ES2293934T3

ES2293934T3 - Nucleoproteina de virus toscana.

Info

Publication number: ES2293934T3
Application number: ES00987600T
Authority: ES
Inventors: Maria Grazia Cusi; Marcello Valassina; Pier Egisto Valensin
Original assignee: Universita degli Studi di Siena
Current assignee: Universita degli Studi di Siena
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2020-12-18
Also published as: GB9929783D0; AU2390101A; EP1237571A2; WO2001044288A2; DE60036563T2; WO2001044288A3; DE60036563D1; ATE374040T1; CY1107607T1; PT1237571E; EP1237571B1; DK1237571T3

Abstract

Una nucleoproteína de virus Toscana (proteína N), para su uso para provocar una respuesta humoral neutralizadora contra infección por virus Toscana.

Description

Nucleoproteína de virus Toscana.

Campo técnico

La presente invención se refiere a nucleoproteína de virus Toscana, y los usos médicos de la misma, tales como vacunación.

Técnica anterior

El virus Toscana (TOSV) pertenece a la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus. Se sabe que la infección por TOSV causa meningitis y meningoencefalitis y en endémica del área Mediterránea, como se indica en estudios en residentes (12, 18, 20) y casos presentados de infecciones en turistas (15, 16). El virus envuelto tiene un genoma de ARN segmentado constituido por tres especies de ARN circulares cerradas de forma no covalente, denominadas "pequeña" (S) que codifica la nucleoproteína (N) y la proteína no estructural (NS), "media" (M) que codifica las glicoproteínas de la envuelta G1 y G2 y "grande" (L) que codifican la polimerasa del virus (1, 3, 9). Análogamente a otros bunyavirus, la cantidad relativa del ARNm S es aproximadamente 10 veces mayor que la de la especie de ARNm M y este gradiente también puede observarse a nivel de las proteínas ya que la proteína N es la proteína más abundante del virión (13).

No existe vacuna contra infección por TOSV.

Descripción de la invención

Generalmente, los antígenos de la glicoproteína de la envuelta del virus, en lugar de la proteína núcleo, inducen una respuesta humoral protectora (10). De hecho, las glicoproteínas situadas en la superficie de virión de bunyavirus funcionan como un sitio de interacción entre la partícula y la célula huésped. Los anticuerpos monoclonales contra las glicoproteínas G1 y G2 de la familia Bunyaviridae tales como el virus Rift Valley (14), el virus La Crosse (7, 8) o virus Hantaan (2) muestran propiedades neutralizadoras del virus.

Sorprendentemente, sin embargo, se ha descubierto que los antígenos de la proteína núcleo de TOSV pueden inducir una respuesta humoral protectora, permitiendo de este modo la producción de composiciones inmunogénicas y vacunas que incorporen dichos antígenos de la proteína núcleo.

La invención proporciona una nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) para su uso para provocar una respuesta humoral neutralizadora contra infección por virus Toscana.

La nucleoproteína de virus Toscana puede estar en forma de una composición farmacéutica que comprende nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) a, por ejemplo, 0,1 M, pH 7,4, NaHCO_{3} a, por ejemplo, 0,2 M u otros fluidos fisiológicamente aceptables semejantes.

La proteína N de la invención puede ser una proteína N recombinante.

La proteína N de la invención puede usarse como vacuna.

El uso de la proteína N de la invención puede comprende además administrar una o más proteínas de TOSV adicionales, seleccionadas entre el grupo constituido por: proteína no estructural (proteína NS), glicoproteína G1 de la envuelta, glicoproteína G2 de la envuelta o polimerasa del virus.

Como alternativa a la proteína N de TOSV, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) para su uso para provocar una respuesta humoral neutralizadora contra infección por virus Toscana. Llamada "inmunización del ADN" [por ejemplo Robison & Torres (1997) Seminars in Immunology 9: 271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15: 617-648]. El ácido nucleico de la invención puede estar en forma de una composición.

La invención también proporciona el uso de nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infección por virus Toscana. El medicamento es preferentemente una vacuna. El medicamento provoca preferentemente una respuesta inmune humoral contra infección por TOSV. Preferentemente, la respuesta inmune humoral es una respuesta inmune antiviral neutralizadora.

Se entenderá que las referencias a nucleoproteína de TOSV incluyen todas sus variantes alélicas y mutantes funcionales. También abarca proteínas que tengan una identidad de secuencia significativa con la proteína de tipo natural. El grado de identidad es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o más) calculado usando, por ejemplo, el algoritmo de búsqueda por homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de afinidad de huecos con parámetros: penalización de abertura del hueco = 12 y penalización de extensión del hueco = 1. El término también incluye fragmentos inmunogénicos de estas proteínas. Además, el término incluye proteínas más largas que incorporan a la nucleoproteína de TOSV o sus variantes o fragmentos (por ejemplo, una proteína de fusión). En todos los casos, sin embargo, la proteína (ya sea de tipo natural, variante, mutante y fragmento o fusión) conservara sustancialmente la inmunogenicidad del tipo natural. También pueden usarse mezclas de diferentes nucleoproteínas de TOSV (por ejemplo una mezcla de una nucleoproteína de tipo natural, y una proteína de fusión constituida por un fragmento inmunogénico de la nucleoproteína TOSV de tipo natural y un compañero de fusión).

Las proteínas de la invención pueden prepararse, por supuesto mediante diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química etc.) y en varias formas (por ejemplo, nativa, fusiones, etc.). Preferentemente se preparan en forma sustancialmente pura o aislada (es decir sustancialmente libres de otras proteínas de TOSV o de la célula huésped).

A continuación se proporciona un resumen de técnicas y procedimientos convencionales que pueden emplearse para realizar la invención (por ejemplo, para utilizar las proteínas para vacunación. Este resumen no es una limitación de la invención, sino que en su lugar proporciona ejemplos que pueden usarse, aunque no son necesarios.

General

La práctica de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); ADN Cloning, Volúmenes I & II (Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames & Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (Hames & Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc), especialmente volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer & Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres), Scopes (1987) Protein Purification; Principles and Practice Segunda Edición (Springer-Verlag, N. Y.) y Handbook of Experimental Immunology, Volumes HV (Weir & Blackwell eds 1986).

En esta memoria descriptiva se usan las abreviaturas convencionales para nucleótidos y aminoácidos.

Definiciones

Una composición que contiene X está "sustancialmente libre de" Y cuando al menos 85% en peso del X+Y total en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del X+Y total en la composición, más preferentemente al menos 95% o incluso 99% en peso.

La expresión "que comprende" significa "que incluye" así como "constituido/a por" por ejemplo una composición "que comprende" X puede estar constituida exclusivamente por X o puede incluir algo además de X, tal como X+Y.

El término "heterólogo" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza. Los componentes pueden ser células huéspedes, genes o regiones reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden funcionar conjuntamente, como cuando un promotor heterólogo para un gen está unido de forma operativa al gen. Otro ejemplo es cuando una secuencia de TOSV es heteróloga para una célula huésped de ratón. Un ejemplo adicional serían epítopos de las mismas o diferentes proteínas que pueden unirse en una única proteína en una disposición que no se encuentra en la naturaleza.

Un "origen de replicación" es una secuencia de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula, capaz de replicarse bajo su propio control. Un origen de replicación puede ser necesario para que un vector se replique en una célula huésped particular. Con algunos orígenes de replicación, un vector de expresión puede reproducirse a un gran número de copias en presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Los ejemplos de orígenes son las secuencias de replicación autónoma que son eficaces en levadura; y el antígeno T viral, eficaz en células COS-7.

Una secuencia "mutante" se define como una secuencia de ADN, ARN o aminoácidos que es diferente de, pero que tiene identidad de secuencia con, la secuencia nativa o descrita. Como se usa en este documento, una "variante alélica" de una molécula, o región, de ácido nucleico para la que se proporciona la secuencia de ácidos nucleicos en este documento, es una molécula, o región, de un ácido nucleico que se produce esencialmente en el mismo locus en el genoma de otro o de un segundo aislado y que, debido a la variación natural causada por ejemplo por mutación o recombinación, tiene una secuencia de ácido nucleico similar pero no idéntica. Una variante alélica de una región codificante codifica normalmente una proteína que tiene una actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se está comparando. Una variante alélica también puede comprender una alteración en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen, tales como en regiones de control reguladoras (véase por ejemplo Patente de Estados Unidos Nº 5.753.235).

Sistemas de expresión

Las secuencias de nucleótidos pueden expresarse en diversos sistemas de expresión diferentes; por ejemplo los que se usan con células de mamífero, baculovirus, plantas, bacterias y levaduras.

I. Sistemas de Mamífero

En la técnica se conocen sistemas de expresión en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción, que se coloca normalmente en situación proximal al extremo 5' de la secuencia codificante, y una caja TATA situada normalmente 25-30 pares de bases (pb) cadena arriba del sitio de iniciación de la transcripción. Se piensa que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero contendrá también un elemento promotor cadena arriba, situado normalmente en 100 ó 200 pb cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina el índice en el que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación [Sambrook y col. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." En Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª ed.]

Los genes virales de mamífero a menudo se expresan con alta frecuencia y tienen un amplio intervalo de huéspedes; por lo tanto las secuencias que codifican genes virales de mamífero proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del virus del tumor de mamífero de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del herpesvirus simplex. Además, las secuencias obtenidas de genes no virales, tales como del gen de metalotioneína de ratón, proporcionan también secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible), dependiendo de sí el promotor puede inducirse con glucocorticoides en células sensibles a hormonas.

La presencia de un elemento potenciador (potenciador) combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, aumentará normalmente los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, con la síntesis comenzando en el sitio de iniciación del ARN normal. Los potenciadores también son activos cuando se colocan cadena arriba o cadena abajo del sitio de iniciación de la transcripción, en orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor [Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.]. Los elementos promotores obtenidos de virus pueden particularmente útiles, debido a que normalmente tienen un intervalo de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 [Dijkema y col. (1985) EMBO J. 4:761] y el potenciador/promotores obtenidos de la repetición terminal larga (LTR) del virus del Sarcoma de Rous [Goman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] y del citomegalovirus humano [Boshart y col. (1985) Cell 41: 521]. Además, algunos potenciadores son regulables y se vuelven activos solamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o un ión metálico [Sassone-Coral y Borell (1986) Trenes Genet. 2: 215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237].

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular en células de mamífero. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianogeno.

Como alternativa, pueden secretarse también proteínas extrañas a partir de la célula al medio de cultivo creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilita la secreción de la proteína extraña en células de mamífero. Preferentemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. El líder tripartito de adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que posibilita la secreción de una proteína extraña en células de mamífero.

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación reconocidas por células de mamífero son regiones reguladoras situadas 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y que por lo tanto, junto con los elementos promotores, flanquean a la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro está formado mediante escisión y poliadenilación post-transcripcional específica de sitio [Birnstiel y col. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA". En Transcription and splicing (ed. B. D. Hames y D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm, que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de señales terminadoras de la transcripción/poliadenilación incluyen las obtenidas de SV40 [Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, constituidos por un promotor, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción se ponen conjuntamente en construcciones de expresión. Los potenciadores, intrones con sitios donadores y aceptores de corte y empalme funcionales, y secuencias líderes también pueden incluirse en una construcción de expresión, si se desea. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped, tales como células de mamífero o bacterias. Los sistemas de replicación de mamíferos incluyen los obtenidos de virus animales, que requieren factores de actuación en trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175] o poliomavirus, se replican a un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno T viral apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los obtenidos del papilomavirus bovino y del virus de Epstein-Barr. Además, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, que permiten de este modo que se mantenga por ejemplo, en células de mamífero para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera mamífero-bacteria incluyen pMT2 [Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] y pHEBO [Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074].

El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformar. Los procedimientos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(los) polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo aunque sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2), y varias otras líneas celulares.

ii. Sistemas de Baculovirus

El polinucleótido que codifica la proteína también puede insertarse en un vector de expresión de insecto adecuado, y se une de forma operativa a los elementos de control dentro de este vector. La construcción de vectores emplea técnicas que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción adecuado para la inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus de tipo natural con una secuencia homóloga al fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma de baculovirus); y células huéspedes de insecto y medios de cultivo apropiados.

Después de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo natural se transfectan en una célula huésped de insecto donde el vector y el genoma viral puede recombinarse. El virus recombinante envuelto se expresa y las placas recombinantes se identifican y se purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus están disponibles en el mercado en forma de kit de entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Estas técnicas generalmente las conocen los expertos en la materia y se describen completamente en el documento Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (en lo sucesivo en este documento "Summers y Smith").

Antes de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden una secuencia promotora, líder (si se desea) y codificante de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan normalmente en una construcción de traslado intermedia (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un único gen y elementos reguladores unidos de forma operativa; múltiples genes, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de forma operativa o múltiples genes, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de traslado intermedias se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, que le permite mantenerse en un huésped adecuado para la clonación y la amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia usado más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de iniciación de polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases cadena abajo del ATT; véase Luckow y Summers; Virology (1989) 17: 31.

El plásmido normalmente contiene también la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller y col. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen procariota de resistencia a ampicilina (amp) y un origen de replicación para selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen normalmente un promotor de baculovirs. Un promotor baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (de 5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca normalmente en situación proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente un sitio de unión a la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio llamado un potenciador que, sí está presente, está normalmente en situación distal al gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Los genes estructurales, que se transcriben de forma muy abundante en las etapas tardías en un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias obtenidas del gen que codifica la proteína polihedrina viral, Friesen y col., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", En: The Molecular Biology of Baculovirus (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nº 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10. VIak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.

Las secuencias de señal adecuadas que codifican ADN pueden obtenerse de genes para proteínas de insecto de baculovirus secretadas tales como el gen de la polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73: 409). Como alternativa, puesto que las señales para modificaciones post-traduccionales de células de mamífero (tales como el péptido señal de escisión, de escisión proteolítica, y de fosforilación) parecen ser reconocidas por células de insecto y las señales necesarias para la secreción y la acumulación nuclear también parecen conservarse entre las células de invertebrado y las células de vertebrado, también pueden usarse líderes de origen no de insectos, tales como los obtenidos de genes que codifican el interferón \alpha humano, Maeda y col., (1985), Nature 315: 592; péptido de liberación de gastrina humano, Lebacp-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129: IL-2 humana. Smith y col., (1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82-8404; IL-3 de ratón, (Miyaljma y col., (1987) Gene 58: 273; glucocerebrosidasa humana, Martin y col., (1988) DNA, 7: 99, para posibilitar la secreción en insectos.

Un polipéptido o poliproteína recombinante puede expresar de forma intracelular o, si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas, puede secretarse. La buena expresión intracelular de proteínas extrañas no fusionadas normalmente necesitas genes heterólogos que tengan idealmente una secuencia líder corta que contenga señales de iniciación de la traducción adecuadas precediendo a la señal de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Como alternativa, las poliproteínas recombinantes que no se secretan de forma natural pueden secretarse a partir de la célula de insecto creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilite la secreción de las proteínas extrañas en insectos. El fragmento de secuencia líder normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína al retículo endoplasmático.

Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o del gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, una célula huésped de insecto se co-transforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo natural, normalmente por co-transfección. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción comprenderán normalmente una sección de 2-5 kb del genoma del baculovirus. Los procedimientos para introducir ADN heterólogos en el sitio deseado en el virus baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y Smith anteriormente; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, mediante recombinación homóloga de doble cruzamiento; la inserción puede ser también en el sitio de una enzima de restricción manipulada en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioesaays 4: 9). La secuencia de ADN, cuando se clona en lugar del gen de la polihedrina del vector en el vector de expresión, está flanqueada en 5' y en 3' por secuencias específicas de polihedrina y se coloca cadena abajo del promotor de polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus recién formado se envasa posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre \sim1% y \sim5%); por lo tanto, la mayoría de los virus producidos después de la co-transfección sigue siendo virus de tipo natural. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una pantalla visual que permite distinguir a los virus recombinantes. La proteína polihedrina, que es producida por el virus nativo, se produce a niveles muy altos en el núcleo de las células infectadas en las etapas tardías después de la infección vírica. La proteína polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta 15 \mum de tamaño, son altamente refractarios, lo que les da una apariencia brillante que se visualiza fácilmente con el microscopio de luz. Las células infectadas con virus recombinante carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir virus recombinantes de los virus de tipo natural, el sobrenadante de transfección se coloca en placas en una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Concretamente, las placas se examinan en el microscopio de luz para detectar la presencia (indicativa de tipos de virus natural), o la ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel y col., eds) a 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers y Smith, anteriormente; Miller y col. (1989).

Los vectores de expresión de baculovirus recombinante se han desarrollado para la infección de varias células de insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (documento WO
89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; y véase generalmente, Fraser, y col., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).

Las células y los medios de cultivo celular están disponibles en el mercado para la expresión directa y de fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de baculovirus/expresión. La tecnología del cultivo celular la conocen generalmente los expertos en la materia. Véase por ejemplo, Summers y Smith anteriormente.

Las células de insectos modificadas pueden cultivarse después en un medio nutriente apropiado, lo que permite el mantenimiento estable del(los) plásmido(s) presente(s) en el huésped insecto modificado. Donde el gen producto de la expresión está bajo control inducible, el huésped puede cultivarse a alta densidad, y la expresión puede inducirse. Como alternativa, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará de forma continúa en el medio y el medio nutriente puede hacerse circular de forma continua mientras se retira el producto de interés y se aumenta los nutrientes agotados. El producto puede purificarse mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc; electroforesis; centrifugado en gradiente de densidad; extracción del disolvente o similares. Cuando sea apropiado, el producto puede purificarse adicionalmente, según se requiera, para retirar sustancialmente cualquier proteína de insecto que también se secrete al medio o resulte de la lisis de las células de insectos, para proporcionar un producto que esté al menos sustancialmente libre de restos del huésped, por ejemplo proteínas, lípidos y polisacáridos.

Para obtener la expresión de proteínas, las células huéspedes recombinantes obtenidas de los transformantes se incuban en condiciones que permiten la expresión de la secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones pueden determinarlas fácilmente los expertos en la materia, en base a lo que se conoce en la técnica.

iii. Sistemas vegetales

Existen muchos sistemas de expresión de cultivo celular vegetal y de expresión genética en todo el vegetal conocido en la técnica. Los sistemas de expresión genéticos celulares vegetales incluyen los que se describen en Patentes tales como: US 5.693.506; US 5.659.122 y US 5.608.143. Los ejemplos adicionales de la expresión genética en cultivo de células vegetales se han descrito por Zenk, Phytochemistry 30: 3861-3863 (1991). Las descripciones de péptido señal de proteínas vegetales pueden encontrarse, además de en la bibliografía descrita anteriormente, en Vaulcombe y col., Mol. Gen. Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col., Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col., Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel y col., Molecular Microbiology 3: 3-14 (1989); Yu y col., Gene 122: 247-253 (1992). Una descripción de la regulación de la expresión génica en vegetales por la fitohormona ácido giberélico y enzimas secretadas inducidas por el ácido giberélico puede encontrarse en los documentos R. L. Jones y J. MacMillin, Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, págs. 21-52. Bibliografía que describe otros genes regulados metabólicamente: Sheen, Plant. Cell, 2: 1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J. 9: 3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).

Normalmente, usando técnicas conocidas en la técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en una casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos diseñados para operar en vegetales. La casete de expresión se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias acompañantes cadena arriba y cadena abajo de la casete de expresión adecuada para la expresión en un huésped vegetal. Las secuencias acompañantes pueden ser de origen plasmídico o viral y pueden proporcionar características necesarias al vector para permitir que el vector mueva el ADN de un huésped de clonación original tal como una bacteria, al huésped vegetal deseado. La construcción del vector bacteriano/vegetal básico proporcionará preferentemente un origen de replicación de procariotas con un intervalo de huéspedes amplios. Un marcador seleccionable de procariotas; y, para transformaciones de Agrobacterium, secuencias de ADN T para transferencia mediada por Agrobacterium de cromosomas vegetales. Donde el gen heterólogo no sea detectable fácilmente, la construcción tendrá también preferentemente un gen marcador seleccionable adecuado para determinar si una célula vegetal se ha transformado. Una revisión general de marcadores adecuados, por ejemplo para los miembros de la familia de las gramíneas se encuentra en el documento Wilkmink y Dons, 1993, Plants, 1993, Plant Mol. Reptr, 11(2): 165-185.

Las secuencias adecuadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la planta también se recomiendan. Estas pueden incluir secuencias de transposón y similares para la recombinación homóloga así como secuencias Ti que permiten la inserción aleatoria de una casete de expresión heteróloga en el genoma de una planta. Los marcadores seleccionables procariotas adecuados, incluyen de resistencia a antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. Otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales, también pueden estar presentes en el vector como se conocen en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluirse en una casete de expresión para la expresión de la(s) proteína(s) de interés. Normalmente, solamente habrá una casete de expresión, aunque es posible tener dos o más. La casete de expresión recombinante contendrá, además de la secuencia que codifica la proteína heteróloga, los siguientes elementos, una región promotora, secuencias no traducidas 5' vegetales, un codón de iniciación dependiendo de si el gen estructural viene equipado o no con uno, y una secuencia de terminación de la transcripción y de la traducción. Los sitios de enzima de restricción únicos en los extremos 5' y 3' de la casete permiten la inserción fácil en un vector pre-existente.

Una secuencia codificante heteróloga puede ser cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido señal que permita el procesamiento y la translocación de la proteína, según sea apropiado, y carecerá normalmente de cualquier secuencia que podría dar como resultado la unión de la proteína deseada de la invención con una membrana. Puesto que, para la mayor parte, la región de iniciación de la transcripción será para un gen que se expresa y se transloca durante la germinación, empleando el péptido señal que posibilita la translocación, puede posibilitarse la translocación de la proteína de interés. De esta manera, la(s) proteína(s) de interés se traslocará(n) de las células en las que expresan y pueden recogerse eficazmente. La secreción típica en semillas es a través de la aleurona o de la capa epitelial del escutello en el endosperma de la semilla. Aunque no es necesario que la proteína se secrete a partir de las células en las que la proteína se produce, esto facilitaría el aislamiento y purificación de la proteína recombinante.

Puesto que la expresión definitiva del producto génico deseado será en una célula eucariota es deseable determinar si cualquier proporción del gen clonado contiene secuencias que se procesarán como intrones por la maquinaria del espliceosoma del huésped. Si es así, puede realizarse la mutagénesis dirigida específica de sitio de la región "intrón" para prevenir la pérdida de una porción del mensaje genético como un código de intrón falso, véase el documento Reed y Maniatis, Cell 41: 95-105, 1985.

El vector puede micro-inyectarse directamente en células vegetales mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mo. Gen. Genet., 202: 179-185, 1985. El material genético también puede transferirse a la célula vegetal usando polietilenglicol, Kresns, y col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración balística a alta velocidad mediante pequeñas partículas con el ácido nucleico en la matriz de perlas de perlas pequeñas o en su superficie, Klein, y col, Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta 185: 330-336 muestran el bombardeo de partículas del endosperma de cebada para crear cebada transgénica. Otro procedimiento de introducción sería la fusión de protoplastos con otras entidades, minicélulas, células lisosomas u otros cuerpos con superficie lipídica fusionable, Fraley, y col., Proc. Natls. Acad Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

El vector también puede introducirse en células vegetales mediante electroporación (From m y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824, 1985). En esta técnica, los protoplastos vegetales se electroporan en presencia de plásmidos que contienen la construcción génica. Los impulsos eléctricos permeabilizan de forma reversible las membranas biológicas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de las plantas electroporados forman de nuevo la pared celular, se dividen y forman callos vegetales.

Todas las plantas a partir de las cuales pueden aislarse y cultivarse los protoplastos para dar plantas completamente regeneradas pueden transformarse mediante la presente invención de modo que se recuperen plantas completas que contiene el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas puede regenerarse a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo aunque sin limitación todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha, algodón, fruta y otros árboles, hortalizas y verduras. Algunas plantas adecuadas incluyen por ejemplo especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linux, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromas, Asparugus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycina, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura.

Los medios para regeneración varían de especie a especie de plantas, pero generalmente, en primer lugar se proporciona una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. Se forma el tejido calloso y pueden inducirse brotes a partir del callo que posteriormente se plantan. Como alternativa, puede inducirse la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. Los brotes y las raíces normalmente se desarrollan de forma simultánea. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si estas tres variables se controlan, entonces la regeneración se totalmente reproducible y repetible.

En algunos sistemas de cultivo de células vegetales, la proteína deseada de la invención puede excretarse o como alternativa, la proteína puede extraerse de la planta completa. Cundo la proteína deseada de la invención se secreta al medio puede recogerse. Como alternativa, los embriones y las semillas sin embrión u otro tejido vegetal, puede romperse de forma mecánica para liberar cualquier proteína secretada entre las células y los tejidos. La mezcla puede suspenderse en una solución tampón para recuperar proteínas solubles. Los procedimientos de purificación y aislamiento de proteínas convencionales se usarán después para purificar la proteína recombinante. Los parámetros de tiempo, temperatura y pH, oxígeno y volúmenes se ajustarán a través de procedimientos rutinarios para optimizar la expresión y la recuperación de proteína heteróloga.

iv. Sistemas Bacterianos

En la técnica se conocen técnicas de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es una secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca normalmente en posición proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio llamado operador, que puede solaparse con un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada de forma negativa (inducible), ya que una proteína represora del gen puede unirse al operador y de este modo inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, puede conseguirse regulación positiva mediante una secuencia de unión a la proteína activadora del gen, que, si ésta presente, está normalmente en posición proximal (5') a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora del gen es la proteína activadora de catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. La expresión regulada puede ser por lo tanto positiva o negativa, potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras obtenidas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col. (1977) Nature 198: 1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras obtenidas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids. Res. 8: 4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patente de Estados Unidos Nº 4.738.921; EP-A-0036776 y EP-A-0121775]. El sistema promotor de g-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "the cloning of interferon and other mistakes", En Interferon 3 (es. I. Gresser)], el bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128] y T5 [Patente de Estados Unidos Nº 4.689.406] sistemas promotores que también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófagos pueden unirse a las secuencias operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, quedando un promotor híbrido sintético [Patente de Estados Unidos Nº 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbridoconstituido por secuencias del promotor trp y del operón lac que está regulado por el represor lac [Amann y col. (1983) Gene 25: 167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural o promotores de origen no bacteriano que tengan la capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural y de origen no bacteriano también puede acoplarse con una ARN polimerasa compatible para producir niveles altos de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa/promotor del bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar constituido por un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (EPO-A-0 267 851).

Además de una secuencia promotora funcional, un sitio de unión al ribosoma eficaz también puede ser útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud situada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación [Shine y col. (1975) Nature 254: 34]. La secuencia SD se cree que promueve la unión del ARNm al ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el ARNr 16S 3' de E. coli [Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger ARN " En Biological Regulation and Development: Gene Expresión (ed. R.F. (Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli". En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N- siempre será una metionina, que está codifica por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa de metionina N-terminal de bacterias (EP- A-0 219 237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Normalmente una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Después de la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula del bacteriófago lambda puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante conserva preferentemente un sitio para un procesamiento enzimático (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago de la proteína extraña [Nagai y col. (1984) Nature 309: 810]. También pueden preparase proteínas de fusión con secuencias de los genes lacZ [Jia y col. (1987) Gene 60: 197], trpE [Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff y col. (1989) J. Gen. Microbial. 135: 11], y Chey [EP-A-0 324 647]. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o puede no codificar un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión a ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de ubiquitina que conserva preferentemente un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, una proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. A través de este procedimiento, puede aislarse una proteína extraña nativa [Millar y col. (1989) Bio/Technology 7: 698].

Como alternativa, las proteínas extrañas pueden secretarse a partir de la célula creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por una secuencia de péptidos señal que posibilite la secreción de la proteína extraña en las bacterias [Patente de Estados Unidos Nº 4.336.336]. El fragmento de la secuencia de señal normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína se secreta en los medios de cultivo (bacterias gram-positivas) o en el espacio periplasmático, situado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas). Preferentemente hay sitios de procesamiento que pueden escindirse in vivo o in vitro codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen extraño.

El ADN que codifica secuencias de señal adecuadas puede obtenerse de genes para proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) [Masui y col. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3: 2437] y la secuencia señal de fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212]. Como ejemplo adicional, puede usarse la secuencia señal del gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus para secretar proteínas heterólogas de B. Subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EP-A- 0 244 042].

Normalmente, la secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y de este modo junto con el promotor que flanquea a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras en bucle que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción obtenidas de genes con promotores potentes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, comprenden un promotor, secuencia señal (si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción, y se ponen conjuntamente en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de este modo mantenerse en un huésped procariota para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un alto o bajo número de copias. Un plásmido con alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente entre 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con alto número de copias contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector con un alto o bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped.

Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de integración.

Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (EP-A-0 127 328). Los vectores de integración también pueden estar constituidos por secuencias de bacteriófagos.

Normalmente, las construcciones extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hagan a la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469].

Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden reunirse en vectores de transformación.

Los vectores de transformación están constituidos normalmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración.

Los vectores de expresión y transformación, replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541] Escherichia coli [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128; Amann y col. (1985) Gene 40: 183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907] Streptococcus cremoris [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [Patente de Estados Unidos Nº 4.745.056].

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos se conocen bien en la técnica e incluyen normalmente la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO.

El ADN también puede introducirse en células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación varían normalmente con la especie bacteriana a transformar. Véase por ejemplo [Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541; Bacillus], [Millar y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172: 949; Campylobacter], [Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. En Genetics Engineering: proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and Nicosia; Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacterial. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc 4º Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].

v. Expresión en Levadura

Los expertos en la materia también conocen sistemas de expresión en levadura. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que normalmente se coloca en posición proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a la ARN polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor de levadura también puede tener un segundo dominio llamado una secuencia activadora cadena arriba (UAS), que si está presente está normalmente en posición distal con respecto al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). En ausencia de la UAS se produce la expresión constitutiva. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.

La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenada (ADH) (EP-A-0 284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada (GAP o GAPDH) hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa, y piruvato quinasa (PyK) (EPO-A-0 329 203). El gen PHO5 de levadura, que codifica fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles [Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 1].

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores de levadura. Por ejemplo las secuencias UAS de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a la región de activación de la transcripción GAP (Patentes de Estados Unidos Nº. 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores constituidos por secuencias reguladoras de los genes ADH2, Gal4, Gal10, o PHO5, combinados con la región de activación de la transcripción del gen de una enzima glicolítica tal como GAP o PyK (EP-A-0 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no de levadura que tengan la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción.

Los ejemplos de dichos promotores incluyen entre otros [Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg y col (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of Medical, Environmental and Comercial Importance (eds. K. N. Timmins and A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11: 163; Panthier y col 81980) Curr. Genet. 2: 109].

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular en una levadura. Una secuencia promotora puede estar unida directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para los sistemas de expresión de levadura, así como en sistemas de expresión de mamíferos, baculovirus y bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica una porción N terminal de una proteína de levadura endógena u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Después de la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la superóxido dismutasa (SOD) de levadura o humana, puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no un sitio escindible. Véase por ejemplo, EP-A- 0196056. Otro ejemplo es una proteína de fusión a ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de ubiquitina que preferentemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. A través de este procedimiento, por lo tanto, puede aislarse una proteína extraña nativa (por ejemplo WO88/024066).

Como alternativa, las proteínas extrañas también pueden secretarse a partir de la célula al medio de cultivo creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilite la secreción de la levadura de la proteína extraña. Preferentemente, existen dos sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula.

El ADN que codifica secuencias de señal adecuadas puede obtenerse de genes para proteínas de levadura secretadas tales como el gen de la invertasa de levadura (EP-A-0012873; JP-62.096.086) y el gen del factor A (Patente de Estados Unidos Nº 4.588.684). Como alternativa, existen líderes no de levadura, tales como el líder de interferón, que también posibilitan la secreción en levadura (EP-A-0060057).

Una clase preferida de líderes de secreción son los que emplean un fragmento del gen del factor-alfa de levadura, que contiene una secuencia de señal "pre" y una región "pro". Los tipos de fragmentos de factor-alfa que pueden emplearse incluyen el líder del factor-alfa pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83 restos de aminoácidos) así como líderes de factor-alfa truncados (normalmente de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos) (patentes de Estados Unidos Nº 4.546.083 y 4.870.008; EP-A-0 324 274). Otros líderes que emplean un fragmento líder de factor-alfa que posibilita la secreción incluyen líderes de factor-alfa híbridos preparados con una pre-secuencia de una primera levadura pero una región pro de un segundo factor-alfa de levadura (véase por ejemplo, WO 89/02463).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son secuencias reguladoras situadas 3' con respecto al codón de terminación de la transcripción, y por lo tanto junto con el promotor que flanquea a la región codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por la levadura, tales como las que codifican enzimas glicolíticas.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente que comprenden una secuencia promotora líder (si se desea) y codificante de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción se reúnen en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmido) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped tal como una levadura o una bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiéndole mantenerse, por ejemplo, en levadura para su expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de levadura-bacteria incluyen YEp24 [Botsein y col. (1979) Gene 8: 17-24], pCl/l [Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646] e YRp17 [Scinchcomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Además, un replicón puede ser un plásmido con un alto o bajo número de copias. Un plásmido con alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 y normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con alto número de copias tendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y más preferentemente al menos aproximadamente 20. Puede seleccionarse un vector con un alto o bajo número de copias dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped. Véase por ejemplo Brake y col., anteriormente.

Alternativamente, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de la levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferentemente contienen dos secuencias homólogas que flanquean a la construcción de expresión. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogos en el vector y en el cromosoma de levadura [Orr-Weaver y col (1983) Methods in enzymol. 101: 228-245]. Un vector de integración puede dirigirse a un locus específico en levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., anteriormente. Puede integrarse una o más construcciones de expresión, afectando posiblemente a los niveles de proteína recombinante producida [Rine y col. (1983) Proc. Natl Acad. Sci. USA. 80: 6750]. Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse como un único elemento en el vector, lo que da como resultado la integración de todo el vector, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean a la construcción de expresión en el vector, lo que puede provocar la integración estable de solamente la construcción de expresión.

Normalmente, las construcciones extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas de levaduras que se hayan transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir gene biosintéticos que pueden expresarse en el huésped de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7, y el gen de resistencia a G418, que otorgan a las células de levadura resistencia a tunicamicina y G418 respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede proporcionar también levaduras con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que las levaduras crezcan en presencia de iones de cobre [Butt y col. (1987) Microbiol, Rev 51: 351].

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden reunirse en vectores de transformación. Los vectores de transformación están constituidos normalmente por marcadores seleccionables que se mantienen en un replicón o se desarrollan en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo se han desarrollado vectores de expresión para entre otras, las siguientes levaduras: Candida albicans [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze, y col. (1985) J. Basic Microbial. 25: 141]. Hansenula polimorfa [Gleeson, y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromices fragilis [Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromices lactis [De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990) BiolTechnology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze y col. (1985) J. Basic. Microbial. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg, y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patente de Estados Unidos Nº 4.387.148 y 4.929.555] Saccharomyces cerevisiae [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163] Schizosacharomyces pombe [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706] y Yarrowia lipolytica [Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49].

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en las levaduras huéspedes se conocen bien en la técnica e incluyen normalmente la transformación de esferoplastos o de levaduras intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies de levaduras a transformar. Véase por ejemplo [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson y col (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985) J. Basic. Microbiol. 25: 141; Patente de Estados Unidos Nº 4.837.148 y 4.929.555, Pichia]; [Hinnen y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito y col (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow y col. (1985) Curr Genet. 10: 39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].

Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas comprenderán normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o dolencia, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse, mediante por ejemplo marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen reducción de los síntomas físicos, tales como temperatura corporal reducida. La cantidad eficaz exacta para un sujeto dependerá del tamaño y del estado de salud del sujeto, la naturaleza y el alcance de la dolencia y los compuestos terapéuticos o la combinación de compuestos terapéuticos seleccionada para la administración. Por lo tanto no es útil especificar una cantidad eficaz exacta con antelación. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede determinarse mediante experimentación rutinaria si está dentro del alcance del juicio del médico.

Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, gen u otros agentes. La expresión se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que puede administrase sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser, macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos los conocen bien los expertos en la materia.

En estos vehículos pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión minuciosa de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en el documento Remington's Pharmaceutical Science (Mack Pub. Co. N.J. 1991).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol, y etanol. Además, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables aunque pueden preparase como soluciones líquidas o suspensiones. También pueden prepararse formas sólidas para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Los liposomas se incluyen dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente
aceptable.

Procedimientos de Suministro

Una vez formuladas, las composiciones pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular pueden tratarse sujetos humanos.

El suministro directo de las composiciones se realizará generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intramuscular o se suministrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrase en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo véase WO 98/20734), agujas, pistolas de genes o pulverizadores hipodérmicos. El tratamiento de la dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.

Vacunas

Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la inyección).

Dichas vacunas comprenden antígeno(s) inmunizante(s), inmunógeno(s), polipéptido(s), proteína(s) o ácido nucleico, normalmente junto con "vehículos farmacéuticamente aceptables" que incluyen cualquier vehículo que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son normalmente moléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos los conocen bien los expertos en la materia. Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además el antígeno o el inmunógeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano tales como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pilory, etc.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, aunque sin limitación: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59^{TM} (WO 90/14837; capítulo 10 en Vaccine desing; the subunit and adjuvant approach, eds Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contienen escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contienen opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no es necesario) formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, M A), (b) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloqueado con pluronic al 5% L121, y thr-MDP (véase a continuación), microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado con vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y (c) el sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trealosa (TDM), y el esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón gamma), factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la eficacia de la composición. Se prefiere alumbre y MF59^{TM}.

Como se ha mencionado anteriormente los péptidos de muramilo, incluyen, aunque sin limitación N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alnil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) etc.

La composición inmunogénica (por ejemplo el antígeno/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico y el vehículo farmacéuticamente aceptable y el adyuvante inmunizadores) contendrá normalmente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares.

Normalmente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, en soluciones líquidas o en suspensiones; también pueden preparase formas sólidas para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado, como se ha descrito anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos o inmunogénicos, así como cualquiera de los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esta cantidad a un individuo, en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y del estado físico del individuo a tratar, del grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación de la situación médica por parte del doctor y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de ensayos rutinarios.

Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo mediante inyección, por vía subcutánea, por vía intramuscular o por vía transdérmica/transcutánea (por ejemplo WO 98/20734). Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de la dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis. La vacuna puede administrase junto con otros agentes inmunorregula-
dores.

Como alternativa para las vacunas basadas en proteínas puede emplearse la vacunación con ADN [por ejemplo Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9: 271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev immunol 15: 617-648, véase a continuación en este documento].

Procedimientos de Suministro

Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos pueden administrarse (1) directamente al sujeto; (2) suministrarse ex vivo a células obtenidas del sujeto; o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos a tratar pueden ser mamíferos o aves. También pueden tratarse sujetos humanos.

El suministro directo de las composiciones se realizará generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intramuscular o se suministrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. Otros modos de administración incluyen administración orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo véase WO 98/20734), agujas y pistolas de genes o pulverizadores hipodérmicos. El tratamiento de la dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.

Los procedimientos para el suministro ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en el documento WO 93/14778. Los ejemplos de células útiles en las aplicaciones ex vivo incluyen por ejemplo, células madre, particularmente hematopoyéticas, células de la linfa, macrófagos, células dendríticas o células tumorales.

Generalmente, el suministro de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vitro puede realizarse mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión del protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos, como se conoce bien en la técnica.

Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos

Además de los vehículos farmacéuticamente aceptables y de las sales descritas anteriormente, pueden usarse los siguientes agentes adicionales con composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.

A. Polipéptidos

Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin limitación, asiolorosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos; ferritina; interleucinas; interferones; factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF); factor estimulador de las colonias de macrófagos (M-CSF); factor de células madre y eritropoyetina. También pueden usarse antígenos virales tales como proteínas de la envuelta. También, proteínas de otros organismos invasores, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína del circumesporozoito de plasmodium falciparum conocido como RII.

B. Hormonas, Vitaminas, etc

Otros grupos que pueden incluirse son por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormonas tiroideas, vitaminas o ácido fólico.

C. Polialquilenos, Polisacáridos, etc

También puede incluirse polialquilenglicol junto con los polinucleótidos/polipéptidos deseados. En una realización preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden incluirse mono-, di-, o polisacáridos. En una realización preferida de este aspecto el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También quitosano y poli(lacturo-co-glicoluro).

D. Lípidos y Liposomas

El polinucleótido/polipéptido deseado también puede encapsularse en lípidos o envasarse en liposomas antes del suministro al sujeto o a las células obtenidas del mismo.

La encapsulación en lípidos se realiza generalmente usando liposomas que son capaces de unirse de forma estable o atrapar y retener al ácido nucleico. La proporción de polinucleótido condensado con la preparación de lípidos puede variar pero generalmente será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido), o más de un lípido. Para una revisión del uso de liposomas como vehículos para el suministro de ácidos nucleicos, véase por ejemplo Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1-17; Straubinger) 1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.

Las preparaciones liposomales catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Los liposomas catiónicos han demostrado mediar en el suministro intracelular del ADN del plásmido (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265: 10189-10192), de forma funcional.

Los liposomas catiónicos están disponibles fácilmente. Por ejemplo, los liposomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) están disponibles con la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (véase, también, Felgner anteriormente). Otros liposomas disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden preparase fácilmente a partir de materiales disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1, 2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamino)propano).

Análogamente, los liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) o pueden preparase fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleilfosfatidil colina (DOPC), dioleilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales pueden mezclarse también con los materiales de partida DOTMA y DOTAP en proporciones adecuadas. Los procedimientos para preparar liposomas usando estos materiales se conocen bien en la técnica.

Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), pequeñas vesículas unilaminares (SUV), o grandes vesículas unilaminares (LUV). Los diversos complejos de liposomas-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica, véase por ejemplo Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta. 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta. 443: 629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Común. 76: 836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 145; Fraley (1980) 255: 10431; Skoza & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215: 166.

E. Lipoproteínas

Además, pueden incluirse lipoproteínas junto con el polinucleótido/polipéptido a suministrar. Los ejemplos de lipoproteínas a utilizar incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL, y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos, o fusiones de estas proteínas. Además, pueden usarse modificaciones de lipoproteínas de origen natural, tales como LDL acetilado. Estas lipoproteínas pueden dirigir el suministro de polinucleótidos a células que expresan receptores de lipoproteína. Preferentemente, si se incluyen lipoproteínas con el polinucleótido a suministrar, no se incluye en la composición ningún otro ligando de dirección. Las lipoproteínas de origen natural comprenden un lípido y una porción proteica. La porción proteica se conoce como apoproteína. Actualmente se han aislado y se han identificado apoproteínas A, B, C, D y E. Al menos dos de éstas contienen varias proteínas, denominadas mediante números romanos, AI, AII, AIV, CI, CII, CII.

Una lipoproteína puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo los quilomicrones de origen natural comprenden A, B, C y E, a lo largo del tiempo, estas lipoproteínas pierden A y adquieren apoproteínas C y E. VLDL comprende A, B, y E, LDL comprende la apoproteína B y HDL comprende las apoproteínas A, C, y E.

Los aminoácidos de estas apoproteínas se conocen y se describen por ejemplo en Breslow (1985) Annu Re. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Bio. 151: 162; Chen (1986) J Biol Chem 261: 12918, Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.

Las lipoproteínas comprende diversos lípidos incluyendo triglicéridos, colesterol, (libre y en forma de ésteres), y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en lipoproteínas de origen natural. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Una descripción más detallada del contenido de lípidos de las lipoproteínas de origen natural puede encontrarse por ejemplo en el documento Meth. Enzymol. 128 (1986). La composición de los lípidos se selecciona para ayudar a la conformación de la apoproteína para la actividad de unión al receptor. La composición de los lípidos también puede seleccionarse para facilitar la interacción hidrófoba y la asociación con la molécula de unión al polinucleótido.

Las lipoproteínas de origen natural pueden aislarse a partir de suero mediante ultracentrifugado, por ejemplo. Dichos procedimientos se describen en el documento Meth. Enzymol. (anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255: 5454-5460 y Mahey (1979) J. Clin. Invest. 64: 743-750. Las lipoproteínas también pueden producirse mediante procedimientos in vitro o recombinantes mediante la expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped deseada. Véase por ejemplo atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15: 403 y Radding (1985) Biochim. Biophys Acta 30: 443. Las lipoproteínas también pueden adquirirse de proveedores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Una descripción adicional de las lipoproteínas puede encontrarse en el documento Zuckermann y col. PCT/US97/14465.

F. Agentes Policatiónicos

Pueden incluirse agentes policatiónicos con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido/polipépti-
do a suministrar.

Los agentes policatiónicos, muestran normalmente una carga positiva neta a un pH fisiológico pertinente y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar el suministro a un punto deseado. Estos agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Los agentes policatiónicos pueden usarse para suministrar ácidos nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, subcutánea, etc.

Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos incluyen, histonas, protaminas, albúmina de suero humano, proteínas de unión al ADN, proteínas cromosómicas no histona, proteínas de la cubierta de virus de ADN, tales como (X147, los factores transcripcionales también contienen dominios que se unen al ADN y por lo tanto también pueden ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. En resumen, los factores transcripcionales tales como CICEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que se unen a las secuencias de ADN.

Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y putrescina.

Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico pueden extrapolarse de la lista anterior, para construir otros agentes policatiónicos polipéptídicos o para producir agentes policatiónicos sintéticos.

Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles incluyen por ejemplo DEAE-dextrano, polibreno, Lipofectin^{TM}, y lipofectAMINE^{TM} que son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos/polipéptidos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Análisis de inmunotransferencia de sueros de ratones y humanos. Los TOSV purificados se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y reaccionaron con anticuerpos. Pista 1, suero de ratón específico de TOSV; pista 2, suero de ratón negativo para TOSV; pista 3, suero positivo para TOSV humano; pista 4 suero negativo para TOSV humano.

Figura 2. (A) Inmunoprecipitación de extractos citoplasmáticos de células infectadas por TOSV (pistas 2 y 4) o células infectadas por simulacro (pistas 1 y 3) con sueros de ratón. Pistas 1-2, suero de ratón específico para proteína N; pistas 3 y 4 suero de ratón positivo para TOSV; (B) Inmunoprecipitación de extractos citoplasmáticos de células infectadas por TOSV (pistas 1 y 2) o células infectadas por simulacro (pistas 3 y 4) con sueros humanos. Pista 1-3, suero humano positivo para TOSV extraído durante una fase aguda de la enfermedad; pistas 2 y 4, suero humano positivo para TOSV extraído del mismo sujeto después de 1 año.

Modos para realizar la invención

Los ejemplos se diseñaron para identificar la naturaleza de anticuerpos producidos con la proteína N de TOSV en ratones y para establecer una correlación con los anticuerpos producidos en seres humanos mediante infección natural. Se usaron tres antígenos: virus completo, la preparación de la nucleocápsida y una preparación de la proteína N de TOSV expresada en E. coli.

Preparación de antígenos

El virus purificado se resuspendió en Nonidet P-40 y se estratificó en una solución de sacarosa al 20% y se centrifugó a 75.000 g durante 3 horas. El sedimiento que contenía la nucleocápsida se resuspendió en tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, pH 7,8). El ARN de TOSV se purificó como en el antecedente 21 y se sometió a RT-PCR. La región correspondiente la gen de la proteína N (nt 40-800) se clonó en el sitio BamHI del plásmido pET15b (Novagen) (19). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía de afinidad y se caracterizó mediante SDS-PAGE.

Inmunizaciones

Tres grupos de animales, cada uno conteniendo cinco ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad (Charles Rivers), se inmunizaron por vía intramuscular cuatro veces a intervalos de 15 días con 100 \mug/dosis de antígeno constituido por (I) preparación del virus completo (ii) proteína de la nucleocápsida de TOSV purificada (iii) proteína R N recombinante. Un grupo de control negativo se inyectó con células infectadas por simulacro. Diez días después de la última inmunización, los animales se sacrificaron y los sueros se ensayaron mediante ensayos serológicos.

Ensayos

Como ya se ha mostrado (17), la inmunotransferencia (IB) junto con el ELISA se consideró el ensayo de elección para la infección de TOSV por serodiagnóstico. Se ensayó mediante ELISA la presencia de anticuerpos específicos anti-TOSV en sueros extraídos de ratones, usando el virus purificado como antígeno (17, 19). Todos los sueros ensayados, excepto los controles negativos, mostraron titulaciones de anticuerpo detectables de aproximadamente > 1/6000. Mediante análisis de IB, los sueros de ratones inmunizados con TOSV completos reaccionaron fuertemente con la proteína N y reaccionaron débilmente con las glicoproteínas G1 y G2 (Figura 1). Del mismo modo, un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mostró la presencia de anticuerpos contra las tres proteínas estructurales principales, N, G1 y G2 (Figura 2A). Por el contrario, diez sueros humanos que previamente se habían clasificado como positivos para TOSV mediante ELISA mostraron reactividad con la proteína N mediante IB pero no contra las proteínas G1 y G2 (Figura 1). Se sabe que G1 es sensible al calor (5), pero los experimentos de electroforesis realizados con las muestras hervidas o tratadas con calor a 37ºC dieron los mismos resultados. Tres de los sueros humanos también se ensayaron mediante RIPA para verificar si tenían anticuerpos anti-G1 y/o anti-G2. Los sueros positivos humanos mostraron una fuerte reactividad con la proteína N y también reaccionaron con las proteínas G1 y/o G2. No fue posible identificar de forma inequívoca el componente de la proteína G con el que reaccionaron los anticuerpos, ya que las dos glicoproteínas tenían una movilidad electroforética idéntica en SDS-PAGE al 12% (Figura 2B).

Los ensayos de neutralización por reducción en placas (PRNT) (4) mostraron que todos los sueros de ratón tenía un título de 1/16 contra TOSV. Dos muestras de suero humano emparejadas extraídas del mismo paciente durante la fase aguda de la enfermedad y después de 12 meses, se ensayaron mediante ELISA, inmunoprecipitación y PRNT con TOSV. El suero convaleciente mostró una disminución en las reactividades de anticuerpos contra TOSV y la proteína N recombinante mediante ELISA, pero las dos muestras mostraron unos títulos de anticuerpos neutralizadores similares (Tabla 1). La inmunoprecipitación realizada usando dos sueros, diluidos para conseguir una titulación de anticuerpos de TOSV idéntica, mostraron que el segundo suero tenía un título bajo de anticuerpos específicos para N, en comparación con el primero, pero los niveles de anticuerpo G1-G2 no cambiaron (Figura 2B). El RIPA confirmó los resultados de ELISA realizado con el virus completo y la proteína N, sugiriendo que la reactividad anti-N disminuye con el tiempo, mientras que los anticuerpos anti-G1-G2 y el anticuerpo neutralizador permanecen sin cambios (Tabla 1).

TABLA 1 Cambios a lo largo del tiempo en los niveles de anticuerpo anti-TOSV en muestras de suero humano

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Conclusiones

La razón de que solamente el suero de ratón anti-TOSV mostrara mala reactividad para las proteínas G1 y G2 mediante IB podría deberse al hecho de que los animales se inmunizaron con una vía de infección diferente, los antígenos de la envuelta podrían haberse procesado de manera diferente de la que se produce durante la infección natural. Además, las glicoproteínas de la envuelta contienen en su mayor parte epítopos conformacionales que pueden haberse destruido o desnaturalizado y que podrían identificarse mediante inmunoprecipitación. No había diferencias en los títulos de anticuerpo neutralizador entre los sueros obtenidos de ratones inmunizados con todo el virus y los inmunizados con las nucleocápsidas purificadas o con la nucleoproteína recombinante.

Parece que los anticuerpos neutralizadores de TOSV se generan en su mayoría contra las glicoproteínas de la envuelta aunque, curiosamente, también se genera una respuesta inmune potente contra la proteína N en animales infectados con el virus, que poseen una actividad neutralizadora parcial in vitro. Se sabe que otros antígenos del núcleo viral, tales como la proteína de la nucleocápsida (NP) del virus de la gripe (22) o la proteína N del virus de la rabia (6, 11) pueden otorgar protección contra la enfermedad mediante inmunidad mediada por células, pero la proteína N de TOSV es el primer ejemplo de un antígeno del virus interno capaz de inducir una respuesta inmune humoral que podría producir anticuerpos con potencial neutralizador. De este modo, las glicoproteínas de la envuelta no son las únicas proteínas que contienen epítopos neutralizadores importantes, ya que la inmunización de ratones muestra que la proteína N de TOSV también puede inducir anticuerpos neutralizadores.

Bibliografía

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22. Wraith y col. (1987) J. Gen. Virol. 68: 433-440.

Claims

1. Una nucleoproteína de virus Toscana (proteína N), para su uso para provocar una respuesta humoral neutralizadora contra infección por virus Toscana.

2. Un ácido nucleico que codifica nucleoproteína de virus Toscana (proteína N), para su uso para provocar una respuesta humoral neutralizadora contra infección por virus Toscana.

3. Una nucleoproteína o ácido nucleico de virus Toscana, en el que el uso comprende además administrar proteínas del virus, seleccionadas entre el grupo constituido por proteína no estructural (proteína NS), glicoproteína de la envuelta G1, glicoproteína de la envuelta G2 o polimerasa del virus.

4. Una nucleoproteína o ácido nucleico de virus Toscana según la reivindicación 3, en la que la una o más proteínas de virus Toscana adicionales es la glicoproteína de la envuelta G2.

5. Una nucleoproteína o ácido nucleico de virus Toscana según cualquier reivindicación anterior, que es una vacuna.

6. Uso de una nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infección por virus Toscana.

7. Uso de un ácido nucleico que codifica nucleoproteína de virus Toscana (proteína N) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infección por virus Toscana.

8. Uso según la reivindicación 6 la reivindicación 7, en el que dicho medicamento comprende además una o más proteínas de virus Toscana adicionales seleccionadas entre el grupo constituido por proteína no estructural (proteína NS), glicoproteína de la envuelta G1, glicoproteína de la envuelta G2 o polimerasa del virus.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la proteína de virus Toscana adicional es glicoproteína de la envuelta G2.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho medicamento es una vacuna.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que dicho medicamento provoca una respuesta humoral inmune.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la respuesta humoral es una respuesta neutralizadora.