
pipetas automáticas con filtro (Sorenson, UTA, USA).
Para comprobar que no se han producido
contaminaciones durante la extracción/amplificación, se han
incluido dos tipos de controles negativos:
(a) Como control negativo del proceso de
extracción del ADN se utilizó una harina de maíz negativa por
ELISA-R5 Sándwich (< 3 ppm de gluten). A los 18
\mul de mezcla de reacción Q-PCR se añadieron 2
\mul de una dilución 1/5 del extracto de ADN de esta harina (20
\mul extracto + 80 \mul H_{2}O milli-Q
estéril).
(b) En los controles negativos de la reacción de
amplificación del ADN (NTCs) los 2 \mul del extracto de ADN
se sustituyeron por 2 \mul de agua milli-Q
estéril.
Al terminar las reacciones de amplificación, se
generaron las curvas de disociación (o curvas de melting),
en las que se monitoriza la fluorescencia de los productos de
amplificación en relación con el aumento de la temperatura: a
medida que se incrementa la temperatura, la fluorescencia
disminuye. En el caso del SYBR® Green I esto es debido a la
separación de la doble cadena del ADN y, consecuentemente, a la
liberación del fluorocromo. La curva de disociación permite
determinar la temperatura de melting (T_{m})
característica del producto específico de amplificación y la
existencia de otros productos inespecíficos (como, por ejemplo,
dímeros de primers).
La electroforesis en geles de agarosa también
permite determinar la presencia o ausencia de dímeros de
primers, así como verificar el tamaño del producto de
amplificación (pb).
Dependiendo del tamaño de gel y del peine, se
mezclaron 2-10 \mul de cada muestra (productos de
amplificación de PCR) con 2 \mul de tampón de carga
Blue/Orange 1,5x [Ficoll® 400 3,75%,
xilen-cianol FF 7,5%, azul de bromofenol
7,5\textperthousand, naranja G 0,1%; Promega]. El
xilen-cianol FF migra con bandas de ADN de \sim4
kb, el azul de bromofenol con bandas de \sim300 pb y el naranja G
con bandas de \sim50 pb (para electroforesis en geles de agarosa
al 0,5-1,4% en tampón TBE).
Estos 4-12 \mul se cargaron en
geles horizontales de agarosa (Sigma-Aldrich) al 3%
(w/v) con SYBR® Green I 1x (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania)
en tampón TAE 1x [Tris 40 mM, ácido acético glacial 20 mM (Panreac,
Barcelona, España), EDTA 1 mM, pH \sim8,4].
Las electroforesis de geles de agarosa pequeños
se llevaron a cabo en una cubeta Hoefer HE 33 (Amersham
Biosciences, Freiburg, Alemania) y las de geles de agarosa grandes
en una cubeta GNA-200 (Amersham Biosciences).
Se empleó tampón TAE 1x como tampón de separación y se aplicó una
diferencia de potencial eléctrico constante de 140 V a temperatura
ambiente durante 30-90 minutos, utilizando una
fuente de alimentación PowerPac 300 (Bio-Rad,
California, USA).
Como marcador de peso molecular se utilizó una
escalera de 25 pb (Promega). Como se puede ver en la Figura
3A, este patrón contiene 12 fragmentos de ADN, con tamaños que van
desde las 25 pb hasta las 300 pb, en incrementos exactos de 25 pb
(es decir: 25, 50, 75, ..., 275 y 300 pb). Se mezclaron 10 \mul
de marcador (364 ng/\mul) con 20 \mul de tampón de carga
Blue/Orange 1,5x y 90 \mul de tampón TAE 1x. Se hicieron
alícuotas de 6 \mul, que se conservaron a -20ºC.
En los geles con Bromuro de Etidio/SYBR® Green I
se aplicaron 6 \mul/pocillo (una alícuota) del marcador de peso
molecular diluido.
Las imágenes de los geles fueron hechas con el
equipo de adquisición de imágenes digital
Fluor-S^{TM} Multilmager
(Bio-Rad) utilizando el software de análisis de
imágenes Quantity One® v4.2.1 (Bio-Rad).
Para editar las imágenes (variar el
brillo/contraste, añadir texto, recortar, etc.) se utilizó el
Adobe® Photoshop® 5.0 (Adobe Systems Inc., San
José/California, USA).
Como material certificado de referencia para
calibrar los sistemas de ELISA-R5 Sándwich y
Western Blot R5 se utilizó el Estándar Europeo de Gliadinas
(CRM IRMM-480) cedido amablemente por el Working
Group on Prolamin Analysis and Toxicity (PWG), con un
contenido estimado de proteínas del 86,4% (determinado por
nitrógeno Kjendahl). De la concentración de 503 \mug/ml del
Estándar Europeo de Gliadinas (en etanol 60%) se hicieron alícuotas
de 50 \mul en tubos Eppendorf de 0,5 ml, que se
conservaron a temperatura ambiente.
La extracción de prolaminas y la posterior
cuantificación de gluten mediante ELISA-R5 sándwich
se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente por los
propios inventores (Valdés I, García E, Llorente M, Méndez E:
"Innovative approach to low-level gluten
determination in foods using a novel sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay protocol".
Eur J Gastroenterol Hepatol, 2003, 15:
465-474).
Se pesaron 250 mg de muestra homogenizada, se
depositaron en un tubo de propileno de 10 ml, se añadieron 10 ml de
etanol 60% [300 ml de etanol (Scharlau, Barcelona, España) + 200 ml
de agua milli-Q] y se agitaron unos segundos en el
vortex (10-60 seg) hasta resuspender completamente
las muestras.
Se pesaron 250 mg de muestra homogenizada y se
depositaron en un tubo de propileno de 10 ml. Se añadieron 2,5 ml
de "Cocktail Solution" (patente WO 02/092633 A1). Para
evitar evaporaciones, se cerraron los tubos con su correspondiente
tapón y se sellaron con papel Parafilm. Se agitaron unos
segundos con la ayuda de un vortex (5-10 seg)
y se incubaron en una estufa a 50ºC durante 40 min.
Tras dejarse enfriar las muestras a temperatura
ambiente, se añadieron 7,5 ml de etanol 80% [400 ml de etanol + 100
ml de agua milli-Q] y se agitaron unos segundos en
el vortex (10-60 segundos) hasta resuspender
completamente las muestras.
Las mezclas obtenidas mediante extracción con
etanol-agua y con Cocktail Solution se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente, en un agitador orbital a 45
rpm. Después se centrifugaron los tubos 10 minutos a 3.525
rpm/2.500 g (temperatura ambiente). Con pipetas Pasteur de vidrio,
y evitando aspirar parte del precipitado, se transfirieron los
sobrenadantes (extractos de prolaminas de las muestra) a tubos
limpios de propileno de 10 ml.
Para cuantificar el gluten de estos extractos
mediante ELISA-R5 Sándwich se diluyeron en tampón
PBS-Tw [Tween® 20 0,05% (v/v)
(Sigma-Aldrich) en PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM; Merck)] según el
grado de contaminación estimado de la muestra.
En el desarrollo de este trabajo se ha utilizado
el anticuerpo monoclonal R5 (Valdés I, García E, Llorente M,
Méndez E: "Innovative approach to low-level gluten
determination in foods using a novel sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay protocol".
Eur J Gastroenterol Hepatol, 2003, 15:
465-474; Henterich N, Osman AA, Méndez E, Mothes T:
"Assay of gliadin by real-time immunopolymerase
chain reaction". Nahrung, 2003, 47 (5):
345-8; Osman AA, Uhlig HH, Valdés I, Amin M, Méndez
E, Mothes T: "A monoclonal antibody that recognizes a potential
coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in
gliadins". Eur J Gastroenterol Hepatol, 2001, 13:
1189-93; Sorell L, López JA, Valdés I, Alfonso P,
Camafeita E, Acevedo B: "An innovative sandwich ELISA system
based on an antibody cocktail for gluten analysis". FEBS
Lett, 1998, 439: 46-50), sin conjugar y
conjugado con peroxidasa de rábano (R5-HRP).
Se recubrió una placa de poliestireno EIA/RIA de
96 pocillos (COSTAR® 3590, Corning, NY, USA) con 100
\mul/pocillo de solución de recubrimiento (AcM R5 3 \mug/ml en
tampón carbonato/bicarbonato sódico 50 mM pH 9,6) y se incubó la
placa en una cámara húmeda a 4ºC durante toda la noche
(overnight).
Al día siguiente se lavó la placa 3 veces en un
lavador ImmunoWash Model 1575 (Bio-Rad) con
300 \mul/pocillo de tampón PBS-Tw. Los sitios de
unión inespecífica se bloquearon con 300 \mul/pocillo de solución
de bloqueo [BSA Fracción V 1% (Roche Diagnostics) en tampón
PBS-Tw] durante 1 hora a 37ºC en cámara húmeda.
Se volvió a lavar la placa 3 veces con 300
\mul/pocillo de tampón PBS-Tw. Entonces se
añadieron 100 \mul/pocillo de los puntos de la curva estándar de
gliadinas (desde 100 ng/ml hasta 0,78 ng/ml, obtenidos mediante
diluciones seriadas 1/2 en tampón PBS-Tw), de los
extractos de prolaminas de las muestras y de los controles. Como
control positivo se utilizó la concentración de 0,312 \mug/ml del
Estándar Europeo de Gliadinas (en etanol 60%), equivalente a 5 mg
gluten/100 g alimento (50 ppm). Como control de fondo (blanco) se
utilizó tampón PBS-Tw. Los valores de absorbancia
correspondientes al blanco debían ser inferiores a 0,200
unidades.
Se dejó reposar la placa durante 1 hora a 37ºC
en cámara húmeda y luego se hicieron 3 lavados con 300
\mul/pocillo de tampón PBS-Tw. El siguiente paso
fue añadir 100 \mul/pocillo de AcM R5 conjugado con peroxidasa de
rábano (R5-HRP, dilución 1:20.000 en tampón
PBS-Tw) y se volvió a incubar la placa otra hora en
cámara húmeda, pero esta vez a temperatura ambiente y en
oscuridad.
Se hicieron otros 6 lavados con 300
\mul/pocillo de tampón PBS-Tw. La reacción
colorimétrica tuvo lugar añadiendo 100 \mul/pocillo de sustrato
Enhanced K-Blue® TMB (Neogen, Lexington,
Kentucky, USA). Se incubó la placa 10 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad. Se paró la reacción adicionando 50
\mul/pocillo de solución de parada [ácido sulfúrico 2,5 M
(Fluka)] y se leyeron las absorbancias a 450 nm en un lector de
placas MICROPLATE READER Model 550
(Bio-Rad).
A continuación se llevó a cabo el procedimiento
de la invención para identificar y cuantificar ADN de varios
cereales y otras plantas con objeto de analizar la especificidad
del mismo. Los cebadores utilizados amplifican una secuencia entre
78 y 81 pares de bases (pb) presente en el trigo (tanto Triticum
durum como Triticum aestivum), la cebada (Hordeum
vulgare) y el centeno (Secale cereale). Tal como se
puede observar el procedimiento de la invención permite detectar
contaminaciones por debajo del límite de cuantificación, entre las
20 y las 10 ppm, mediante geles de agarosa teñidos con SYBR® Green
I (Figura 3A). Este procedimiento permite la detección específica
en trigo, cebada y centeno, mientras que no manifiesta reactividad
cruzada con otras especies, como la avena, el maíz, el arroz, la
soja, el alforfón o el altramuz (Figura 3A). Además, por la
temperatura de melting (T_{m}) de los productos de
amplificación se puede discriminar si la contaminación es de
trigo/cebada (T_{m} = 72,0ºC) o centeno (T_{m} = 72,7ºC)
(Figuras 3B y 4). Se analizaron alimentos tan variados como masas
fermentadas (de cebada y centeno), harinas de maíz, avenas y
extractos proteicos (de guisante y altramuz).
\vskip1.000000\baselineskip
En los alimentos no tratados con calor (Figura
5A) existe una buena correlación lineal entre los datos de
gliadinas (determinados por ELISA-R5 Sándwich) y ADN
(determinados por el sistema PCR-CNB). Además,
gracias al pequeño tamaño del producto de amplificación (entre 78 y
81 pares de bases), se pueden detectar contaminaciones de
trigo/cebada/centeno en alimentos tratados con calor (Figura 5B)
como, por ejemplo, panes, papillas, y harinas tostadas, donde las
moléculas de ADN suelen estar parcialmente degradadas y/o
fragmentadas. Pero en este último caso no se observa ninguna
correlación entre los datos de gliadinas y ADN (Figura 5B).
Otra limitación del procedimiento de la presente
invención es que no detecta contaminaciones de trigo, cebada y
centeno en aquellos alimentos en los que el ADN está total o
parcialmente hidrolizado, como es el caso de las cervezas, los
siropes, los extractos de malta y los cereales para el desayuno
(datos no mostrados).
Finalmente, se compararon los resultados
obtenidos mediante el procedimiento de Q-PCR de la
presente invención que identifica la presencia simultánea de trigo,
centeno, cebada y sus cruces, con la realización de los distintos
Q-PCR individuales para cada uno de los cereales
mencionados (ver Tabla 2). Así, se llevó a cabo el análisis de
muestras de alimentos contaminados con mezclas de trigo (Tr),
cebada (Cb) y/o centeno (Cn).
Como se puede observar en la Tabla 2, existe una
buena correlación entre los sistemas individuales y el sistema
simultáneo (entre un 83 y un 146%). Estos resultados son muy buenos
si se tiene en cuenta que las reproducibilidades de los métodos
desarrollados rondan entre el 11,01 y el 15,02% de coeficiente de
variación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los porcentajes de correspondencia entre los
sistemas individuales y el simultáneo (%) están calculados
dividiendo la cantidad total de ADN calculada con los sistemas
individuales (Q-PCRTr + Q-PCRCb +
Q-PCRCn) entre la cantidad de ADN calculada con el
sistema simultáneo (Q-PCRTCC), y multiplicado este
número por cien.
Los valores están expresados en picogramos (pg)
de ADN por miligramo (mg) de muestra.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DE ADN PROVENIENTE DE TRIGO, CEBADA,
CENTENO, SUS CRUCES Y SUS MEZCLAS EN ALIMENTOS, ELEMENTOS NECESARIOS
PARA LLEVARLOS A CABO Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Q-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer PX_WBR.F8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataatcaaat tcttcaattc aaattcaaag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<213> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer PX_WBR.R8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctctttgtc ctcgtccgat taa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secale cereale
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (8)
1. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN proveniente de trigo, centeno, cebada,
triticale y sus mezclas caracterizado porque es una
detección y cuantificación simultánea de ADN en tiempo real y
porque comprende las siguientes etapas:
a) extracción del ADN de una muestra de
alimento, mediante una etapa previa de homogenización de las
muestras, y una etapa propiamente de extracción de ADN de las
muestras que comprende:
- -
- la adición a la muestra homogenizada de los reactivos de extracción en el siguiente orden y cantidades adecuadas: tampón de extracción TNE [Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 1% (w/v)], proteinasa K 20 mg/ml e hidrocloruro de guanidina 5 M,
- -
- agitación durante 10-30 segundos hasta resuspender completamente la muestra,
- -
- calentamiento de la mezcla 30 minutos a 100ºC con agitación (1.400 rpm),
- -
- enfriamiento de las muestras 10 minutos a 4ºC, centrifugación durante 15 minutos a 13.200 rpm/16.000 g a temperatura ambiente, y captura de los sobrenadantes (extractos de ADN de las muestra) para la realización de la siguiente etapa o su conservación a -20ºC para su uso posterior,
b) realización de una PCR cuantitativa en tiempo
real utilizando los primers o cebadores específicos de una región
del intrón del gen cloroplastidial trnL conservada en trigo,
centeno, cebada y triticale; la muestra de ADN a analizar, un
control de ADN de estos cereales, y una curva estándar de ADN de
trigo/cebada/centeno y los controles adecuados, que comprende:
- b.1.-
- preparación de la muestra de reacción de PCR mediante la mezcla de los distintos extractos de ADN, incluido el de la muestra problema, con la solución de reacción de Q-PCR y los primers o cebadores específicos mencionados, y
- b.2.-
- ejecución de la reacción de amplificación del ADN por PCR cuantitativa mediante un sistema que utilice un marcador de doble cadena de ADN, y
c) Análisis de los productos de amplificación
del ADN mediante:
- c.1.-
- Curvas de disociación, y/o
- c.2.-
- Electroforesis en geles de agarosa teñidos con un marcador de ADN que incremente su sensibilidad.
2. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN según la reivindicación 1
caracterizado porque el sistema de PCR cuantitativa utiliza
un fluoróforo perteneciente al grupo de los marcadores que se unen
al surco menor del ADN de doble cadena.
3. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN según la reivindicación 1
caracterizado porque los cebadores específicos utilizados en
la PCR de b.1) son los cebadores WBR.F8 (SEQ ID NO1) y WBR.R8 (SEQ
ID NO2).
4. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN según la reivindicación 1
caracterizado porque la reacción de Q-PCR se
llevó a cabo con el siguiente protocolo de amplificación: 1 ciclo
de 10 minuto a 95ºC y 35 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a
60ºC.
5. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN, según la reivindicación 1
caracterizado porque el marcador que se utiliza para la
tinción de los de geles de agarosa pertenece al grupo de reactivos
que se unen al surco menor del ADN de doble cadena.
6. Secuencia de nucleótidos útiles para llevar a
cabo la determinación de gluten mediante PCR caracterizada
porque pertenece al siguiente grupo: cebador WBR.F8 (SEQ ID NO1) y
WBR.R8 (SEQ ID NO2).
7. Uso de la secuencia según la reivindicación 6
en la elaboración de un kit de reactivos para la determinación de
gluten en alimentos.
8. Uso del procedimiento según las
reivindicaciones 1 a la 5 para la determinación de gluten en
alimentos.
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|---|---|---|---|
| ES200700686A ES2304874B1 (es) | 2007-03-15 | 2007-03-15 | Procedimiento de deteccion y cuantificacion simultanea de adn proveniente de trigo, cebada, centeno, sus cruces y sus mezclas en alimentos, elementos necesarios para llevarlo a cabo y sus aplicaciones. |
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