ES2300345T3 - Radioligando y ensayo de union. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto radioligando de Fórmula I que es (Ver fórmula) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
Description
Radioligando y ensayo de unión.
La presente invención proporciona un compuesto
radioligando que es un útil agente para la selección de posibles
compuestos antiarrítmicos de Clase III y un procedimiento de
seleccionar esta actividad I_{Kr} usando este compuesto
radioligando. En el pasado se realizó un ensayo de unión similar
usando un radioligando[^{3}H] capaz de unirse a un gen
relacionado con
éter-a-go-go (ERG)
en miocitos de cobaya o se realizó la técnica de pinza de voltaje
en células intactas, Véase Geonzon, R. y col. J. Mol. Cell Cardiol.
30, pág. 1691-1701 (1998); Chadwick, C.C. y col.
circulación Research 72, pág. 707-714 (1993); Duff,
H. J. y col. Circulation Research 77, pág. 718-725
(1995); y Fiset, C. y col. J. Mol Cardiol. 28 pág.
185-1096 (1996).
La presente invención ofrece varias ventajas
sobre los procedimientos previos. El uso de un radioligando marcado
[^{35}S] ofrece la ventaja de que el [^{35}S] es un radioisótopo
de mayor energía y actividad específica que el [3H], lo que permite
a los científicos perfeccionar las condiciones del ensayo con el uso
de menos radioligando y canal ERG humano (también denominado ERGh),
así como la capacidad de establecer un ensayo más sensible. El
ensayo de unión actual también se ha desarrollado usando membranas
de células que expresan ERGh, en lugar de ERG en células animales
intactas, como la fuente del canal iónico. Por tanto, el uso de ERG
humano en el presente ensayo proporcionará a los investigadores un
ensayo de unión más relevante que el ERG animal.
Además, las membranas son una fuente más cómoda
del canal iónico en comparación con las células intactas. Es
posible un rendimiento mayor, ya que se puede preparar con
antelación una gran cantidad de la membrana, almacenar congelada y
descongelar el día del ensayo. Asimismo, una fuente de membrana de
canal iónico posee sus sitios extracelulares e intracelulares
expuestos y no depende de los cambios en la fisiología de una célula
intacta para exponer todos los posibles puntos de unión. Una última
ventaja del ensayo de unión basado en [^{35}S] es que se puede
realizar con un rendimiento mucho más elevado en comparación con un
ensayo de pinza de voltaje de célula entera. Por tanto, la presente
invención es más adecuada para una selección amplia. Este ensayo se
usa como contraselección en los programas de investigación en los
que no es deseable una actividad prolongada del QT.
La patente de EE.UU. nº 5.633.247 describe y
reivindica el compuesto no marcado (también denominado ligando
frío),
N-[|'-6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro,
2(R)-naftalenil]-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]-metanosulfonamida.
Esta invención se refiere a un compuesto
radioligando,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(Fórmula I) radiomarcado con [^{35}S] o sales, hidratos o
solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo. También dentro del
alcance de esta invención se encuentra un procedimiento para
identificar los compuestos que se unen al canal de I_{Kr}.
Un compuesto radioligando de Fórmula I
o sales, hidratos o solvatos
farmacéuticamente aceptables del mismo. El compuesto radioligando de
Fórmula I también se denomina
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S]. El compuesto de Fórmula II es el
compuesto no marcado,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida.
Una forma de realización de la invención incluye
el compuesto radioligando de Fórmula I que posee una actividad
específica superior a 500 Ci/mmol y, preferentemente, en el
intervalo de 900 Ci/mol.
Un procedimiento de caracterizar un canal iónico
como un canal de I_{Kr} que comprende poner el contacto el canal
iónico con el compuesto radioligando,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], y determinar si el compuesto
radioligando se une al canal iónico.
Un procedimiento para caracterizar la actividad
de un compuesto como un bloqueantes del canal de I_{Kr}, que
comprende poner en contacto el compuesto de prueba con una membrana
que contiene el canal de I_{Kr} en presencia del compuesto
radioligando,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], y monitorizar si el compuesto de
prueba influye sobre la unión del compuesto radioligando a la
membrana que contiene el canal de I_{Kr}. La membrana que contiene
el canal I_{Kr} deriva de una línea celular adecuada capaz de
transfeccionarse de forma estable con el gen ERG y de expresar la
proteína del canal de IKr, ejemplos representativos de la misma son
células HEK 293 (ATCC N1 CRL-1573, Colección
Americana de Cultivos Tipo 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110) o células CHO que se han transfeccionado de forma estable
con el gen ERG humano, canino o de primates y que son capaces de
expresar la proteína del canal de IKr. El gen ERG humano se
describe en T. Itoh y col. Human Genetics 102(4), pág.
435-439 (1998) y MD. Adams, y col. Nature 377:
3-174 (1995). El compuesto radioligando útil en este
procedimiento posee una actividad específica superior a 500 Ci/mmol
y, preferentemente, en el intervalo de 900 CI/mmol a 1498
Ci/mmol.
Un procedimiento para evaluar la unión de un
compuesto de prueba a una membrana que contenga el canal de IKr
usando un radioligando de Fórmula I,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], que comprende las etapas de:
- 1)
- preparar soluciones del compuesto de prueba a 5 o más concentraciones diferentes, una solución de vehículo control y una solución de (+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida (compuesto de Fórmula II) en un disolvente;
- 2)
- mezclar el compuesto radioligando de Fórmula I con la membrana que contiene el canal de I_{Kr} diluido con un tampón de ensayo para formar una mezcla de membrana/radioligando de concentración conocida;
- 3)
- incubar una cantidad de concentración conocida de la mezcla membrana/radioligando con la solución del compuesto de prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula II, como se cita en la etapa 1, durante un periodo de tiempo establecido a un intervalo de temperatura de entre 4ºC y 37ºC para dar una mezcla de membrana unida al radioligando y al compuesto de prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula II, donde la concentración final de la membrana que contiene el canal de I_{Kr} está predeterminada;
- 4)
- aislar de la mezcla incubada la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula II;
- 5)
- medir la radioactividad de la membrana aislada unida con el radioligando y el compuesto de prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula II;
- 6)
- repetir las etapas 3 a 5 con el compuesto de prueba a cada concentración, la solución del vehículo control y la solución del compuesto de Fórmula II, como se cita en la etapa 1; y
- 7)
- calcular la CI_{50} correspondiente a la radiactividad medida de: 1) la membrana unida con el radioligando y cada concentración del compuesto de prueba, 2) la membrana unida con el radioligando y con el vehículo control y 3) la membrana unida con el radioligando y el compuesto de Fórmula II.
La potencia de la interacción con el canal de
I_{Kr} o la CI_{50} se determina comparando los recuentos de
radioligando-[35S] unido a las membranas en presencia de un
vehículo disolvente (100% control) en presencia de Fórmula II 1
\muM (unión inespecífica final) y a cada una de siete
concentraciones diferentes del compuesto de prueba. El número de
diferentes concentraciones analizadas puede ser más o menos de
siete, Se prepara una solución 100 \muM del compuesto de prueba
en un disolvente tal como dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, agua o
tampón y se preparan siete concentraciones del compuesto de prueba
mediante diluciones log (10 veces), diluciones 5 veces o diluciones
3 veces de la solución 100 \muM madre del compuesto de prueba. El
valor porcentual control se determina para cada condición y se
realiza un gráfico de regresión no lineal de 4 parámetros y se
determina el punto de inflexión o la CI_{50} de esta gráfica.
Este valor se comunica como una medida de la afinidad del compuesto
de la interacción con el canal de ERG. Cuando los datos no se
ajustan adecuadamente a la ecuación de 4 parámetros, se fijan bien
la unión máxima o bien la unión mínima, o ambas, y se usa un ajuste
de 3 ó 2 parámetros, respectivamente, para general el punto de
inflexión.
El radioligando unido a la membrana se
monitoriza tras aislamiento mediante filtración del radioligando
libre usando, por ejemplo, el Unifilter (Packard) o usando técnicas
alternativas que incluyen el Ensayo de proximidad de centelleo
(SPA) con perlas (Amersham Pharmacia Biotech) o el Flashplates (New
England Nuclear Life Sciences). El uso de las dos últimas técnicas
requiere la incubación de las membranas, el radioligando y el
compuesto con la perla de SPA en una placa de ensayo convencional o
en una Flashplate.
Un procedimiento para evaluar la unión de un
compuesto de prueba a una membrana que contenga el canal de I_{Kr}
usando un radioligando de Fórmula I,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], que comprende las etapas de:
- 1)
- preparar pocillos de ensayo con 4 \mul del compuesto de prueba en dimetilsulfóxido (DMSO) diluido 100 veces con tampón de ensayo a 5 o más concentraciones diferentes, un vehículo control de DMSO y una solución de DMSO de (+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida (compuesto de Fórmula II);
- 2)
- añadir el compuesto radioligando de Fórmula I a 50 pM a la membrana que contiene el canal de I_{Kr} diluido con tampón de ensayo para formar una mezcla de membrana/radioligando;
- 3)
- incubar cada pocillo de ensayo con 400 \mul de la mezcla membrana/radioligando 50 pM durante 75 minutos a 90 minutos a temperatura ambiente (25ºC) para dar pocillos de ensayo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II, donde la concentración final de la membrana que contiene el canal de I_{Kr} es 11 \mug/ml;
- 4)
- filtrar los pocillos de ensayo incubados a través de filtros preempacados con BSA al 0,1% para aislar en los filtros la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II;
- 5)
- lavar cada uno de los filtros que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II 5 veces con 500 \mul de tampón de ensayo helado;
- 6)
- secar los filtros lavados que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II a temperatura ambiente en una campana de extracción de humos;
- 7)
- añadir 50 \muL de Microscint-20 de microcentelleo a los filtros secos que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II;
- 8)
- medir el recuento de microcentelleo de los filtros tratados de microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II durante un minuto; y
- 9)
- calcular la CI_{50} correspondiente al recuento de microcentelleo medido de: 1) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y cada concentración del compuesto de prueba, 2) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y con el vehículo control y 3) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesta de Fórmula II.
El procedimiento tal y como se ha citado
anteriormente, en el que la membrana que contiene el canal de
I_{Kr} deriva de una línea celular transfeccionada con el gen ERG,
en el que la línea celular es la línea de células HEK 293 o de
células CHO y, preferentemente, células HEK 293, y en el que el gen
ERG es humano, canino o de primates y, preferentemente, humano o
canino.
El procedimiento tal y como se ha citado
anteriormente, en el que las soluciones del compuesto de prueba se
preparan en la etapa 1 a 7 concentraciones diferentes
(diluciones).
El procedimiento tal y como se ha citado
anteriormente, en el que el compuesto radioligando de Fórmula I
posee una actividad específica en el intervalo superior a 500 y,
preferentemente, en el intervalo de 900 Ci/mmol a 1498 Ci/mmol. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que la
membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada
concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula
II se filtra en la etapa 4 con Unifilters (Parkard).
\newpage
Se describe el procedimiento para la preparación
de
un intermedio clave en la
preparación del compuesto radioligando de Fórmula I, que comprende
las etapas
de
(1) hacer reaccionar el alcohol con
2,6-lutidina y triflato de
t-butildimetilsililo
para dar un compuesto hidroxilo
t-butildimetilsililo
protegido
(2) alquilar el compuesto hidroxilo
t-butildimetilsililo protegido mediante tratamiento
con hidruro sódico y después mediante tratamiento con cloruro de
2-trimetilsililetanosulfonilo para dar el compuesto
sulfonamida
disustituido
\newpage
(3) tratar la disulfonamida con alcanotiolato
C_{1}-C_{8} para dar una mezcla de las
sulfonamidas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
y
\vskip1.000000\baselineskip
(4) separar la mezcla de sulfonamida usando
cromatografía para aislar la sulfonamida apolar que eluye con un
sistema de disolvente apolar.
\vskip1.000000\baselineskip
y después eluyendo el isómero polar
usando un sistema de disolvente
polar
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(5) desulfonar el isómero
apolar
usando un compuesto de fluoruro en
un disolvente orgánico y calentando durante aproximadamente 24 horas
a aproximadamente 48 horas para dar la amina sin
alcohol
(6) hacer reaccionar la
alcohol-amina libre con trimetilsililimidazol en un
disolvente
orgánico
para dar el compuesto
trimetilsililoxi
deseado.
El material de partida (también denominado
compuesto de Fórmula II) para el procedimiento tal y como se ha
citado anteriormente se describe en las patentes de número
5.633.247, 5.206.240, 5.484.923 y 5.464.762. Además, en la
publicación británica nº 2.290.790 publicada el 10 de enero de 1996
se describe una síntesis asimétrica del compuesto intermedio
tetrahidronaftaleno en la síntesis de este material de partida. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que la
alquilación en la etapa 2 se agita a temperatura ambiente durante
hasta 24 horas y, preferentemente, durante 18 horas. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que el
alcanotiolato C_{1}-C_{8} usado en la etapa 3 es
un alcanotiolato de cadena lineal o ramificada, tal como
hexanotiolato de sodio o de potasio, butanotiolato de sodio o de
potasio, 2-metilpentanotiolato de sodio o de
potasio, 2-metilpropianotiolato de sodio o de
potasio, metanotiolato de sodio o de potasio, etanotiolato de sodio
o de potasio y, preferentemente,
2-metilpropanotiolato de sodio. El procedimiento tal
y como se ha citado anteriormente, en el que la reacción de
desulfonación en la etapa 3 funciona durante menos de 24 horas,
preferentemente durante de aproximadamente 30 minutos a una hora. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que la
separación de la mezcla de sulfonamida en la etapa 4 funciona usando
cromatografía ultrarrápida con un sistema de disolvente de acetato
de etilo y hexano a acetato de etilo y metanol, y, preferentemente,
con un sistema de disolvente apolar de acetato de etilo: hexano 1:1
y un sistema de disolvente polar de 99:1 de acetato de
etilo:metanol; El procedimiento tal y como se ha citado
anteriormente, en el que el compuesto de fluoruro usado en la
desulfonación de la etapa 5 se selecciona de: fluoruro de cesio
(CsF) y fluoruro de tetrabutilamonio y, preferentemente, CsF. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que el
disolvente orgánico usado en la desulfonación de la etapa 5 se
selecciona de: dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido y
N-metilpirrolidinona y es, preferentemente, DMF. El
procedimiento tal y como se ha citado anteriormente, en el que el
disolvente orgánico de la etapa 6 es acetonitrilo, tetrahidrofurano
o éter, y es, preferentemente, acetonitrilo.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para la preparación de un compuesto radioligando de Fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende las etapas
de:
(a) hacer reaccionar la amina
\vskip1.000000\baselineskip
con cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S] en presencia de una base orgánica para
formar la metanosulfonamida-[^{35}S]
silil-protegida;
y
(b) eliminar el grupo protector de sililo de la
metanosulfonamida-[^{35}S] silil-protegida con
ácido trifluoroacético, para dar el compuesto radioligando de
Fórmula I.
El procedimiento, en el que se usa una base
orgánica tal como trietilamina, trimetilamina y
diisopropiletilamina, preferentemente trietilamina. El
procedimiento funciona preferentemente a temperatura ambiente
durante aproximadamente 2 horas en condiciones anhidras.
También se describe el producto intermedio clave
en la síntesis del compuesto radioligando de Fórmula I, que es el
compuesto amina.
El compuesto radioligando
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S] se preparo utilizando la siguiente vía
sintética. Los esquemas 1 y 2 describen las etapas para preparar
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-trimetilsililoxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]amina
de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida.
El esquema 3 describe la preparación del cloruro de metanosulfonilo
radiomarcado usando sulfito de sodio-[^{35}S] para preparar
metanosulfonato de sodio-[^{35}S], que después se convierte en el
cloruro de sulfonilo y la sulfonilación de la amina con el cloruro
de metanosulfonilo radiomarcado, seguido por la eliminación del
grupo protector de trimetilsililo.
Esquema
1
\newpage
Esquema
2
\newpage
Esquema
3
Los siguientes ejemplos ilustran esta
invención.
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-trimetilsililoxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-
piperidin]-6-il]amina.
piperidin]-6-il]amina.
Etapa
A
A una solución a -20ºC de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(5,0 g, 10,7 mmol) en diclorometano (50 ml) en argón se añadió
2,6-lutidina (3,74 ml, 32,1 mmol) seguido por
triflato de t-butildimetilsililo (6,46 ml, 26,8
mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar a 0ºC durante 3 h
hasta que se completó. La reacción se concentró al vacío, se
diluyó con metanol y lentamente se añadió hidróxido sódico 1N (110
ml). La mezcla se agitó durante 30 min, se extrajo con acetato de
etilo (2 x 200 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró
al vacío hasta obtener un aceite (9 g). La purificación
mediante cromatografía ultrarrápida usando diclorometano/acetona
95/5 seguido por diclorometano/acetona/metanol 90/10/3 dio una
concentración de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-t-butildimetilsililhidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(5,5 g, 88%) en forma de un sólido blanco. MS m/z 583
(M^{+}).
Etapa
B
A una solución de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-t-butil-dimetilsililhidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(2,5 g, 4,30 mmol) en tetrahidrofurano en argón se añadió hidruro
sódico (disk. 60%, 0,50 g, 13,0 mmol). La mezcla se dejó agitar
durante 30 min, se enfrió hasta -20ºC y se añadió cloruro de
trimetilsililetanosulfonilo (2,5 ml. 12,4 mmol). La reacción se
dejó agitar durante 18 horas, tras lo cual se añadió
2-metilpropanoetiolato sódico (5,0 g, 44,0 mmol) en
una porción. La reacción se dejó agitar durante 30 min, se diluyó
con agua (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (400 ml). El
extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato
sódico, se concentró al vacío hasta obtener un aceite y se
purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando acetato de
etilo/hexano 1/1 para dar
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-t-butildimetilsililhidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]trimetilsililetanosulfonamida
(1,43 g, 50%), seguido por acetato de etilo/metanol 99/1 para dar
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-t-butil-dimetilsililhidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(1,1 g, 44%), MS m/z 668 (M^{+}).
Etapa
C
A una mezcla de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-t-butildimetilsililhidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]trimetilsililetanosulfonamida
(0,50 g, 0,75 mmol) en dimetilformamida (5 ml) en argón se añadió
fluoruro de cesio (0,34 g, 2,25 mmol) y la mezcla se calentó hasta
95ºC durante 30 h. La reacción se enfrió diluida con bicarbonato
sódico acuoso al 10% (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2X
50 ml). Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico
concentrado al vacío hasta obtener un aceite y se purificó mediante
cromatografía ultrarrápida usando diclorometano/métanlo 90/10 para
dar
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]amina
(0,218 g, 80%) en forma de una espuma. MS m/z 390 (M^{+}),
^{1}H RMN (CDCL_{3}) \delta 1,4-2,2 (9H, m),
2,6-3,2 (9H, m), 3,4 (1H, as), 4,82 (1H, at), 6,60
(1H, dd, J= 9,3 y 2,8 Hz), 6,71 (1H, d, J= 9,3 Hz), 6,81 (1H, d, J=
2,8 Hz), 7,18 (1H, d, J= 9,3 Hz), 7,37 (2H, m).
Etapa
D
A una solución de
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]amina
(50 mg, 0,128 mmol) en acetonitrilo en argón se añadió
trimetilsililimidazol (0,36 g, 2,5 mmol) y la reacción se calentó
hasta 60ºC durante 1,5 h. La reacción se concentró al vacío y se
purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando
diclorometano/metanol/trietilamina 96/5/0,1 para dar
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-trimetilsililoxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]amina
en forma de una espuma (58 mg, 98%). MS m/z 462 (M+) 462 (M^{+}),
^{1}H RMN (CDCL_{3}) \delta 0,09 (9H, s),
1,4-2,1 (8H, m), 2,4-2,9 (9H, m),
3,2 (2H, as), 4,65 (1H, t), 6,41 (1H, dd, J= 9,2 y 3,3 Hz), 6,49
(1H, d, J= 3,3 Hz), 6,52 (1H, d, J= 9,2 Hz), 7,03 (1H, d, J= 9,2
Hz), 7,22 (2H, m).
N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-pipe-
ridin]-6-il]metanosulfonamida-[^{35}S].
ridin]-6-il]metanosulfonamida-[^{35}S].
Etapa
A
A una solución de sulfito sódico-[^{35}S]
(1Ci/mmol, 215 \muCi en 100 \mul de solución de NaOH 0,1N con
DTT 10 mM y EDTA 1 mM) (que se puede obtener mediante reducción de
ácido sulfúrico-[^{35}S] en una superficie de cobre con
atropamiento del dióxido de azufre-[^{35}S] generado en solución
de hidróxido sódico) se añadió 25 \mul de yoduro de metilo y la
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. El análisis
de radioactividad mediante HPLC (Astec cyclobond I columna,
gradiente de solución de ácido nítrico 10 mM a una solución de
ácido nítrico 180 mM durante 20 min, 1 ml/min) indicó la conversión
completa en ácido metanosulfónico-[^{35}S]. La solución se
concentró en nitrógeno hasta casi sequedad, se añadieron 500 \mul
de agua DI y la solución se desgasificó con nitrógeno. La solución
resultante de metanosulfonato sódico-[^{35}S] (177 \muCi) se
almacenó a 0ºC.
Etapa
B
Una solución de ácido metanosulfónico-[^{35}S]
(3,37 mCi en 2,08 g de hidróxido sódico 0,1N, actividad específica=
1342 Ci/mmol, aprox. 90% RCP, obtenido de New England Nuclear) se
sopló hasta sequedad mediante cloruro de oxalilo (100 \mul, 0,54
mmol). Se produjo un enérgico desarrollo de gas durante
aproximadamente 1,5 h, punto en el cual la adición de cloruro de
oxalilo adicional (20 \mul) no produjo ninguna reacción visible.
Se añadió una solución al 10% de dimetilformamido en diclorometano
(20 \mul) que tuvo como resultado un cambio de color a amarillo
verdoso. La adición de cloruro de oxalilo (20 \mul, 0,761 mmol
total) no produjo reacción visible y la mezcla de reacción se agitó
a 0ºC durante 12 h. La mezcla se dejó calentar hasta la temperatura
ambiente, se diluyó con diclorometano (3 ml), se contó (2,37 mCi) y
se lavó con solución de bicarbonato sódico al 5% (2 X 1 ml),
seguido por solución de bisulfito sódico al 2% (1 ml). La solución
de diclorometano se secó sobre sulfato sódico y se almacenó en
CH_{2}Cl_{2} seco a -78ºC en un desecador. HPLC: columna
analítica Zorbax SB-C84.8 X 250 mm, de 80% de agua
(que contiene ácido trifluoroacético al 0,1%):acetonitrilo al 20% a
20% de agua (que contiene ácido trifluoroacético al 0,1%):
acetonitrilo al 80% en 30 min, UV= 254 nm, Caudal= 1 ml/min, tiempo
de retención (Tr) del cloruro de metanosulfonilo-[^{35}S]= 9,2
min. La medición de la radioactividad contando la solución
resultante indicó la presencia de 1,75 mCi (rendimiento de aprox.
58%). Los detalles para la preparación de cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S] se describen en "Development of a High
Specific Activity Sulfur-35 Labelled Sulfonamide
Radioligand That Allowed the Identification of a New Growth Hormona
Secretagogue Receptor." Dean, D.C., Nargund, R.P., Melillo, D.G.,
Pong, S.S., Patchett, A.A., Smith, R.G., Chaung, L.P., Ellsworth,
R.L., Griffin, P., Van der Ploeg, L.J. Med. Chem. 1996, 39,
1767.
Etapa
C
De una solución madre de cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S] en CH_{2}Cl_{2} (recién secada sobre
sulfato sódico anhidro), 25 mCi de cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S] se transfirió en un matraz de forma de
pera de 25 ml y el exceso de disolvente se destiló a presión
atmosférica a 60-64ºC. La destilación se detuvo
cuando el volumen de la solución fue de aproximadamente
100-200 \mul. El matraz se retiró del baño de
calor y se dejó enfriar ligeramente. A continuación esta solución
se transfirió mediante una jeringa de extremos romos a una solución
que contenga el producto amina del Ejemplo 1, Etapa D (\sim 5 mg,
exceso de \sim5000 veces respecto al cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S]) en 30 \mul de CH_{2}Cl_{2}
anhidro. El matraz de destilación se aclaró con CH_{2}Cl_{2}
anhidro (2 x 50 \mul) y el disolvente orgánico de combinación se
transfirió a la mezcla de reacción. A esta solución se añadieron 10
\mul de trietilamina anhidra (almacenada bajo tamices moleculares
activados de 4A. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se analizó mediante
análisis HPLC mediante inactivación de una alícuota de la solución
de reacción (< 0,1 \mul) en eluyente de HPLC (sistema HPLC:
columna analítica Zorbax-SB-C8 4,5 x
250 mm, 70% de agua (que contiene HClO_{4} al 0,1%):acetonitrilo
al 30% durante 30 min o MeCN 100% durante 10 min, después se
mantuvo durante 10 min, UV= 230 nm, caudal= 1 ml/min, Tr de
MeSO_{3}H-[^{35}S]= 3,1 min, Tr de la amina 1= 5,1 min, Tr de
sulfonamida[^{35}S] fue 10,1 min, \sim50% de
MeSO_{3}H-[^{35}S], rendimiento radioquímica del 45%).
La reacción se diluyó con 200 \mul de agua y
10 \mul de ácido trifluoroacético (con el fin de desproteger el
grupo O-trimetilsililo). Después de agitar durante
30 min a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con
5 ml de CH_{2}Cl_{2} y se agitó enérgicamente. La capa de
diclorometano se separó y se lavó con bicarbonato sódico saturado
(2 x 2 ml).La capa acuosa se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 10
ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato sódico
anhidro y se evaporó hasta la sequedad usando un evaporador
rotatorio a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en
una mezcla de acetonitrilo:agua (2:1 v:v) y se purificó usando HPLC
preparativa (columna semiprep.
Zorbax-SB-C8 9,4 x 250 mm, 75% de
agua que contiene HClO_{4} al 0,1%: acetonitrilo al 25%, UV= 230
nm, caudal= 3 ml/min, Tr de MK-0499= 14,9 MIN). Las
fracciones que contienen producto se combinaron y neutralizaron con
bicarbonato sódico saturado. El acetonitrilo se eliminó mediante
concentración en nitrógeno en un contenedor de polipropileno y la
solución resultante se pasó a través de un cartucho Semiprep
(Waters, C-18). El cartucho se lavó con agua (10
ml), seguido por la elución del producto con metanol (2 x 5 ml). Se
recolectó la fracción de metanol y se determinó que tenía una
actividad total de 11,5 mCi.
Este lote mostró una impureza radioquímica de
1,3% a 2,3 min u una impureza de 1,1% a 6,7 min. Por tanto, este
lote se repurificó de nuevo usando la columna semiprep.
Zorbax-SB fenilo usando las mismas condiciones que
antes, seguido por purificación Sep-Pak. La
actividad total obtenida fue de 8,832 mCi con una pureza
radioquímica > 99%. El compuesto de Fórmula I posee una
actividad específica de 1368 Ci/mmol.
B. Membranas:
Las células renales embrionarias humanas que
expresen constitutivamente ERGh se recolectan, homogeneizan en
tampón Tris-EDTA (que contiene Tris 50 mM y EDTA 1
mM (pH 7,4)) y se centrifugan a 45.000 g durante 20 min a 4ºC. El
precipitado se resuspende en tampón Tris-EDTA,
re-homogeneiza y centrifuga como se ha indicado
antes. Por último, el precipitado se resuspende en tampón
Tris-EDTA, se alícuota y almacena a -70ºC. Las
membranas se homogeneizan brevemente el día del experimento y cada
alícuota se usa sólo una vez.
C. Radioligando: Fórmula I a una
concentración final de 50 pM.
D. Desplazador inespecífico: Fórmula II;
1 \muM).
E. Células: Las células son HEK 293
transfeccionadas de forma estable con ADNc de ERGh. Véase Z.
Zhou y col. Biophysical Journal 74 pág. 230-241
(1998). Se encuentran en medio congelado. Deberán cultivarse en
medio mínimo esencial (MEM) suplementado con sales de Earle,
aminoácidos no esenciales (0,1 mM), piruvato sódico (1 mM),
penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml),
geneticina (G418, Gibco BRL, 0,4 mg/ml) y suero bovino fetal
(10%).
Etapa
B
Las membranas ERG humanas (ERGh) se diluyen en
tampón de ensayo, se mezclan con radioligando hasta una
concentración final de 50 pM y se añaden 400 \mul de mezcla de
membrana/ligando por pocillo a bloques de ensayo de 96 pocillos
(Costar, Nº Cat., 3957), que contiene 4 \mul de 100 x los
almacenes de los fármacos analizados o DMSO al 100% (unión máx.) o
solución de 100 \muM del compuesto de Fórmula II (unión
inespecífica). La concentración final de la proteína de membrana en
el ensayo es de 11 \mug/ml. Esta mezcla se incuba a temperatura
ambiente durante 57 min, después se filtra a través de GFB
Unifilters (Packard) preempacados en BSA al 0,1% y lavados 5 x 500
\mul con tampón de ensayo helado. Los filtros se secan dentro de
la campana de extracción de humos a temperatura ambiente, a cada
pocillo se añaden 50 \mul de Microscint-20 y los
Unifilters se cuentan durante 1 min en Topcount (Packard).
Claims (30)
1. Un compuesto radioligando de Fórmula I que
es
o sales farmacéuticamente
aceptables del
mismo.
2. El compuesto radioligando de Fórmula I, según
la reivindicación 1, que posee una actividad específica superior a
500 Ci/mmol.
3. El compuesto radioligando de Fórmula I, según
la reivindicación 1, que posee una actividad específica en el
intervalo de 900 Ci/mmol a 1498 Ci/mmol.
4. Un procedimiento in vitro de
caracterizar un canal iónico como un canal de I_{Kr}, que
comprende poner en contacto el canal iónico con el compuesto
radioligando de la reivindicación 1 y determinar si el compuesto
radioligando se une al canal iónico.
5. Un procedimiento in vitro de
caracterizar la actividad de un compuesto como un bloqueante del
canal de I_{Kr}, que comprende poner en contacto el compuesto de
prueba con una membrana que contiene el canal de I_{Kr} en
presencia del compuesto radioligando de la reivindicación 1 y
monitorizar si el compuesto de prueba influye sobre la unión del
compuesto radioligando a la membrana que contiene el canal de
I_{Kr}.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que la membrana que contiene el canal de I_{Kr} deriva de
una línea celular transfeccionada con el gen ERG.
7. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que la línea celular es la línea de células HEK 293 o de
células CHO.
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
en el que el gen ERG es humano, canino o de primate.
9. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el compuesto radioligando de Fórmula I posee una
actividad específica en el intervalo de 900 Ci/mmol a 1498
Ci/mmol.
10. Un procedimiento in vitro para
evaluar la unión de un compuesto de prueba a una membrana que
contiene el canal de I_{Kr} usando un compuesto radioligando de
Fórmula I,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], que comprende las etapas de:
1) preparar las soluciones del compuesto de
prueba a 5 o más concentraciones diferentes, una solución de
vehículo control y una solución de
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
(compuesto de Fórmula II) en un disolvente;
2) mezclar el compuesto radioligando de Fórmula
I con la membrana que contiene el canal de I_{Kr} diluido con un
tampón de ensayo para formar una mezcla de membrana/radioligando de
concentración conocida;
3) incubar una cantidad de concentración
conocida de la mezcla membrana/radioligando con la solución del
compuesto de prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula
II, como se cita en la etapa 1, durante un periodo de tiempo
establecido a un intervalo de temperatura de entre 4ºC y 37ºC para
dar una mezcla de membrana unida al radioligando y al compuesto de
prueba, el vehículo control o el compuesto de Fórmula II, donde la
concentración final de la membrana que contiene el canal de
I_{Kr} está predeterminada;
4) aislar de la mezcla incubada la membrana
unida con el radioligando y el compuesto de prueba, el vehículo
control o el compuesto de Fórmula II;
\newpage
5) medir la radioactividad de la membrana
aislada unida con el radioligando y el compuesto de prueba, el
vehículo control o el compuesto de Fórmula II;
6) repetir las etapas 3 a 5 con el compuesto de
prueba a cada concentración, la solución del vehículo control y la
solución del compuesto de Fórmula II, como se cita en la etapa 1;
y
7) calcular la CI_{50} correspondiente a la
radiactividad medida de: 1) la membrana unida con el radioligando y
cada concentración del compuesto de prueba, 2) la membrana unida con
el radioligando y con el vehículo control y 3) la membrana unida
con el radioligando y el compuesto de Fórmula II.
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la membrana que contiene el canal de I_{Kr} deriva de
una línea celular transfeccionada con el gen ERG.
12. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que la línea celular es la línea de células HIEK 293 o de
células CHO.
13. El procedimiento según la reivindicación 12,
en el que el gen ERG es humano, canino o de primate.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que las soluciones del compuesto de prueba se preparan en la
Etapa 1 a 7 concentraciones diferentes.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que el periodo de tiempo para la incubación en la etapa 3 es
de 30 minutos a 1 hora.
16. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el que la temperatura para la incubación en la etapa 3 es la
temperatura ambiente (25ºC).
17. El procedimiento según la reivindicación 16,
en el que la membrana unida con radioligando o compuesto de prueba
se aísla en la etapa 4 con Unifilters, perlas del ensayo de
proximidad de centelleo (SPA) o las Flashplates.
18. El procedimiento según la reivindicación 17,
en el que la membrana que contiene el canal de I_{Kr} deriva de
una línea celular HEK 293 transfeccionada con el gen ERG humano.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que el compuesto radioligando de Fórmula I posee una actividad
específica en el intervalo de 900 Ci/mmol a 1498 Ci/mmol.
20. Un procedimiento in vitro para
evaluar la unión de un compuesto de prueba a una membrana que
contiene el canal de I_{Kr} usando un radioligando de Fórmula I,
(+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida
radiomarcado con [^{35}S], que comprende las etapas de:
- 1)
- preparar pocillos de ensayo preparar pocillos de ensayo con 4 \mul del compuesto de prueba en dimetilsulfóxido (DMSO) diluido 100 veces con tampón de ensayo a 5 o más concentraciones diferentes, un vehículo control de DMSO y una solución de DMSO de (+)-N-[1'-(6-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-2(R)-naftalenil)-3,4-dihidro-4(R)-hidroxiespiro[2H-1-benzopiran-2,4'-piperidin]-6-il]metanosulfonamida (compuesto de Fórmula II);
- 2)
- añadir el compuesto radioligando de Fórmula I a 50 pM a la membrana que contiene el canal de I_{Kr} diluido con tampón de ensayo para formar una mezcla de membrana/radioligando;
- 3)
- incubar cada pocillo de ensayo con 400 \mul de la mezcla membrana/radioligando 50 pM durante 75 minutos a 90 minutos a temperatura ambiente (25ºC) para dar pocillos de ensayo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II, donde la concentración final de la membrana que contiene el canal de I_{Kr} es 11 \mug/ml;
- 4)
- filtrar los pocillos de ensayo incubados a través de filtros preempacados con BSA al 0,1% para aislar en los filtros la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II;
- 5)
- lavar cada uno de los filtros que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II 5 veces con 500 \mul de tampón de ensayo helado;
- 6)
- secar los filtros lavados que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II a temperatura ambiente en una campana de extracción de humos;
- 7)
- añadir 50 T1 de Microscint-20 de microcentelleo a los filtros secos que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II;
- 8)
- medir el recuento de microcentelleo de los filtros tratados de microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesto de prueba a cada concentración, el vehículo control DMSO o el compuesto de Fórmula II durante un minuto; y
- 9)
- calcular la CI_{50} correspondiente al recuento de microcentelleo medido de: 1) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y cada concentración del compuesto de prueba, 2) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y con el vehículo control y 3) los filtros tratados con microcentelleo que contienen la membrana unida con el radioligando y el compuesta de Fórmula II.
21. El procedimiento como se cita en la
reivindicación 20, en el que la membrana que contiene el canal de
I_{Kr} deriva de una línea celular transfeccionada con el gen
ERG.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
en el que la línea celular es la línea de células HEK 293.
23. El procedimiento según la reivindicación 22,
en el que el gen ERG es humano o canino.
24. El procedimiento según la reivindicación 23,
en el que las soluciones del compuesto de prueba se preparan en la
etapa 1 a 7 concentraciones diferentes.
25. El procedimiento según la reivindicación 24,
en el que la membrana que contiene el canal de I_{Kr} deriva de
una línea celular HEK 293 transfeccionada con el gen ERG humano.
26. El procedimiento según la reivindicación 25,
en el que el compuesto radioligando de Fórmula I posee una actividad
específica en el intervalo de 900 Ci/mmol a 1498 Ci/mmol.
27. El procedimiento según la reivindicación 26,
en el que la membrana unida con radioligando o el compuesto de
prueba se filtra en la Etapa 4 con Unifilters.
28. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto radioligando de Fórmula I como se reivindica en la
reivindicación 1.
que comprende las etapas
de:
(a) hacer reaccionar la amina
con cloruro de
metanosulfonilo-[^{35}S] en presencia de una base orgánica para
formar la metanosulfonamida-[^{35}S]
silil-protegida;
y
(b) eliminar el grupo protector de sililo de la
metanosulfonamida-[^{35}S] silil-protegida con
ácido trifluoroacético, para dar el compuesto radioligando de
Fórmula I.
29. El procedimiento según la reivindicación 28,
en el que la base orgánica se selecciona de trietilamina,
trimetilamina y diisopropiletilamina.
30. El procedimiento según la reivindicación 29,
en el que la base orgánica es trietilamina.
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