JP2006514562A

JP2006514562A - 試験管内で生産された三次元組織を組織細胞及び／又は外因性因子と組合わせて用いた罹患組織、変性組織又は損傷組織の治療方法

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Publication number: JP2006514562A
Application number: JP2004548677A
Authority: JP
Inventors: アラゼフィックオリフェラヨジモフィック; イェアンネッテリベラ; ハンスペーターヴィースマン; ウルリッヒヨース; ノヴァコヴィックゴルダナヴンジャク
Original assignee: コンパニードンアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2006-05-11
Also published as: US20050074477A1; EP1481055A1; AU2003294621A1; DE10394045D2; DE10253066A1; CA2473776A1; WO2004042038A1

Abstract

本発明は、(a)ヒト又は動物の生物体から得られた細胞から生産され、静置浮遊培養として疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖細胞と遊走細胞が存在している外部領域を含んでいる細胞凝集体が得られるまで培養される前形成された三次元組織、(b)(i)体内血清が添加され、増殖刺激化合物が添加されない体内細胞から生産されたオートロガス組織細胞浮遊液、(ii)充填材又は支持材料及び/又は(iii)成長因子及び/又は(c)(a)からの組織に対する電磁場、機械的刺激及び/又は超音波の作用を含む、組織置換構造に関する。

Description

発明の詳細な説明

説明
本発明は、新規な組織置換構造、組織病変を改善する方法、及びメッセンジャー物質及び/又は構造成分の供給原として前形成された三次元組織の使用に関する。
硝子軟骨組織は、単一型の細胞、即ち、弾性細胞外マトリックス(ECM)を合成する軟骨細胞からなる。健康なECMは、主にコラーゲンとプロテオグリカン(PG)からできている。硝子軟骨において優勢であるコラーゲンは、高弾性繊維を形成するII型コラーゲンである。プロテオグリカンは、コラーゲン線維の架橋を与える。健康な軟骨においては、軟骨の一定の弾性に重要であるマトリックス成分が連続して変換される。
ECM代謝の重要な機能は、酵素とその阻害剤の機能である。軟骨に有効な酵素は、コラーゲンとプロテオグリカンの分解を触媒する金属プロテイナーゼ(MMP)である。これらの酵素の活性は、軟骨において同様に合成される阻害剤(金属プロテイナーゼの組織阻害剤: TIMP)によって調節される。MMPとTIMP間の平衡は、軟骨マトリックスを維持するのに極めて重要である。
サイトカインと成長因子は、軟骨マトリックス構造成分の合成と酵素とその阻害剤の分解に影響する。健康な軟骨においては、マトリックス成分の分解と新規合成との間、即ち、サイトカインの発現と成長因子の発現との間で平衡し、その平衡は軟骨の弾性を維持するのに極めて重要であり、“消費した”構造成分の連続する再生を行なわせる。関節における成長因子の存在増加は、軟骨の生体内再生能を支持することができる。
軟骨において既知の最も重要な同化成長因子は、形質転換増殖因子β(TGFβ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子2(FGF2; 以前には塩基性(b)FGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)である。TGFβ、IGF I、BMP-2は軟骨の成熟を促進させるのに最も重要な因子とみなされている。
PDGFもIGFもヒト軟骨細胞の増殖を刺激するものである。IGF Iは成人組織において優位の成長因子であり、軟骨分解サイトカインIL-1βによる刺激時にさえPG合成を促進するとともに軟骨マトリックスの分解を阻止する。

TGFβ₁は、軟骨代謝において同化作用を有し、TIMPの発現、PGとコラーゲンの合成を刺激し、軟骨細胞の増殖を促進させる。更に、TGFβ₁はPDGFやIGFの軟骨再生作用を増強する。
FGF 2は、培養した軟骨細胞の増殖を刺激し、TGFβと組合わせて相乗作用を有する。FGFによるマトリックス合成の刺激も検出し得る。
BMPは、軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を刺激し、前駆細胞(例えば、骨膜又は骨髄由来)の成熟軟骨細胞への分化を支持する。全体として、軟骨細胞の分化を進め、よって軟骨治癒を支持する。
Brittberg & Petersonにより開発された古典的ACT法の作用機序は、生体内で硝子質又は硝子様再生体を形成する単層において増殖したオートロガス軟骨細胞の能力に基づき、周囲の硝子質関節軟骨と似ているので、軟骨病変の機能再生を示している。
患者の治療の場合、単層培養内で小さな生検から得られた少数の軟骨細胞を増殖することが必要である。この過程で、軟骨細胞は典型的な形の間葉組織細胞を呈し、その場状態と比べて発現パターンが変化する。実際に、単層内増殖と続いての3D培養内移入後に硝子軟骨のマーカーを再発現させるための軟骨細胞の能力は、多くの研究において試験管内で確立されている。特に開発された細胞培養系を用いて、純粋なオートロガス方式で-骨膜又は成長因子を添加せずに-単層内で増殖した軟骨細胞が担体を含まない3D培養内移入後に軟骨マーカーとしてコラーゲンIIとS-100を再発現することも証明されている。種々の細胞培養系においては、成長因子を注入すると特定の軟骨マーカーの合成が促進し増強し、動物モデルにおける軟骨欠損の治癒が加速する。それ故、ACTが行なわれた後に同様の機序が生体内で生じると考えられることは合理的なことである。骨膜又はコラーゲン材料によって生じた関節における三次元空間に適用した後、軟骨細胞は前者の生体内発現パターンを示し、II型コラーゲンの発現が顕著な硝子軟骨を再生させる。これは、ACTが行なわれた後に患者から採取された生検によって確認された。試験管内ですでに証明されているように、TGFβ、IGF I又はBMP-2のような成長因子は培養した骨膜によって分泌されるので、ACTの過程で注入された軟骨細胞によって硝子軟骨の再生が促進される。
更に、様々な種由来関節軟骨についての試験管内実験は、細胞浮遊液中で軟骨表面に適用された軟骨細胞が未変性組織と安定に結合し、結果としてACT後に形成された新しい軟骨が周囲の未変性軟骨に安定且つ長期間組込まれる。

関節の正常な使用においては、コーティングした硝子質関節軟骨は非常に大きな圧力負荷にさらされ、その構造の損傷又は傷害は系の機能性全体に非常に影響する。
関節軟骨の自然再生能力は非常に低い。健康な成人の軟骨においては、軟骨細胞は普通は分裂しない(Mankin 64)。軟骨下骨板が損傷した関節軟骨欠損だけが髄腔から注入する幹細胞の結果として幾分修復能を有する。対照的に、無傷軟骨下骨板による表在性軟骨欠損はほとんど自己再生能がない。
軟骨が一旦損傷すると、軟骨分解影響が刺激するために変性が絶えず拡大する。それ故、軟骨傷害は罹患した患者の関節症の危険増加を示し、多くの場合、最後には関節人工骨頭の使用を必要とする。
上述したように、組織の機能を回復させる又は損傷、変性又は罹患している又は損傷、変性又は罹患した組織を補強する解決法は再生医学の分野において非常に長い間探究されてきた。一方では、支持材料をもつ又はもたない内因性細胞、もう一方では、支持材料だけがこのために用いられてきた。症状によっては、吸収性又は非吸収性材料を使用し得る。
それ故、本発明の目的は、組織置換構造又は試験管内組織、特に軟骨置換構造又は軟骨再生構造、及び組織欠損、例えば、罹患、損傷又は変性軟骨組織の組織欠損の容易で安全で効率がよく且つ効果的な治療を可能にする罹患、損傷又は変性組織を治療又は改善する方法を提供することである。
本発明は、
(a)ヒト又は動物の生物体から細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産することができる前形成された三次元組織と;
(b)(i)内在性血清が添加され、成長促進化合物が添加されない内在性細胞から生産することができるオートロガス細胞浮遊液、(ii) 充填材又は支持材料及び/又は(iii)成長因子とを含み; 及び/又は
(c)(a)を電磁場、機械的刺激及び/又は超音波にさらすことにより得ることができる
組織置換構造を供給することにより上記の技術的問題を解決する。

従って、本発明は、組織が球状体と呼ばれることもある、組織治療をより効果的にするために用いられる種々のサイズの三次元組織、即ち、試験管内組織に関する。本質的に、前記組織置換構造又は組織再生構造、又は球状体は、球状体内に含有する細胞とこれらの細胞によって形成されたマトリックスから構成され、単一浮遊細胞と、遺伝的に修飾された単一浮遊細胞と、支持材料と、外因性成長因子、活性物質、外因性DNA、RNAと、及び/又は充填材と組合わせて存在する。そのような球状体は、罹患、変性及び/又は損傷した組織を治療する場合の生物学的及び化学的活性物質や物理的要因の試験管内試験系として、器官置換として、又は組織置換構造として用いることができる。本発明の組織置換構造は、例えば、心筋梗塞後の心筋を補強するのに、例えば、球状体が特定の活性物質と組合わせて用いられる場合に、組織再生を誘導し加速するために又は第一に組織再生を可能にするために用いられる。
従来技術は支持材料を含む又は含まない内在性細胞を用いるか又は吸収性又は非吸収性支持材料のみを用いるが、本発明の構造は、器官や組織の機能をつくるために試験管内で生産された構造的に且つ機能的に予め製造された三次元組織の使用と移植を意味している。即ち、周知の方法と構造の単個細胞は用いられていない。それ故、本発明の組織置換構造又は球状体は、たいていの様々な組織球状体と、単個細胞と外因性因子とを組合わせることにより予め製造された組織の移植と更に有効性の増加を可能にする。従って、従来技術と異なり、例えば、成長因子は、細胞と組合わせても組合わせなくてもに無関係に支持体又は支持材料によってもはや遊離しない。驚くべきことに、新しい組織置換構造又は球状体は組織再生を促進する他の因子と組合わせるのに使用し得ることが証明された。特に本発明の軟骨球状体と軟骨細胞を用いた場合に、改善された生成が達成された。そのような驚くべき改善された生成は、他の球状体と成長促進因子又は細胞とを組合わせた場合にも観察された。

多くの疾患においては、組織置換構造又は球状体は分離した方式で罹患組織領域に挿入することができない。移植後の状況のために、特定の場所に保たれず、結果として十分に特定された組織再生の誘導ができないからである。有利には、球状体はそれぞれの場所に固定し得る。このことは、それ自体が欠損領域又はその周囲に結合又は固定化する支持体又は膜と組合わせることにより有利に行なわれる。骨細胞由来のいわゆる細胞球のような人工三次元組織構造は、骨欠損においてその単独挿入を可能にする高機械的強度がまったくない。本発明の組織置換構造又は球状体は三次元支持体と組合わせて導入される。驚くべきことに、球状体が特に良好な相互作用、密着及び支持材料との組込みを示すことが証明された。有利には、このことにより欠損領域において球状体の良好な固定が可能になる。驚くべきことに、球状体の接着は、単個細胞の存在、治療すべき未変性組織と球状体との間に接触架橋を形成する単個細胞又は組織置換構造によって促進される。特に、このことは、未変性軟骨組織上やその組織内での軟骨凝集体と軟骨細胞の使用において証明された。本発明によれば、単個細胞又は内在性細胞は、例えば、組織再生過程を促進させるために、遺伝子工学によって修飾し得る。特に球状体が遺伝子工学によるトランスフェクションを許さない場合には、欠損領域に遺伝子操作した細胞を投与することにより組織再生を促進させる作用が達成され得る。
好ましくは、本発明の組織置換構造を用いることにより行なわれる再生過程は、例えば、遺伝子工学による修飾が望ましくない場合に、球状体と成長因子又は他の因子の組合わせを用いて治療すべき組織への球状体の移植に続いて使うことができる。例えば、DNA分子又はRNA分子が、例えば、細胞により非特異的に取込まれた後、対応する配列の合成が起こり得る因子として用いることができる。
本発明の構造の他の利点は、薬剤の試験系として使用し得ることである。特に、このことは、球状体が罹患細胞、例えば、関節炎の軟骨細胞、又は腫瘍細胞、又は筋ジストロフィの場合の筋細胞から得られ、それらの細胞が活性物質や薬剤を調べるために用いられる場合にあてはまる。迅速な効果と生体内と試験管内双方での使用のほかに、本発明の組織置換構造の他の利点はヒト又は動物であり得る患者が純粋なオートロガス方式で治療し得るので、取込まれた移植片に対する防御反応の危険を排除するという事実によって示される。特に、入院やリハビリテーションの期間がこのように著しく短縮される。また、再生過程全体のコストも減少し、治療した患者の急速なリハビリテーションが達成される。更に、本発明の構造は活性物質のスクリーニング又は一般的には生体内又は試験管内試験系として、例えば、薬剤について組織再生に対する影響を試験するのに使用し得る。

好ましくは、そのような組織内の細胞として次の細胞: 筋細胞(横紋心筋、骨格筋、平滑筋)、軟骨細胞(硝子軟骨、線維状軟骨、弾性軟骨)、骨細胞(骨芽細胞や骨細胞)、皮膚細胞(角化細胞、例えば、棘状細胞)、真皮や皮下組織由来の結合組織細胞、エクリンやアポクリンの汗腺や皮脂腺、毛髪原基由来の細胞(例えば、有糸分裂活性毛球細胞、爪原基由来の細胞)、内皮細胞、結合組織細胞(線維芽細胞、線維細胞、遊走細胞、マスト細胞、色素細胞、網状細胞)、脂肪細胞(成人の脂肪細胞や脂肪前駆細胞)、神経組織細胞(神経細胞、神経膠細胞)、骨髄/末梢血管由来の間葉幹細胞、肝細胞、単層や多層上皮や表面の上皮、ガンゲス(gangetic)上皮、小腺上皮、感覚上皮、上内皮(表在層、中間層、基底層、皮膚角質層、顆粒層、棘状層由来の細胞)由来の上皮細胞及び/又は膵細胞が使用し得る。
好ましくは、組織と組合わせられる細胞として次の細胞: 筋細胞(横紋心筋、骨格筋、平滑筋)、軟骨細胞(硝子様軟骨、線維状軟骨、弾性軟骨)、骨細胞(骨芽細胞や骨細胞)、皮膚細胞(角化細胞)、内皮細胞、結合組織細胞(腱や靭帯)、脂肪細胞(成人の脂肪細胞や脂肪前駆細胞)、神経組織細胞(神経細胞、神経膠細胞)、幹細胞(骨髄/末梢血管由来、成人の組織自体、例えば、膵、角膜由来、胚や胎児由来)、肝細胞、単層や多層の上皮や表面の上皮、ガンゲス上皮、小腺上皮、感覚上皮、上内皮(表在層、中間層、基底層、皮膚角質層、顆粒層、棘状層由来の細胞)由来の上皮細胞及び/又は膵細胞が使用し得る。組織内細胞、即ち、前形成された三次元組織と、組織細胞浮遊液からの単個細胞は遺伝子工学により修飾することができる。遺伝子修飾は、特に、成長因子、サイトカイン、構造タンパク質、マーカータンパク質、又は調節活性物質が発現されるようにすることができる。
有利には、本発明の構造は、充填材又は支持材料、例えば:
- 外因性因子(例えば、成長因子)自体をもつことができる生体適合性材料、分解性材料又は非分解性(吸収性)材料、同種材料、オートロガス材料、異種材料、合成材料;
- ポリマー(例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ヒアルロン酸、そのすべての誘導体)、
- 好ましくは中性PGA/PLA混合物、
- 炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、動物前処理天然骨マトリックス、
- 線維タンパク質、フィブリン系支持体、
- ゲル(例えば、アルギン酸塩、アガロース、コラーゲンゲル、ヒドロゲル、フィブリン)、
- メンブラン、羊毛、足場(3D支持体)、及び/又は
- 人工装着物(チタン材料、各種金属材料、貴金属材料)
と組合わせることができる。

更に、本発明の構造と、組織細胞浮遊液又は前形成された三次元組織を外因性成長因子と組合わせることも可能であり、具体的な各部位で組織補強や再構成の過程、その管理又は調節を行なうそれぞれの組織特異的成長因子が使用し得る。軟骨の場合には、例えば、次の因子: 形質転換成長因子β(TGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子2(FGF2、以前には塩基性(b)FGF)、インスリン様成長因子(IGF)、及び骨形態形成タンパク質(BMP); 例えば、骨の場合にはBMP7、又は筋の場合にはMGFの1種である。
外因性成長因子のほかに、他の外因性因子、例えば、サイトカイン又は酵素のような調節作用を有するすべての物質、更に、RNA分子やDNA分子、又はウイルス、又はサイトカイン(IL-1、TNF-α)、接着タンパク質、酵素(リパーゼ、プロテイナーゼ)、メッセンジャー物質(cAMP)、マトリックス構造タンパク質(コラーゲン、プロテオグリカン)、一般タンパク質、脂質(ホスファチジルセリン)のような体細胞によって通常生産又は分泌されるタンパク質も用いることができることは明らかである。
好適実施態様においては、本発明は、
(a) ヒト又は動物の生物体由来の軟骨細胞、骨細胞、又は間葉細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれた少なくとも40体積％の細胞外マトリックスを含み、且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産し得る前形成された三次元軟骨組織と;
(b) 内在性血清が添加され、成長促進化合物を用いずに内在性細胞から生産されたオートロガス細胞浮遊液とを含み、及び/又は(a)の組織を物理的因子にさらした、
軟骨置換構造を提供する。
本発明によれば、患者由来組織生検又は試料、又は間葉幹細胞、例えば、末梢血又は骨髄由来、を前形成される組織、即ち、組織置換構造の成分の出発材料として用いられる。組織補強細胞は、従来方法の生検から組織の酵素消化、遊走、又は標的細胞を認識する試薬を用いて分離される。本発明によれば、これらの細胞は、次に、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で慣用の培養液を用いた簡単な方式で浮遊液中の静置培養に、分化細胞が埋め込まれた少なくとも40体積％、好ましくは少なくとも60体積％、最高95体積％の細胞外マトリックス(ECM)を含む三次元細胞凝集体が形成されるまで供される。形成された細胞凝集体は外部領域を有し、増殖と遊走ができる細胞が存在している。

本発明に従って生産された球状体に組込まれた細胞がすべて生存していること、及び進行した培養時間後さえ内部の細胞が壊死しないことは注目すべきことである。培養時間が増加するにつれて、凝集体内部の細胞は分化を受けてECM、分化細胞及び末梢増殖ゾーンからなる球状体を形成する。細胞が埋め込まれた組織特異的マトリックスの形成過程は、体内での組織形成又は新生や再組織化の過程と非常に似ている。細胞培養での分化で、組織特異的マトリックスが形成するために凝集した細胞の間に間隔が増える。組織の組織学が球状体内部で発達し、それは天然組織と非常に似ている。天然軟骨のように、球状体内部の細胞は栄養素と拡散によってのみ供給される。球状体生産の過程で、更に増殖と遊走ができる細胞のゾーンが球状体の境界に形成される。このゾーンは、欠損に球状体が取り込まれた後、この末梢ゾーンに位置する細胞が周囲組織と活発に接触するように及び/又はその環境において試験管内で生産される組織の取込みを可能にするように遊走できるという点で計り知れないほど有利である。従って、生産された組織特異的細胞凝集体は組織欠損の治療や組織の試験管内及び生体内新生に用いるのにうまく適している。
治療すべき組織欠損のサイズによっては、欠損がより急速に充満を達成するように早い段階で大きな組織片を移植することが有利なことがある。この場合、得られた少なくとも2つの又は好ましくそれ以上の細胞凝集体を上記と同じ条件下で同じ培養容器内で所望のサイズが達成されるまで培養を続けることにより融合させる。
得られた軟骨又は骨組織は、特別に安定である。細胞凝集体は、例えば、針によって体内に注入された場合、破壊又は分解せずに直径の3/4まで圧縮し得る。組織片は、ピンサーズ又はピペットを用いて細胞培養容器から取り出すことができる。
本発明の有利な実施態様においては、患者から得られた細胞を、まず本発明の浮遊培養するのに用いうる十分な軟骨又は骨細胞を有するように単層培養内でそれ自体既知の方法で増殖する。単層培養内の細胞の継代はできるだけ少なく保たれる。集密的段階に達した後、単層内で増殖した細胞を取り出し、上記の本発明の方法に従って浮遊液中で培養する。
浮遊液と単層の培養双方に通常の培地、例えば、ダルベッコのMEMを細胞培養液として血清を添加して使用し得る。DMEMとHAMSを1:1の割合で用いることが好ましい。しかしながら、試験管内で生産した組織に対して患者の免疫学的応答を避けるために、血清として患者からの自己血清を用いることが好ましい。異種又は同種血清を用いることも可能である。

本発明によれば、培養液に抗生物質、静真菌剤又は他の補助物質は添加されない。細胞や細胞凝集体の自己、異種又は同種培養と抗生物質や静真菌剤を含まない培養のみが単層培養内の細胞の罹患されていない形態と分化及び細胞凝集体内の個々のマトリックスのかき混ぜられていない形成を可能にすることがわかった。更に、生産の間いかなる添加剤も避けることにより、ヒト又は動物の生物体において試験管内で生産される組織を取込むときのあらゆる免疫学的反応が排除される。
極めて驚くべきことに、実際に、成長因子又は他の増殖刺激添加剤が浮遊培養にも単層培養にも必要とされない。そのような添加剤が存在しないにもかかわらず、本発明の浮遊培養のわずか2日後に組織特異的性質を有する三次元細胞凝集体が得られる。サイズが培養液の容量に対する導入細胞の数に左右されることは明らかである。例えば、300μlの培養液中に1×10⁷細胞を取込む場合、直径約500〜700μmの三次元球状体が1週間以内に形成される。1cm²の組織欠損の場合、約100のそのような球状体を、例えば、注入により移植することが必要である。他の方法は、上記のようにより大きなものを形成する小細胞凝集体の試験管内融合や欠損におけるより大きな凝集体の取込みである。本発明によれば、小細胞凝集体を生産するために300μlの培養液中、好ましくは1×10⁴〜1×10⁷細胞、更に好ましくは1×10⁵細胞が用いられる。細胞型と患者特異的特徴によっては、数日後に形成された球状体を次に適切な培養液中で少なくとも2〜4週間培養して組織特異的マトリックスの形成を誘導する。培養の約1週間から、組織パッチのサイズを大きくする特別な場合には個々の球状体を融合することが可能である。
培養容器として、浮遊液における本発明の培養には、疎水性、即ち、接着防止面を有するもの、例えば、ポリスチレン又はテフロン（登録商標）の使用が必要である。表面が非疎水性の細胞培養容器は、寒天又はアガロースでコーティングすることにより疎水性にすることができる。添加剤を更に必要としない。好ましくは、細胞培養容器としてウェルプレートが用いられる。例えば、小細胞凝集体を生産するために96ウェルプレート、前記融合凝集体を生産するために24ウェルを使用し得る。

本発明によれば、細胞培養容器は底が細く、好ましくはくぼんでいなければならない。本発明の組織は平らな底の容器では形成されないことがわかった。くぼみが細胞を見出すのに有効であることは明らかである。組織細胞浮遊液、好ましくは軟骨細胞浮遊液と組合わせたこのようにして得られた前形成された三次元組織は組織置換構造、好ましくは軟骨置換構造を形成している。しかしながら、支持材料又は成長因子と組合わせた前形成された三次元組織を用いることも好ましい。更に、前形成された組織は、電磁場、機械的刺激及び/又は超音波のような物理力にさらされることが好ましい。これらの物理力は、置換構造の試験管内、例えば、培養容器内、又は生体内、即ち、患者における生産中に前形成された組織に作用し得る。
好適方法においては、組織置換構造は筋置換構造、特に心臓平滑筋置換構造、又は骨置換構造である。
本発明は、また、組織病変を改善する方法であって、
(a)内在性血清が添加され、成長促進化合物が添加されない、内在性細胞から生産されたオートロガス細胞浮遊液と、
(b)ヒト又は動物の生物体から細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ、且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産することができる前形成された三次元組織と
が該組織病変内に取込まれ、及び/又は
(c)(a)の組織が電磁場、機械的刺激及び/又は超音波に生体内又は試験管内でさらされる、前記方法に関する。
本発明の他の好適実施態様においては、本発明は、軟骨病変を改善する方法であって、
(a)内在性血清が添加され、成長促進化合物が添加されない、内在性細胞から生産されたオートロガス軟骨浮遊液と、
(b)ヒト又は動物の生物体由来の軟骨細胞、骨細胞、又は間葉幹細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、少なくとも40体積％の細胞外マトリックスを含み、分化細胞が埋め込まれ、且つ増殖と遊走ができる細胞が存在する外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産し得る前形成された三次元軟骨組織と
が該組織病変内に取込まれ、及び/又は(a)の組織が物理的因子に試験管内又は生体内でさらされる、前記方法に関する。

好ましくは、組織病変は骨、軟骨及び/又は筋の病変である。
本発明の方法は、特に古典的な治療法と比べて、欠損の治療を加速するために、軟骨再生を支持する成長因子の自然作用を使うものである。前記三次元組織、特に軟骨組織を用いると、治療された欠損において直接完全な天然オートロガス成長因子の発現を達成することが可能であるので、機能的再生体の形成を加速させる。
従って、組織病変、特に軟骨病変を改善するための治療の過程で、オートロガス軟骨細胞浮遊液のほかに前形成された三次元軟骨組織が適用され、前記三次元軟骨組織がマトリックス合成の刺激に必要とされる成長因子を合成し、よって治療された組織病変、例えば、軟骨病変の治癒又は改善が支持される。3D構築物と呼ばれることもある三次元軟骨組織と共に取込まれる軟骨浮遊液の細胞は、特に周囲の軟骨において形成される再生体の最適な組込みを行なわせる。三次元組織によって合成された成長因子は、浮遊細胞のマトリックス形成の刺激増加を生じるので、例えば、欠損の治癒を加速させる。
本発明の方法は、三次元軟骨組織が試験管内でさえ完全なオートロガス条件下で患者自体に由来しない物質を添加せずに前形成され、その組織が未変性軟骨に対する性質が非常に似ていることにより、手術直後に更に軟骨物質の補強の基礎となることから特に有利である。
他の利点は、周知の方法における作用機序に必須の骨膜によって分泌される成長因子が本発明の方法において前形成された三次元軟骨組織によって供給されることから、よく知られた方法の骨膜組織片の複雑な適用をこのように避けることができるということである。本発明によれば、前形成された三次元軟骨組織が硝子軟骨マトリックスを試験管内でさえ形成できることが証明された。コラーゲンII、特に硝子質関節軟骨の固有のタンパク質であるコラーゲンIIは前形成された三次元軟骨組織によって多量に形成され、特に、移植時に活発な方式で成長因子が既に生産されている。

本発明の特別な実施態様においては、軟骨細胞浮遊液と軟骨組織の取込みに続いて病変が膜で被覆される。
本発明は、また、メッセンジャー物質、構造成分、足場成分及び/又はマトリックス成分の供給源としての、ヒト又は動物の生物体から得られ、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊液培養として静置方式で、特に、少なくとも40体積％の細胞外マトリックスを含み、分化細胞が埋め込まれ、且つ細胞が増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養される軟骨細胞、筋細胞、骨細胞、又は間葉幹細胞の使用に関する。
再生促進成長因子と既に前形成された硝子軟骨マトリックスの供給源として得られた軟骨細胞を用いることにより、いままでに既知の方法で可能であるよりも軟骨欠損の著しく急速な治癒を達成することが可能である。急速な作用のほかに、生体内又は試験管内使用によって与えられる本質的な一利点は、患者が純粋なオートロガス方法で治療し得るので、取込まれた移植片に対する防御反応の危険が取り除かれるという事実によって示される。
本発明の他の好適実施態様においては、使用は生体内又は試験管内である。
他の特に好適実施態様においては、使用は組織病変、好ましくは軟骨、骨及び/又は筋の病変の治療にある。
本発明の意味では、病変は細胞又は組織構造のあらゆる疾患、変性又は損傷を含むと理解される。従って、本発明の構造は次の疾患、変性又は損傷:
- 心筋病変、
- 関節症(例えば、軟骨表面に球状体を適用し、膜で被覆する)、
- リウマチ、関節炎、
- 遺伝的欠陥又は変化に基づく疾患、
- 梗塞(生存中の組織壊死、例えば、脾梗塞)、
- 虚血(例えば、動脈閉塞症による)、
- 神経系や筋神経系の器官/組織の奇形、病変、変性、
- 眼における組織の疾患や変性(例えば、角膜、結膜)、例えば、網膜剥離、
- 神経内分泌系の疾患や変性(例えば、甲状腺の機能低下症)、
- 心臓血管系(例えば、心臓の奇形、心筋梗塞)、
- 気道の病変、
- 消化管(食道炎、例えば、胃炎後の胃粘膜の形成)、
- 骨: 治癒していない骨折、腫瘍後の骨形成、
- 関節: 半月板疾患や病変、椎間板変性、腱、靭帯、
- 皮膚病変(例えば、乏毛症)
の治療に使用し得ることが好ましい。

本発明の使用の開示から、他の均等な使用が当業者に明らかである。本発明の組織置換構造、即ち、前形成された三次元組織と、それぞれの添加剤、即ち、組織細胞浮遊液、充填材又は支持材料又は成長因子とを含む組合わせ調製物は、細胞が分離され得るいかなる組織にも用いることができ、別個に又は前記前形成された三次元組織の生産において用いることができる。電磁場、機械的刺激及び/又は超音波のような物理力も本発明の意味では前形成された三次元組織の添加剤として使用し得ることは当然のことである。この場合、前形成された三次元組織は、病変又は欠損の治癒が行なわれるように前記物理力に試験管内又は生体内でさらされる。
更に、本発明の組織置換構造は、器官置換として、例えば、上記組織の1つ以上の器官機能を回復させるのに使用し得る。他の好ましい器官又は組織は、パーキンソン病又は神経変性疾患の治療におけるドーパミン産生構造や組織、膵欠損症の治療におけるインスリン産生構造、甲状腺欠損症の治療におけるチロキシン産生組織、視床下部機能を回復させるためのリベリン-又はスタチン-産生置換構造である。
本発明は、また、構造がヒト又は動物の生物体由来の細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれかつ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより構造が生産される、筋細胞、結合細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、神経細胞、肝組織、内皮細胞、上皮細胞及び/又は幹細胞の群より選ばれた組織置換構造に関する。
本発明は、また、本発明の構造を含むキット、及び診断や治療におけるその使用に関する。更に、キットには、緩衝液、血清、塩、培養液、及び内容物をどのように組合わせるかの情報が含まれてもよい。
従って、本発明は、内在性三次元培養軟骨のみをいわゆる形状体の形で用いる組織病変、例えば、軟骨病変の改善又は治療方法に関する。例えば、関節炎の変性軟骨の回復がこのように可能である。この球状体技術又は球状体を用いて、更に広範な製品を革新するための基本骨格技術が提供され、外傷性関節軟骨病変の内在性細胞再生を可能にする。球状体によって生産された内在性成長因子の使用により、結果として圧力抵抗性関節軟骨がかなり急速に形成される。特に、このことは、軟骨の十分に特定された一特異的増殖によって達成され、よって最小の侵襲性関節鏡オートロガス軟骨細胞移植治療を可能にする。更に特に、入院やリハビリテーション期間が著しく短縮される。また、コストが低下し、治療した患者の急速なリハビリテーションが達成される。球状体技術が軟骨に限定されず、むしろあらゆる種類のヒト組織の再生に使用し得る。
下記実施例によって本発明を限定せずに更に詳細に説明する。

組合わせ調製物(組織置換構造)の第一成分(軟骨)の調製
健康な硝子軟骨の領域から患者の生検を用いる。コラーゲナーゼ溶液とインキュベートすることによる酵素消化を用いてこの生検から軟骨細胞を単離する。単離した細胞を消化されない軟骨組織から分離した後、細胞を細胞培養フラスコに移し、DMEM/HAMS F12培養液(1/1)と患者からの10％オートロガス血清を添加した後、37℃、5％CO₂でインキュベートする。培養液を1週間に2回交換する。集密的段階に達した後、細胞層を生理的食塩水で洗浄し、トリプシンを用いて細胞培養表面から取り出す。もう1回洗浄した後、そのつど1×10⁵細胞をアガロースで被覆した細胞培養容器に移す。1日後、第一細胞は凝集体の中に配列している。これらの凝集体を2日毎に新しい培養液と共に供給し、少なくとも2週間培養する。
わずか1週間後、II型コラーゲンとプロテオグリカンが凝集体に検出された。これのために、II型コラーゲンに特異的な抗体を用いたII型コラーゲンに結合した一次抗体を二次抗体を用いて検出し、これにABC系を結合した。即ち、二次抗体はアビジン-ビオチンによって酵素のアルカリホスファターゼを結合し、その酵素は基質フクシンと反応して赤色色素を生じる。
ゴールドナー染色によってプロテオグリカンを検出した。II型コラーゲンとプロテオグリカンは生体内軟骨マトリックスの成分であり、軟骨機能に極めて重要な有意性を有する最も重要な構造タンパク質である。
同時に、軟骨細胞に特異的なタンパク質S 100は凝集体の外層に検出された。S 100は骨組織でも結合組織でも発現されない。形成することもできる後者のこれらの組織のみである。結果として、生じた組織は軟骨組織であることが明らかになった。
1〜2週間培養した後、細胞はなお一緒に接近している。培養時間が増えるにつれて、細胞外マトリックスの割合が増大し、細胞の割合が低下する。1週間後、少なくとも40％のECMが検出することができ、3週間後、約60％のECMが既に生じた。軟骨組織培養の3ヶ月後、ECMの割合は80〜90％に増大した。即ち、軟骨様組織は生産した凝集体の内部につくられてきたが、その構造の組織は生体内軟骨に対応し、軟骨組織の機能を呈することができる。

他の第一成分(骨組織)の調製
海綿状領域から患者の骨生検を用いる。コラゲナーゼ溶液とインキュベートすることによる酵素消化を用いてこの生検から骨芽細胞を単離した。単離した細胞を消化されない骨組織から分離した後、細胞を細胞培養フラスコに移し、DMEM/HAMS F12培養液(1/1)と患者からの10％オートロガス血清を添加した後、37℃、5％CO₂でインキュベートする。培養液を1週間に2回交換する。集密的段階に達した後、細胞層を生理的食塩水で洗浄し、トリプシンを用いて細胞培養表面から取り出す。もう1回洗浄した後、そのつど1×10⁵細胞をアガロースで被覆した細胞培養容器に移す。1日後、第一細胞は凝集体の中に配列している。これらの凝集体を2日毎に新しい培養液と共に供給し、少なくとも2週間培養する。
わずか1週間後、I型コラーゲンとプロテオグリカンが凝集体に検出された。これのために、I型コラーゲンに特異的な抗体を用いた。コラーゲンIを検出することによりこれが軟骨組織でないことが明らかに証明される。二次抗体とそれに結合したABC系を用いてI型コラーゲンに結合した一次抗体を検出した。即ち、二次抗体はアビジン-ビオチンによって酵素のアルカリホスファターゼを結合し、その酵素は基質フクシンと反応して赤色色素を生じる。
実施例1のように、ゴールドナー染色によってプロテオグリカンを検出した。I型コラーゲンとプロテオグリカンは生体内軟骨マトリックスの成分であり、骨機能に極めて重要な有意性を有する最も重要な構造タンパク質である。
同時に、増殖性骨細胞が凝集体の外層に検出された。
2週間培養した後、細胞はなお一緒に接近している。培養時間が増えるにつれて、細胞外マトリックスの割合が増大し、細胞の割合が低下する。1週間後、少なくとも40％のECMが検出することができ、3週間後、約60％のECMが既に生じた。即ち、骨様組織は生産した凝集体の内部につくられてきたが、その構造の組織は生体内骨に対応し、骨組織の機能を呈することができる。
このようにして得られた単一成分はすぐに軟骨浮遊細胞/単個細胞と組合わせることができる。三次元試験管内組織において細胞によって生産分泌された成長因子は、関節軟骨又は骨構造の新規再生を促進させるので、軟骨又は骨組織の治療において効率を上げる働きをする。

電磁場を用いた骨細胞から前形成された三次元組織(球状体)の組合わせ
骨細胞系球状体の生産及び/又は続いて骨球状体を罹患、変性又は破壊組織に取込む間、組織又は組織再生過程は電磁場によって生体内で刺激される。著しくは、搬送周波数5 kHzで変調周波数がいろいろ(例えば、16Hz)の電磁場を加えた場合に骨細胞から産生された球状体の成熟が刺激されることが求められた。更に、球状体と成長因子とを組合わせることが可能である。驚くべきことに、軟骨細胞の増殖、また、マトリックス形成と成熟が軟骨細胞からの球状体の生産中に外因性成長因子を添加した際にうまく影響され得ることが求められた。

遺伝子操作した軟骨細胞由来の球状体の浮遊液中の軟骨細胞と組合わせた調製
形成された軟骨組織の成熟がヒト軟骨細胞の感染やその球状体の生産が促進されることが証明された。臨床使用において、特に、このことは再生中の欠損又は組織の急速な治癒を意味する。

球状体とPLA/PGAポリマーとの組合わせ
骨細胞から生産された球状体は、組織工学において構造物質として植え込まれる支持材料、例えば、自然に分解するPLA/PGAポリマーとコラーゲンフリースへコーティング又は増殖させるのに用いられる。自然に分解するPLA/PGAポリマーの表面上に骨細胞から生産された球状体の添加に続いて、前記球状体は表面を横切って増殖して最終層を形成するが、ポリマーへ遊走することも証明された。臨床使用の場合、このようにして欠損の急速な治癒と自然に分解する急速な再構成が達成される。同様に骨細胞由来の球状体とコラーゲン膜との組合わせについても同様に示された。

メニスカス
前形成された三次元メニスカス軟骨組織を軟骨組織に記載されたように生産し、体の外部で、例えば、手術中に支持材料と組合わせ、その材料は機械的安定性と形を与える。

筋
三次元筋細胞は、軟骨細胞の生産と同様に生産され、内在性心筋細胞又は幹細胞からなり、内在性血清を更に含み、成長促進化合物を添加せずにオートロガス筋細胞浮遊液と組合わせる。内在性心臓細胞及び/又は幹細胞のオートロガス筋細胞浮遊液の代わりに、前形成された三次元組織は膜上に適用することができ、続いて筋欠損に取込まれるか又は被覆される。

結合組織細胞
他の実施例は、インスリン合成のベクターを含むような方法で遺伝子操作することにより修飾した結合組織細胞からの球状体の調製に関する。これらの細胞から生産された球状体は、それを通って外部にインスリンを拡散することを可能にする不活性支持材料に封入される。この組合わせは血液供給動脈に移植される。球状体の細胞濃度が高いために、この手順は特に高インスリン遊離を可能にし、よって治療効果が高められる。

Claims

構造が
(a)ヒト又は動物の生物体から細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産することができる前形成された三次元組織と;
(b)(i)内在性血清が添加され、成長促進化合物が添加されない内在性細胞から生産することができるオートロガス細胞浮遊液、(ii)充填材又は支持材料及び/又は(iii)成長因子と
を含み; 及び/又は
(c)(a)の組織を電磁場、機械的刺激及び/又は超音波にさらすことにより得ることができることを特徴とする、組織置換構造。
組織置換構造が軟骨置換構造であり、前記組織細胞浮遊液が軟骨細胞浮遊液であり、前記三次元組織が軟骨組織であり、軟骨細胞、骨細胞及び/又は間葉幹細胞が前記生物体から得られ、前記細胞凝集体が少なくとも40体積％の細胞外マトリックスを含有していることを特徴とする、請求項1記載の組織置換構造。
構造が筋組織、骨組織、結合組織、皮膚組織、脂肪組織、神経組織、肝組織、内皮組織及び/又は上皮組織の置換構造、特に心臓平滑筋組織置換構造であることを特徴とする、請求項1又は2記載の組織置換構造。
構造が、ヒト又は動物の生物体から細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産することができることを特徴とする、筋組織、結合組織、皮膚組織、脂肪組織、神経組織、肝組織、内皮細胞、上皮細胞、及び/又は幹細胞を含む群より選ばれた組織置換構造。
組織病変を改善する方法であって、
(a)ヒト又は動物の生物体から細胞を得、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している細胞凝集体が形成されるまで培養することにより生産することができる前形成された三次元組織と
(b)内在性血清が添加され、成長促進化合物が添加されない、内在性細胞から生産することができるオートロガス細胞浮遊液と
を該組織病変に取込むこと及び/又は
(c)(a)の組織を電磁場、機械的刺激及び/又は超音波にさらすこと
を特徴とする、前記方法。
組織病変が骨、軟骨及び/又は筋の病変であることを特徴とする、請求項5記載の方法。
軟骨病変の前記改善において、軟骨細胞浮遊液が細胞浮遊液として生産され、軟骨組織が三次元組織として生産され、軟骨細胞、骨細胞及び/又は間葉幹細胞が生物体から得られ、細胞凝集体が少なくとも40体積％の細胞外マトリックスを含んでいることを特徴とする、請求項6記載の方法。
軟骨細胞浮遊液と軟骨組織の取込みに続いて病変を膜で被覆することを特徴とする、請求項7記載の方法。
細胞内メッセンジャー物質、構造成分、足場成分及び/又はマトリックス成分の供給源としての、細胞がヒト又は動物の生物体から得られ、疎水性表面で底が細くなっている細胞培養容器内で浮遊培養として静置方式で、分化細胞が埋め込まれ且つ増殖と遊走ができる細胞が存在している外部領域を有する細胞凝集体が形成されるまで培養される軟骨細胞、筋細胞、骨細胞、及び/又は間葉幹細胞の使用。
細胞内メッセンジャー物質が成長因子及び/又はサイトカインであることを特徴とする、請求項9記載の使用。
使用が生体内又は試験管内である、請求項9又は10記載の使用。
組織病変の治療のための請求項1〜4のいずれか1項に記載の組織置換構造の使用。
組織病変が軟骨、骨及び/又は筋の病変であることを特徴とする、請求項12記載の使用。
試験管内又は生体内試験系として、特に活性物質をスクリーニングするための請求項1〜4のいずれか1項に記載の組織置換構造の使用。
請求項1〜4のいずれか1項に記載の少なくとも1種の組織置換構造を、任意によりキットの内容物の組合わせについての情報と共に含む、キット。