ES2292449T3 - 17867, una aminopeptidasa humana novedosa. - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que (i) es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o al inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; y (ii) codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa, o un complemento de la misma; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o del inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa, o un complemento de la misma; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en laATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que el fragmento comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, y en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa; y e) una molécula de ácido nucleico que codifica una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que lamolécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en la que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45°C, seguido de lavado en 0, 2x SSC/ 0, 1% de SDS a 65°C, y en la que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa.

Description

17867, una aminopeptidasa humana novedosa.
La presente invención se refiere a una aminopeptidasa humana recién identificada. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican la aminopeptidasa. La invención se refiere además a procedimientos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa como diana para el diagnóstico y tratamiento en trastornos relacionados con aminopeptidasas. La invención se refiere además a procedimientos de selección de fármacos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa para identificar agonistas y antagonistas para el diagnóstico y tratamiento. La invención engloba además agonistas y antagonistas basados en los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa. La invención se refiere además a procedimientos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa.
Antecedentes de la invención
Las proteasas pueden funcionar en la carcinogénesis inactivando o activando reguladores del ciclo celular, diferenciación, muerte celular programada u otros procesos que afectan al desarrollo y/o la progresión del cáncer. De manera coherente con el modelo que implica la actividad proteasa y la progresión tumoral, ciertos inhibidores de proteasas han demostrado ser inhibidores eficaces de la carcinogénesis tanto in vitro como in vivo.
Las aminopeptidasas (AP) son un grupo de exopeptidasas ampliamente distribuidas que catalizan la hidrólisis de restos de aminoácido desde el extremo amino-terminal de polipéptidos y proteínas. Las enzimas se encuentran en tejidos vegetales y animales, en eucariotas y procariotas, y en formas secretadas y solubles. Las funciones biológicas de las aminopeptidasas incluyen la maduración de proteínas, degradación terminal de proteínas, regulación del nivel hormonal y control del ciclo celular.
Las enzimas participan en una gran cantidad de estados y trastornos que incluyen envejecimiento, cánceres, cataratas, fibrosis quística y leucemias. En eucariotas, las AP se asocian con la eliminación del iniciador metionina. En procariotas la metionina se elimina por la metionina aminopeptidasa posteriormente a la eliminación del grupo N-formilo del iniciador N-formil-metionina, facilitando modificaciones posteriores tales como N-acetilación y N-miristoilación. En E. coli, se requiere AP-A (pepA), el producto del gen xerB para la estabilización de multímeros plasmídicos inestables.
Las AP también participan en el metabolismo de moléculas reguladoras secretadas, tales como hormonas y neurotransmisores, y la modulación de interacciones intercelulares. En células y tejidos de mamífero, aparentemente se requieren las enzimas para las fases terminales de la degradación de proteínas, y el control del ciclo celular inducido por EGF; y pueden desempeñar un papel en el recambio de proteínas y la eliminación selectiva de proteínas obsoletas o defectuosas. Además, las enzimas participan en el suministro de aminoácidos y energía durante la inanición y/o diferenciación, y la degradación de péptidos exógenos transportados en aminoácidos para la nutrición. Como la leucotrieno A4 hidrolasa puede ser una aminopeptidasa, las AP pueden desempeñar además un papel en la inflamación. Los usos industriales de las enzimas incluyen la modificación de extremos amino-terminal en proteínas expresadas de manera recombinante. Véase A. Taylor (1993) TIBS 18:1993:167-172.
Se ha identificado una variedad de aminopeptidasas a partir de una amplia variedad de tejidos y organismos, incluyendo aminopeptidasa de cinc y aminopeptidasa M de membrana de riñón de rata; arginina aminopeptidasa de hígado; aminopeptidasa N^{b} de músculo; leucina aminopeptidasa (LAP) de riñón y cristalino de cerdo y bovino; aminopeptidasa A (producto del gen xerB) de E. coli; ysc1 APE1/LAP4 y aminopeptidasa A (producto del gen pep4) de S. cerevisiae; LAP de Aeromonas; dipeptidasa de ascitis de ratón; metionina aminopeptidasa de Salmonella, E. coli, S. cerevisiae e hígado de cerdo; y D-aminoácido aminopeptidasa de Ochrobactrum anthropi SCRC
C1-38.
De estas aminopeptidasas, se ha caracterizado bien la estructura de la leucina aminopeptidasa de cristalino bovino (b1LAP) y está constituida por un homohexámero sintetizado como un precursor grande, conteniendo cada monómero dos tercios de la proteína en un lóbulo mayor y un tercio en un lóbulo menor. El lóbulo menor contiene los 150 restos N-terminales. Todos los supuestos restos de sitios activos, también presumiblemente el sitio de unión a bestatina del inhibidor, se encuentran en el lóbulo C-terminal e incluyen Ala-333, Asn-330, Leu360, Asp332, Asp255, Glu-334, Lys250, Asp273, Met-454, Ala-451, Gly362, Thr-359, Met270, Lys262, Gly362 e Ile-421.
Muchas aminopeptidasas son metaloenzimas, que requieren cationes divalentes, con especificidades para Zn^{2+} o Co^{2+}; sin embargo, sitios particulares de determinadas aminopeptidasas pueden utilizar fácilmente Mn^{2+} y Mg^{2+}. Los restos usados para el ligando Zn^{2+} incluyen las configuraciones de His His Glu y Asp Glu Lys. Además de la bestatina, los ácidos bóricos y fosfónicos, \alpha-metil-leucina e isoamiltioamida se identifican como inhibidores competitivos para la mayoría de las aminopeptidasas. Véanse A. Taylor (1993) TIBS 18:1993:167-172; Burley et al. (1992) J. Mol. Biol. 224:113-140; Taylor et al. (1993) Biochemistry 32:784-790.
Las aminopeptidasas de diversos organismos y diversos tejidos en un organismo tienen altos grados de homología de secuencia primaria, tal como se indica mediante ensayos inmunológicos. Algunas enzimas también muestran perfiles cinéticos muy similares. La comparación directa de la secuencia de aminoácidos de b1LAP y aminopeptidasa-A de E. coli muestra una identidad del 18%, 44% y 35% para los extremos amino- y carboxi-terminal, y la proteína completa, respectivamente. La comparación muestra una identidad del 46%, 66%, y 60% para las respectivas regiones. Véase Burley et al. (1992) J Mol. Biol. 224:113-140.
La leucina aminopeptidasa de cristalino bovino (b1LAP), LAP de riñón bovino, las LAP de cristalino e hígado humano, las LAP de cristalino, riñón e intestino de cerdo, prolina-AP, AP-A de E. coli, AP-I y el producto del gen pepA de S. typhimurium se han clasificado como pertenecientes a la familia de las aminopeptidasas de cinc que utilizan los restos Asp Glu Lys para la unión al cinc y la configuración de aminoácidos del sitio activo descrita anteriormente para la LAP bovina LAP para la unión al sustrato. Se sugiere que esta familia, que posiblemente incluye también LAP de Aeromonas, se distingue de las proteasas de cinc que utilizan His His Glu en la unión al cinc y Arg en la unión al sustrato. La de metionina-AP de Saccharomyces se caracteriza porque contiene dos motivos de tipo dedo de cinc en el extremo amino-terminal y comparte poca homología con b1LAP. Véase A. Taylor (1993) TIBS 18: mayo de 1993: 167-171; Watt et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:5480-5487.
La expresión de leucina aminopeptidasa está regulada a nivel transcripcional, evidenciado por el aumento tanto de la actividad como del ARNm con la eliminación del suero de células epiteliales del cristalino en transformación y/o envejecidas in vitro. Además, se induce ARNm de LAP y proteína por interferón \gamma en carcinoma renal ACHN, carcinoma de pulmón A549, fibroblastos HS153 y melanoma A375 humanos. También participa la regulación mediante el crecimiento y desarrollo. El gen pepN de E. coli está regulado transcripcionalmente en la anaerobiosis y carencia de fosfato. Se expresa AP-N (CD13) unida a la membrana de manera restringida al linaje por subconjuntos de células normales y malignas, aparentemente a través de la regulación mediante promotores físicamente distintos. La expresión del producto APE1 de la levadura ycsI depende de los niveles de los productos de los genes yscA y PEP4. La síntesis de APE1 es sensible a los niveles de glucosa en los medios, y la actividad de la aminopeptidasa de levadura es sensible a la sustitución de amoniaco en vez de peptona como fuente de nitrógeno. Véanse Harris et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:6865-6869; Jones et al. (1982) Genetics 102:665-677.
En consecuencia, las aminopeptidasas son una diana importante para la acción y el desarrollo farmacológicos. Por lo tanto, es valioso para el campo del desarrollo farmacéutico identificar y caracterizar aminopeptidasas previamente desconocidas. La presente invención adelanta el estado de la técnica proporcionando una aminopeptidasa humana previamente no identificada.
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención identificar aminopeptidasas novedosas.
Es otro objeto de la invención proporcionar polipéptidos de aminopeptidasa novedosos que son útiles como reactivos o dianas en ensayos de aminopeptidasas aplicables al tratamiento y diagnóstico de trastornos relacionados con aminopeptidasas.
Es otro objeto de la invención proporcionar polinucleótidos correspondientes a los polipéptidos de aminopeptidasa novedosos que son útiles como dianas y reactivos en ensayos de aminopeptidasas aplicables al tratamiento y diagnóstico de trastornos relacionados con aminopeptidasas y útiles para producir polipéptidos de aminopeptidasa novedosos mediante procedimientos recombinantes.
Un objeto específico de la invención es identificar compuestos que actúan como agonistas y antagonistas y modulan la expresión de la aminopeptidasa novedosa.
Por tanto, la invención se basa en la identificación de una aminopeptidasa humana novedosa. La secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos se muestra como SEC ID NO: 2.
La invención se refiere a polipéptidos de aminopeptidasa aislados, incluyendo un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA, como nº ATCC PTA-1642 el 4 de abril de 2000 ("el ADNc depositado").
En consecuencia, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de:
a)
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
(i)
es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o al inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; y
(ii)
codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa,
o un complemento de la misma;
b)
una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o del inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa, o un complemento de la misma;
c)
una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642;
d)
una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que el fragmento comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, y en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa; y
e)
una molécula de ácido nucleico que codifica una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en la que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45ºC, seguido de lavado en 0,2x SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC, y en la que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa.
La invención también proporciona un polipéptido aislado seleccionado de:
a)
un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en el que el fragmento comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642 y en el que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa;
b)
una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45ºC, seguido de lavado en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC, y en el que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa; y
c)
un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 80% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o un complemento de la misma, en el que dicho polipéptido tiene actividad aminopeptidasa.
La invención proporciona además constructos de ácido nucleico que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico de la invención están operativamente unidas a una secuencia reguladora.
La invención también proporciona vectores y células huésped para expresar los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de aminopeptidasa, y particularmente vectores y células huésped recombinantes.
La invención también proporciona procedimientos para preparar los vectores y células huésped y procedimientos para usarlos para producir los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de aminopeptidasa.
La invención también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen de manera selectiva a los polipéptidos y fragmentos de aminopeptidasa.
La invención también proporciona procedimientos para seleccionar compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácido nucleico (ARN o ADN) de aminopeptidasa.
La invención también se refiere a un procedimiento in vitro para modular la expresión o actividad del polipéptido o ácido nucleico de aminopeptidasa, especialmente usando los compuestos seleccionados. La invención también se refiere al tratamiento de estados relacionados con la actividad o expresión aberrante de los polipéptidos o ácidos nucleicos de aminopeptidasa.
La invención también se refiere a ensayos para determinar la actividad de o la presencia o ausencia de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de aminopeptidasa en una muestra biológica, incluyendo para el diagnóstico de una enfermedad.
La invención también se refiere a ensayos para determinar la presencia de una mutación en los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico, incluyendo para el diagnóstico de una enfermedad.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 2) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 1) de aminopeptidasa.
La figura 2 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de aminopeptidasa: regiones de giros o vueltas \alpha\beta; hidrofilicidad; regiones anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico; y gráfico de probabilidad superficial.
La figura 3 muestra un gráfico de hidrofobicidad de la aminopeptidasa (SEC ID NO: 1).
La figura 4 muestra un análisis del marco de lectura abierto de la aminopeptidasa para aminoácidos correspondientes a sitios funcionales específicos (SEC ID NO: 1). La proteína también contiene una región de unión a cinc distintiva que se encuentra en las metalopeptidasas de cinc neutras.
La figura 5 muestra la expresión de ARN de la aminopeptidasa en tejidos humanos normales y en carcinomas.
La figura 6 muestra la expresión de ARN de la aminopeptidasa en tejidos y células humanos.
Descripción detallada de la invención Polipéptidos
La invención se basa en el descubrimiento de una aminopeptidasa humana novedosa. Específicamente, se seleccionó una etiqueta de secuencia expresada (EST) basándose en la homología con las secuencias de aminopeptidasa. Se usó esta EST para diseñar cebadores basados en las secuencias que contiene y usarlos para identificar un ADNc de una biblioteca de ADNc de células endoteliales. Se secuenciaron los clones positivos y se ensamblaron los fragmentos solapantes. El análisis de la secuencia ensamblada reveló que la molécula de ADNc clonada codifica una aminopeptidasa.
Por tanto, la invención se refiere a una aminopeptidasa novedosa que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la figura 1 (SEC ID NO: 1) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, nº ATCC PTA-1642.
El depósito se mantendrá según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos. El depósito se proporciona como una comodidad para el experto en la técnica y no es una admisión de que se requiere un depósito según la ley 35 U.S.C. \NAK 112. La secuencia depositada, así como los polipéptidos codificados por la secuencia, se incorpora al presente documento por referencia y predomina en el caso de cualquier discrepancia, tal como un error de secuenciación, con la descripción en esta solicitud.
"Polipéptido de aminopeptidasa" o "proteína de aminopeptidasa" se refiere al polipéptido en la SEC ID NO: 1 o codificado por el ADNc depositado. La expresión "proteína de aminopeptidasa" o "polipéptido de aminopeptidasa", sin embargo, incluye además las numerosas variantes descritas en el presente documento, así como fragmentos derivados de la aminopeptidasa de longitud completa y variantes.
Los tejidos y/o células en los que se encuentra la aminopeptidasa incluyen, pero no se limitan a, los tejidos mostrados en las figuras 5 y 6. Además de estos tejidos, también se ha encontrado expresión en carcinoma de colon y mama y en carcinoma de pulmón, especialmente carcinoma de células escamosas.
Por tanto, la presente invención proporciona un polipéptido de aminopeptidasa aislado o purificado y variantes y fragmentos del mismo.
Basándose en una búsqueda con BLAST, se mostró la mayor homología con una aminopeptidasa de membrana regulada por insulina.
Tal como se usa en el presente documento, se dice que un polipéptido está "aislado" o "purificado" cuando está sustancialmente libre de material celular cuando se aísla a partir de células recombinantes y no recombinantes, o está libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Sin embargo, un polipéptido puede unirse a otro polipéptido con el que no se asocia normalmente en una célula y considerarse todavía que está "aislado" o "purificado."
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Los polipéptidos de aminopeptidasa pueden purificarse hasta homogeneidad. Sin embargo, se entiende que las preparaciones en las que el polipéptido no está purificado hasta homogeneidad son útiles y se considera que contienen una forma aislada del polipéptido. La característica crítica es que la preparación permite la función deseada del polipéptido, incluso en presencia de cantidades considerables de otros componentes. Por tanto, la invención engloba diversos grados de pureza.
En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la aminopeptidasa que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de otras proteínas (es decir, proteína contaminante), menos de aproximadamente el 20% de otras proteínas, menos de aproximadamente el 10% de otras proteínas, o menos de aproximadamente el 5% de otras proteínas. Cuando el polipéptido se produce de manera recombinante, también puede estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 10%, o menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de proteína.
Un polipéptido de aminopeptidasa se considera también que está aislado cuando es parte de una preparación de membrana o está purificado y luego reconstituido con liposomas o vesículas de membrana.
La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido de aminopeptidasa en las que se separa de los precursores químicos o de otros productos químicos que participan en su síntesis. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de precursores químicos o de otros productos químicos, menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos o de otros productos químicos, menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos o de otros productos químicos, o menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos o de otros productos químicos.
En una realización, el polipéptido de aminopeptidasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1. Sin embargo, la invención también engloba variantes de secuencia. Las variantes incluyen una proteína sustancialmente homóloga codificada por el mismo locus genético en un organismo, es decir, una variante alélica. Las variantes también engloban proteínas derivadas de otros loci genéticos en un organismo, pero que tienen una homología sustancial con la aminopeptidasa de la SEC ID NO: 1. Las variantes también incluyen proteínas sustancialmente homólogas a la aminopeptidasa pero derivadas de otro organismos, es decir, un ortólogo. Las variantes también incluyen proteínas que son sustancialmente homólogas a la aminopeptidasa que se producen mediante síntesis química. Las variantes también incluyen proteínas que son sustancialmente homólogas a la aminopeptidasa que se producen mediante procedimientos recombinantes. Sin embargo, se entiende que las variantes excluyen cualquier secuencia de aminoácidos descrita antes de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, dos proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente homólogas cuando las secuencias de aminoácidos son homólogas en al menos aproximadamente el 60-65%, el 65-70%, el 70-75%, normalmente en al menos aproximadamente el 80-85%, y de la forma más normal en al menos aproximadamente el 90-95% o más. Una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga, según la presente invención, estará codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico, o parte de la misma, de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 en condiciones rigurosas según lo descrito con más detalle a continuación.
Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para fines comparativos óptimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para la alineación óptima y pueden omitirse las secuencias no homólogas para fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines comparativos es al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80% o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con las secuencias de aminoácidos del presente documento que tienen 502 restos de aminoácido, se alinean al menos 165, preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, incluso más preferiblemente al menos 300, e incluso más preferiblemente al menos 350, 400, 450 y 500 restos de aminoácido). Entonces se comparan los restos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o nucleótido. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.
La invención también engloba polipéptidos que tienen un menor grado de identidad pero que tienen una similitud suficiente como para realizar una o más de las mismas funciones realizadas por la aminopeptidasa. La similitud está determinada por la sustitución conservada de aminoácidos. Tales sustituciones son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Es probable que las sustituciones conservativas sean fenotípicamente silenciosas. Normalmente se han considerado sustituciones conservativos los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e ile; el intercambio de los restos hidroxílicos Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amídicos Asn y Gln, el intercambio de los restos básicos Lys y Arg y los reemplazos entre los restos aromáticos Phe, Tyr. Se encuentra una orientación referente a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos en Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990).
TABLA 1 Sustituciones conservativas de aminoácidos
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La comparación de secuencias y la determinación de la identidad en porcentaje y la similitud entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).
Un ejemplo no limitante, preferido de tal algoritmo matemático se describe en Karlin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) según lo descrito en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. En una realización, los parámetros para la comparación de secuencias pueden fijarse en puntuación =100, longitud de palabra =12, o pueden variarse (por ejemplo, W = 5 o
W = 20).
En una realización preferida, se determina la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Needleman et al. (1970) (J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz BLOSUM 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, se determina la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos usando el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (1):387) (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Otro ejemplo no limitante, preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programa de alineación de secuencias CGC. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de restos en peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4. Se conocen en la técnica otros algoritmos para el análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM según lo descrito en Torellis et al. (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson et al. (1988) PNAS 85:2444-8.
Un polipéptido variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones, fusiones y truncamientos o una combinación de cualquiera de éstos.
Polipéptidos variantes pueden ser totalmente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. Por tanto, en el presente caso, las variaciones pueden afectar la función, por ejemplo, de una o más de las regiones correspondientes a la región catalítica, regiones reguladoras, regiones de unión a sustratos, regiones de unión a cinc, regiones que participan en la asociación con la membrana, y regiones que participan en la modificación enzimática, por ejemplo, mediante fosforilación.
Normalmente, las variantes totalmente funcionales contienen sólo una variación conservativa o una variación en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener la sustitución de aminoácidos similares, que no da como resultado cambio o un cambio insignificante de la función. Como alternativa, tales sustituciones puede afectar positiva o negativamente a la función en cierto grado.
Normalmente, las variantes no funcionales contienen una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones o truncamiento de aminoácidos no conservativos o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o una región crítica.
Según lo indicado, las variantes pueden producirse en la naturaleza o pueden prepararse mediante medios recombinantes o síntesis química para proporcionar características útiles y novedosas para el polipéptido de aminopeptidasa. Esto incluye evitar la inmunogenicidad de las formulaciones farmacéuticas evitando la agregación de proteínas.
Las variaciones útiles incluyen además la alteración de la actividad catalítica. Por ejemplo, una realización supone una variación en el sitio de unión a péptido que da como resultado la unión pero no la hidrólisis del sustrato peptídico. Otra variación útil en el mismo sitio puede dar como resultado una afinidad alterada por el sustrato peptídico. Las variaciones útiles también incluyen cambios que proporcionan afinidad por otro sustrato peptídico. Otra variación útil proporciona una proteína de fusión en la que uno o más dominios o subregiones están operativamente fusionados a uno o más dominios o subregiones de otra aminopeptidasa.
Pueden identificarse los aminoácidos que son esenciales para la función mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham et al. (1985) Science 244:1081-1085). Este último procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales en cada resto en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se someten entonces a prueba para determinar su actividad biológica, tal como hidrólisis de enlaces peptídicos in vitro o actividad biológica relacionada, tal como actividad proliferativa. También pueden determinarse los sitios que son críticos para la unión mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcado por fotoafinidad (Smith et al. (1992) J. Mol. Biol. 224:899-904; de Vos et al. (1992) Science 255:306-312).
La homología sustancial puede ser con la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico completa o con fragmentos de estas secuencias.
Por tanto, la invención también incluye fragmentos de polipéptido de la aminopeptidasa. Los fragmentos pueden derivarse de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1. Sin embargo, la invención también engloba fragmentos de las variantes de la aminopeptidasa según lo descrito en el presente documento.
Sin embargo, no debe considerarse que los fragmentos a los que se refiere la invención engloban fragmentos que pueden haberse descrito antes de la presente invención.
En consecuencia, un fragmento puede comprender al menos 50 o más aminoácidos contiguos. Los fragmentos pueden conservar una o más de las actividades biológicas de la proteína, por ejemplo la capacidad para unirse a o hidrolizar péptidos diana, así como fragmentos que pueden usarse como un inmunógeno para generar anticuerpos frente a la aminopeptidasa.
Los fragmentos biológicamente activos (péptidos que son, por ejemplo, de 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) pueden comprender un sitio funcional. Tales sitios incluyen pero no se limitan al sitio catalítico, sitios reguladores, sitios importantes para el reconocimiento o la unión a sustratos, la región de unión a cinc, la región que contiene un motivo de metaloproteasa (IAHELAHQW), sitios que contienen el motivo característico de las aminopeptidasas en la familia M1 (GAMEN), el sitio que contribuye a la especificidad de exopeptidasa, el dominio peptidasa desde aproximadamente el aminoácido 69 hasta aproximadamente el aminoácido 458, sitios de fosforilación, sitios de glucosilación, y otros sitios funcionales descritos en el presente documento.
Pueden identificarse tales sitios o motivos por medio de procedimientos de búsqueda de homología informatizados rutinarios.
Los fragmentos, por ejemplo, pueden extenderse en uno o ambos sentidos desde el sitio funcional para englobar 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o hasta 100 aminoácidos. Además, los fragmentos pueden incluir subfragmentos de las regiones o sitios específicos descritos en el presente documento, conservando los subfragmentos la función del sitio o región del que se derivan.
Estas regiones pueden identificarse mediante procedimientos bien conocidos que suponen un análisis de homología informatizado.
La invención también proporciona fragmentos con propiedades inmunogénicas. Éstos contienen una parte que porta epítopos de la aminopeptidasa y variantes. Estos péptidos que portan epítopos son útiles para producir anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido o región o fragmento de aminopeptidasa. Estos péptidos pueden contener al menos 10, 12, al menos 14, o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos.
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos incluyen pero no se limitan a péptidos derivados de regiones extracelulares. En la figura 2 se muestran regiones que tienen un elevado índice de antigenicidad. Sin embargo, también están englobados los anticuerpos preparados de manera intracelular ("intracuerpos"), que reconocerían regiones peptídicas intracelulares.
Los polipéptidos de aminopeptidasa que portan epítopos pueden producirse mediante cualquier medio convencional (Houghten, RA. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:5131-5135). Se describe la síntesis simultánea de múltiples péptidos en la patente estadounidense número 4.631.211.
Los fragmentos pueden ser diferenciados (no fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos) o pueden estar dentro de un polipéptido mayor. Además, pueden estar comprendidos varios fragmentos dentro de un único polipéptido mayor. En una realización, un fragmento diseñado para la expresión en un huésped puede tener regiones heterólogas de pre- y pro-polipéptido fusionadas al extremo amino-terminal del fragmento de aminopeptidasa y otra región fusionada al extremo carboxilo-terminal del fragmento.
Por tanto, la invención proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Éstas comprenden una secuencia peptídica de aminopeptidasa operativamente unida a un péptido heterólogo que tiene una secuencia de aminoácidos que no es sustancialmente homóloga a la aminopeptidasa. "Operativamente unido" indica que el péptido de aminopeptidasa y el péptido heterólogo están fusionados en el marco. El péptido heterólogo puede fusionarse al extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la aminopeptidasa o puede ubicarse internamente.
En una realización, la proteína de fusión no afecta a la función de la aminopeptidasa per se. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión de GST en la que se fusionan secuencias de aminopeptidasa al extremo C-terminal de las secuencias de GST. Otros tipos de proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión enzimáticas, por ejemplo fusiones de beta-galactosidasa, fusiones de GAL4 de doble híbrido de levadura, fusiones de poli-His y fusiones de Ig. Tales proteínas de fusión, particularmente las fusiones de poli-His, pueden facilitar la purificación de aminopeptidasa recombinante. En determinadas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), puede aumentarse la expresión y/o secreción de una proteína usando una secuencia señal heteróloga. Por lo tanto, en otra realización, la proteína de fusión contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal.
El documento EP-A-O 464 533 describe proteínas de fusión que comprenden diversas partes de regiones constantes de inmunoglobulina. La Fc es útil en el tratamiento y el diagnóstico y por tanto da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (documento EP-A 0232 262). En el descubrimiento de nuevos fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas con partes Fc con el fin de realizar ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas (Bennett et al. (1995) J. Mol. Recog. 8:52-58 (1995) y Johanson et al. J. Biol. Chem. 270:9459-9471). Por tanto, esta invención también engloba proteínas de fusión solubles que contienen un polipéptido de aminopeptidasa y diversas partes de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, cuando tiene lugar la fusión en la región bisagra. Para algunos usos, es deseable eliminar la Fc tras haberse usado la proteína de fusión para su fin pretendido, por ejemplo cuando la proteína de fusión va a usarse como antígeno para inmunizaciones. En una realización particular, puede eliminarse la parte Fc de manera sencilla mediante una secuencia de ruptura, que también está incorporada y puede romperse con el factor Xa.
Puede producirse una proteína quimérica o de fusión mediante las técnicas de ADN recombinante habituales. Por ejemplo, se acoplan juntos fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de proteína en el marco según técnicas convencionales. En otra realización, puede sintetizarse el gen de fusión mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. Como alternativa, puede llevarse a cabo la amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos, que pueden reasociarse posteriormente y volver a amplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology). Además, están comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, una proteína GST). Puede clonarse un ácido nucleico que codifica una aminopeptidasa en un vector de expresión de este tipo de modo que el resto de fusión está unido en el marco a la aminopeptidasa.
Otra forma de proteína de fusión es una que afecta directamente a las funciones de la aminopeptidasa. En consecuencia, un polipéptido de aminopeptidasa está englobado por la presente invención en el que se han sustituido una o más de las regiones de aminopeptidasa (o partes de la misma) por regiones homólogas (o partes de las mismas) de otra aminopeptidasa. En consecuencia, son posibles diversas permutaciones. Por tanto, pueden formarse aminopeptidasas quiméricas en las que se han sustituido entre sí uno o más de las subregiones o dominios nativos.
Adicionalmente, pueden producirse proteínas de aminopeptidasa quiméricas en las que uno o más sitios funcionales se derivan de una aminopeptidasa diferente. Sin embargo, se entiende que los sitios podrían derivarse de aminopeptidasas que se producen en el genoma de un mamífero pero que aún no se han descubierto ni caracterizado.
La proteína de aminopeptidasa aislada puede purificarse a partir de células que la expresan en la naturaleza, tal como a partir de cualquiera de los tejidos mostrados en las figuras 5 y 6, especialmente purificarse a partir de células que se han alterado para que la expresen (recombinantes), o sintetizarse usando procedimientos conocidos de síntesis de proteínas.
En una realización, se produce la proteína mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de aminopeptidasa en un vector de expresión, se introduce el vector de expresión en una célula huésped y se expresa la proteína en la célula huésped. Entonces, puede aislarse la proteína a partir de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas habituales de purificación de proteínas.
Los polipéptidos contienen frecuentemente aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos denominados comúnmente como los 20 aminoácidos que se producen en la naturaleza. Además, pueden modificarse muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Se describen modificaciones comunes que se producen en la naturaleza en los polipéptidos en libros de texto básicos, monografías detalladas y la bibliografía de investigación, y las conocen bien los expertos en la técnica.
En consecuencia, los polipéptidos también engloban derivados o análogos en los que un resto de aminoácido sustituido no es uno codificado por el código genético, en los que se incluye un grupo sustituyente, en los que el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o en los que los otros aminoácidos se fusionan con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteína.
Las modificaciones conocidas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.
Tales modificaciones las conocen bien los expertos en la técnica y se han descrito en gran detalle en la bibliografía científica. Se describen varias modificaciones particularmente comunes, glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, en los libros de texto más básicos, tales como Proteins - Structure and Molecular Properties, 2ª ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Están disponibles muchas revisiones detalladas sobre este tema, tales como por Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York 1-12 (1983); Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646) y Rattan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62).
Tal como se sabe también, los polipéptidos no son siempre completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de acontecimientos postraduccionales, incluyendo acontecimientos de procesamiento naturales y acontecimientos provocados por la manipulación humana que no se producen en la naturaleza. Pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados mediante procesos naturales no traduccionales y mediante procedimientos sintéticos.
Pueden producirse modificaciones en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo-terminal. El bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente, es común en polipéptidos que se producen en la naturaleza y sintéticos. Por ejemplo, el resto amino-terminal de polipéptidos preparados en E. coli, antes del procesamiento proteolítico, será casi invariablemente N-formilmetionina.
Las modificaciones pueden ser función de cómo se prepara la proteína. Para polipéptidos recombinantes, por ejemplo, las modificaciones estarán determinadas por la capacidad de modificación postraduccional de la célula huésped y las señales de modificación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. En consecuencia, cuando se desea la glucosilación, debe expresarse un polipéptido en un huésped de glucosilación, generalmente una célula eucariota. Las células de insecto llevan a cabo con frecuencia las mismas glucosilaciones postraduccionales que las células de mamífero y, por este motivo, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar de manera eficaz proteínas de mamífero que tienen patrones de glucosilación nativos. Se aplican consideraciones similares a las otras modificaciones.
Puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o un grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener más de un tipo de modificación.
Usos del polipéptido
Pueden usarse las secuencias de proteína de la presente invención como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos publicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Pueden realizarse tales búsquedas usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las proteínas de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST según lo descrito en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los polipéptidos de aminopeptidasa son útiles para producir anticuerpos específicos para la aminopeptidasa, regiones, o fragmentos. En la figura 2, se muestran regiones que tienen una elevada puntuación del índice de antigeni-
cidad.
Los polipéptidos de aminopeptidasa son útiles para ensayos biológicos relacionados con las aminopeptidasas. Tales ensayos implican cualquiera de las funciones o actividades o propiedades de aminopeptidasa conocidas, útiles para el diagnóstico y tratamiento de estados relacionados con aminopeptidasas.
Los polipéptidos de aminopeptidasa también son útiles en ensayos de selección de fármacos, en sistemas basados en células o libres de células. Los sistemas basados en células pueden ser nativos, es decir, células que normalmente expresan la aminopeptidasa, como una biopsia o expandido en cultivo celular. Sin embargo, en una realización, los ensayos basados en células implican células huésped recombinantes que expresan la aminopeptidasa.
La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con la aminopeptidasa también puede comprender determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferentemente al polipéptido en comparación con la capacidad de una molécula de unión conocida para unirse al polipéptido.
También pueden usarse los polipéptidos para identificar compuestos que modulan la actividad aminopeptidasa. Por ejemplo, tales compuestos pueden aumentar o disminuir la afinidad o la velocidad de unión al sustrato peptídico, competir con el sustrato peptídico por la unión a la aminopeptidasa, o desplazar el sustrato peptídico unido a la aminopeptidasa. Pueden usarse tanto la aminopeptidasa como variantes y fragmentos apropiados en selecciones de alto rendimiento para someter a ensayo compuestos candidatos para determinar la capacidad para unirse a la aminopeptidasa. Estos compuestos pueden seleccionarse adicionalmente frente a una aminopeptidasa funcional para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad aminopeptidasa. Pueden identificarse compuestos que activan (agonistas) o inactivan (antagonistas) la aminopeptidasa hasta un grado deseado. Pueden realizarse procedimientos moduladores in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, como alternativa, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto).
Pueden utilizarse los polipéptidos de aminopeptidasa para seleccionar un compuesto según la capacidad para estimular o inhibir la interacción entre la proteína de aminopeptidasa y una molécula diana que normalmente interacciona con la proteína de aminopeptidasa, por ejemplo, sustrato-péptido o componente de cinc. Este ensayo incluye las etapas de combinar la proteína de aminopeptidasa con un compuesto candidato en condiciones que permiten que la proteína de aminopeptidasa o fragmento interaccione con la molécula diana, y detectar la formación de un complejo entre la proteína de aminopeptidasa y la diana o detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la aminopeptidasa y la diana.
También puede lograrse la determinación de la capacidad de la aminopeptidasa para unirse a una molécula diana usando una tecnología tal como análisis de interacción bimolecular (BIA) en tiempo real. Sjolander et al. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705. Tal como se usa en el presente documento, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguna de las moléculas que interaccionan (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Pueden usarse los cambios en la resonancia de plasmón superficial (SPR) de fenómeno óptico como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
Pueden obtenerse los compuestos de prueba de la presente invención usando cualquiera de los numerosos enfoques en los procedimientos con bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralelas espacialmente direccionables; procedimientos con bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución; el procedimiento con biblioteca "una perla-un compuesto"; y procedimientos con bibliotecas sintéticas usando selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque con la biblioteca biológica está limitado a bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de polipéptidos, oligómeros no peptídicos y pequeñas moléculas de compuestos (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
Pueden encontrarse ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo en DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233. Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), o sobre perlas (Lam (1991) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner documento USP 5.223.409), esporas (Ladner documento USP '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) o en fago (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. 97: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner citado anteriormente).
Los compuestos candidatos incluyen, por ejemplo, 1) péptidos tales como péptidos solubles, incluyendo péptidos de fusión con cola de Ig y miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios (véase, por ejemplo, Lam et al. (1991) Nature 354: 82-84; Houghten et al. (1991) Nature 354: 84-86) y bibliotecas moleculares derivadas de la química combinatoria preparadas a partir de aminoácidos con configuración D y/o L; 2) fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos, parcialmente degenerados y aleatorios, véase, por ejemplo, Songyang et al. (1993) Cell 72: 767-778); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos y de cadena sencilla así como fragmentos de Fab, F (ab')_{2}, bibliotecas de expresión de Fab, y fragmentos de unión a epítopos de anticuerpos); y 4) pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, moléculas obtenidas de bibliotecas combinatorias y de productos naturales).
Un compuesto candidato es una aminopeptidasa de longitud completa soluble o fragmento que compite por la unión al péptido. Otros compuestos candidatos incluyen aminopeptidasas mutantes o fragmentos apropiados que contienen mutaciones que afectan a la función de aminopeptidasa y compiten por el sustrato peptídico. En consecuencia, un fragmento que compite por el sustrato, por ejemplo con una mayor afinidad, o un fragmento que se une al sustrato pero no lo degrada, está englobado por la invención.
La invención proporciona otros criterios de valoración para identificar compuestos que modulan (estimulan o inhiben) la actividad aminopeptidasa. Los ensayos normalmente implican un ensayo de acontecimientos celulares que indican la actividad aminopeptidasa. Por tanto, puede someterse a prueba la expresión de genes que están regulados por incremento o regulados por disminución en respuesta a la actividad aminopeptidasa. En una realización, la región reguladora de tales genes puede unirse operativamente a un marcador que puede detectarse fácilmente, tal como luciferasa. Como alternativa, también podría medirse la modificación de la aminopeptidasa.
Puede usarse cualquiera de las funciones biológicas o bioquímicas mediadas por la aminopeptidasa como ensayo de un criterio de valoración. Estas incluyen todos los acontecimientos bioquímicos o bioquímicos/biológicos descritos en el presente documento, en las referencias citadas en el presente documento, incorporadas por referencia para estas dianas del ensayo de un criterio de valoración, y otras funciones conocidas por los expertos en la técnica.
En el caso de la aminopeptidasa, los criterios de valoración específicos pueden incluir la hidrólisis de enlaces peptídicos.
También pueden seleccionarse compuestos de unión o activación usando proteínas quiméricas de aminopeptidasa en las que puede sustituirse una o más regiones, segmentos, sitios, y similares, según lo descrito en el presente documento, o partes de los mismos, por sus equivalentes heterólogos derivados de otras aminopeptidasas. Por ejemplo, puede usarse una región catalítica que interacciona con una especificidad y/o afinidad por la secuencia peptídica diferente a la de la aminopeptidasa nativa. En consecuencia, está disponible un conjunto diferente de componentes como ensayo de un criterio de valoración para determinar la activación. Como otra alternativa, puede remplazarse el sitio de modificación por una proteína efectora, por ejemplo de fosforilación, por el sitio para una proteína efectora diferente. También puede detectarse la activación mediante un gen indicador que contiene una región codificante que puede detectarse fácilmente, operativamente unida a una secuencia reguladora de la transcripción que es parte de la ruta nativa en la que participa la aminopeptidasa.
Los polipéptidos de aminopeptidasa también son útiles en ensayos de unión competitiva en procedimientos diseñados para descubrir compuestos que interaccionan con la aminopeptidasa. Por tanto, se expone un compuesto a un polipéptido de aminopeptidasa en condiciones que permiten que el compuesto se una o interaccione de otro modo con el polipéptido. El polipéptido de aminopeptidasa soluble también se añade a la mezcla. Si el compuesto de prueba interacciona con el polipéptido de aminopeptidasa soluble, disminuye la cantidad de complejo formado o la actividad procedente de la diana de aminopeptidasa. Este tipo de ensayo es particularmente útil en los casos en los que se buscan compuestos que interaccionan con regiones específicas de la aminopeptidasa. Por tanto, el polipéptido soluble que compite con la región de la aminopeptidasa diana está diseñado para contener secuencias peptídicas correspondientes a la región de interés.
Puede usarse otro tipo de ensayo de unión competitiva para descubrir compuestos que interaccionan con sitios funcionales específicos. Como ejemplo, puede añadirse un compuesto candidato y que puede unirse a cinc a una muestra de la aminopeptidasa. Los compuestos que interaccionan con la aminopeptidasa en el mismo sitio que el cinc reducirán la cantidad de complejo formado entre la aminopeptidasa y el cinc. En consecuencia, es posible descubrir un compuesto que evita específicamente la interacción entre la aminopeptidasa y el componente de cinc. Otro ejemplo implica añadir un compuesto candidato a una muestra de aminopeptidasa y péptido sustrato. Un compuesto que compite con el péptido reducirá la cantidad de hidrólisis o unión del péptido a la aminopeptidasa. En consecuencia, pueden descubrirse compuestos que interaccionan directamente con la aminopeptidasa y compiten con el péptido. Tales ensayos pueden implicar cualquier otro componente que interaccione con la aminopeptidasa.
Para realizar ensayos de selección de fármacos libres de células, es deseable inmovilizar la aminopeptidasa, o un fragmento, o bien la molécula diana para facilitar la separación de los complejos de las formas no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como para adaptarse a la automatización del ensayo.
Pueden usarse técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los ensayos de selección de fármacos. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que la proteína se una a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/aminopeptidasa sobre perlas de glutatión-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con los lisados celulares (por ejemplo, marcados con ^{35}S) y el compuesto candidato, y se incuba la mezcla en condiciones propicias para la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sales y el pH). Tras incubación, se lavan las perlas para eliminar cualquier marcador no unido, y se inmoviliza la matriz y se determina directamente el radiomarcador, o en el sobrenadante tras disociarse los complejos. Como alternativa, pueden disociarse los complejos de la matriz, separarse mediante SDS-PAGE, y cuantificarse el nivel de proteína que se une a la aminopeptidasa que se encuentra en la fracción de las perlas a partir del gel usando técnicas electroforéticas habituales. Por ejemplo, puede inmovilizarse el polipéptido o bien su molécula diana utilizando conjugación de biotina y estreptavidina, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Como alternativa, pueden derivatizarse anticuerpos reactivos con la proteína pero que no interfieren en la unión de la proteína a su molécula diana en los pocillos de la placa, y la proteína atrapada en los pocillos mediante conjugación del anticuerpo. Se incuban preparaciones de un componente diana de unión a aminopeptidasa, tal como un péptido o componente de cinc, y un compuesto candidato en los pocillos que presentan aminopeptidasa y puede cuantificarse la cantidad de complejo atrapado en el pocillo. Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la immunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la molécula diana de aminopeptidasa, o que son reactivos con aminopeptidasa y compiten con la molécula diana; así como ensayos unidos a enzimas que se basan en detectar una actividad enzimática asociada con la molécula
diana.
Pueden usarse los moduladores de la actividad aminopeptidasa identificados según estos ensayos de selección de fármacos para tratar un sujeto con un trastorno relacionado con la aminopeptidasa, tratando las células que expresan la aminopeptidasa, tal como cualquiera de las mostradas en las figuras 5 y 6. Estos procedimientos de tratamiento incluyen las etapas de administrar los moduladores de la actividad aminopeptidasa en una composición farmacéutica según lo descrito en el presente documento, a un sujeto que necesita tal tratamiento.
Los trastornos en los que está implicado el pulmón incluyen, pero no se limitan a, anomalías congénitas; atelectasia; enfermedades de origen vascular, tales como congestión y edema pulmonar, incluyendo edema pulmonar hemodinámico y edema producido por una lesión microvascular, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (daño alveolar difuso), embolia pulmonar, hemorragia e infarto, e hipertensión pulmonar y esclerosis vascular; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, tal como enfisema, bronquitis crónica, asma bronquial, y bronquiectasia; enfermedades intersticiales difusas (infiltrativas, restrictivas), tales como neumoconiosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis intersticial descamativa, neumonitis por hipersensibilidad, eosinofilia pulmonar (infiltración pulmonar con eosinofilia), bronquiolitis obliterante con neumonía en organización, síndromes de hemorragia pulmonar difusa, incluyendo síndrome de Goodpasture, hemosiderosis pulmonar idiopática y otros síndromes hemorrágicos, implicación pulmonar en trastornos vasculares del colágeno, y proteinosis alveolar pulmonar; complicaciones de tratamientos, tales como enfermedad pulmonar inducida por fármacos, enfermedad pulmonar inducida por radiación, y trasplante de pulmón; tumores, tales como carcinoma broncogénico, incluyendo síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como tumores carcinoides bronquiales, diversos, y tumores metastásicos; patologías de la pleura, incluyendo derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotórax, y tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.
Los trastornos en los que está implicado el colon incluyen, pero no se limitan a, anomalías congénitas, tales como atresia y estenosis, divertículo de Meckel, megacolon agangliónico congénito-enfermedad de Hirschsprung; enterocolitis, tal como diarrea y disentería, enterocolitis infecciosa, incluyendo gastroenteritis vírica, enterocolitis bacteriana, enterocolitis necrosante, colitis asociada a antibióticos (colitis pseudomembranosa), y colitis colagenosa y linfocítica, trastornos inflamatorios intestinales diversos, incluyendo parásitos y protozoos, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, trasplante lesión intestinal inducida por fármacos, enterocolitis por radiación, colitis neutropénica (tiflitis), y colitis por derivación; enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; tumores del colon, tales como pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorrectal, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides.
Los trastornos en los que la expresión de la aminopeptidasa es especialmente importante incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de mama y colon, carcinoma de pulmón, especialmente carcinoma de células escamosas y trastornos relacionados con la insulina tales como diabetes.
La aminopeptidasa se sobreexpresa tanto en cáncer de pulmón, de mama como de colon. Como tal, el gen es particularmente importante para el tratamiento de estos trastornos, en los que inhibir la expresión del gen podría afectar al desarrollo y/o progresión tumoral.
La aminopeptidasa también se expresa en los tejidos mostrados en las figuras 5 y 6, y como tal está implicada específicamente en trastornos relacionados con estos tejidos.
Por tanto, los polipéptidos de aminopeptidasa son útiles para tratar un trastorno asociado con aminopeptidasa caracterizado por la expresión o actividad aberrante de una aminopeptidasa. Puede administrarse un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de selección descrito en el presente documento), o una combinación de agentes que modula (por ejemplo, regula por incremento o regula por disminución) la expresión o actividad de la proteína. La aminopeptidasa puede administrarse como tratamiento para compensar la expresión o actividad reducida o aberrante de la proteína.
Pueden administrarse aminopeptidasa o fragmentos de la proteína de aminopeptidasa solubles que compiten por el sustrato o cualquier otro componente que interacciona directamente con la aminopeptidasa, tal como cinc o cualquiera de las enzimas que modifican la aminopeptidasa. Estas aminopeptidasas o fragmentos pueden tener una afinidad superior por la diana de modo que proporcionan una competencia eficaz.
La estimulación de la actividad es deseable en situaciones en las que la proteína está regulada por disminución de manera anómala y/o en las que es probable que el aumento de la actividad tenga un efecto beneficioso. Asimismo, la inhibición de la actividad es deseable en situaciones en las que la proteína está regulada por incremento de manera anómala y/o en las que es probable que la disminución de la actividad tenga un efecto beneficioso. En un ejemplo de una situación de este tipo, un sujeto tiene un trastorno caracterizado por una diferenciación celular o desarrollo aberrante. En otro ejemplo, el sujeto tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer) o un trastorno caracterizado por una respuesta hematopoyética aberrante. En otro ejemplo, es deseable conseguir la regeneración tisular en un sujeto (por ejemplo, cuando un sujeto ha sufrido una lesión cerebral o de la médula espinal y es deseable regenerar el tejido neuronal de manera regulada).
Aún en otro aspecto de la invención, las proteínas de la invención pueden usarse como "proteínas cebo" en un ensayo de doble híbrido o un ensayo de triple híbrido (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y el documento WO 94/10300 de Brent), para identificar otras proteínas (proteínas capturadas) que se unen o interaccionan con las proteínas de la invención y modulan su actividad.
Los polipéptidos de aminopeptidasa también son útiles para proporcionar una diana para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad mediada por la aminopeptidasa, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas enfermedades tratadas en el presente documento, y particularmente carcinoma de pulmón, de mama y de colon y trastornos relacionados con la insulina, tales como la diabetes. Las dianas son útiles para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad mediada por la aminopeptidasa, en los tejidos mostrados en las figuras 5 y 6. En consecuencia, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia, o los niveles de, la aminopeptidasa en una célula, un tejido o un organismo. El procedimiento implica poner en contacto una muestra biológica con un compuesto que puede interaccionar con la aminopeptidasa de manera que la reacción pueda detectarse.
Un agente para detectar aminopeptidasa es un anticuerpo que puede unirse de manera selectiva a aminopeptidasa. Una muestra biológica incluye tejidos, células y líquidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y líquidos presentes en un sujeto.
La aminopeptidasa también proporciona una diana para diagnosticar una enfermedad activa, o la predisposición a una enfermedad, en un paciente que tiene una aminopeptidasa variante. Así, la aminopeptidasa puede aislarse de una muestra biológica y someterse a ensayo para detectar la presencia de una mutación genética que da como resultado una proteína aberrante. Esto incluye la sustitución, deleción, inserción, reorganización, (como resultado de acontecimientos de corte y empalme aberrantes) y modificación postraduccional inapropiada de aminoácidos. Los procedimientos analíticos incluyen movilidad electroforética alterada, digestión de péptidos trípticos alterada, actividad aminopeptidasa alterada en un ensayo basado en células o libre de células, alteración en la degradación o unión a péptidos, patrón de unión a anticuerpos o unión a cinc, punto isoeléctrico alterado, secuenciación directa de aminoácidos y cualquier otra técnica de ensayo conocido útil para detectar mutaciones en una proteína en general o en una aminopeptidasa de manera específica.
Las técnicas in vitro para la detección de aminopeptidasa incluyen ensayos de inmunoabsorción asociada a enzimas (ELISA), inmunotransferencias de tipo Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Como alternativa, la proteína puede detectarse in vivo en un sujeto introduciendo en el sujeto un anticuerpo anti-aminopeptidasa marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de obtención de imágenes convencionales. Son particularmente útiles los procedimientos, que detectan la variante alélica de la aminopeptidasa expresada en un sujeto, y los procedimientos, que detectan fragmentos de la aminopeptidasa en una muestra.
Los polipéptidos de aminopeptidasa también son útiles en el análisis farmacogenómico. La farmacogenómica trata de las variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a fármacos debidas a la disponibilidad del fármaco alterada y la acción anómala en personas afectadas. Véanse, por ejemplo, Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11):983-985, y Linder, M.W. (1997) Clin. Chem. 43 (2):254-266. Las consecuencias clínicas de estas variaciones dan como resultado toxicidad grave de fármacos terapéuticos en ciertos individuos o fracaso terapéutico de fármacos en ciertos individuos como un resultado de la variación individual en el metabolismo. Así, el genotipo de un individuo puede determinar el modo en que un compuesto terapéutico actúa en el cuerpo o el modo en que el cuerpo metaboliza el compuesto. Además, la actividad de las enzimas metabolizadoras de fármacos afecta tanto a la intensidad como a la duración de la acción del fármaco. Así, la farmacogenómica del individuo permite la selección de compuestos eficaces y dosificaciones eficaces de tales compuestos para el tratamiento terapéutico o profiláctico basándose en el genotipo de un individuo. El descubrimiento de polimorfismos genéticos en algunas enzimas metabolizadoras de fármacos ha explicado por qué algunos pacientes no obtienen los efectos farmacológicos esperados, muestran un efecto farmacológico exagerado o experimentan toxicidad grave a partir de dosificaciones farmacológicas convencionales. Los polimorfismos pueden expresarse en el fenotipo del metabolizador rápido y el fenotipo del metabolizador lento. En consecuencia, el polimorfismo genético puede conducir a variantes de proteína alélicas de la aminopeptidasa en las que una o más de las funciones de aminopeptidasa en una población es/son diferente(s) de la/las de la otra población. Los polipéptidos permiten así que una diana determine una predisposición genética que puede afectar a la modalidad de tratamiento. Así, en un tratamiento a base de péptidos, el polimorfismo puede dar lugar a regiones catalíticas que son más o menos activas. En consecuencia, la dosificación tendría que modificarse necesariamente para maximizar el efecto terapéutico en una población dada que contiene el polimorfismo. Como alternativa al genotipado, podrían identificarse polipéptidos polimórficos
específicos.
Los polipéptidos de aminopeptidasa también son útiles para controlar los efectos terapéuticos durante ensayos clínicos y otros tratamientos. Así, la eficacia terapéutica de una agente que se diseña para aumentar o disminuir la expresión de genes, niveles de proteínas o actividad aminopeptidasa, puede controlarse a lo largo del transcurso del tratamiento usando los polipéptidos de aminopeptidasa como diana de criterio de valoración. El control puede ser, por ejemplo, tal como sigue: (i) obtener una muestra previa a la administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o más muestras posteriores a la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína en las muestras posteriores a la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína en las muestra previas a la administración con la proteína en la muestra o las muestras posteriores a la administración; y (vi) aumentar o disminuir la administración del agente al sujeto en consecuencia.
Anticuerpos
La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera selectiva a la aminopeptidasa y sus variantes y fragmentos. Se considera que un anticuerpo se une de manera selectiva, incluso si también se une a otras proteínas que no son sustancialmente homólogas con la aminopeptidasa. Estas otras proteínas comparten homología con un fragmento o dominio de la aminopeptidasa. Esta conservación en regiones específicas da lugar a anticuerpos que se unen a ambas proteínas en virtud de la secuencia homóloga. En este caso, se entenderá que el anticuerpo que se une a la aminopeptidasa es todavía selectivo.
Para generar anticuerpos, se usa un polipéptido de aminopeptidasa aislado como un inmunógeno para generar anticuerpos usando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Puede usarse la proteína de longitud completa o bien el fragmento peptídico antigénico. En la figura 2, se muestran regiones que tienen un elevado índice de antigenicidad.
Los anticuerpos se preparan preferiblemente a partir de estas regiones o a partir de fragmentos diferenciados en estas regiones. Sin embargo, los anticuerpos pueden prepararse a partir de cualquier región del péptido según lo descrito en el presente documento. Un fragmento preferido produce un anticuerpo que disminuye o evita completamente la unión o hidrólisis del péptido. Los anticuerpos pueden desarrollarse frente a la aminopeptidasa completa o dominios de la aminopeptidasa según lo descrito en el presente documento, por ejemplo, la región de unión a cinc, el motivo de metaloproteasa (IAHELAHQW), el motivo GAMEN, sitios que contribuyen a la especificidad de exopeptidasa, y el dominio peptidasa o subregiones de la misma. Los anticuerpos también pueden desarrollarse frente a sitios funcionales específicos según lo descrito en el presente documento.
El péptido antigénico puede comprender una secuencia contigua de al menos 12, 14, 15 ó 30 restos de aminoácido. En una realización, los fragmentos corresponden a las regiones que están ubicadas en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas. Sin embargo, no ha de considerarse que estos fragmentos engloban cualquier fragmento, que puede haberse descrito antes de la invención.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}).
La detección puede facilitarse mediante acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano blanco, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamino-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de material radiactivo incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
Una preparación inmunogénica apropiada puede derivarse de péptidos nativos, expresados de manera recombinante o sintetizados químicamente.
Usos del anticuerpo
Los anticuerpos pueden usarse para aislar una aminopeptidasa mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Los anticuerpos pueden facilitar la purificación de la aminopeptidasa natural de células y la aminopeptidasa producida de manera recombinante expresada en células huésped.
Los anticuerpos son útiles para detectar la presencia de aminopeptidasa en células o tejidos para determinar el patrón de expresión de la aminopeptidasa entre diversos tejidos en un organismo y durante el transcurso del desarrollo normal.
Los anticuerpos pueden usarse para detectar la aminopeptidasa in situ, in vitro, o en un sobrenadante o lisado celular con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión.
Los anticuerpos pueden usarse para evaluar la distribución tisular anómala o la expresión anómala durante el desarrollo.
Puede usarse la detección con anticuerpos de fragmentos circulantes de la aminopeptidasa de longitud completa para identificar el recambio de aminopeptidasa.
Además, los anticuerpos pueden usarse para evaluar la expresión de aminopeptidasa en estados patológicos tales como en fases activas de la enfermedad o en un individuo con una predisposición a la enfermedad relacionada con la función de la aminopeptidasa. Cuando un trastorno está producido por una distribución tisular, una expresión en el desarrollo o un nivel de expresión inapropiados de la proteína de aminopeptidasa, el anticuerpo puede prepararse frente a la proteína de aminopeptidasa normal. Si un trastorno se caracteriza por una mutación específica en la aminopeptidasa, pueden usarse anticuerpos específicos para esta proteína mutante para someter a ensayo la presencia de la aminopeptidasa mutante específica. Sin embargo, también están englobados los anticuerpos preparados de manera intracelular ("intracuerpos"), que reconocerían regiones peptídicas de aminopeptidasa intra-
celulares.
Los anticuerpos también pueden usarse para evaluar la ubicación subcelular normal y aberrante de células en diversos tejidos en un organismo. Los anticuerpos pueden desarrollarse frente a la aminopeptidasa completa o partes de la aminopeptidasa, por ejemplo, partes del dominio peptidasa desde el aminoácido 69-458, incluyendo el sitio de reconocimiento del sustrato.
Pueden aplicarse los usos diagnósticos, no sólo en pruebas genéticas, sino también para controlar una modalidad de tratamiento. En consecuencia, si el tratamiento tiene como objetivo en última instancia corregir el nivel de expresión de la aminopeptidasa o la presencia de aminopeptidasas aberrantes y la expresión en el desarrollo o la distribución tisular aberrante, pueden usarse los anticuerpos dirigidos frente a la aminopeptidasa o fragmentos pertinentes para controlar la eficacia terapéutica.
En consecuencia, los anticuerpos pueden usarse en diagnóstico para controlar los niveles de proteínas en tejidos como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, tal como, para determinar por ejemplo la eficacia de un régimen de tratamiento dado.
Adicionalmente, los anticuerpos son útiles en el análisis farmacogenómico. Así, pueden usarse los anticuerpos preparados frente a aminopeptidasa polimórfica para identificar individuos que requieren modalidades de tratamiento modificadas.
Los anticuerpos también son útiles como herramientas de diagnóstico como un marcador inmunológico para la aminopeptidasa aberrante analizada mediante la movilidad electroforética, punto isoeléctrico, digestión de péptidos trípticos y otros ensayos físicos conocidos por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos también son útiles para el tipado de tejidos. Así, cuando se ha correlacionado una aminopeptidasa específica con la expresión en un tejido específico, pueden usarse los anticuerpos que son específicos para esta aminopeptidasa para identificar un tipo de tejido.
Los anticuerpos también son útiles en la identificación forense. En consecuencia, cuando se ha correlacionado un individuo con un polimorfismo genético específico dando como resultado una proteína polimórfica específica, puede usarse un anticuerpo específico para la proteína polimórfica como ayuda en la identificación.
Los anticuerpos también son útiles para inhibir la función de la aminopeptidasa, por ejemplo, la unión a cinc, y la hidrólisis y/o unión a péptidos.
Estos usos también pueden aplicarse en un contexto terapéutico en el que el tratamiento implica inhibir la función de la aminopeptidasa. Un anticuerpo puede usarse, por ejemplo, para bloquear la unión a péptidos. Pueden preparase anticuerpos frente a fragmentos específicos que contienen sitios requeridos para la función o frente a aminopeptidasa intacta asociada con una célula.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Para un revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg et al. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para un estudio detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, por ejemplo, la patente estadounidense 5.625.126; la patente estadounidense 5.633.425; la patente estadounidense 5.569.825; la patente estadounidense 5.661.016; y la patente estadounidense 5.545.806.
La invención también engloba kits para usar anticuerpos para detectar la presencia de una proteína de aminopeptidasa en una muestra biológica. El kit puede comprender anticuerpos tales como un anticuerpo marcado o que puede marcarse y un compuesto o agente para la detección de la aminopeptidasa en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de aminopeptidasa en la muestra; y medios para comparar la cantidad de aminopeptidasa en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar envasado en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además las instrucciones de uso del kit para detectar la aminopeptidasa.
Polinucleótidos
La secuencia de nucleótidos en la SEC ID NO: 2 se obtuvo secuenciando el ADNc humano depositado. En consecuencia, la secuencia del clon depositado está controlando cualquier discrepancia entre las dos y cualquier referencia a la secuencia de la SEC ID NO: 2 incluye la referencia a la secuencia del ADNc depositado.
El ADNc descrito específicamente comprende la región codificante y las secuencias no traducidas en 5' y 3' en la SEC ID NO: 2.
La invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican la aminopeptidasa novedosa. La expresión "polinucleótido de aminopeptidasa" o "ácido nucleico de aminopeptidasa" se refiere a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2 o en el ADNc depositado. La expresión "polinucleótido de aminopeptidasa" o "ácido nucleico de aminopeptidasa" incluye además variantes y fragmentos de los polinucleótidos de aminopeptidasa.
Un ácido nucleico de aminopeptidasa "aislado" es uno que se separa de otros ácidos nucleicos presentes en la fuente natural del ácido nucleico de aminopeptidasa. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean en la naturaleza el ácido nucleico de aminopeptidasa (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Sin embargo, puede haber algunas secuencias de nucleótidos flanqueantes, por ejemplo de hasta aproximadamente 5 KB. El punto importante es que el ácido nucleico de aminopeptidasa esta aislado de secuencias flanqueantes de modo que puede someterse a manipulaciones específicas descritas en el presente documento, tales como expresión recombinante, preparación de sondas y cebadores y otros usos específicos para las secuencias de ácido nucleico de aminopeptidasa.
Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc o ARN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse a otras secuencias codificantes o reguladoras y considerarse todavía aislado.
En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo, un extracto bruto que contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material puede purificarse hasta homogeneidad esencial, por ejemplo tal como se determina mediante PAGE o cromatografía en columna tal como HPLC. Preferiblemente, un ácido nucleico aislado comprende al menos aproximadamente un 50%, 80% o 90% (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante que se mantienen en células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN aisladas de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención incluyen además tales moléculas producidas sintéticamente.
En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo, un extracto bruto que contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material puede purificarse hasta homogeneidad esencial, por ejemplo tal como se determina mediante PAGE o cromatografía en columna tal como HPLC. Preferiblemente, un ácido nucleico aislado comprende al menos aproximadamente un 50%, 80% o 90% (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden codificar la proteína madura más aminoácidos amino- o carboxi-terminales adicionales, o aminoácidos interiores con respecto al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde el precursor hasta una forma madura, facilitar el tráfico de proteínas, prolongar o acortar la semivida de la proteína o facilitar la manipulación de una proteína para someterla a ensayo o su producción, entre otras cosas. Tal como es generalmente el caso in situ, los aminoácidos adicionales pueden procesarse aparte de la proteína madura mediante enzimas celulares.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa incluyen, pero no se limitan a, la secuencia que codifica el polipéptido maduro solo, la secuencia que codifica el polipéptido maduro y secuencias codificantes adicionales, tales como una secuencia secretora o líder (por ejemplo, una secuencia pre-pro o pro-proteína), la secuencia que codifica el polipéptido maduro, con o sin la secuencias codificantes adicionales, más secuencias no codificantes adicionales, por ejemplo intrones y secuencias en 5' y 3' no codificantes tales como las secuencias transcritas pero no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, procesamiento de ARNm (incluyendo señales de poliadenilación y corte y empalme), unión a ribosomas y estabilidad del ARNm. Además, el polinucleótido puede fusionarse a una secuencia de marcador que codifica, por ejemplo, un péptido que facilita la purificación.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido mediante técnicas de síntesis química o mediante una combinación de las mismas. El ácido nucleico, especialmente ADN, puede ser de cadena doble o de cadena sencilla. El ácido nucleico de cadena sencilla puede ser la cadena codificante (cadena sentido) o la cadena no codificante (cadena antisentido).
El ácido nucleico de aminopeptidasa puede comprender las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID NO: 2, correspondiente a un ADNc de células endoteliales humanas.
En una realización, el ácido nucleico de aminopeptidasa comprende sólo la región codificante.
La invención proporciona además polinucleótidos de aminopeptidasa variantes, y fragmentos de los mismos, que difieren en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético y por tanto codifican la misma proteína que la codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 2.
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico de aminopeptidasa que codifican los polipéptidos variantes descritos en el presente documento. Tales polinucleótidos pueden producirse en la naturaleza, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus) y ortólogos (diferente organismo), o pueden construirse mediante procedimientos de ADN recombinante o mediante síntesis química. Tales variantes que no se producen en la naturaleza pueden preparase mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo aquéllas aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. En consecuencia, según lo tratado anteriormente, las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos.
Normalmente, las variantes tienen una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2 y los complementos de la misma. La variación puede producirse en cada una o ambas de las regiones codificante y no codificante. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas como no conservativas.
Las variantes alélicas, homólogos y ortólogos pueden identificarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una aminopeptidasa que es homóloga normalmente en al menos aproximadamente un 60-65%, 65-70%, 70-75%, más normalmente en al menos aproximadamente un 80-85%, y lo más normalmente en al menos aproximadamente un 90-95% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 2 o un fragmento de esta secuencia. Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente ya que pueden hibridar en condiciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 2 o a fragmento de la secuencia. Ha de entenderse que la hibridación rigurosa no indica homología sustancial cuando se debe a homología general, tal como las secuencias de poli-A, o secuencias comunes a todas o la mayor parte de las proteínas, metaloproteasas, todas las proteínas de unión a cinc, todas las proteínas de la familia M1 o todas las aminopeptidasas. Además, ha de entenderse que las variantes no incluyen ninguna de las secuencias de ácido nucleico que pueden haberse descrito antes de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir condiciones para la hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido homólogas al menos en un 50-55%, 55% entre sí, normalmente siguen estando hibridadas entre sí. Las condiciones pueden ser de manera que las secuencias idénticas en al menos aproximadamente un 65%, en al menos aproximadamente un 70%, en al menos aproximadamente un 75%, en al menos aproximadamente un 80%, en al menos aproximadamente un 90%, en al menos aproximadamente un 95% o más entre sí, siguen estando hibridadas entre sí. Los expertos en la técnica conocen tales condiciones rigurosas y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado por referencia. Un ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación son hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 50-65ºC. En otro ejemplo no limitante, las moléculas de ácido nucleico se dejan hibridar en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados de baja rigurosidad en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a temperatura ambiente, o mediante uno o más lavados de rigurosidad moderada en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a 42ºC, o lavado en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC para la rigurosidad alta. En una realización, una molécula de ácido nucleico aislado que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de la SEC ID NO: 2 corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce en la naturaleza. Tal como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "que se produce en la naturaleza" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural).
Tal como entienden los expertos en la técnica, pueden determinarse empíricamente las condiciones exactas y dependerán de la fuerza iónica, temperatura y la concentración de agentes desestabilizantes tales como formamida o agentes desnaturalizantes tales como SDS. Otros factores considerados en la determinación de las condiciones de hibridación deseadas incluyen la longitud de las secuencias de ácido nucleico, la composición de bases, el apareamiento erróneo en porcentaje entre las secuencias de hibridación y la frecuencia de aparición de subconjuntos de las secuencias dentro de otras secuencias no idénticas. Así, pueden determinarse condiciones equivalentes variando uno o más de estos parámetros mientras que se mantiene un grado de identidad o similitud similar entre las moléculas de ácido nucleico.
La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que contienen una parte o un fragmento de cadena sencilla o doble que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o el complemento de la SEC ID NO: 2. En una realización, el ácido nucleico está constituido por una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 y el complemento de la SEC ID NO: 2. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención son al menos de aproximadamente 15, preferiblemente al menos de aproximadamente 18, 20, 23 ó 25 nucleótidos, y pueden ser de 30, 40, 50, 100, 200, 500 o más nucleótidos de longitud. Son útiles fragmentos más largos, por ejemplo, de 30 o más nucleótidos de longitud, que codifican polipéptidos o proteínas antigénicas descritos en el presente documento.
Además, la invención proporciona polinucleótidos que comprenden un fragmento de los polinucleótidos de aminopeptidasa de longitud completa. El fragmento puede ser de cadena sencilla o doble y puede comprender ADN o ARN. El fragmento puede derivarse de la secuencia codificante o bien de la no codificante.
En otra realización, un ácido nucleico de aminopeptidasa aislado codifica la región codificante completa. En otra realización, el ácido nucleico de aminopeptidasa aislado codifica una secuencia correspondiente a la proteína madura que puede ser desde aproximadamente el aminoácido 6 hasta el último aminoácido. Otros fragmentos incluyen secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de aminoácidos descritos en el presente documento.
Así, los fragmentos de ácido nucleico de aminopeptidasa incluyen además secuencias correspondientes a las regiones descritas en el presente documento, subregiones también descritas y sitios funcionales específicos. Los fragmentos de ácido nucleico de aminopeptidasa también incluyen combinaciones de las regiones, segmentos, motivos y otros sitios funcionales descritos anteriormente. Un experto en la técnica será consciente de las muchas permutaciones que son posibles.
Cuando se ha previsto la ubicación de las regiones o sitios mediante análisis informático, un experto en la técnica apreciará que los restos de aminoácidos que constituyen estas regiones puede variar dependiendo de los criterios usados para definir las regiones.
Sin embargo, ha de entenderse que un fragmento de aminopeptidasa incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que no incluya el gen completo.
La invención también proporciona fragmentos de ácido nucleico de aminopeptidasa que codifican regiones que portan epítopos de las proteínas de aminopeptidasa descritas en el presente documento.
No ha de considerarse que los fragmentos de ácido nucleico, según la presente invención, engloban aquellos fragmentos que pueden haberse descrito antes de la invención.
Usos de polinucleótidos
La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las proteínas de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST según lo descrito en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los fragmentos de ácido nucleico de la invención proporcionan sondas o cebadores en ensayos tales como los descritos a continuación. Las "sondas" son oligonucleótidos que hibridan de una manera específica de base con una cadena complementaria de ácido nucleico. Tales sondas incluyen ácidos polipéptido-nucleicos, según lo descrito en Nielsen et al. (1991) Science 254:1497-1500. Normalmente, una sonda comprende una región de una secuencia de nucleótido que hibrida en condiciones altamente rigurosas con al menos aproximadamente 15, normalmente de manera aproximada 20-25, y más normalmente de manera aproximada 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NO: 2 y los complementos de la misma. Más normalmente, la sonda comprende además un marcador, por ejemplo, radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor enzimático.
Tal como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido de cadena sencilla que actúa como un punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida por molde usando procedimientos bien conocidos (por ejemplo, PCR, LCR) incluyendo, pero sin limitarse a los descritos en el presente documento. La longitud apropiada del cebador dependerá del uso particular, pero normalmente oscila entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos. La expresión "sitio de cebador" se refiere a la zona del ADN diana con la que hibrida un cebador. La expresión "par de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador (en el sentido de) 5' que hibrida con el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que va a amplificarse y un cebador (en el sentido de) 3' que hibrida con el complemento de la secuencia que va a amplificarse.
Por tanto, los polinucleótidos de aminopeptidasa son útiles para sondas, cebadores y en ensayos biológicos.
Cuando se usan los polinucleótidos para evaluar las funciones o propiedades de aminopeptidasa, tal como en los ensayos descritos en el presente documento, puede ser útil todo o menos de todo el ADNc completo. Los ensayos dirigidos específicamente a las funciones de aminopeptidasa, tales como evaluar la actividad agonista o antagonista, engloban el uso de fragmentos conocidos. Además los procedimientos de diagnóstico para evaluar la función de aminopeptidasa también pueden ponerse en práctica con cualquier fragmento, incluyendo aquellos fragmentos que pueden haberse conocido antes de la invención. De manera similar, en los procedimientos que implican el tratamiento de la disfunción de aminopeptidasa, se engloban todos los fragmentos incluyendo aquéllos que pueden haberse conocido en la técnica.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa son útiles como una sonda de hibridación para ADNc y ADN genómico para aislar un ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican los polipéptidos descritos en la SEC ID NO: 1 y para aislar ADNc y clones genómicos que corresponden a variantes que producen los mismos polipéptidos mostrados en la SEC ID NO: 1 o las otras variantes descritas en el presente documento. Pueden aislarse variantes a partir del mismo tejido y organismo de los que se aislaron los polipéptidos mostrados en la SEC ID NO: 1, diferentes tejidos del mismo organismo, o de diferentes organismos. Este procedimiento es útil para aislar genes y ADNc que están controlados con respecto al desarrollo y por tanto pueden expresarse en el mismo tejido o diferentes tejidos en diferente momentos del desarrollo de un organismo.
La sonda puede corresponder a cualquier secuencia a lo largo de la longitud completa del gen que codifica la aminopeptidasa. En consecuencia, podría derivarse de regiones en 5' no codificantes, la región codificante y regiones en 3' no codificantes.
La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el ADNc de longitud completa de la SEC ID NO: 2, o un fragmento del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 12, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con ARNm o ADN.
Los fragmentos de los polinucleótidos descritos en el presente documento también son útiles para sintetizar fragmentos mayores o polinucleótidos de cadena completa descritos en el presente documento. Por ejemplo, un fragmento puede hibridar con cualquier parte de un ARNm y puede producirse un ADNc de longitud completa o mayor.
Los fragmentos también son útiles para sintetizar moléculas antisentido de secuencia y longitud deseadas.
Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden diseñarse usando las secuencias de nucleótidos de la SEC ID NO: 2, y construirse usando reacciones de síntesis química y acoplamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen en la naturaleza o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés).
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden modificarse en el resto de base, resto de azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de desoxirribosa-fosfato de los ácidos nucleicos puede modificarse para generar ácidos péptido-nucleicos (véase Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5). Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "ácidos péptido-nucleicos" o "APN" se refieren a miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, miméticos de ADN, en los que el esqueleto de desoxirribosa-fosfato está reemplazado por un esqueleto de pseudopéptido y sólo se mantienen las cuatro bases nitrogenadas naturales. El esqueleto neutro de los APN ha mostrado que permite la hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de APN puede realizarse usando protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida convencionales según lo descrito en Hyrup et al. (1996), citado anteriormente; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670. Los APN pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar su estabilidad, especificidad o captación celular, uniendo grupos lipófilos u otros auxiliares al APN, mediante la formación d quimeras de APN-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la técnica. La síntesis de quimeras de APN-ADN puede realizarse según lo descrito en Hyrup (1996), citado anteriormente, Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17):3357-63, Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973, y Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119.
Las moléculas de ácido nucleico y fragmentos de la invención también pueden incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana las aminopeptidasas de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; publicación PCT número WO 88/0918) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT número WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de rotura que desencadenan hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes de intercalación (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm Res. 5:539-549).
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles como cebadores para PCR para amplificar cualquier región dada de un polinucleótido de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para construir vectores recombinantes. Tales vectores incluyen vectores de expresión que expresan una parte de, o la totalidad de, los polipéptidos de aminopeptidasa. Los vectores también incluyen vectores de inserción, usados para integrarse en otra secuencia de polinucleótido, tales como en el genoma celular, para alterar in situ la expresión de genes de aminopeptidasa y productos génicos. Por ejemplo, una secuencia codificante de aminopeptidasa endógena puede reemplazarse por medio de recombinación homóloga por toda o parte de la región codificante que contiene una o más mutaciones introducidas de manera específica.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para expresar partes antigénicas de las proteínas de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles como sondas para determinar las posiciones cromosómicas de los polinucleótidos de aminopeptidasa por medio de procedimientos de hibridación in situ, tales como FISH. (Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, Nueva York), y el mapeo por PCR de los híbridos de células somáticas. El mapeo de las secuencias en los cromosomas es una primera etapa importante para correlacionar estas secuencias con los genes asociados con enfermedades.
Pueden usarse individualmente reactivos para el mapeo cromosómico para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma, o pueden usarse paneles de reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. En realidad se prefieren los reactivos que corresponden a las regiones no codificantes de los genes para los fines de mapeo. Es más probable que las secuencias codificantes se conserven dentro de las familias de genes, aumentando así la oportunidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.
Una vez que se ha mapeado una secuencia en una ubicación cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la biblioteca médica Welch de la Universidad Johns Hopkins). La relación entre un gen y una enfermedad mapeados en la misma región cromosómica, puede identificarse entonces a través del análisis del ligamiento (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes), descrito en, por ejemplo, Egeland et al. ((1987) Nature 325:783-787).
Además, pueden determinarse las diferencias en las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados por una enfermedad asociada con un gen específico. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ninguno de los individuos no afectados, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad particular. La comparación de individuos afectados y no afectados generalmente implica en primer lugar buscar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones, que son visibles a partir de extensiones cromosómicas, o pueden detectarse usando PCR basada en esa secuencia de ADN. Finalmente, puede realizarse la secuenciación completa de genes procedentes de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir las mutaciones de los polimorfismos.
Las sondas de polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para determinar patrones de la presencia del gen que codifica las aminopeptidasas y sus variantes con respecto a la distribución tisular, por ejemplo, si se ha producido duplicación génica y si la duplicación de produce en todos o sólo un subconjunto de tejidos. Los genes pueden producirse en la naturaleza o pueden haberse introducido en una célula, tejido, u organismo de manera
exógena.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para diseñar ribozimas que corresponden a la totalidad, o una parte, del ARNm producido a partir de los genes que codifican los polinucleótidos descritos en el presente documento.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para construir células huésped que expresan una parte, o la totalidad, de los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para construir animales transgénicos que expresan la totalidad, o una parte, de los polipéptidos y polinucleótidos de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para preparar vectores que expresan parte, o la totalidad, de los polipéptidos de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles como sondas de hibridación para determinar el nivel de expresión de ácido nucleico de aminopeptidasa. En consecuencia, las sondas pueden usarse para detectar la presencia de, o para determinar los niveles de, ácido nucleico de aminopeptidasa en células, tejidos y en organismos. El ácido nucleico cuyo nivel se determina puede ser ADN o ARN. En consecuencia, pueden usarse sondas correspondientes a los polipéptidos descritos en el presente documento para calcular el número de copias génicas en una célula, tejido u organismo dado. Esto es particularmente importante en los casos en los que existe una amplificación de los genes de aminopeptidasa.
Como alternativa, la sonda puede usarse en un contexto de hibridación in situ para evaluar la posición de copias extras de los genes de aminopeptidasa, como en elementos extracromosómicos o como integrada en los cromosomas en los que no se encuentra normalmente el gen de aminopeptidasa, por ejemplo como una región de tinción homogénea.
Estos usos son importantes para el diagnóstico de trastornos que implican un aumento o disminución de la expresión de aminopeptidasa con respecto a la normal, tal como un trastorno proliferativo, un trastorno del desarrollo o la diferenciación, o un trastorno hematopoyético.
Los trastornos en los que es importante la expresión de aminopeptidasa incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón y colon y trastornos relacionados con la insulina, tales como la diabetes.
La aminopeptidasa se expresa en los tejidos mostrados en las figuras 5 y 6. Como tal, el gen es particularmente importante para el tratamiento de trastornos en los que están implicados estos tejidos, especialmente pulmón, mama y colon.
Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del ácido nucleico de aminopeptidasa, en el que se obtiene una muestra de prueba de un sujeto y se detecta un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico), en el que se diagnostica la presencia del ácido nucleico a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del ácido nucleico.
Un aspecto de la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de ácido nucleico así como la actividad en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar si un individuo padece una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno, asociado con la expresión o actividad aberrante del ácido nucleico. Tales ensayos pueden usarse para fines predictivos o de pronóstico para tratar así de manera profiláctica a un individuo antes de la aparición de un trastorno caracterizado por o asociado con la expresión o actividad de las moléculas de ácido nucleico.
Las técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones de tipo Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para detectar ADN incluyen hibridaciones de tipo Southern e hibridación in situ.
Pueden usarse sondas como una parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan la aminopeptidasa, tal como mediante la medición del nivel de un ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, ARNm o ADN genómico, o determinar si se ha mutado el gen de aminopeptidasa.
Los ensayos de expresión de ácido nucleico son útiles para la selección de fármacos para identificar compuestos que modulan la expresión de ácido nucleico de aminopeptidasa (por ejemplo, fármacos antisentido, polipéptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos). Se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión de ARNm. El nivel de expresión del ARNm en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato puede identificarse entonces como un modulador de la expresión de ácido nucleico basándose en esta comparación y puede usarse, por ejemplo, para tratar un trastorno caracterizado por una expresión aberrante de ácido nucleico. El modulador puede unirse al ácido nucleico o modular indirectamente la expresión, tal como mediante la interacción con otros componentes celulares que afectan a la expresión de ácido nucleico.
Los procedimientos de modulación pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, como alternativa, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto) en pacientes o en animales transgénicos.
Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que puede usarse para tratar un trastorno asociado con la expresión de ácido nucleico del gen de aminopeptidasa. El procedimiento normalmente incluye someter a ensayo la capacidad del compuesto para modular la expresión del ácido nucleico de aminopeptidasa e identificar así un compuesto que puede usarse para tratar un trastorno caracterizado por la expresión indeseada del ácido nucleico de aminopeptidasa.
Los ensayos pueden realizarse en sistemas basados en células o libres de células. Los ensayos basados en células incluyen células que expresan en la naturaleza el ácido nucleico de aminopeptidasa o células recombinantes modificadas mediante ingeniería genética para expresar secuencias de ácido nucleico específicas.
Como alternativa, pueden someterse a ensayo in vivo compuestos candidatos en pacientes o en animales transgénicos.
El ensayo para determinar la expresión del ácido nucleico de aminopeptidasa puede implicar el ensayo directo de los niveles del ácido nucleico, tales como los niveles de ARNm, o en compuestos secundarios (tales como la hidrólisis de péptidos). Además, también puede someterse a ensayo la expresión de genes que están regulados por incremento o por disminución en respuesta a la actividad aminopeptidasa. En esta realización, las regiones reguladoras de estos genes pueden estar unidas operativamente a un gen indicador tal como luciferasa.
Así, los moduladores de la expresión del gen de aminopeptidasa pueden identificarse en un procedimiento en el que se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión de ARNm. El nivel de expresión de ARNm de aminopeptidasa en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de ARNm de aminopeptidasa en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato puede identificarse entonces como un modulador de la expresión del ácido nucleico basándose en esta comparación y usarse, por ejemplo, para tratar un trastorno caracterizado por la expresión aberrante del ácido nucleico. Cuando la expresión de ARNm es estadísticamente mayor de manera significativa en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión del ácido nucleico. Cuando la expresión del ácido nucleico es estadísticamente menor de manera significativa en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión del ácido nucleico.
La invención se refiere a un tratamiento, con el ácido nucleico como diana, que usa un compuesto identificado mediante la selección de fármacos como un modulador de genes para modular la expresión del ácido nucleico de aminopeptidasa. La modulación incluye tanto la regulación por incremento (es decir la activación o agonización) o regulación por disminución (supresión o antagonización) o efectos sobre la actividad del ácido nucleico (por ejemplo cuando el ácido nucleico está mutado o modificado de manera inapropiada). El tratamiento es de trastornos caracterizados por la expresión o actividad aberrante del ácido nucleico.
Los trastornos en los que es pertinente la expresión de aminopeptidasa incluyen, pero no se limitan a, los tratados en el presente documento y particularmente en carcinoma de pulmón y colon y trastorno relacionado con insulina, tal como diabetes.
Como alternativa, un modulador para la expresión del ácido nucleico de aminopeptidasa puede ser una molécula pequeña o fármaco identificado usando los ensayos de selección descritos en el presente documento siempre que la molécula pequeña o fármaco inhiba la expresión del ácido nucleico de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para controlar la eficacia de los compuestos de modulación sobre la expresión o actividad del gen de aminopeptidasa en ensayos clínicos o en un régimen de tratamiento. Así, el patrón de expresión génica puede servir como un barómetro para la eficacia continuada del tratamiento con el compuesto, particularmente con compuestos a los que un paciente puede desarrollar resistencia. El patrón de expresión génica también puede servir como un marcador indicativo de una respuesta fisiológica de las células afectadas al compuesto. Por consiguiente, tal control permitiría un aumento de la administración del compuesto o bien la administración de compuestos alternativos a los que el paciente no se ha vuelto resistente. De manera similar, si el nivel de expresión del ácido nucleico disminuye por debajo de un nivel considerable, la administración del compuesto podría disminuirse de manera correspondiente.
El control puede ser, por ejemplo, tal como sigue: (i) obtener una muestra previa a la administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de un ARNm o ADN genómico específico de la invención en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o más muestras posteriores a la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad del ARNm o ADN genómico en las muestras posteriores a la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad del ARNm o ADN genómico en la muestra previa a la administración con el ARNm o ADN genómico en la muestra o las muestras posterior(es) a la administración; y (vi) aumentar o disminuir la administración del agente al sujeto en consecuencia.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles en los ensayos de diagnóstico para determinar cambios cualitativos en el ácido nucleico de aminopeptidasa, y particularmente en cambios cualitativos que conducen a una patología. Los polinucleótidos pueden usarse para detectar mutaciones en genes de aminopeptidasa y productos de expresión génica tales como ARNm. Los polinucleótidos pueden usarse como sondas de hibridación para detectar las mutaciones genéticas que se producen en la naturaleza en el gen de aminopeptidasa y para determinar así si un sujeto con la mutación está en riesgo de padecer un trastorno producido por la mutación. Las mutaciones incluyen deleción, adición o sustitución de uno o más nucleótidos en el gen, reorganización cromosómica, tal como inversión o transposición, modificación del ADN genómico, tal como patrones de metilación aberrante o cambios en el número de copias génicas, tal como amplificación. La detección de una forma mutada del gen de aminopeptidasa asociada con una disfunción proporciona una herramienta de diagnóstico para determinar una enfermedad activa o la propensión a la enfermedad cuando la enfermedad resulta de la sobreexpresión, subexpresión o expresión alterada de una aminopeptidasa.
Pueden detectarse mutaciones en el gen de aminopeptidasa al nivel de ácido nucleico mediante una variedad de técnicas. Puede analizarse el ADN genómico directamente o puede amplificarse usando PCR antes del análisis. Puede usarse ARN o ADNc del mismo modo.
En ciertas realizaciones, la detección de la mutación implica el uso de una sonda / un cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo las patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de anclaje o RACE-PCR, o, como alternativa, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen (véase Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, ARN genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente con un gen en condiciones tales que se produce la hibridación y la amplificación del gen (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Pueden detectarse deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales mediante la hibridación de secuencias de ADN amplificadas con secuencias de ARN normales o de ADN antisentido.
Se prevé que puede ser deseable usar PCR y/o LCR como una etapa de amplificación preliminar en conjunción con cualquiera de las técnicas usadas para detectar las mutaciones descritas en el presente documento.
Los procedimientos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replicasa (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), o cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos.
Como alternativa, pueden identificarse directamente mutaciones en un gen de aminopeptidasa, por ejemplo, mediante alteraciones en los patrones de digestión con enzimas de restricción determinados mediante electroforesis en gel.
Además, pueden usarse ribozimas específicas de secuencia (patente estadounidense número 5.498.531) para puntuar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o la pérdida de un sitio de ruptura de ribozima.
Pueden distinguirse las secuencias perfectamente apareadas de las secuencias con apareamiento erróneo mediante los ensayos de digestión con ruptura de nucleasas o mediante diferencias en la temperatura de fusión.
También pueden evaluarse los cambios en las secuencias en ubicaciones específicas mediante ensayos de protección de nucleasas tales como el procedimiento de ruptura química o de protección de ARNasa y S1.
Además, pueden determinarse las diferencias en la secuencia entre un gen de aminopeptidasa mutante y un gen de tipo natural mediante la secuenciación directa de ADN. Pueden utilizarse una variedad de procedimientos de secuenciación automática cuando se realizan los ensayos de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19:448), incluyendo la secuenciación mediante espectrometría de masas (véanse, por ejemplo, la publicación internacional PCT número WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).
Otros procedimientos para detectar mutaciones en el gen incluyen procedimientos en los que se usa la protección de los agentes de ruptura para detectar las bases con apareamiento erróneo en dúplex de ARN/ARN o de ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230:1242); Cotton et al. (1988) PNAS 85:4397; Saleeba et al. (1992) Meth. Enzymol. 217:286-295), se compara la movilidad electroforética del ácido nucleico mutante y de tipo natural (Orita et al. (1989) PNAS 86:2766; Cotton et al. (1993) Mutat. Res. 285:125-144; y Hayashi et al. (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79), y se somete a ensayo el movimiento de los fragmentos mutantes o de tipo natural en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de agente desnaturalizante usando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (Myers et al. (1985) Nature 313:495). La sensibilidad del ensayo puede mejorarse usando ARN (más que ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización, el procedimiento objeto utiliza análisis de heterodúplex para separar las moléculas de heterodúplex de cadena doble basándose en los cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5). Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, hibridación selectiva con oligonucleótidos, amplificación selectiva y extensión de cebadores selectiva.
En otras realizaciones, pueden identificarse mutaciones genéticas hibridando ácidos nucleicos de una muestra y control, por ejemplo, ADN o ARN, con alineamientos de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2:753-759). Por ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en alineamientos bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas mediante luz según lo descrito en Cronin et al, citado anteriormente. Brevemente, puede usarse una primera alineación de hibridación de sondas para explorar a través de tramos largos de ADN en una muestra y control para identificar los cambios de base entre las secuencias preparando alineaciones lineales de sondas solapantes secuenciales. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida por una segunda alineación de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando alienaciones de sondas especializadas, más pequeñas complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada alineación de mutación está compuesta por conjuntos de sondas paralelas, uno complementario al gen de tipo natural y el otro complementario al gen mutante.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para someter a prueba a un individuo para detectar un genotipo que, aunque, no necesariamente produce la enfermedad, en cambio afecta a la modalidad de tratamiento. Por tanto, los polinucleótidos pueden usarse para estudiar la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta del individuo a un compuesto usado para el tratamiento (relación farmacogenómica). En el presente caso, por ejemplo, una mutación en el gen de aminopeptidasa que da como resultado una afinidad alterada por cinc podría dar como resultado un efecto farmacológico excesivo o disminuido con concentraciones convencionales de cinc. En consecuencia, los polinucleótidos de aminopeptidasa descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar el contenido de mutación del gen en un individuo con el fin de seleccionar un régimen de dosificación o compuesto apropiado para el tratamiento.
Por tanto, los polinucleótidos que presentan variaciones genéticas que afectan al tratamiento proporcionan una diana de diagnóstico que puede usarse para adaptar el tratamiento en un individuo. En consecuencia, la producción de células y animales recombinantes que contienen estos polimorfismos permite el diseño clínico eficaz de regímenes de dosificación y compuestos de tratamiento.
Los procedimientos pueden implicar obtener una muestra biológica de control de un sujeto control, poner en contacto la muestra control con un compuesto o agente que puede detectar ARNm, o ADN genómico, de modo que la presencia de ARNm o ADN genómico se detecta en la muestra biológica, y comparar la presencia de ARNm o ADN genómico en la muestra control con la presencia de ARNm o ADN genómico en la muestra de prueba.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también son útiles para la identificación cromosómica cuando la secuencia se identifica con un cromosoma individual y en una ubicación particular en el cromosoma. En primer lugar, la secuencia de ADN se aparea al cromosoma mediante hibridación in situ u otra hibridación específica de cromosomas. Las secuencias pueden correlacionarse también con cromosomas específicos preparando cebadores de PCR que pueden usarse para la selección mediante PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas individuales de las especies deseadas. Solamente los híbridos que contienen el cromosoma que contiene el gen homólogo al cebador proporcionarán un fragmento amplificado. La sublocalización puede conseguirse usando fragmentos cromosómicos. Otras estrategias incluyen la selección previa con cromosomas separados por citometría de flujo marcados y la preselección mediante hibridación con bibliotecas específicas de cromosomas. Otras estrategias de mapeo incluyen la hibridación fluorescente in situ, que permite la hibridación con sondas más cortas que las usadas tradicionalmente. Pueden usarse individualmente reactivos para el mapeo cromosómico para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma, o pueden usarse paneles de reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. En realidad se prefieren los reactivos que corresponden a las regiones no codificantes de los genes para los fines de mapeo. Es más probable que las secuencias codificantes se conserven dentro de las familias de genes, aumentando así la oportunidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también pueden usarse para identificar individuos a partir de pequeñas muestras biológicas. Esto puede realizarse, por ejemplo, usando el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) para identificar un individuo. Por tanto, los polinucleótidos descritos en el presente documento son útiles como marcadores de ADN para el RFLP (véase la patente estadounidense número 5.272.057).
Además, puede usarse la secuencia de aminopeptidasa para proporcionar una técnica alternativa, que determina la secuencia de ADN real de los fragmentos seleccionados en el genoma de un individuo. Por tanto, pueden usarse las secuencias de aminopeptidasa descritas en el presente documento para preparar dos cebadores de PCR desde los extremos 5' y 3' de las secuencias. Entonces, estos cebadores pueden usarse para amplificar ADN de un individuo para su posterior secuenciación.
Los paneles de las secuencias de ADN correspondientes de individuos preparados de esta manera pueden proporcionar identificaciones de los individuos únicas, ya que cada individuo tendrá un conjunto único de tales secuencias de ADN. Se estima que la variación alélica en los seres humanos se produce con una frecuencia de aproximadamente una por cada 500 bases. La variación alélica se produce en cierto grado en las regiones codificantes de estas secuencias, y en un grado mayor en las regiones no codificantes. Las secuencias de aminopeptidasa pueden usarse para obtener tales secuencias de identificación a partir de individuos y a partir de tejido. Las secuencias representan fragmentos únicos del genoma humano. Cada una de las secuencias descritas en el presente documento puede usarse, hasta cierto grado, como un patrón frente al que puede compararse el ADN de un individuo para fines de identificación.
Si se usa un panel de reactivos a partir de las secuencias para generar una base de datos de identificación única para un individuo, esos mismos reactivos pueden usarse posteriormente para identificar tejido de ese individuo. Usando la base de datos de identificación única, puede realizarse la identificación positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa también pueden usarse en procedimientos de identificación forense. Puede usarse tecnología de PCR para amplificar secuencias de ADN tomadas a partir de muestras biológicas muy pequeñas, tales como, un único folículo piloso, líquidos corporales (por ejemplo sangre, saliva o semen). Entonces puede compararse la secuencia amplificada con un patrón, permitiendo la identificación del origen de la muestra.
Por tanto, los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden usarse para proporcionar reactivos de polinucleótidos, ejemplo, cebadores de PCR, dirigidos a loci específicos en el genoma humano, que pueden potenciar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en el ADN, por ejemplo, proporcionando otro "marcador de identificación" (es decir otra secuencia de ADN que es única de un individuo particular). Tal como se describió anteriormente, la información de secuencia de bases real puede usarse para la identificación como una alternativa acertada a los patrones formados por los fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias dirigidas a la región no codificante son particularmente útiles debido a que se produce un polimorfismo mayor en las regiones no codificantes, haciendo más fácil diferenciar individuos usando esta técnica.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden usarse además para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, sondas marcadas o que pueden marcarse, que pueden usarse, por ejemplo, en una técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico. Esto es útil en los casos en los que un médico forense se enfrenta a un tejido de origen desconocido. Los paneles de sondas de aminopeptidasa pueden usarse para identificar el tejido por especie y/o por tipo de órgano.
De una forma similar, estos cebadores y sondas pueden usarse para examinar un cultivo de tejido para detectar contaminación (es decir examinar para detectar la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).
Como alternativa, los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden usarse directamente para bloquear la transcripción o traducción de secuencias del gen de aminopeptidasa por medio de constructos antisentido o de ribozima. Por tanto, en un trastorno caracterizado por la expresión del gen de aminopeptidasa anómalamente alta o indeseable, pueden usarse directamente ácidos nucleicos para el tratamiento.
Por tanto, los polinucleótidos de aminopeptidasa son útiles como constructos antisentido para controlar la expresión del gen de aminopeptidasa en células, tejidos y organismos. Un polinucleótido antisentido de ADN está diseñado para ser complementario a una región del gen implicado en la transcripción, evitando la transcripción y por tanto la producción de proteína de aminopeptidasa. Un polinucleótido de ADN o ARN antisentido hibridará con el ARNm y por tanto bloqueará la traducción del ARNm para dar la proteína de aminopeptidasa.
Los ejemplos de moléculas antisentido útiles para inhibir la expresión de ácido nucleico incluyen moléculas antisentido complementarias a un fragmento de la región no traducida en 5' de la SEC ID NO: 2 que incluye también el codón de iniciación y moléculas antisentido que son complementarias a un fragmento de la región no traducida en 3' de la SEC ID NO: 2.
Como alternativa, puede usarse una clase de moléculas antisentido para inactivar el ARNm con el fin de disminuir la expresión de ácido nucleico de aminopeptidasa. En consecuencia, estas moléculas pueden tratar un trastorno caracterizado por la expresión de ácido nucleico de aminopeptidasa anómala o indeseada. Esta técnica implica la ruptura por medio de ribozimas que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a una o más regiones del ARNm que atenúan la capacidad del ARNm para traducirse. Las posibles regiones incluyen las regiones codificantes y particularmente las regiones codificantes correspondientes a las actividades catalíticas u otras actividades funcionales de la proteína de aminopeptidasa.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa proporcionan también vectores para terapia génica en pacientes que contienen células que son aberrantes en la expresión del gen de aminopeptidasa. Por tanto, se introducen células recombinantes, que incluyen las células del paciente que se han modificado mediante ingeniería genética ex vivo y se han devuelto al paciente, en un individuo en el que las células producen la proteína de aminopeptidasa deseada para tratar al individuo.
La invención engloba también kits para detectar la presencia de un ácido nucleico de aminopeptidasa en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender reactivos tales como un ácido nucleico marcado o que puede marcarse o un agente que puede detectar ácido nucleico de aminopeptidasa en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de ácido nucleico de aminopeptidasa en la muestra; y medios para comparar la cantidad de ácido nucleico de aminopeptidasa en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones para usar el kit para detectar ADN o ARNm de aminopeptidasa.
Medios legibles por ordenador
Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención se proporcionan también en una variedad de medios para facilitar el uso de las mismas. Tal como se usa en el presente documento, "proporcionar" se refiere a una fabricación, distinta de una molécula de aminoácidos o de ácido nucleico aislada, que contiene una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la presente invención. Una fabricación de este tipo proporciona las secuencias de nucleótidos o aminoácidos, o un subconjunto de las mismas (por ejemplo, un subconjunto de marcos de lectura abiertos (ORF)) en una forma que permita a un experto examinar la fabricación usando medios que no pueden aplicarse directamente para examinar las secuencias de nucleótidos o aminoácidos, o un subconjunto de las mismas, tal como existen en la naturaleza o en forma purificada.
En una aplicación de esta realización, puede grabarse una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención en medios legibles por ordenador. Tal como se usa en el presente documento, "medios legibles por ordenador" se refiere a cualquier medio que pueda leerse y al que se pueda acceder directamente mediante un ordenador. Tales medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético, tales como discos flexibles, medio de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico tales como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. El experto apreciará fácilmente cómo puede usarse cualquiera de los medios legibles por ordenador conocidos en la actualidad para crear una fabricación que comprende un medio legible por ordenador que tiene grabado en él una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.
Tal como se usa en el presente documento, "grabado" se refiere a un proceso para almacenar información en un medio legible por ordenador. El experto puede adoptar fácilmente cualquiera de los procedimientos conocidos en la actualidad para grabar información en un medio legible por ordenador para generar fabricaciones que comprenden la información de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.
Hay disponible una variedad de estructuras de almacenamiento de datos para un experto para crear un medio legible por ordenador que tiene grabado en él una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos se basará generalmente en los medios elegidos para acceder a la información almacenada. Además, puede usarse una variedad de formatos y programas de procesamiento de datos para almacenar la información de secuencia de nucleótidos de la presente invención en un medio legible por ordenador. La información de secuencia puede representarse en un archivo de texto de tratamiento de textos, formatearse en un programa disponible comercialmente tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representarse en forma de un archivo ASCII, almacenarse en una aplicación de base de datos, tal como DB2, Sybase, Oracle o similares. El experto puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesamiento de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) con el fin de obtener un medio legible por ordenador que tiene grabado en él la información de secuencia de nucleótidos de la presente invención.
Proporcionando las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención en forma legible por ordenador, el experto puede acceder rutinariamente a la información de secuencia para una variedad de fines. Por ejemplo, un experto en la técnica puede usar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención en forma legible por ordenador para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada en los medios de almacenamiento de datos. Se usan medios de búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención que coincidan con una secuencia diana o motivo diana en
particular.
Tal como se usa en el presente documento, a una "secuencia diana" puede ser cualquier secuencia de ADN o de aminoácidos de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. Un experto puede reconocer fácilmente que cuanto más larga sea una secuencia diana, será menos probable la aparición aleatoria de la secuencia diana en la base de datos. La longitud de secuencia más preferida de una secuencia diana es desde aproximadamente 10 hasta 100 aminoácidos o desde aproximadamente 30 hasta 300 residuos de nucleótidos. Sin embargo, está bien reconocido que los fragmentos comercialmente importantes, tales como fragmentos de secuencia implicados en la expresión génica y el procesamiento de proteínas, pueden ser de longitud más corta.
Tal como se usa en el presente documento, "un motivo estructural diana", o "motivo diana", se refiere a cualquier secuencia o combinación de secuencias seleccionada racionalmente en la que la(s) secuencia(s) se eligen basándose en una configuración tridimensional que se forma tras el plegamiento del motivo diana. Existe una variedad de motivos diana conocidos en la técnica. Los motivos diana de proteína incluyen, pero no se limitan a, sitios activos de enzima y secuencias señal. Los motivos diana de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, estructuras en forma de horquilla y elementos de expresión inducible (secuencias de unión a
proteína).
Los programas informáticos están públicamente disponibles, lo que permite al experto acceder a la información de secuencia proporcionada en un medio legible por ordenador para el análisis y la comparación de otras secuencias. Se da a conocer públicamente una variedad de algoritmos conocidos, y se usa y puede usarse una variedad de programas comercialmente disponibles para realizar medios de búsqueda en los sistemas basados en ordenador de la presente invención. Los ejemplos de tales programas incluyen, pero no se limitan a, MacPattern (EMBL), BLASTN y BLASTX (NCBIA).
Por ejemplo, pueden usarse los programas que implementan los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) y BLAZE (Brutlag et al. (1993) Comp. Chem. 17: 203-207) en un sistema Sybase para identificar marcos de lectura abiertos (ORF) de las secuencias de la invención que contienen homología con los ORF o las proteínas de otras bibliotecas. Tales ORF son fragmentos de codifican proteínas y son útiles para producir proteínas comercialmente importantes tales como las enzimas usadas en diversas reacciones y en la producción de metabolitos comercialmente útiles.
Vectores/células huésped
La invención proporciona también vectores que contienen los polinucleótidos de aminopeptidasa. El término "vector" se refiere a un vehículo, preferiblemente una molécula de ácido nucleico que puede transportar los polinucleótidos de aminopeptidasa. Cuando el vector es una molécula de ácido nucleico, los polinucleótidos de aminopeptidasa están covalentemente unidos al ácido nucleico de vector. Con este aspecto de la invención, el vector incluye un plásmido, fago de cadena sencilla o doble, un vector viral de ADN o ARN de cadena sencilla o doble, o cromosoma artificial, tal como un BAC, PAC, YAC o MAC.
Puede mantenerse un vector en la célula huésped como un elemento extracromosómico en la que se replica y produce copias adicionales de los polinucleótidos de aminopeptidasa. Como alternativa, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped y producir copias adicionales de los polinucleótidos de aminopeptidasa cuando se replica la célula huésped.
La invención proporciona vectores para el mantenimiento (vectores de clonación) o vectores para la expresión (vectores de expresión) de los polinucleótidos de aminopeptidasa. Los vectores pueden funcionar en células procariotas o eucariotas o en ambas (vectores lanzadera).
Los vectores de expresión contienen regiones reguladoras que actúan en cis que están operativamente unidas en el vector a los polinucleótidos de aminopeptidasa de modo que se permite la transcripción de los polinucleótidos en una célula huésped. Los polinucleótidos pueden introducirse en la célula huésped con un polinucleótido separado que puede afectar a la transcripción. Por tanto, el segundo polinucleótido puede proporcionar un factor que actúa en trans que interactúa con la región control reguladora en cis para permitir la transcripción de los polinucleótidos de aminopeptidasa del vector. Como alternativa, puede proporcionarse un factor que actúa en trans por la célula huésped. Finalmente, puede producirse un factor que actúa en trans a partir del propio vector.
Se entiende, sin embargo, que en algunas realizaciones, la transcripción y/o traducción de los polinucleótidos de aminopeptidasa puede producirse en un sistema libre de células.
La secuencia reguladora a la que pueden estar operativamente unidos los polinucleótidos descritos en el presente documento incluye promotores para dirigir la transcripción del ARNm. Éstos incluyen, pero no se limitan a, el promotor izquierdo del bacteriófago \lambda, los promotores lac, TRP y TAC de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotor temprano inmediato de CMV, los promotores tempranos y tardíos de adenovirus, y repeticiones terminales largas de retrovirus.
Además de las regiones de control que promueven la transcripción, los vectores de expresión pueden incluir también regiones que modulan la transcripción, tales como potenciadores y sitios de unión a represor. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40, el potenciador temprano inmediato de citomegalovirus, potenciador de polioma, potenciadores de adenovirus y potenciadores de LTR de retrovirus.
Además de contener sitios para la iniciación y el control de la transcripción, los vectores de expresión pueden contener también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. Otros elementos de control reguladores para la expresión incluyen codones de iniciación y terminación así como señales de poliadenilación. El experto en la técnica tendrá conocimiento de las numerosas secuencias reguladoras que son útiles en los vectores de expresión. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Puede usarse una variedad de vectores de expresión para expresar un polinucleótido de aminopeptidasa. Tales vectores incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de episomas de levadura, de elementos cromosómicos de levadura, incluyendo cromosomas artificiales de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus, virus de la pseudorrabia, y retrovirus. Los vectores pueden derivarse también de combinaciones de estas fuentes tales como las derivadas elementos genéticos de bacteriófago y de plásmido, por ejemplo cósmidos y fagémidos. Los vectores de expresión y de clonación apropiados para huéspedes procariotas y eucariotas se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
La secuencia reguladora puede proporcionar la expresión constitutiva en una o más células huésped (es decir, específica de tejido) o puede proporcionar la expresión inducible en uno o más tipos de célula tal como mediante temperatura, aditivo nutriente o un factor exógeno tal como una hormona u otro ligando. Los expertos habituales en la técnica conocen bien una variedad de vectores que proporcionan la expresión constitutiva e inducible en huéspedes procariotas y eucariotas.
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden insertarse en el ácido nucleico de vector mediante metodología bien conocida. Generalmente, la secuencia de ADN que se expresará por último se une a un vector de expresión rompiendo la secuencia de ADN y el vector de expresión con una o más enzimas de restricción y acoplando entonces los fragmentos juntos. Los expertos habituales en la técnica conocen bien los procedimientos para el acoplamiento y la digestión con enzimas de restricción.
El vector que contiene el polinucleótido apropiado puede introducirse en una célula huésped apropiada para la propagación o la expresión usando técnicas bien conocidas. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium. Las células eucariotas incluyen, pero no se limitan a, levadura, células de insecto tales como Drosophila, células animales tales como células COS y células CHO, y células vegetales.
Tal como se describe en el presente documento puede ser deseable expresar el polipéptido como una proteína de fusión. En consecuencia, la invención proporciona vectores de fusión que permiten la producción de los polipéptidos de aminopeptidasa. Los vectores de fusión pueden aumentar la expresión de una proteína recombinante, aumentar la solubilidad de la proteína recombinante y ayudar en la purificación de la proteína actuando, por ejemplo, como un ligando para la purificación por afinidad. Puede introducirse un sitio de ruptura proteolítica en la unión del resto de fusión de modo que puede separarse por último el polipéptido deseado del resto de fusión. Las enzimas proteolíticas incluyen, pero no se limitan a, factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de fusión típicos incluyen pGEX (Smith et al. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. Los ejemplos de vectores de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89).
La expresión de proteínas recombinantes puede maximizarse en una bacteria huésped proporcionando un antecedente genético en el que la célula huésped tenga una capacidad disminuida para romper proteolíticamente la proteína recombinante. (Gottesman, S. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128). Como alternativa, puede alterarse la secuencia del polinucleótido de interés para proporcionar una utilización del codón preferente para una célula huésped específica, por ejemplo E. coli. (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118).
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden expresarse también mediante vectores de expresión que son operativos en levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura, por ejemplo S. cerevisiae, incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden expresarse también en células de insecto usando, por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al. (1989) Virology 170:31-39).
En determinadas realizaciones de la invención, los polinucleótidos descritos en el presente documento se expresan en células de mamífero usando vectores de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).
Los vectores de expresión enumerados en el presente documento se proporcionan a modo de ejemplo solamente de los vectores bien conocidos disponibles para los expertos habituales en la técnica que serían útiles para expresar los polinucleótidos de aminopeptidasa. El experto habitual en la técnica tendrá conocimiento de otros vectores adecuados para mantener la propagación o la expresión de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Éstos se encuentran por ejemplo en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
La invención engloba también vectores en los que las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento están clonadas en el vector en orientación inversa, pero operativamente unidas a una secuencia reguladora que permite la transcripción del ARN antisentido. Por tanto, un transcrito antisentido puede producirse en todas, o en una parte, de las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento, incluyendo las regiones tanto codificantes como no codificantes. La expresión de este ARN antisentido se somete a cada uno de los parámetros descritos anteriormente en relación a la expresión del ARN sentido (secuencias reguladoras, expresión inducible o constitutiva, expresión específica de tejido).
La invención se refiere también a células huésped recombinantes que contienen los vectores descritos en el presente documento. Por lo tanto, las células huésped incluyen células procariotas, células eucariotas inferiores tales como levadura, otras células eucariotas tales como células de insecto y células eucariotas superiores tales como células de mamífero.
Las células huésped recombinantes se preparan introduciendo los constructos de vector descritos en el presente documento en las células mediante técnicas fácilmente disponibles para el experto en la técnica. Éstas incluyen, pero no se limitan a, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, lipofección y otras técnicas tales como las encontradas en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Las células huésped pueden contener más de un vector. Por tanto, pueden introducirse diferentes secuencias de nucleótidos en diferentes vectores de la misma célula. De manera similar, los polinucleótidos de aminopeptidasa pueden introducirse solos o bien con otros polinucleótidos que no están relacionados con los polinucleótidos de aminopeptidasa tales como aquellos que proporcionan factores que actúan en trans para los vectores de expresión. Cuando se introduce más de un vector en una célula, los vectores pueden introducirse independientemente, introducirse conjuntamente o unirse al vector de polinucleótidos de aminopeptidasa.
En el caso de vectores virales o bacteriófagos, éstos pueden introducirse en células como virus empaquetados o encapsulados mediante procedimientos convencionales para la infección y la transducción. Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En el caso en el que la replicación viral es defectuosa, la replicación se producirá en las células huésped que proporcionan funciones que complementan los defectos.
Los vectores incluyen generalmente marcadores seleccionables que permiten la selección de la subpoblación de células que contienen los constructos de vector recombinante. El marcador puede estar contenido en el mismo vector que contiene los polinucleótidos descritos en el presente documento o puede estar en un vector separado. Los marcadores incluyen genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para las células huésped procariotas y resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para las células huésped procariotas. Sin embargo, será eficaz cualquier marcador que proporcione selección para un rasgo fenotípico.
Aunque las proteínas maduras pueden producirse en bacterias, levadura, células de mamífero y otras células bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas, los sistemas de transcripción y traducción libres de células pueden usarse también para producir estas proteínas usando ARN derivado de los constructos de ADN descritos en el presente documento.
Cuando se desea la secreción del polipéptido se incorporan las señales de secreción apropiadas en el vector. La secuencia señal puede ser endógena con respecto a los polipéptidos de aminopeptidasa o heterológa con respecto a estos polipéptidos.
Cuando el polipéptido no se secreta al medio, la proteína puede aislarse de la célula huésped mediante procedimientos de perturbación convencionales, incluyendo congelación-descongelación, sonicación, perturbación mecánica, uso de agentes de lisado y similares. El polipéptido puede recuperarse entonces y purificarse mediante procedimientos de purificación bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía en lectina o cromatografía líquida de alta resolución.
También se entiende que dependiendo de la célula huésped en la producción recombinante de los polipéptidos descritos en el presente documento, los polipéptidos pueden tener diversos patrones de glucosilación, dependiendo de la célula, o quizá no glucosilados cuando se producen en bacterias. Además, los polipéptidos pueden incluir una metionina modificada inicial en algunos casos como resultado de un proceso mediado por el huésped.
Usos de vectores y células huésped
Se entiende que "células huésped" y "células huésped recombinantes" se refieren no solamente a la célula objeto en particular sino también a la progenie o posible progenie de una célula de este tipo. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones futuras debido a mutación o bien influencias medioambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero aun se incluyen dentro del alcance del término tal como se usa en el presente documento.
Las células huésped que expresan los polipéptidos descritos en el presente documento, y particularmente las células huésped recombinantes, tienen una variedad de usos. En primer lugar, las células son útiles para producir proteínas o polipéptidos de aminopeptidasa que pueden purificarse adicionalmente para producir las cantidades deseadas de fragmentos o proteína de aminopeptidasa. Por tanto, las células huésped que contienen vectores de expresión son útiles para la producción de polipéptidos.
Las células huésped son útiles también para dirigir ensayos basados en células que implican la aminopeptidasa o fragmentos de aminopeptidasa. Por tanto, una célula huésped recombinante que expresa una aminopeptidasa nativa es útil para realizar ensayos para determinar compuestos que estimulen o inhiban la función aminopeptidasa. Esto incluye la unión a péptidos o cinc, expresión génica a nivel de transcripción o traducción e interacción con otros componentes celulares.
Las células huésped son útiles también para identificar mutantes de aminopeptidasa en los que estas funciones están afectadas. Si los mutantes se producen en la naturaleza y dan lugar a una patología, las células huésped que contienen las mutaciones son útiles para someter a ensayo los compuestos que tienen un efecto deseado sobre la aminopeptidasa mutante (por ejemplo, función estimuladora o inhibidora) que puede no estar indicado por su efecto sobre la aminopeptidasa nativa.
Las células huésped recombinantes son útiles también para expresar los polipéptidos quiméricos descritos en el presente documento para evaluar los compuestos que activan o suprimen la activación por medio de un sitio, segmento, dominio heterólogo y similares, según lo descrito en el presente documento.
Además, pueden diseñarse aminopeptidasas mutantes en las que se modifica mediante ingeniería genética una o más de las diversas funciones para aumentarse o disminuirse y se usan para aumentar o remplazar las proteínas de aminopeptidasa en un individuo. Por tanto, las células huésped pueden proporcionar un beneficio terapéutico remplazando una aminopeptidasa aberrante o proporcionando una aminopeptidasa aberrante que proporciona un resultado terapéutico. En una realización, las células proporcionan aminopeptidasas que son activas de manera anómala.
En otra realización, las células proporcionan aminopeptidasas que son inactivas de manera anómala. Estas aminopeptidasas pueden competir con las aminopeptidasas endógenas del individuo.
En otra realización, las células que expresan aminopeptidasas que no pueden activarse, se introducen en un individuo con el fin de competir con las aminopeptidasas endógenas por cinc o péptido. Por ejemplo, en el caso en el que cinc excesivo es parte de una modalidad de tratamiento, puede ser necesario inactivar el cinc de manera eficaz en un momento específico del tratamiento. Sería beneficioso proporcionar células que compitan por la molécula, pero que no puedan afectarse por la activación de aminopeptidasa.
Pueden producirse también células huésped recombinantes de manera homóloga que permitan la alteración in situ de secuencias de polinucleótidos de aminopeptidasa endógenas en un genoma de célula huésped. Esta tecnología se describe más completamente en los documentos WO 93/09222, WO 91/12650 y U.S. 5.641.670. En resumen, se deja que las secuencias de polinucleótidos específicas que corresponden a los polinucleótidos de aminopeptidasa o secuencias proximales o distales con respecto a un gen de aminopeptidasa se integren en un genoma de célula huésped mediante recombinación homóloga en la que puede afectarse la expresión del gen. En una realización, se introducen secuencias reguladoras que aumentan o bien disminuyen la expresión de una secuencia endógena. En consecuencia, puede producirse una proteína de aminopeptidasa en una célula que normalmente no la produce, o la expresión aumentada de proteína de aminopeptidasa puede dar como resultado una célula que normalmente produce la proteína a un nivel específico. Como alternativa, puede delecionarse el gen completo. Aún otras mutaciones específicas pueden introducirse en cualquier región del gen deseada para producir proteínas mutantes de aminopeptidasa. Tales mutaciones podrían introducirse, por ejemplo, en las regiones específicas descritas en el presente documento.
En una realización, la célula huésped puede ser un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria que puede usarse para producir un animal transgénico que contiene el gen de aminopeptidasa alterado. Como alternativa, la célula huésped puede ser una célula madre u otro precursor de tejido temprano que dé lugar a un subconjunto específico de células y pueda usarse para producir tejidos transgénicos en un animal. Véase también Thomas et al., Cell 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga. El vector se introduce en una línea de células madres embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el gen introducido se ha recombinado de manera homóloga con el gen de aminopeptidasa endógena (véase por ejemplo, Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). Entonces se inyectan las células seleccionadas en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón) formando quimeras por agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) páginas 113-152). Entonces puede implantarse un embrión quimérico en animal portador hembra pseudopreñada adecuada y llevarse a término el embrión. La progenie que alberga el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales puede usarse para generar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado de manera homóloga mediante transmisión de la línea germinal del transgén. Adicionalmente, se describen procedimientos para construir vectores de recombinación homólogos y animales de recombinación homólogos en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en las publicaciones internacionales PCT números WO 90/11354; WO 91/01140; y WO 93/04169.
Las células huésped modificadas genéticamente mediante ingeniería genética pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Un animal transgénico es preferiblemente un mamífero, por ejemplo un roedor, tal como una rata o un ratón, en el que una o más células del animal incluyen un transgén. Un transgén es ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro en uno o más tejidos o tipos de células del animal transgénico. Estos animales son útiles para estudiar la función de una proteína de aminopeptidasa e identificar y evaluar los moduladores de la actividad de la proteína de aminopeptidasa.
Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, gallinas y anfibios.
En una realización, una célula huésped es un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria en los que se han introducido secuencias de polinucleótidos de aminopeptidasa.
Puede producirse un animal transgénico introduciendo ácido nucleico en pronúcleos masculinos de un ovocito fertilizado, por ejemplo mediante microinyección, infección retroviral y dejando que el ovocito se desarrolle en un animal portador hembra pseudopreñada. Puede introducirse cualquiera de las secuencias de nucleótidos de aminopeptidasa como un transgén en el genoma de un animal no humano tal como un ratón.
Cualquiera de las secuencias reguladoras u otras secuencias útiles en los vectores de expresión pueden formar parte de la secuencia transgénica. Esto incluye secuencias intrónicas y señales de poliadenilación, si no estaban ya incluidas. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejido puede(n) estar operativamente unidas al transgén para dirigir la expresión de la proteína de aminopeptidasa hacia células particulares.
Los procedimientos para generar animales transgénicos mediante microinyección y manipulación de embriones, particularmente animales tales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder et al., patente estadounidense número 4.873.191 de Wagner et al. y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se usan procedimientos similares para la producción de otros animales transgénicos. Puede identificarse un animal fundador transgénico basándose en la presencia del transgén en su genoma y/o en la expresión de ARNm transgénico en tejidos o células de los animales. Entonces, puede usarse un animal fundador transgénico para generar otros animales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén pueden reproducirse además con otros animales transgénicos que portan otros transgenes. Un animal transgénico incluye también animales en los que se ha producido el animal completo o tejidos del animal usando las células huésped recombinantes de manera homóloga descritas en el presente documento.
En otra realización, pueden producirse animales transgénicos no humanos que contienen sistemas seleccionados, que permiten la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de un sistema de este tipo es el sistema de recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema de recombinasa cre/loxP, véase, por ejemplo, Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa FLP de S. cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355. Si se usa un sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgén, se requieren animales que contengan transgenes que codifiquen tanto la recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Pueden proporcionarse tales animales a través de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales transgénicos, uno conteniendo un transgén que codifica una proteína seleccionada y el otro conteniendo un transgén que codifica una recombinasa.
Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en el presente documento pueden producirse también según los procedimientos descritos en Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813 y publicaciones internacionales PCT números WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, una célula, por ejemplo, una célula somática, puede aislarse de un animal transgénico e inducirse para que salga del ciclo de crecimiento y entre en la fase G_{o}. Entonces puede fusionarse la célula en reposo, por ejemplo, a través del uso de pulsos eléctricos, a un ovocito enucleado de un animal de la misma especie del que se aísla la célula en reposo. Entonces se cultiva el ovocito reconstruido, de modo que evoluciona hasta mórula o blastocisto y luego se transfiere a un animal portador hembra pseudopreñada. Las crías nacidas de este animal portador hembra serán un clon del animal a partir del que se aísla la célula, por ejemplo, la célula somática.
Los animales transgénicos que contienen células recombinantes que expresan los polipéptidos descritos en el presente documento son útiles para realizar los ensayos descritos en el presente documento en un contexto in vivo. En consecuencia, los diversos factores fisiológicos que están presentes in vivo y que podrían afectar a la unión o a la activación, pueden no aclararse a partir de ensayos basados en células o libres de células in vitro. En consecuencia, es útil proporcionar animales transgénicos no humanos para someter a ensayo in vivo la función de aminopeptidasa, incluyendo la interacción de péptidos, el efecto de aminopeptidasas mutantes específicas sobre la función de aminopeptidasa y la interacción de péptidos, y el efecto de las aminopeptidasas quiméricas. También es posible evaluar el efecto de las mutaciones nulas, es decir, mutaciones que eliminan sustancial o completamente una o más funciones aminopeptidasa.
Composiciones farmacéuticas
Las moléculas de ácido nucleico de aminopeptidasa, la proteína, los moduladores de la proteína y los anticuerpos (también denominados en el presente documento "compuestos activos") pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. Tales composiciones comprenden normalmente la molécula de ácido nucleico, la proteína, el modulador o el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "administrar" se usa en su sentido más amplio e incluye cualquier procedimiento de introducción de las composiciones de la presente invención en un sujeto. Esto incluye producir polipéptidos o polinucleótidos in vivo mediante transcripción o traducción in vivo de polinucleótidos que se han introducido de manera exógena en un sujeto. Por tanto, los polipéptidos o ácidos nucleicos producidos en el sujeto a partir de las composiciones exógenas están englobados en el término "administrar."
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente sea incompatible con el compuesto activo, tales medios pueden usarse en las combinaciones de la invención. También pueden incorporarse a las composiciones compuestos activos complementarios. Se formula una composición farmacéutica de la invención para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis fabricados en cristal o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de una dispersión o disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida hasta el punto de que exista una facilidad de inyección con jeringuilla. Deber ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una proteína de aminopeptidasa o un anticuerpo anti-aminopeptidasa) en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquéllos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución sometida previamente a filtración estéril de los mismos.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Éstas pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos. Para la administración oral, el agente puede estar contenido en formas entéricas para superar el estómago o además estar revestidos o mezclados para liberarse en una región particular del tracto GI mediante procedimientos conocidos. Para el fin de la administración oral terapéutica, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales pueden prepararse también usando un vehículo líquido para su uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se hacen enjuagues, se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas o trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina: un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o sabor a naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de una pulverización de aerosol desde un dosificador o envase a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica puede ser también mediante medios transdérmicos o transmucosos. Para la administración transdérmica o transmucosa, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que va a atravesarse. Tales agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse a través del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, se formulan los compuestos activos para dar pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como se conocen generalmente en la técnica.
Los compuestos pueden prepararse también en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
En una realización, se preparan los compuestos activos con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del organismo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales pueden obtenerse también comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales frente a antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, según lo descrito en la patente estadounidense número 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en formas unitarias de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. "Forma unitaria de dosificación" tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que va a lograrse, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de individuos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en vectores y usarse como vectores para terapia génica. Los vectores para terapia génica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (documento U.S. 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase por ejemplo, Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector para terapia génica puede incluir el vector para terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en el que está incluido el vehículo de inserción génica. Como alternativa, cuando puede producirse el vector de inserción génica completo intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de inserción génica.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, paquete o dosificador junto con instrucciones para su administración.
Esta invención puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada al conjunto de realizaciones expuestas en el presente documento; más bien, se proporcionan estas realizaciones de modo que esta descripción transmitirá completamente la invención a los expertos en la técnica. Muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención se le ocurrirán a un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en la descripción anterior. Aunque se emplean términos específicos, se usan tal como en la técnica a menos que se indique lo contrario.
<110> Kapeller-Libermann, Rosana
\hskip1cm Williamson, Mark
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<120> 17867, una aminopeptidasa humana novedosa
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
5
6

Claims (29)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de:
a)
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
(i)
es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o al inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; y
(ii)
codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa,
o un complemento de la misma;
b)
una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o del inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa, o un complemento de la misma;
c)
una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642;
d)
una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que el fragmento comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, y en la que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa; y
e)
una molécula de ácido nucleico que codifica una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en la que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45ºC, seguido de lavado en 0,2x SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC, y en la que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa.
2. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que se selecciona de:
a)
una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642 o un complemento de la misma; y
b)
una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642.
3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además secuencias de ácido nucleico de vector.
4. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido heterólogo.
5. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
6. La célula huésped según la reivindicación 5, que es una célula huésped de mamífero.
7. Una célula huésped de mamífero no humano que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
8. Un polipéptido aislado seleccionado de:
a)
un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en el que el fragmento comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642 y en el que dicho fragmento codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa;
b)
una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642; en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45ºC, seguido de lavado en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC, y en el que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa; y
c)
un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 80% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 2 o un complemento de la misma, en el que dicho polipéptido tiene actividad aminopeptidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El polipéptido aislado según la reivindicación 8, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642.
10. El polipéptido según la reivindicación 8; que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.
11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera selectiva a un polipéptido según la reivindicación 8.
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 11, que se selecciona de:
(i)
un anticuerpo monoclonal,
(ii)
un anticuerpo policlonal,
(iii)
un fragmento Fab, y
(iv)
un fragmento F(ab')_{2}.
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13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 11 ó 12, que se selecciona de:
(i)
un anticuerpo quimérico,
(ii)
un anticuerpo humanizado,
(iii)
un anticuerpo humano, y
(iv)
un anticuerpo de cadena sencilla.
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14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el anticuerpo o fragmento está acoplado a una sustancia detectable.
15. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 14, en el que la sustancia detectable se selecciona de:
(i)
enzimas;
(ii)
grupos prostéticos,
(iii)
materiales fluorescentes,
(iv)
materiales luminiscentes,
(v)
materiales bioluminiscentes, y
(vi)
materiales radiactivos.
\newpage
16. Un procedimiento para producir un polipéptido seleccionado de:
a)
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642 o;
b)
un polipéptido que comprende un fragmento
(i)
de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, o
(ii)
que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en el que dicho fragmento tiene actividad aminopeptidasa; y
c)
una variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de depósito de patente PTA-1642, en el que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 2 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas son hibridación en 6X SSC a 45ºC, seguido de lavado en 0,2X SSC/ 0,1% de SDS a 65ºC, y en el que dicha variante alélica que se produce en la naturaleza de un polipéptido tiene actividad aminopeptidasa;
que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 en las condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1.
18. Un procedimiento para detectar la presencia de un polipéptido según la reivindicación 8 en una muestra, que comprende:
a)
poner en contacto la muestra con un compuesto que se une de manera selectiva a un polipéptido según la reivindicación 8; y
b)
determinar si el compuesto se une al polipéptido en la muestra.
19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que el compuesto que se une al polipéptido es un anticuerpo.
20. Un kit que comprende un anticuerpo que se une de manera selectiva a un polipéptido según la reivindicación 8 e instrucciones para su uso.
21. Un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en una muestra, que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto la muestra con un cebador o sonda de ácido nucleico que hibrida de manera selectiva con la molécula de ácido nucleico; y
b)
determinar si el cebador o sonda de ácido nucleico se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra.
22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico.
23. Un kit para detectar la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende
(i)
una sonda de ácido nucleico que hibrida de manera selectiva con al menos 15 nucleótidos consecutivos de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, o
(ii)
un par de cebadores de ácido nucleico que pueden hibridar con y amplificar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, e instrucciones para su uso.
24. Un procedimiento para identificar un compuesto que se une a un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto un polipéptido, o una célula que expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un compuesto de prueba; y
b)
determinar si el polipéptido se une al compuesto de prueba.
25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que la unión del compuesto de prueba al polipéptido se detecta mediante un procedimiento seleccionado de:
a)
detección de la unión mediante detección directa de la unión compuesto de prueba/polipéptido;
b)
detección de la unión usando un ensayo de unión competitiva;
c)
detección de la unión usando un ensayo para determinar la transducción de señales mediadas de tipo GPCR.
26. Un procedimiento para modular la actividad de un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende poner en contacto in vitro un polipéptido o una célula que expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al polipéptido en una concentración suficiente para modular la actividad del polipéptido.
27. Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende:
a)
poner en contacto un polipéptido según la reivindicación 8 con un compuesto de prueba; y
b)
determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad del polipéptido para identificar así un compuesto que modula la actividad del polipéptido.
28. Un procedimiento para identificar el agente que modula el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en una célula, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho agente con la célula que expresa dicha molécula de ácido nucleico de modo que dicho nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico puede modularse en dicha célula mediante dicho agente y medir dicho nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico.
29. Una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos según la reivindicación 8, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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