PT1237571E

PT1237571E - Nucleoproteína do vírus toscana

Info

Publication number: PT1237571E
Application number: PT00987600T
Authority: PT
Inventors: Maria Grazia Cusi
Original assignee: Univ Siena
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2007-12-31
Also published as: EP1237571B1; GB9929783D0; AU2390101A; CY1107607T1; ATE374040T1; WO2001044288A3; EP1237571A2; DK1237571T3; WO2001044288A2; DE60036563D1; DE60036563T2; ES2293934T3

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "NUCLEOPROTEINA DO VÍRUS TOSCANA"

Campo técnico

Este invento relaciona-se com a nucleoproteina do virus Toscana e com as aplicações médicas da mesma, tal como a vacinação.

Antecedentes do invento 0 virus Toscana (TOSV) pertence à família Bunyaviridae, género Phlebovirus. Sabe-se que a infecção por TOSV causa meningite e meningoencefalite e é endémica na zona do Mediterrâneo, tal como indicam os estudos em residentes (12, 18, 20) e os relatórios de casos de infecção em turistas (15, 16) . O vírus com envelope possui um genoma de RNA segmentado consistindo em três espécies de RNA circular fechado por ligação não covalente, designados por "pequeno" (S), que codifica para a nucleoproteina (N) e a proteína não estrutural (NS), "médio" (M), que codifica para as glicoproteínas G1 e G2 do envelope, e "grande" (L), que codifica para a polimerase do vírus (1, 3, 9) . De modo similar ao verificado em outros bunyavírus, a quantidade relativa do mRNA S é cerca de dez vezes maior do que a da espécie M de mRNA, e este gradiente pode igualmente observar-se a nível das proteínas, já que a proteína N constitui a proteína mais abundante no virião (13). Não existe vacina contra a infecção por TOSV. 1

Exposição do invento

De modo geral, são os antigénios glicoproteicos do envelope virai que provocam uma resposta humoral protectora (10), e não a proteína do core. De facto, as glicoproteínas localizadas à superfície do virião de bunyavírus funcionam como um local de interacção entre a partícula e a célula hospedeira. Os anticorpos monoclonais contra as glicoproteínas G1 e G2 dos membros da família Bunyaviridae como o vírus Rift Valley (14), o vírus La Crosse (7, 8) ou o vírus Hantaan (2) exibem propriedades de neutralização dos vírus.

Surpreendentemente, no entanto, foi descoberto que os antigénios da proteína do core do TOSV possuem a capacidade de induzir uma resposta humoral protectora, deste modo possibilitando a produção de composições e vacinas imunogénicas incorporando estes antigénios da proteína do core. O invento proporciona uma nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) para uso na estimulação de uma resposta humoral neutralizante contra a infecção pelo vírus Toscana. A nucleoproteína do vírus Toscana poderá encontrar-se sob a forma de uma composição farmacêutica compreendendo a nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os exemplos de excipientes adequados incluem o soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) a, por exemplo, 0,1 M, pH 7,4, NaHC03 a, por exemplo, 0,2 M e outros fluidos fisiologicamente aceitáveis. A proteína N do invento poderá corresponder a uma proteína N recombinante. A proteína N do invento poderá ser utilizada como vacina. O uso da proteína N de acordo com o invento poderá ainda compreender a administração de uma ou mais de entre outras proteínas do TOSV, seleccionadas a partir do grupo que 2 consiste em: proteína não estrutural (proteína NS), glicoproteína G1 do envelope, glicoproteína G2 do envelope ou polimerase virai.

Como alternativa à proteína N do TOSV, o invento proporciona um ácido nucleico codificando para a nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) , para uso na estimulação de uma resposta humoral neutralizante contra a infecção pelo vírus Toscana - o que se designa por "imunização por DNA" [p. ex., Robinson e Torres (1997), Semínars in Inmunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648]. 0 ácido nucleico segundo o invento poderá encontrar-se sob a forma de uma composição. 0 invento proporciona ainda o uso da nucleoproteína N do vírus Toscana (proteína N) no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da infecção pelo vírus Toscana. 0 medicamento corresponde preferencialmente a uma vacina. Esta estimula preferencialmente uma resposta imune humoral contra a infecção por TOSV. De preferência, a resposta imune humoral corresponde a uma resposta imune anti-viral neutralizante.

Deverá apreciar-se que as referências à nucleoproteína de TOSV incluem todas as suas variantes alélicas e mutantes funcionais. 0 termo abrange igualmente proteínas que possuem uma identidade de sequência significativa face à proteína de tipo selvagem. 0 grau de identidade é preferencialmente superior a 50% (p.ex., 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais), e é determinada usando, por exemplo, o algoritmo de pesquisa de homologias de Smith-Waterman, tal como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando uma pesquisa de gaps de afinidade com parâmetros de gap open penalty = 12 e gap extension penalty = 1.0 termo inclui ainda fragmentos imunogénicos destas proteínas. Adicionalmente, o termo inclui proteínas mais longas incorporando a nucleoproteína do TOSV ou suas variantes ou fragmentos (p.ex., 3 uma proteína de fusão). Em qualquer dos casos, no entanto, a proteína (quer seja de tipo selvagem, variante, mutante, fragmento ou de fusão) reterá de modo substancial a imunogenicidade correspondente ao tipo selvagem. Poderão igualmente ser usadas misturas de diferentes nucleoproteínas de TOSV (p.ex., uma mistura de uma nucleoproteína de tipo selvagem e de uma proteína de fusão consistindo em um fragmento imunogénico da nucleoproteína de TOSV de tipo selvagem e um parceiro de fusão).

As proteínas do invento poderão, como é evidente, ser preparadas por diversos métodos (p.ex., expressão recombinante, purificação a partir de cultura celular, síntese química, etc.) e sob variadas formas (p.ex., forma nativa, proteínas de fusão, etc.). As proteínas serão preferencialmente preparadas sob uma forma substancialmente pura ou isolada (i.e., substancialmente isenta de outras proteínas de TOSV ou da célula hospedeira).

Segue-se um resumo das técnicas e procedimentos padronizados que poderão ser utilizados para colocar em prática o invento (p.ex., para utilizar as proteínas com fins de vacinação). Este resumo não pretende limitar o âmbito do invento, servindo apenas para apresentar, de modo não vinculativo, exemplos que poderão ser seguidos.

Generalidades A colocação em prática do presente invento utilizará, ao não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, as quais são bem conhecidas neste campo técnico. Tais técnicas encontram-se descritas em detalhe na literatura [p.ex., Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (ed. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (ed. Gait, 1984); Nucleic Acid 4

Hybridization (eds. Hames & Higgins, 1984); Transcription and Translation (eds. Hames & Higgins, 1984); Animal Cell Culture (ed. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), especialmente os volumes 154 e 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (eds. Miller e Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer e Walker, eds. (1987), ImmunoChemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987), Protein Purification: Principies and Practice, 2a Ed. (Springer-Verlag, N.Y.), e Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (eds. Weir e Blackwell, 1986)].

Serão usadas nesta especificação as abreviaturas convencionais para designação de nucleótidos e aminoácidos.

Definições

Uma composição contendo X encontra-se "substancialmente isenta de" Y quando pelo menos 85% em peso do total de X + Y na composição corresponde a X. De preferência, X compreende pelo menos cerca de 90% em peso do total de X + Y na composição, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% ou até 99% em peso. O termo "compreendendo" abrange os termos "incluindo" e "consistindo em"; p.ex., uma composição "compreendendo" X poderá consistir exclusivamente em X ou poderá incluir um componente adicional, p.ex., X + Y. O termo "heterólogo" refere-se a dois componentes biológicos que não são encontrados juntos na natureza. Os componentes poderão corresponder a células hospedeiras, genes ou regiões reguladoras, tais como promotores. Apesar de os componentes heterólogos não se encontrarem juntos na natureza, estes poderão funcionar em conjunto, tal como acontece quando 5 um promotor heterólogo relativamente a um gene se encontra ligado de modo operativo a esse gene. Outro exemplo é dado por uma sequência de TOSV que é heteróloga relativamente a uma célula hospedeira de ratinho. Outro exemplo de componentes heterólogos será o de dois epitopos da mesma proteína ou de proteínas diferentes que tenham sido reunidos numa só proteína segundo uma disposição não encontrada na natureza.

Uma "origem de replicação" corresponde a uma sequência polinucleotídica que inicia e regula a replicação de polinucleótidos, tal como um vector de expressão. A origem de replicação comporta-se como uma unidade autónoma de replicação polinucleotídica no interior de uma célula, tendo a capacidade de se replicar sob o seu próprio controlo. Poderá ser necessária a existência de uma origem de replicação para que um vector se replique numa determinada célula hospedeira. Com certas origens de replicação, um vector de expressão poderá reproduzir-se até um elevado número de cópias se as proteínas apropriadas se encontrarem presentes no interior da célula. Como exemplos de origens de replicação encontram-se as sequências de replicação autónoma, as quais são eficazes em leveduras; e o antigénio T virai, o qual é eficaz nas células COS-7 .

Uma sequência "mutante" é definida como uma sequência de DNA, RNA ou aminoácidos que seja distinta de, mas possua uma identidade de sequência com, a sequência nativa ou apresentada. Tal como aqui é usado, o termo "variante alélica" de uma molécula, ou região, de ácido nucleico para a qual é aqui apresentada a sequência de ácido nucleico corresponde a uma molécula, ou região, de ácido nucleico que ocorre essencialmente no mesmo locus do genoma de um outro ou segundo isolado, e que, devido à variação natural causada por, por exemplo, mutação ou recombinação, apresenta uma sequência de ácido nucleico que é semelhante mas não idêntica. Uma variante 6 alélica de uma sequência codificante codifica tipicamente para uma proteína que possui uma actividade semelhante à da proteína codificada pelo gene com o qual se compara a variante. Uma variante alélica poderá igualmente compreender uma alteração nas regiões 5' ou 3' não traduzidas do gene, tais como as regiões reguladoras de controlo (ver, p.ex., a Patente dos EUA N° 5.753.235).

Sistemas de expressão

As sequências nucleotídicas poderão ser expressas em uma variedade de sistemas de expressão diferentes; por exemplo, os usados com células de mamífero, baculovírus, plantas, bactérias e leveduras. i. Sistemas de Mamíferos

Os sistemas de expressão de mamíferos são bem conhecidos neste campo técnico. Um promotor de mamífero corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RN A polimerase de mamífero e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição, que geralmente está colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante, e uma TATA box, geralmente localizada 25-30 pares de bases (pb) a montante do local de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box dirija a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no local correcto. Um promotor de mamífero conterá igualmente um elemento promotor a montante, geralmente localizado entre 100 a 200 pb a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a rapidez à qual se inicia a transcrição e pode actuar em ambas as orientações [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned 7

Genes in Mammalian Cells", em Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a ed. ] .

Os genes de vírus que infectam mamíferos são frequentemente expressos em frequência elevada e possuem uma larga variedade de hospedeiros; assim, as sequências que codificam para genes de vírus que infectam mamíferos constituem sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos destes promotores encontram-se o promotor precoce de SV40, o promotor LTR virai do tumor mamário de ratinho, o promotor principal tardio de adenovírus (Ad MLP) e o promotor do vírus herpes simplex. Adicionalmente, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotioneína murino, proporcionam igualmente sequências promotoras úteis. A expressão poderá ser constitutiva ou regulada (indutível), dependendo de o promotor ser ou não susceptível de indução com glucocorticóides em células hormono-responsivas. A presença de um elemento enhancer, combinado com os elementos promotores acima descritos, aumentará geralmente os níveis de expressão. Um enhancer é uma sequência reguladora de DNA que tem a capacidade de estimular a transcrição em até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, sendo a síntese iniciada no local normal de iniciação do RNA. Os enhancers são igualmente activos quando colocados a montante ou a jusante do local de iniciação da transcrição, na orientação normal ou invertida, ou a uma distância de mais do que 1000 nucleótidos de afastamento do promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1231; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2a ed.] . Os elementos enhancer derivados de vírus poderão ser

particularmente úteis, uma vez que estes possuem geralmente uma gama mais alargada de hospedeiros. Os exemplos incluem o enhancer do gene precoce de SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO 8 J. 4:761] e o enhancer/promotores derivados da longa sequência repetitiva terminal (LTR) do virus de sarcoma Rous [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sei. 79:6777] e do citomegalovirus humano [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, alguns enhancers são reguláveis e tornam-se activos apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona ou um ião metálico [Sassone-Corsi e Borelli (1986) Trends Genet 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1231].

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em células de mamíferos. Uma sequência promotora poderá encontrar-se directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a extremidade N será removida da proteína por incubação in vitro_com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão também ser secretadas pela célula para o meio de cultura através da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha em células de mamífero. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. 0 fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. 0 leader tripartido de adenovírus constitui um exemplo de uma sequência leader que proporciona a secreção de uma proteína estranha por células de mamífero.

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação que são reconhecidas pelas células de mamíferos correspondem a regiões reguladoras localizadas a 3' 9 relativamente ao codão de paragem da tradução, que deste modo flanqueiam, juntamente com os elementos promotores, a sequência codificante. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada, após a transcrição, por corte e poliadenilação específicos de local [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot e Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA". Em Transcription and splicing (eds. B.D. Hames e D.M. Glover); Proudfoot (1989), Trends Biochem. Sei. 14:105]. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Como exemplos de terminadores da transcrição/sinais de poliadenilação encontram-se os derivados do SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". Em Molecular Cloning: a Laboratory Manual].

Habitualmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. Se desejado, podem igualmente incluir-se numa construção de expressão enhancers, introns com locais dadores e aceitadores de splice funcionais e sequências leader. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmídeos) que tem a capacidade de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como células de mamíferos ou bactérias. Os sistemas de replicação em mamíferos incluem os derivados de vírus que infectam animais, os quais requerem factores trans-actuantes para a sua replicação. Por exemplo, os plasmídeos contendo os sistemas de replicação de papovavírus, tal como o SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] ou poliomavírus, replicam-se até um número muito elevado de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Como exemplos adicionais de replicons de mamífero encontram-se os derivados do papilomavírus bovino e do vírus de Epstein-Barr. 10

Adicionalmente, o replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, permitindo deste modo a sua manutenção, por exemplo, em células de mamíferos para a expressão e num hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de mamíferos-bactérias incluem o pMT2 [Kaufman et al. (19891 Mol. Cell Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol. 5:1074], O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos da técnica e incluem os processos de transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do DNA nos núcleos.

As linhas celulares de mamífero disponíveis para uso como hospedeiros para expressão são conhecidas neste campo técnico e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas de modo não limitativo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), e diversas outras linhas celulares. ii. Sistemas de Baculovirus O polinucleótido que codifica para a proteína poderá igualmente ser inserido num vector adequado para expressão em células de insecto, estando ligado de modo operativo aos elementos de controlo que se encontram nesse vector. A construção de vectores utiliza técnicas conhecidas neste campo. Geralmente, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, geralmente um plasmídeo 11 bacteriano, que contém um fragmento de genoma do baculovírus e um local de restrição conveniente para inserção no gene ou genes heterólogo (s) a ser expresso (s); um baculovírus de tipo selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento específico de baculovírus no vector de transferência (tal permite a recombinação homóloga do gene heterólogo com o genoma do baculovírus); e as células hospedeiras de insecto e meios de cultura apropriados.

Após a inserção da sequência de DNA que codifica para a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem são transfectados numa célula hospedeira de insecto, na qual se dá a recombinação do vector e do genoma virai. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos usados para os sistemas de expressão de baculovírus/células de insecto encontram-se comercialmente disponíveis sob a forma de kit, que, entre outras possibilidades, é fornecido pela empresa Invitrogen, San Diego, CA (kit "MaxBac") . Estas técnicas são geralmente conhecidas dos peritos neste campo e encontram-se descritas em detalhe em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555_(1987) (aqui designado por "Summers e Smith") .

Anteriormente à inserção da sequência de DNA codificando para a proteína no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas numa construção de transcolocação intermédia (vector de transferência). Esta construção poderá conter um único gene e elementos reguladores ligados de modo operativo; múltiplos genes, cada um com o seu próprio conjunto de elementos reguladores ligados de modo operativo; ou múltiplos genes, 12 regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções de transcolocação intermédia são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmídeos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possuirá um sistema de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais vulgarmente usado para a introdução de genes estranhos no AcNPV é o pAc373. Têm igualmente sido concebidos muitos outros vectores já conhecidos dos peritos da técnica. Estes incluem, por exemplo, o pVL985 (que altera o codão de iniciação da polihedrina de ATG para ATT, e que introduz um local de clonagem para BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT; ver Luckow e Summers, Virology (1989) 17:31. 0 plasmideo geralmente contém também o sinal de poliadenilação da polihedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:111) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.

Os vectores de transferência de baculovirus contêm geralmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus corresponde a qualquer sequência de DNA com a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase de baculovirus e de iniciar a transcrição a jusante (5' para 3') de uma sequência codificante (p.ex., gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um vector de transferência de baculovirus poderá igualmente 13 conter um segundo domínio designado por enhancer, o qual, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A expressão poderá ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos em períodos tardios num ciclo de infecção virai, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos encontram-se as sequências derivadas do gene que codifica para a proteína do poliedro virai [Friesen et al. (1986), "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", em: The Molecular Blology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publs. EPO nos. 127 839 e 155 476] e o gene codificando para a proteína plO [Vlak et al. (1988), J. Gen. Vírol. 69:765]. 0 DNA codificando para sequências de sinal apropriadas poderá derivar de genes para proteínas secretadas por células de insecto ou por baculovirus, tal como o gene de polihedrina do baculovirus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, uma vez que os sinais para as modificações pós-tradução em células de mamífero (tais como o corte do péptido de sinal, o corte proteolítico e a fosforilação) parecem ser reconhecidos pelas células de insecto, e que os sinais requeridos para a secreção e a acumulação no núcleo parecem igualmente ser conservados entre as células de invertebrados e as células de vertebrados, os leaders que não provêm de insectos, tais como os que derivam de genes codificando para o α-interferão humano (Maeda et al. (1985), Nature 315:592), o péptido humano de libertação da gastrina (Lebacq-Verheyden et al. (1988) Molec. Cell Biol. 8:3129), IL-2 humana (Smith et al. (1985) Proc. Nat'1 Acad. Sei USA 82:8404), IL-3 de ratinho (Miyajima et al. (1987) Gene 58:213), e glucocerebrosidase humana (Martin et al. (1988) DNA 7:99), poderão igualmente ser usados para possibilitar a secreção em insectos. 14

Um polipéptido ou poliproteína recombinante poderá ser expresso intracelularmente ou, se expresso com as sequências reguladoras apropriadas, poderá ser secretado. Uma boa expressão intracelular de proteínas estranhas não fundidas requer geralmente genes heterólogos que idealmente possuam uma curta sequência leader contendo sinais de iniciação da tradução adequados precedendo um sinal de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína madura através da incubação in vítro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as poliproteínas ou proteínas recombinantes que não são naturalmente secretadas poderão ser secretadas pelas células de insecto por meio da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporciona a secreção da proteína estranha em insectos. 0 fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirige a translocação da proteína para o retículo endoplasmático.

Após a inserção da sequência de DNA e/ou do gene codificando para o produto de expressão precursor da proteína, uma célula hospedeira de insecto é co-transformada com o DNA heterólogo do vector de transferência e com o DNA genómico do baculovírus de tipo selvagem - geralmente por co-transfecção. 0 promotor e a sequência de terminação da transcrição desta construção compreenderão geralmente uma secção de 2-5 kb do genoma do baculovírus. Os métodos para a introdução de DNA heterólogo no local desejado do baculovírus são bem conhecidos da técnica (ver Summers e Smith, supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell Bíol. (1983) 3:2156; e Luckow e Summers (1989)) . Por exemplo, a inserção poderá efectuar-se num gene tal como o gene da polihedrina, por recombinação 15 homóloga com crossover duplo; a inserção poderá igualmente dar-se num local de restrição de um enzima construído no gene de baculovírus desejado. Miller et al. (1989) Bioessays 4:9. A sequência de DNA, quando clonada em lugar do gene da polihedrina no vector de expressão, é flanqueada em 5' e em 3' por sequências específicas de polihedrina e está posicionada a jusante do promotor da polihedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recém-formado é subsequentemente empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a uma baixa frequência (entre cerca de 1% e cerca de 5%) ; assim, a maior parte do vírus produzido após a co-transfecção corresponde ainda ao vírus de tipo selvagem. Deste modo, será necessário recorrer a um método de identificação dos vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é a de que uma inspecçâo visual permite a distinção dos vírus recombinantes. A proteína de polihedrina, a qual é produzida pelo vírus nativo, é produzida em níveis muito elevados no núcleo das células infectadas num período tardio após a infecção virai. A proteína de polihedrina acumulada forma corpos de oclusão que contêm também partículas incorporadas. Estes corpos de oclusão, que possuem uma dimensão de até 15 ym, são muito refringentes, o que lhes dá uma aparência bastante brilhante que é facilmente visualizada ao microscópio. As células infectadas com vírus recombinantes não apresentam corpos de oclusão. Para distinguir os vírus recombinantes dos vírus de tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é plaqueado sobre uma monocamada de células de insecto recorrendo a técnicas conhecidas dos peritos neste campo. Nomeadamente, as placas são inspeccionadas ao microscópio para avaliar a presença (indicativa de vírus de tipo selvagem) ou ausência (indicativa de vírus recombinante) de corpos de oclusão. "Current Protocols in Microbiology", Vol.2 (Ausubel et al., eds.) em 16 16.8 (supl. 10, 1990); Summers e Smith, supra; Miller et al. (1989). Têm sido desenvolvidos vectores de expressão recombinantes de baculovirus para a infecção de diversas células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovirus recombinantes para as células de, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al. (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156; e ver, genericamente, Fraser et al. (1989), In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Encontram-se disponíveis no mercado células e meios de cultura celular destinados a expressão directa, e a expressão em produtos de fusão, de polipéptidos heterólogos num sistema de expressão de baculovirus; a tecnologia aplicada à cultura celular encontra-se difundida entre os peritos na técnica. Ver, p.ex., Summers e Smith, supra.

As células de insecto modificadas poderão então ser cultivadas num meio com nutrientes apropriados, o qual permite a manutenção estável do(s) plasmídeo(s) que se encontra(m) presente(s) no hospedeiro de insecto modificado. Quando o gene do produto de expressão se encontra sob controlo indutível, o hospedeiro poderá ser cultivado até uma elevada densidade e a expressão poderá ser induzida. Alternativamente, quando a expressão é constitutiva, o produto será expresso de modo contínuo para o meio e o meio com nutrientes terá de ser continuamente renovado, removendo o produto de interesse e aumentando os nutrientes consumidos. O produto poderá ser purificado por técnicas como a cromatografia, p.ex., HPLC, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, etc.; electroforese; centrifugação em gradiente de densidade; extracção por solvente, ou semelhantes. Quando apropriado, o produto poderá ser purificado de modo mais completo para 17 remover substancialmente todas as proteínas de insecto que sejam igualmente secretadas para o meio ou que resultem da lise das células de insecto, desta forma se obtendo um produto que se encontra pelo menos substancialmente isento de resíduos do hospedeiro, p.ex., proteínas, lípidos e polisacáridos.

De modo a se obter a expressão das proteínas, as células recombinantes do hospedeiro que derivam dos transformantes são incubadas sob condições que possibilitam a expressão da sequência que codifica para a proteína recombinante. Estas condições variam, dependendo da célula de hospedeiro seleccionada. No entanto, as condições são facilmente discerníveis pelos técnicos de perícia média, tomando como base os conhecimentos difundidos neste campo técnico. iii. Sistemas de Plantas São já bem conhecidos neste campo técnico diversos tipos de sistemas de expressão genética em culturas de células de plantas e em plantas inteiras. Como exemplos de sistemas de expressão genética em células de plantas encontram-se os sistemas descritos em patentes como as US 5.693.506, 5.659.122 e 5.608.143. Outros exemplos de expressão genética em culturas de células de plantas foram descritos por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Para além das referências acima apresentadas, poderão encontrar-se descrições de péptidos de sinal de proteínas de plantas em Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Poderá encontrar-se uma descrição da regulação da expressão de genes de plantas pela fito-hormona 18 ácido giberelínico, e da secreção de enzimas induzida pelo ácido giberelínico, em R.L. Jones e J. MacMillin, Giberellins, em: Advanced Plant Physiology, ed. Malcolm B. Wilkins (1984), Pitman Publishing Limited, London, págs. 21-52. Referências que descrevem outros genes de regulação metabólica: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel e Hickey, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:1337-1339 (1987).

Tipicamente, por recurso a técnicas bem conhecidas neste campo, uma sequência polinucleotidica desejada é inserida numa cassette de expressão compreendendo elementos reguladores de genes concebidos para funcionamento em plantas. A cassette de expressão é inserida num vector de expressão desejado juntamente com sequências acompanhantes a montante e a jusante da cassette de expressão adequada para expressão numa planta hospedeira. As sequências acompanhantes terão origem plasmidica ou virai e proporcionam ao vector as caracteristicas necessárias para que este transfira o DNA de um hospedeiro de clonagem original, como uma bactéria, para uma planta hospedeira desejada. A construção básica do vector de bactéria/planta proporcionará preferencialmente uma origem de replicação procariótica para uma larga gama de hospedeiros; um marcador procariótico de selecção; e, para as transformações com Agrobacterium, sequências de DNA T para a transferência mediada por Agrobacterium para os cromossomas da planta. Nos casos em que o gene heterólogo não se encontra facilmente acessivel para detecção, a construção possuirá também, de preferência, um gene para um marcador de selecção apropriado para determinar se uma célula de planta foi transformada. Poderá encontrar-se uma exposição geral sobre marcadores de selecção, por exemplo para os membros da familia da grama, em Wilmink e Dons, 1993, Plant Mol. Bíol. Reptr. 11 (2) :165-185. 19 É igualmente recomendável a presença de sequências adequadas para permitir a integração da sequência heteróloga no genoma da planta. Estas sequências poderão incluir sequências de transposão, e semelhantes, para a recombinação homóloga, assim como sequências Ti que permitem a inserção aleatória de uma cassette heteróloga de expressão num genoma de planta. Os marcadores procarióticos de selecção apropriados incluem a resistência a antibióticos como a ampicilina ou a tetraciclina. Poderão ainda encontrar-se presentes no vector outras sequências de DNA que codifiquem para funções adicionais, tal como previsto neste campo técnico.

As moléculas de ácido nucleico do presente invento poderão ser incluídas numa cassette de expressão de modo a possibilitar a expressão da(s) proteína (s) de interesse. Existirá habitualmente apenas uma cassette de expressão, se bem que a existência de duas ou mais cassettes seja também possível. A cassete de expressão recombinante conterá, para além da sequência que codifica para a proteína heteróloga, os seguintes elementos: uma região promotora, sequências 5' não traduzidas da própria planta, codão de iniciação (dependendo de o gene estrutural se encontrar ou não equipado com este elemento), e uma sequência de terminação da transcrição e da tradução. A presença de locais únicos de restrição enzimática a nível das extremidades 5' e 3' da cassette permitem a fácil inserção num vector pré-existente. A sequência codificante heteróloga poderá corresponder a qualquer das proteínas abrangidas pelo presente invento. A sequência codificando para a proteína de interesse codificará para um péptido de sinal que permita o processamento e translocação da proteína, segundo apropriado, e não conterá, em geral, qualquer sequência que possa resultar na ligação da proteína do invento desejada a uma membrana. Uma vez que, na sua maior parte, a região de iniciação da transcrição dirá 20 respeito a um gene que é expresso e translocado durante a germinação, ao se utilizar o péptido de sinal que proporciona a translocação será igualmente proporcionada a translocação da proteína de interesse. Deste modo, a(s) proteína (s) de interesse serão translocadas para o exterior das células nas quais são expressas e poderão ser facilmente recolhidas. Tipicamente, as sementes secretam as proteínas através do aleurónio ou da camada escutelar do epitélio para o endosperma da semente. Apesar de não ser necessário que a secreção da proteína se processe para o exterior das células em que a proteína é produzida, tal facilita o isolamento e purificação da proteína recombinante.

Uma vez que a expressão final do produto genético desejado ocorrerá numa célula eucariótica, será desejável determinar se qualquer porção do gene clonado contém sequências que serão processadas como introns pelo equipamento de splicing do hospedeiro. Em caso afirmativo, poderá efectuar-se a mutagénese dirigida da região de "intron" para evitar que se perca uma porção da mensagem genética sob a forma de falso código de intron. Reed e Maniatis, Cell 41:95-105, 1985. O vector poderá ser microinjectado directamente nas células da planta, utilizando micropipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet. 202:179-185, 1985. O material genético poderá igualmente ser transferido para a célula utilizando polietilenoglicol; Krens et al., Nature, 296, 12-1 A, 1982. Outro método de introdução de segmentos de ácido nucleico consiste na penetração balística a alta velocidade por meio de pequenas partículas que transportam o ácido nucleico no interior da matriz de pequenas esferas ou partículas ou à sua superfície; Klein et al., Nature, 327, 70-73, 1987 e Knudsen e Muller, 1991, Planta, 185:330-336, expõem o bombardeamento por partículas do endosperma de cevada para criar cevada transgénica. Outro 21 método de introdução possível seria a fusão de protoplastos com outros elementos, como mini-células, células, lisossomas ou outros corpos de superfície lipídica fundíveis; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 1859-1863, 1982. 0 vector poderá ainda ser introduzido nas células da planta por electroporação (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985). Nesta técnica, os protoplastos da planta são electroporados na presença de plasmídeos que contêm a construção genética. As biomembranas são reversivelmente permeabilizadas por impulsos eléctricos de elevada força de campo, deste modo possibilitando a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos electroporados da planta reconstroem a parede celular, dividem-se e formam o calo vegetal.

Todas as plantas a partir das quais é possível isolar e cultivar protoplastos para fornecer plantas inteiras regeneradas poderão ser transformadas por meio do presente invento de modo a se recuperarem plantas completas que contenham o gene transferido. Sabe-se já que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos cultivados, incluindo, de modo não limitativo, todas as espécies principais de cana-do-açúcar, beterraba sacarina, algodão, árvores de fruto e outras árvores, legumes e vegetais hortícolas. Algumas das plantas apropriadas incluem, por exemplo, espécies pertencentes aos géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaaliã, Glycine, Lolium, Zea, Tríticum e Sorghum. 22

Os meios para regeneração variam consoante a espécie de planta considerada, mas em geral é fornecida em primeiro lugar uma suspensão de protoplastos transformados contendo cópias do gene heterólogo. É formado o tecido do calo, podendo induzir-se a formação de rebentos a partir do calo, os quais são subsequentemente enraizados. Alternativamente, a formação do embrião poderá ser induzida a partir da suspensão de protoplastos. Estes embriões germinam sob a forma de embriões naturais para formar plantas. 0 meio de cultura conterá geralmente vários aminoácidos e hormonas, tais como auxina e citocininas. Será também vantajosa a adição de ácido glutâmico e de prolina ao meio, especialmente para as espécies como o milho e a alfafa. Os rebentos e as raízes desenvolvem-se normalmente em simultâneo. A eficiência da regeneração dependerá do meio, do genotipo e da história da cultura. Se estas três variáveis forem controladas, a regeneração processar-se-á com reprodutibilidade e repetibilidade completas.

Em alguns sistemas de cultura de células de plantas, a proteína do invento desejada poderá ser excretada ou, alternativamente, a proteína poderá ser extraída a partir da planta inteira. Quando a proteína do invento desejada é secretada para o meio de cultura, esta poderá ser recolhida. Alternativamente, os embriões e a porção anembrionada das sementes, ou outros tecidos da planta, poderão ser submetidos a ruptura mecânica para permitir a libertação de qualquer proteína secretada presente entre as células e os tecidos. A mistura poderá ser suspensa numa solução-tampão para se obterem as proteínas em forma solúvel. Serão então utilizados métodos convencionais de isolamento e purificação de proteínas para purificar a proteína recombinante. Os parâmetros de tempo, temperatura, pH, oxigénio e volumes serão ajustados, 23 recorrendo a procedimentos de rotina, para optimizar a expressão e a recuperação da proteína heteróloga. iv. Sistemas Bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são já conhecidas da técnica. Um promotor bacteriano corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição que geralmente se encontra colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por operador, que se poderá sobrepor a um local adjacente de ligação à RNA polimerase a nível do qual tem início a síntese de RNA. 0 operador permite uma transcrição negativamente regulada (indutível), já que uma proteína repressora de um gene se poderá ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição deste gene específico. A expressão constitutiva poderá ocorrer na ausência de elementos de regulação negativa, tal como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva poderá ser atingida por meio de uma sequência de ligação a uma proteína activadora do gene, a qual, quando presente, se encontra geralmente em posição proximal (5') relativamente à sequência de ligação à RNA polimerase. Como exemplo de uma proteína activadora de gene encontra-se a proteína activadora de catabolitos (CAP), a qual ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. A expressão poderá deste modo 24 sofrer uma regulação positiva ou negativa, deste modo se acentuando ou reduzindo a transcrição.

As sequências que codificam para enzimas de vias metabólicas fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos destas sequências incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares tais como a galactose, a lactose (iac) [Chang et ai. (1977) Nature 198:1056] e a maltose. Outros exemplos incluem as sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas como o triptofano (trp) [Goeddel et ai. (1980) Nucl. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981)_Nucl. Acids Res. 9:731;

Patente dos EUA N° 4.738.921; EP-A-0036776 e EP-A-0121775] . O sistema promotor da beta-lactamase (bla) [Weissman (1981) "The cloning of interferon and other mistakes", em Interferon 3 (ed. I. Grosser)] e os sistemas promotores do bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] e do T5 [Patente dos EUA N° 4.689.406] proporcionam igualmente sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam também como promotores em bactérias. Por exemplo, as sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago poderão ser reunidas com as sequências de operão de outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor sintético híbrido [Patente dos EUA N° 4.551.433]. Por exemplo, o promotor tac corresponde a um promotor híbrido trp-lac, composto pelo promotor trp e pelas sequências do operão lac, que é regulado pelo repressor lac [Amann et al. (1983) Gene 25^161; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21]. Ainda, um promotor bacteriano poderá incluir promotores de ocorrência natural com origem não bacteriana que possuam a capacidade de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de ocorrência natural e de origem não 25 bacteriana poderá igualmente ser acoplado a uma RNA polimerase compatível para produzir elevados níveis de expressão de alguns genes em procariotas. 0 sistema de RNA polimerase de bacteriófago T7/promotor constitui um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei 82:1074]. Adicionalmente, um promotor híbrido poderá igualmente ser composto por um promotor de bacteriófago e por uma região operadora de E. colí (EPO-A-0267 851).

Para além de uma sequência promotora funcional, a presença de um local eficiente de ligação ao ribossoma é também útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. colí, o local de ligação ao ribossoma é designado por sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de extensão localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Pensa-se que a sequência SD promova a ligação do mRNA ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do rRNA 16S de E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Acerca da expressão de genes eucarióticos e genes procarióticos com um fraco local de ligação ao ribossoma, ver Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli", em "Molecular Cloning: a Laboratory Manual".

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in 26 vitro com brometo de cianogénio ou por incubação in vivo ou in vitro com uma metionina N-terminal peptidase bacteriana (EPO-A-0219 237).

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, a construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene celular do bacteriófago lambda poderá ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e expresso em bactérias. A proteína de fusão resultante retém de preferência um local para uma enzima de processamento (factor Xa) , para o corte da proteína de bacteriófago a partir da proteína estranha [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. As proteínas de fusão poderão igualmente ser produzidas a partir de sequências dos genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:191], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], e Chey [EP-A-0 324 647]. A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não codificar para um local susceptível de corte. Outro exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698] .

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula através da criação de moléculas quiméricas de DNA que codificam para uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de uma sequência de péptido 27 de sinal que proporciona a secreção da proteína estranha em bactérias [Patente dos EUA N° 4.336.336]. 0 fragmento de sequência de sinal codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína a partir da célula. A proteína poderá ser secretada para o meio de crescimento (bactérias gram- positivas) ou para o espaço periplásmico, localizado entre as membranas celulares interna e externa (bactérias gram- negativas). Existirão de preferência locais de processamento, que poderão ser cortados in vivo ou in vitro, codificados entre o fragmento de péptido de sinal e o gene estranho. 0 DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes para proteínas bacterianas secretadas, tal como o gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), em Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] e a sequência de sinal da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1212] . Como exemplo adicional, a sequência de sinal do gene da alfa-amilase proveniente de diversas estirpes de Bacillus poderá ser usada para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; EP-A- 0 244 042] .

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por bactérias correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA com cerca de 50 nucleótidos que têm a capacidade de formar estruturas em gancho que auxiliam na terminação da 28 transcrição. Os exemplos destas sequências incluem sequências de terminação de transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tal como o gene trp de E. coli, assim como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, uma sequência de sinal (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex. plasmideos), que tem a capacidade de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possui um sistema de replicação, o que possibilita a sua manutenção num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmideo de baixo número de cópias ou de elevado número de cópias. Um plasmideo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma bacteriano por meio de um vector integrativo.

Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite a integração do vector. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo do vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores integrativos construídos 29 a partir de DNA proveniente de diversas estirpes de Bacillus integram-se no cromossoma de Bacillus (EP-A-0 127 328) . Os vectores integrativos poderão igualmente ser compostos por sequências de bacteriófago ou de transposão.

Geralmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas conterão marcadores de selecção que permitam a selecção das estirpes bacterianas que foram transformadas. Os marcadores de selecção poderão ser expressos pelo hospedeiro bacteriano e poderão incluir genes que tornem a bactéria resistente a antibióticos como a ampicilina, o cloranfenicol, a eritromicina, a kanamicina (neomicina) e a tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469] .

Os marcadores de selecção poderão igualmente incluir genes biossintéticos, tal como os genes das vias metabólicas da histidina, triptofano e leucina.

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação.

Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes bactérias, entre outras: Bacillus subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183;

Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; E-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 e EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; 30

Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [Patente dos EUA N° 4.745.056] .

Os métodos para a introdução de DNA exógeno em hospedeiros bacterianos são bem conhecidos neste campo técnico e incluem geralmente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou com outros agentes, tal como catiões divalentes e DMSO. O DNA poderá também ser introduzido nas células bacterianas por electroporação. Os procedimentos de transformação variam geralmente com a espécie bacteriana a transformar. Ver, p.ex., [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:213; Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publs. EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 1 72:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6121; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEI-derived plasmids. Em Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia); Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Bíophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:113, Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", em: Streptococcal Genetics (eds. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Congo Biotechnology 1:412, Streptococcus]. 31 v. Expressão em Leveduras

Os sistemas de expressão em leveduras são igualmente familiares aos técnicos de perícia média neste campo. Um promotor de levedura corresponde a qualquer sequência de DNA que possua a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor conterá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase (a "TATA box") e um local de iniciação da transcrição. 0 promotor de levedura poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por sequência activadora a montante (UAS), que, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (indutível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada poderá ser positiva ou negativa, ou seja, a transcrição poderá ser aumentada ou reduzida.

Uma levedura é um organismo fermentativo com uma via metabólica activa, pelo que as sequências que codifiquem para enzimas da via metabólica constituirão sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos destas enzimas encontram-se a álcool desidrogenase (ADH) (EP-A-0 284 044), enolase, glucoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvatoquinase (PyK) (Publ. EPO-A-0 329 203). O gene PH05 de levedura, codificando para a fosfatase ácida, proporciona igualmente sequências promotoras úteis [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1]. 32

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza poderão também funcionar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências UAS de um promotor de levedura poderão ser reunidas com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando-se um promotor híbrido sintético. Os exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora da ADH ligada à região de activação da transcrição da GAP (Patentes dos EUA Nos. 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que correspondem às sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PH05, combinadas com a região de activação da transcrição de um gene de uma enzima glicolítica como a GAP ou a PyK (EP- -A-0 164 556) . Adicionalmente, um promotor de levedura poderá incluir promotores de ocorrência natural não derivados de leveduras que possuam a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição.

Os exemplos de tais promotores incluem, entre outros, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Current Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic

Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisae", em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercer-Au-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109] .

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em leveduras. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido localizado na extremidade N-terminal da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na 33 extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa aos sistemas de expressão em leveduras, assim como aos sistemas de expressão em mamíferos, baculovírus e bactérias. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) humana ou de levedura poderá ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e expresso em leveduras. A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não conter um local susceptível de corte. Ver, p.ex., a EP-A-0 196 056. Um exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa (ver, p.ex., WO 88/024066).

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula para o meio de cultura, recorrendo à criação de moléculas quiméricas de DNA que codifiquem para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha pela levedura. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. O fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. 34 0 DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes de proteínas secretadas por leveduras, tal como o gene da invertase de levedura (EP-A-0 012 873; JPO 62.096.086) e o gene do factor A de levedura (Patente dos EUA N° 4.588.684). Alternativamente, existem leaders não derivados de leveduras, tal como um leader de interferão, que proporcionam igualmente a secreção por leveduras (EP-A-0 060 057) . É particularmente preferida uma classe de leaders de secreção que utilizam um fragmento do gene do factor alfa de levedura, o qual contém tanto uma sequência de sinal "pré" como uma região "pró". Os tipos de fragmentos de factor alfa que podem ser utilizados incluem o leader de factor alfa pré-pró de extensão completa (com cerca de 83 resíduos de aminoácidos) assim como leaders de factor alfa truncados (geralmente com cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos) (Patentes dos EUA Nos. 4.546.083 e 4.870.008; EP-A-0 324 274). Outros leaders que utilizam um fragmento do leader de factor alfa para proporcionar a secreção incluem leaders híbridos de factor alfa construídos com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas uma pró-região proveniente de um segundo factor alfa de levedura (ver, p.ex., WO 89/02463).

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por leveduras correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que poderá ser traduzido para o polipéptido que é codificado pelo DNA. Existem diversos exemplos de sequências terminadoras da transcrição e de outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, tais como as que codificam para enzimas glicolíticas. 35

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmideos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma levedura ou bactéria. 0 replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção, por exemplo, numa levedura para a expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de levedura-bactéria incluem o YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA 81:4642-4646] e YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmideo de elevado número de cópias ou de baixo número de cópias. Um plasmideo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro. Ver, p.ex., Brake et al., supra.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma de levedura através de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma de levedura que permite a integração do vector, e de preferência contêm duas sequências homólogas flanqueando a construção de expressão. As 36 integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma da levedura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vector integrativo poderá ser dirigido para um locus especifico na levedura através da selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al., supra. Um ou mais construções de expressão poderão sofrer integração, possivelmente afectando os niveis de proteína recombinante produzidos [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6750)]. As sequências cromossómicas incluídas no vector poderão ocorrer sob a forma de um único segmento no vector, o que resulta na integração do vector completo, ou de dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando a construção de expressão no vector, o que poderá resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.

Usualmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas poderão conter marcadores de selecção que permitam a selecção das estirpes de leveduras que foram transformadas. Os marcadores de selecção poderão incluir genes biossintéticos que podem ser expressos no hospedeiro de levedura, tal como os genes ADE2, HIS4, LEU2, TRPl e ALG7, e o gene de resistência a G418, que conferem resistência em células de leveduras à tunicamicina e a G418, respectivamente. Adicionalmente, um marcador de selecção apropriado poderá igualmente conferir à levedura a capacidade de se desenvolver na presença de compostos tóxicos, como metais. Por exemplo, a presença de CUP1 permite à levedura crescer na presença de iões de cobre [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação. Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção 37 que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de leveduras. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes leveduras, entre outras: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Bíol. 6:142], Candida maltosa [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbíol. 25:141], Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbíol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbíol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 523316; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse (1981) Nature 3002106] e Yarrowia lipolytica [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Os métodos para introdução de DNA exógeno em hospedeiros de levedura são bem conhecidos neste campo técnico, e incluem geralmente a transformação de esferoplastos, ou de células de levedura intactas, com tratamento por catiões alcalinos. Os procedimentos de transformação variam geralmente segundo a espécie de levedura a ser transformada. Ver, p.ex., [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbíol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbíol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. 38

Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165;

Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces] ; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163; Saccharomyces]; [Beach e Nurse (1981) Nature 300:106; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas compreenderão tipicamente uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui é usado, refere-se a uma quantidade de agente terapêutico que trata, melhora ou previne uma doença ou estado para os quais se deseja o efeito terapêutico, ou que exibe um efeito terapêutico ou profiláctico detectável. O efeito poderá ser detectado através de, por exemplo, marcadores químicos ou concentrações de antigénio. Os efeitos terapêuticos incluem igualmente a redução dos sintomas físicos, tal como a redução da temperatura corporal. A quantidade eficaz precisa a utilizar num indivíduo dependerá da massa corporal do indivíduo e do seu estado de saúde, da natureza e gravidade do estado e da terapêutica ou combinação de terapêuticas que foram seleccionadas para administração. Assim, não será útil especificar antecipadamente uma quantidade eficaz exacta. No entanto, a quantidade eficaz para uma dada situação poderá ser determinada através de experimentação de rotina e será decidida pelo clínico. 39

Uma composição farmacêutica poderá igualmente incluir um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 termo "veiculo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veiculo para administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ou polipéptidos, genes e outros agentes terapêuticos. 0 termo abrange qualquer veiculo farmacêutico que não induza por si mesmo a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição, e que possa ser administrado sem dai resultar uma toxicidade indevida. Os veículos adequados poderão corresponder a macromoléculas grandes de metabolização lenta, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inactivas. Tais veículos são bem conhecidos dos técnicos de perícia média neste campo.

Poderão utilizar-se sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e os sais de ácidos orgânicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Encontra-se disponível uma exposição detalhada dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis em Remington's Farmaceutical Sciences (Mack Publ. Co., N.J., 1991) .

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis que se encontram presentes em composições terapêuticas poderão conter líquidos como a água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Adicionalmente, poderão encontrar-se presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponadoras de pH e semelhantes. Tipicamente, as composições terapêuticas são preparadas sob a forma de injectáveis, em soluções ou suspensões líquidas; poderão igualmente preparar-se formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos 40 líquidos antes da injecção. Os lipossomas são incluídos no âmbito da definição de um veículo farmaceuticamente aceitável. Métodos de Administração

Uma vez formuladas, as composições do presente invento poderão ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos a tratar poderão ser animais e, em particular, seres humanos. A administração directa das composições será geralmente conseguida através de injecção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou de libertação para o espaço instersticial de um tecido. As composições poderão ainda ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem a administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutâneas (ver, p.ex., WO98/20734), agulhas e pistolas de genes ou hiposprays. A posologia poderá corresponder a um regime de dose única ou a um regime de múltiplas doses.

Vacinas

As vacinas produzidas de acordo com o invento poderão ter fins profilácticos (i.e., de prevenção da infecção) ou terapêuticos (i.e., de tratamento da doença após a infecção).

Estas vacinas compreenderão antigénio(s) imunizante (s), imunogénio (s), polipéptido (s), proteína (s) ou ácido nucleico, geralmente em combinação com "veículos farmaceuticamente aceitáveis", os quais incluem qualquer veículo que não induza por si mesmo a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. Os veículos adequados correspondem tipicamente a macromoléculas grandes de metabolização lenta, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos 41 (tais como gotículas de óleo e lipossomas) e partículas virais inactivas. Tais veículos são bem conhecidos dos técnicos de perícia média neste campo. Adicionalmente, estes veículos poderão funcionar como agentes imunoestimuladores ("adjuvantes"). Ainda, o antigénio ou imunogénio poderá estar conjugado com um toxóide bacteriano, tal como um toxóide de H. pylori ou dos agentes patogénicos da difteria, tétano, cólera, etc.

Os adjuvantes preferidos para acentuar a eficácia da composição incluem, de modo não limitativo: (1) sais de alumínio (alum) tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimuladores específicos tais como muramil-péptidos (ver abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF59® (WO 90/14837; Capítulo 10 em Vaccine Design: the Subunit and Adjuvant Approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press (1995)), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente quantidades diversas de MTP-PE (ver abaixo), se bem que tal não seja necessário), formulado em partículas submicrónicas por meio de um microfluidificador, tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado por plurónico, e thr-MDP (ver abaixo), microfluidizado até uma emulsão submicrónica ou vortexado para gerar uma emulsão com partículas de maior tamanho, e (c) sistema adjuvante RIBI® (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana pertencentes ao grupo que consiste em monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL+CWS (Detox®); (3) adjuvantes de 42 saponinas, tal como o Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) , ou partículas criadas a partir destes, tal como os ISCOMS (complexos imunoestimuladores); (4) Adjuvante

Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (p.ex., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferões (p.ex., interferão gama), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose de tumor (TNF), etc.; e (6) outras substâncias que actuam como agentes imunoestimuladores para aumentar a eficácia da composição. É dada preferência ao alum e ao MF59®.

Tal como acima se mencionou, os muramil-péptidos incluem, mas de modo não limitativo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D- isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

As composições imunogénicas (p.ex., o antigénio imunizante/ imunogénio / polipéptido / proteína / ácido nucleico, o veículo farmaceuticamente aceitável e o adjuvante) conterão tipicamente diluentes, tais como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, poderão encontrar-se presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e semelhantes.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas sob a forma de injectáveis, em soluções líquidas ou suspensões; poderão ainda preparar-se formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injecção. A preparação poderá igualmente ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para acentuar o seu efeito adjuvante, tal como acima se referiu para os veículos farmaceuticamente aceitáveis. 43

As composições imunogénicas que são usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipéptidos antigénicos ou imunogénicos, assim como de qualquer dos componentes acima mencionados, segundo requerido. Por "quantidade imunologicamente eficaz" pretende-se significar que a administração de tal quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia segundo o estado de saúde e as condições físicas do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (p.ex., um primata não humano, um primata, etc.) a capacidade de produção de anticorpos evidenciada pelo sistema imunológico do indivíduo, o grau de protecção desejada, a formulação da vacina, a avaliação da situação clínica por parte do médico e outros factores relevantes. Será de esperar que esta quantidade se encontre dentro de um intervalo relativamente alargado que poderá ser determinado através de ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, p.ex. por injecção, subcutânea, intramuscular ou transdérmica/transcutânea (ver, p.ex., WO 98/20734). As formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem as formulações orais e pulmonares, os supositórios e as aplicações transdérmicas. A dosagem de tratamento poderá ser administrada num regime de dose única ou num regime de doses múltiplas. A vacina poderá ser administrada em conjunção com outros agentes imunoreguladores.

Como alternativa às vacinas baseadas em proteínas, poderá usar-se a vacinação com DNA [ver, p.ex., Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunol 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; aqui referidos mais adiante]. 44 Métodos de Administração

Uma vez formuladas, as composições de polinucleótido poderão ser administradas (1) directamente ao indivíduo; (2) libertadas ex vivo para células derivadas do indivíduo; ou (3) in vitro, para a expressão das proteínas recombinantes. Os indivíduos a tratar poderão ser mamíferos ou aves. Poderão igualmente ser tratados seres humanos. A administração directa das composições será geralmente conseguida através de injecção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou de libertação para o espaço instersticial de um tecido. As composições poderão ainda ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem a administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutâneas (ver, p.ex., WO98/20734), agulhas e pistolas de genes ou hiposprays. A posologia poderá corresponder a um regime de dose única ou a um regime de múltiplas doses.

Os métodos para administração ex vivo e reimplantação das células transformadas num indivíduo são bem conhecidas neste campo técnico e encontram-se descritas em, p.ex., W093/14778. Os exemplos de células úteis para aplicações ex vivo incluem, por exemplo, células estaminais, particularmente células hematopoiéticas, células linfóides, macrófagos, células dendríticas ou células tumorais.

De modo geral, a administração de ácidos nucleicos em aplicações ex vivo e in vitro poderá ser conseguida recorrendo, por exemplo, aos seguintes procedimentos: transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do DNA nos núcleos celulares, sendo todos estes métodos bem conhecidos neste campo técnico. 45

Composições farmacêuticas de polinucleótidos e polipéptidos

Para além dos sais e veículos farmaceuticamente aceitáveis acima descritos, poderão ainda usar-se os agentes que se seguem em conjunção com composições de polinucleótidos e/ou polipéptidos. A. Polipéptidos

Nos exemplos destes polipéptidos incluem-se, sem limitação: asialoorosomucóide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticorpos; fragmentos de anticorpos; ferritina; interleucinas; interferões, factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de células estaminais e eritropoietina. Poderão igualmente usar-se antigénios virais, tal como proteínas de envelope. Adicionalmente, poderão usar-se proteínas provenientes de outros organismos invasivos, tal como o péptido de 17 aminoácidos, designado por RII, da proteína do circumsporozoíto de Plasmodium falciparum. B. Hormonas, Vitaminas, etc.

Outros grupos que poderão ser incluídos correspondem, por exemplo, a: hormonas, esteróides, androgénios, estrogénios, hormona da tiróide, vitaminas, ácido fólico. C. Polialquilenos, Políssacáridos, etc.

Adicionalmente, poderá incluir-se um polialquilenoglicol em associação aos polinucleótidos/polipéptidos desejados. Numa forma de realização preferida, o polialquilenoglicol corresponde ao polietilenoglicol. Adicionalmente, poderão incluir-se mono-, di- ou políssacáridos. Numa forma de 46 realização preferida segundo este aspecto, o polissacárido corresponde a dextrano ou a DEAE-dextrano. Poderão ainda utilizar-se quitosano e poli(lactido-co-glicólido). D. Lípidos e Lipossomas 0 polinucleótido/polipéptido desejado poderá igualmente ser encapsulado em lípidos ou empacotado em lipossomas antes de ser administrado ao indivíduo ou a células derivadas deste. A encapsulação em lípidos é geralmente conseguida usando lipossomas que tenham a capacidade de se ligar a ácido nucleico, ou a capturá-lo e retê-lo, de modo estável. A razão de polinucleótido condensado para preparação de lípido poderá variar, mas situa-se geralmente à volta de 1:1 (mg DNA:micromoles lípido), ou maior quantidade de lípido. Para consulta de uma revisão sobre o uso de lipossomas como veículos para libertação de ácidos nucleicos, ver Hug e Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

As preparações de lipossomas incluem preparações catiónicas (carregadas positivamente), aniónicas (carregadas negativamente), e neutras. Verificou-se que os lipossomas catiónicos medeiam a libertação intracelular de DNA plasmídico (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7416); mRNA (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6077-6081); e factores de transcrição purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), em forma funcional.

Os lipossomas catiónicos são facilmente adquiríveis no mercado. Por exemplo, os lipossomas de N[l-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamónio (DOTMA) encontram-se disponíveis sob o nome comercial de Lipofectin, da empresa Gibco BRL, Grand Island, NY (ver também Felgner, supra). Outros lipossomas comercialmente disponíveis incluem o Transfectace (DDAB/DOPE) e o DOTAP/DOPE (Boehringer). Poderão 47 preparar-se outros lipossomas catiónicos a partir de materiais prontamente disponíveis utilizando técnicas bem conhecidas neste campo. Ver, p.ex., Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:4194-4198, e WO90/11092, para obter uma descrição da síntese de lipossomas de DOTAP (1,2-bis (oleoiloxi)-3-(trimetilamónio)propano).

De forma similar, os lipossomas aniónicos e neutros encontrar-se-ão facilmente disponíveis no mercado, a partir de empresas como a Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), ou poderão ser facilmente preparados a partir de materiais prontamente disponíveis. Tais materiais incluem a fosfatidil-colina, colesterol, fosfatidil-etanolamina, dioleoilfos-fatidil-colina (DOPC), dioleoilfosfatidil-glicerol (DOPG), dioleoilfosfatidil-etanolamina (DOPE), entre outros. Estes materiais poderão igualmente ser misturados com os materiais de partida para DOTMA e DOTAP em razões apropriadas. Os métodos para o fabrico de lipossomas utilizando estes materiais são bem conhecidos da técnica.

Os lipossomas poderão compreender vesículas multilamelares (MLVs), vesículas unilamelares pequenas (SUVs), ou vesículas unilamelares grandes (LUVs). Os diversos complexos de lipossoma-ácido nucleico são preparados usando métodos conhecidos neste campo. Ver, p.ex., Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:145; e Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166. 48 E. Lipoproteínas

Adicionalmente, poderão incluir-se lipoproteínas na composição de polinucleótido/polipéptido a ser administrada. Os exemplos de lipoproteínas que podem ser utilizadas incluem: quilomicra, HDL, IDL, LDL e VLDL. Poderão igualmente usar-se mutantes, fragmentos ou fusões destas proteínas. Poderão ainda usar-se modificações de lipoproteínas de ocorrência natural, tal como LDL acetilada. Estas lipoproteínas podem dirigir a libertação de polinucleótidos para células que expressem receptores para lipoproteínas. De preferência, se as lipoproteínas se encontrarem associadas aos polinucleótidos a administrar, não será incluído outro ligando direccionador na composição.

As lipoproteínas de ocorrência natural compreendem um lípido e uma porção de proteína. As porções de proteína são designadas por apoproteínas. Até ao presente, foram já isoladas e identificadas as apoproteínas A, B, C, D e E. Pelo menos duas destas contêm diversas proteínas, designadas por números romanos: AI, AII, AIV; Cl, CII, CIII.

Uma lipoproteína poderá conter mais do que uma apoproteína. Por exemplo, as quilomicra de ocorrência natural compreendem as apoproteínas A, B, C e E; ao longo do tempo, estas lipoproteínas perdem a apoproteína A e adquirem as apoproteínas C e E. A lipoproteína VLDL compreende as apoproteínas A, B, C e E, a LDL compreende a apoproteína B e a HDL compreende as apoproteínas A, C e E.

Os aminoácidos destas apoproteínas são conhecidos e encontram-se descritos em, por exemplo, Breslow (1985) Annu

Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sei USA 77:2465; e Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

As lipoproteínas contêm uma variedade de lípidos, incluindo triglicéridos, colesterol (livre e ésteres) e 49 fosfolípidos. A composição dos lipidos varia nas lipoproteinas de ocorência natural. Por exemplo, as quilomicra compreendem principalmente triglicéridos. Poderá encontrar-se uma descrição mais detalhada do conteúdo em lipidos das lipoproteinas de ocorrência natural em, por exemplo, Meth. Enzymol. 128 (1986). A composição dos lipidos é escolhida de modo a auxiliar a conformação da apoproteina relativamente à sua actividade de ligação ao receptor. A composição em lipidos poderá igualmente ser escolhida de modo a facilitar a interacção hidrofóbica e a associação com a molécula de ligação ao polinucleótido.

As lipoproteinas de ocorrência natural poderão ser isoladas a partir do soro através de ultracentrifugação, por exemplo. Tais métodos encontram-se descritos em Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 e Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. As lipoproteinas podem igualmente ser produzidas por métodos in vitro ou recombinantes, através da expressão dos genes de apoproteinas em uma célula hospedeira desejada. Ver, por exemplo, Atkinson (1986), Annu Rev Biophys Chem 15:403 e Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30:443. As lipoproteinas poderão ainda ser adquiridas a fornecedores como a empresa Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachussetts, EUA. Poderá encontrar-se uma descrição mais detalhada sobre lipoproteinas em Zuckermann et al., PCT/US97/14465. F. Agentes Policatiónicos

Poderão incluir-se agentes policatiónicos, com ou sem lipoproteinas, numa composição com o polinucleótido/polipéptido que se deseja administrar.

Os agentes policatiónicos exibem tipicamente uma carga positiva bruta a um pH fisiologicamente relevante e têm a capacidade de neutralizar a carga eléctrica dos ácidos 50 nucleicos, facilitando deste modo a sua libertação para um local desejado. Estes agentes são utilizáveis em aplicações in vitro, ex vivo ou in vivo. Os agentes policatiónicos poderão ser usados para administrar ácidos nucleicos a um indivíduo vivo através das vias intramuscular, subcutânea, etc.

Como exemplos de polipéptidos úteis como agentes policatiónicos encontram-se os seguintes: polilisina, poliarginina, poliornitina e protamina. Outros exemplos incluem histonas, protaminas, albumina sérica humana, proteínas de ligação ao DNA, proteínas cromossómicas não-histónicas, proteínas de revestimento de vírus DNA, tais como a proteína X174; os factores transcricionais contêm igualmente domínios que se ligam ao DNA e que, deste modo, poderão ser úteis como agentes condensadores de ácidos nucleicos. Abreviadamente, os factores transcricionais como CICEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP e TFIID contêm domínios básicos que se ligam a sequências de DNA.

Os agentes orgânicos policatiónicos incluem: espermina, espermidina e putrescina.

As dimensões e propriedades físicas de um agente policatiónico poderão ser extrapoladas a partir da lista acima tendo em vista a construção de outros agentes policatiónicos polipeptídicos ou a produção de agentes policatiónicos sintéticos.

Os agentes policatiónicos sintéticos com utilidade incluem, por exemplo, DEAE-dextrano e polibreno. Lipofectin® e LipofectAMINE® são monómeros que formam complexos policatiónicos quando combinados com polinucleótidos/polipéptidos. 51

Breve Descrição dos Esquemas

Figura 1. Análise por imunoblot de soros humanos e de ratinhos. Submeteu-se o TOSV purificado a electroforese em SDS-PAGE a 12%, após o que se realizou a sua transferência para uma membrana de nitrocelulose e se permitiu a sua reacção com anticorpos. Corrida 1, soro de ratinho específico para TOSV; corrida 2, soro de ratinho negativo para TOSV; corrida 3, soro humano positivo para TOSV; corrida 4, soro humano negativo para TOSV.

Figura 2. (A) Imunoprecipítação de extractos cítoplásmícos de células infectadas por TOSV (corridas 2 e 4) ou células simulando infecção (corridas 1 e 3) com soros de ratinhos. Corridas 1-2, soro de ratinho específico para a proteína N; corridas 3-4, soro de ratinho TOSV-positivo; (B) Imunoprecipítação de extractos citoplásmicos de células infectadas por TOSV (corridas 1 e 2) ou de células simulando infecção (corridas 3 e 4) com soros humanos. Corridas 1-3, soro humano TOSV-positivo colhido durante a fase aguda da doença; corridas 2-4, soro humano TOSV-positivo colhido do mesmo indivíduo após 1 ano.

Formas de Realização do Invento

Os exemplos que se seguem foram concebidos para a identificação da natureza dos anticorpos produzidos contra a proteína N do TOSV em ratinhos e para o estabelecimento de uma correlação com os anticorpos produzidos em seres humanos durante uma infecção natural. Foram usados três antigénios: o vírus completo, uma preparação da nucleocápside e uma preparação da proteína rN do TOSV expressa em E. coli.

Preparação dos antigénios 0 vírus purificado foi ressuspenso em Nonidet P-40 e estratificado numa almofada de sacarose a 20%, sendo então 52 centrifugado a 75.000g durante 3 horas. 0 pellet contendo a nucleocápside foi ressuspenso em tampão TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,15M, EDTA lmM, pH 7,8). O RNA de TOSV foi purificado tal como se descreve na Referência 21 e foi submetido a RT-PCR. A região correspondendo ao gene da proteína N (nt 40-800) foi clonada sobre o local de restrição de BamHI no plasmídeo pETl5b (Novagen) (19). A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade e caracterizada em SDS-PAGE.

Imunizações

Três grupos de animais, cada um contendo cinco ratinhos fêmea BALB/c com 8 semanas de idade (Charles Rivers), foram imunizados intramuscularmente por quatro vezes, com intervalos de 15 dias entre cada imunização, com 100 yg/dose de antigénio composto por (i) uma preparação de vírus completo, (ii) proteína da nucleocápside de TOSV purificada ou (iii) proteína N recombinante. Um grupo de controlo negativo foi injectado com células simulando infecção. Dez dias depois da última imunização, os animais foram sacrificados e os soros foram testados por ensaios serológicos.

Ensaios

Tal como já anteriormente se referiu (17), o ensaio de imunoblot (IB) associado a ELISA foi considerado como o teste de eleição para o serodiagnóstico da infecção por TOSV. Os soros colhidos dos ratinhos foram testados por ELISA quanto à presença de anticorpos específicos anti-TOSV, usando-se o vírus purificado como antigénio (17, 19). Todos os soros testados, com excepção dos controlos negativos, revelaram títulos detectáveis de anticorpo de cerca de > 1/6000. Através da análise por IB, os soros de ratinhos imunizados com o TOSV completo reagiram fortemente com a proteína N e fracamente com as glicoproteínas G1 e G2 (Figura 1) . De modo similar, um 53 teste de radioimunoprecipitação (RIPA) revelou a presença de anticorpos contra todas as três proteínas estruturais principais, N, G1 e G2 (Figura 2A) . Por contraste, dez soros humanos que haviam previamente sido classificados por ELISA como positivos para TOSV mostraram-se reactivos contra a proteína N quando analisados por IB, mas não exibiram reactividade contra as proteínas Gl e G2 (Figura 1) . É sabido que a proteína Gl é sensível ao calor (5), mas as electroforeses efectuadas com amostras levadas à ebulição ou tratadas por aquecimento até 37°C forneceram os mesmos resultados. Três dos soros humanos foram igualmente testados por RIPA para verificar se possuíam anticorpos anti-Gl e/ou anti-G2. Os soros humanos positivos exibiram uma forte reactividade contra a proteína N e reagiram igualmente contra as proteínas Gl e/ou G2. Não foi possível uma identificação sem ambiguidades do componente de proteína G com o qual os anticorpos reagiram, uma vez que as duas glicoproteínas possuem uma mobilidade electroforética idêntica em SDS-PAGE a 12% (Figura 2B).

Os ensaios de neutralização por redução de placas (PRNT) mostraram que todos os soros de ratinhos possuíam um título de 1/16 contra o TOSV. Duas amostras emparelhadas de soro humano colhidas do mesmo paciente durante a fase aguda da doença, e após 12 meses, foram testados por ELISA, por imunoprecipitação e por PRNT com TOSV. 0 soro de convalescença revelou uma diminuição da reactividade de anticorpos contra o TOSV e contra a proteína N recombinante quando testado por ELISA, mas ambas as amostras exibiram títulos semelhantes de anticorpos neutralizantes (Tabela 1) . A imunoprecipitação realizada utilizando dois soros, diluídos para atingir títulos de anticorpos anti-TOSV idênticos, mostrou que o segundo soro possuía um baixo título de anticorpos N-específicos quando comparado com o primeiro, mas que os níveis de anticorpos 54 anti-Gl-G2 permaneciam inalterados (Figura 2B) . 0 ensaio de RIPA confirmou os resultados obtidos por ELISA com o virus completo e a proteina rN, sugerindo que a reactividade anti-N diminui com o tempo, enquanto que os titulos de anticorpos anti-Gl-G2 e de anticorpo neutralizante permanecem inalterados (Tabela 1).

Tabela 1. Alterações ao longo do tempo dos títulos de anticorpos anti-TOSV em amostras de soros humanos.

Ensaio Antigénio Título 12 soro Título 22 soro ELISA TOSV 3200 1600 ELISA Proteína rN 3200 1600 PRNT TOSV 64 64 (Os títulos de anticorpos são apresentados como o valor das recíprocas).

Conclusões A razão pela qual apenas o soro de ratinho anti-TOSV exibiu uma fraca reactividade face às proteínas G1 e G2 no ensaio de IB poderá atribuir-se ao facto de que os animais foram imunizados através de uma via de infecçâo diferente - os antigénios do envelope poderão ter sido processados de uma forma diferente da que ocorre durante a infecçâo natural. Ademais, as glicoproteínas do envelope contêm principalmente epitopos conformacionais que poderão ter sido destruídos ou desnaturados, sendo a sua identificação apenas possível por imunoprecipitação. Não se encontraram diferenças relativamente aos títulos de anticorpos neutralizantes entre os soros obtidos a partir de ratinhos imunizados com o vírus inteiro e os imunizados com a nucleocápside purificada ou com a nucleoproteína recombinante. 55

Os anticorpos neutralizantes anti-TOSV parecem ser principalmente dirigidos contra as glicoproteinas do envelope, se bem que, surpreendentemente, seja também gerada uma potente resposta imune contra a proteína N em animais infectados pelo vírus, resposta essa que possui uma actividade neutralizante parcial In vitro. É sabido que outros antigénios do core virai, tais como a proteína da nucleocápside (NP) do influenzavírus (22) ou a proteína N do vírus da raiva (6, 11) poderão conferir protecção contra a doença através de imunidade mediada por células, mas a proteína N do TOSV constitui o primeiro exemplo de um antigénio interno do vírus exibindo a capacidade de induzir uma resposta imune humoral que poderá produzir anticorpos com potencial neutralizante. As glicoproteinas do envelope não são, deste modo, as únicas proteínas que contêm epitopos neutralizantes importantes, já que a imunização em ratinhos demonstrou que a proteína N do TOSV pode igualmente induzir a produção de anticorpos neutralizantes.

REFERÊNCIAS 1. Accardi et al. (1993) Vírus Rès, 27:119-131. 2. Arikawa et al (1989) J, Gen. Vi rol 70:615:624. 3. Bishop etal. pâges1155-1173of Virotogy (ed. Fields et al ), Raven Press, New York. 4. Casais (1967) pages 140-163 ot Methods in Virology (eds. Maramorosch &. Koprowsky) Academic Press, New York. 5. Di Bonito etal. (1997) J. Gen. Virol 78:77-81. 6. Dietzschold et al. (1987) PNAS USA. 84:9165-9169. 56 7. Gonzaiez-Scarano et al. (1982) Virology 120:42-53. 8. Gtady & Kinch (1985) J. Gen. S/irol. 66:2773-2776, 9. Grdetah (1992) Virology 191:435-438, 10. Kíngsfõrd (1991) pags 181-216deCurrent Topics in Microbiology and Ihiffiunotogy (éd, Kolakofsky) Spririger-Verlag. Heidelberg, Alemanha . 11. Lafon & i-aíage (1987) J. Gen. Virai. 68:3113-3123. 12. Nicoletti et ah (1991) Am. J. Trop. Med Hyg. 45:429-434. 13. Obijeski et al, (1976) J, Virol. 19:985-987. 14. Saluzzo et al. (198.9) Res. Virol. 140:155-164. 15. Sçljwsuzetal. (1995) Epidemioi. Infeet 114:501-510, 16. Schwarz etal. (1993) Lancet 342:803-804. 17. Soldateschi et al, (1999) J. Clin. Miorcbiol 37:649-652, 18. Tesh et al. (1976) Buli. W.H.O. 54:663-674, 1,9. Valassina et al. (1998) J. Clin, Vlcrobo. 35:3170-5177 20. Valassiria etal, (1998) J. Çlíh. Mícrobiol. 36:21,03-2104. 21. Valassina etal. (1996) J. Clin. Microbiol. 34:2500-2502. 22. Wraith et al. (1987) J. Gen Virol. 68:433-440.

Lisboa, 19 de Dezembro de 2007 57

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) , caracterizada por se destinar a ser usada na estimulação de uma resposta humoral neutralizante contra a infecção pelo vírus Toscana.
2. Um ácido nucleico codificando para a nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) , caracterizada por se destinar a ser usada na estimulação de uma resposta humoral neutralizante contra a infecção pelo vírus Toscana.
3. Uma nucleoproteína ou ácido nucleico do vírus Toscana, caracterizada por o seu uso compreender ainda a administração de proteínas do vírus, seleccionadas a partir do grupo que consiste em proteína não estrutural (proteína NS) , glicoproteína Gl do envelope, glicoproteína G2 do envelope ou polimerase do vírus.
4. Uma nucleoproteína ou ácido nucleico do vírus Toscana, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizada por a proteína entre uma ou mais proteínas adicionais do vírus Toscana corresponder à glicoproteína G2 do envelope.
5. Uma nucleoproteína ou ácido nucleico do vírus Toscana, de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizada por corresponder a uma vacina.
6. 0 uso da nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N), caracterizada por ser utilizada no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da infecção pelo vírus Toscana.
7. 0 uso de um ácido nucleico, codificando para a nucleoproteína do vírus Toscana (proteína N) , caracterizado por ser utilizado no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da infecção pelo vírus Toscana.
8. 0 uso, de acordo com as Reivindicações N°.6 ou N°.7, caracterizado por o dito medicamento compreender ainda uma ou 1 mais de outras proteínas do vírus Toscana, seleccionadas a partir do grupo que consiste em proteína não estrutural (proteína NS), glicoproteína G1 do envelope, glicoproteína G2 do envelope ou polimerase do vírus.
9. 0 uso, de acordo com a Reivindicação N°.8, caracterizado por a outra proteína do vírus Toscana corresponder à glicoproteína G2 do envelope.
10. O uso, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.6 a N°.9, caracterizado por o dito medicamento corresponder a uma vacina.
11. O uso, de acordo com qualquer uma das Reivindicações N°.6 a N°.10, caracterizado por o dito medicamento estimular uma resposta imune humoral.
12. 0 uso, de acordo com a Reivindicação N°.ll, caracterizado por a resposta humoral corresponder a uma resposta neutralizante. Lisboa, 19 de Dezembro de 2007 2