ES2296813T3 - Metodo para la reparacion y la regeneracion de cartilago y de colageno ex vivo e in vitro. - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo o in vitro para la restauración de la función del cartílago degenerado, dañado o lesionado, en el que dicho método comprende la etapa de: (a) someter un cartílago degenerado, dañado o lesionado o un injerto de cartílago extirpado de una articulación, o condrocitos, ex vivo o in vitro, a una presión hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre aproximadamente 0, 5 y aproximadamente 30 MPa durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas diarias; (b) retirar la IHP durante un periodo de recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y (c) repetir las etapas (a) y (b) durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos como sea necesario.

Description

Método para la reparación y la regeneración de cartílago y de colágeno ex vivo e in vitro.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para la reparación, la regeneración, la formación de novo y la remodelación ex vivo e in vitro de células mesenquimales o derivadas del mesénquima, cartílago, colágeno y hueso dañadas y normales, y a los medicamentos para tales fines. En particular, esta invención se refiere a la regeneración ex vivo e in vitro de cartílago y de colágeno articular y a la remodelación ósea mediante presión hidrostática aplicada de manera intermitente. El método implica la aplicación de carga externa a intervalos que consisten en periodos repetidos de presión hidrostática aplicada seguidos de e interrumpidos por periodos de recuperación. El método se refiere específicamente a la aplicación de la presión hidrostática intermitente a niveles de 0,5-30 MPa durante un intervalo de 1-8 horas seguido de un periodo de recuperación de hasta aproximadamente 16-23 horas, aplicándose dicha presión a células cartilaginosas y óseas in vitro, explantes de injerto cartilaginoso y óseo ex vivo y al cartílago que queda intacto dentro del espacio articular de articulaciones diartróticas. La carga a intervalos da como resultado un aumento significativo de la expresión de proteínas que proporcionan las propiedades fenotípicas únicas del cartílago y del hueso y la inhibición selectiva de enzimas degradantes de la matriz, citocinas proinflamatorias y quimiocinas que atraen células inflamatorias hacia la cavidad articular y la disminución selectiva de la expresión génica de factores de crecimiento que son inhibidores de la reparación y regeneración de la matriz extracelular.

La invención también se refiere a métodos ex vivo e in vitro para el tratamiento de la regeneración, restauración y transplante de cartílago y de colágeno articular.

Descripciones anteriores y relacionadas

Las enfermedades artríticas, particularmente la osteoartritis, afectan a más gente que cualquier otra enfermedad. La osteoartritis implica la pérdida de función del cartílago que experimenta una degeneración lenta progresiva en muchas articulaciones. Aunque la osteoartritis se considera una enfermedad no inflamatoria, se produce cierto grado de inflamación. La osteoartritis se distingue de la artritis reumatoide, que es una enfermedad articular inflamatoria crónica.

La osteoartritis afecta a la mayoría de la gente de mediana edad tardía. Las afecciones relacionadas con osteoartritis disminuyen la productividad personal y la calidad de vida y, en una sociedad cada vez más envejecida, aumentan la morbidez y la mortalidad de hombres y mujeres aumentando la incidencia de otras afecciones crónicas tales como, por ejemplo, la osteoporosis. Actualmente, el único tratamiento con éxito para una enfermedad articular en fase terminal requiere una cirugía mayor que implica el reemplazo total de la articulación, que no está libre de complicaciones asociadas tales como infección, desprendimiento aséptico y dolor. Estas complicaciones pueden conducir a la necesidad de una artoplastia de revisión. La reversión de la aparición temprana de asteoartritis mediante técnicas quirúrgicas novedosas que eliminarían la necesidad de reemplazo de la articulación está ahora mismo en fases expe-
rimentales.

Se están desarrollando procedimientos quirúrgicos intraarticulares que suponen la transferencia de células cartilaginosas de regiones sanas de la articulación a superficies dañadas para restaurar la función articular. En este contexto, se colocan células cartilaginosas o pequeñas regiones de cartílago en defectos parciales o del grosor completo de la superficie articular usando un procedimiento quirúrgico abierto. Después, la construcción celular se mantiene en su lugar mediante tejido perióstico que se sutura en su sitio. En muchos casos, estos injertos se fibrilan y se degradan rápidamente. En un procedimiento alternativo, la mosaicoplastia implica trasladar múltiples pequeños injertos de cartílago de un área de la superficie articular a otra para favorecer que vuelva a soportar peso. Con cualquier tipo de intercambio cartilaginoso, se favorecerá enormemente la eficacia de reparación después de la restauración de una estructura de matriz extracelular de cartílago normal antes de su uso.

Las enfermedades cartilaginosas, colagenosas y óseas, por lo tanto, representan un problema médico de enorme importancia, particularmente con una población cada vez más envejecida que es más propensa a osteoartritis y otras enfermedades regenerativas articulares y será importante, por lo tanto, tener disponible un medio para la regeneración del cartílago y del colágeno articulares y la remodelación ósea.

El cartílago articular recubre los extremos de los huesos largos y es un tejido de soporte de carga que distribuye las fuerzas por las superficies articulares, protegiendo, de este modo, al hueso subyacente más rígido. También facilita una articulación y flexión suaves de las articulaciones durante las actividades normales de la vida diaria.

Continuamente se realiza intentos de regenerar cartílago articular. La patente de Estados Unidos Nº 6.080.194, por ejemplo, describe un molde de colágeno formado por combinación de una esponja de colágeno porosa con una membrana de colágeno. La patente Nº 5.786.217 describe métodos y composiciones para la reparación de defectos del cartílago articular. La patente Nº 5.206.023 describe métodos y composiciones para el tratamiento y la reparación de defectos o lesiones del cartílago. La patente Nº 5.041.138 se refiere a la neomorfogénesis de cartílago in vivo a partir de un cultivo celular para el desarrollo e implantación de estructuras cartilaginosas. Sin embargo, ninguna de estas patentes describe un método que regeneraría el cartílago dañado hasta un estado funcional y todavía se carece de dicho método.

Los ensayos clínicos en seres humanos y los estudios experimentales con modelos animales confirman que las cargas mecánicas proporcionan un estímulo esencial para el mantenimiento de una homeostasis normal del cartílago articular (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 190: 275 (1989)).

Las alteraciones de la carga articular debidas a inmovilización (Clin. Orthop. Rel. Res., 219: 28 (1987)), laxitud ligamentosa (Ibídem, 213: 69 (1986)), impacto excesivo (J. Biomechanics, 6: 51 (1973)) o rigidez ósea subcondral aumentada (J. Biomechanics, 28: 357 (1995) dan como resultado cambios patológicos en el cartílago característicos de osteoartritis.

La capacidad del cartílago de cambiar de forma rápidamente y de manera reversible es atribuible a una matriz resistente y elástica con un alto contenido de proteoglicanos altamente solubles que están atrapados en colágeno, una red de fibras insolubles. Los proteoglicanos, el colágeno y otras moléculas presentes en el tejido cartilaginoso se producen mediante células cartilaginosas derivadas del mesénquima, los condrocitos.

Los estudios in vitro confirman que las células cartilaginosas, los condrocitos articulares, responden a condiciones de carga específicas a través de una reacción anabólica o catabólica que puede atribuirse la carga y a la tensión que se imparten a la célula mediante el estímulo físico (Biochem. Biophys. Res. Commun., 240: 216 (1997); Spine, 22: 1085 (1997) y J. Orthop. Res., 15: 189 (1997)).

El reconocimiento del papel que la carga mecánica desempeña en la regulación del metabolismo de los condrocitos articulares se ha definido en parte mediante el análisis matemático de la distribución de fuerzas por las superficies articulares (J. Biomech., 22: 853 (1989)).

Los análisis biomecánicos descritos en J. Exp. Physiol., 81: 535 (1996) confirman que los condrocitos del cartílago de una articulación diartrótica experimentan niveles de presión hidrostática del orden de 7 a 10 MPa que resultan de actividades normales de la vida diaria. Los estudios que investigan la influencia de fuerzas mecánicas sobre la diferenciación tisular revelaron que se encuentra un grosor de cartílago aumentado en regiones de la articulación diartrótica expuestas a una carga hidrostática de compresión elevada intermitente. El cartílago más fino coincide con regiones que experimentan una presión hidrostática disminuida y que tienen fuerzas de tensión que se originan tangencialmente a la superficie articular (Bone, 11: 127 (1990)).

Los estudios experimentales descritos en J. Orthop. Res., 9: 1-10 (1991) confirmaron que la presión hidrostática influye en el metabolismo de la matriz cartilaginosa articular cuando se aplican in vitro y establecieron que una presión hidrostática a niveles de 5-15 MPa modula los índices de incorporación de ^{35}SO_{4} y ^{3}H-prolina en el cartílago articular bovino adulto in vitro.

Los experimentos de cultivo de órganos descritos en J. Biol. Chem., 262: 15490 (1987) demostraron que los sitios de producción de proteoglicanos coinciden con regiones de presión hidrostática natural. Los niveles fisiológicos de presión hidrostática potencian los niveles de señal de ARNm para agrecano y colágeno de tipo II cuando se miden inmediatamente después de la aplicación de carga, como se describe en J. Orthop. Res., 14: 53 (1996). En un estudio de compresión de carga controlada de expresión de ARNm de agrecano en explantes de cartílago bovino se observó una sobrerregulación transitoria después de una hora de carga.

Aunque la investigación anterior describe y reconoce la importancia de la presión hidrostática sobre la función normal del cartílago y del colágeno de tipo II, tales conocimientos eran sin embargo imposibles de aplicar clínicamente ya que la aplicación continua de la presión hidrostática conduce al agotamiento del potencial metabólico del cartílago y a su lesión, mientras que la carga breve (<1 hora) con presión hidrostática conduce a respuestas celulares modificadas que alteran el metabolismo y la homeostasis de los condrocitos. Por ejemplo, un breve periodo de aplicación de carga de presión hidrostática produce una expresión aumentada de ARNm de colágeno de tipo II, mientras que la carga aplicada de manera continua no mantiene dicha expresión aumentada. Por otro lado, la expresión de señal de agrecano continuó aumentando durante toda la duración de la carga. Evidentemente, estos resultados alteran el equilibrio celular entre el agrecano y el colágeno de tipo II. Las células cartilaginosas responden a múltiples estímulos de maneras impredecibles y la variabilidad de la respuesta depende del tiempo, de la magnitud y de la frecuencia de la carga. Obviamente, esta impredecibilidad impide el uso de periodos continuos largos o cortos de carga de presión hidrostática indiscriminada para el tratamiento de osteoartritis o la regeneración de cartílago dañado (J. Rehab. Res. Dev., 37: 153-161 (2000)).

El documento WO 96/39992 se refiere a un aparato y a un método para esterilizar, sembrar, cultivar, almacenar, transportar y ensayar construcciones de tejido cartilaginoso de reemplazo. El documento US 5.746.704 se refiere a un aparato de terapia que tiene un dispositivo de movilidad pasiva para flexionar un miembro corporal. El documento US 5.752.925 se refiere al aumento de la resistencia a la fractura del hueso mediante la aplicación repetida de fuerzas de baja magnitud simulando las fuerzas del traumatismo.

\newpage

En vista de la gravedad y del efecto incapacitante de la osteoartritis y de otras enfermedades cartilaginosas, colagenosas u óseas, sería importante proporcionar un método que permitiera una regeneración de cartílago o de colágeno y una remodelación ósea.

Hasta hace poco se pensaba que el cartílago articular no podía auto-repararse una vez que se altera la distribución de las fibras de soporte. (Articular Cartilage and Osteoarthritis, Workshop Conference Hoechst-Werk, Kalle-Albert, Wiesbaden, 12-16 de mayo de 1991, Eds. Kuettner et al., Rosen Press, Nueva York).

Se ha descubierto ahora que tal regeneración es posible con un régimen específico de presión hidrostática aplicada de manera intermitente a células mesenquimales o derivadas del mesénquima, tales como fibroblastos, fibrocondrocitos o condrocitos y es, por lo tanto, un objetivo primario de la presente invención proporcionar métodos para el tratamiento ex vivo e in vitro de osteoartritis y de otras enfermedades cartilaginosas y colagenosas mediante la estimulación de su regeneración, formación de novo y remodelación ósea, proporcionando dichos métodos un entorno de carga mecánica definido que regenera y repara células cartilaginosas y óseas adultas.

Sumario

La presente invención proporciona un método ex vivo o in vitro para la restauración de la función de una articulación degenerada, dañada o lesionada, caracterizado porque dicho método comprende la etapa de:

(a) someter al cartílago degenerado, dañado o lesionado o a un injerto de cartílago extirpado de la articulación, o a condrocitos, ex vivo o in vitro a una presión hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 30 MPa durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas diarias;

(b) retirar la IHP durante un periodo de recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y

(c) repetir las etapas (a) y (b) durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos como sea necesario.

La invención proporciona además el uso de cartílago, colágeno, ligamentos, tendones, hueso, condrocitos o injertos de cartílago obtenidos por un método de la invención en la fabricación de un medicamento para la restauración de la función de una articulación degenerada, dañada o lesionada.

Un aspecto de la presente invención es un método in vitro o ex vivo para la reparación, regeneración y formación de novo de cartílago, suministro de condrocitos, o deposición de colágeno de tipo II y estimulación y remodelación ósea.

Otro aspecto de la presente invención es un método in vitro o ex vivo para el tratamiento de enfermedades de cartílago, colágeno o hueso mediante la estimulación de la regeneración de cartílago y de colágeno y de la remodelación ósea usando un régimen de carga a intervalos que consiste en periodos repetidos de presión hidrostática aplicada de manera intermitente dentro de un intervalo de carga determinado seguido de un periodo de recuperación.

Otro aspecto más de la presente invención es un método ex vivo o in vitro para la reparación, regeneración y formación de novo de cartílago, en el que la regeneración se consigue mediante la aplicación de un régimen de carga a intervalos que consiste en periodos repetidos de presión hidrostática aplicada seguidos de periodos de recuperación a cartílago o células cartilaginosas ex situ o a cartílago o células cartilaginosas in vitro.

Otro aspecto más de la presente invención es un método de reparación, regeneración, y formación de novo de cartílago ex vivo que implica aplicar una presión hidrostática al tejido cartilaginoso que necesita regenerarse, extraído in situ o de condrocitos, fibroblastos o fibrocondrocitos adheridos a una matriz y sometidos al régimen que comprende aplicar la presión hidrostática de manera intermitente durante aproximadamente 1-8 horas seguido de aproximadamente 16-23 horas de periodo de recuperación.

Otro aspecto más de la presente invención es el uso de injertos de cartílago en la fabricación de un medicamento para la regeneración de articulaciones dañadas para restaurar la función normal de las articulaciones, en el que los injertos se han sometido a la carga de presión hidrostática intermitentes de la invención para restaurar una matriz sana que soporte carga.

Otro aspecto más de la presente invención es un cartílago de soporte de carga sano funcional aislado y regenerado a partir del cartílago dañado, en el que el cartílago dañado se somete a una presión hidrostática intermitente seguida de periodos de recuperación hasta que se recuperan las propiedades mecánicas y bioquímicas normales.

El método ex vivo o in vitro de la invención puede comprende además la detección de la funcionalidad del cartílago mediante la determinación in vitro de los niveles relativos, o de los niveles de expresión de, enzimas degradantes de cartílago o de hueso, citocinas y sus inhibidores o sustancias promotoras del crecimiento, factores de crecimiento y hormonas, después de someter al cartílago o hueso dañado a una presión hidrostática intermitente seguida de periodos de recuperación.

En particular, el método puede comprender además la determinación de la funcionalidad o de la extensión de la lesión del cartílago o del colágeno, después del tratamiento de IHP de la invención, mediante la determinación del nivel de expresión de ARNm de colágeno, ARNm de agrecano, TGF, MMP-1, MMP-2 o IL-6.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un esquema de un instrumento de aplicación de carga servohidraúlica adecuado para la aplicación de una presión hidrostática intermitente a condrocitos articulares.

La Figura 2 es un gráfico que ilustra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la expresión de agrecano (Figura 2A) y colágeno de tipo II (Figura 2B) en condrocitos articulares humanos normales.

La Figura 3 es un gráfico que ilustra los efectos de una carga a intervalos de 4 horas durante 4 días con 10 MPa de presión hidrostática intermitente sobre la expresión de señal de ARNm de agrecano y de colágeno de tipo II en condrocitos articulares osteoartríticos humanos.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de metaloproteinasa 2 de la matriz por condrocitos articulares humanos normales usando ELISA (Figura 4A) y la actividad enzimática usando zimografía de una preparación activada (+APMA) e inactivada (Figura 4B).

La Figura 5 es un gráfico que muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) por condrocitos articulares humanos normales.

La Figura 6 es un gráfico que muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de proteína quimioatrayente de macrófagos 1 (MCP-1) por condrocitos articulares humanos normales.

La Figura 7 es un gráfico que demuestra la ausencia de efecto de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1) por condrocitos articulares humanos normales.

La Figura 8 es un gráfico que muestra los niveles de señal de RT-PCR para la expresión de colágeno de tipo II y de tipo I y de beta-actina en células de control sin carga.

La Figura 9 muestra los niveles de señal para la expresión de beta-actina en células expuestas a IHP y en células de control sin carga.

La Figura 10 muestra los niveles de señal de RT-PCR para agrecano después de la exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a IHP.

La Figura 11 muestra los niveles de señal de RT-PCR para colágeno de tipo II después de la exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a IHP.

La Figura 12 muestra el análisis del transcurso de tiempo para la liberación de TGF-\beta1 por células MG-63 expuestas a una presión hidrostática intermitente (10 MPa).

La Figura 13 describe los efectos en respuesta a la dosis de una presión hidrostática intermitente sobre la liberación de TGF-\beta1 por células MG-63.

La Figura 14 muestra el análisis del transcurso de tiempo para la liberación de MMP-2 por células MG-63 expuestas a IHP.

Definiciones

Como se usan en este documento:

El término "esponjoso" se refiere a hueso que tiene una estructura de tipo reticular o esponjosa.

Las expresiones "mesenquimal", "células madre mesenquimales" o "célula derivada del mesénquima" se refieren a las células que se localizan en el interior de y que producen la matriz extracelular del cartílago (condrocitos), tejido conectivo (fibroblastos), fibrocartílago (fibrocondrocitos), tendones (tenocitos) y hueso (osteoblastos y osteocitos).

Las expresiones "carga" o "intervalo de carga" se refieren a un periodo de carga de IHP aplicada, o a un estímulo en un tejido, seguido de un periodo de recuperación en el que no se aplica presión externa y en el que la presión vuelve a las condiciones ambientales.

El término "intervalo" se refiere a una combinación de periodos de carga y de recuperación repetidos tantas veces como sea necesario.

La expresión "formación de novo" se refiere a la producción de tejido conectivo cartilaginoso, fibrocartílago, tendones y huesos como resultado de la adherencia de condrocitos, fibroblastos, fibrocondrocitos, tenocitos y osteoblastos dentro de una estructura de soporte (armazón o matriz de colágeno) después de la exposición a un intervalo de carga.

El término "osteoblasto" se refiere a una célula formadora de hueso que deriva del mesénquima (fibroblasto) y que forma una matriz ósea en la que la se incluye como un osteocito.

Los términos "fibroblasto" o "fibrocito" se refieren a una célula estrellada o con forma de huso con procesos citoplasmáticos presentes en el tejido conectivo capaces de formar fibras de colágeno.

El término "agrecano" se refiere a un proteoglicano agregante grande que desempeña un papel impartiendo resistencia a la compresión al cartílago articular y permitiendo el soporte de carga. El agrecano es un proteoglicano abundante que representa aproximadamente el 85% de los proteoglicanos totales.

La expresión "colágeno de tipo II" se refiere a una molécula homopolimérica de cadenas \alpha1 (11) que es el producto de un único gen COL2A1. El colágeno de tipo II es el más abundante de todos los demás tipos de colágeno y representa aproximadamente el 95% del colágeno total.

Las expresiones "metaloproteinasa de la matriz" o "MMP" se refieren a una proteasa que provoca y que está asociada con la degeneración cartilaginosa en una articulación dañada. La MMP puede diferenciarse además en MMP-1, MMP-2, MMP-9, etc.

Las expresiones "proteína quimioatrayente de macrófagos 1" o "MCP-1" se refieren a un mediador proinflamatorio que influye en el estado inmune del tejido. Su nivel aumentado se asocia con el comienzo o el aumento de la destrucción tisular, y su nivel disminuido se asocia con una disminución del daño tisular o cicatrización.

Las expresiones "factor de crecimiento transformante \beta" o "TGF-\beta" se refieren a un factor liberado por las células tras aplicar una presión hidrostática intermitente e implican un cambio en el metabolismo celular.

Las expresiones "factor de crecimiento de fibroblastos 1" o "FGF-1" se refieren a un factor de crecimiento que no se conoce que esté implicado en la proliferación de condrocitos o de células de tipo osteoblástico.

El término "MPa" se refiere a MegaPascales. Un MPa es igual a 145 psi.

El término "GAG" se refiere a glicosaminoglicanos.

El término "IHP" se refiere a presión hidrostática intermitente.

El término "GAPDH" se refiere a gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.

El término "APMA" se refiere a acetato de 4-aminofenilmercurio, un activador de la proenzima latente a la enzima activa.

Descripción detallada de la invención

La invención descrita en este documento se refiere a un descubrimiento de que presión hidrostática aplicada de manera intermitente y repetidamente durante periodos de carga a intervalos influye en la expresión génica de los condrocitos articulares, provoca la expresión de colágeno de tipo II dependiente de carga, disminuye una metaloproteinasa de la matriz, permite la formación de novo de células mesenquimales o derivadas del mesénquima dentro de una matriz y altera la remodelación ósea. El descubrimiento es adecuado para la reparación y el tratamiento de enfermedades articulares degenerativas tales como osteoartritis, artrosis, lesiones del cartílago articular, enfermedad articular degenerativa, reemplazo articular, reestructuración ósea y otras enfermedades de cartílago, colágeno y hueso.

I. Método para la Regeneración de Cartílago y de Colágeno y para la Remodelación Ósea

El método para la regeneración de cartílago y de colágeno y la remodelación ósea para el tratamiento de las enfermedades enumeradas anteriormente comprende, en su alcance más general, la aplicación de un régimen de carga a intervalos de acuerdo con la invención, a injertos de grosor completo transplantables de cartílago o de hueso humano osteoartrítico o dañado ex vivo o a las células aisladas de cartílago, colágeno y hueso sano o dañado in vitro.

A. Condiciones Generales del Régimen Terapéutico para la Regeneración Cartilaginosa

El régimen terapéutico consiste en la estimulación de tejido tratado o de células aisladas con periodos repetidos de presión hidrostática aplicada seguidos de periodos de recuperación (intervalo de carga). La presión se aplica preferiblemente de manera intermitente dentro de cada intervalo de carga. Los parámetros del método, tales como, presión, frecuencia, longitud de los intervalos, intermitencia y periodo de recuperación, se seleccionan en base al método seleccionado para la regeneración, es decir, ex vivo o in vitro, así como a la enfermedad y a la gravedad de la degeneración cartilaginosa.

1. Presión Hidrostática

El régimen de carga adecuado para la reparación, regeneración o formación de novo de cartílago intacto, hueso intacto, injerto o células cartilaginosas y óseas, comprende generalmente la aplicación de una presión hidrostática de entre 0,5 MPa y 30 MPa, preferiblemente de entre 1 MPa y 20 MPa, y más preferiblemente de entre 5 MPa y 10 MPa en intervalos intermitentes de 1 Hz de frecuencia.

Típicamente, no se usan ni se recomiendan presiones mayores que aproximadamente 30 MPa, ya que pueden conducir a daños celulares, mientras que presiones menores de 0,1 MPa pueden no ser eficaces para la regeneración de células o tejido. Las presiones de aproximadamente 5-10 MPa se corresponden con los niveles fisiológicos normales que se encuentran en el cartílago articular in vivo.

2. Duración de los Periodos de IHP y de Recuperación

La duración de los intervalos de alta presión generalmente oscila de unos minutos a 8 horas, y es preferiblemente de entre aproximadamente 1 y 8 horas, más preferiblemente de aproximadamente 4 horas.

Durante el periodo de recuperación, el tejido o las células de interés están expuestos a presión constante atmosférica o suficientemente baja. Los periodos de recuperación pueden oscilar generalmente desde unos minutos hasta decenas de horas, y son preferiblemente de entre aproximadamente 16 a aproximadamente 23 horas, preferiblemente de aproximadamente 20 horas.

3. Frecuencia

Dentro de cada intervalo de presión hidrostática intermitente, la presión se aplica de manera intermitente con una frecuencia de entre 0,1 Hz y 10 Hz, preferiblemente del orden de 1 Hz. En la realización preferida para células cartilaginosas, el régimen de carga a intervalos se aplica durante al menos 4 días consecutivos, típicamente durante aproximadamente 4 horas de carga a 10 MPa aplicada a 1 Hz seguido de aproximadamente 20 horas de recuperación a presión atmosférica constante.

4. Duración del Tratamiento

La duración del tratamiento del cartílago depende totalmente del grado y de la gravedad de la degeneración cartilaginosa, de la extensión de la pérdida de colágeno, de la gravedad de la enfermedad ósea o del grado y de la gravedad de la lesión articular. Típicamente, la mejora en la funcionalidad del cartílago y su regeneración se observan después de aproximadamente 4 tratamientos una carga de IHP, es decir, típicamente después de 4 días de tratamiento. En cartílago más degenerado, dañado o lesionado, se continúa dicho tratamiento durante hasta 100 días sin ninguna consecuencia negativa, y puede continuarse indefinidamente cuando la función del cartílago y/o del colágeno está alterada de manera crónica. El tratamiento preferible durará con éxito entre 7 y 30 días.

Para la formación de novo, la matriz de colágeno se llena de células sanas o dañadas a tratar y el tratamiento se continúa hasta que se forma el nuevo tejido.

5. Ensayo de Funcionalidad

La duración del tratamiento depende de la rapidez de la recuperación funcional. La funcionalidad del cartílago depende de la recuperación y/o de la reconstrucción y/o de la formación de una matriz que soporte carga. La degeneración cartilaginosa se produce como resultado de la deformación de las células, por niveles inapropiados de carga de tensión de cizalla sobre la matriz y degeneración debida a cambios metabólicos.

Estos cambios metabólicos afectan a la expresión genética de la célula cartilaginosa con respecto al agrecano y al colágeno, particularmente al colágeno de tipo II, y a cierto factor de crecimiento como el TGF-\beta. Los cambios y el metabolismo de los condrocitos también conducen a la expresión o sobreexpresión de proteínas que no se expresan normalmente o que se expresan en menor medida en condrocitos funcionales sanos, tales como metaloproteinasas MMP-1, MMP-2, MMP-9 y citocinas proinflamatorias, tales como IL-1 e IL-6.

Por consiguiente, durante y particularmente después del tratamiento de carga de IHP, se ensayan algunos o todos los factores anteriores y se evalúa su presencia para determinar una actividad aumentada. Actividades ausentes o disminuidas se correlacionan con la regeneración de la integridad del cartílago y de su función de soporte de carga.

TABLA 1 Ensayo de Funcionalidad

1

\hskip0.3cm

nd = no detectable o traza.

El ensayo de funcionalidad descrito en este documento implica la determinación de los valores relativos de los componentes de la matriz extracelular tales como agrecano y colágeno de tipo II, proteasas tales como MMP-1, MMP-2, MMP-9 y citocinas tales como IL-6, IL-1 y MCP1. Estos valores son distintos dependiendo de la preparación del tejido y del método usado, pero la tendencia continúa siendo la misma, concretamente, los niveles de proteínas de la matriz extracelular disminuyen y los niveles de proteasas y citocinas aumentan en cartílago y colágeno lesionados o degenerados. Durante la regeneración, los niveles vuelven a sus intervalos fisiológicos normales.

Se descubrió que el régimen de carga aplicada de acuerdo con la invención estimulaba la regeneración del tejido cartilaginoso articular, del tejido de colágeno, del tejido óseo y/o de sus células respectivas aisladas. También se descubrió que el régimen de carga a intervalos aumentaba la expresión génica de las proteínas que forman la matriz extracelular funcional del cartílago articular. Después de la aplicación de un régimen de carga a intervalos de la presente invención, la tinción de la matriz con colorantes catiónicos confirmó la presencia aumentada de matriz extracelular.

Además, se descubrió que el régimen de carga a intervalos daba como resultado la inhibición selectiva de enzimas degradantes de la matriz, citocinas proinflamatorias y quimiocinas que atraen células inflamatorias hacia la cavidad articular. Además, se descubrió que el régimen de carga a intervalos afecta a la expresión de factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF-\beta1), de metaloproteinasas de la matriz tales como, por ejemplo, MMP-1, MMP-2, MMP-9 y de inhibidor tisular de metaloproteinasa (TIMP) en células de tipo osteoblástico humanas. Éstos y otros factores pueden usarse de la manera conveniente para evaluar la funcionalidad del cartílago y del hueso, como se muestra en la Tabla 1.

Los métodos que se usan para la detección de los parámetros para la determinación de la funcionalidad incluyen, pero sin limitación, RT-PCR, zimografía, bioquímica, tinción, ELISA, técnicas de matrices de genes y proteómica.

B. Tratamiento In Vitro

Para el tratamiento in vitro, se extirpa el tejido cartilaginoso dañado de un paciente por medios quirúrgicos. El régimen de carga a intervalos puede aplicarse al tejido intacto, como a un injerto osteocondrocartilaginoso, para el tratamiento ex vivo. Para el tratamiento in vitro, se degrada la matriz cartilaginosa normal o dañada y se aplica el régimen de carga a intervalos a las células cartilaginosas resultantes cultivadas en suspensión dentro de un armazón o soporte o como monocapas. Después de la aplicación del régimen de carga, el tejido formado de novo resultante o la colección de células se reimplantan en un paciente. Preferiblemente, pero no necesariamente, el transplante es autólogo.

El procedimiento quirúrgico sigue generalmente la técnica que se ha desarrollado y usado para la intervención artroscópica usando injertos osteocondrales. En este procedimiento, se extirpa una muestra de grosor completo de cartílago de las regiones periféricas de la superficie articular y después se transfiere a un defecto circular. El sitio hospedador tiene típicamente una circunferencia que es menor que el material a insertar, de tal modo que la unión entre el sitio hospedador y el tejido de reemplazo es un ajuste resistente. En el material que se produce en respuesta a la carga a intervalos, el material cartilaginoso reimplantado se ajusta en tamaño para coincidir con los contornos de la superficie articular. Éste es diferente del procedimiento habitual para injertos osteocondrales, en los que se deja un injerto de tamaño superior 2-3 mm por encima de la superficie del cartílago circundante. La formación de una matriz extracelular basada en colágeno de tipo II, que es capaz de resistir cargas articulares normales, permite que los injertos ajustados por presión coincidan con el grosor de la superficie articular normal, que coincide con el grosor natural que corresponde a la variación regional de la articulación normal.

El tratamiento in vitro de células, monocapas de células o cultivos celulares se describe básicamente en la sección II.

C. Tratamiento Ex Vivo

Para el tratamiento ex vivo, que es particularmente adecuado para el tratamiento de lesiones del cartílago articular, tales como rotura o desgarro de menisco, en las que puede estar lesionado sólo una parte del cartílago y el resto del cartílago está sano y funcional, el cartílago desgarrado o roto se extirpa quirúrgicamente como un injerto de cartílago y se somete a un régimen de carga de IHP. La funcionalidad del injerto de cartílago se ensaya periódicamente hasta que los criterios alcanzan los niveles normales del cartílago sano, como se muestra en la Tabla 1. Después, el injerto, que conserva su forma y tamaño originales, se reimplanta en la articulación. El tratamiento de IHP ex vivo, el ensayo, la extirpación quirúrgica y la reimplantación se realizan en condiciones estériles.

La ventaja del tratamiento ex vivo es que el tejido es autólogo, solamente el tejido dañado se somete a tratamiento y el tamaño y la forma del explante continúan siendo los mismos, de tal modo que no se añade más ni menos tejido cartilaginoso. Además, el tejido se retransplanta solamente si y cuando está completamente regenerado. La desventaja de este procedimiento es una doble cirugía. No obstante, en lesiones articulares extensas de la articulación, este procedimiento es de todas formas preferible al reemplazo de la articulación o a dejar la articulación sin el cartílago o sin una parte del cartílago.

D. Equipo para la Aplicación de Carga de Presión Hidrostática Intermitente

Los instrumentos y equipos para la regeneración de matriz y/o de las células del cartílago articular en tratamientos ex vivo e in vitro comprenden, básicamente, un generador de presión hidrostática, un contador de frecuencia, un temporizador y un dispositivo de control de temperatura.

Un equipo in vitro adecuado comprende una cámara de presurización para contener el tejido, células de interés o cultivos celulares, un instrumento de carga hidráulica (dispositivo de presurización) en contacto fluido con la cámara de presurización, para presurizar la cámara de presurización a presiones predeterminadas de interés, y componentes electrónicos de control para el control de frecuencia en contacto eléctrico con el instrumento de carga, para controlar el instrumento de carga, para aplicar un régimen de carga a intervalos predeterminado al tejido o a las células de interés.

Se observa en la Figura 1 un instrumento adecuado para la aplicación de una presión hidrostática intermitente a condrocitos articulares aislados para el tratamiento in vitro. El instrumento en particular que se observa en la Figura 1 es un recipiente de presión de acero inoxidable disponible en el mercado conectado con un instrumento de carga servohidráulica. Este diseño facilita la evacuación completa del aire del sistema, dando como resultado la aplicación de simplemente presión hidrostática.

El aparato que se observa en la Figura 1 es solamente ejemplar y debe entenderse que se pretende que, cualquier instrumento y equipo, independientemente de cómo de modificado, que comprenda componentes similares y proporcione resultados similares, se incluya dentro del alcance de esta invención. También se refiere a un instrumento in vivo que comprende un dispositivo de sujeción para sujetar una articulación o extremidad de un paciente o medios de sujeción al tejido del paciente, un motor acoplado con el dispositivo de sujeción para mover el dispositivo de sujeción a lo largo de una trayectoria predeterminada, y componentes electrónicos de control conectados eléctricamente al motor para controlar el motor para mover la extremidad del paciente para aplicar un régimen de carga a intervalos al tejido cartilaginoso de interés.

La carga in vivo de la articulación se realiza mediante un dispositivo que abarca la articulación diartródica en cuestión. Por ejemplo, para la rodilla, el equipo abarca la distancia desde la cadera hasta la punta del pie, con las restricciones correspondientes para mantener la pierna en extensión. El dispositivo incluye un mecanismo de contracción por el que el cartílago condilar femoral puede yuxtaponerse sobre el cartílago de la meseta tibial a través del menisco a una frecuencia de entre 0,1 y 10 Hz y generará presiones en el intervalo de 1 a 20 MPa para intervalos prescritos de entre 1 y 8 horas, más aproximadamente de 4 horas por día a una actividad diaria normal.

II. Carga a Intervalos de Condrocitos Humanos Normales y Osteoartríticos

El componente principal de cargas mecánicas a las que están expuestos los condrocitos articulares en el interior de la matriz extracelular del cartílago articular es la presión hidrostática. La carga normal de las articulaciones durante actividades diarias provoca que el cartílago articular esté expuesto a altos niveles de presión hidrostática intermitente. Los estudios descritos en esta sección demuestran que condrocitos osteoartríticos mantenidos in vitro responden a una presión hidrostática aplicada aumentando una actividad metabólica positiva y disminuyendo la expresión de enzimas destructoras.

El efecto de una presión hidrostática intermitente sobre la síntesis de proteínas de la matriz cartilaginosa en condrocitos articulares humanos adultos aislados se centró en la expresión de ARNm de colágeno de tipo II, agrecano y otras proteínas degradantes y promotoras del crecimiento, tales como MMP-2, TGF-\beta, MCP-1 y FGF-1. Se observan resultados de estos estudios en las Figuras 2-7.

En esta serie de estudios, la expresión de ARNm de agrecano, colágeno de tipo II, MMP-2, TGF-\beta, MCP-1 y FGF-1 de condrocitos humanos normales sanos y osteoartríticos estimulados con 1 MPa o 10 MPa de presión hidrostática durante 5 minutos o 4 horas durante 4 días se comparó con la expresión de ARNm en los controles. Cuando la carga se realizó a modo de respuesta a una dosis que oscila entre 1, 5 y 10 MPa, cara a cara, la presión hidrostática limitada a 5 minutos intermitentes o a 4 horas intermitentes por día a una presión de 1 MPa y 10 MPa, se observó que la señal de ARNm de agrecano aumentaba con cargas de 1 MPa, 5 MPa y 10 MPa, como se observa en la Figura 2.

Los resultados que se observan en la Figura 2 confirman claramente que el régimen actual de carga a intervalos da como resultado una expresión genética aumentada de agrecano y de colágeno de tipo II. El agrecano es el proteoglicano agregante grande y más abundante que desempeña un papel fundamental impartiendo resistencia a la compresión al cartílago articular y permitiendo que persista el soporte de carga. El colágeno de tipo II proporciona al tejido resistencia a la tracción. El tratamiento de la invención conduce, por lo tanto, a una resistencia aumentada del cartílago y a la capacidad de soportar cargas mayores.

La Figura 3 muestra los efectos de una carga a intervalos de 4 horas durante 4 días con 10 MPa de presión hidrostática intermitente (IHP) sobre la expresión de señal de ARNm de agrecano y colágeno de tipo II, expresados como una proporción entre agrecano o colágeno de tipo II y proteína intracelular de referencia \beta-actina en condrocitos articulares humanos osteoartríticos.

Estos resultados confirman claramente que la expresión tanto de agrecano como de colágeno de tipo II, las proteínas macromoleculares fundamentales de la matriz extracelular del cartílago, aumentó en las células cartilaginosas osteoartríticas humanas dañadas después del tratamiento de IHP.

Como se observa en las Figuras 3A y 3B, la aplicación de una presión hidrostática intermitente dio como resultado una proporción aumentada de producción de señal de agrecano respecto a \beta-actina de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5, es decir, un aumento de aproximadamente 5 veces. La proporción de señal de colágeno de tipo II respecto a \beta-actina aumentó aún más, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,12, como se observa en la Figura 3B.

También se estudió el análisis inmunohistoquímico del efecto de la presión hidrostática sobre los condrocitos. La inmunohistoquímica proporciona un índice de la respuesta a la matriz extracelular a cargas mecánicas. Con las condiciones de carga descritas anteriormente, el análisis inmunohistoquímico demostró que la aplicación de una presión hidrostática aumentaba la deposición de proteoglicano y de colágeno en la matriz extracelular (no se muestran los datos).

Para estudiar si la IHP puede tener también efectos sobre la expresión de deleciones moleculares del cartílago, se realizaron una serie de experimentos para evaluar la liberación y la carga a intervalos eficaz de proteasas y factores de crecimiento.

El efecto de una carga a intervalos con presión hidrostática intermitente sobre la inhibición de la expresión de ARNm de metaloproteinasa de la matriz se determinó ensayando los efectos de la presión hidrostática en las mismas condiciones que se describen en la Figura 2.

Los resultados se observan en la Figura 4, que muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de metaloproteinasa 2 de la matriz por condrocitos articulares humanos normales.

La metaloproteinasa 2 de la matriz (MMP-2) es una de varias enzimas que se sabe que están asociadas con la degeneración cartilaginosa en una articulación dañada. La reducción de los niveles de esta enzima después de la aplicación de IHP a 10 MPa durante 4 horas durante 4 días muestra que se está produciendo la reparación y la regeneración de la matriz extracelular. El análisis zimográfico, que se observa en la Figura 4B, de la expresión de metaloproteinasa neutra, demostró que la APMA sometida a una presión hidrostática intermitente durante 4 horas seguida de 20 horas de recuperación durante 4 días disminuyó los niveles de actividad gelatinolítica.

El factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF-\beta1) se sabe que está implicado en los cambios metabólicos asociados con la resorción acelerada de la matriz que se produce, por ejemplo, en la osteoartritis, en la que están activadas las rutas tanto anabólicas como catabólicas del metabolismo del agrecano. Por lo tanto, el TGF-\beta1 afecta a la homeostasis del cartílago.

El papel del TGF-\beta1 es más pronunciado en células progenitoras, tales como, por ejemplo, la región perióstica circundante del hueso. Los efectos directos del TGF-\beta1 sobre células cartilaginosas aisladas varían dependiendo del nivel de proteína producida, ya que presenta acciones pleiotrópicas de células diferentes. La adición de TGF-\beta1 a células cartilaginosas articulares en cultivo disminuye la expresión de colágeno de tipo II que es contraproducente para la producción de matriz.

La Figura 5 muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de TGF-\beta1 por condrocitos articulares humanos normales.

El efecto de una presión hidrostática intermitente sobre la liberación de TGF-\beta que se observa en la Figura 5 significa que el metabolismo celular está modulado por el estímulo mecánico. La producción disminuida de este factor de crecimiento está claramente acoplada a otros cambios del metabolismo celular.

Como se observa en la Figura 5, la aplicación de IHP durante 4 horas a 10 MPa da como resultado una disminución de la liberación de TGF-\beta por condrocitos normales demostrando que la síntesis proteica disminuye con una presión mayor (10 MPa) aplicada de manera intermitente durante periodos más prolongados. Estos resultados establecen que la estimulación de IHP influencia de manera diferencial el estado metabólico de los condrocitos de un modo dependiente del tiempo y de la dosis. Como se observará a continuación, se observaron resultados similares después de la estimulación de IHP de células de tipo osteoblástico.

La Figura 6 muestra los efectos de una carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre la liberación de proteína quimioatrayente de macrófagos 1 (MCP-1) por condrocitos articulares humanos normales.

La MCP-1 representa una de varios mediadores por inflamatorios que influyen en el estado inmune de los tejidos. Una disminución de MCP-1 en los condrocitos es significativa como marcador de un cambio en el metabolismo celular y en la finalización de los procesos inflamatorios que acompañan a la degeneración o lesión del cartílago. La liberación de MCP-1 se asocia normalmente con el reclutamiento de monocitos y macrófagos, las células del sistema inmune, que desempeñan un papel en la destrucción tisular. Esta expresión disminuida señala una mejora de la lesión del cartílago.

Como se observa en la Figura 6, la liberación de MCP-1 por condrocitos articulados humanos normales disminuye significativamente, aproximadamente 8 veces, después de la aplicación de IHP a 10 MPa durante 4 horas.

La disminución observada en la liberación de MCP-1 demuestra claramente que el mecanismo antiinflamatorio o anti-lesión del cartílago está menos activado, acarreando, por lo tanto, un menor grado de degeneración y destrucción cartilaginosa.

Para determinar si la disminución de la liberación de MMP-1, MMP-2 o TGF-\beta después de IHP es selectiva para aquellas proteínas implicadas en la degeneración cartilaginosa, se realizaron estudios con factor de crecimiento de fibroblastos 1, que no está implicado en tales procesos y que, por lo tanto, no debería reaccionar a la IHP. Los resultados se observan en la Figura 7.

La Figura 7 demuestra la ausencia de un efecto de la aplicación de carga a intervalos con diferentes magnitudes de presión hidrostática intermitente sobre el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1) por condrocitos articulares humanos normales.

La Figura 7 demuestra que no todos los factores de crecimiento responden a una presión hidrostática intermitente sino solamente los factores que están implicados en la degeneración o la regeneración cartilaginosa. La Figura 7 también demuestra que los condrocitos no se están dañando por la IHP y que la liberación disminuida de MMP-2, TGF-\beta y MMP-1 se debía al cartílago dañado.

El objetivo de los estudios descritos en las Figuras 2-7 era investigar si la aplicación de una presión hidrostática intermitente sobre cartílago acarrea cambios en la síntesis proteica de la matriz en condrocitos articulares humanos adultos aislados.

Las Figuras 2-7 muestran de manera acumulativa que una carga excesiva o insuficiente (5 minutos a 10 MPa o 4 horas a 1 MPa) del cartílago articular no proporciona un estímulo suficiente para la reparación y regeneración cartilaginosa y, en algunos casos, puede incluso conducir a una degeneración aumentada y a la pérdida de la función. Los resultados que se observan en las Figuras 2-7 confirman que existe una correlación entre la IHP y entre la aparición de cambios beneficiosos en los procesos metabólicos de los condrocitos que conducen a la regeneración cartilaginosa.

La rehabilitación de la función articular depende de la reparación y de la regeneración del cartílago dañado. Una diversidad de procedimientos experimentales descritos anteriormente confirman que la carga mecánica influye en la síntesis de componentes de la matriz extracelular de los condrocitos articulares, es decir, de agrecano y de colágeno de tipo II. Sin embargo, hasta ahora no se había demostrado que existiera una conexión clara para la modulación inducida mecánicamente de la expresión génica de la matriz cartilaginosa que establezca que la estimulación de IHP mecánica sirve como impulso para la reparación y la regeneración cartilaginosa. Los resultados descritos anteriormente hacen posible la intervención terapéutica in vitro y ex vivo.

III. Efectos Dependientes del Tiempo de la IHP sobre la Expresión de ARNm de Colágeno de Tipo II y Agrecano

Los estudios iniciales que condujeron a esta invención han demostrado que la presión hidrostática aplicada de manera continua no conduce a la reparación y regeneración cartilaginosa, medida por el aumento o disminución de las actividades metabólicas de la síntesis proteica pertinente. Dicha presión, aplicada durante un corto periodo de tiempo, dio como resultado una expresión aumentada de ARNm de colágeno de tipo II, mientras que la carga aplicada de manera continua no mantuvo dicho expresión aumentada. Por otro lado, la expresión de señal de agrecano continuó aumentando durante toda la duración de la carga.

Los estudios documentados en la sección II han demostrado que existe una correlación entre la IHP y los procesos metabólicos de los condrocitos.

Los estudios descritos en esta sección investigaron los efectos dependientes del tiempo de la IHP sobre la expresión de ARNm de colágeno de tipo II y de agrecano en condrocitos articulares normales de bovinos adultos in vitro.

El propósito de este estudio era ensayar si la presión intermitente aplicada a condrocitos potencia los niveles de ARNm de colágeno de tipo II y de agrecano sin estimular el ARNm de colágeno de tipo I. El procedimiento experimental se basaba en el uso de RT-PCR para la cuantificación relativa de los niveles de ARNm de colágeno y de agrecano con respecto al ARNm de beta-actina como señal de referencia interna.

Específicamente, este estudio examinó los efectos de dos tipos de regímenes de carga de presión hidrostática intermitente sobre la expresión de ARNm de colágeno de tipo II y de agrecano en condrocitos articulares adultos normales. Los condrocitos se aislaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Un sistema para la carga cuantitativa de condrocitos articulares adultos usaba un cultivo en monocapa de alta densidad (1,75 x 10^{5} células/cm^{2}) o grupos de células agregadas.

La carga de las células con presión hidrostática intermitente se realizó en un patrón continuo durante un periodo de 24 horas o como una carga a intervalos, aplicándose la carga durante cuatro horas por día de acuerdo con el Ejemplo 3. La respuesta metabólica de los condrocitos articulares se determinó usando ensayos semicuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa con trascripción inversa (RT-PCR) para determinar la señal de ARNm de colágeno de tipo II, agrecano y beta-actina. Los resultados se observan en las Figuras 8-12.

La Figura 8 es un gráfico que muestra los niveles de señal de RT-PCR para la expresión de colágeno de tipo II y de tipo I y de beta-actina en cultivos de condrocitos de alta actividad sin carga mantenidos durante los periodos de ensayo señalados de 2-24 horas.

La Figura 9 muestra los niveles de señal para la expresión de beta-actina en células expuestas a IHP y en células de control sin carga.

La Figura 8 muestra los niveles de señal determinados por RT-PCR para la expresión de colágeno de tipo II y de \beta-actina en células de control obtenidas sin estimulación a 2, 4, 8, 12 y 24 horas de acuerdo con el Ejemplo 3. Las condiciones de RT-PCR fueron las descritas en el Ejemplo 4.

La Figura 8 demuestra que los niveles de señal de RT-PCR para la expresión de colágeno de tipo II y de tipo I y de \beta-actina en células de control sin carga son claramente detectables y no varían.

Los condrocitos articulares sembrados en placas y mantenidos como cultivos en monocapa de alta densidad a presión atmosférica (cultivos de control sin carga) no presentaron variaciones significativas con respecto a los niveles de señal para ARNm de colágeno de tipo II o ARNm de \beta-actina. Estas observaciones continuaron siendo ciertas durante un transcurso de tiempo de 2, 4, 8, 12 y 24 horas, como se observa en la Figura 8.

Para determinar una señal de ARNm de referencia que no variara en respuesta a la IHP aplicada y, por lo tanto, que proporcionara un punto de referencia para la comparación, se seleccionó la \beta-actina debido a su abundancia relativa de ARNm y por su localización.

La Figura 9 muestra los niveles de señal de RT-PCR para la expresión de \beta-actina en células expuestas a una presión hidrostática intermitente y en células de control sin carga.

Como se observa en la Figura 9, la exposición de condrocitos a presión hidrostática intermitente no alteró los niveles de señal de ARNm de \beta-actina durante un transcurso de tiempo de 2, 4, 8, 12 y 24 horas en comparación con las células de control sin carga.

Por el contrario, la aplicación de IHP a condrocitos normales en cultivo en monocapa o en cultivo agregado demostró que la señal de ARNm de colágeno de tipo II no era muy marcada a periodos de carga de 4 y 8 horas y disminuía a partir de entonces. Por otro lado, el ARNm de agrecano, en las mismas condiciones, ha demostrado un perfil diferente y continuaba aumentando durante 24 horas.

Los resultados relativos a la expresión de colágeno de tipo II provocaron el estudio de una aplicación de carga a intervalos en el que se aplicaba IHP durante periodos de 4 horas seguidos de un periodo de recuperación.

Los agregados de cultivo de condrocitos se expusieron a una presión hidrostática intermitente usando una aplicación de carga continua durante un periodo de veinticuatro horas. Los resultados se observan en las Figuras 10 y 11.

La Figura 10 muestra los niveles de señal de RT-PCR para agrecano después de la exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a una presión hidrostática intermitente usando una carga a intervalos de 4 horas por día seguidos de una recuperación de 20 horas durante 4 días.

La Figura 11 muestra los niveles de señal de RT-PCR para colágeno de tipo II después de la exposición de cultivos en monocapa de alta densidad a una presión hidrostática intermitente usando una carga a intervalos de 4 horas por día seguidos de una recuperación de 20 horas durante 4 días.

En estas condiciones de aplicación de carga, el nivel de señal del ARNm de agrecano aumentó aproximadamente 4 veces respecto a los controles sin carga (Figura 10). El cambio del protocolo de carga acarreó un aumento de aproximadamente siete veces en la señal de ARNm de colágeno de tipo II respecto a los controles sin carga (Figura 11).

Los resultados de los estudios descritos anteriormente e ilustrados en las Figuras 8-11 demostraron que los condrocitos respondían a un protocolo de carga cambiado por un patrón que incluía la exposición a una presión hidrostática intermitente durante 4 horas seguida de un periodo de veinte horas de recuperación, y la señal de RT-PCR atribuible al ARNm de tipo II aumentó significativamente respecto a la señal que representaba el ARNm de \beta-actina. La señal de ARNm de agrecano también aumentó.

Estos datos muestran que la carga de IHP mecánica con un tipo apropiado de estímulo sirve para modular la expresión de macromoléculas de la matriz de los condrocitos articulares. Los resultados obtenidos confirman que la aplicación de regímenes de carga específicos facilita la reparación y la regeneración de cartílago articular y contribuye a la producción con éxito de compuestos de injertos de cartílago transplantables.

Los efectos documentados de la presión hidrostática sobre los condrocitos demuestran que los regímenes de carga específicos proporcionan un estímulo eficaz para modular la síntesis de macromoléculas de la matriz extracelular cartilaginosa y para iniciar reacciones relacionadas con la reparación y la regeneración de cartílago dañado y de colágeno de tipo II.

IV. Efectos de una Presión Hidrostática Intermitente sobre la Expresión de TGF-\beta1 y de MMP-2 en Células de tipo osteoblástico

La carga mecánica generada durante las actividades normales de soporte de peso contribuye a la estructura y función óseas a través de un ciclo específico que implica formación osteoblástica y resorción osteoblástica. El mantenimiento de la homeostasis ósea normal en respuesta a una historia de carga implica a varias hormonas, citocinas y factores de crecimiento.

Después de los descubrimientos descritos anteriormente, este estudio investigaba si la presión hidrostática intermitente (IHP) modula la expresión del factor de crecimiento pleiotrópico, concretamente, del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-\beta1) en células MG-63 y HOS TE85, y si funciona como una señal mecánica para la modulación del metabolismo de células óseas. Con este fin, se ensayó el efecto de IHP sobre la expresión osteoblástica de TGF-\beta1, que se sabe que influye en la proliferación de osteoblastos y en la expresión fenotípica de proteínas específicas del hueso. Además, se estudió la expresión de metaloproteinasa de la matriz MMP-2.

Los resultados se observan en las Figuras 12-14. Las Figuras 12-14 ilustran el efecto de IHP sobre la producción proteica de TGF-\beta o la expresión de MMP-2 en células de tipo osteoblástico MG-63.

La Figura 12 muestra el análisis del transcurso de tiempo para la liberación de TGF-\beta1 por células MG-63 expuestas a IHP de 10 MPa. La Figura 13 muestra los efectos en respuesta a la dosis de IHP sobre la liberación de TGF-\beta1 por células MG-63. La barra y la línea vertical de las Figuras 12 y 13 representan las medias \pm DT, respectivamente (n = 3), p < 0,05 en comparación con el control.

La concentración proteica de TGF-\beta1 en el medio condicionado de MG-63 se examinó por ELISA. Con células MG-63, no se observó ningún cambio significativo en la liberación de TGF-\beta1 después de una exposición de 12 horas a IHP, como se muestra en la Figura 12. Sin embargo, como también se observa en la Figura 12, la aplicación de IHP durante 24 y 48 horas disminuyó la liberación de TGF-\beta1 por las células MG-63 en un 65% (p < 0,05) y un 53% (p < 0,05), respectivamente, respecto a las células sin carga. Se observaron resultados similares para las células HOS TE85 (no se muestran los datos).

Una segunda serie de estudios que se observan en la Figura 13 investigaron el efecto en respuesta a la dosis de IHP sobre la expresión de TGF-\beta1 con células MG-63. Una exposición de 12 horas a IHP a un nivel de 1 y 10 MPa no alteró la liberación de TGF-\beta1. Después de una aplicación de 24 horas de IHP a 1 MPa o a 10 MPa, como se observa en la Figura 13, se inhibió la liberación de TGF-\beta1 al medio en un 23% y en un 31%, respectivamente, en comparación con las células sin carga.

La Figura 14 representa un análisis del transcurso de tiempo para la liberación de MMP-2 (pg/ml) por células MG-63 expuestas a IHP, cuantificada por ELISA.

La Figura 20 muestra la cuantificación de la liberación de MMP-2 al medio condicionado usando ELISA. Se observó un patrón similar en el análisis zimográfico (no se muestran los datos). Como se observa en la Figura 20, después de 24 y de 48 horas de exposición a IHP, la liberación de MMP-2 se inhibió significativamente, en un 46% y un 28%, respectivamente, respecto a los controles. La aplicación de IHP en las mismas condiciones también disminuyó la liberación de TIMP-1 al medio condicionado de las células de tipo osteoblástico. Después de 24 y de 48 horas de exposición a IHP, la liberación de TIMP-1 se inhibió significativamente en un 63% y en un 29%, respectivamente, respecto a las células sin carga. No se detectó MMP-1 ni MMP-9 en las muestras de medio de células expuestas a IHP o de células sin carga en cualquier periodo de tiempo (no se muestran los datos).

El análisis zimográfico ilustrado demostró que MMP-2 era la metaloproteinasa de la matriz más importante liberada por las MG-63. En presencia de IHP, la zimografía demostró una inhibición de la liberación de la forma latente de 72 kD de MMP-2 y de las dos formas activadas, de 68 kD y de 62 kD, en muestras de medio de células expuestas a IHP durante 24 y 48 horas, en comparación con muestras de células sin carga.

VI. Utilidad Terapéutica

El método terapéutico de la invención es útil en los campos de la cirugía ortopédica, la reumatología, y la medicina deportiva y de rehabilitación. El método de la invención permite la formación de novo y la regeneración de cartílago dañado o lesionado, en particular de cartílago articular. El método también permite la regeneración ex vivo de cartílago o de injertos de cartílago utilizables extirpados de la articulación dañada o lesionada, la regeneración de dicho cartílago o injerto hasta un grado en el que se restauran las propiedades tanto mecánicas como bioquímicas del cartílago hasta sus niveles normales y la reimplantación del injerto en la articulación una vez que se restaura la matriz de colágeno cartilaginosa. Además, el método permite el tratamiento in vitro de células cartilaginosas y óseas y de cultivos celulares para dar tejido funcional adecuado para transplante y la formación de novo y la producción de cartílago sano que funcione normalmente y otras células derivadas del mesénquima.

Ejemplo 1 Aislamiento de Condrocitos

Este ejemplo describe el procedimiento usado para el aislamiento de condrocitos.

Los condrocitos articulares de bovinos adultos se aislaron a partir de cartílago de grosor completo extirpado de las articulaciones radiocarpales recién obtenidas en un matadero local.

Las células de cartílago se liberaron de la matriz mediante incubación en 15 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía gentamicina (50 \mug/ml) y una mezcla de colagenasas bacterianas, de tipo II y de tipo IV, (Worthington, Freehold, NJ) a una concentración final de 0,6 mg/ml cada una en 15 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 de Ham (DMEM/F12, Gibco BRL, Grand Island, NY) que contenía 25 \mug/ml de gentamicina (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras de cartílago se incubaron durante un total de 18 horas a 37ºC en CO_{2} al 7,5% y humedad del 100% para asegurar una digestión completa. Los condrocitos liberados de la matriz se filtraron a través de un filtro de malla de nailon para aislar células individuales. Las células se recogieron posteriormente mediante centrifugación repetida a 600 x g, resuspendiéndose las células y recogiéndose en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (3 x 50 ml).

Se suspendió un sedimento celular final en el medio DMEM/F12 sin suero y se contaron las células en un hemocitómetro evaluando la viabilidad mediante exclusión de azul tripán. La viabilidad normal obtenida para los condrocitos en estas condiciones fue mayor del 95%.

Los condrocitos se sembraron después en placas de tejido de 60 mm y los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 7,5% en aire. Para la adhesión en condiciones sin suero, las placas individuales se pretrataron durante una noche con poli-D-lisina (Sigma, 0,1 mg/ml) y se lavaron dos veces con PBS sin calcio ni magnesio. Las células se sembraron en placas a una densidad de 1 x 10^{5} células/cm^{2}.

Ejemplo 2 Medio que Contiene Suero o Sin Suero

Este ejemplo describe una composición de medio que contiene suero o sin suero.

El medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene suero (DMEM) contenía suero fetal bovino dializado inactivado por calor a una concentración del 10% v/v. El medio sin suero consistía en una mezcla 1:1 de F12 de Ham/DMEM suplementado con selenio y liposomas. Los liposomas se prepararon disolviendo lecitina, colesterol, esfingomielina y acetato de vitamina E en 1 ml de cloroformo/metanol 2:1 (vol/vol) que se seca en N_{2}. Se añadió un ml de DMEM/F12 y después se sonicó la mezcla lipídica 3 veces durante intervalos de 3 minutos cada una, usando una micropunta con un coeficiente de utilización del 70%. Esta solución madre de liposomas se realizó a una concentración final de 1000 x, se conservó en N_{2} y se almacenó a 4ºC. En algunos experimentos, se añadió ascorbato al medio a una concentración de 50 \mug/ml.

Ejemplo 3 Aplicación de Carga Mecánica con Presiones Hidrostáticas Intermitentes

Este ejemplo describe el protocolo de carga y las condiciones para aplicar una presión hidrostática intermitente.

Se aplicó de manera cíclica una presión hidrostática a una dosis de carga de 10 MPa y a una frecuencia de 1 Hz. La presión hidrostática intermitente se aplicó retirando las células a periodos de 2, 4, 8, 12 y 24 horas, o mediante un protocolo de carga a intervalos retirando las células después de un periodo de 4 días durante los que se aplicó una presión hidrostática intermitente durante y limitada a 4 horas por día seguidas de 20 horas de recuperación. Esto se repitió diariamente durante 4 días o más. Cada punto temporal experimental se ensayó por triplicado y cada experimento se realizó para un mínimo de tres ensayos independientes.

La presión se generó con un recipiente de presión de acero inoxidable disponible en el mercado conectado con un instrumento de carga servohidráulica, que se observa en la Figura 1. El diseño facilitaba la evacuación completa del aire del sistema de tal modo que la aplicación de presión era simplemente hidrostática. Las placas de cultivo se cargaron en el interior de bolsas estériles selladas por calor que contenían cuarenta y cinco ml de medio de cultivo (DMEM/F12 1:1 con HEPES 30 mM ajustado a pH 7,4 para la estabilidad del pH en ausencia de dióxido de carbono).

El control de la temperatura se consiguió mediante la inmersión parcial del recipiente de carga hidrostática en un baño de agua circulante y mantenida a 37ºC. No se produjo ningún cambio medible en la temperatura durante periodos de carga de hasta 96 horas. Los cultivos de control se mantuvieron en condiciones idénticas en bolsas selladas por calor y se colocaron en un recipiente idéntico colocado en el mismo baño de agua de temperatura controlada que los cultivos cargados.

Ejemplo 4 Análisis de Niveles de Señal de ARNm de Agrecano y de Colágeno de Tipo II (RT-PCR)

Este ejemplo describe el procedimiento usado para el análisis de los niveles de señal de ARNm de agrecano y de colágeno de tipo II por RT-PCR.

Para permitir ensayar múltiples muestras para cada condición de carga, se usó un procedimiento experimental que usa RT-PCR semicuantitativa para analizar los niveles de señal de ARNm de agrecano y de colágeno de tipo II, como se describe en J. Orthop. Res., 15: 94. El ARN total de las células expuestas a una presión hidrostática intermitente y de las células sin carga se extrajo de las células mediante el método del isotiocianato de guanidina descrito en Biochemistry, 18: 5296 (1979) con un reactivo triple disponible en el mercado (Sigma, St. Louis, MO). Un rendimiento típico de ARN celular por placa de 60 mm era de 5 microgramos.

Todas las preparaciones de ARN se examinaron de manera rutinaria en geles de agarosa para determinar la integridad del ARN ribosómico. Las concentraciones de ARN total se determinaron por espectrofotometría y se ajustaron a 200 ng/ml para la trascripción inversa usando cebadores de hexámeros aleatorios. La muestra de ARNm se convirtió en ADNc de cadena sencilla usando transcriptasa inversa m-MLV (Gibco-BRL) en presencia de inhibidor de ARNasa (5-Prime, 3-Prime, Inc., Boulder, Co.) y en presencia de dNTP 500 \muM (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). La reacción se realizó a 37ºC durante 15 minutos, 42ºC durante 10 minutos, 47ºC durante 10 minutos y finalmente se aumentó a 99ºC para inactivar la transcriptasa inversa. La mezcla de reacción se diluyó 10 x y se usó para PCR.

Las secuencias diana en las muestras de ADNc transcritas inversamente se amplificaron por PCR, usando cebadores de oligonucleótidos específicos de secuencia diseñados para producir secuencias de aproximadamente 200 pb que abarcan diferentes exones dentro de los genes del agrecano (Anal. Biochem., 225: 356 (1995)) y del colágeno de tipo II (Arch. Biochem. Biophys., 314: 90 (1994)). Los conjuntos de cebadores para el agrecano y el colágeno de tipo II se basaron en los datos de secuencia publicados para estos genes.

Los análisis del tamaño del ADN y la secuenciación de ADN de los productos específicos determinaron la validez de los productos generados usando los conjuntos de cebadores.

La PCR se realizó con 1,0 \mul de ADNc en un tubo de reacción de 0,5 ml que contenía 1,5 \mul de mezcla madre de PCR; la reacción se inició a 65ºC para evitar hibridaciones inespecíficas. La mezcla madre de PCR contenía Tris HCl 125 mM, amoniaco 50 mM, cada uno de los cebadores cadena abajo y cadena arriba y ADN polimerasa Tf1 a 0,625 U/ml (Epicentre Technologies, Madison, WI). Se añadió ^{32}P-\alpha-dCTP a 3.000 Ci/mmol (Amersham NEN-Corp.) a la mezcla madre para obtener una concentración final de 0,1 mCi/ml para el radiomarcaje aleatorio de los productos amplificados. El volumen de reacción total al comienzo de la PCR era de 2,5 ml.

Para la comparación de la expresión relativa, se añadieron 0,5 ml de una solución de cebadores que contenía 900 nM de un conjunto de cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de la región 3' no traducida de la \beta-actina, Tris HCl 50 mM, sulfato de amonio 20 mM y cloruro magnésico 1,5 mM en el décimo ciclo y se amplificó en el mismo tubo de reacción. La señal de ARNm de \beta-actina sirvió como un control interno para controlar las variaciones entre tubos en las condiciones de amplificación y las diferencias en la concentración inicial o la carga del ADNc. El programa de termociclado incluía un ciclo de 95ºC durante 3 minutos para el calentamiento inicial, seguido de ciclos repetidos de 95ºC durante 1 minuto y 65ºC durante 1 minuto. La elongación final se realizó a 72ºC durante 5 minutos. El número total de ciclos empleados en este estudio fue de 30 ciclos para agrecano y colágeno de tipo II y de 26 ciclos para \beta-actina.

Los productos amplificados por PCR se separaron en geles de poliacrilamida al 5% y los geles se analizaron directamente usando el PhosphoImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA.). La expresión relativa del ARNm se expresó como niveles de señal específicos y como una proporción de la señal del agrecano y del tipo II respecto a la señal de \beta-actina.

Ejemplo 5 Métodos Estadísticos

Este ejemplo describe los detalles de los métodos estadísticos usados para la evaluación de los resultados obtenidos en los Ejemplos 3 y 4.

La significación de las diferencias entre muestras cargadas y sin carga se examinó usando el método lineal general de una corrección para ensayos de comparación múltiple ((SAS, Gary, NC).

La determinación de los niveles de señal de ARNm mediante técnicas de RT-PCR semicuantitativas proporcionó suficientes diferencias entre muestras tratadas y no tratadas de tal modo que se consiguió un nivel de potencia para determinar la significación a p < 0,05 con cinco ensayos independientes. En el caso de la cuantificación de ARNm, la hipótesis que se ensayaba era que se producía un cambio en la expresión génica de la matriz relativo a la expresión de \beta-actina. Se determinó que la expresión de \beta-actina no variaba en respuesta a una presión hidrostática intermitente. Esto permitió usar un ensayo t para muestras relacionadas para ensayar la significación de las diferentes muestras de cultivo.

Ejemplo 6 Cultivo Celular de Osteoblastos Humanos

Este ejemplo describe el procedimiento usado para preparar cultivos celulares de osteoblastos humanos.

Las células de tipo osteoblástico humanas, MG-63 y HOS TE85, se adquirieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia).

Las células se cultivaron en placas de 60 mm con medio esencial mínimo alfa (alfa-MEM) (Gibco, Gran Island, NY) que contenía suero fetal bovino al 10% (Gibco) y antibióticos y antimicóticos (Gibco; penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, anfotericina B 0,25 \mug/ml) a 37ºC en una atmósfera de aire que contenía CO_{2} al 5%.

Se incubaron cultivos confluentes durante 24 horas adicionales en ausencia de suero para establecer una detención del crecimiento. El medio de cultivo se retiró y cada placa de cultivo se colocó en una bolsa sellada por calor que contenía 40 ml de alfa-MEM sin suero suplementado con BSA al 0,1%, HEPES 15 mM, ácido ascórbico (50 \mug/ml) y Na-\beta-glicerolfosfato (10 mM). Las bolsas selladas por calor se sumergieron en un recipiente de alta presión relleno con agua y se aplicó IHP (1 ó 10 MPa a una frecuencia de 1 Hz).

Se mantuvieron cultivos de control a presión atmosférica. Tanto el recipiente de presión como los cultivos de control sin carga se mantuvieron a presión atmosférica. Tanto el recipiente de presión como los cultivos de control sin carga se mantuvieron en el baño de agua durante el periodo de ensayo para mantener la temperatura 37ºC. Las muestras de medio de cultivo se recogieron a los periodos de tiempo especificados en las leyendas de las Figuras 13-18 y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

Para estudiar la estabilidad del ARNm, se disolvió actinomicina D (2,5 mg/ml) en metanol y se aplicó a los cultivos a una concentración final de 5 \muM.

Los condrocitos humanos se obtuvieron de la misma forma pero se pretrataron con tripsina 0,1 mg/ml para eliminar proteasas e inhibidores de colágeno.

Ejemplo 7 Medición del Nivel Proteico de TGF-\beta en el Medio Condicionado

Este ejemplo describe un método usado para la medición del nivel proteico de TGF-\beta en el medio.

Se adquirieron parejas combinadas de anticuerpos contra TGF-\beta1 en R & D Systems (Minneapolis, MN). Se activó el TGF-\beta1 latente en el medio condicionado mediante HCl 1 N y las muestras de medio condicionado se neutralizaron mediante la adición de NaOH 1,2 M/tampón HEPES 0,5 M. La TGF-\beta1 total se midió usando ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Todas las muestras se analizaron por triplicado. Las densidades ópticas se determinaron en un lector de ELISA a 450 nM con corrección por señal de fondo a 595 nM.

Ejemplo 8 Análisis de Transferencia de Northern para TGF-\beta

Este ejemplo describe las condiciones usadas para el análisis de transferencia de Northern de TGF-\beta.

Se extrajo el ARN total de las células.

Para una análisis de transferencia de Northern, se desnaturalizaron 10 \mug de ARN total y se fraccionaron en un gel de agarosa al 1% con formaldehído 1,1 M y se tiñó con bromuro de etidio para determinar la integridad de las bandas 28S y 18S. Se realizó la transferencia a una membrana de nailon mediante métodos convencionales. Las membranas se hibridaron con sondas de ADNc marcadas con ^{32}P para TGF-\beta1 (ATCC) y GAPDH (ATCC).

Se analizó la radioactividad de cada sonda hibridada usando un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)

Ejemplo 9 Método para el Análisis Estadístico

Este ejemplo describe el método para el análisis estadístico de los estudios descritos en los Ejemplos 7 y 8.

La significación entre grupos tratados y de control se determinó usando ANOVA y ensayo t de Student para dos muestras no relacionadas (de dos colas) usando la aproximación de Bonferroni para comparaciones múltiples. Todos los valores se proporcionan como las medias \pm DT. Los resultados de transferencia de Northern se expresaron como una proporción de la señal de ARNm diana (TGF-\beta1) sobre la señal ARNm constitutiva (GAPDH): Las diferencias en las proporciones de ARNm observadas con y sin tratamiento de IHP se evaluaron usando el ensayo U de Mann-Whitney con una p < 0,05 que representa la significación.

Ejemplo 10 Zimografía

Este ejemplo describe las condiciones usadas para zimografía.

Las muestras de medio se activaron mediante incubación en acetato de 4-aminofenilmercurio 1,0 mM (APMA) durante una hora a 37ºC. Las muestras se mezclaron posteriormente con tampón de muestra y se corrieron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% impregnados con gelatina 1 mg/ml. Los geles se lavaron con agua y se empaparon durante una hora con Triton X-100 al 2,5% en agua. Después de una exposición de dieciséis horas a 37ºC en tampón de sustrato (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl_{2} 5 mM) los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250 en etanol al 30% y ácido acético al 10%, y después se destiñeron en agua para visualizar la actividad gelatinolítica.

Ejemplo 11 Medición de Péptidos de MMP y TIMP-1 en el Medio Condicionado

Este ejemplo describe un método usado para la determinación de la presencia de proteínas MMP-1, MMP-2, MMP-9 y TIMP-1 en el medio.

A la finalización de la aplicación de carga, se recogieron las muestras de medio de cada bolsa y se midió la concentración de proteínas MMP-1, MMP-2, MMP-9 y TIMP-1 usando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Oncogene, Cambridge, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 12 Análisis de Transferencia de Northern para MMP-2 y TIMP-1

Este ejemplo describe las condiciones para el análisis de transferencia de Northern para MMP-2 y TIMP-1.

Se extrajo el ARN total de las células mediante el mismo método que se describe en el Ejemplo 8. Para un análisis de transferencia de Northern, se desnaturalizaron 10 \mug de ARN total y se fraccionaron en un gel de agarosa al 1% con formaldehído 1,1 M y se tiñeron con bromuro de etidio para determinar la integridad de las bandas 28S y 18S. Se realizó la transferencia a una membrana de nailon mediante métodos convencionales.

Las membranas se hibridaron con sondas de ADNc marcadas con ^{32}P para MMP-2 y TIMP-1 (ATCC, Manassas, VA). Se analizó la radioactividad de cada sonda hibridada usando un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Ejemplo 13 Determinación de la Estabilidad del ARNm

Este ejemplo describe un método usado para la determinación de la estabilidad del ARNm.

La estabilidad del ARNm después de un periodo de ensayo de carga mecánica de 24 horas se determinó mediante la adición de actinomicina D a las células de acuerdo con el Ejemplo 6. Se añadió actinomicina D a cuatro mililitros de medio de cultivo sin suero. Las células se mantuvieron durante periodos de ensayo de 0, 1, 2 y 4 horas antes del aislamiento del ARN celular total. El análisis de los niveles de señal de ARNm se realizó como se describe en el Ejemplo 11 para la transferencia de Northern. Se determinó la estabilidad del ARNm en los cultivos de control como se describe con las células no expuestas a IHP.

Ejemplo 14 Análisis Estadístico

Este ejemplo describe un método para el análisis estadístico de los resultados obtenidos en los estudios descritos en los Ejemplos 10-12.

La significación entre grupos tratados y de control se determinó usando ANOVA y ensayo t de Student para dos muestras no relacionadas (de dos colas), usando la aproximación de Bonferroni para comparaciones múltiples. Todos los valores se proporcionan como las medias \pm DT.

Claims (14)

1. Un método ex vivo o in vitro para la restauración de la función del cartílago degenerado, dañado o lesionado, en el que dicho método comprende la etapa de:

(a) someter un cartílago degenerado, dañado o lesionado o un injerto de cartílago extirpado de una articulación, o condrocitos, ex vivo o in vitro, a una presión hidrostática aplicada de manera intermitente (IHP) de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 30 MPa durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas diarias;

(b) retirar la IHP durante un periodo de recuperación de aproximadamente 16 a 22 horas; y

(c) repetir las etapas (a) y (b) durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 días o de tantos como sea necesario.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la presión se aplica a una frecuencia de aproximadamente 0,1-10 Hz.

3. El método de acuerdo con la reivindicaciones 1 ó 2, en el que la presión es de entre aproximadamente 1 MPa y aproximadamente 10 MPa, la presión que se aplica de manera intermitente durante aproximadamente 4 horas y el periodo de recuperación es de aproximadamente 20 horas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la presión es de aproximadamente 5 MPa-10 MPa.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cartílago se somete a la IHP ex vivo y, después de la regeneración, se formula en un medicamento para devolverlo a una articulación tratada.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el método comprende además formular una matriz que comprende condrocitos regenerados en un medicamento para implantar en dicha articulación.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cartílago se regenera in vitro sometiendo los condrocitos a IHP.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el método es un método de novo y comprende someter una matriz con una suspensión de células mesenquimales o derivadas del mesénquima a dicha IHP.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la determinación de la funcionalidad o de la extensión de la lesión del cartílago o del colágeno después del tratamiento de IHP ex vivo o in vitro, mediante la determinación in vitro del nivel de expresión de ARNm de colágeno, ARNm de agrecano, TGF, MMP-1, MMP-2 o IL-6.

10. Uso de cartílago, colágeno, ligamentos, tendones, hueso, condrocitos o injerto de cartílago obtenido mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de un medicamento para la restauración de la función de una articulación degenerada, dañada o lesionada.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que la enfermedad es osteoartritis y/o osteoartrosis.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que la degeneración es una enfermedad articular degenerativa.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que la enfermedad es una deficiencia de colágeno.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el uso de la reivindicación 10, en el que la lesión articular es cartílago cargado o dañado.