ES2300642T3 - Metodos para inducir estimulacion dirigida de la recombinacion meiotica y kits para realizar dichos metodos. - Google Patents

Abstract

Método para aumentar la recombinación entre cromosomas homólogos en una célula que está dividiéndose, excluyendo células humanas, durante la meiosis, que comprende las etapas de: (i) introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, y (ii) hacer que la célula se divida, de modo que aumenta la recombinación entre cromosomas homólogos en dicha célula.

Description

Métodos para inducir estimulación dirigida de la recombinación meiótica y kits para realizar dichos métodos.

Campo de la invención

En todos los eucariotas, las tasas de recombinación meiótica entre los cromosomas paternos y maternos varían en varios órdenes de magnitud en diferentes locus cromosómicos. En Saccharomyces cerevisiae y en otros organismos, la recombinación meiótica se inicia mediante roturas bicatenarias del ADN (DSB) programadas, un proceso que requiere al menos 15 proteínas incluyendo Spo11, una proteína ampliamente conservada que probablemente cataliza la escisión.

La presente invención se refiere a métodos y kits para aumentar la tasa de recombinación meiótica en una célula, excluyendo células humanas y, más específicamente, para inducir recombinación meiótica dirigida. Esta invención se basa en el hecho de que es posible dirigir el inicio de la recombinación meiótica hasta un sitio diana, expresando en la célula, excluyendo células humanas, una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a la proteína Spo11.

Antecedentes y técnica anterior

En los organismos que se reproducen sexualmente, la reducción a la mitad del contenido en ADN de una célula de línea germinal diploide durante el ciclo celular meiótico permite la producción de gametos haploides. Durante este proceso, la recombinación desempeña un papel doble: intercambia información a lo largo de las longitudes de cromosomas homólogos, creando diversidad genética que se transmite a la progenie, y garantiza la segregación apropiada de polos homólogos a opuestos durante la primera de las dos divisiones meióticas. Hace aproximadamente cien años, de Vries predijo que tienen lugar intercambios entre cromosomas maternos y paternos homólogos durante la transmisión hereditaria. Poco después, en 1905, Bateson descubrió el ligamiento parcial entre los caracteres de color de pétalo y forma del polen en el guisante de olor. Estos y posteriores descubrimientos en el campo emergente de la recombinación condujeron a la noción de las distancias genéticas, tal como se miden mediante la frecuencia de intercambio (entrecruzamiento) entre marcadores unidos, y al desarrollo de mapas de ligamiento. En 1913, Sturtevant escribió "Por supuesto, no puede saberse si estas distancias tal como se dibujan representan o no las distancias espaciales relativas reales separadas de los factores". Desde el advenimiento de la era molecular, esta intuición clarividente se ha verificado exhaustivamente mediante comparaciones cuantitativas de las distancias genéticas y físicas. Para todos los organismos, incluyendo la levadura Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Mus musculus, y el ser humano, las tasas de recombinación meiótica (expresadas como cM/kb) varían en varios órdenes de magnitud a lo largo de los cromosomas. Estudios recientes en S. cerevisiae sugieren fuertemente que la mayor parte de esta variación está relacionada con las frecuencias de los acontecimientos de iniciación (Baudat y Nicolas, 1997), pero sigue sin explicarse por qué es relativamente frecuente en algunos locus (puntos calientes) y relativamente infrecuente en otros (puntos fríos).

En S. cerevisiae, la recombinación meiótica resulta de la formación y reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB) programadas (para una revisión, véase por ejemplo: Smith y Nicolas, 1998). Numerosos estudios han mostrado que los sitios de DSB naturales no están distribuidos uniformemente y que las frecuencias de escisión varían 10-100 veces de un sitio a otro (Baudat y Nicolas, 1997; Gerton et al., 2000). Los factores que determinan si un sitio o región específicos son propensos a la formación de DSB (y por tanto, a la recombinación) no se entienden completamente, pero se sabe que actúan tanto local como globalmente. Localmente, la organización génica y la estructura de la cromatina parecen ser de importancia primordial y relacionada. Normalmente, la mayoría de los sitios de DSB naturales están en regiones que contienen un promotor (Baudat y Nicolas, 1997). En el locus HIS4, se han distinguido dos tipos de puntos calientes de recombinación, los puntos calientes \alpha (dependientes de factores de transcripción pero no dependientes de la transcripción) y \beta (independientes de factores de transcripción) (revisado por Petes, 2001). De manera más particular, todos los sitios de DSB conocidos están ubicados en regiones que son sensibles a la ADNasa I o a la nucleasa microcócica (MNasa I) tanto en células mitóticas como meióticas, lo que sugiere que es necesaria una configuración de cromatina abierta para la escisión (Ohta et al., 1994; Wu y Lichten, 1994). Sin embargo, la accesibilidad de la cromatina local no puede ser el único árbitro de la selectividad del sitio de DSB, porque no todos los sitios hipersensibles a nucleasa son sitios de DSB.

Los determinantes globales también controlan la distribución de las DSB. Tanto el mapeo fino de los sitios de DSB en el cromosoma III de levadura como el mapeo en todo el genoma de los sitios de DSB han confirmado la existencia de grandes dominios subcromosómicos calientes o fríos para la formación de DSB (Baudat y Nicolas, 1997; Gerton et al., 2000). La base molecular de estos dominios resistentes a, o competentes para, DSB no se ha aclarado, pero el hallazgo de que un indicador competente para la recombinación insertado en diversos sitios a lo largo del cromosoma III adopta propiedades locales con respecto a la sensibilidad a la ADNasa I y las frecuencias de formación de DSB y recombinación demuestra que los controles a nivel de dominio se superponen sobre los determinantes locales (Borde et al., 1999). Es decir, una región caliente puede hacerse fría, pero hasta la fecha no se ha observado lo contrario: las regiones frías normalmente permanecen frías.

Una consideración de la variación cromosómica en las frecuencias de DSB también debe tener en cuenta la influencia de factores que actúan en trans. Se requiere un gran número de genes para la formación de DSB, incluyendo SPO11, MEI4, MER1, MER2/REC107, MRE2/NAM8, MRE11, RAD50, REC102, REC103/SKI8, REC104, REC114 y XRS2, pero en la mayoría de los casos se desconocen sus papeles moleculares. Mutantes nulos para todos los genes anteriores no consiguen llevar a cabo la recombinación meiótica y producen esporas inviables. Se requieren otros tres genes específicos de meiosis para obtener niveles completos de DSB: MEK1/MRE4 codifica para una cinasa que regula las actividades de los productos de RED1 y HOP1, que son componentes estructurales de cromosomas meióticos. SPO11 codifica para una proteína que comparte similitud de secuencia con la subunidad más pequeña (Top6A) de la topoisomerasa tipo II de la arqueobacteria Sulfobolus shibatae (Bergerat et al., 1997). Spo11 permanece covalentemente unida a los extremos terminales de la cadena 5' de fragmentos de DSB en mutantes (por ejemplo, rad50S) que son defectuosos para el procesamiento nucleolítico de 5' a 3' de extremos de DSB que precede normalmente a la reparación (Keeney et al., 1997), lo que indica que es el componente catalítico de la actividad de escisión por DSB meiótica. Estos y otros estudios genéticos y moleculares en hongos y eucariotas superiores han demostrado que es probable que se requieran ortólogos de Spo11 de manera universal para la recombinación meiótica, lo que sugiere fuertemente que las DSB inician la recombinación meiótica en la mayoría si no en todos los eucariotas. El uso de mutagénesis dirigida al sitio para identificar regiones de Spo11 que contribuyen a la escisión de la cadena y la unión a ADN ha demostrado la significación funcional de los motivos estructurales conservados en toda la familia de Spo11/Top6A (Bergerat et al., 1997; Diaz et al., 2002). De manera interesante, las variaciones en el nivel y distribución de las DSB en el punto caliente his4::LEU2 en algunos mutantes de Spo11 sugieren que Spo11 no sólo está implicada en la actividad de escisión, si no que también contribuye a la elección del sitio para la formación de las DSB, al menos localmente (Diaz et al., 2002).

Bibikova et al, Molecular and Cellular Biology (enero de 2001) págs. 289-297 dan a conocer nucleasas quiméricas que son híbridos entre un dominio de escisión de ADN no específico y un dominio de reconocimiento de ADN de tipo dedo de zinc, que escinden el ADN e inician la recombinación en células vivas.

El documento WO 00/46386 describe métodos para inducir la escisión de ADN bicatenario en un sitio específico en el ADN cromosómico que induce un mecanismo de reparación celular que conduce a acontecimientos recombinatorios en ese locus específico.

Sumario de la invención

Los inventores han fusionado Spo11 al dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (Gal4BD), creando una proteína de fusión Gal4BD-Spo11. La proteína Gal4 es uno de los activadores transcripcionales mejor caracterizado en S. cerevisiae y se requiere para la expresión de genes implicados en el catabolismo de la galactosa. La proteína se une a una secuencia activadora consenso en sentido 5' (UAS_{GAL}) a través de su dominio N-terminal y estimula la transcripción mediante su dominio de activación C-terminal. Análisis de la huella genética ("footprint") in vitro e in vivo han definido una secuencia consenso de 17 pares de bases en los sitios UAS_{GAL} (CGGN_{11}CCG) como suficiente para la unión a Gal4. Los inventores han demostrado entonces, tal como se explica en los ejemplos, que esta proteína de fusión podría estimular la recombinación en regiones anteriormente frías, lo que condujo a la presente
invención.

Un objeto de la presente invención es un método para aumentar la recombinación entre cromosomas homólogos en una célula que está dividiéndose, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de expresar una proteína DBD-Spo11 (en la que DBD es un dominio de unión a ADN), en una célula que está dividiéndose.

La invención también se refiere a un método para realizar una recombinación dirigida entre dos o más polimorfismos portados por un mismo cromosoma en una célula, haciendo que se exprese dicha proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, en una célula que está dividiéndose, excluyendo una célula humana, y en el que el dominio de unión reconoce una secuencia de ADN situada entre o cerca de dichos polimorfismos.

Si es necesario, puede introducirse una secuencia de ADN reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a Spo11 en el genoma de la célula, mediante técnicas convencionales.

En los métodos de la invención, la célula que está dividiéndose puede ser una célula mitótica o meiótica.

En estos métodos, la célula puede comprender cromosomas artificiales que portan una o más secuencia(s) reconocida(s) por el dominio de unión a ADN operativamente unido a la proteína Spo11.

Si es necesario, el ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión DBD-Spo11 se integra de manera estable en el genoma de la célula.

Otro aspecto de la presente invención es un método para inducir recombinación meiótica en cromosomas artificiales en una célula, excluyendo una célula humana, que comprende la introducción en una célula meiótica de un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión DBD-Spo11, bajo el control de un promotor específico de meiosis, en el que el dominio de unión a ADN reconoce al menos una secuencia de dicho cromosoma artificial.

Según una ejecución de este método, la célula es una levadura, el cromosoma artificial es un YAC que consiste en ADN de levaduras o no de levaduras que tiene uno o más sitios con una secuencia CGGN_{11}CGG, y la proteína de fusión es una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

La invención también se refiere a un método para generar variantes de un organismo, excluyendo organismos humanos, que comprende las etapas de inducir una recombinación meiótica usando una proteína de fusión DBD-Spo11, bajo el control de un promotor específico de meiosis, expresada en una célula meiótica, y hacer que se produzca la recombinación meiótica a una tasa superior y/o en locus diferentes de los cromosomas homólogos de las células meióticas.

Este método puede comprender además una etapa de examinar dichas variantes para determinar la presencia de dos o más caracteres.

De la misma forma, la presente invención abarca un método para analizar el genoma de un organismo, que comprende las etapas de generar variantes de dicho organismo, realizando el método anterior, realizar un análisis genético y un análisis fenotípico de ciertos caracteres de dichas variantes, y analizar el genoma de dicho organismo.

Todos los métodos según la invención pueden realizarse en cualquier clase de células eucariotas, excluyendo células humanas, y organismos, excluyendo organismos humanos, tales como hongos, plantas y animales.

Otro aspecto de la presente invención es un kit para realizar los métodos descritos anteriormente, que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicha proteína de fusión puede inducir recombinación meiótica en regiones anteriormente frías. Tal kit puede comprender además un ácido nucleico que porta una secuencia diana reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11.

Los ácidos nucleicos del kit según la invención pueden estar comprendido en un vector, que puede ser cualquier clase de vector, tal como, por ejemplo, plásmidos o cualquier clase de ADN replicativos, complejados con agentes de transfección si es necesario, o fagos o virus.

La invención también se refiere a una célula eucariota, excluyendo células humanas, que expresa una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en la que dicha proteína de fusión puede inducir recombinación meiótica en regiones anteriormente frías del genoma de dicha célula eucariota.

Esta célula eucariota puede ser por ejemplo un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero, excluyendo células humanas, o una célula de insecto.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a la misma, en los que dicha proteína Spo11 es, por ejemplo, la proteína AtSpo11 de Arabidopsis thaliana o la proteína Spo11 murina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Estructura y expresión de GAL4BD-SPO11

(A) Se construyó el plásmido pAP1 que contiene la fusión GAL4BD-SPO11 bajo el control del promotor (pADH1) y terminador (tADH1) de ADH1 tal como se describe en los procedimientos experimentales. Los residuos de aminoácido derivados de las proteínas Gal4BD y Spo11 se indican anteriormente y a continuación, respectivamente. (B) Para el análisis de tipo Northern, se preparó ARN total a partir de células con SPO11 (ORD5740) y GAL4BD-SPO11 (ORD5806) durante el crecimiento vegetativo (Y) o en momentos diferentes tras la transferencia a medio de esporulación y se hibridó con una sonda de SPO11. Volvieron a hibridarse las transferencias con una sonda de ACT1 para proporcionar una base de comparación. (C) Cuantificación de los niveles de transcrito de SP011 (círculos) y GAL4BD-SPO11 (cuadrados) con respecto al nivel de ARNm de ACT1 a lo largo del transcurso de la meiosis. (D) Se detectó la proteína Gal4BD-Spo11 mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-Gal4(DBD). Cargándose la misma cantidad de proteína en cada carril, la proteína de fusión está presente al mismo nivel en células ORD5806 durante todo el ciclo meiótico. No se detectó señal para diploides con spo11\Delta (ORD5805) en la meiosis.

Figura 2

Formación de DSB meiótica en los puntos calientes naturales YCR043c-YCR048w, ARG4 y CYS3 en diploides con SP011 y GAL4BD-SP011

Se preparó ADN genómico a partir de diploides con SPO11 (ORD1181) y GAL4BD-SPO11 (ORD5807) tomados en el momento indicado tras la transferencia a medio de esporulación y se detectaron las DSB mediante análisis de tipo Southern. Estas cepas son homocigóticas para el alelo rad50S::URA3, lo que permite la formación de DSB pero impide la resección y reparación (Alani et al., 1990). A la derecha de cada gel un mapa de la región muestra los ORF (las flechas en blanco indican el sentido transcripcional), los sitios de DSB (flechas) y las posiciones de las
sondas.

(A) Formación de DSB en la región YCR043c-YCR048w. Se digirió el ADN con AseI y se examinó con sonda con un fragmento interno de YCR048w. Se muestran las supuestas secuencias de unión consenso a Gal4 en el ORF de YCR048w como barras negras. (B) Cuantificación de las DSB prominentes en las células con SPO11 y GAL4BD-SPO11 se muestra en la figura 2A. Las sumas de las frecuencias de formación de DSB en el promotor de YCR046c (1), el promotor de YCR047c-YCR048w (2) y el ORF de YCR048w (3) se representan como un histograma. Estas sumas representan \geq 99% de las DSB totales detectadas en la región YCR043c-YCR048w. (C) Formación de DSB en el locus ARG4. Se digirió el ADN con SnaBI y se examinó con sonda con un fragmento interno de ARG4. El asterisco indica una banda de hibridación cruzada. (D) Formación de DSB en el locus CYS3. Se digirió el ADN con HindIII y se examinó con sonda con un fragmento interno de FUN36.

Figura 3

DSB promovidas por GAL4BD-SPO11 en locus con secuencias UAS_{GAL}

Se preparó ADN genómico a partir de diploides con SPO11 (ORD1181) y GAL4BD-SPO11 (ORD5807) y se analizó tal como se describió en la figura 2. Las secuencias UAS_{GAL} se indican como cajas. (A) Formación de DSB en el locus GAL2. Se digirió el ADN con XbaI-NcoI y se examinó con sonda con un fragmento interno de GAL2. (B) Formación de DSB en el locus GAL1,7,10. Se digirió el ADN con ClaI-AatII y se examinó con sonda con un fragmento interno de GAL1.

Figura 4

La recombinación se estimula en el locus GAL2 en una cepa con GAL4BD-SPO11

(A) Formación de DSB en el locus GAL2 en una cepa con RAD50 (ORD5806). Se digirió el ADN genómico con XbaI-NcoI y se examinó con sonda con un fragmento interno de GAL2. La flecha a la izquierda muestra las DSB en el sitio UAS_{GAL} de GAL2 en una cepa con rad50S (ORD 5807) isogénica; la barra a la derecha indica el grado de "mancha" de los fragmentos de DSB. (B) Segregación de los alelos con GAL2 y gal2-Bsp entre la progenie de un diploide con GAL4BD-SPO11 (ORD6626). Se diseccionaron tétradas en YPD y se obtuvieron réplicas de las colonias mediante siembra en placa en YPGal. El alelo con gal2-Bsp confiere un fenotipo de crecimiento lento. Pueden observarse en este ejemplo las conversiones génicas (3+:1- y 1+:3-) y los patrones de segregación mendeliana (2+:2-). (C) Frecuencias de conversión génica meiótica en el locus GAL2 en diploides con GAL4BD-SPO11 (ORD6626) y SPO11 (ORD6632) heterocigóticos para los alelos GAL2 y gal2-Bsp.

Figura 5

El locus GAL2 está ubicado en una región fría

Análisis por transferencia de tipo Southern de la formación de DSB en un intervalo de 20 kb centrado en el locus GAL2. Se digirió ADN meiótico de diploides con SPO11 (ORD1181) y GAL4BD-SPO11 (ORD5807) con las enzimas de restricción indicadas y se examinaron con sonda con un fragmento interno de GAL2. La representación esquemática muestra los sentidos transcripcionales de los genes y los sitios de restricción relevantes. Las flechas indican los sitios de DSB.

Figura 6

Requisitos genéticos para la formación de DSB en cepas con SPO11 y GAL4BD.SP011

Se llevaron a cabo análisis por transferencia de tipo Southern tal como en las figuras 2 y 3 para medir las frecuencias de DSB meiótica (eje z) en el locus GAL2, el ORF de YCR048w y el promotor de YCR048w (eje y) en diploides que portaban los constructos SPO11 o GAL4BD-SPO11 (barras negras o blancas, respectivamente) en antecedentes de tipo natural y mutantes (tal como se indica en el eje x). Los genotipos de todas las cepas sometidas a ensayo se enumeran en la tabla I. Se determinaron las frecuencias de DSB a las 8 ó 10 h tras la transferencia a medio de esporulación.

Figura 7

Formación de DSB meióticas en las regiones YCR048W (figura 7A) y GAL2 (figura 7B)

Se detectan las DSB meióticas con bandas más cortas. Las DSB intrínsecas y los sitios de DSB dependientes del sitio UAS se indican mediante flechas continuas y de puntos, respectivamente. Ambos constructos, mediante los cuales se expresa la proteína de fusión Gat4BD-Spo11 de manera extremadamente temprana (promotor de IME1) y temprana (promotor de REC8) durante la profase de la meiosis, permiten dirigir las DSB a los sitios UAS.

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Figura 8

Formación de DSB meióticas en las regiones YCR04BW y GAL2

Se detectan las DSB meióticas con bandas más cortas. Las DSB intrínsecas y los sitios de DSB dependientes del sitio UAS se indican mediante flechas continuas y de puntos, respectivamente. El constructo, mediante el cual se expresa la proteína de fusión Gal4BD-Rec104 de manera constitutiva, permite dirigir las DSB a los sitios UAS.

Figura 9

Secuencia del constructo P_{IME1}-Gal4BD-Spo11

La secuencia del promotor de IME1 está subrayada, la secuencia que codifica para el dominio de unión de GAL4 está en negrita y la secuencia que codifica para la porción de Spo11 de la proteína de fusión Gal4BD-Spo11 está en cursiva.

Figura 10

Secuencia del constructo P_{REC8}-Gal4BD-Spo11

La secuencia del promotor de REC8 está subrayada, la secuencia que codifica para el dominio de unión de Gal4 está en negrita y la secuencia que codifica la porción de Spo11 de la proteína de fusión Gal4BD-Spo11 está en cursiva.

Figura 11

Secuencia del constructo P_{ADH1}-QQR-Spo11

La secuencia del promotor de ADH1 está subrayada, la secuencia que codifica para el dominio de unión a QQR está en negrita y la secuencia que codifica para la porción de Spo11 de la proteína de fusión QQR-Spo11 está en cursiva.

Figura 12

Secuencia del constructo P_{ADH1}-Gal4BD-Rec104

La secuencia del promotor de ADH1 está subrayada, la secuencia que codifica para el dominio de unión de Gal4 está en negrita, y la secuencia que codifica la porción de Rec104 de la proteína de fusión Gal4BD-Rec104 está en cursiva.

Figura 13

Secuencia del constructo P_{AtSPO11}-Gal4BD-AtSpo11-1

La secuencia del promotor de AtSPO11 está subrayada, la secuencia que codifica para el dominio de unión de Gal4 está en negrita y la secuencia que codifica para la porción de AtSpo11 de la proteína de fusión Gal4BD-AtSpo11-1 está en cursiva.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

A lo largo de esta solicitud, se emplean varias palabras, cuyo significado debe entenderse según las siguientes definiciones:

Una proteína de fusión es una proteína quimérica que comprende al menos dos restos que se originan a partir de diferentes fuentes. Normalmente, es el producto de un gen de fusión que comprende secuencias codificantes que se originan a partir de diferentes fuentes, en el que dichas secuencias codificantes están en marco.

La presente invención implica proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11. En estas fusiones, el dominio de unión a ADN, o DBD, es cualquier dominio de cualquier proteína, que tiene la propiedad de unirse al ADN, ya sea esta unión específica de secuencia o no. Ejemplos de DBD no específicos son las topoisomerasas como TopoI y TopoII y las proteínas de intercambio de cadena tales como Rad 51, y ejemplos de DBD específicos de secuencia son el DBD de Gal4 (indicado en lo sucesivo Gal4BD), el QQR (Smith, Bibikova et al, 2000) o el represor lexA. Por supuesto, estos ejemplos son puramente indicativos, y pueden usarse otros DBD para realizar la invención. En las figuras 9 y 10 se proporciona la secuencia de un ejemplo de proteína Gal4BD-Spo11, y en la figura 11 se muestra la secuencia de un ejemplo de QQR-Spo11.

El segundo resto de las proteínas de fusión según la invención es una proteína Spo11. Este término designa el producto proteico del gen SPO11 identificado en S. cerevisiae (Esposito y Esposito, 1969), pero también las proteínas ortólogas de Spo11, es decir, los productos de genes ortólogos del gen SPO11, entendiéndose que genes ortólogos son genes homólogos que se encuentran en dos taxones diferentes y que realizan la misma función en cada taxón. Otros ejemplos de proteínas Spo11 son la AtSpo11 de Arabidipsis thaliana (Grelon et al, 2001), y la mSpo11 murina, cuya secuencia se describe en (Baudat y Keeney, 2000).

Alternativamente, el segundo resto de las proteínas de fusión puede ser una proteína diferente de Spo11, que es una pareja de Spo11 implicada en la formación de DSB y que puede reclutar Spo11. Por "reclutar" hace referencia al hecho de que la proteína de fusión DBD-pareja formará un complejo con Spo11, que conducirá a la formación de DSB en el sitio seleccionado como diana por el DBD. El término "pareja" usado a continuación designará una pareja de Spo11 que puede reclutar Spo11. Se citan ejemplos de proteínas que pueden usarse como segundo resto en las proteínas de fusión según la invención en los artículos revisados por Keeney (2001) y por Smith y Nicolas (1998).

Los dos restos de las proteínas de fusión implicadas en la presente invención (el DBD y Spo11 o una de sus parejas) están "operativamente unidos", lo que significa que la proteína de fusión conserva la capacidad de unirse al ADN a través del resto de DBD (de una manera específica de secuencia si el DBD es específico de secuencia), y conserva también las funciones iniciales de Spo11 (generación de roturas bicatenarias). Dependiendo del DBD y la Spo11, el resto de DBD puede ubicarse en el extremo N-terminal o C-terminal de la fusión. Alternativamente, pueden fusionarse dos DBD (posiblemente diferentes) a Spo11, uno en cada extremo de la proteína.

Aparecerán otras definiciones en la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas.

De manera interesante, tal como se describe en los ejemplos, la presente invención proporciona una forma novedosa de aumentar sustancialmente la frecuencia de recombinación homóloga durante la meiosis y de dirigir esta recombinación mediante una sencilla modificación de la proteína Spo11. Informes previos han descrito el uso de nucleasas específicas de sitio, tales como I-Scel, HO o VDE para estimular localmente la recombinación homóloga meiótica. El presente método de añadir un dominio de unión a ADN heterólogo a Spo11 proporciona una estrategia alternativa con características distintas y ventajas prácticas. Por ejemplo, este enfoque explota sitios cromosómicos que se producen de manera natural de baja complejidad, multiplicando de ese modo el número de posibles dianas sin requerir la introducción previa de una secuencia específica ni la deleción del gen SPO11 residente. Además, la escisión permanece bajo control fisiológico normal con respecto a determinantes que actúan en cis y trans, y como consecuencia, se reparan las DSB mediante la ruta de recombinación homóloga, permitiendo la producción de gametos viables y la recuperación de recombinantes novedosos.

La presente invención se refiere a un método para aumentar la recombinación entre cromosomas homólogos en una célula que está dividiéndose, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que aumenta la recombinación entre cromosomas homólogos en dicha célula.

De hecho, tal como se describe más adelante en el ejemplo 1, los inventores han demostrado que una proteína Gal4BD-Spo11 podía inducir roturas bicatenarias en puntos calientes naturales y, además, a nivel de las secuencias consenso de Gal4BD, incluso si están situadas en regiones frías del genoma. Si es necesario, el método anterior puede comprender además, antes de la etapa (ii), una etapa de introducir en el genoma de dicha célula una secuencia de ADN reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11. La introducción de varias de tales secuencias aumentará la tasa de recombinación homóloga en la célula. Además, estas secuencias pueden introducirse en ciertas ubicaciones, permitiendo de ese modo un direccionamiento de la recombinación, tal como se describe con más detalles a continuación.

Alternativamente, el método anterior puede realizarse introduciendo un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, entre un dominio de unión a ADN y una pareja de Spo11 implicada en la formación de DSB y que puede reclutar Spo11. Tal como ya se mencionó anteriormente, la proteína que puede usarse según esta realización específica de la solicitud puede seleccionarse, por ejemplo, de las proteínas citadas en los artículos revisados por Keeney (2001) y por Smith y Nicolas (1998), y más específicamente del grupo que comprende REC102, REC103/SK18, REC101, REC114, MEI4, MRE2/NAM8, MER2/REC107, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1 en mamíferos, HOP1, RED1, SAE2/COM1, MER1 y MEK1. Esta realización de la invención se ilustra mediante una proteína Gal4BD-Rec104, en el ejemplo 1.10. A lo largo de todo el texto a continuación, el término "Spo11" en proteínas de fusión debe entenderse por tanto o bien como la propia proteína Spo11, o bien como una pareja de Spo11 que puede reclutar Spo11.

Este método puede realizarse con una célula que comprende cromosomas artificiales que portan una o más secuencia(s) reconocida(s) por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a la proteína Spo11. De hecho, tal como se explica en el ejemplo 5, los cromosomas artificiales no siempre se recombinan durante la meiosis, lo que conduce a problemas de segregación, y por tanto a la pérdida de estos cromosomas en algunas células hijas.

En el método descrito anteriormente, el ácido nucleico introducido en la célula en la etapa (i), que codifica para la proteína de fusión DBD-Sdpo11, puede mantenerse episomal, ya sea en un episoma transitorio o en un episoma estable. Un episoma transitorio es una molécula de ADN que permanece fuera del genoma de la célula y que no siempre se transmitirá a las células hijas durante las divisiones celulares. Puede ser, por ejemplo, y dependiendo de las células huésped, un plásmido o un genoma de vector adenoviral. Un episoma estable es uno que se replicará y transmitirá a las células hijas, tal como, por ejemplo, un replicón que porta el sistema oriP-EBNA-1 del virus de Epstein-Barr. De manera importante, los inventores han demostrado que pueden inducirse roturas bicatenarias meióticas dirigidas mediante Gal4BD-Spo11 codificada por un plásmido introducido en la célula, sin alterar el gen SPO11 residente.

En una realización específica del método anterior, que se ilustra en el ejemplo 1, la célula es una levadura y el ácido nucleico introducido en la misma en la etapa (i) codifica para una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

La presente invención también se refiere a un método para realizar una recombinación dirigida entre dos o más polimorfismos portados por un mismo cromosoma en una célula, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una secuencia situada entre dichos dos o más polimorfismos, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce la recombinación entre dichos dos o más polimorfismos en dicha célula.

Un método para dirigir una conversión génica en una célula, excluyendo una célula humana, es decir, una transferencia local de uno o varios polimorfismo(s), dando como resultado una adquisición unidireccional de dicho polimorfismo por un cromosoma, es también parte de la invención. De hecho, la presente invención permite la obtención de diferentes haplotipos mediante conversión génica así como mediante entrecruzamiento. Este último método comprende las siguientes etapas:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una secuencia situada cerca del/de los polimorfismo(s) que va(n) a transferirse, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce la conversión génica.

Estos métodos pueden ser particularmente útiles para estudiar interacciones entre genes que normalmente se segregan juntos, en particular genes que están situados en una región del ADN que no comprende ningún punto caliente. Si es necesario, estos métodos pueden comprender además antes de la etapa (ii), una etapa de introducir en el genoma de dicha célula, entre o cerca de dicho(s) polimorfismo(s), una secuencia de ADN reconocida por el dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11.

En el método para realizar una recombinación dirigida según la invención, la célula, excluyendo una célula humana, puede comprender cromosomas artificiales que portan una o más secuencia(s) reconocida(s) por el DBD operativamente unido a la proteína Spo11. Por tanto, este método ayuda a dirigir la recombinación homóloga en ubicaciones específicas a lo largo de los cromosomas artificiales.

En una realización preferida de los métodos anteriores, la célula es una levadura, y el resto de Spo11 proviene de S. cerevisiae. Opcionalmente, el DBD es el Gal4BD.

En una realización preferida de los métodos de la invención, la división celular realizada en la etapa (ii) es una meiosis. Algunas células, tales como levaduras, pueden iniciar una meiosis y luego retornar a una mitosis, mediante un proceso denominado "retorno al crecimiento", o RTG. En tales células, el método puede realizarse induciendo la recombinación en una etapa temprana de la meiosis, y luego haciendo que las células retornen al crecimiento.

Otro aspecto de la presente invención es un método para inducir recombinación meiótica en cromosomas artificiales en una célula, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una o más secuencia(s) portada(s) por dichos cromosomas artificiales, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce recombinación meiótica entre cromosomas artificiales.

Tal como se mencionó anteriormente, los cromosomas artificiales no se recombinan necesariamente durante la meiosis, acarreando de ese modo problemas de segregación. Ésta es una desventaja principal que limita el uso de cromosomas artificiales. En esta memoria descriptiva, el término "cromosoma artificial" no sólo designa cromosomas completamente artificiales (tales como YAC), si no también cromosomas homólogos y heterólogos de otras cepas. Por ejemplo, en levaduras, es posible obtener cepas híbridas que comprenden cromosomas que se originan de diferentes cepas de tipo natural. Tales cromosomas, cuando tienen un porcentaje de identidad relativamente alto, se denominan "homólogos", mientras que los cromosomas que son menos cercanos en secuencia son "heterólogos". En levaduras híbridas, los cromosomas heterólogos y, en un menor grado los homólogos, no consiguen recombinarse durante la meiosis.

Al permitir la recombinación meiótica entre cromosomas artificiales en una célula, excluyendo una célula humana, la presente invención abre nuevas posibilidades interesantes, en particular en industrias que implican a las levaduras. Por ejemplo, en el campo de la fabricación de cerveza, las levaduras son a menudo cepas híbridas, ya que el experto en la técnica intenta combinar en la misma cepa varios caracteres ventajosos de diferentes cepas de tipo natural. La selección de cepas óptimas no es fácil, especialmente porque estas cepas no pueden esporular, por la razón mencionada anteriormente.

El método de la invención ayuda generalmente a recombinar haplotipos en una célula. Las recombinaciones obtenidas mediante este método pueden ser alélicas, cuando se producen entre las mismas posiciones en cromosomas homólogos, o ectópicas, cuando se producen entre regiones que son sólo localmente homólogas. Por tanto, el método permite crear translocaciones entre los cromosomas. En consecuencia, el método según la invención, al permitir la recombinación entre los diferentes cromosomas en células durante la división celular, podría aumentar sin duda el rendimiento de las cepas de levaduras mencionadas anteriormente y, más generalmente, de cualquier clase de cepas usadas en la industria. De manera interesante, tal como se mencionó anteriormente, es posible inducir la recombinación en una etapa temprana de la meiosis, y luego dejar que la célula regrese a la mitosis, mediante el proceso RTG.

En una realización específica del método para inducir recombinación en cromosomas artificiales, en el que la célula es una levadura, el cromosoma artificial es un YAC que tiene uno o más sitios con una secuencia CGGN_{11}CGG, y la proteína de fusión es una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

La recombinación de cromosomas artificiales también puede conducir a un uso más amplio de esta herramienta en una síntesis proteica en cultivos de células eucariotas, por ejemplo en el campo farmacéutico.

La presente invención también se refiere a un método para generar variantes de un organismo, excluyendo organismos humanos, que comprende las etapas de

(i)

introducir en una célula de dicho organismo un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una o más secuencia(s) portada(s) por el genoma de dicha célula;

(ii)

hacer que la célula realice una meiosis, de modo que se produce recombinación meiótica entre cromosomas homólogos de dicha célula, a una tasa superior y/o en locus diferentes que en una meiosis natural de dicho organismo; y

(iii)

generar variantes de dicho organismo con la célula obtenida en la etapa (ii).

En este método, el término "variante" debe entenderse en sentido amplio, y designa un organismo que presenta al menos una diferencia fenotípica o genotípica en relación con su(s) progenitor(es). Las variantes que resultan de la recombinación entre cromosomas homólogos resultarán de la reasociación de polimorfismos genéticos, definidos por la secuencia de ADN, que se producen entre o dentro de los genes. De manera más general, una variante designa en el presente documento un organismo, excluyendo un organismo humano, cuyo haplotipo es diferente del/de los haplotipo(s)
de su(s) progenitor(es).

Tal como se describió anteriormente, Spo11 es homóloga con respecto a una topoisomerasa de arqueobacterias (Bergerat, de Massy, 1997). Sin embargo, los métodos según la presente invención se realizan preferiblemente en células eucariotas. Estas células pueden seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero y una célula de insecto. La parte experimental descrita más adelante ilustra ejemplos de tales células, S. cerevisiae para los hongos, A. thaliana para las plantas, ratón para los mamíferos, y Drosophila para los insectos. De todas formas, en el método anterior para generar variantes de un organismo, este organismo puede seleccionarse del grupo que consiste en un hongo, una planta, un mamífero no humano y un insecto.

El método para generar variantes de un organismo, excluyendo un organismo humano, según la invención, puede comprender además una etapa de examinar las variantes obtenidas para determinar la presencia de dos o más caracteres. Este método, al aumentar la tasa de recombinación y/o al inducir recombinación meiótica dirigida, permite la obtención rápida de variantes que combinan caracteres diferentes de las células progenitoras. Por tanto, puede disminuir drásticamente la cantidad de individuos que deben examinarse para encontrar uno que presente una cierta combinación de alelos.

El método descrito anteriormente conduce a otro aspecto de la presente invención, que es un método para analizar el genoma de un organismo, que comprende las etapas de:

(i)

generar variantes de dicho organismo, según el método de la invención;

(ii)

realizar un análisis genético y un análisis fenotípico de ciertos caracteres de dichas variantes; y

(iii)

analizar el genoma de dicho organismo.

De hecho, la rápida obtención de un gran número de variantes facilita indudablemente establecer una correlación entre genotipos y fenotipos, ya que se reduce la cantidad de organismos (por ejemplo, ratones) que deben examinarse para encontrar alguno con el/los alelo(s) deseados.

Las variantes que pueden obtenerse mediante el método de la invención pueden usarse en modelos experimentales para examinar el efecto de un compuesto de cualquier clase, por ejemplo en el transcurso del desarrollo de fármacos, o para obtener una célula huésped apropiada adecuada para una expresión génica recombinante.

La presente invención también se refiere a un kit para realizar los métodos descritos anteriormente, que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que la proteína de fusión puede inducir roturas bicatenarias en regiones anteriormente frías.

En este kit, Spo11 puede tener la secuencia de una proteína Spo11 de una célula, excluyendo una célula humana, seleccionada, seleccionada del grupo de un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero y una célula de insecto. Ejemplos de tales secuencias son spo11 de S. cerevisiae (levaduras), Atspo11 de A. thaliana (plantas), la spo11 murina (mamíferos), y spo11 de Drosophila (insectos). Por supuesto, estos ejemplos no son restrictivos, y puede usarse cualquier gen ortólogo de spo11 de cualquier otro organismo.

El kit de la invención puede comprender además un ácido nucleico que porta una secuencia diana reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11. Esta secuencia diana puede estar comprendida en cualquier clase de vector, por ejemplo en un vector de clonación que comprende un elevado número de sitios de restricción, de modo que se facilitan constructos para insertar esta secuencia diana en el locus deseado del cromosoma deseado.

El ácido nucleico que comprende la secuencia de OBD-spo11 también puede estar comprendido en un vector. Tal como se mencionó anteriormente, los métodos de la invención pueden realizarse sin integrar el gen DBD-spo11 en el genoma de la célula. Por tanto, y dependiendo del tipo de células, una gran variedad de vectores son apropiados, tales como plásmidos, ADN replicativos, ácidos nucleicos complejados con cualquier clase de agentes de transfección, fagos y virus. Pueden usarse diferentes virus como vectores para introducir el ácido nucleico que comprende la secuencia de DBD-spo11 en células de mamífero, algunos de los cuales se integrarán en el genoma de la célula (tales como retrovirus, por ejemplo), mientras que algunos no lo harán (por ejemplo, adenovirus).

También es parte de la presente invención una célula eucariota, excluyendo una célula humana, que expresa una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en la que dicha proteína de fusión puede inducir roturas bicatenarias en regiones anteriormente frías del genoma de dicha célula eucariota. Por supuesto, la frase "región de puntos fríos", en este contexto, designa regiones de puntos fríos para la recombinación meiótica. En esta célula, el gen DBD-spo11 está bajo el control de un promotor específico de meiosis. La célula según la invención también puede modificarse mediante ingeniería genética de modo que se modifica la expresión de proteínas específicas de meiosis, tal como se explica en el ejemplo 6. Esta célula puede ser por ejemplo un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero o una célula de insecto.

Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para una proteína de fusión que comprende un resto de Spo11 y un dominio de unión a ADN unido al mismo, en el que dicha proteína Spo11 es, por ejemplo, la proteína AtSpo11 de Arabidopsis thaliana o la proteína Spo11 murina.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos pueden realizarse usando los procedimientos experimentales descritos a continuación:

Procedimientos experimentales Construcción de plásmidos

Para crear el plásmido pAP1 integrativo, que codifica para la fusión Gal4BD-Spo11, se generó el ORF de SPO11 mediante PCR y se introdujo como un fragmento BamHI/PstI en sentido 3' de la secuencia que codifica el dominio de unión a ADN de Gal4 (Gal4BD) en el vector de dos híbridos pAS2\Delta\Delta (Fromont-Racine, Rain et al. 1997). La fusión N-terminal en marco de Gal4BD a Spo11 y el ORF completo se verificaron mediante secuenciación. Se insertó el casete de resistencia a fármacos kanMX4 (Wach, 1996) en un sitio NruI único, y se eliminó el origen de replicación de 2\mu sustituyendo un fragmento BpmI-Bsu36I por el fragmento correspondiente de pRS304 (Sikorski y Hieter, 1989) produciendo pAP1. Para crear plCM99, se amplificó el locus GAL2 a partir de ADN genómico y se sometió a mutagénesis un subclón que contenía la región promotora y los primeros 655 pb del ORF de GAL2 con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene). Esta mutación de desplazamiento del marco genera un sitio de restricción BspHI y da lugar a una proteína truncada de 66 aminoácidos. Se secuenció el fragmento relevante para confirmar la mutación y finalmente se subclonó en pRS306 (Sikorski y Hieter, 1989), produciendo plCM99.

Cepas de levaduras

Todas las cepas de levadura son derivados isogénicos de SK1 (Kane y Roth, 1974). Se obtuvieron mediante transformación o cruzamiento y sus genotipos relevantes se muestran en la tabla I. Se integró pAP1 digerido con XbaI en el locus trp1 mediante transformación usando el método de acetato de litio/polietilenglicol (Ausubel et al., 1988). Se seleccionaron transformantes resistentes a G418 (200 \mug/ml) y se comprobaron para determinar la prototrofia de triptófano. Se verificó el direccionamiento correcto mediante análisis de tipo Southern. Se introdujo la mutación gal2-BspHl en el locus GAL2 mediante el procedimiento de sustitución en dos etapas usando URA3 como un marcador seleccionable (Ausubel et al., 1988). Para la transformación, se linealizó plCM99 en el sitio Bg/II único en el ORF de GAL2, y se verificó el direccionamiento mediante PCR y análisis de tipo Southern. Se confirmó la retención de la mutación puntual deseada entre clones que aparecieron de pronto resistentes a 5-fluoroorotato mediante análisis de restricción con BspHI de fragmentos de GAL2 amplificados.

Medios y técnicas genéticas

Se usaron medios convencionales (YPD) y SD (base de nitrógeno de levaduras al 0,67% sin aminoácidos, glucosa al 2%), complementados cuando fue necesario con nutrientes apropiados (Sherman et al., 1983), para el crecimiento vegetativo. Se prepararon cultivos meióticos tal como se describe (Alani et al., 1990). El medio YPGal con galactosa completo, en el que la glucosa se sustituyó por galactosa (20 g/l), permitió la monitorización de la segregación del alelo gal2-BspHI. Se determinaron las viabilidades de las esporas diseccionando ascas con cuatro esporas producidas en medio de esporulación tras 48 h.

Técnicas moleculares

Para la detección y cuantificación de las DSB, se preparó ADN genómico a partir de células en esporulación y se sometieron a análisis de tipo Southern. Se visualizaron bandas de DSB y progenitoras con un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad y se cuantificaron con el uso del programa ImageQuant (Molecular Dynamics) tal como se describe (Vedel y Nicolas, 1999). Se realizó análisis de tipo Northern tal como se describe (Smith et al., 2001). Se prepararon extractos de células completas y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo anti-Gal4 (DBD) (Santa Cruz Biotechnology) usando procedimientos convencionales (Ausubel et al., 1988).

Descripción de constructos de plásmido Constructo promotor de IME1-GAL4BD-SPO11: plásmido denominado pAP111

Se construyó el plásmido pAP11 mediante deleción del fragmento SacI-SacI (posición 1891-3330) de pAP1 (Pecina et al., 2002). Se subclonó el plásmido pBS delta1 que contenía el fragmento XhoI de 1216 pb de pAP11 en el plásmido pBS delta0 derivado anteriormente mediante deleción del fragmento SmaI-HincII de pBlueScript. Se aisló el promotor de IME1 a partir del plásmido p2053 (Guttmann-Raviv et al., 2001) cortando con SphI, seguido por tratamiento con Klenow y cortando con HindIII. Se insertó este fragmento en el vector pBS delta1 cortado mediante EcoRV y HindIII. Esto crea un plásmido pBS delta11. Entonces se escindió la región que contenía el promotor de IME1 de pBSdelta11 mediante XhoI y se subclonó en el sitio XhoI de pAP11 para crear el plásmido pAP111.

Constructo promotor de REC8-GAL4BD-SPO11: plásmido denominado pAP118

Se subclonó el fragmento SacI-BamHI de 1471 pb del plásmido pAP11 en el plásmido pBS delta0 para crear el plásmido pBS delta2. Se amplificó el promotor de REC8 a partir de ADN genómico de la cepa ORD7254-25D (antecedente SK1) de S. cerevisiae con dos cebadores, REC8 UP (5'-CGATATCTATACATTACCAATCCTTCCT-3'), y REC8 LO (5'-CAAGCTTTGCAGAATATTTGTAATATT-3') y se clonó en pGEM T-easy (Promega) y se secuenció. Entonces se subclonó el fragmento EcoRV-HindIII (que contenía el promotor de REC8) en el plásmido pBSdelta2 escindido también mediante EcoRV-HindIII. Esto crea el plásmido pBS delta28. Finalmente, se subclonó el fragmento Sac/-BamHI (que contenía el promotor de REC8) de pBS delta28 en el plásmido pAP11 escindido en los sitos SacI-BamHI para crear el plásmido pAP118.

Constructo promotor de ADH1-QQR-SPO11: plásmido denominado pAP119

Se amplificó el fragmento QQR a partir de ADN de plásmido de pET15bi QQR(Lo) FN (proporcionado por la Dr. Dana Carroll, Universidad de Utah, EE.UU, Smith, Bibikova et al, 2000) con dos cebadores, QQR UP (5'-AAGCT
TATGGAAAAACTGCGGA-3'), y QQR LO (5'-TGGCCATAAATTCCGGACTAGTTGCTTCTTAT-3'). Se clonó el fragmento amplificado en el vector pGEM T-easy (Promega) y se secuenció. Entonces, se subclonó el fragmento QQR en el vector pBS delta2 escindido con HindIII y MscI para crear el plásmido pBS delta29. Finalmente, se insertó el fragmento SacI-BamHI de pBS delta29 (que contenía la secuencia de QQR) en el plásmido pAP11 escindido mediante SacI-BamHI. Esto crea el plásmido pAP119.

Constructo de promotor de ADH1-GAL4BD-REC104: plásmido denominado eXP3

Se amplificó la región codificante de REC104 mediante PCR a partir de la cepa ORD7254-25D (antecedente SK1) de S. cerevisiae con dos cebadores, REC104UP (5'-GAGATGGCCATGGAGGCCATGTCCATCGAGGAG
GAAGAT-3'), y REC104LO (5'-GGATCCCCGGGGCTCAGGGACTACTAAACTGAAA-3'). Se clonó el fragmento amplificado en el vector pCR2.1 y se verificó. Entonces, se subclonó el fragmento REC104 en el vector integrativo pASIN escindido mediante SfiI y XmaI. Esto crea el plásmido pXP3. El plásmido pASIN (promotor de ADH1-GAL4BD, AmpR, TRP1) deriva de pAS2\Delta\Delta (Fromont-Racine, Rain et al., 1997) mediante eliminación del origen de replicación de 2 micrómetros.

Plásmido cphs-gal4bd-meiw68

Se aisló el ADNc de mei-W68 (ortólogo de Drosophila de Spo11) a partir del plásmido pAH69 (Kim McKim y Aki Hayashi-Hagihara, 1998).

-

Clonación de XmnI-DraI de pAH69 en pAS2\Delta\Delta digerido mediante SmaI. Se crea el plásmido pAPAP1.

-

Amplificación por PCR y clonación de un fragmento mei-W68 en pGemT-easy: pGEMT-easy(mei5,). Cebadores:

5'meiW68: 5'-ggaatggccacaatggatgaattttcgg-3'

3'meiW68: 5'-ggtgaaacttcctccgcggac-3'

-

Clonación del fragmento MscI-SacII de pGEMT-easy (mei5,) en pAPAP1. Esto crea el plásmido pAPAP2. Este plásmido contiene la proteína de fusión Gal4BD-meiW68 bajo el promotor de ADH1 en un plásmido replicativo con marcadores de Amp y TRP1.

-

Clonación de BsgI-SalI de pAPAP2 en el vector de Drosphila pCasper-hs (Hpal) que contiene el promotor de HsP70. Esto crea el plásmido cphs-gaI4bd-meiw68.

Integración de los constructos y cepas

Se linealizó pXP3 con XbaI y se usó para la transformación de ORD7254-25D (\alpha, ura3, leu2, trp1, his4). Se llevó a cabo la transformación con el método del acetato de litio y se propagaron las células en una placa mermada en triptófano. Se verificaron las células transformadas mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Se cruzaron estas células transformadas, se hicieron esporular y se aparearon los segregantes para crear la cepa
ORD7770.

Se linealizó pAP111 con Bsu361 y se usó para la transformación de ORD7254-25D (\alpha, ura3, leu2, trp1, his4). Se llevó a cabo la transformación con el método del acetato de litio y se propagaron las células en una placa mermada en triptófano. Se verificaron las células transformadas mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Se cruzaron las células transformadas, se hicieron esporular y se aparearon los segregantes para crear la cepa ORD8016.

Se linealizó pAP118 con XbaI y se usó para la transformación de ORD7254-25D (\alpha, ura3, leu2, trp1, his4). Se llevó a cabo la transformación con el método del acetato de litio y se propagaron las células en una placa mermada en triptófano. Se verificaron las células transformadas mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Se cruzaron las células transformadas, se hicieron esporular y se aparearon los segregantes para crear la cepa ORD8016.

Aislamiento de ADN y detección de DSB

Se recogieron diez mililitros de cultivos meióticos en cada punto de tiempo y se lavaron una vez con agua estéril. Se produjo un esferoplasto mediante incubación con Zymolyase 20T (Chemical Credential, ICN) durante 30 min. a 30ºC. Se lisó el esferoplasto en 500 \mul de disolución de lisado (EDTA 50 mM, proteinasa K 200 ng/ml, SDS al 0,4%) durante 30 min. a 65ºC. Entonces, se añadieron 200 \mul de acetato de potasio 5 M y se incubó durante más de 1 hora en hielo. Tras centrifugación durante 15 min. a la velocidad de 13000 rpm, se extrajeron los sobrenadantes a tubos ependorf nuevos y se añadieron 500 \mul de isopropanol para precipitar el ácido nucleico. Se lavó el ácido nucleico precipitado con un 70% de etanol y se trató con ARNasa A durante 1 hora a 37ºC. Se precipitó el ADN con etanol y finalmente se resuspendió en agua estéril.

Se digirieron aproximadamente 1 \mug de ADN con AseI para la detección de DSB en la región YCR048W y con XbaI para la región GAL2(YLR081W). Se sometieron estas muestras a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se realizó la transferencia sobre una membrana de nylon (Hybond-N; Amarsham®). Para la detección de DSB en la región YCR048W y GAL2, se usaron ADN de marco de lectura abierto de YCR048W y GAL2 como sondas, respectivamente.

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Ejemplo 1

Estimulación dirigida de la recombinación meiótica en Saccharomyces cerevisiae 1.1 La proteína de fusión Gal4BD-Spo11 se expresa en la meiosis

Una fusión que codifica para el dominio de unión a ADN de Gal4 (Gal4BD, aminoácidos 1-147) con el extremo N-terminal de la proteína Spo11 de S. cerevisiae de longitud completa se puso bajo del control del promotor de ADH1 constitutivo (figura 1A) y se integró en el locus TRP1 en una cepa con spo11\Delta. Se derivaron diploides homocigóticos mediante cruzamientos genéticos (tabla 1).

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TABLA I Genotipos de las cepas

Las cepas son ho::LYS2/"lys2/" ura3/"trp1I". Todas las cepas se construyeron para este trabajo
excepto ORD1181 (Baudat y Nicolas, 1997) y ORD5740 (Smith et al, 2001).

1

2

3

4

Para verificar la expresión, se analizó el ARN total durante el crecimiento vegetativo o en diversos momentos tras la transferencia al medio de esporulación y se sometió a análisis por transferencia de tipo Northern. En diploides de tipo natural, el ARNm de SPO11 comienza a acumularse tras la transferencia de las células al medio de esporulación y disminuye tras 7 h, momento en el que la formación de ascosporas ha comenzado (figura 1B). Por el contrario, se detecta ARNm de GAL4BD-SPO11 tanto en células vegetativas como meióticas, pero tal como el ARNm de SPO11, disminuye en puntos de tiempo posteriores (6-7 h). La cuantificación de los niveles de transcrito (figura 1C) indica que la fusión se expresa altamente en células en crecimiento vegetativo y que los niveles de ARNm de GAL4BD-SPO11 son sólo ligeramente mayores que los niveles de ARNm de SPO11 durante la profase meiótica (2-6 h), lo más probablemente porque el promotor de ADH1 es menos activo en células meióticas que en mitóticas mientras que el promotor de SPO11 se induce fuertemente. Finalmente, el análisis por inmunotransferencia de tipo Western muestra que la proteína de fusión se expresa tanto en células GAL4BD-SPO11 mitóticas como meióticas y es del tamaño esperado, 63,5 kDa (figura 1D).

1.2. Gal4BD-Spo11 complementa el defecto de esporulación de una cepa con spo11\Delta

Las células con spo11\Delta diploides pueden esporular pero producir una progenie inviable porque los cromosomas se segregan de manera anómala cuando no está iniciada la recombinación meiótica. Los inventores examinaron si la proteína Gal4BD-Spo11 podría complementar los defectos de esporulación de un diploide con spo11\Delta. Tal como las cepas con spo11\Delta (ORD5805) y SPO11 (ORD5740) de tipo natural, un diploide con spo11\Delta de GAL4BD-SPO11 (ORD5806) esporula eficazmente (aproximadamente el 80%), dando lugar en primer lugar a ascas de cuatro esporas. El análisis de tétradas muestra que, como se esperaba, ninguna de las esporas producidas por los diploides con spo11\Delta germina (0/512). En cambio, la proteína de fusión Gal4BD-Spo11 restablece la viabilidad completa en las esporas con spo11\Delta (531/552, el 96%), la misma observada para la progenie del diploide con SPO11 (505/526, el 96%). Se encontró de manera similar una alta viabilidad de las esporas para un diploide que contiene tanto GAL4BD-SPO11 como SPO11 (ORD5817). En total, estos resultados demuestran que el constructo GAL4BD-SPO11 es funcional y que no confiere ningún efecto adverso.

1.3. Gal4BD-Spo11 promueve la formación de DSB en sitios naturales

Dado que la viabilidad de las esporas depende de la recombinación meiótica entre cada uno de un par de cromosomas homólogos, la complementación del defecto de spo11\Delta mediante GAL4BD-SPO11 sugirió que la proteína de fusión también podría recuperar el defecto de DSB de spo11\Delta. Para probar esta idea, se examinaron varias regiones del genoma en las que se forman normalmente DSB meióticas. La región YCR043c-YCR048w del cromosoma III contiene numerosos sitios de DSB, incluyendo un punto caliente fuerte en la región intergénica YCR047c-048w (Baudat y Nicolas, 1997). Tal como se muestra en la figura 2A, estas DSB se forman tanto en células meióticas SPO11 como GAL4BD-SPO11. En la cepa GAL4BD-SPO11 pueden observarse dos nuevos sitios de DSB dentro de la región codificante YCR048w, lo que es notable dado que las DSB naturales se restringen generalmente a regiones que contienen promotores (figura 2A, y véase a continuación). Un análisis cuantitativo de la intensidad de la banda de DSB indica que la frecuencia acumulativa de las DSB meióticas en esta región cromosómica de 9,6 kb es similar en ambas cepas (aproximadamente el 13 \pm 2%). En la mayoría de los casos, la frecuencia de DSB en un sitio dado es también similar, aunque las DSB se forman a una frecuencia inferior en la región intergénica YCR047c/48w del diploide con GAL4BD-SPO11 que en el diploide con SPO11 (el 5 \pm 1% frente al 11 \pm 1%, respectivamente) (figura 2B). De manera interesante, la disminución en la frecuencia de DSB en este sitio se compensa localmente mediante la aparición de nuevas DSB en el ORF de YCR048w (4 \pm 1%); esta redistribución sugiere una competición entre sitios de DSB adyacentes, tal como se notificó anteriormente para DSB iniciadas por Spo11 (Wu y Lichten, 1995). Se examinaron también otras dos regiones bien caracterizadas, los locus ARG4 (en el cromosoma VIII) y CYS3 (en el cromosoma I) (Vedel y Nicolas, 1999). En ambos casos, se detectaron perfiles de DSB meióticas similares en células SPO11 y GAL4BD-SPO11, con respecto a su ubicación e intensidad (figura 2C y 2D). En total, estos resultados demuestran que la proteína Gal4BD-Spo11 puede promover la formación de DSB en sitios naturales a frecuencias comparables con las promovidas por Spo11 de tipo natural, explicando de ese modo su capacidad para complementar totalmente la inviabilidad de las esporas con spo11\Delta.

1.4. Gal4BD-Spo11 promueve la formación de DSB cerca de los sitios de unión a ADN de Gal4 consenso

Tal como se describió anteriormente, se observaron dos sitios de DSB adicionales en la región codificante
YCR048w: un sitio fuerte cerca del extremo 5' del ORF de YCR048w y un sitio mucho más débil en sentido 3' (figura 2A). Estos nuevos sitios podrían resultar de una aberración en la especificidad de direccionamiento del dominio de la proteína Spo11 por sí mismo, al menos en regiones tales como el locus YCR048w en el que Spo11 ya es activa, o podrían reflejar la presencia fortuita de sitios de unión consenso de Gal4. De hecho, un examen de la secuencia de YCR048w revela dos sitios de este tipo dentro del ORF, en las posiciones +295 y +1320 nt desde el sitio de iniciación de la traducción, respectivamente, lo que se correlaciona con las ubicaciones estimadas de las dos nuevas DSB específicas de Gal4BD-Spo11 en este locus. Esta observación indica que la proteína Gal4BD-Spo11 puede dirigir las DSB a secuencias específicas, al menos en este dominio competente para DSB (Baudat y Nicolas, 1997).

Para determinar si el amarre del dominio de unión a ADN de Gal4 a Spo11 permite que las DSB meióticas se dirijan a sitios de unión de Gal4 bien caracterizados, los inventores examinaron varios locus que contenían sitios UAS_{GAL} que se habían implicado en el catabolismo de la galactosa. La región promotora de GAL2 contiene cuatro secuencias CCG(N)_{11}GGC (verificadas secuenciando el promotor de GAL2 de ORD6632), de las que dos se unen constitutivamente por Gal4 in vivo (Huibregtse et al.; 1993). En una cepa con SPO11, las DSB apenas pueden detectarse en el locus GAL2, lo que indica que esta región no es un sitio de DSB natural frecuente. Por el contrario, en una cepa con GAL4BD-SPO11, pueden observarse DSB prominentes en el promotor de GAL2 cerca o en los sitios UAS_{GAL} (figura 3A). Similar a lo que se observó para el intervalo YCR043c-YCR048w, las DSB aparecen en el locus GAL2 en células meióticas GAL4BD-SP011 en el plazo de 2 horas de la transferencia de las células al medio de esporulación, y su intensidad aumenta a lo largo del transcurso de la meiosis, alcanzando un máximo a las 8-10 h (figura 3A). El análisis cuantitativo de varios experimentos independientes indica que la frecuencia de las DSB de GAL2 en la cepa GAL4BD-SPO11 es aproximadamente del 12 \pm 2%, en contraste con \leq0,6% observado en la cepa de tipo natural, una estimulación de 20 veces (figura 3).

Para generalizar estas observaciones, los inventores examinaron el direccionamiento de las DSB cerca de los genes GAL7, GAL10 y GAL1, que tal como GAL2 se inducen transcripcionalmente mediante la proteína Gal4 en presencia de galactosa. En estos locus, no se forman DSB meióticas en diploides con SPO11 pero por el contrario, pueden detectarse fácilmente en o cerca de sus sitios UAS_{GAL} asociados en diploides con GAL4BD-SPO11 (figura 3B). El análisis cuantitativo indica una estimulación sustancial de la formación de DSB, con frecuencias del 4 \pm 1% para la región en sentido 5' de GAL7 y del 2 \pm 1% para la región intergénica de GAL1-GAL10 transcrita de manera divergente. Esto es notablemente inferior que la frecuencia del 12 \pm 2% observada para el promotor de GAL2 (figura 3A). En total, estos resultados muestran que la proteína Gal4BD-Spo11 puede dirigir las DSB específicas de meiosis a sitios de unión a ADN de Gal4, creando sitios de DSB genómicos novedosos de diversa fuerza.

Finalmente, se verificó con varias cepas control que la proteína de fusión Gal4BD-Spo11 es la única responsable de la aparición de estas nuevas DSB. En primer lugar, las cepas con spo11\Delta que expresan la proteína de fusión Y135F de Gal4BD-spo11, en la que el residuo de tirosina catalítico de Spo11 está sustituido por un residuo de fenilalanina catalíticamente inerte (Bergerat et al., 1997), no muestran DSB meióticas o bien en la región YCR043c-YCR048w o bien en el locus GAL2. En segundo lugar, las cepas SPO11 que expresan el dominio de unión de Gal4 o bien solo o bien fusionado con la proteína Rpb5 (una subunidad de la ARN polimerasa cuya función no está relacionada con el inicio de la recombinación), y una cepa que expresa un constructo pADH1::SPO11 (sin Gal4BD) muestran DSB en la región YCR043c-YCR048w pero no en el locus GAL2. De manera colectiva, estos experimentos de control demuestran que la estimulación de las DSB dependientes de Gal4BD-Spo11 cerca de los sitios de unión de Gal4 requiere tanto los componentes Gal4BD como Spo11 de la proteína quimérica.

1.5. La fusión Gal4BD-Spo11 estimula fuertemente la recombinación en el locus GAL2

Los experimentos de DSB anteriores se realizaron en cepas con rad50S, a partir de las cuales no pueden recuperarse recombinantes viables. Para determinar si las nuevas DSB promovidas por GAL4BD-SPO11 son recombinogénicas, se examinaron en primer lugar fragmentos de DSB meióticas en la región de GAL2 en un antecedente de RAD50 para observar si se procesaban como las DSB inducidas por Spo11. Se detectaron DSB (figura 4A) como una mancha de fragmentos de mayor movilidad que la banda de rad50S discreta, mostrando que las nuevas DSB de GAL2 experimentan procesamiento. Además, la naturaleza transitoria de la mancha (apareciendo en 3 h y desapareciendo entre 7-9 h) sugiere que estas DSB se reparan con cinéticas normales.

Para valorar si las DSB dependientes de Gal4BD-Spo11 se reparan mediante recombinación homóloga, se midió luego la frecuencia de conversión génica meiótica en el locus GAL2. Para este fin, se construyó un alelo mutante, gal2-Bsp. Este alelo mutante contiene un desplazamiento de marco en la posición 197 del ORF de GAL2 y heterocigotos para GAL2/gal2-Bsp derivados tanto en el antecedente SPO11 como GAL4BD-SPO11. A partir de 218 tétradas de cuatro esporas producidas por el diploide con SPO11, sólo se encontraron cinco acontecimientos de conversión. Por el contrario, para la cepa con GAL4BD-SPO11, se observaron 55 acontecimientos de conversión en ambos sentidos (3:1 y 1:3) entre las 212 tétradas analizadas (el 26%), un aumento de 10 veces sobre el nivel observado para la cepa con SPO11 (figura 4C). Las DSB promovidas por Gal4BD-Spo11 también inician la recombinación en otros locus: el análisis de tétradas confirmó que los niveles de conversión génica meiótica en el punto caliente natural ARG4 son similares en diploides con SPO11 y con GAL4BD-SPO11. Estos resultados muestran que las DSB formadas en el promotor de GAL2 en cepas con GAL4BD-SPO11 son recombinogénicas y que se comportan como las roturas inducidas por Spo11.

1.6. Gal4BD-Spo11 promueve la escisión dentro de una gran región que normalmente es fría para la formación de DSB

El análisis de la actividad de Gal4BD-Spo11 en un gran intervalo de aproximadamente 20 kb centrado en GAL2 (entre los ORF de YLR072w y YLR084c en el cromosoma XII) que contiene ocho regiones intergénicas que contienen promotor (figura 5A). En una cepa con SPO11, no se observaron DSB en este intervalo. En una cepa con GAL4BD-SPO11, la región promotora de GAL2 es el único sitio en el que puede detectarse una DSB. Dado que no hay otras secuencias consenso de Gal4 en este intervalo, estos resultados subrayan tres características importantes de la actividad de DSB de Gal4BD-Spo11. En primer lugar, la estimulación de las DSB cerca de GAL2 se dirige específicamente. En segundo lugar, la escisión en GAL2 no promueve la formación cercana de otras DSB. En tercer lugar, al contrario de lo que se observa para las DSB en la región YCR048w del cromosoma III, las nuevas DSB de GAL2 se producen en una región cromosómica fría de manera natural.

1.7. La formación de DSB mediante Gal4BD-Spo11 requiere la actividad de otros genes de DSB conocidos

Además de SPO11, se sabe que se requieren otros 14 genes para la formación de niveles de tipo natural de DSB en sitios naturales en S. cerevisiae. Si uno o más de sus productos es necesario para reclutar Spo11 a futuros sitios de DSB, la adición del dominio de unión a ADN de Gal4 a Spo11 podría evitar este requisito, al menos para las DSB en los sitios de unión de Gal4. El análisis por transferencia de tipo Southern indica que mutantes nulos de rec102, rec103/ski8, rec104, rec114, mei4, mer2/rec107, mre2/nam8, mre11, rad50 y xrs2, en cualquiera de los antecedentes SPO11 o GAL4BD-SPO11, no muestran DSB meióticas en el intervalo YCR043c-YCR048w o en GAL2 (figura 6), mientras que los mutantes nulos de red1, mre4/mek1, hop1 y mer1 muestran niveles reducidos pero todavía detectables de DSB. De manera cuantitativa, en el locus GAL2, la mutación de red1 reduce la frecuencia de las DSB promovidas por Gal4BD-Spo11 en aproximadamente 3 veces, las mutaciones de mre4/mek1 y hop1 confieren una reducción de 10 veces y la mutación de mer1 elimina casi completamente la formación de DSB. De manera un tanto diferente, en la región YCR047c-48w (promotor de YCR048w + ORF), la mutación de mre4/mek1 no tiene efecto en ninguna de las cepas con SPO11 o con GAL4BD-SPO11, y las mutaciones red1, mer1 y hop1 tienen efectos represores crecientes en ambas cepas. Los efectos diferenciales de cada una de estas mutaciones sobre el cromosoma III y en GAL2 pueden reflejar una variación específica de locus. En términos generales, dado que todos estos genes, que son o bien esenciales o bien importantes para la formación de DSB en cepas con SPO11 se requieren de manera similar en cepas con GAL4BD-SPO11, puede concluirse que no ayudan a Spo11 en la selección del sitio diana.

1.8. La escisión de Gal4BD-Spo11 también requiere actividad de Clb5 Clb6

Se requieren ciclinas CLB5 y CLB6 de tipo B para la replicación meiótica y para la formación de DSB meióticas. Para determinar si las DSB promovidas por Gal4BD-Spo11 dependen también de la actividad de Clb5 y Clb6, se sometió a ensayo la formación de DSB en diploides con clb5 y clb5 clb6 que contenían el constructo GAL4BD-SPO11 (ORD6534 y ORD6551, respectivamente). Tal como se indicó en la figura 6, no se detectó formación de DSB en ninguno de los locus YCR048w o GAL2 en estas cepas, demostrando que la adición de un dominio de unión a ADN heterólogo a Spo11 no evita los requisitos de la actividad de Clb5 y Clb6 y por tanto no supera el defecto de replicación meiótica que es relevante para la inducción de DSB. Junto con el requisito demostrado de los otros genes de DSB, este resultado indica que la proteína Gal4DB-Spo11 se somete a los mismos controles genéticos (que actúan en trans) que la proteína Spo11 para la formación de DSB tanto en dominios naturales como dirigidos.

1.9. Escisión de Gal4BD-Spo11 usando promotores heterólogos específicos de meiosis

Se puso el constructo GAL4BD-SPO11 bajo el control del promotor de IME1 (Guttmann-Raviv et al, 2001), que se expresa de manera muy temprana durante la meiosis, o bajo el control del promotor de REC8, que se expresa de manera temprana en la meiosis. Las secuencias obtenidas para los constructos promotor-GAL4BD-SPO11 se muestran en las figuras 9 y 10, respectivamente. La figura 7 muestra que ambos constructos inducen la formación de DSB en sitios UAS, o bien en la región YCR048w (figura 7A) o bien en la región GAL2 (figura 7B).

1.10. Spo11 puede reclutarse mediante otra proteína requerida para la formación de DSB

Rec104 es una proteína requerida para inducir DSB en levadura. Se clonó su secuencia codificante en el mismo marco de lectura abierto que la secuencia de Gal4BD, para generar la secuencia de una proteína de fusión Gal4BD-Rec104, que se puso bajo el control del promotor de ADH1 constitutivo. La secuencia resultante se muestra en la figura 12.

La figura 8 ilustra el hecho de que la presencia del constructo GAL4BD-REC104 en levadura induce roturas bicatenarias en sitios UAS, demostrando por tanto que GAL4BD-REC104 podría reclutar Spo11 en estos sitios.

1.11. La deleción del gen GAL4 residente aumenta el nivel de roturas bicatenarias específicas de UAS

Se delecionó la secuencia de GAL4 residente del genoma de levadura en el que se introdujo un constructo GAL4BD-SPO11. En comparación con la levadura que albergaba aún la secuencia codificante de GAL4BD, el número de DSB inducidas en los sitios UAS fue superior. Esto se debía probablemente a la ausencia de competición en los sitios UAS entre la proteína Gal4BD-Spo11 y la proteína Gal residente.

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Ejemplo 2

Estimulación dirigida de la recombinación meiótica en plantas

Se amplificó el ADNc que codifica para la proteína AtSPO11-1 (Grelon, Vezon et al. 2001) mediante PCR usando los 2 oligonucleótidos MG133 5' GAAACTCGGGATCCATGGAGGGAAAATTC 3' y MG134 5' GGA
GACTCGCTCGAGGCTCAAGGAGA 3', se clonó en pCR-Bluntll-Topo (In Vitrogen) y se secuenció, lo que condujo al plásmido pVeCM2. A partir de pVeCM2, se volvió a clonar el ADNc entre los sitios BamHI y SpeI de pBluescript KS lo que condujo al plásmido pVeCM12. Se amplificó el fragmento de ADN que codifica para el dominio de unión a ADN de Gal4 (GAL4BD) mediante PCR a partir del plásmido pAPI usando los dos oligonucleótidos CM1 5' gaCTG
CAgaaagagATGAAGCTACTGTCTTCTAT 3' y CM2 5' CGGGGCCTCCATGGCCATAAA 3'. Este fragmento de PCR, correspondiente al fragmento ATG-NcoI de GAL4BD (455 pb), se clonó en pCR-Bluntll-Topo, lo que condujo al plásmido pVeCM15 y se secuenció. Se clonó el fragmento de ADN Pst1-NcoI de pVeCM15 que contenía Gal4BD y en 5' de sus 8 bases de ATG correspondientes a las bases -8 a -1 en sentido 5' del ATG de AtSPO11-1 y el sitio Pst1 (CTGCAgaaagagATG), en pVeCM12 entre los sitios PstI y NcoI, lo que condujo al plásmido pVeCM20. pVeCM20 contiene un sitio PstI seguido por las bases -8 a -1 de AtSP011-1, el GAL4BD seguido en fusión por el ADNc completo de AtSPO11-1 (1089 pb). Se amplificó mediante PCR un fragmento del promotor de AtSPO11-1 (Gene bank AP000375) aislado por Mathilde Grelon usando los 2 oligonucleótidos CM3 5' ccatctctttcTGCAGtcaaaactgaaaaatg 3' y CM4 5' ATGGGCCCgcctttgttttatctctcctcaccgta 3', se clonó en pCR-Bluntll-Topo, lo que condujo al plásmido pVeCM14 y se secuenció. Se clonó el fragmento Apa1-Pst1 de pVeCM14 que contenía las bases -1352 a -8 del promotor de AtSPO11-1 en pVeCM20 entre Apa1 y Pst1, lo que condujo al plásmido pVeCM22. Entonces se clonó el fragmento Apa1-BseR1 que contenía la región -2266 a -1324 de AtSPO11-1 en pVeCM20 entre los sitios Apa1 y BseR1, lo que condujo al plásmido pVeCM25. Se volvió a secuenciar el fragmento Apa1-Spe1 de pVeCM25 que contenía el constructo promotor de AtSPO11-1/ADNc de GAL4BD-AtSPO11-1. Estaba presente una inserción de 11 nucleótidos (CCCATCTCTTT) justo en 5' con respecto al sitio de clonación Pst1. El promotor corresponde por tanto a las bases -2266 a -1 del promotor At, con una inserción de 11 nucleótidos justo en 5' con respecto al sitio de clonación Pst1. Se clonó el fragmento Apa1-Spe1 de pVeCM25 en pCambia 1380 (comercializado por Cambia, Australia), entre los sitios Apa1 y Spe1, lo que condujo al plásmido pVeCM26. Se introdujo pVeCM26 mediante transformación en la cepa de Agrobacterium con C58C1 pMP90. Se usó esta cepa para transformar la línea de Arabidopsis thaliana DYK209 (Grelon et al., 2001) heterocigótica para la mutación de Atspo11-1-1. Se seleccionaron las plantas T1 transformadas in vitro en higromicina, se transfirieron a la tierra y se analizaron mediante PCR. Una planta, AtpVeCM26.9, homocigótica para la mutación de Atspo11-1-1 y que contenía el promotor de AtSP011-1:transgén de ADNc de GAL4BD-AtSPO11-1 tenía algunas silicuas mayores que las observadas normalmente para una planta con Atspo11-1-1 homocigótica. En la progenie de esta planta con AtpVeCM26.9 seleccionada en higromicina, transferida a la tierra y genotipada mediante PCR, 9 plantas homocigóticas para la mutación Atspo11-1-1 y que contenían el promotor de AtSPO11-1:transgén de ADNc de GAL4BD-AtSPO11-1 tenían un promedio de 3,7 \pm 0,7 semillas por silicua, lo que es aproximadamente dos veces más que el número de semillas por silicua detectado en una planta homocigótica para la mutación de Atspo11-1-1 (Grelon et al., 2001).

Con el fin de evitar la inserción de 11 nucleótidos que se había observado tal como se describió anteriormente, se preparó de nuevo el constructo P_{AtSPO11}-GAL4BD-AtSPO11-1, usando un protocolo diferente, lo que condujo a la secuencia mostrada en la figura 13. Se realizó entonces la transformación de Arabidopsis thaliana tal como se describió anteriormente.

Se determina entonces la estimulación de la recombinación meiótica mediante análisis de marcadores de microsatélite que existen en sentido 5' y en sentido 3' con respecto a las dianas naturales para GAL4BD que existen en el genoma de Arabidopsis (más de 40 con la secuencia consenso más rigurosa, y hasta varios cientos con la más degenerada, es decir, sólo los 3 pb en cada lado del UAS), en mutantes homocigóticos y cepas de tipo natural.

Se construye también una línea celular que muestra dos genes de resistencia como marcadores, separados por una secuencia de reconocimiento de GAL4BD, con el fin de estudiar el entrecruzamiento entre estos dos marcadores.

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Ejemplo 3

Inducción de recombinación meiótica aumentada y/o dirigida al sitio en ratones

El gen Sycp1, que codifica para el complejo sinaptonémico murino, se expresa tanto en las fases cigotena como paquitena de la meiosis (Sage, Martin et al. 1999). Por tanto, puede usarse para expresar un gen SPO11 en fases tempranas de la meiosis. La expresión de la proteína de fusión Gal4BD-mSpo11 en una fase temprana de la meiosis tiene tres ventajas: permite el direccionamiento de la recombinación meiótica a nuevos sitios y ayuda al seguimiento del impacto del inicio de la recombinación sobre cambios cromosómicos asociados y sobre el desarrollo del ratón.

El ADN quimérico de Gal4BD-mSP011 se coloca bajo el control de la región en sentido 5' de la secuencia codificante de Sycp1 u otro fragmento de promotor funcional en la meiosis temprana, en un plásmido bacteriano.

Se construye una secuencia que codifica para una proteína de fusión Gal4BD-mSpo11, en la que la proteína mSpo11 es la proteína Spo11 murina, colocando la secuencia codificante de Gal4BD en fase con la secuencia de SPO11 de ADNc murina descrita por Metzler-Guillemain C. y B. de Massy (2000). Esto puede realizarse por ejemplo usando la siguiente estrategia de clonación de múltiples etapas: se amplifica el fragmento Gal4BD de pAP1 mediante PCR usando cebadores APG4up (5'GAGATTAATTAAGGCCATATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAA) y APG4LO (5'AATCCTGTTAACAATGCTTTT), y se clonó en pGEM-T Easy (Promega) y se secuenció, creando pAP15 que contenía un sitio NdeI que se solapaba con el sitio de iniciación de la traducción ATG de la secuencia de Gal4BD.

A continuación, se escinde pAP15 mediante PacI-HpaI y se clona el fragmento que contiene la secuencia 5' de Gal4BD (sitio que contiene NdeI) en el vector pAP51, se escinde mediante PacI-HpaI para eliminar el promotor de pADH1 creando el plásmido pAP16.

A continuación, se escinde pA16 mediante PacI-SacI para eliminar el marcador KanMX (resistencia a G418), se hacen romos los extremos y se vuelve a ligar para crear pAP17.

Se sustituye entonces el fragmento BamHI-PstI de pAP17 que contiene el fragmento de Spo11 de S. cerevisiae por el fragmento BgIII-PstI de pCMV\beta (Clontech) que contiene un sitio de poliadenilación de SV40 para crear el plásmido pAP3.

A continuación, el fragmento relleno con extremos romos EcoRI-SaII de pTAg 0,8 que contiene el promotor de SyCP1, se rellena con extremos romos y se clona en el sitio EcoRI de pAP3, creando pAP18.

Entonces se amplifica el fragmento EcoRI del plásmido pGEM-tSPO11s, que contiene el ADNc de SPO11 de ratón, mediante PCR con cebadores para añadir sitios de restricción SfiI y XmaI flanqueantes y se clona en el vector pGEM-t Easy (Promega), creando el plásmido pAP19 y se secuencia.

Finalmente, se fusiona el fragmento SfiI-XmaI de pAP19, que contiene el promotor de pSycp1 (fragmento TaqI-EcoRI) seguido por el fragmento de Gal4BD (EcoRl-SfiI), con el ADNc de SPO11 de ratón (fragmento SfiI-XmaI) y se termina mediante el fragmento de poliA (XmaI-PstI), creando un casete modular para el intercambio conveniente de los diversos componentes, portado por un vector que permite la multiplicación en bacterias.

Este plásmido pGal4BD-mSpo11 se linealiza e introduce mediante microinyección en un óvulo de ratón. Entonces se seleccionan ratones mediante análisis de ADN genómico con una sonda específica para el transgén Sycp1/Gal4BD-mSpo11. Entonces se establecen familias transgénicas Sycp1/Gal4BD-mSpo11 independientes a través de reproducciones cruzadas con ratones normales y caracterizados.

Entonces se determina la funcionalidad meiótica de la expresión transgénica en los ratones mutantes y de tipo natural inactivados para el gen de mSPO11 (Baudat, Manova et al. 2000) mediante observación del efecto sobre la fertilidad de los animales y monitorizando las frecuencias de recombinación meiótica entre marcadores polimórficos en la progenie, los gametos o en una preparación de células meióticas mediante transferencia de tipo Southern o técnicas de PCR, examinando con sonda una región cromosómica que contiene un sitio de reconocimiento consenso para la proteína Gal4. Este sitio diana es una secuencia o bien natural o bien transgénica que porta una o más copias del motivo UAS de GAL4.

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Ejemplo 4

Mejora de la recombinación homóloga en Drosophila

Drosophila ofrece muchas ventajas como organismo experimental. Sin embargo, en comparación con la levadura y el ratón, otros dos sistemas modelo eucariotas ampliamente usados, Drosophila padece una incapacidad de realizar recombinación homóloga entre ADN introducido y el correspondiente locus cromosómico. La capacidad de modificar específicamente los genomas de levaduras y ratón proporciona una forma rápida y fácil para generar o recuperar mutaciones en genes para los que hay disponible un clon o secuencia de ADN. Recientemente, Rong y Golic han desarrollado una nueva técnica para la recombinación homóloga dirigida, usando la enzima I-Scel de restricción de intrones como un inductor de roturas bicatenarias en moléculas lineales de ADN generadas a partir de la escisión mediante recombinasa Flp del ADN (Rong y Golic 2000). De esta forma, recuperan la mutación yellow (Rong y Golic 2000) y alteran el gen pugilist y, más recientemente, los genes N/acZ, GC, p53 y CG11305. Esta técnica de desactivación tiene una eficacia muy baja, y la mutación se genera en dos etapas.

La proteína de fusión Gal4BD-Spo11, descrita en el ejemplo 1, puede usarse en lugar de la enzima I-Scel con el fin de desarrollar un nuevo enfoque para generar "animales deficientes" en Drosophila, y para mejorar la eficacia de la recombinación homóloga dirigida. Para este fin, se insertó la secuencia que codifica para Gal4BD-Spo11 en un vector de expresión para la Drosophila (P(Casper-hs), Pirrotta 1988). En este vector, la secuencia de Gal4BD-Spo11 está colocada bajo el control de un promotor de choque térmico. Se han obtenido cinco inserciones diferentes de este elemento transponible en Drosophila.

Se somete a prueba la recuperación del fenotipo de esterilidad de meiW68 (McKim y Hayashi-Hagihara 1998) en Drosophila homóloga para Spo11, con la inducción de Gal4-Spo11 durante el tiempo de desarrollo en el que se generan los gametos.

Se sustituye la secuencia de reconocimiento de I-Scel sobre el gen yellow por secuencias UAS, reconocidas por el dominio de unión de GAL4 (usando elementos P) y se construyen cepas gal4-meiW68. Se repite la recuperación de yellow de Rong y Golic para comparar las eficacias de los dos métodos.

Para realizar estos experimentos, se usan los siguientes plásmidos:

-

Vector de expresión: pCasper-hs (Pirrotta 1988)

-

Promotor de choque térmico hsP70 (Pirrotta 1988)

-

p(UAS) dirigido: donador y (Rong y Golic 2000) modificado mediante la sustitución del sitio I-Scel por secuencias UAS (cinco)

La cepa de Drosophila usada en estos experimentos es Canton-Special (CS) y^{1}.

Tal como se describió anteriormente, los métodos para someter a ensayo el efecto de Gal4-Spo11 son la recuperación del fenotipo de mei-W68 y la recuperación de y^{1} (color de cuerpo normal).

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Ejemplo 5

Estimulación de la recombinación meiótica entre cromosomas escasamente recombinantes

Una recombinación genética eficaz entre cromosomas homólogos requiere la formación de una lesión iniciadora tal como una rotura bicatenaria del ADN formada por la proteína Spo11 tal como se muestra como ejemplo en el ejemplo 1. Por tanto, los cromosomas que carecen de sitios diana de Spo11 se recombinarán escasamente. La proteína de fusión Gal4Bd-Spo11, descrita en el ejemplo 1, puede usarse para estimular el inicio de la recombinación en sitios de unión de Gal4 introducidos de manera natural o artificial a lo largo de cualquier cromosoma natural o artificial (YAC) que consiste en ADN de levaduras o que no es de levaduras. De manera similar, la recombinación podría estimularse entre plásmidos lineales de levaduras con estructuras principales de ADN de bacteriófago \lambda que se recombinan escasamente.

Una recombinación genética eficaz también requiere una homología casi perfecta entre las moléculas que participan. Según su grado de divergencia, los cromosomas homólogos se recombinan de manera variable en la meiosis y como consecuencia del nivel reducido de entrecruzamiento, la viabilidad de los gametos disminuye y la proporción de productos de aneuploide aumenta de manera consecuente con los defectos en la meiosis I o II sin disyunción de los homólogos. Los cromosomas homólogos V Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carlbergensis prácticamente no se recombinan en la meiosis, pero se encontró que regiones cortas creadas artificialmente de homología inducen el entrecruzamiento meiótico, probablemente facilitando la formación intermedia de heterodúplex iniciada en sitios adyacentes. La proteína de fusión Gal4BD-Spo11, descrita en el ejemplo 1, puede usarse para estimular el inicio de la recombinación en sitios de unión de Gal4 naturales o introducidos de manera artificial a lo largo de cualquier cromosoma natural o artificial (YAC) que consiste en ADN homólogo de levaduras y que no es de levaduras.

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Ejemplo 6

Estimulación de la recombinación homóloga en células mitóticas

Se induce un alto nivel de recombinación homóloga durante la meiosis mediante la formación de Spo11-alto nivel de recombinación homóloga durante la meiosis mediante la formación de roturas bicatenarias dependientes de Spo11, que también requieren la expresión de al menos otras 14 proteínas (denominadas genes de DSB en el ejemplo 1). Algunas de ellas se expresan solamente durante la inducción de la meiosis. Aprovechando la novedosa propiedad de unión a ADN de la proteína de fusión Gal4BD-SPO11, que permite evitar el requisito del factor que actúa en trans que lleva Spo11 hasta sus sitios diana, se logra el intento de obtener actividad de escisión del ADN dependiente de Spo11 en células mitóticas expresando los genes adicionales requeridos para la formación de DSB en células mitóticas. Esto puede lograrse mediante varios enfoques: expresión heteróloga de los genes individuales y/o de una biblioteca genómica de ADNc tras un promotor expresado de manera mitótica, o mediante un cambio mutacional del/de los factor(es) de transcripción que reprime(n) su expresión en células en crecimiento mitótico.

Bibliografía

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<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE INSTITUT CURIE

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<120> MÉTODOS PARA INDUCIR ESTIMULACIÓN DIRIGIDA DE LA RECOMBINACIÓN MEIÓTICA Y KITS PARA REALIZAR DICHOS MÉTODOS

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<130> B5255A - JAZ/VMA/VG

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<140> PCT/EP 03/08834

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<141> 18-07-2003

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<150> Documento US 10/199.762

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<151> 2002-07-19

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<160> 24

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(29)

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<223> MG133

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaaactcggg atccatggag ggaaaattc

\hfill

29

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<210> 2

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(26)

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<223> MG134

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<400> 2

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ggagactcgc tcgaggctca aggaga

\hfill

26

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<210> 3

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(34)

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<223> CM1

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcagaa agagatgaag ctactgtctt ctat

\hfill

34

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(21)

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<223> CM2

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggggcctcc atggccataa a

\hfill

21

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<210> 5

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<211> 15

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> Sitio Pst 1 y bases -8 a -1 en sentido 5' de ATG de AtSPO11-1 y ATG

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcagaaag agatg

\hfill

15

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<210> 6

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(32)

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<223> CM3

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccatctcttt ctgcagtcaa aactgaaaaa tg

\hfill

32

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<210> 7

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(35)

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<223> CM4

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgggcccgc ctttgtttta tctctcctca ccgta

\hfill

35

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<210> 8

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<211> 11

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> inserto de 11 nucleótidos justo en 5' con respecto al sitio de clonación de Pst 1 en pve CM5

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccatctctt t

\hfill

11

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<210> 9

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(42)

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<223> APG4up

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagattaatt aaggccatat gaagatactg tcttctatcg aa

\hfill

42

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<210> 10

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(21)

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<223> APG4LO

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatcctgtta acaatgcttt t

\hfill

21

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<210> 11

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> secuencia activadora en sentido 5' consenso reconocida por el dominio de unión a ADN de la proteína Gal 4

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (4)..(14)

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<223> cualquier nucleótido

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggnnnnnnn nnnncgg

\hfill

17

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<210> 12

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1) .. (28)

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<223> REC8 UP

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgatatctat acattaccaa tccttcct

\hfill

28

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<210> 13

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(27)

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<223> REC8 LO

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

caagctttgc agaatatttg taatatt

\hfill

27

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<210> 14

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(22)

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<223> QQR UP

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttatgg aaaaactgcg ga

\hfill

22

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<210> 15

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(32)

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<223> QQR LO

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggccataaa ttccggacta gttgcttctt at

\hfill

32

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<210> 16

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(39)

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<223> REC104 UP

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagatggcca tggaggccat gtccatcgag gaggaagat

\hfill

39

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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<220>

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<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(34)

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<223> REC104 LO

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccccgg ggctcaggga ctactaaact gaa

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(28)

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<223> 5'meiw68

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaatggcca caatggatga attttcgg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (1)..(21)

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<223> 3' meiw68

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgaaactt cctccgcgga c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2785

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> PIME1-Gal4BD-Spo11

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (1)..(2785)

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<223> FIGURA 9

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<400> 20

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5

6

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<210> 21

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<211> 2166

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PREC8-Gal4Bd-Spo11

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2166)

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<223> FIGURA 10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

7

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<210> 22

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<211> 2253

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> PADH1-QQR-Spo11

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (1)..(2253)

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<223> FIGURA 11

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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9

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 1748

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PADH1-Gal4BB-Rec104

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (1)..(1748)

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<223> FIGURA 12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

11

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<210> 24

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<211> 3791

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<212> ADN

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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> PAtSPO11-Gal4BD-AtSpo11-1

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(3791)

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<223> FIGURA 13

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

13

14

Claims (36)

1. Método para aumentar la recombinación entre cromosomas homólogos en una célula que está dividiéndose, excluyendo células humanas, durante la meiosis, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que aumenta la recombinación entre cromosomas homólogos en dicha célula.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además, antes de la etapa (ii), una etapa de introducir en el genoma de dicha célula una secuencia de ADN reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho promotor específico de meiosis es el promotor de IME1 o el promotor de REC8.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula es una célula eucariota.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero y una célula de insecto.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha célula comprende cromosomas artificiales que portan una o más secuencia(s) reconocida(s) por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a la proteína Spo11.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico introducido en la célula en la etapa (i) se integra de manera estable en el genoma de la célula.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha célula es una levadura y el ácido nucleico introducido en la misma en la etapa (i) codifica para una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

9. Método para realizar una recombinación dirigida entre dos o más polimorfismos portados por un mismo cromosoma en una célula excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una secuencia situada entre dichos dos o más polimorfismos, y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce la recombinación entre dichos dos o más polimorfismos en dicha célula.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además antes de la etapa (ii), una etapa de introducir en el genoma de dicha célula, entre dichos dos o más polimorfismos, una secuencia de ADN reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11.

11. Método según la reivindicación 9, en el que la división celular realizada en la etapa (ii) es una meiosis.

12. Método según la reivindicación 9, en el que dicho promotor específico de meiosis es el promotor de IME1 o el promotor de REC8.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que dicha célula es una célula eucariota.

14. Método según la reivindicación 9, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero y una célula de insecto.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que dicha célula comprende cromosomas artificiales que portan una o más secuencia(s) reconocida(s) por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a la proteína Spo11.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que dicha célula es un hongo y el ácido nucleico introducido en la misma en la etapa (i) codifica para una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

\newpage

17. Método para introducir una conversión génica en una célula, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una secuencia situada cerca de un polimorfismo; y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce la conversión génica.

18. Método para inducir recombinación meiótica en cromosomas artificiales en una célula, excluyendo una célula humana, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en dicha célula un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una o más secuencia(s) portada(s) por dicho cromosoma artificial; y

(ii)

hacer que la célula se divida, de modo que se produce la recombinación meiótica entre cromosomas artificiales homólogos.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dicha célula es una levadura, dicho cromosoma artificial es un YAC que tiene uno o más sitios con una secuencia CGGN11CGG, y dicha proteína de fusión es una proteína de fusión Gal4BD-Spo11.

20. Método para generar variantes de un organismo excluyendo organismos humanos, que comprende las etapas de:

(i)

introducir en una célula de dichos organismos un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, en el que dicho dominio de unión a ADN reconoce una o más secuencia(s) portada(s) por el genoma de dicha célula;

(ii)

hacer que la célula realice una meiosis, de modo que se produce recombinación meiótica entre cromosomas homólogos de dicha célula, a una tasa superior y/o en locus diferentes que en la meiosis natural de dichos organismos; y

(iii)

generar variantes de dichos organismos con la célula obtenida en la etapa (ii).

21. Método según la reivindicación 20, en el que dichos organismos se seleccionan del grupo que consiste en un hongo, una planta, un mamífero y un insecto.

22. Método según la reivindicación 20 ó 21, que comprende además una etapa de examinar dichas variantes para determinar la presencia de dos o más caracteres.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que en la proteína de fusión que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, se sustituye el resto Spo11 por una pareja de Spo11 que puede reclutar Spo11.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha pareja es REC104.

25. Método para analizar el genoma de un organismo, que comprende las etapas de:

(i)

generar variantes de dicho organismo, realizando el método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24;

(ii)

realizar un análisis genético y un análisis fenotípico de ciertos caracteres de dichas variantes; y

(iii)

analizar el genoma de dicho organismo.

26. Kit para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, en el que dicha proteína de fusión puede inducir roturas bicatenarias en regiones de puntos anteriormente fríos.

27. Kit según la reivindicación 26, en el que dicha Spo11 tiene la secuencia de una proteína Spo11 de una célula seleccionada del grupo de un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero y una célula de insecto.

28. Kit según la reivindicación 26 o la reivindicación 27, que comprende además un ácido nucleico que porta una secuencia diana reconocida por dicho dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11.

29. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dicho ácido nucleico está comprendido en un vector.

30. Kit según la reivindicación 29, en el que dicho vector es un plásmido, un ADN replicativo, un ácido nucleico complejado con agentes de transfección, un fago o un virus.

31. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en el que en el ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, la secuencia codificante spo11 se sustituye por la secuencia codificante de una pareja de Spo11 que puede reclutar Spo11.

32. Kit según la reivindicación 31, en el que dicha pareja es REC104.

33. Célula eucariota, excluyendo una célula humana, que expresa una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN, en la que dicha proteína de fusión puede inducir roturas bicatenarias en regiones de puntos anteriormente fríos del genoma de dicha célula eucariota.

34. Célula eucariota según la reivindicación 33, que es un hongo, una célula vegetal, una célula de mamífero o una célula de insecto.

35. Ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína AtSpo11, que induce roturas bicatenarias en el ADN de Arabidopsis thaliana.

36. Ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, bajo el control de un promotor específico de meiosis, que comprende un dominio de unión a ADN operativamente unido a una proteína Spo11 murina, que induce roturas bicatenarias en el ADN.