ES2278734T3 - 27411, una fosfatidil-glicerolfosfato (pgp) sintasa humana. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre el grupo constituido por: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 90% idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o a las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa. b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 450 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o a las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 2 o de las secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa y e) una molécula de ácido nucleico que comprende la molécula complementaria completa de a), b), c) o d).

Description

27411, una fosfatidil-glicerolfosfato (PGP) sintasa humana.

La presente invención se refiere a una fosfatidilglicerolfosfato (PGP) sintasa humana recientemente identificada que pertenece a la familia de las PGP sintasas de mamífero. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican la PGP sintasa. La invención además se refiere a procedimientos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de la PGP sintasa como diana para diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados o relacionados con la PGP sintasa. La invención además se refiere a procedimientos de selección de fármacos usando los polipéptidos y polinucleótidos de la PGP sintasa para identificar agonistas y antagonistas para el diagnóstico y tratamiento. La invención además abarca agonistas y antagonistas basados en los polipéptidos y polinucleótidos de la PGP sintasa. La invención además se refiere a procedimientos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de la PGP sintasa.

Antecedentes de la invención

La cardiolipina es un fosfolípido dimérico que tiene un papel importante en la biogénesis y función mitocondriales. Es necesaria para la actividad de varias enzimas mitocondriales y, posiblemente, para el transporte de proteínas al interior de la mitocondria de eucariotas (Minskoff, S. y col. (1997) Biochimica et Biophysica Acta 1348: 187-191). Parece que la cardiolipina está implicada directa o indirectamente en la modulación de varios procesos celulares, incluyendo la activación de las enzimas mitocondriales y la producción de energía mediante la fosforilación oxidativa (Hatch, G. (1998) International J. of Mol. Medicine 1: 33-41).

La cardiolipina se encuentra en animales, plantas y hongos. En los mamíferos, se encuentra exclusivamente en la mitocondria. La cardiolipina es el principal poliglicerolfosfolípido encontrado en el corazón y en la mayoría de los tejidos de mamífero (Hatch, G. (1998) International J. of Molec. Medicine 1: 33-41). La ruta biosintética de la cardiolipina ha sido bien estudiada en levaduras. La primera enzima en la ruta de biosíntesis de la cardiolipina es la fosfatidilglicerolfosfato sintasa (PGP sintasa). La PGP sintasa es una enzima clave en la ruta ya que cataliza la primera etapa comprometida de la ruta.

La biosíntesis de cardiolipina tiene lugar en 3 etapas enzimáticas. En la primera etapa, la PGP sintasa cataliza la formación de fosfatidilglicerolfosfato (PGP) a partir de fosfatidil-CMP (CDP-diacilglicerol, CDP-DG) y glicerol 3-fosfato. A continuación, la PGP fosfatasa desfosforila el PGP a fosfatildilglicerol (PG). Finalmente, la cardiolipina de eucariotas se sintetiza a partir de PG y otra molécula de CDP-DG en una reacción catalizada por la cardiolipina sintasa.

Parece que la cardiolipina es esencial para la función de varias enzimas de la fosforilación oxidativa. (Hatch, G. (1996) Molecular and Cellular Biochemistry 159: 139-148). También, la cardiolipina ha sido implicada en la función de muchas actividades enzimáticas incluyendo, pero sin limitaciones: (1) citocromo c oxidasa, (2) carnitina acilcarnitica translocasa, (3) importación de proteínas a la mitocondria y (4) unión de Ca^{+2} de la matriz (Kawasaki, K. (1999) J. of Biological Chemistry, Vol. 274, Nº 3, 1828-1834).

Debe haber niveles rigurosos de control de las enzimas implicadas en el metabolismo de cardiolipina en el corazón para mantener el contenido apropiado y la composición de la especie molecular del fosfolípido. El mantenimiento del contenido y composición molecular de la cardiolipina en la mitocondria cardiaca es esencial para una función cardiaca apropiada (Hatch, G. (1998) International J of Mol. Medicine 1: 33-41).

Fosfatidilglicerol (PG) y cardiolipina (CL) son los glicerofosfátidos más ampliamente distribuidos en los lípidos de membrana de animales, plantas y microbios (Hostletler, K. Y. (1982) en Phospholipids (Hawthorne y Ansell, editores) pág. 215-261, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Ámsterdam).

El PG se localiza en muchas localizaciones intracelulares como componente de fosfolípidos, donde representa menos del 1% del fósforo lipídico, excepto en el pulmón donde representa aproximadamente el 10% de los fosfolípidos totales (Mason, R. J. y col., (1980) Biochim. Biophys. Acta 617:36-50). PG sirve como un componente importante del tensioactivo pulmonar en el pulmón (Ohtsuka y col., (1993) J. Biol. Chem. Vol. 268:22908-22913). CL se localiza principalmente en la mitocondria y parece que es esencial para la función de varias enzimas de fosforilación oxidativa. CL es esencial para la producción de energía en el latido cardíaco (Hatch, G.M. (1996) Molecular and Cellular Biochemistry, 159:139-148).

La PGP sintasa se ha estudio y caracterizado ampliamente en dos levaduras evolutivamente divergentes, Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccaromyces pombe. La PGP sintasa se ha purificado a homogeneidad de S. pombe (Minskoff, S. y col. (1997) Biochimica et Biophysica Acta 1348: 187-191). A diferencia de la segunda y tercera enzimas de la ruta de biosíntesis de cardiolipina, la actividad PGP sintasa está muy regulada tanto por control cruzado con otros rutas como por factores que afectan al desarrollo mitocondrial.

Se ha demostrado que la PGP sintasa está controlada por dos grupos de factores: control cruzado con otras rutas y factores que afectan al desarrollo mitocondrial. El control cruzado con otras rutas de control de fosfatidilinositol y fosfatidilcolina está caracterizado por tres parámetros En primer lugar, la disponibilidad del fosfolípido soluble en agua precursor del inositol controla la expresión de enzimas que biosintetizan fosfolípidos. Segundo, la represión por inositol de la biosíntesis de fosfolípidos tiene lugar sólo si las células pueden sintetizar fosfatidilcolina. Tercero, la represión por inositol está mediada por los genes reguladores INO2-INO4-OPI1. La PGP sintasa está regulada por el inositol. Sin embargo, no está sujeta al control de los genes reguladores IN02-IN04-OPI1. La actividad PGP sintasa disminuye de 3-5 veces en las células de Saccharomyces cerevisiae cultivadas en presencia de inositol (Greenberg, M. L. y col., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 4773-4779).

La PGP sintasa normalmente se denomina glicerofosfatofosfatidil transferasa (E.C.2.7.8.5). Cataliza la transferencia de un grupo fosfato sustituido. Los sustratos naturales de la enzima son CDP-1, 2-diacil-sn-glicerol y glicerol 3-fosfato (implicado en la síntesis de fosfatidilglicerol). Los diferentes cofactores y grupos prostéticos que se ha demostrado que son importantes para la actividad PGP sintasa máximo incluyen, pero sin limitaciones: Triton X-100, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol. Los diferentes metales y/o sales que se ha demostrado que son importantes para la actividad PGP sintasa máximo incluyen, pero sin limitaciones: Mn^{+2}, Mg^{+2}, Ca^{+2}, Co^{+2} y Ba^{+2}.

Se ha encontrado que la PGP sintasa de dos levaduras diferentes (S. cerevisiae y S. pombe) son sensibles a compuestos reactivos de azufre y tienen un requerimiento de cationes divalente (Minskoff, S. y col (1997) Biochimica et Biophysica Acta 1348:187-191).

Se ha demostrado que los inhibidores de la PGP sintasa incluyen, pero sin limitaciones: liponucleótidos, CDP diacilglicerol, glicerol 3-fosfato, agentes reactivos de azufre, calcio, inositol, Triton X-100, magnesio, cadmio, cinc, cobre y mercurio (http://www.expasy.ch/cgi-bin/enzyme-search-ec). Como ejemplo, se ha demostrado que la actividad PGP sintasa disminuye de 3 a 5 veces en las células de S. cerevisiae cultivadas en presencia de inositol.

La actividad PGP sintasa puede ensayarse determinando la conversión de [^{14}C(U)]glicerol 3-fosfato en fosfatidil[^{14}C(U)]glicerol 3-fosfato como describen Cao y col. (Cao y col. (1994) LIPIDS, Vol. 29, no. 7, pág. 475-480).

Para elucidar mejor el papel de la enzima en la biosíntesis de PG y CL se han estudiado células de ovario de hámster chino (CHO) defectuosas respecto a la producción de PGP sintasa (Ohtsuka, T. y col., (1993) J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 30, pág. 22908-22913). Ohtsuka y col. desarrollaron un ensayo de análisis autorradiográfico rápido para detectar la actividad PGP sintasa en los lisados de colonias de células de ovario de hámster chino inmovilizadas en poliéster, como describen Raetz y col. (Raetz y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 3223-3227). El estudio de Ohtsuka confirmaba el papel de la PGP sintasa en la biosíntesis de PG y su papel esencial en el crecimiento de las células CHO. Los resultados proporcionaban evidencias directas sobre la formación de PG in vivo y que PG es un precursor metabólico principal de la biosíntesis de CL celular.

La investigación reciente se ha dirigido hacia la generación de un mutante defectuoso en PGP sintasa en células CHO-K1 (Kawasaki, K. y col. (1999) J. Biol. Chem. Vol. 274: 1828-1834). Kawasaki y col. aislaron un ADNc de ovario de hámster chico (CHO) que codifica una posible proteína similar en secuencia al producto del gen PGS1 de levadura, la PGP sintasa. El ADNc PGS1 de CHO codificaba una proteína que tenía una elevada homología de aminoácidos con el PGS1 de levadura. La transfección de las células CHO-K1 con el ADNc PGS1 de CHO en E. coli daba lugar a un nivel de actividad de PGP sintasa muy elevado. Además, cuando el PGS1 de CHO se introducía en un mutante PGS-S (mutante termosensible defectuoso para la PGP sintasa), el mutante recuperaba la biosíntesis normal y el contenido celular de PG y CL. Los resultados demostraban que el ADNc PGS1 de CHO codificaba una PGP sintasa (Kawasaki, K. y col. (1999) J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 3, pág. 1828-1834). El ADNc PGS1 de CHO clonado era capaz de complementar el defecto mitocondrial así como los defectos biosintéticos en la biosíntesis de CL
y PG.

Además, hay una aparente diferencia en los mecanismos moleculares de la PGP sintasa entre organismos eucariotas y procariotas. La PGP sintasa eucariota utiliza más probablemente un mecanismo de reacción ping-pong, en contraste con la PGP sintasa procariota que emplea un mecanismo de reacción bi-bi (Dryden, S. (1996) J. Bacteriol. 178:1030-1038). La PGP sintasa es una enzima esencial en bacterias (Heacock, P.N. y col., (1987) J. Biol. Chem. 262:13044-13049). Presumiblemente, esta diferencia en el mecanismo de reacción entre las PGP sintasas eucariotas y procariotas podría representar una diana para agentes antibacterianos (Kawasaki, K. y col. (1999) J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 3, pág. 1828-1834).

Las PGP sintasas son importantes ya que están relacionadas con el metabolismo de la cardiolipina en el envejecimiento y en la disfunción tiroidea. El envejecimiento y el hipotiroidismo son dos afecciones asociadas con la disfunción mitocondrial y con la deficiencia en cardiolipina (Schlame, M y col., (1997) Biochimica et Biophysica Acta, 1348:207-213). En ambos casos, la deficiencia en cardiolipina mitocondrial podría estar relacionada con el descenso en la actividad del transporte de metabolitos a través de la membrana mitocondrial. En relación con el proceso de envejecimiento, se ha sugerido que la deficiencia en cardiolipina es la causa de la reducción del transporte de metabolitos debido a los cambios en el ambiente de membrana de las proteínas vehículo (Paradies y col. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1103:324-326).

Por el contrario, el hipertiroidismo se caracteriza por el aumento del contenido de cardiolipina en la mitocondria y el aumento de las actividades de transporte de metabolitos (Paradies (1990) Biochim. Biophys. Acta 1019:133-136). La tiroxina es un estimulador bien conocido de la biogénesis mitocondrial; se sabe que aumenta el número de mitocondrias así como potencia su funcionamiento.

Por tanto, las PGP sintasas son una diana principal para la acción y desarrollo de fármacos. Por tanto, es valioso para el campo del desarrollo farmacéutico identificar y caracterizar nuevas PGP sintasas y tejidos y trastornos en los que las PGP sintasas se expresen de forma diferencial. La presente invención avanza el estado actual de la técnica proporcionando una nueva PGP sintasa humana y tejidos y enfermedades en los que es importante la expresión de la PGP sintasa humana. Por tanto, la invención proporciona procedimientos dirigidos a la expresión de la PGP
sintasa.

Kawasaki y col. (1999) J. Biol. Chem. 274:1828-34 describen el aislamiento de un ADNc de ovario de hámster chino (CHO) que codifica la fosfatidilglicerofosfato (PGP) sintasa.

El documento WO 01/02568 describe secuencias (SED ID Nº 1.812 y ID SEC Nº 3.322) que son homólogas con las secuencias de la PGP sintasa.

Raetz y col (1997) Science 196:303-5 describen un fosfolípido derivado de citosina arabinósido y su conversión en fosfatidilinositol por el tejido animal.

Resumen de la invención

Es un objeto de la invención identificar una nueva PGP sintasa.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar nuevos polipéptidos con actividad PGP sintasa que sean útiles como reactivos o dianas en ensayos aplicables al tratamiento y diagnóstico de trastornos mediados o relacionados con la PGP sintasa.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar polinucleótidos que se corresponden con los polipéptidos de la nueva PGP sintasa que sean útiles como dianas y reactivos en ensayos de PGP sintasa aplicables al tratamiento y diagnóstico de trastornos mediados o relacionados con la PGP sintasa y útiles para producir nuevos polipéptidos PGP sintasa mediante procedimientos de recombinación.

Un objeto específico de la invención es identificar compuestos que actúen como agonistas y antagonistas, y modulen la expresión de la nueva PGP sintasa.

Un objeto específico adicional de la invención es proporcionar compuestos que modulen la expresión de la PGP sintasa para el tratamiento y diagnóstico de trastornos relacionados con la PGP sintasa.

De este modo, la invención se basa en la identificación de una nueva PGP sintasa humana. La secuencia de aminoácidos de la PGP sintasa se muestra en la ID SEC Nº 2. La secuencia de nucleótidos de la PGP sintasa se muestra en la ID SEC Nº 1.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntico a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 3 o a las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 450 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa;

c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos codificadas por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340;

d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos codificadas por las inserciones de ADNc plasmídico depositado en la ATCC con los números de depósitos de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 2, o de las secuencias de aminoácidos codificados por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerofosfato sintasa, y

e) una molécula de ácido nucleico que comprende la longitud completa de a), b), c) o d).

La invención también proporciona un polipéptido aislado seleccionado entre el grupo constituido por:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos codificada por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con números de depósito de patentes PTA-2011 y PTA-2340.

b) un polipéptido biológicamente activo que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a la longitud completa de un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o de las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa;

c) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o de las secuencias de aminoácidos codificadas por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con el número de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 2, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa;
y

d) un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa.

La invención además proporciona construcciones de ácidos nucleicos que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico de la invención se unen de forma operativa a una secuencia reguladora.

La invención también proporciona vectores y células huésped para la expresión de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la PGP sintasa y, especialmente, vectores recombinantes y células huésped.

La invención también se refiere a procedimientos para realizar los vectores y células huésped y procedimientos para su uso en la producción de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la PGP sintasa.

La invención también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen selectivamente a los polipéptidos y fragmentos de la PGP sintasa.

La invención también se refiere al análisis de compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de la PGP sintasa (ARN o ADN).

La invención también se refiere a un procedimiento para modular la expresión o la actividad del polipéptido o ácido nucleico de la PGP sintasa, usando especialmente los compuestos analizados. Puede usarse la modulación para tratar las afecciones relacionadas con actividad o expresión anómala de los polipéptidos o ácidos nucleicos de la PGP sintasa.

La invención también se refiere a la determinación de la actividad o de la presencia o ausencia de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la PGP sintasa en una muestra biológica, incluyendo para el diagnóstico de una enfermedad.

La invención también se refiere a ensayos para determinar la presencia de una mutación en los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico, incluyendo para el diagnóstico de la enfermedad.

La invención también se refiere a soportes legibles en el ordenador que contienen las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención, respectivamente.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (ID SEC Nº 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 2) de la nueva PGP sintasa. La secuencia que codifica la PGP sintasa, nucleótidos 315-1.985 de la ID SEC Nº 1, constituye la ID SEC Nº 3.

La Figura 2 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de la PGP sintasa: regiones de giros y de hélices \alpha\beta; hidrofilicidad; regiones anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y perfil de probabilidad de superficie.

La Figura 3 muestra un perfil de hidrofobicidad de la secuencia de aminoácidos de la PGP sintasa (ID SEC Nº 2). Los restos hidrófobos relativos se muestran sobre la línea horizontal de puntos y los restos hidrófilos relativas están por debajo de la línea horizontal de puntos. Los restos de cisteína (cys) y los sitios de N-glucosilación (N-glu) se indican mediante líneas verticales cortas justo por debajo de la línea de hidropatía. Se indican los números correspondientes con la secuencia de aminoácidos (mostrada en la ID SEC Nº 2) de 27411 humana. Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: toda o parte de una secuencia hidrófoba (secuencia por debajo de la línea de puntos) o todo o parte de un fragmento hidrófilo (secuencia por encima de la línea de puntos). Otros fragmentos incluyen restos de cisteína o un sitio de N-glucosilación. Se predice un péptido señal de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 68. También se muestran los segmentos transmembranales predichos de la proteína de longitud completa de aproximadamente el aminoácido 51 a aproximadamente el aminoácido 73 y de aproximadamente el 469 a aproximadamente el aminoácido 485. Un segmento transmembranal predicho del presunto péptido maduro abarca de aproximadamente el aminoácido 402 a aproximadamente el aminoácido
418.

La Figura 4 muestra un análisis de la fase de lectura abierta de la PGP sintasa para los aminoácidos (ID SEC Nº 2) correspondiente con sitios funcionales específicos. Se encuentran sitios N-glucosilación de aproximadamente el aminoácido 213 a aproximadamente el aminoácido 216, de aproximadamente el aminoácido 236 a aproximadamente el aminoácido 239 y de aproximadamente el aminoácido 390 a aproximadamente el aminoácido 393. Se encuentran sitios de fosforilación de proteína cinasa dependiente de AMP cíclico y cGMP de aproximadamente el aminoácido 46 a aproximadamente el aminoácido 49 y de aproximadamente el aminoácido 172 a aproximadamente el 175. Se encuentran sitios de fosforilación de proteína cinasa C de aproximadamente el aminoácido 35 a aproximadamente el aminoácido 37, de aproximadamente el aminoácido 243 a aproximadamente el aminoácido 245 y de aproximadamente el aminoácido 313 a aproximadamente el aminoácido 315. Se encuentran sitios de fosforilación de caseina cinasa II de aproximadamente el aminoácido 102 a aproximadamente el aminoácido 105, de aproximadamente el aminoácido 143 a aproximadamente el aminoácido 146, de aproximadamente el aminoácido 333 a aproximadamente el aminoácido 336, de aproximadamente el aminoácido 374 a aproximadamente el aminoácido 377 y de aproximadamente el aminoácido 402 a aproximadamente el aminoácido 405. Se encuentra un sitio de fosforilación e tirosina cinasa de aproximadamente el aminoácido 344 a aproximadamente el aminoácido 352. Se encuentran sitios de N-miristoilación de aproximadamente el aminoácido 19 a aproximadamente el aminoácido 24, de aproximadamente el aminoácido 91 a aproximadamente el aminoácido 96, de aproximadamente el aminoácido 234 a aproximadamente el aminoácido 239, de aproximadamente el aminoácido 423 a aproximadamente el aminoácido 428 y de aproximadamente el aminoácido 527 a aproximadamente el aminoácido 532. Se encuentra un sito de amidación de aproximadamente el aminoácido 170 a aproximadamente el aminoácido 173.

La Figura 5 muestra la expresión relativa de 27411 en diversos órganos y tipos celulares humanos: arteria (columna 1), arteria enferma (columna 2), vena (columna 3), células de músculo liso coronario (columna 4); HUVEC (células endoteliales de la vena del cordón umbilical) (columna 5), hemangioma (columna 6), corazón (columna 7), corazón con insuficiencia cardiaca congestiva (columna 8), riñón (columna 9); músculo esquelético (columna 10), tejido adiposo (columna 11), páncreas (columna 12), osteoblastos primarios (columna 13), osteoclastos diferenciados (columna 14), piel (columna 15), médula espinal (columna 16), córtex cerebral (columna 17), hipotálamo cerebral (columna 18), nervio (columna 19), ganglio de la raíz dorsal (columna 20), mama (columna 21), tumor de mama (columna 22), ovario (columna 23), tumor ovárico (columna 24), próstata (columna 25), tumor de próstata (columna 26), glándulas salivares (columna 27), colon (columna 28), tumor de colon (columna 29), pulmón (columna 30), tumor de pulmón (columna 31), pulmón con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (columna 32), bazo (columna 33), amígdala (columna 34), ganglio linfático (columna 35), intestino delgado (columna 36), macrófagos (columna 37), sinovio (columna 38), células mononucleares de la médula ósea (columna 39), células mononucleares de sangre periférica activadas (columna 40), neutrófilos (columna 41), megacariocitos (columna 42) y tejido eritroide (columna 43). Los tejidos o tipos celulares eran normales a no ser que se indicara lo contrario. Los niveles de expresión se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa (kit de PCR cuantitativa de marca Taqman®, Applied Biosystems). Estas reacciones de RT-PCR cuantitativa se realizaron según las instrucciones del fabricante del
kit.

Descripción detallada de la invención

Siempre que no se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse en la práctica o ensayo de la invención cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, aquí se describen los procedimientos y materiales preferidos.

"Secuencia de ácido nucleico" según se usa en este documento, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y a fragmentos o porciones de los mismos y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser mono o bicatenario, y representar la cadena sentido o complementaria. De forma similar, "secuencia de aminoácidos" según se usa en este documento, se refiere a un oligopéptido, polipéptido o secuencia de proteína, y a fragmentos o porciones de los mismos y a moléculas naturales, recombinantes o sintéticas.

Cuando en este documento se enumera una "secuencia de aminoácidos" para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula proteica natural, a una secuencia de aminoácidos y similares, términos tales como "polipéptido" o "proteína", no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la proteína enumerada.

PGP sintasa según se usa en este documento, se refiere a las secuencias de aminoácidos de la PGP sintasa sustancialmente purificada de cualquier especie, particularmente de mamíferos, incluyendo bovino, ovino, porcino, murino, equino y, preferiblemente, humano, a partir de cualquier fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.

Una "deleción" según se usa en este documento se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácido o de nucleótidos en el que están ausentes uno o más aminoácidos o restos de nucleótidos.

Una "inserción" o "adición" según se usa en este documento, se refiere a un cambió en una secuencia de aminoácido o nucleótidos que da como resultado la adición de uno o más restos de aminoácidos o nucleótidos.

Una "sustitución" según se usa en este documento, se refiere a la sustitución de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.

La expresión "biológicamente activa" según se usa en este documento, se refiere a una proteína que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de la PGP sintasa. También "inmunológicamente" activa se refiere a la capacidad de la PGP sintasa natural, recombinante o sintética o a cualquier oligopéptido de la misma para inducir una respuesta inmune específica en animales o células apropiadas y para unirse con anticuerpos específi-
cos.

La expresión "agonista" según se usa en este documento, se refiere a una molécula que, cuando se une a la sintasa, causa un cambio en la PGP sintasa que modula la actividad de la PGP sintasa. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula.

Las expresiones "antagonista" o "inhibidor" según se usa en este documento, se refiere a una molécula que bloquea o modula la actividad biológica de la PGP sintasa. Los antagonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula.

El término "modular" según se usa en este documento, se refiere a un cambio en el nivel o actividad biológica de la PGP sintasa. La modulación puede ser un incremento o un descenso de la actividad de la proteína, un cambio en las características de unión de PGP sintasa a su sustrato o a una molécula efectora, o cualquier otro cambio en las propiedades biológicas, funcionales o inmunológicas de la PGP sintasa.

El término "derivado" según se usa en este documento, se refiere a las modificaciones químicas de un ácido nucleico que codifica la PGP sintasa o la PGP sintasa codificada. Ejemplos de estas modificaciones podría ser una sustitución de un hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Un ácido nucleótido derivado podría codificar un polipéptido que retenga las características biológicas esenciales de la molécula natural.

Polipéptidos

La invención se basa en la identificación de una nueva PGP sintasa y la secuencia de polinucleótidos que codifica la PGP sintasa.

De este modo, la invención se refiere a una nueva PGP sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos codificadas por los ADNc depositados con los números de depósito de patentes PT-2011 o PTA-2340.

Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos de la invención se depositaron el 9 de junio de 2000 y el 10 de agosto de 2000 en el Depósito de Patente de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia y se les asignaron los números de depósito de patentes PTA-2011 y PTA-2340, respectivamente. Los depósitos se mantendrán según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos. El depósito se facilita a conveniencia de los expertos en la materia y según la normativa 35 U.S.C. § 112, no es un reconocimiento de que sea necesario el depósito.

"Polipéptido PGP sintasa" o "proteína PGP sintasa" se refiere al polipéptido de la ID SEC Nº 2 o al polipéptido codificado por el ADNc depositado. La expresión "proteína PGP sintasa" o "polipéptido PGP sintasa", sin embargo, además incluye las numerosas variantes descritas en este documento, así como fragmentos derivados de la PGP sintasa de longitud completa y de sus variantes. Por "variantes" se entienden proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. Entre las variantes también se incluyen polipéptidos codificados por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, o polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o un complementario de la misma, en afecciones rigurosas. En otra realización, una variante de un polipéptido aislado de la presente invención difiere, en al menos 1, pero en menos de 5, 10, 20, 50 ó 100 restos de aminoácidos de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 2. Si es necesario un alineamiento para esta comparación, las secuencias deben alinearse para una identificación máxima. Las secuencias que forman "bucles" debido a deleciones o inserciones, o falta de coincidencia, se consideran diferencias. Estas variantes retienen la actividad funcional de las proteínas similares a PGP sintasa de la invención. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a una variación o mutagénesis alélica natural.

Se han encontrado PGP sintasas en la mayoría de los tejidos de mamíferos con las concentraciones más elevadas en el corazón, pulmón e hígado (http://www.expasy.ch/enzyme).

De este modo, la presente invención proporciona polipéptidos de la PGP sintasa aislados o purificados y variantes y fragmentos de los mismos.

En base a una búsqueda en Blast, se demostró que la más elevada homología de la PGP sintasa de la invención era con la fosfatidilglicerolfosfato sintasa de Cricetulus griseus (Nº de Registro Genbank AB016930). El polipéptido de la invención es idéntico al 93% con la fosfatidilglicerolfosfato sintasa de C. griseus en la región de los aminoácidos 4 a 556 de la ID SEC Nº 2. La secuencia de nucleótidos de la invención es idéntica al 87% con la región de la secuencia de nucleótidos de la fosfatidilglicerolfosfato sintasa de C. griseus en la región de los nucleótidos 326-1.911 de la ID SEC Nº 1.

Según se usa en este documento, se dice que un polipéptido está "aislado" o "purificado" cuando está sustancialmente libre de material celular cuando se aísla a partir de células recombinantes o no recombinantes, o libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. Un polipéptido, sin embargo, puede unirse a otro polipéptido con el que normalmente no está asociado en la célula y continúa considerándose "aislado" o "purificado".

Los polipéptidos PGP sintasa puede purificarse de tejidos a partir de mamíferos (McMurray, W.C. y col., (1978) Can. Jo. Biochem. 56: 414-419). Se entiende, sin embargo, que las preparaciones en las que el polipéptido no está purificado a homogeneidad son útiles y se considera que contienen una forma aislada del polipéptido. El aspecto crítico es que la preparación permita la detección de la función deseada del polipéptido, incluso en presencia de cantidades considerables de otros componentes. De este modo, la invención abarca diversos grados de pure-
za.

En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la PGP sintasa con menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de otras proteínas (es decir, proteínas contaminantes), menos de aproximadamente el 20% de otras proteínas, menos de aproximadamente el 10% de otras proteínas o menos de aproximadamente el 5% de otras proteínas. Cuando el polipéptido se produce de forma recombinante, también puede estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 10% o menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación
proteica.

Un polipéptido PGP sintasa también se considera que está aislado cuando es parte de una preparación de membrana o se purifica y, a continuación, se reconstituye con vesículas de membrana o liposomas.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos" incluye preparaciones del polipéptido PGP sintasa en las que está separado de precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en su síntesis. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos" incluye preparaciones del polipéptido con menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de precursores químicos u otros compuestos químicos, menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos u otros compuestos químicos, menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos u otros compuestos químicos o menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos u otros compuestos quími-
cos.

En una realización, los polipéptidos PGP sintasa comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la ID SEC Nº 2. Sin embargo, la invención además abarca variantes de secuencia. Las variantes incluyen una proteína sustancialmente homóloga codificada por el mismo locus genético en un organismo, es decir, una variante alé-
lica.

Las variantes también comprenden proteínas derivadas de otros loci genéticos en un organismo, pero que tiene homología sustancial con la PGP sintasa de la ID SEC Nº 2. Las variantes también incluyen proteínas sustancialmente homólogas con la PGP sintasa pero derivadas de otro organismo, es decir, un ortólogo. Las variantes también incluyen proteínas que son sustancialmente homólogas a la PGP sintasa que se producen mediante síntesis química. Las variantes también incluyen proteínas que son sustancialmente homólogas a la PGP sintasa que se producen mediante procedimientos recombinantes. Las variantes que retienen la actividad funcional de los polipéptidos similares a la PGP sintasa se muestran en la ID SEC Nº 2. Se entiende, sin embargo, que las variantes excluyen a cualquier secuencia de aminoácidos descrita antes de la invención.

Según se usa en este documento, dos proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente homólogas cuando las secuencias de aminoácidos tienen al menos una identidad de aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%. Según la presente invención, una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga estará codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico, o porción de la misma, de la secuencia mostrada en la ID SEC Nº 1 o en la ID SEC Nº 3 en afecciones rigurosas como se describe más en profundidad a continuación. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para una comparación óptima (por ejemplo, para el alineamiento óptimo pueden introducirse huecos en una o en ambas secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico primera y segunda y pueden excluirse para la comparación las secuencias no homólogas). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para la comparación es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60% e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (según se usa en este documento, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453 que se ha incorporado al programa GAP del paquete de programas GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna. CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto de parámetros especialmente preferidos (y el que se utilizaría si el profesional no está seguro de los parámetros que deberían aplicarse para determinar si una molécula está dentro de la limitación de identidad u homología de secuencia de la invención) es el que utiliza una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco abierto de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por hueco de fase
de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede terminarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989) CABIOS 4:11-17 que se ha incorporada al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de peso de resto PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco
de 4.

Las secuencias del ácido nucleico y de la proteína descritas en este documento puede usarse además como la "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, valor = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de 27411 de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, valor = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de la proteína 27411 de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para la comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. También se describen polipéptidos que tienen un grado de identidad menor pero similitud suficiente como para que realicen una o más de las mismas funciones realizadas por la PGP sintasa. La similitud se determina mediante la sustitución de aminoácidos conservados. Estas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido determinado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservadoras son probablemente fenotípicamente imperceptibles. Generalmente, las que se ven como sustituciones conservadoras son las sustituciones, de uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los restos hidroxilo de Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos de Asp y Glu, la sustitución entre los restos amida de Asn y Gln, el intercambio de los restos básicos de Lys y Arg y sustituciones entre los restos aromáticos de Phe y Tyr. Las directrices con respecto a qué cambios de aminoácidos probables son fenotípicamente imperceptibles se encuentran en Bowie y col., Science 247: 1306-1310 (1990).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Sustituciones conservadoras de aminoácidos

1

Una variante de polipéptido puede diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones, fusiones y truncamientos o una combinación de cualquiera de éstos. Las variantes polipeptídicas pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. Las variantes incluyen aquellas alteraciones que afectan a la interacción con cualquiera de los sustratos o moléculas efectoras, incluyendo pero sin limitaciones a los que se describen en este documento, o que afectan a la función de la PGP sintasa que normalmente da lugar a esta interacción. Por ejemplo, las variantes de la PGP sintasa pueden tener la afinidad de unión por los sustratos CDP-diacilglicerol o glicerol 3-fosfato alterada.

Otra variación útil proporciona una proteína de fusión en la que uno o más dominios o subregiones se fusionan de forma operativa a uno o más dominios o subregiones de otra PGP sintasa. Específicamente, puede introducirse un dominio o subregión que altera las especificidades por el sustrato y la velocidad de la reacción enzimática.

Generalmente, las variantes completamente funcionales contienen sólo unas variaciones conservadoras o variaciones en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener una sustitución de aminoácidos similares, que no dan lugar a ningún cambio o a un cambio insignificante en la función. Alternativamente, estas sustituciones pueden afectar positiva o negativamente en algún grado a la función.

Generalmente las variantes no funcionales contienen una o más sustituciones de aminoácidos no conservadores, deleciones, inserciones, inversiones o truncamientos, o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o en una región crítica.

Como se indica, las variantes pueden ser naturales o pueden estar hechas mediante recombinación o síntesis química para proporcionar características útiles y nuevas al polipéptido PGP sintasa. Esto incluye prevenir la inmunogenicidad de formulaciones farmacéuticas mediante la prevención de la agregación proteica.

Los aminoácidos que son esenciales para la función pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediante alanitas (Cunningham y col. (1985) Science 244: 1081-1085). Este último procedimiento introduce mutaciones puntuales de alanina en cada resto de la molécula. A continuación, se ensaya la actividad PGP sintasa de las moléculas mutantes resultantes, tales como la afinidad de unión por los sustratos y la determinación de las constantes catalíticas de transferencia de grupo fosfato sustituido entre CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato. Los sitios que son críticos para la unión al sustrato pueden determinarse también mediante análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith y col. (1992) J. Mol. Biol. 224: 899-904; de Vos y col. (1992) Science 255: 306-312).

Los ensayos de actividad enzimática de la PGP sintasa son bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ohtsuka y col. (1993) J. Biol. Chem. Vol. 268, Nº 30, 22908-22913). Puede existir homología sustancial con la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos completa o con fragmentos de estas secuencias.

De este modo, la invención también incluye fragmentos de la PGP sintasa. Los fragmentos pueden derivar de las secuencias de aminoácidos mostradas en la ID SEC Nº 2. Sin embargo, la invención también abarca a fragmentos de las variantes de la PGP sintasa como se describe en este documento.

Sin embargo, no debe interpretarse que los fragmentos a los que se refiere la invención abarcan a fragmentos que puedan haberse descritos con anterioridad a la presente invención. Por lo tanto, un fragmento de la PGP sintasa puede comprender al menos 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ó 556 aminoácidos contiguos. Los fragmentos pueden retener una o más de las actividades biológicas de la proteína, por ejemplo, la capacidad para unirse al sustrato o la capacidad para catalizar la transferencia de un grupo fosfato sustituido. Alternativamente, los fragmentos pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos frente a PGP-sintasa.

Los fragmentos biológicamente activos (péptidos que tienen una longitud de, por ejemplo, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ó 556 aminoácidos) pueden comprender un dominio o motivo que incluya un sitio de unión al sustrato, sitio de unión catalítica y sitios de glucosilación, fosforilación de la proteína cinasas C, fosforilación de caseína cinasa II, fosforilación dependiente de AMP cíclico y cGMP, fosforilación de tirosina cinasa y N-miristoilación. Posibles fragmentos adicionales pueden incluir sitios importantes para direccionamiento celular o subcelular.

Estos dominios o motivos pueden identificarse mediante procedimientos de búsqueda de homología por ordenador rutinarios.

Los fragmentos, por ejemplo, pueden extenderse en una o ambas direcciones desde el sitio funcional hasta abarcar 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o hasta 100 aminoácidos. Además, los fragmentos pueden incluir subfragmentos de los dominios específicos mencionados anteriormente, cuyos subfragmentos retienen la función del dominio del cual derivan.

Estas regiones pueden identificarse mediante procedimientos bien conocidos que implican el análisis de homología por ordenador.

La invención también proporciona fragmentos con propiedades inmunogénicas. Estos contienen una porción que porta un epítopo de la PGP sintasa o variantes de la PGP sintasa. Estos péptidos portadores del epítopo son útiles para obtener anticuerpos que se unan específicamente a un polipéptido, región o fragmento de la PGP sintasa. Estos péptidos pueden contener al menos 5, 10, al menos 15 o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos.

Los ejemplos no limitantes de polipéptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos incluyen, pero sin limitaciones, péptidos derivados de un sitio extracelular. En la Figura 2 se muestran las regiones de la PGP sintasa que tienen un alto índice de antigenicidad. Sin embargo, también se abarcan anticuerpos hechos intracelularmente ("intracuerpos"), que podrían reconocer regiones peptídicas intracelulares.

Los polipéptidos PGP sintasa portadores de epítopos pueden obtenerse por cualquiera de los medios convencionales (Houghten, R.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135). En la Patente de EE.UU. Nº 4.631.211 se describe la síntesis simultánea de péptidos múltiples.

Los fragmentos pueden ser discretos (sin fusionar con otros aminoácidos o polipéptidos) o pueden estar dentro de un polipéptido mayor. Además, un único polipéptido más grande puede comprender varios fragmentos. En una realización, un fragmento diseñado para la expresión en un huésped puede tener regiones heterólogas del pre y pro-polipéptido fusionadas al extremo amino terminal del fragmento de la PGP sintasa y una región adicional fusionada al extremo carboxilo terminal del fragmento.

De este modo, la invención proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Éstas comprenden una secuencia peptídica de la PGP sintasa unida de forma operativa a un péptido heterólogo que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente no homóloga a la PGP sintasa. "Unido de forma operativa" indica que el péptido PGP sintasa y el péptido heterólogo se fusionan en fase. El péptido heterólogo puede fusionarse al extremo N-terminal o al C-terminal de la PGP sintasa o puede localizarse internamente. En el caso en el que un casete de expresión contiene dos regiones codificadoras de proteína unidas de manera contigua en la misma fase de lectura, el polipéptido codificado se define en este documento como un "polipéptido heterólogo" o un "polipéptido quimérico" o un "polipéptido de fusión". Según se usa en este documento, una "proteína heteróloga" o "proteína quimérica" o "proteína de fusión" PGP sintasa comprende un polipéptido PGP sintasa unido de forma operativa a un polipéptido que no es PGP sintasa.

En una realización, la proteína de fusión no afecta a la función de la PGP sintasa per se. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión con GST en la que las secuencias de la PGP sintasa se fusionan con el extremo C-terminal de las secuencias de GST. Otros tipos de proteínas de fusión incluyen, pero sin limitaciones, proteínas de fusión enzimáticas, por ejemplo, fusiones con beta-galactosidasa, fusiones GAL-4 por doble híbrido de levadura, fusiones poli-His y fusiones Ig. Estas proteínas de fusión, especialmente las fusiones poli-His, pueden facilitar la purificación de la PGP sintasa recombinante. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de una proteína puede aumentarse usando una secuencia señal heteróloga. Por tanto, en otra realización, la proteína de fusión contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal.

El documento EP-A-O 464 533 describe las proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de regiones constantes de inmunoglobulina. El Fc es útil para terapia y diagnóstico y, de este modo, da lugar por ejemplo a la mejora de las propiedades farmacocinéticas (documento EP-A 0232 262). En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas con las porciones Fc con el fin de obtener ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas (Bennett y col. (1995) J. Mol. Recog. 8:52-58 (1995) y Johanson y col. J. Biol. Chem. 270:9459-9471). De este modo, esta invención también abarca proteínas de fusión solubles que contienen un polipéptido PGP sintasa y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de las inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, en particular la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región de bisagra. Para algunos usos es deseable eliminar el Fc después de que la proteína de fusión se haya usado para el propósito al que está destinada, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se usa como antígeno para inmunizaciones. En una realización en particular, la parte Fc puede eliminarse de una forma sencilla mediante una secuencia de escisión que también se incorpora y que puede ser escindida con el factor Xa.

Una proteína quimérica o de fusión puede producirse mediante técnicas de recombinación de ADN convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias proteicas se unen en fase de acuerdo con técnicas convencionales. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación por PCR de los fragmentos génicos puede realizarse usando cebadores anclados que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden, posteriormente, hibridarse y amplificarse de nuevo para generar una secuencia génica quimérica (véase Ausubel y col. (1992) Current Protocols in Molecular Biology). Además, hay disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, una proteína GST). Puede clonarse un ácido nucleico que codifique la PGP sintasa en dicho vector de expresión, de modo que el resto de fusión se una en fase a la PGP sintasa.

Otra forma de proteína de fusión es aquella que afecta directamente a las funciones de la PGP sintasa. Por tanto, la presente invención abarca un polipéptido PGP sintasa en el que uno o más de los dominios de la PGP sintasa (o partes de los mismos) han sido sustituidos por dominios homólogos (o partes de los mismos) de otra PGP sintasa.

Por consiguiente, son posibles diversas permutaciones. Por ejemplo, el dominio de unión o catalítico, o una subregión de los mismos, puede reemplazarse por el dominio o subregión de otra PGP sintasa u otra fosfatidil transferasa. De este modo, pueden formarse PGP sintasas en las que se sustituyen uno o más de los dominios o subregiones nativas.

Adicionalmente, pueden producirse proteínas PGP sintasa quiméricas en las que uno o más sitios funcionales derivan de una PGP sintasa diferente o isoforma. Sin embargo, se entiende que pueden derivarse sitios de otras PGP sintasas que aparecen en el genoma de mamíferos pero que aún no han sido descubiertas o caracterizadas. Estos sitios incluyen, pero sin limitaciones, el sitio catalítico y los sitios de unión al sustrato y otros sitios funcionales descritos en este documento.

Se reconoce además que las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden alterarse para que contengan codones, que sean preferidos o no preferidos, para un sistema de expresión en especial. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser aquel en el que se haya alterado al menos un codón y, preferiblemente, se hayan alterado al menos el 10% o el 20% de los codones de modo que se optimice la secuencia para su expresión en E. coli, levadura, humano, insecto o células CHO. Los procedimientos para determinar este uso de codones son bien conocidos en la técnica.

La PGP sintasa aislada puede purificarse a partir de células que la expresan de forma natural, incluyendo pero sin limitaciones en corazón, pulmón e hígado así como en los tejidos mostrados en la Figura 5. La PGP sintasa de la presente invención también puede purificarse de las células que han sido alteradas para que la expresen (recombinantes), o pueden sintetizarse usando procedimientos de síntesis de proteínas conocidos.

En una realización, la proteína se produce por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica la PGP sintasa en un vector de expresión, se introduce el vector de expresión en una célula huésped y se expresa la proteína en la célula huésped. A continuación, la proteína puede aislarse a partir de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas convencionales de purificación de proteínas. Los polipéptidos a menudo contienen aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos frecuentemente denominados como los 20 aminoácidos naturales. Además, muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden modificarse mediante procedimientos naturales, tales como el procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química bien conocidas en la materia. Las modificaciones normales que se producen de forma natural en los polipéptidos se describen en textos básicos, monografías detalladas y en la literatura científica y son bien conocidas para los expertos en la materia.

Por tanto, los polipéptidos también abarcan derivados o análogos en los que un resto de aminoácido sustituido no está codificado por el código genético, en los que se incluye un grupo sustituyente, en los que el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) o en los que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína.

Las modificaciones conocidas incluyen, pero sin limitaciones, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación.

Estas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en la literatura científica. Varias modificaciones especialmente frecuentes, glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de los textos básicos, tales como Proteins-Structure and Molecular Properties, 2ª edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman y Compañía, Nueva York (1993). Sobre este tema se dispone de muchas revisiones detalladas, tales como las de Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, editor, Academic Press, Nueva York 1-12 (1983); Seifter y col. (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646) y Rattan y col. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62).

Como también es bien sabido, los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de los sucesos postraduccionales, que incluyen sucesos del procesamiento natural y sucesos realizados por la manipulación humana que no ocurren de forma natural. Se pueden sintetizar polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados mediante procesos naturales no traduccionales y mediante procedimientos sintéticos.

Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales. En polipéptidos naturales y sintéticos es frecuente el bloqueo de los grupos amino o carboxilo o de ambos, mediante una modificación covalente. Por ejemplo, el resto amino terminal de polipéptidos obtenidos en E. coli, antes del procesamiento proteolítico, será casi invariablemente N-formilmetionina.

Las modificaciones pueden ser una función de cómo se sintetiza la proteína. Para polipéptidos recombinantes, por ejemplo, las modificaciones se determinarán mediante la capacidad de modificación postraduccional de la célula huésped y por las señales de modificación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por tanto, cuando se deseé una glucosilación, debería expresarse el polipéptido en un huésped capaz de glucosilar, generalmente una célula eucariota. Las células de insecto a menudo realizan las mismas glucosilaciones postraduccionales que las células de mamíferos y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión en células de insecto para expresar eficazmente proteínas de mamífero con un patrón nativo de glucosilación. Consideraciones similares se aplican a otras modificaciones.

El mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grado variable en varios sitios de un polipéptido determinado. Además, un polipéptido determinado puede contener más de un tipo de modificación.

Usos de los polipéptidos

Los polipéptidos PGP sintasa son útiles para producir anticuerpos específicos para la PGP sintasa, sus regiones o fragmentos. En la Figura 2 se muestran las regiones que tienen un valor elevado del índice de antigenicidad.

Los polipéptidos PGP sintasa son útiles para ensayos biológicos relacionados con la PGP sintasa. Estos ensayos implican cualquiera de las funciones o actividades o propiedades de la PGP sintasa conocidas útiles para el diagnóstico y tratamiento de afecciones relacionadas con la PGP sintasa, incluyendo la biosíntesis de CL y PG.

Los polipéptidos PGP sintasa también son útiles en los ensayos de selección de fármacos, en sistemas basados en células o libres de células. Los sistemas basados en células pueden ser nativos, es decir, células que normalmente expresan la PGP sintasa, como de una biopsia o expandidas en cultivo celular. En una realización, sin embargo, los ensayos basados en células implican células huésped recombinantes que expresan la PGP sintasa, tales como aquellos descritos en los antecedentes anteriores.

La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con la PGP sintasa también puede comprender la determinación de la capacidad de los compuestos de ensayo para unirse de forma preferente al polipéptido en comparación con la capacidad de una molécula de unión conocida (por ejemplo, CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato) para unirse al polipéptido.

Los polipéptidos pueden usarse para identificar compuestos que modulen la actividad PGP sintasa. Estos compuestos, por ejemplo, pueden aumentar o disminuir la afinidad o velocidad de unión a los sustratos CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato, competir con los sustratos por la unión a la PGP sintasa o desplazar los sustratos unidos a la PGP sintasa. Estos compuestos también pueden aumentar o disminuir la actividad enzimática de la PGP sintasa. Los compuestos que modulan la actividad PGP sintasa incluyen, pero sin limitaciones, liponucleótidos, CDP diacilglicéridos, glicerol 3-fosfato (Hirabayashi y col. (1976) Biochemistry 15: 5205-5211), agentes reactivos de azufre (Carman y col. (1984) J. Food Biochem 8:321-333), inositol (Bleasdale y col. (1982) Biochim. Biophys. Acta 710:377-390) y Ca^{2+} (Dowhan y col. (1992) Methods Enzymol 71:313-321).

La PGP sintasa de la presente invención y variantes y fragmentos apropiados pueden usarse en selecciones de alto rendimiento para analizar la capacidad de unión a la PGP sintasa de compuestos candidatos. Estos compuestos pueden seleccionarse adicionalmente frente a una PGP sintasa funcional para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad de la PGP sintasa. Pueden identificarse compuestos que activen (agonista) o inactiven (antagonista) a la PGP sintasa en un grado deseado. Los procedimientos moduladores puede realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la células con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un suje-
to).

Los polipéptidos PGP sintasa pueden usarse para seleccionar compuestos con capacidad para estimular o inhibir la interacción entre la PGP sintasa y una molécula diana que normalmente interacciona con la proteína PGP sintasa. La diana puede ser un cofactor, un ión metálico o el sustrato de la PGA sintasa. Los diferentes cofactores y grupos prostéticos que se ha demostrado son importantes para la actividad PGP sintasa máximo incluyen, pero sin limitaciones Triton X-100, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol.

Diferentes metales o sales que se ha demostrado son importantes para la actividad de la PGP sintasa incluyen, pero sin limitaciones Mn^{+2}, Mg^{+2}, Ca^{+2}, Co^{+2} y Ba^{+2}. El ensayo incluye las etapas de combinar la proteína PGP sintasa con un compuesto candidato en afecciones que permitan que la proteína PGP sintasa o un fragmento interaccione con la molécula diana, y detectar la formación de un complejo entre la proteína PGP sintasa y la diana o detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la PGP sintasa y la diana.

La determinación de la capacidad de la PGP sintasa para unirse a una molécula diana también puede lograrse usando una tecnología, tal como un análisis de interacción biomolecular (BIA) en tiempo real. Sjolander y col. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Según se usa en este documento, "BIA" es una tecnología para el estudio de las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los elementos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia del plasmón superficial (SPR) pueden usarse como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de las numerosas aproximaciones de procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidas en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida paralela o de fase en soluciones direccionables, procedimientos de bibliotecas sintéticas que necesitan deconvolución, el procedimientos de biblioteca "una perla, un compuesto" y procedimientos de bibliotecas sintéticas usando selección por cromatografía de afinidad. La estrategia de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de polipéptidos, mientras que las otras cuatro estrategias se aplican a polipéptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de pequeñas moléculas de compuestos (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

En la técnica pueden encontrarse ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas molecular, por ejemplo, en DeWitt y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann y col. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho y col. (1993) Science 261:1303; Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 y en Gallop y col. (1994) J Med. Chem. 37:1233. Las bibliotecas de compuestos pueden estar presentes en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421) o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, documento USP 5.223.409), esporas (Ladner, documento USP'409), plásmidos (Cull y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner supra).

Los compuestos candidatos incluyen, por ejemplo, 1) péptidos, tales como péptidos solubles, que incluyen péptidos de fusión con cola de Ig y miembros de bibliotecas aleatorias de péptidos (véase, por ejemplo, Lam y col. (1991) Nature 354:82-84; Houghten y col. (1991) Nature 354: 84-86) y bibliotecas moleculares derivadas mediante química combinatoria hechas de aminoácidos de configuración D y/o L; 2) fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos aleatorios y parcialmente degenerados, véase, por ejemplo, Songyang y col. (1993) Cell 72:767-778); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, antiidiotípicos, quiméricos y de cadena sencilla, así como Fab, F(ab')_{2}, fragmentos Fab de bibliotecas de expresión y fragmentos de anticuerpos de unión a epítopo) y 4) moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas (por ejemplo, moléculas obtenidas de bibliotecas combinatorias y de productos naturales).

Un compuesto candidato es una PGP sintasa soluble de longitud completa o un fragmento, que compite por la unión al sustrato, incluyendo pero sin limitaciones los descritos en este documento. Otros compuestos candidatos incluyen PGP sintasas mutantes o fragmentos apropiados que contienen mutaciones que afecta a la función de la PGP sintasa y, de este modo, compite por los sustratos, por ejemplo, CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato. Por consiguiente, la invención abarca un fragmento que compite por el sustrato de unión, por ejemplo con una afinidad mayor, o un fragmento que se une al sustrato o sustratos, pero no cataliza la transferencia del grupo fosfato.

La invención proporciona otros puntos finales para identificar compuestos que modulen (estimulen o inhiban) la actividad PGP sintasa. Típicamente, los ensayos implican un ensayo de sucesos que da lugar a una transferencia de un grupo fosfato sustituido indicativo de la actividad PGP sintasa. De este modo, puede analizarse la expresión de genes que están regulados por incremento o por disminución en respuesta a la enzima PGP sintasa. En una realización, la región reguladora de estos genes se puede unir de forma operativa a un marcador que sea fácilmente detectable, tal como la luciferasa. Adicionalmente, las medidas del transporte del metabolito a través de las membranas mitocondriales y el contenido mitocondrial en cardiolipina pueden servir como parámetros para cuantificar la actividad PGP sintasa.

Cualquiera de las funciones biológicas o bioquímicas mediadas por la PGP sintasa puede usarse como ensayo de punto final. Estas incluyen todos los sucesos bioquímicos o biológicos descritos en este documento, en las referencias citadas en este documento e incorporadas por referencia de estos sucesos, y otras funciones de la PGP sintasa conocidos por los expertos en la materia.

Los compuestos de unión y/o activación también pueden analizarse usando proteínas PGP sintasa quiméricas en las que uno o más dominios, sitios y similares, según se describe en este documento, o parte de las mismas, pueden sustituirse por sus equivalentes heterólogos derivados de otras PGP sintasas. Por ejemplo, puede usarse una región de unión al sustrato o región de unión al cofactor que interacciona con una especificidad y/o afinidad de sustrato o cofactor diferente al de la PGP sintasa nativa. Alternativamente, puede sustituirse la secuencia de direccionamiento nativa por una secuencia de direccionamiento heteróloga. Esto dará lugar a una localización subcelular o celular diferente. Como una alternativa adicional, los sitios que son responsables del desarrollo, temporal o especificidad tisular pueden sustituirse por sitios heterólogos, de modo que la PGP sintasa puede detectarse en afecciones de desarrollo específica, temporal o expresión específica de tejido.

Los polipéptidos PGP sintasa también son útiles en ensayos competitivos de unión en procedimientos diseñados para descubrir compuestos que interaccionen con la PGP sintasa. De este modo, se expone un compuesto a un polipéptido PGP sintasa en afecciones que permitan al compuesto unirse o interaccionar con el polipéptido de alguna otra forma. También se añade a la mezcla un polipéptido PGP sintasa soluble. Si el compuesto de ensayo interacciona con el polipéptido PGP sintasa soluble, disminuye la cantidad de complejo formado o la actividad de la diana de la PGP sintasa. Este tipo de ensayo es especialmente útil en los casos en que se buscan compuestos que interaccionen con regiones específicas de la PGP sintasa. De este modo, el polipéptido soluble que compite con la región diana de la PGP sintasa se diseña para que contenga secuencias peptídicas correspondientes a la región de interés.

Puede usarse otro tipo de ensayo de competición-unión para descubrir compuestos que interaccionan con sitios específicos funcionales e inhiben la PGP sintasa. Como ejemplo, pueden añadirse a la muestra de PGP sintasa los sustratos (CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato) y un compuesto candidato. Los compuestos que interaccionan con la PGP sintasa en el mismo sitio que los sustratos reducirán la cantidad de complejo formado entre la PGP sintasa y los sustratos. Un ejemplo de un grupo de compuestos que afectan a la actividad PGP sintasa son agentes tiorreactivos. Los inhibidores adicionales de la PGP sintasa incluyen: liponucleótido, inositol, Triton X-100 y los cationes divalentes de magnesio, calcio, cadmio, cinc, mercurio y cobre a ciertas concentraciones milimolares críticas. (http://www.expasy.ch/enzyme).

Para realizar ensayos libres de células para la selección de fármacos, es deseable inmovilizar la PGP sintasa, o un fragmento, o su molécula diana para facilitar la separación de los complejos de las formas no acomplejadas de una o ambas proteínas, así como adaptar la automatización del ensayo.

En los ensayos de selección de fármacos pueden usarse técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añada un dominio que permita a la proteína unirse a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/PGP sintasa a perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, San Luis, MO) o a placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, que a continuación se mezclan con los lisados celulares (por ejemplo, marcados con ^{35}S) y el compuesto candidato y la mezcla se incuba en afecciones que promueven la formación de complejos (por ejemplo, en afecciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, las perlas se lavan para eliminar cualquier marcaje no unido, y la matriz inmovilizada y el radiomarcaje se determina directamente, o en el sobrenadante después de que se disocien los complejos. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, separarse por SDS-PAGE y a partir del gel, puede cuantificarse el nivel de proteína PGP sintasa unida al receptor que se encuentra en la fracción de perlas usando técnicas electroforéticas convencionales. Por ejemplo, el polipéptido o su molécula diana pueden inmovilizarse utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina usando técnicas bien conocidas en la materia. Alternativamente, los anticuerpos que reaccionan con la proteína, pero que no interfieren con la unión de la proteína a su molécula diana, pueden derivatizarse en los pocillos de la placa para atrapar la proteína en los pocillos mediante la conjugación con el anticuerpo. Las preparaciones de un componente diana de unión a la PGP sintasa y de un compuesto candidato se incuban en los pocillos que presenta la PGP sintasa y puede cuantificarse la cantidad de complejos retenidos en el pocillo. Los procedimientos para detectar estos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la inmunodetección de los complejos usando anticuerpos que reaccionan con la molécula diana PGP sintasa, o que reaccionan con la PGP sintasa y compiten con la molécula diana, así como ensayos ligados a enzimas que dependen de la detección de la actividad enzimática asociada con la molécula diana.

Los moduladores de la actividad PGP sintasa identificados según estos ensayos de análisis de fármacos pueden usarse para tratar a un sujeto con un trastorno mediado por la PGP sintasa, tratando las células que expresan la PGP sintasa. Estos procedimientos de tratamiento incluyen las etapas de administrar los moduladores de la actividad PGP sintasa en una composición farmacéutica como se describe en este documento, a un sujeto que necesita este tratamiento.

El tratamiento se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido o línea celular aislada de un paciente que tiene una enfermedad, un síntoma de la enfermedad o una predisposición a la enfermedad, con el fin de curar, cicatrizar, aligerar, disipar, alterar, remediar, aliviar, mejorar o afectar a la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. "Sujeto", según se usa en este documento, puede referirse a un mamífero, por ejemplo, un humano o a un modelo experimental o animal o de enfermedad. El sujeto puede también ser un animal no humano, por ejemplo, un caballo, vaca, cabra u otros animales domésticos. Un agente terapéutico incluye, pero sin limitaciones, pequeñas moléculas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos complementarios.

La PGP sintasa se expresa en tejidos que incluyen, pero sin limitaciones, corazón, pulmón, hígado y los tejidos mostrados en la Figura 5.

Por tanto, la PGP sintasa de la presente invención es importante para el tratamiento de trastornos que afectan a estos tejidos.

Los trastornos que afecta al pulmón incluyen, pero sin limitaciones, anomalías congénitas; atelectasis; enfermedades de origen vascular, tales como congestión pulmonar y edema, incluyendo edema pulmonar hemodinámico y edema causado por daño microvascular, síndrome de estrés respiratorio del adulto (daño alveolar difuso), embolia pulmonar, hemorragia e infarto, e hipertensión pulmonar y esclerosis vascular; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, tal como enfisema, bronquitis crónica, asma bronquial y bronquiectasis; enfermedades intersticiales difusas (infiltradas, restrictivas), tales como neumoconiasis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis intersticial descamativa, neumonitis hipersensible, eosinofilia pulmonar (infiltración pulmonar con eosinofilia), neumonía ocasionada por Brochiolitis obliterans, síndromes de hemorragia pulmonar difusa, incluyendo el síndrome de Goospasture, hemosiderosis pulmonar idiopática y otros síndromes hemorrágicos, implicación pulmonar en trastornos vasculares de colágeno y proteinosis alveolar pulmonar; complicaciones de terapias, tales como enfermedad pulmonar inducida por fármacos, enfermedad pulmonar inducida por radiación y trasplante pulmonar; tumores, tales como carcinoma broncogénico, incluyendo síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores diversos y tumores metastáticos; patologías de la pleura, incluyendo derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotórax y tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

Los trastornos que afectan al hígado incluyen, pero sin limitaciones, daño hepático; ictericia y colestasis, tales como formación de bilirrubina y de ácidos biliares; insuficiencia hepática y cirrosis, tal como cirrosis, hipertensión portal, incluyendo ascitis, derivación portosistémica y esplenomegalia, trastornos infecciosos, tales como hepatitis vírica, incluyendo infección por hepatitis A-E e infección por otros virus de la hepatitis, síndromes clínicopatológicos, tales como el estado portador, infección asintomática, hepatitis viral aguda, hepatitis viral crónica y hepatitis fulminante; hepatitis autoinmune; enfermedad hepática inducida por fármacos y toxinas, tales como enfermedad hepática alcohólica; errores congénitos del metabolismo y enfermedad hepática pediátrica, tal como hemocromatosis, enfermedad de Wilson, deficiencia de \alpha1-antitripsina y hepatitis neonatal; enfermedad del conducto biliar intrahepático, tales como cirrosis biliar secundaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y anomalías de árbol biliar; trastornos circulatorios, tales como deficiencia del flujo sanguíneo en el hígado, incluyendo compromiso de la arteria hepática y obstrucción de la vena porta y trombosis, alteración de flujo sanguíneo que atraviesa el hígado, incluyendo congestión pasiva y necrosis centrilobular y peliosis hepática, obstrucción del flujo de salida de la vena hepática, incluyendo trombosis de la vena hepática (síndrome de Budd-Chiari) y enfermedad venooclusiva; enfermedad hepática asociada con el embarazo, tal como preeclampsia y eclampsia, hígado graso agudo del embarazo y colestasis intrahepática del embarazo; complicaciones hepáticas del trasplante de órgano o de médula ósea, tal como toxicidad a fármacos tras el trasplante de médula ósea, enfermedad injerto contra huésped y daño no inmunológico en hígados alógrafos; tumores y afecciones tumorales, tales como hiperplasias, adenomas y tumores malignos, incluyendo carcinoma primario de hígado y tumores metastáticos.

Los trastornos que afectan al corazón incluyen, pero sin limitaciones, insuficiencia cardiaca, incluyendo pero sin limitaciones, hipertrofia cardiaca, insuficiencia cardiaca del lado izquierdo e insuficiencia cardiaca del lado derecho; enfermedad cardiaca isquémica, incluyendo pero sin limitaciones, angina de pecho, infarto de miocardio, enfermedad cardiaca isquémica crónica y muerte cardiaca súbita, enfermedad cardiaca hipertensiva, incluyendo pero sin limitaciones, la enfermedad cardiaca hipertensiva sistémica (del lado izquierdo) y enfermedad cardiaca hipertensiva pulmonar (del lado derecho); enfermedad cardiaca valvular, incluyendo pero sin limitaciones, la degeneración valvular causada por calcificación, tal como estenosis aórtica por calcificación, calcificación de una válvula aórtica congénitamente bicúspide y calcificación anular mitral y degeneración mixomatosa de la válvula mitral (prolapso de la válvula mitral), fiebre reumática y enfermedad cardiaca reumática, endocarditis infecciosa y vegetaciones no infectadas, tal como endocarditis trombótica no bacteriana y endocarditis de lupus eritematoso sistémico (enfermedad de Libman-Sacks), enfermedad cardiaca carcinoide y complicaciones de válvulas artificiales; enfermedad miocárdica, incluyendo, pero sin limitaciones, cardiomipatía dilatada, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía restrictiva y miocarditis; enfermedad pericárdica, incluyendo pero sin limitaciones, derrame pericárdico y hemopericardio y pericarditis, incluyendo pericarditis aguda y pericarditis en curación, y enfermedad cardiaca reumatoide; enfermedad cardiaca neoplásica, incluyendo pero sin limitaciones, tumores cardiacos primarios, tales como mixoma, lipoma, fibroelastoma papilar, rabdomioma y sarcoma, y efectos cardiacos de neoplasias no cardiacas; enfermedad cardiaca congénita, incluyendo pero sin limitaciones, cianosis tardía (derivación de izquierda a derecha), tales como defecto del septo atrial, defecto del septo ventricular, ducto arterioso patente y defecto del septo atrioventricular, cianosis temprana (derivación de izquierda a derecha) tal como tetralogía de Fallot, transposición de las arterias grandes, tronco arterioso, atresia tricúspide y conexión venosa pulmonar anómala total, anomalías congénitas obstructivas, tales como coartación de la aorta, estenosis pulmonar y atresia y estenosis aórtica y atresia y trastornos que implican trasplante cardíaco.

Los trastornos que afectan a los vasos sanguíneos incluyen, pero sin limitaciones, respuestas de las células de las paredes vasculares a lesiones, tales como disfunción endotelial y activación endotelial y engrosamiento de la íntima; enfermedades vasculares que incluyen, pero sin limitaciones, anomalías congénitas, tales como fístula arteriovenosa, aterosclerosis y enfermedad vascular hipertensiva, tal como hipertensión; enfermedad inflamatoria (las vasculítides, tales como arteritis de células gigantes (temporal), arteritis de Takayasu, poliarteritis nodosa (clásica), síndrome de Kawasaki (síndrome mucocutáneo y del ganglio linfático), poliangeítis microscópica (poliarteritis microscópica, hipersensibilidad o angeítis leucocitoclástica), granulomatosis de Wegener, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger), vasculitis asociada con otras enfermedades y arteritis infecciosa; enfermedad de Raynaud; aneurismas y disección, tales como aneurisma aórtico abdominal, aneurismas sifilíticos (luéticos) y disección aórtica (hematoma disecante); enfermedades de venas y vasos linfáticos, tales como venas varicosas, tromboflebitis y flebotrombosis, obstrucción de la vena cava superior (síndrome de la vena cava superior), obstrucción de la vena cava inferior (síndrome de la vena cava inferior) y linfangitis y linfedema; tumores, incluyendo tumores benignas y enfermedades similares a tumores, tales como hemangioma, linfangioma, tumor glómico (glomangioma), ectasias vasculares y angiomatosis bacilar, y tumores de grado intermedio (limítrofe maligno de grado bajo), tales como sarcoma de Kaposi y hemangioendotelioma y tumores malignos, tales como angiosarcoma y hemangiopericitoma; y patología de intervenciones terapéuticas en enfermedad vascular, tales como angioplastia con globo y técnicas relacionadas y sustitución vascular, tales como cirugía de implante de bypass de la arteria coronaria.

Los trastornos que afectan a los eritrocitos incluyen, pero sin limitaciones, anemias, tales como anemias hemolíticas, incluyendo esferocitosis hereditaria, enfermedad hemolítica debida a defectos en las enzimas de los eritrocitos: deficiencia de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, enfermedad de células falciformes, síndromes de talasemia, hemoglobinuria paroxismal nocturna, anemia inmunohemolítica y anemia hemolítica como resultado de un trauma de los eritrocitos y anemias de eritropoyesis disminuida, incluyendo anemias megaloblásticas, tales como anemias de vitamina B12: anemia perniciosa y anemia por deficiencia de folato, anemia por deficiencia de hierro, anemia por enfermedad crónica, anemia aplásica, aplasia pura de eritrocitos y otras formas de insuficiencia de la médula ósea.

Los trastornos que implican al músculo esquelético incluyen tumores tales como rabdomiosarcoma.

Las enfermedades que afectan al riñón incluyen, pero sin limitaciones, anomalías congénita, pero sin limitaciones, enfermedades quísticas del riñón, que incluyen pero sin limitaciones, displasia renal quística, enfermedad del riñón poliquístico autosómica dominante (adulto), enfermedad del riñón poliquístico autosómica recesiva (infancia) y enfermedades quísticas de la médula renal, que incluyen, pero sin limitaciones, riñón con médula en esponja y complejo nefronoptisis-enfermedad quística medular urémica, enfermedad quística adquirida (asociada a diálisis), tal como quites simples; enfermedad glomerular que incluyen patologías de daño glomerular que incluye, pero sin limitaciones, en depósito de complejos inmunes in situ, que incluyen, pero sin limitaciones, nefritis anti-GBM, nefritis de Heymann y anticuerpos frente a antígenos plantados, nefritis de complejo inmune en circulación, anticuerpos frente a células glomerulares, inmunidad mediada por células en glomerulonefritis, activación de la vía alternativa del complemento, daño de células epiteliales y patologías que implican a mediadores de daño glomerular incluyendo mediadores celulares y solubles, glomerulonefritis aguda, tal como glomerulonefritis proliferativa (postestreptocócica, postinfección), incluyendo pero sin limitaciones, glomerulonefrítis postestreptocócica y glomerulonefritis aguda no estreptocócica, glomerulonefritis rápidamente progresiva (semilunar), síndrome nefrótico, glomerulonefritis membranosa (nefropatía membranosa), enfermedad de cambio mínimo (nefrosis lipoide), glomeruloesclerosis segmentaria focal, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía de IgA (enfermedad de Berger), glomerulonefritis focal proliferativa necrosante (glomerulonefritis focal), nefritis hereditaria, incluyendo pero sin limitaciones, el síndrome de Alport y la enfermedad de membrana delgada (hematuria familiar benigna), glomerulonefritis crónica, lesiones glomerulares asociada a la enfermedad sistémica, incluyendo pero sin limitaciones, lupus eritematoso sistémico, púrpura de Henock-Schölein, endocarditis bacteriana, glomeruloesclerosis diabética, amiloidosis, glomerulonefritis fibrilar e inmunolactoide y otros trastornos sistémicos; enfermedades que afectan a los túbulos e intersticio, incluyendo necrosis tubular aguda y nefritis tubulointersticial, incluyendo pero sin limitaciones, pielonefritis e infección del tracto urinario, pielonefritis agua, pielonefritis crónica y nefropatía por reflujo y nefropatía tubulointersticial inducida por fármacos y toxinas, incluyendo pero sin limitaciones, nefritis intersticial inducida por fármacos, nefropatía por abuso de analgésico, nefropatía asociada con fármacos antiinflamatorios no esteroideos y otras enfermedades tubulointersticial incluyendo, pero sin limitaciones, nofropatía por urato, hipercalcemia y nefrocalcinosis, y mieloma múltiple; enfermedades de vasos sanguíneos incluyendo nefroesclerosis benigna, hipertensión maligna y nefroesclerosis acelerada, estenosis de la arteria renal y microangiopatias trombóticas incluyendo, pero sin limitaciones, síndrome hemolítico urémico clásico (infancia), púrpura trombocitopénica trombótica/síndrome hemolítico urémico del adulto, HUS/TTp idiopático y otros trastornos vascular, pero sin limitaciones, enfermedad renal isquémica aterosclerótica, enfermedad renal ateroembólica, enfermedad por nefropatía de de células falciformes, necrosis cortical difusa e infartos renales; obstrucción del tracto urinario (uropatía obstructiva); urolitiasis (cálculos renales, piedras) y tumores del riñón incluyendo, pero sin limitaciones, tumores benignos, tales como adenoma papilar renal, fibroma renal o hamartoma (tumor de células intersticiales renomedulares), angiomiolipoma y oncocitoma y tumores malignos, incluyendo carcinomas de células renales (hipernefroma, adenocarcinoma de riñón), que incluyen carcinomas uroteliales de pelvis renales.

Los trastornos que afectan al páncreas incluyen aquellos del páncreas exocrino, tal como anomalías congénitas, incluyendo pero sin limitaciones, páncreas ectópico; pancreatitis, incluyendo pero sin limitaciones, pancreatitis aguda; quistes, incluyendo pero sin limitaciones, pseudoquistes, tumores, incluyendo pero sin limitaciones, tumores quísticos y carcinoma del páncreas, y trastornos del páncreas endocrino tales como, diabetes mellitus; tumores de las células del islote, incluyendo pero sin limitaciones, insulinomas, gastrinomas y otros tumores raros de las células del islote.

Entre las células formadoras del hueso se incluyen células osteoprogenitoras, osteoblastos y osteocitos. Los trastornos del hueso son complejos ya que pueden afectar al esqueleto durante cualquier de las etapas de su desarrollo. Por tanto, los trastornos pueden tener manifestaciones variables y pueden afectar a uno, a múltiples o a todos los huesos del cuerpo. Estos trastornos incluyen, malformaciones congénitas, acondroplasia y enanismo tanatofórico, enfermedades asociadas con una matriz anómala, tales como enfermedad de colágeno de tipo 1, osteoporosis, enfermedad de Paget, raquitismo, osteomalacia, osteodistrofia de alto recambio, enfermedad aplásica o de bajo recambio, osteonecrosis, osteomielitis piogénica, osteomielitismo tuberculoso, osteoma, osteoma osteoide, osteoblastoma, osteosarcoma, osteocondroma, condromas, condroblastoma, fibroma condromixóide, condrosarcoma, defectos corticales fibrosos, displasia fibrosa, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma de Ewing, tumor neuroectodérmico primitivo, tumor de células gigantes y tumores metastásicos.

Los trastornos que afectan al cerebro incluyen, pero sin limitaciones, trastornos que afectan a neuronas y trastornos que afectan a la glía, tales como astrocitos, oligodendrocitos, células ependimales y microglía; edema cerebral, aumento de la presión intracraneal y herniación, e hidrocéfalo; malformaciones y enfermedades del desarrollo, tales como defectos del tubo neural, anomalías en el prosencéfalo, anomalías en la fosa posterior y siringomielia e hidromielia; daño cerebral perinatal; enfermedades cerebrovasculares, tales como las relacionadas con hipoxia, isquemia e infarto, incluyendo hipotensión, hipoperfusión, y estados de flujo bajo (isquemia cerebral global e isquemia cerebral focal) infarto debido a obstrucción del aporte sanguíneo local, hemorragia intracraneal, incluyendo hemorragia intracerebral (intraparenquimal), hemorragia subaracnoidea y rotura de aneurismas congénitos y malformaciones vasculares, enfermedad cerebrovascular hipertensivo; incluyendo infartos lagunares, hemorragias en hendidura y encefalopatía hipertensivas; infecciones, tales como meningitis aguda, incluyendo meningitis piogénica aguda (bacteriana) y meningitis aséptica aguda (viral), infecciones focales supurativas agudas, incluyendo abscesos cerebrales, empiema subdural y abscesos extradulares, meningoencefalitis bacteriana crónica, incluyendo tuberculosis y micobacteriosis, neurosífilis y neuroborreliosis (enfermedad de Lyme), meningoencefalitis viral, incluyendo encefalitis viral vectorizada por artrópodos (Arbo), virus Herpes simplex de Tipo 1, virus Herpes simplex de Tipo 2, virus Varicella-zoster (Herpes zoster), citomegalovirus, poliomielitis, rabia y virus 1 de la inmunodeficiencia humana, incluyendo meningoencefalitis por VIH-1 (encefalitis subaguda), mielopatía vacuolar, miopatia asociada al SIDA, neuropatía periférica y SIDA en niños, leucoencefalopatía multifocal progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, meningoencefalitis fúngica, otras enfermedades infecciosa del sistema nervioso; encefalopatías espongiformes transmisibles (enfermedades de priones); enfermedades desmielinizantes, incluyendo esclerosis múltiple, variantes de esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda y encefalomielitis hemorrágica necrosante aguda y otras enfermedades con desmielinización; enfermedades degenerativas, tales como enfermedades degenerativas que afectan a al córtex cerebral, incluyendo enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Pick, enfermedades degenerativas de ganglios basales y del tronco cerebral, incluyendo Parkinsonismo, enfermedad idiopática de Parkinson (parálisis temblorosa), parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, atrofia multisistémica, incluyendo degeneración estriatonigral, síndrome de Shy-Drager y atrofia olivopontocerebelar y enfermedad de Huntington; degeneraciones espinocerebelares, incluyendo ataxias espinocerebelares, incluyendo ataxia de Friedreich y ataxia telangectasia, enfermedades degenerativas que afectan a neuronas motoras, incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de neuronas motoras), atrofia bulboespinal (síndrome de Kennedy) y atrofia muscular espinal; errores congénitos del metabolismo, tales como leucodistrofias, incluyendo la enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, adrenoleucodistrófia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher y enfermedad de Canavan, encefalomiopatias mitocondriales, incluyendo la enfermedad de Leigh y otras encefalomiopatias mitocondriales; enfermedades metabólicas tóxicas o adquiridas, incluyendo deficiencias en vitaminas tales como deficiencia en tiamina (vitamina B_{1}) y deficiencia en vitamina B_{12}, secuelas neurológicas de trastornos metabólicos, incluyendo hipoglucemina, hiperglucemia y encefalopatía hepática, enfermedades tóxicas, incluyendo monóxido de carbono, metanol, etanol y radiación, incluyendo daños inducidos por metotrexato y radiación combinados; tumores, tales como gliomas, incluyendo astrocitoma, incluyendo astrocitoma fibrilar (difuso) y glioblastoma multiforme, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitoma pleomórfico y glioma del tronco cerebral, oligodendroglioma y ependimoma y lesiones relacionadas con la masa paraventricular, tumores neuronales, neoplasias poco diferenciados, incluyendo meduloblastoma, otros tumores parenquimales, incluyendo linfoma cerebral primario, tumores de células germinales y tumores parenquimales pineales, meningiomas, tumores metastáticos, síndromes paraneoplásicos, tumores de la vaina nerviosa periférica, incluyendo neurilemmoma, neurofibroma y tumores maligno de la vaina nerviosa periférica (schwannoma maligno) y síndromes neurocutáneos (facomatosos), incluyendo neurofibromatosis, incluyendo neurofibromatosis de Tipo 1 (NF1) y neurofibromatosis de Tipo 2 (NF2), esclerosis tuberosa y enfermedad de Von Hippel-Lindau.

Los trastornos de la mama incluyen, pero sin limitaciones, trastornos del desarrollo; inflamaciones, incluyendo pero sin limitaciones, mastitis aguda, mastitis periductal, mastitis periductal (absceso subareolar recurrente, metaplasia escamosa de los conductos lactíferos), ectasia del conducto mamario, necrosis grasa, mastitis granulomatosas y patologías asociadas con los implantes de mama de silicona; cambios fibroquísticos, enfermedad de mama proliferativa, incluyendo pero sin limitaciones, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante y papilomas de conducto pequeño; tumores que incluyen, pero sin limitaciones, tumores estromales tales como fibroadenoma, tumor filoides y sarcomas, y tumores epiteliales tales como papiloma de conducto grande; carcinoma de la mama que incluye carcinoma in situ (no invasivo) que incluye carcinoma ductal in situ (incluyendo la enfermedad de Paget) y el carcinoma lobular in situ, y carcinoma invasivo (infiltrante) que incluye, pero sin limitaciones, carcinoma ductal invasivo, de ningún tipo en especial, carcinoma lobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucosa), carcinoma tubular y carcinoma papilar invasivo y neoplasias malignos diversos.

Los trastornos en el pecho del varón incluye, pero sin limitaciones, ginecomastia y carcinoma.

Los trastornos que afectan al ovario incluyen, por ejemplo, enfermedad ovárica poliquística, síndrome de Stein-Leventhal, Pseudomyxoma peritonei e hipertecosis estromal; tumores de ovario tales como, tumores de epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucosos, tumores endometroides, adenocarcinoma de células claras, cistadenofibroma, tumores de Brenner, tumores epiteliales superficiales; tumores de células germinales, tales como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas malignos inmaduros, disgerminoma, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma; tumores de los cordones sexuales y del estroma, tales como, tumores de células de la teca-granulosa, tecomas-fibromas, andoblastomas, tumores de células en colina y gonadoblastoma; y tumores metastáticos tales como tumores de Krukenberg.

Los trastornos que afectan a la próstata incluye, pero sin limitaciones, inflamaciones, aumento benigno, por ejemplo, hiperplasia nodular (hipertrofia o hiperplasia prostática benigna) y tumores tales como carcinoma.

Los trastornos que afectan al colon incluyen, pero sin limitaciones, anomalías congénitas, tales como atresia y estenosis, divertículo de Meckel, megacolon agangliónico congénito (enfermedad de Hirschspung); enterocolitis, tales como diarrea y disentería, enterocolitis infecciosa, incluyendo gastroenteritis viral, enterocolitis bacteriana, enterocolitis necrosante, colitis asociada a antibióticos (colitis pseudomembranosa) y colitis colagenosa y linfocítica, trastornos inflamatorios intestinales diversos, incluyendo parásitos y protozoos, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, trasplante, daño intestinal inducido por fármacos, enterocolitis por radiación, colitis neutropénica (tifilitis) y colitis derivada, enfermedad intestinal inflamatoria idiopática, tal como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; tumores del colon, tales como pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorrectal, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides.

Los trastornos que afectan al bazo incluyen, pero sin limitaciones, esplenomegalia, incluyendo esplenitis aguda inespecífica, esplenomegalia congestiva e infartos esplénicos; neoplasias, anomalías congénitas y rotura. Los trastornos asociados con la esplenomegalia incluyen infecciones, tales como esplenitis inespecífica, mononucleosis infecciosa, tuberculosis, fiebre tifoidea, brucelosis, citomegalovirus, sífilis, malaria, histoplasmosis, toxoplasmosis, leishmaniasis visceral, tripanosomiasis, esquistosomiasis, leishmaniasis y equinococosis; estados congestivos relacionados con hipertensión parcial, tales como cirrosis hepática, trombosis de la vena porta o esplénica e insuficiencia cardiaca, trastornos linfohematogénicos, tales como la enfermedad de Hodgkin, linfomas/leucemia no Hodgkin, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, anemias hemolíticas y púrpura tromocitopénica; dolencias inmunológicas-inflamatorias, tales como artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico; enfermedades de almacenamiento, tales como la enfermedad de Gaucher, enfermedad de Nieman-Pick, y mucopolisacaridosis y otras dolencias, tales como amiloidosis, neoplasias primarios y quistes y neoplasias secundarias.

Los trastornos que afectan al intestino delgado incluyen los síndromes de mala absorción, tales como celiaquía, esprúe tropical (esprúe postinfeccioso), enfermedad de Whipple, deficiencia de disacaridasa (lactasa), abetalipoproteinemia y tumores del intestino delgado que incluyen adenomas y adenocarcinomas.

En la medula ósea normal, las series mielocíticas (células polimorfonucleares) representan aproximadamente el 60% de los elementos celulares y las series eritrocíticas el 20-30%. Los linfocitos, monocitos, células reticulares, células plasmáticas y megacariocitos en conjunto constituyen el 10-20%. Los linfocitos constituyen el 5-15% de la médula ósea del adulto normal. En la médula ósea, los tipos celulares están mezclados de modo que los precursores de eritrocitos (eritroblastos), macrófagos (monoblastos), plaquetas (megacariocitos), leucocitos polimorfonucleares (mielobastos) y linfocitos (linfoblastos) de la sangre, pueden verse en el campo de un microscopio. Además, existen células troncales para las diferentes estirpes celulares, así como una célula troncal precursora para las células progenitoras comprometidas de los diferentes linajes. Los expertos en la técnica conocerán los diversos tipos de células y fases de cada una que se encuentran, por ejemplo, en la página 42 (Figuras 2-8) de Immunology, Immunopathology and Immunity, Quinta Edición, Sell y col. Simon y Schuster (1996) muestran los tipos celulares encontrados en la médula ósea. Por tanto, la invención se dirige a trastornos originados a partir de estás células. Estos trastornos incluyen, pero sin limitaciones, los siguientes: enfermedades que afectan a las células troncales hematopoyéticos; células linfoides progenitoras comprometidas; células linfoides que incluyen células B y T; progenitores mieloides comprometidos, que incluyen monocitos, granulocitos y megacariocitos y progenitores eritroides comprometidos. Estas incluyen, pero sin limitaciones, las leucemias, incluyendo leucemias linfoides B, leucemias linfoides T, leucemias indiferenciadas; eritroleucemia, leucemia megacarioblástica, monocíticas (se incluyen leucemias con o sin diferenciación); leucemia linfoblástica crónica y aguda, leucemia linfocítica crónica y aguda, leucemia mielogénica crónica y aguda, linfoma, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide crónica y aguda, leucemia mielomonocítica, leucemia mieloblástica crónica y aguda, leucemia mielogénica crónica y aguda, leucemia promielocítica crónica y aguda, leucemia mielocítica crónica y aguda; tumores hematológicos de la estirpe monocito-macrófago, tales como leucemia mielogénica crónica juvenil; LMA secundaria, antecedentes de trastorno hematológico; anemia refractaria; anemia aplásica; angioendoteliomatosis cutánea reactiva, trastornos fibrosos que afectan a la expresión alterada en células dendríticas, trastornos que incluyen esclerosis sistémica, síndrome E-M, síndrome epidémico del aceite tóxico, fascitis eosinofílica con formas localizadas de escleroderma, colonopatía queloide y fribrosa, histiocitoma fibroso maligno angiomatoide; carcinoma, incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; sarcoma, incluyendo sarcoma de Kaposi; fibroadenoma y tumores filoides, incluyendo fibroadenoma mamario; tumores del estroma, tumores filoides, incluyendo histiocitoma; eritroblastosis, neurofibromatosis; enfermedades del endotelio vascular; desmielinización, especialmente en lesiones viejas; gliosis, edema vasogénico, enfermedad vascular, enfermedad de Alzheimer y de Parkinson; linfomas de células T; linfomas de células B.

Los trastornos de la piel, incluyen pero sin limitaciones, trastornos de la pigmentación y de los melanocitos, que incluyen pero sin limitaciones, vitíligo, lunares, melasma, lentigo, nevus nevocelular, nevus displásico y melanoma maligno; tumores epiteliales benignos, que incluyen pero sin limitaciones, queratosis seborréica, acantosis pigmentaria, pólipo fibroepitelial, quiste epitelial, queratoacantoma y tumores anexiales (anejos); tumores epidérmicos premalignos y malignos, incluyendo pero sin limitaciones, queratosis actínica, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, y carcinoma de células de Merkel; tumores de la dermis, que incluyen pero sin limitaciones, histocitoma fibroso benigno, dermatofibrosarcoma protuberante, xantomas y tumores vasculares dérmicos; tumores de células que migran a la piel, que incluyen pero sin limitaciones, histiocitosis X, mucosis fungoides (linfoma cutáneo de células T) y mastocitosis; enfermedades de maduración epidérmica, que incluyen pero sin limitaciones, ictiosis; dermatosis inflamatoria aguda, incluyendo pero sin limitaciones, urticaria, dermatitis eccematosa aguda y eritema multiforme; dermatosis inflamatoria crónica, que incluye pero sin limitaciones, psoriasis, liquen plano y lupus eritematoso; enfermedades ampollosos (bullosas), que incluyen pero sin limitaciones, pénfigo, pengifóide bulloso, dermatitis herpetiforme y enfermedades ampollosos no inflamatorias: epidermolisis bullosa y porfiria; trastornos de los anejos epidérmicos, incluyendo pero sin limitaciones, el acné vulgar; paniculitis, que incluye sin limitaciones, eritema nodoso y eritema indurado, e infección e infestación, tal como verrugas, moluscos contagiosos, impétigo, infecciones fúngicas superficiales y mordeduras de artrópodos, picaduras e infestaciones.

Los trastornos que afectan a las amígdalas incluyen, pero sin limitaciones, amigdalitis, abscesos periamigdalinos, carcinoma de células escamosas, disnea, hiperplasia, hiperplasia folicular, hiperplasia linfoide reactiva, linfoma no Hodgkin y linfoma de células B.

Los ejemplos de trastornos de la proliferación y/o diferenciación celular incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, trastornos metastásicos o enfermedades neoplásicas hematopoyéticas, por ejemplo, leucemias. Un tumor metastásico puede aparecer a partir de una multitud de tipos de tumores primarios, incluyendo pero sin limitaciones, los originarios de próstata, colon, pulmón, mama e hígado.

Según se usa en este documento, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad de crecer de forma autónoma, es decir, un estado o afección anómala caracterizada por crecimiento de proliferación celular rápido. Los estados de la enfermedad hiperproliferativa y neoplásica pueden clasificarse como patológicos, es decir, que caracterizan o constituyen un estado de enfermedad, o pueden clasificarse como no patológicos, es decir, una desviación de la situación normal pero no asociados a ningún estado de enfermedad. La expresión pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procedimientos oncogénicos, tejidos metastáticos o células, tejidos u órganos transformados en malignos, independientemente del tipo histopatológico o la etapa de invasividad. Las células con "hiperproliferación patológica" aparecen en estados de la enfermedad caracterizados por el crecimiento de un tumor maligno. Ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociadas con la reparación de heridas.

Los términos "cáncer" o "neoplasia" incluyen tumores malignos de los diversos sistemas orgánicos, tales como los que afectan al pulmón, mama, tiroides, linfoides, gastrointestinales y tracto genitourinario, así como adenocarcinomas que incluyen tumores malignos tales como la mayoría de los cánceres de colon, carcinomas de células renales, cánceres de próstata y/o tumores de testículo, carcinomas de células no pequeñas del pulmón, cáncer del intestino delgado y cáncer del esófago.

El término "carcinoma" está reconocido en la técnica y se refiere a tumores malignos de los tejidos epitelial o endocrino que incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Los ejemplos de carcinomas incluyen aquellos que se forman a partir del tejido del cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles.

El término "sarcoma" está reconocido en la técnica y se refiere a tumores malignos de origen mesenquimal.

El ácido nucleico y la proteína 27411 de la invención pueden usarse para tratar y/o diagnosticar diversos trastornos proliferativos. Por ejemplo, estos trastornos incluyen trastornos neoplásicos hematopoyéticos. Según se usa en este documento, la expresión "trastornos neoplásicos hematopoyéticos" incluye enfermedades que afectan a células hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, surgidas a partir de las estirpes mieloide, linfoide o eritroide, o células precursoras de las mismas. Preferiblemente, las enfermedades surgen a partir de leucemias agudas poco diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Los ejemplos adicionales de trastornos mieloides incluyen, pero sin limitaciones, la leucemia promieloide aguda (APML), la leucemia mielógena aguda (AML) y la leucemia mielógena crónica (CML) (revidado en Vaickus, L. (1991) Crit. ReV. in Oncol./Hemotol. 11:267-97); los tumores malignos linfoides incluyen, pero sin limitaciones, leucemia linfoblástica aguda (ALL) que incluyen ALL de la estirpe B y ALL de la estirpe T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Las formas adicionales de linfomas malignos incluyen, pero sin limitaciones, linfoma no Hodgkin y variantes del mismo, linfomas de células T periféricas, linfoma o leucemia de células T adultas (ATL), linfoma cutáneo de células T (CTCL), leucemia linfocítica granular de células grandes (LGF), enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Reed-Sternberg.

Las PGP sintasas son importantes ya que están relacionadas con el metabolismo de la cardiolipina en el proceso de envejecimiento y en la disfunción del tiroides. El envejecimiento y el hipotiroidismo son dos afecciones asociados con la disfunción mitocondrial y con la deficiencia de cardiolipina (Schlame, M. y col., (1997) Biochimica et Biophysica Acta 1348:207-213). Además, el hipertiroidismo se caracteriza por mitocondrias con aumento del contenido en cardiolipina y el aumento de las actividades metabólicas de transporte (Paradies, G. y col., (1992) Biochim. Biophys. Acta, 1019:133-136). Por lo tanto, puede probarse que las PGP sintasas son herramientas clínicas útiles para el tratamiento de cualquiera de estos procesos y dolencias.

De este modo, los polipéptidos PGP sintasa son útiles para tratar trastornos asociados con la PGP sintasa caracterizados por una expresión o actividad anómalas de una PGP sintasa. En una realización, el procedimiento implica la administración de un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de análisis descrito o citado en este documento) o combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regulan por incremento o por disminución) la expresión o actividad de la proteína. En otra realización, el procedimiento implica la administración de la PGP sintasa como terapia para compensar la expresión o actividad reducida o anómala de la proteína.

Los procedimientos para el tratamiento incluyen, pero sin limitaciones, el uso de una PGP sintasa soluble o fragmentos de la proteína PGP sintasa que compiten por la unión al sustrato, o interfieren con la reacción mediada por el polipéptido PGP sintasa. Estas PGP sintasas o fragmentos pueden tener una afinidad mayor por la diana de modo que proporcionan una competición eficaz.

Es deseable la estimulación de la actividad en situaciones en las que la proteína está regulada por descenso de forma anómala y/o en las que un aumento de la actividad probablemente tenga un efecto beneficioso. Asimismo, es deseable la inhibición de la actividad en situaciones en las que la proteína está regulada por incremento de forma anómala y/o en las que un descenso de la actividad probablemente tenga un efecto beneficioso. En un ejemplo de esta situación, un sujeto tiene un trastorno caracterizado por un desarrollo o diferenciación celular anómalos. En otro ejemplo, el sujeto tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer).

Aún en otro aspecto de la invención, las proteínas de la invención pueden usarse como "proteínas cebo" en un ensayo de doble híbrido o en un ensayo de triple híbrido (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.283.317; Zervos y col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent, documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas (proteínas capturadas) que se unen o interaccionan con las proteínas de la invención y modulan su actividad.

Los polipéptidos PGP sintasa también son útiles para proporcionar una diana para el diagnóstico de una enfermedad o de la predisposición a una enfermedad mediada por la PGP sintasa, incluyendo, pero sin limitaciones, enfermedades que afectan a tejidos en los que se expresa la PGP sintasa, como se describe en este documento. Por consiguiente, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia o los niveles de la PGP sintasa en una célula, tejido u organismo. El procedimiento implica poner en contacto una muestra biológica con un compuesto capaz de interaccionar con la PGP sintasa de modo que la interacción pueda ser detectada. Un agente para la detección de la PGP sintasa es un anticuerpo capaz de unirse de forma selectiva a la PGP sintasa. Una muestra biológica incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto.

La PGP sintasa también proporciona una diana para diagnosticar una enfermedad activa o la predisposición a la enfermedad, en un paciente que tiene una variante de la PGP sintasa. De este modo, la PGP sintasa puede aislarse a partir de una muestra biológica, y evaluarse la presencia de una mutación genética que da lugar a una proteína anómala. Esto incluye la sustitución, deleción, inserción, reordenamiento (como resultado de sucesos de ayuste anómalos) de aminoácidos y modificaciones postraduccionales inadecuadas. Los procedimientos analíticos incluyen movilidad electroforética alterada, digestión tríptica alterada de péptidos, actividad PGP sintasa alterada en un ensayo con células o libre de células, alteración de la unión al sustrato, transferencia alterada de grupo fosfato sustituido, patrón de unión al anticuerpo alterado, punto isoeléctrico alterado, secuenciación directa de aminoácidos y cualquier otra de las técnicas de ensayo conocidas útiles para detectar mutaciones en una proteína en general o específicamente en una PGP sintasa.

Las técnicas in vitro para la detección de la PGP sintasa incluyen ensayos de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), inmunotransferencias, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Alternativamente, la proteína puede detectarse in vivo en un sujeto introduciendo en el sujeto un anticuerpo frente a la PGP sintasa marcada. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse mediante técnicas convencionales de adquisición de imágenes. Son especialmente útiles los procedimientos para detectar las variantes alélicas de la PGP sintasa expresadas en un sujeto y los procedimientos para detectar fragmentos de la PGP sintasa en una muestra.

Los polipéptidos PGP sintasa también son útiles en el análisis farmacogenómico.

Los parámetros farmacogenómicos analizan las variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a fármacos debido a una disposición al fármaco alterada y a una acción anómala en las personas afectadas. Véase, por ejemplo., Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985 y Linder, M. W. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266. Los resultados clínicos de estas variaciones dan lugar a una toxicidad grave de los fármacos terapéuticos en ciertos individuos o a fracaso terapéutico de los fármacos en ciertos individuos como resultado de una variación individual del metabolismo. De este modo, el genotipo del individuo puede determinar la manera en que un compuesto terapéutico actúa sobre el organismo o la manera en que el organismo metaboliza el compuesto. Adicionalmente, la actividad de las enzimas que metabolizan el fármaco afecta tanto a la intensidad como a la duración de la acción del fármaco. De este modo, los parámetros farmacogenómicos del individuo permiten la selección de compuestos eficaces y de dosificaciones eficaces de estos compuestos para el tratamiento profiláctico o terapéutico en función del genotipo del individuo. El descubrimiento de polimorfismos genéticos en algunas enzimas que metabolizan fármacos ha explicado porqué no se obtienen en algunos pacientes los efectos del fármaco esperados, muestran un efecto del fármaco exagerado o experimentan toxicidad grave a partir de dosis convencionales del fármaco. Los polimorfismos puede expresarse en el fenotipo del metabolizador extenso y el fenotipo del metabolizador pobre. Por consiguiente, el polimorfismo genético puede llevar a variantes alélicas proteicas de la PGP sintasa en las en una población una o más de las funciones de la PGP sintasa son diferentes a las de otra población. Por tanto, los polipéptidos constituyen una diana para establecer una predisposición genética que puede afectar a la modalidad de tratamiento. De este modo, en un tratamiento basado en una PGP sintasa, el polimorfismo puede dar lugar a regiones catalíticas que son más o menos activas.

Por tanto, la dosis podría modificarse necesariamente para maximizar el efecto terapéutico en una población determinada que contiene el polimorfismo. Como alternativa a la determinación del genotipo, podrían identificarse polipéptidos polimórficos específicos.

Los polipéptidos de la PGP sintasa también son útiles para controlar los efectos terapéuticos durante los ensayos clínicos y otro tratamiento. De este modo, la eficacia terapéutica de un agente que se diseña para aumentar o disminuir la expresión génica, los niveles de proteína o la actividad de la PGP sintasa se pueden controlar durante el transcurso del tratamiento usando los polipéptidos PGP sintasa como un criterio de valoración objetivo. El control puede ser, por ejemplo como sigue: (i) obtener una muestra de preadministración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión o la actividad de la proteína en la muestra preadministración; (iii) obtener una o más muestras postadministración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o la actividad de la proteína en las muestras postadministración, (v) comparar el nivel de expresión o la actividad de la proteína en la muestra preadministración con la proteína en la muestra o muestras postadministración y (vi) en consecuencia, aumentar o disminuir la administración del agente.

Anticuerpos

La invención también proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a la PGP sintasa y a sus variantes y fragmentos. Se considera que un anticuerpo se une selectivamente, incluso si también se une a otras proteínas que no son sustancialmente homólogas a la PGP sintasa.

Estas otras proteínas comparten homología con un fragmento o dominio de la PGP sintasa.

Esta conservación de regiones específicas da origen a anticuerpos que se unen a ambas proteínas en virtud de la secuencia homóloga. En este caso, se entendería que la unión del anticuerpo a la PGP sintasa sigue siendo selectiva.

Se usa un polipéptido PGP sintasa aislado como inmunógeno para generar anticuerpos usando técnicas convencionales para la preparación de un anticuerpo policlonal y monoclonal. Pueden usarse la proteína completa o un fragmento peptídico antigénico. En la Figura 2 se muestran las regiones que tienen un alto índice de antigenicidad.

Los anticuerpos se preparan preferiblemente a partir de estas regiones o a partir de fragmentos diferenciados de estas regiones. Sin embargo, los anticuerpos pueden preparase a partir de cualquier región del péptido como se describe en este documento. Un fragmento preferido produce un anticuerpo que disminuye o previene por completo la unión al sustrato o al cofactor o previenen la transferencia del grupo fosfato. Pueden desarrollarse anticuerpos frente a la PGP sintasa completa o a dominios de la PGP sintasa como se describe en este documento. Los anticuerpos también pueden desarrollarse frente a sitios funcionales específicos como se describe en este documento.

El péptido antigénico puede comprender una secuencia contigua de al menos 12, 14, 15 ó 30 restos de aminoácidos. En una realización, los fragmentos corresponden a regiones que se localizan en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas. Sin embargo, no se pretende que estos fragmentos comprendan ningún fragmento que pueda haber sido descrito antes de la invención.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o (F(ab')_{2}).

La detección puede facilitarse conjugando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluye ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Una preparación inmunogénica apropiada puede derivar de péptidos nativos, expresada mediante recombinación o sintetizada químicamente.

Usos de los anticuerpos

Los anticuerpos pueden usarse para aislar una PGP sintasa mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Los anticuerpos pueden facilitar la purificación de la PGP sintasa natural a partir de las células y de la PGP sintasa producida mediante recombinación, expresada en las células hués-
ped.

Los anticuerpos son útiles para detectar la presencia de la PGP sintasa en células o tejidos para determinar el patrón de expresión de la PGP sintasa entre los diversos tejidos de un organismo y a lo largo del curso del desarrollo normal.

Los anticuerpos pueden usarse para detectar la PGP sintasa in situ, in vitro o en un lisado o sobrenadante de células, para evaluar la abundancia y el patrón de expresión.

Los anticuerpos pueden usarse para evaluar una distribución tisular anómala o una expresión anómala durante el desarrollo.

Puede usarse la detección por anticuerpos de fragmentos circulantes de la proteína PGP sintasa de longitud completa para identificar el recambio de la PGP sintasa.

Adicionalmente, los anticuerpos pueden usarse para evaluar la expresión de PGP sintasa en estados de la enfermedad, tales como en fases activas de la enfermedad, o en un individuo con predisposición a la enfermedad, relacionada con la función de PGP sintasa. Cuando un trastorno está causado por una distribución tisular, expresión durante el desarrollo o nivel de expresión de la proteína PGP sintasa inadecuadas, puede prepararse el anticuerpo frente a la proteína PGP sintasa normal. Si un trastorno se caracteriza por una mutación específica en la PGP sintasa, pueden usarse anticuerpos específicos para esta proteína mutante para ensayar la presencia de la PGP sintasa mutante específica. Sin embargo, también se abarcan anticuerpos hechos intracelularmente ("intracuerpos"), que podrían reconocer regiones peptídicas intracelulares de la PGP sintasa.

Los anticuerpos también pueden usarse para evaluar la localización subcelular normal y anómala de células en los diversos tejidos del organismo. Pueden desarrollarse anticuerpos frente a la PGP sintasa completa o a porciones de la PGP sintasa.

Los usos diagnósticos pueden aplicarse, no sólo en ensayos genéticos sino también en el control de una modalidad de tratamiento. Por consiguiente, si el objetivo del tratamiento es, finalmente, corregir el nivel de expresión de la PGP sintasa o la presencia de la PGP sintasa anómala y la distribución tisular o expresión anómalas durante en tratamiento, pueden usarse anticuerpos dirigidos frente a la PGP sintasa o a fragmentos importantes para controlar la eficacia terapéutica.

Por consiguiente, pueden usarse anticuerpos desde un punto de vista diagnóstico para controlar los niveles de proteína en un tejido, como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado.

Adicionalmente, los anticuerpos son útiles para análisis farmacogenómicos. De este modo, los anticuerpos preparados frente a la PGP sintasa polimórfica pueden usarse para identificar individuos que requieran modalidades de tratamiento modificadas.

Los anticuerpos son también útiles como herramientas de diagnóstico, como un marcador inmunológico para PGP sintasa anómala analizada por movilidad electroforética, punto isoeléctrico, digestión tríptica peptídica, y otros ensayos físicos conocidas en la técnica.

Los anticuerpos también son útiles para identificar tejidos. De este modo, cuando una PGP sintasa específica se ha correlacionado con la expresión en un tejido específico, pueden usarse anticuerpos que sean específicos de esta PGP sintasa para identificar un tipo de tejido.

Los anticuerpos también son útiles para la identificación forense. Por consiguiente, si se ha correlacionado a un individuo con un polimorfismo genético específico que da lugar a una proteína polimórfica específica, puede usarse un anticuerpo específico de la proteína polimórfica como ayuda para la identificación.

Los anticuerpos también son útiles para inhibir la función de la PGP sintasa, por ejemplo bloqueando la unión al sustrato o interrumpiendo la transferencia del grupo fosfato entre CDP-diacilglicerol y glicerol 3-fosfato.

Estos usos también pueden aplicarse en un contexto terapéutico en el que el tratamiento implica inhibir la función PGP sintasa. Puede usarse un anticuerpo para, por ejemplo, bloquear la unión al sustrato. Pueden preparase anticuerpos frente a fragmentos específicos que contengan sitios requeridos para la función o frente a la PGP sintasa intacta asociada a una célula.

Los anticuerpos completamente humanos son especialmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Para una visión general de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y col. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para una descripción detalladas de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos y de anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir estos anticuerpos véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.625.126; la patente de EE.UU. 5.633.425; la patente de EE.UU. 5.569.825; la patente de EE.UU. 5.661.016 y la patente de EE.UU. 5.545.806.

También se describen kits para el uso de anticuerpos en la detección de la presencia de una proteína PGP sintasa en una muestra biológica. El kit puede comprender anticuerpos tales como un anticuerpo marcado o susceptible de marcaje y un compuesto o agente para detectar la PGP sintasa en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de PGP sintasa en la muestra y medios para comparar la cantidad de PGP sintasa en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede empaquetarse en un recipiente adecuado. El kit además puede comprende instrucciones de uso del kit para detectar la PGP sintasa.

Polinucleótidos

La secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 se obtuvo secuenciando el ADNc humano depositado. Por lo tanto, se controla que no haya discrepancias entre las dos secuencias de los clones depositados y cualquier referencia a las secuencias de la ID SEC Nº 1, incluye referencia a las secuencias de los ADNc depositados.

Los ADNc descritos específicamente comprenden la región codificadora y las secuencias no traducidas 5' y 3' de la ID SEC Nº 1.

La invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican la nueva PGP sintasa. Las expresiones "polipéptido PGP sintasa" o "ácido nucleico PGP sintasa" se refieren a las secuencias mostradas en la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o en los ADNc depositados. La expresión "polinucleótido PGP sintasa" o "ácido nucleico de PGP sintasa" además incluye variantes y fragmentos de los polinucleótidos PGP sintasa. Generalmente, las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos del ácido nucleico 27411 comprenden al menos 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200, 1.250, 1.300, 1.400, 1500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.686 nucleótidos o hasta el número de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos similar a la PGP sintasa humana de longitud completa descrita en este documento (por ejemplo, 2.686 nucleótidos de la ID SEC Nº 1) dependiendo del uso que se pretenda. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico que es un fragmento de una secuencia de nucleótidos similar a 27411 de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1.000, 1.000-1.100, 1.100-1.200, 1.200-1.300, 1.300-1.400, 1.400-1.500, 1.500-1.600, 1.600-1.700, 1.700-1.800, 1.800-1.900, 1.900-2.000, 2.000-2.100, 2.100-2.200, 2.200-2.300, 2.300-2.400, 2.400-2.500, 2.500-2.600, 2.600-2.686 de la ID SEC Nº 1.

Un ácido nucleico de PGP sintasa "aislado" es aquel que se separa de otro ácido nucleico presente en la fuente natural del ácido nucleico de la PGP sintasa. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de forma natural al ácido nucleico de la PGP sintasa (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Sin embargo, puede haber algunas secuencias de nucleótidos flanqueantes, por ejemplo, de hasta aproximadamente 5 kb. El punto importante es que el ácido nucleico de la PGP sintasa se aísla a partir de las secuencias flanqueantes de modo que puede someterse a las manipulaciones específicas descritas en este documento, tales como expresión recombinante, preparación de sondas y cebadores y otros usos específicos de las secuencias del ácido nucleico de la PGP sintasa.

Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc o de ARN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o de medio de cultivo cuando se produce por técnicas de recombinación o de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse con otras secuencias codificadoras o reguladoras y seguir considerándose aislada.

En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo, un extracto crudo que contiene otras sustancias), sistema tampón y mezcla de reactivos.

En otras circunstancias, el material puede purificarse esencialmente hasta homogeneidad, por ejemplo, como se determina mediante PAGE o cromatografía en columna, tal como HPLC.

Preferiblemente, un ácido nucleico aislado comprende al menos aproximadamente el 50, 80 ó 90% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN aisladas de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención además incluyen estas moléculas producidas sintéticamente.

En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo, un extracto crudo que contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material puede purificarse esencialmente hasta la homogeneidad, por ejemplo, como se determina mediante PAGE o cromatografía en columna, tal como HPLC. Preferiblemente, un ácido nucleico aislado comprende al menos aproximadamente el 50, 80 ó 90% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden codificar la proteína madura más aminoácidos amino o carboxilo terminales adicionales o aminoácidos del interior del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Estas secuencias pueden intervenir en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor a una forma madura, facilitar el tráfico de la proteína, prolongar o acortar la semivida de la proteína o facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in situ, los aminoácidos adicionales pueden eliminarse de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa incluyen, pero sin limitaciones, la secuencia que codifica el polipéptido madura sólo, la secuencia que codifica el polipéptido maduro y secuencias codificadoras adicionales, tales como una secuencia líder o secretora (por ejemplo, una secuencia pre-pro o pro-proteína), la secuencia que codifica el polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales, además de secuencias no codificadoras adicionales, por ejemplo, intrones y secuencias 5' y 3' no codificadoras, tales como secuencias transcritas pero no traducidas que intervienen en la transcripción, en el procesamiento del ARNm (incluyendo las señales de ayuste y de poliadenilación), en la unión al ribosoma y en la estabilización del ARNm. Además, el polinucleótido puede fusionarse con una secuencia marcadora que codifica, por ejemplo, un péptido que facilita la purificación

Los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo ADNc y ADN genómico obtenidos por clonación o producidos por técnicas de síntesis química o mediante una combinación de los mismos. El ácido nucleico, especialmente ADN, puede ser mono o bicatenario. El ácido nucleico monocatenario puede ser la cadena codificadora (cadena sentido) o la cadena no codificadora (cadena complementaria). El ácido nucleico de la PGP sintasa puede comprender las secuencias de nucleótidos mostradas en la ID SEC Nº 1 y ID SEC Nº 3 correspondientes al ADNc de la PGP sintasa humana.

En una realización, el ácido nucleico de la PGP sintasa comprende sólo la región codificadora.

La invención además proporciona variantes de los polinucleótidos de la PGP sintasa y fragmentos de los mismos que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 1 debido a la degeneración del código genético y, de este modo, codifica la misma proteína que la codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 1 o ID SEC Nº 3.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico de la PGP sintasa que codifican las variantes polipeptídicas descritas en este documento. Estos polinucleótidos pueden ser naturales, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogas (diferente locus) y ortólogas (diferente organismo) o pueden construirse por procedimientos de ADN recombinante o por síntesis química. Estas variantes no naturales pueden obtenerse mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Por consiguiente, como se discute anteriormente, las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos.

Generalmente, las variantes de secuencias de nucleótidos de la invención serán al menos idénticas al 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la secuencia de nucleótidos descrita en este documento. La variación puede darse en una o en ambas regiones codificadora y no codificadora. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos tanto conservadoras como no conservadoras.

Las variantes ortólogas, homólogas y alélicas pueden identificarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una PGP sintasa que es al menos aproximadamente el 60-65%, 65-70%, típicamente al menos aproximadamente el 70-75%, más típicamente al menos aproximadamente el 80-85% y lo más típicamente al menos aproximadamente el 90-95% o más homólogo con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o un fragmento de estas secuencias. Estas moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente como capaces de hibridar en afecciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o un fragmento de estas secuencias. Se entiende que la hibridación rigurosa no indica homología sustancial cuando es debida a una homología general, tal como secuencias poli A o secuencias comunes a todas o a la mayoría de las proteínas, a todas las PGP sintasas o a todas las transferasa de grupo fosfato. Además, se entiende que estas variantes no incluyen ninguna de las secuencias de ácido nucleico que puedan haber sido descritas antes de la invención.

Como se usa en este documento, la expresión "hibrida en afecciones rigurosas" describe afecciones para la hibridación y lavado. Los expertos en la materia conocen las afecciones rigurosas que pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology John Wiley e hijos, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. En esta referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos y pueden usarse cualquiera. Un ejemplo preferido de afecciones rigurosas de hibridación es la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico x6 (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC x 0,2, SDS al 0,1% a 50ºC. Otro ejemplo preferido de afecciones rigurosas de hibridación es la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico x6 (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC x 0,2, SDS al 0,1% a 55ºC. Un ejemplo adicional de afecciones rigurosas de hibridación es la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico x6 (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC x 0,2, SDS al 0,1% a 60ºC. Preferiblemente, las afecciones rigurosas de hibridación son hibridación en cloruro sódico/citrato sódico x6 (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC x 0,2, SDS al 0,1% a 65ºC. Afecciones especialmente rigurosas preferidas (y las afecciones que deben usarse si el investigador no está seguro de qué afecciones deberían aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de hibridación de la invención) son fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido de uno ó más lavados en SSC x 0,2, SDS al 1% a 65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida en afecciones rigurosas con la secuencia de la ID SEC Nº 1 o ID SEC Nº 3, se corresponde con una molécula de ácido nucleico natural.

Según se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Como entiende un experto en la material, las afecciones exactas pueden determinarse empíricamente y dependen de la fuerza iónica, temperatura y de la concentración de agentes desestabilizantes, tales como formamida, o agentes desnaturalizantes, tales como SDS. Otros factores considerados para determinar las afecciones de hibridación deseada incluyen la longitud de las secuencias de ácido nucleico, la composición de bases, el porcentaje de falta de coincidencia entre las secuencias de hibridación y la frecuencia de aparición de subgrupos de secuencias entre otras secuencias no idénticas. De este modo, pueden determinarse afecciones equivalentes variando un uno o más de estos parámetros mientras se mantiene un grado de identidad o similitud similar entre las dos moléculas de ácido nucleico.

Se describen ácidos nucleicos aislados que contienen una porción o fragmento mono o bicatenario que híbrida en afecciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o la complementaria de ellas.

En una realización, el ácido nucleico está compuesto de una porción de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o la complementaria de ellas.

Se entiende que los fragmentos aislados incluyen cualquier secuencia contigua no descrita antes de la invención así como secuencias que son sustancialmente la misma y que no están descritas. Por consiguiente, si un fragmento se ha descrito antes de la presente invención, no se pretende que la invención abarque este fragmento.

Cuando una secuencia no se ha descrito antes de la presente invención, un fragmento de ácido nucleico aislado tiene una longitud de al menos aproximadamente 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600 o más nucleótidos. Son útiles fragmentos más largos, por ejemplo, con una longitud de 30 o más nucleótidos, que codifican proteínas o polipéptidos antigénicos descritos en este documento.

Para la PGP sintasa, por ejemplo son especialmente destacables las secuencias de los nucleótidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 285, de aproximadamente 1.992 a aproximadamente 2.041 y de aproximadamente 2.562 a aproximadamente 2.643 y abarcan fragmentos de 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, etc., según se describe en este documento.

La secuencia de nucleótidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.991 abarca fragmentos mayores de aproximadamente 315, 325, 345, 355 ó 365 nucleótidos; la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 1.074 a aproximadamente 2.689 abarca fragmentos mayores de 167, 175, 185, 195, ó 205 nucleótidos y la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 2.507 a aproximadamente 2.689 abarca fragmentos mayores 28, 35, 40, 45, 50 ó 55 nucleótidos.

El fragmento puede ser mono o bicatenario y puede comprender ADN o ARN.

El fragmento puede derivar tanto de la secuencia codificadora como de la no codificadora.

En otra realización un ácido nucleico de PGP sintasa aislado codifica la región codificadora completa. En otra realización, el ácido nucleico de PGP sintasa aislado codifica una secuencia correspondiente a la proteína madura. Por ejemplo, la forma madura de la PGP sintasa abarca desde aproximadamente el aminoácido 68 al último aminoácido. Otros fragmentos incluyen secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de aminoácidos descritos en este documento.

De este modo, los fragmentos de ácido nucleico de la PGP sintasa incluyen además secuencias que corresponden a los dominios descritos en este documento subregiones también descritas y sitios funcionales específicos. Los fragmentos de ácido nucleico de la PGP sintasa también incluyen combinaciones de los dominios, segmentos y otros sitios funcionales descritos anteriormente. Una persona experta en la materia conocerá las numerosas permutaciones posibles.

Cuando se haya predicho la localización de los dominios o sitios mediante análisis por ordenador, un experto apreciará que los restos de aminoácidos que constituyen estos dominios pueden variar dependiendo de los criterios usados para definir los dominios.

Sin embargo, se entiende que un fragmento de la PGP sintasa incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que no incluya el gen completo.

La invención también proporciona fragmentos de ácido nucleico de la PGP sintasa que codifican regiones portadoras de epítopos de las proteínas PGP sintasas descritas en este documento.

No se interpreta que los fragmentos de ácido nucleico, según la presente invención, incluyan a aquellos fragmentos que puedan haber sido descritos antes de la invención.

Usos de los polinucleótidos

Los fragmentos de ácido nucleico de la invención proporcionan sondas o cebadores para los ensayos, tales como los descritos a continuación. Las "sondas" son oligonucleótidos que hibridan de una manera específica de base con una cadena complementaria de ácido nucleico. Estas sondas incluyen ácidos nucleicos de polipéptidos, como se describe en Nielsen y col. (1991) Science 254:1497-1500. Típicamente, una sonda comprende una región de secuencia de nucleótido que hibrida en afecciones muy rigurosas con al menos aproximadamente 15, típicamente con aproximadamente 20-25 y, más típicamente con aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de la secuencia del ácido nucleico mostrado en la ID SEC Nº 1 y las complementarias de la misma. Más típicamente, la sonda además comprende un marcador, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor de una enzima.

Según se usa en este documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido monocatenario que actúa como punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida por molde usando procedimientos bien conocidos (por ejemplo, PCR, LCR) incluyendo, pero sin limitaciones, aquellos descritos en este documento.

La longitud apropiada del cebador depende del uso en particular, pero típicamente oscila de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. La expresión "sitio del cebador" se refiere al área del ADN diana en el que hibrida un cebador. La expresión "par de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador 5' (antes del extremo 5') que hibrida con el extremo 5' de la secuencia del ácido nucleico que se va a amplificar y un cebador 3' (después del extremo 3') que hibrida con la secuencia complementaria a la que se va a amplificar.

Por tanto, los polinucleótidos de la PGP sintasa son útiles como sondas, cebadores y en ensayos biológicos.

Cuando los polinucleótidos se usan para evaluar las propiedades o funciones de la PGP sintasa, tales como en los ensayos descritos en este documento, puede se útil todo o casi todo el ADNc completo. Los ensayos específicamente dirigidos a las funciones de la PGP sintasa, tales como la evaluación de la actividad agonista o antagonista, abarcan el uso de fragmentos conocidos. Adicionalmente, también pueden practicarse procedimientos diagnósticos para evaluar la función de la PGP sintasa con cualquier fragmento, incluyendo los fragmentos que pueden ser conocidos antes de la invención.

De forma similar, en procedimientos que implican el tratamiento de la disfunción de la PGP sintasa, se abarcan todos los fragmentos incluyendo aquellos que puedan ser conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos para la PGP sintasa son útiles coma sonda de hibridación con ADNc y ADN genómico para aislar clones de ADNc o genómico de longitud completa que codifican los polipéptidos descritos en la ID SEC Nº 2 y para aislar los clones de ADNc y genómico que se corresponden con la producción de variantes de los mismos polipéptidos mostrados en la ID SEC Nº 2 o las demás variantes descritas en este documento. Las variantes pueden aislarse del mismo tejido y organismo del que se aislaron los polipéptidos mostrados en la ID SEC Nº 2, tejidos diferentes del mismo organismo o de diferentes organismos. Este procedimiento es útil para aislar genes y ADNc que están controlados por el desarrollo y, por tanto, pueden expresarse en el mismo tejido o en tejidos diferentes en puntos diferentes del desarrollo de un organismo.

La sonda puede corresponderse con cualquier secuencia a lo largo de la longitud completa del gen que codifica la PGP sintasa. Por consiguiente, podría derivar de las regiones 5' no codificadoras, de la región codificadora y de las regiones 3' no codificadoras.

La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el ADNc de longitud completa de la ID SEC Nº 1, o un fragmento del mismo, tal como un oligonucleótido con una longitud de al menos 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 100, 250 ó 500 nucleótidos y suficiente para hibridar específicamente en afecciones rigurosos con ARNm o ADN.

Los fragmentos de los polinucleótidos descritos en este documento también son útiles para sintetizar fragmentos mayores o polinucleótidos de longitud completa descritos en este documento. Por ejemplo, un fragmento puede hibridar con cualquier porción de un ARNm y puede producir un ADNc mayor o de longitud completa.

Los fragmentos también son útiles para sintetizar moléculas complementarias de longitud y secuencia deseadas.

Pueden diseñarse ácidos nucleicos complementarios de la invención usando las secuencias de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 o ID SEC Nº 3 y construirse usando reacciones de síntesis química y ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico complementario (por ejemplo, un oligonucleótido complementario) usando nucleótido naturales o nucleótidos modificados de forma diversa para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del duplete formando entre los ácidos nucleicos complementarios y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que puede usarse para generar el ácido nucleico complementario incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hypoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N-l6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacétio (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3) w y 2,6-diaminopurina.

Alternativamente, el ácido nucleico complementario puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en que el que ha subclonado un ácido nucleico en orientación complementaria (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación complementaria con respecto al ácido nucleico diana de interés).

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden modificarse en el resto de la base, resto del azúcar o en el esqueleto fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, puede modificarse el esqueleto fosfato desoxirribosa de los ácidos nucleicos para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup y col. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5). Como se usa en este documento, las expresiones "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" se refieren a miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, miméticos de ADN, en los que el esqueleto fosfato desoxirribosa se sustituye por un esqueleto pseudopeptídico y sólo se mantienen las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutro de los PNA permite la hibridación específica con ADN y ARN en afecciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA puede realizarse usando protocolos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en Hyrup y col. (1996), supra; Perry-O'Keefe y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670.

Los PNA pueden modificarse además, por ejemplo, para potenciar su estabilidad, especificidad o captación celular, uniendo grupos lipófilos u otros grupos auxiliares a PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocido en la técnica. La síntesis de quimeras PNA-ADN puede realizarse como se describe en Hyrup (1996), supra, Finn y col. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63, Mag y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973 y Peterser y col. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119.

Las moléculas de ácido nucleico y fragmentos de la invención también pueden incluir otros grupos añadidos, tales como péptidos (por ejemplo, dirigir la PGP sintasa in vivo a la células huésped) o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT Nº WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de escisión que desencadenan la hibridación (véase, por ejemplo, Krol y col. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm Res. 5:539-549).

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles como cebadores de PCR para amplificar cualquier región determinada de un polinucleótido de la PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para construir vectores recombinantes. Estos vectores incluyen vectores de expresión que expresan una porción o todos los polipéptidos de la PGP sintasa. Los vectores también incluyen vectores de inserción, usados para integrarse en otra secuencia polinucleotídica, tal como dentro del genoma celular, y para alterar la expresión in situ de los genes de la PGP sintasa y de los productos génicos. Por ejemplo, una secuencia que codifica la PGP sintasa endógena puede sustituirse mediante recombinación homóloga con toda o parte de la región codificadora que contiene una o más mutaciones introducidas específicamente.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para expresar porciones antigénicas de las proteínas PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles como sondas para determinar las posiciones cromosómicas de los polinucleótidos de la PGP sintasa mediante procedimientos de hibridación in situ, tales como FISH. (Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, Nueva York) y PCR para el mapeo de híbridos celulares somáticos. El mapeo de las secuencias en cromosomas es una primera etapa importante para la correlación de estas secuencias con genes asociados con la enfermedad.

Los reactivos para el mapeo cromosómico, pueden usarse individualmente para marcar un único cromosoma o un único sitio en este cromosoma o pueden usarse paneles de reactivos para marcar sitios múltiples y/o cromosomas múltiples. Realmente, con el fin de mapear se prefieren reactivos que corresponden a regiones no codificadoras de los genes. Es más probable que las secuencias codificadoras estén conservadas dentro de las familias de genes, aumentado de este modo la posibilidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.

Una vez que se ha mapeado una secuencia en una localización cromosómica precisa, puede establecerse una correlación entre la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa genético. (Estos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible a través de la red en la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre un gen y una enfermedad mapeada en la misma región cromosómica, pueden identificarse a continuación a través del análisis de ligamiento (coheredabilidad de genes físicamente adyacentes), descrito, por ejemplo, en England y col. (1987) Nature 325:783-787).

Además, pueden determinarse las diferencias en las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con una enfermedad asociada con un gen específico. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en los individuos no afectados, entonces, probablemente la mutación es un agente causal de la enfermedad en particular.

La comparación de individuos afectados o no afectados generalmente suponen una primera búsqueda de alteraciones en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones, que se ven en extensiones de cromosomas o se pueden detecta usando PCR basada en esta secuencia de ADN. Finalmente, puede realizarse una secuenciación completa de los genes de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones a partir de polimorfismos.

Las sondas de polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para determinar los patrones de la presencia del gen que codifica la PGP sintasa y sus variantes con respecto a la distribución tisular, por ejemplo, si ha tenido lugar una duplicación génica y si la duplicación tiene lugar en todos o sólo en un subgrupo de tejidos. Los genes pueden ser naturales o puede introducirse en una célula, tejido u organismo de forma exógena.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para diseñar ribozimas correspondientes a todo, o parte, del ARNm producido a partir de los genes que codifican los polinucleótidos descritos en este documento.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para construir células huésped que expresen una parte o todos los polinucleótidos y polipéptidos de la PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para construir animales transgénicos que expresen una parte o todos los polinucleótidos y polipéptidos de la PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para construir vectores que expresen una parte o todos los polipéptidos de la PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles como sondas de hibridación para determinar el nivel de expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa. Por consiguiente, las sondas pueden usarse para detectar la presencia o para determinar los niveles de ácido nucleico de la PGP sintasa en células, tejidos y en organismos. El ácido nucleico cuyo nivel se determina puede ser ADN o ARN. Por lo tanto, las sondas que se corresponden con los polipéptidos descritos en este documento pueden usarse para evaluar el número de copias de un gen en una célula, tejido u organismo determinado. Esto es especialmente importante en casos en los que ha habido una amplificación de los genes de la PGP sintasa.

Alternativamente, la sonda puede usarse en un contexto de hibridación in situ para evaluar la posición de copias extra de los genes de la PGP sintasa, como en elementos extracromosómicos, o integrados en cromosomas en los que normalmente no se encuentra el gen de la PGP sintasa, por ejemplo, como una región teñida homogéneamente.

Estos usos son importantes para el diagnóstico de las enfermedades que suponen un aumento o disminución de la expresión de la PGP sintasa con respecto a lo normal, tales como trastornos proliferativos o un trastorno de diferenciación o desarrollo.

Los trastornos en los que la expresión de la PGP sintasa es importante incluyen, pero sin limitaciones, enfermedades asociadas con la biosíntesis y metabolismo defectuoso de cardiolipina (CL) y fosfatidilglicerol (PG).

Los tejidos y/o células en los que se expresa 27411 se describen anteriormente en este documento. De este modo, el gen es especialmente importante para el tratamiento de enfermedades que afectan a estos tejidos.

Además, las enfermedades en las que es importante la expresión de 27411 se describen anteriormente en este documento.

De este modo, se describen un procedimiento para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad anómala del ácido nucleico de la PGP sintasa, en el que se obtiene una muestra de un sujeto y se detecta un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm o ADN genómico), en el que la presencia del ácido nucleico es diagnóstico para un sujeto con una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollarlos, asociados con la expresión o actividad anómala de ácido nucleico.

"Expresión incorrecta o anómala", como se usa en este documento, se refiere a un patrón de tipo no silvestre de la expresión génica, a nivel de ARN o de proteína. Incluye: expresión a niveles no de tipo silvestre, es decir, sobre o infraexpresión; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de tiempo o fase en la que se expresa el gen, por ejemplo, aumento o descenso de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un periodo o fase de desarrollo predeterminada; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del tamaño de ayuste, secuencia de aminoácidos, modificación postranscripcional o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del efecto de un estímulo ambiental o un estímulo extracelular sobre expresión del gen; por ejemplo, un patrón del aumento o descenso de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en presencia de un aumento o disminución de la intensidad del estímulo.

Un aspecto de la invención se refiere a ensayos diagnósticos para determinar la expresión de un ácido nucleico así como la actividad en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar si un individuo tiene una enfermedad o trastornos, o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión de ácido nucleico o actividad anómala. Estos ensayos pueden usarse con fines de pronóstico o predicción y, de este modo, tratar profilácticamente a un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado o asociado con la expresión o actividad de las moléculas de ácido nucleico.

Las técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones de la transferencia de ARN total e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de ADN incluyen hibridaciones de la transferencia de ADN e hibridación in situ.

Las sondas pueden usarse como parte de un kit de ensayo diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan la PGP sintasa, tal como midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica la PGP sintasa en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, ARNm o ADN genómico, o determinando si el gen de la PGP sintasa ha muta-
do.

Los ensayos de expresión de ácido nucleico son útiles para el análisis de fármacos para identificar compuestos que modulan la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa (por ejemplo, moléculas complementarias, de polipéptidos, peptidomiméticas, pequeñas moléculas u otros fármacos). Se pone una célula en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm. El nivel de expresión del ARNm en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm en ausencia del compuesto candidato. A continuación, el compuesto candidato puede identificarse como un modulador de la expresión de ácido nucleico en base a esta comparación y usarse, por ejemplo, para tratar un trastorno caracterizado por la expresión anómala del ácido nucleico. El modulador puede unirse al ácido nucleico o modular la expresión indirectamente, tal como mediante la interacción con otros compuestos celulares que afectan a la expresión del ácido nucleico.

Los procedimientos moduladores puede realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto) en pacientes o animales transgénicos.

Por tanto, la invención se refiera a un procedimiento para identificar un compuesto que puede usarse para tratar un trastorno asociado con la expresión del ácido nucleico del gen de la PGP sintasa. El procedimiento típicamente incluye evaluar la capacidad del compuesto para modular la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa y, por tanto, identificar un compuesto que pueda usarse para tratar un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de un ácido nucleico de la PGP sintasa.

Los ensayos pueden realizarse en sistemas basados en células y libres de células. Los ensayos basados en células incluyen células que expresan de forma natural el ácido nucleico de la PGP sintasa o células recombinantes modificadas genéticamente para expresar secuencias de ácido nucleico específicas, por ejemplo, las citadas anteriormente y en los antecedentes.

Alternativamente, los compuestos candidatos pueden ensayarse in vivo en pacientes o en animales transgénicos.

El ensayo para la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa puede implicar un ensayo directo de los niveles de ácido nucleico, tales como los niveles de ARNm, o de los compuestos colaterales implicados en la reacción catalizada por la PGP sintasa. Adicionalmente, también pueden evaluarse la expresión de genes que se regulan por incremento o por descenso en respuesta a la ruta de señalización de la PGP sintasa. En esta realización, las regiones reguladoras de estos genes pueden unirse de forma operativa a un gen indicador, tal como la luciferasa.

De este modo, pueden identificarse moduladores de la expresión del gen de la PGP sintasa en un procedimiento en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm. El nivel de expresión del ARNm de la PGP sintasa en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm de la PGP sintasa en ausencia del compuesto candidato. A continuación, el compuesto candidato puede identificarse como un modulador de la expresión de ácido nucleico en base a esta comparación y usarse, por ejemplo, para tratar un trastorno caracterizado por la expresión anómala del ácido nucleico. Cuando la expresión del ARNm es significativamente mayor, desde un punto de vista estadístico, en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión del ácido nucleico. Cuando la expresión del ácido nucleico es significativamente menor, desde un punto de vista estadístico, en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión del ácido nucleico.

Por consiguiente, la invención se refiere al tratamiento, con el ácido nucleico como objetivo, usando un compuesto identificado a través del análisis de fármacos como un modulador del gen para modular la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa. La modulación incluye tanto regulación por incremento (es decir, activación o efecto agonista) como regulación por disminución (supresión o efecto antagónico) o efectos sobre la actividad de ácido nucleico (por ejemplo, cuando el ácido nucleico está mutado o se ha modificado de forma incorrecta). El tratamiento es de trastornos que se caracterizan por la expresión o actividad anómala del ácido nucleico. Se han descrito anteriormente en este documento trastornos en los que el gen es especialmente destacable para el tratamiento.

Alternativamente, un modulador de la expresión del ácido nucleico del PGP sintasa puede ser una molécula pequeña o un fármaco identificado usando los ensayos de selección descritos en este documento siempre que el fármaco o la molécula pequeña inhiba la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para controlar la eficacia de los compuestos moduladores sobre la expresión o actividad del gen de la PGP sintasa en ensayos clínicos o en un régimen de tratamiento. De este modo, el patrón de expresión del gen puede servir como barómetro de la eficacia continuada del tratamiento con el compuesto, especialmente con compuestos a los que el paciente puede desarrollar resistencia. El patrón de expresión del gen también puede servir como marcador indicativo de una respuesta fisiológica de las células afectadas al compuesto. Por consiguiente, este control permitía aumentar la administración del compuesto o la administración de compuestos alternativos a los que el paciente no se ha hecho resistente. De forma similar, si el nivel de expresión del ácido nucleico cae por debajo de un nivel deseado, podría disminuirse de forma proporcional la administración del compuesto.

El control puede ser, por ejemplo, como sigue: (i) obtener una muestra preadministración a partir de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de un ARNm o ADN genómico de la invención en la muestra de preadministración; (iii) obtener una o más muestras de postadministración a partir del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o la actividad del ARNm o del ADN genómico en las muestras postadministración, (v) comparar el nivel de expresión o la actividad de del ARNm o del ADN genómico en la muestra preadministración con el ARNm o el ADN genómico en la muestra o muestras postadministración y (vi) en consecuencia, aumentar o disminuir la administración del agente.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles en los ensayos diagnósticos de cambios cualitativos en el ácido nucleico de la PGP sintasa, y especialmente en cambios cualitativos que lleven a una patología. Los polinucleótidos pueden usarse para detectar mutaciones en los genes de la PGP sintasa y en los productos de expresión del gen, tales como ARNm. Los polinucleótidos pueden usarse como sondas de hibridación para detectar mutaciones genéticas naturales en el gen de la PGP sintasa y para determinar, de este modo, si un sujeto con la mutación está en riesgo de desarrollar un trastorno causado por la mutación. Las mutaciones incluyen deleción, adición o sustitución de uno o más nucleótidos en el gen, reordenamiento cromosómico, tal como inversión o transposición, modificación del ADN genómico, tal como patrones de metilación anómalos o cambios en el número de copias del gen, tal como amplificación. La detección de una forma mutada del gen de la PGP sintasa asociada con una disfunción proporciona una herramienta diagnóstica de una enfermedad activa o de la susceptibilidad a una enfermedad cuando la enfermedad es el resultado de sobreexpresión, infraexpresión o expresión alterada de una PGP sintasa.

La mutaciones en el gen de la PGP sintasa pueden detectarse a nivel del ácido nucleico mediante varias técnicas. El ADN genómico puede analizarse directamente o puede amplificarse usando una PCR previa al análisis. Pueden usarse ARN o ADNc de la misma manera.

En ciertas realizaciones, la detección de la mutación supone el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR anclada o PCR RACE o, alternativamente, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran y col. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa y col. (1994) PNAS 91:360-363), la última de las cuales puede ser especialmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen (véase Abravaya y col., (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibriden específicamente con un gen en afecciones en las que tenga lugar esta hibridación y amplificación del gen (si está presente) y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando el ADN amplificado con secuencias de ARN normales o de ADN complementarias.

Se anticipa que puede ser deseable usar la PCR y/o la LCR como una etapa preliminar de amplificación junto con cualquiera de las técnicas usada para detectar mutaciones descritas en este documento.

Los procedimientos alternativos a la amplificación incluyen: replicación automantenida de secuencia (Guatelli y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi y col. (1988) Bio/Technology 6:1197), o cualquier otro procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si estas moléculas se presentan en cantidades muy bajas.

Alternativamente, las mutaciones en un gen de PGP sintasa puede identificarse directamente, por ejemplo, mediante alteraciones en los patrones de digestión con enzimas de restricción determinados por electroforesis en gel.

Adicionalmente, pueden usarse ribozimas específicas de secuencia (Patente de EE.UU. Nº 5.498.531) para valorar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o pérdida de un sitio de escisión para la ribozima.

Las secuencias perfectamente coincidentes pueden distinguirse de las secuencias no coincidentes mediante ensayos de digestión con nucleasas o mediante diferencias en la temperatura de fusión.

Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también pueden valorarse mediante ensayos de protección a nucleasa, tales como protección a RNAsa y S1, o mediante el procedimiento de la escisión química.

Adicionalmente, las diferencias de secuencia entre un gen de PGP sintasa mutante y un gen de tipo silvestre pueden determinarse mediante secuenciación directa del ADN. Durante la realización de los ensayos diagnósticos pueden utilizarse varios procedimientos de secuenciación automática ((1995) Biotechniques 19:448), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT Nº WO 94/16101; Cohen y col. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162 y Griffin y col. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).

Otros procedimientos para detectar mutaciones en el gen incluyen procedimientos en los que la protección frente a agentes de escisión se usa para detectar falta de apareamiento entre bases en dupletes de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers y col. (1985) Science 230:1242; Cotton y col. (1988) PNAS 85:4397; Saleeba y col. (1992) Meth. Enzymol. 217:286-295), en los que se compara la movilidad electroforética de los ácidos nucleicos mutante y de tipo silvestre (Orita y col. (1989) PNAS 86:2766; Cotton y col. (1993) Mutat. Res. 285:125-144 y Hayashi y col. (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79) y se analiza el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo silvestre en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalización usando geles de electroforesis con un gradiente desnaturalizante (Myers y col. (1985) Nature 313:495). La sensibilidad del ensayo puede potenciarse usando ARN (mejor que ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización, el procedimiento en cuestión utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de doble cadena heterodúplex en base a cambios en la movilidad electroforética (Keen y col. (1991) Trends Genet. 7:5). Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen la hibridación selectiva de oligonucleótidos, la amplificación selectiva y la extensión selectiva con cebador.

En otras realizaciones, las mutaciones genéticas pueden identificarse mediante hibridación de una muestra con los ácidos nucleicos control, por ejemplo, ADN o ARN, en matrices de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin y col. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal y col. (1996) Nature Medicine 2:753-759). Por ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN que generan luminiscencia, como describen Cronin y col, supra. Brevemente, puede usarse una primera matriz de sondas de hibridación para buscar a lo largo de segmentos largos de ADN en una muestra y en un control para identificar cambios de bases entre las secuencias haciendo matrices lineares de sondas secuenciales solapantes. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando matrices más pequeñas de sondas especializadas complementarias de todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutación está compuesta de conjuntos de sondas paralelas, una complementaria con el gen de tipo silvestre y la otra complementaria con el gen mutante.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para analizar un genotipo de un individuo que, aunque necesariamente no causa la enfermedad, afecta, sin embargo, a la modalidad de tratamiento. De este modo, los polinucleótidos pueden usarse para estudiar la relación entre un genotipo de un individuo y la respuesta del individuo a un compuesto usado para el tratamiento (relación farmacogenómica). En el caso presente, por ejemplo, una mutación en el gen de la PGP sintasa que da lugar a una afinidad alterada por una coenzima podría dar lugar a un efecto excesivo o disminuido del fármaco a concentraciones convencionales de la coenzima que activan a la PGP sintasa. Por consiguiente, los polinucleótidos de la PGP sintasa descritos en este documento pueden usarse para evaluar el contenido de mutación del gen en un individuo para seleccionar un compuesto o pauta de dosificación apropiado para el tratamiento.

De este modo, los polinucleótidos que muestran variaciones genéticas que afectan al tratamiento proporcionan un objetivo diagnóstico que puede usarse para adaptar el tratamiento a un individuo. Por consiguiente, la producción de células y animales recombinantes que contienen estos polimorfismos permite un diseño clínico eficaz de compuestos de tratamiento y pautas de dosificación.

Los procedimientos pueden implicar obtener una muestra biológica control a partir de un sujeto control, poner en contacto la muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar el ARNm o el ADN genómico, de modo que se detecte la presencia del ARNm o del ADN genómico en la muestra biológica, y comparar la presencia del ARNm o del ADN genómico en la muestra control con la presencia del ARNm o ADN genómico en la muestra de ensayo.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también son útiles para la identificación cromosómica cuando la secuencia se identifica con un cromosoma en particular y con una localización en particular en el cromosoma. En primer lugar, la secuencia de ADN se hace coincidir con el cromosoma por hibridación in situ u otra hibridación específica de cromosomas. Las secuencias también pueden correlacionarse con cromosomas específicos preparando cebadores para PCR que pueden usarse para analizar por PCR híbridos de células somáticas que contienen cromosomas individuales a partir de las especies deseadas. Sólo los híbridos que contengan el cromosoma con el gen homólogo para el cebador producirán un fragmento amplificado. Puede conseguirse una sublocalización usando fragmentos cromosómicos. Otras estrategias incluyen la preselección con cromosomas marcados separados por flujo y la preselección mediante hibridación con bibliotecas específicas de cromosoma. Estrategias de mapeo adicionales incluyen la hibridación in situ fluorescente que permite la hibridación con sondas más cortas que las usadas tradicionalmente. Los reactivos para el mapeo cromosómico pueden usarse individualmente para marcar un único cromosoma o un único sitio en el cromosoma o pueden usarse paneles de reactivos para marcar sitios múltiples y/o cromosomas múltiples. Realmente, con el fin de mapear se prefieren reactivos que se correspondan con regiones no codificadoras de los genes. Dentro de las familias de genes es más probable que estén conservadas las secuencias codificadoras aumentado, de este modo, la posibilidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también pueden usarse para identificar individuos a partir de muestras biológicas pequeñas. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para identificar a un individuo. De este modo, los polinucleótidos descritos en este documento son útiles como marcadores de ADN para RFLP (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.272.057).

Además, la secuencia de la PGP sintasa puede usarse para proporcionar una técnica alternativa que determine la secuencia de ADN real de fragmentos seleccionados en el genoma de un individuo. De este modo, las secuencias de la PGP sintasa descritas en este documento pueden usarse para preparar dos cebadores de PCR a partir de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores pueden usarse a continuación para amplificar el ADN de un individuo para su secuenciación posterior.

Los paneles de secuencias de ADN correspondiente a individuos, preparados de esta manera, pueden proporcionar identificaciones individuales únicas, de modo que cada individuo tendrá un único conjunto de estas secuencias de ADN. Se estima que la variación alélica en humanos tiene lugar con una frecuencia de aproximadamente una de cada 500 bases. La variación alélica tiene lugar hasta un cierto grado en las regiones codificadoras de estas secuencias y en mayor grado en las regiones no codificadoras. Las secuencias de la PGP sintasa pueden usarse para obtener estas secuencias de identificación de individuos y de tejidos. Las secuencias representan fragmentos únicos del genoma humano. Cada una de las secuencias descritas en este documento puede, en cierto grado, usarse con patrón frente al que poder comparar el ADN de un individuo con fines de identificación.

Si se usa un panel de reactivos de las secuencias para generar una base de datos de identificación única de un individuo, estos mismos reactivos pueden usarse posteriormente para identificar el tejido de este individuo. Usando la base de datos de identificación única, puede hacerse una identificación positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también pueden usarse en procedimientos de identificación forense. La tecnología de PCR puede usarse para amplificar secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas, tales como un único folículo piloso o fluidos corporales (por ejemplo, sangre, saliva o semen). A continuación, la secuencia amplificada puede compararse con un patrón, lo que permitirá la identificación del origen de la muestra.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden usarse por tanto para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, cebadores para PCR, dirigidos hacia loci específicos del genoma humano, que pueden potenciar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en el ADN proporcionando, por ejemplo, otro "marcador de identificación" (es decir, otra secuencia de ADN que es única de un individuo en particular). Como se describe anteriormente, la información real de la secuencia de bases puede usarse para la identificación como una alternativa precisa a los patrones formados por fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias dirigidas hacia las regiones no codificadoras son especialmente útiles ya que los mayores polimorfismos tienen lugar en las regiones no codificadoras, haciendo más fácil la diferenciación de los individuos usando esta técnica.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden además usarse para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, sondas marcadas o susceptibles de marcaje que pueden usarse, por ejemplo, en una técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico. Esto es útil en los casos en que un patólogo forense se presenta con un tejido de origen desconocido. Los paneles de las sondas de la PGP sintasa pueden usarse para identificar el tejido por especie y/o por tipo de órgano.

De modo similar, estos cebadores y sondas pueden usarse para analizar la contaminación en cultivos tisulares (es decir, análisis de la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).

Alternativamente, los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden usarse directamente para bloquear la transcripción o la traducción de las secuencias del gen de la PGP sintasa mediante construcciones complementarias o ribozimas. De este modo, en un trastorno caracterizado por una expresión anómalamente elevada o no deseada del gen de la PGP sintasa, los ácidos nucleicos pueden usarse directamente para el tratamiento.

De este modo, los polinucleótidos de la PGP sintasa son útiles como construcciones complementarias para controlar la expresión del gen de la PGP sintasa en células, tejidos y organismos. Se diseña un polinucleótido de ADN complementario para que sea complementario a una región del gen implicada en la transcripción, que prevenga la transcripción y, por tanto, la producción de la proteína PGP sintasa.

Un polinucleótido de ARN o ADN antisentido hibridaría con el ARNm y, por tanto, bloquearía la traducción del ARNm a la proteína PGP sintasa.

Ejemplos de moléculas antisentido útiles para inhibir la expresión del ácido nucleico incluyen moléculas complementarias con un fragmento de la región no traducida 5' de la ID SEC Nº 1, que también incluye el codón de inicio y moléculas complementarias que lo son de un fragmento de la región no traducida 3' de la ID SEC Nº 1.

Alternativamente, puede usarse una clase de moléculas complementarias para inactivar el ARNm con el fin de disminuir la expresión del ácido nucleico de la PGP sintasa. Por consiguiente, estas moléculas pueden tratar un trastorno caracterizado por una expresión anómala o no deseada del ácido nucleico de la PGP sintasa. Esta técnica implica la escisión mediante ribozimas que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a una o más regiones del ARNm, que atenúan la capacidad del ARNm para ser traducido. Las regiones posibles incluyen regiones codificadoras y, especialmente, regiones codificadoras correspondientes a la actividad catalítica y a otras actividades funcionales de la proteína PGP sintasa.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también proporcionan vectores para terapia génica en pacientes que contienen células anómalas para la expresión del gen de la PGP sintasa. De este modo, las células recombinantes, que incluyen las células del paciente que han sido manipuladas genéticamente ex vivo y devueltas al paciente, se introducen en un individuo donde las células producen la proteína PGP sintasa deseada para tratar al individuo.

También se describen kits para la detección de la presencia de un ácido nucleico de la PGP sintasa en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender reactivos, tales como un ácido nucleico o agente marcado o susceptible de marcaje, capaces de detectar el ácido nucleico de la PGP sintasa en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de ácido nucleico de la PGP sintasa en la muestra y medios para comparar la cantidad de ácido nucleico de la PGP sintasa en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede empaquetarse en un recipiente adecuado. El kit además puede comprenden instrucciones de uso del kit para detectar el ARNm o el ADN de la PGP
sintasa.

Soportes legibles en el ordenador

Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de la invención pueden estar en forma de varios medios para facilitar el uso de las mismas. Tal como un producto, distinto de una molécula de ácido nucleico o aminoácido aislado, que contenga una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención. Este producto proporciona las secuencias de nucleótidos o aminoácidos o un subgrupo de los mismos (por ejemplo, un subgrupo de fases de lectura abierta (ORF)) en una forma que permite a un experto examinar el producto usando medios no aplicables directamente al examen de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, o a un subgrupo de los mismos, como existen en la naturaleza o en forma purificada.

En una aplicación de esta realización, puede registrarse una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención en soportes legibles en el ordenador. Según se usa en este documento, "soportes legibles en el ordenador" se refiere a cualquier medio que puede leerse y al que puede accederse directamente mediante un ordenador. Estos soportes incluyen, pero sin limitaciones: soportes de almacenamiento magnético, tales como disquetes, soportes de almacenamiento en disco duro y cinta magnética; soportes de almacenamiento óptico, tal como CD-ROM; soportes de almacenamiento electrónico, tales como RAM y ROM e híbridos de estas categorías, tales como soportes de almacenamiento magnético/óptico. Un experto apreciará fácilmente cuántos de los soportes legibles en el ordenador conocidos actualmente pueden usarse para crear un producto que comprenda un soporte legible en el ordenado que tenga grabada en él una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.

Según se usa en este documento, "grabar" se refiere a un procedimiento para almacenar información en un soporte legible en el ordenador. Un experto puede adoptar fácilmente cualquiera de los procedimientos actualmente conocidos para grabar información en un soporte legible en el ordenador para generar productos que comprendan la información de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.

Un experto dispone de diversas estructuras para el almacenamiento de datos para crear un soporte legible en el ordenador en el que se ha grabado una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención. La elección de la estructura para el almacenamiento de datos generalmente se basará en los soportes elegidos para el acceso a la información almacenada. Además, pueden usarse diversos programas y formatos de procesamientos de datos para almacenar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en un soporte legible en el ordenador. La información de secuencia puede presentarse en un archivo de procesador de texto, con formato para software disponible en el mercado, tal como WordPerfect y Microsoft Word, o presentarse en formato de archivo ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, tales como DB2, Sybase, Oracle o similares. Un experto puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos con estructura de procesador de texto (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener un soporte legible en el ordenador que tiene grabada la información de la secuencia de nucleótido de la presente invención.

Proporcionando las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención en formato legible en el ordenador, el experto puede acceder de forma rutinaria a la información de la secuencia con diversos propósitos. Por ejemplo, un experto puede usar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención en formato legible en el ordenador para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada en los soportes de almacenamiento de datos. Se usan medios de búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención que coinciden con una secuencia diana o un motivo diana en especial.

Como se usa en este documento, una "secuencia diana" puede ser cualquier secuencia de ADN o de aminoácidos de seis nucleótidos o más o de dos aminoácidos o más. Un experto puede reconocer fácilmente que cuanto más larga sea una secuencia diana menos probable es que esta secuencia diana se presente de forma aleatoria en la base de datos. La longitud de secuencia más preferida de una secuencia diana es de aproximadamente 10 a 100 aminoácidos o de aproximadamente 30 a 300 restos de nucleótidos. Sin embargo, está bien reconocido que los fragmentos importantes desde un punto de vista comercial, tal como fragmentos de secuencias implicados en la expresión génica y en el procesamiento de proteínas, puede tener una longitud menor.

Como se usa en este documento, "un motivo estructural diana" o "motivo diana" se refiere a cualquier secuencia o combinación de secuencias seleccionadas de forma racional en donde la secuencia o secuencias se eligen en base a una configuración tridimensional formada tras el plegamiento del motivo diana. En la técnica se conocen varios motivos diana. Los motivos diana proteicos incluyen, pero sin limitaciones, sitios activos y secuencias señal de enzimas. Los motivos diana de ácido nucleico incluyen, pero sin limitaciones, secuencias promotoras, estructuras en horquilla y elementos de expresión inducibles (secuencias de unión a proteína).

El software para el ordenador está disponible públicamente, lo que permite a un experto acceder a la información de la secuencia proporcionada en un soporte legible en el ordenador para análisis y comparación con otras secuencias. Se describen públicamente diversos algoritmos conocidos y hay y pueden usarse diversos softwares disponibles en el mercado en los sistemas que utilizan ordenadores de la presente invención. Ejemplos de este software incluye, pero sin limitaciones, MacPattern (EMBL), BLASTN y BLASTX (NCBIA).

Por ejemplo, el software que pone en práctica los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) y BLAZE (Brutlag y col. (1993) Comp. Chem. 17:203-207) que busca algoritmos en un sistema Sybase puede usarse para identificar fases de lectura abierta (ORF) de la secuencia de la invención que contiene homología con los ORF o proteínas de otras bibliotecas. Estos ORF son fragmentos que codifican una proteína y son útiles para producir proteínas de importancia comercial, tales como enzimas, usadas en diversas reacciones y en la producción de metabolitos de utilidad comercial.

Vectores/células huésped

La invención también proporciona vectores que contienen los polinucleótidos de la PGP sintasa. El término "vector" se refiere a un vehículo, preferiblemente una molécula de ácido nucleico, que puede transportar los polinucleótidos de la PGP sintasa. Cuando el vector es una molécula de ácido nucleico, los polinucleótidos de la PGP sintasa se unen covalentemente al ácido nucleico del vector. En este aspecto de la invención, el vector incluye un plásmido, un fago mono o bicatenario, un vector vírico de ARN o ADN mono o bicatenario o un cromosoma artificial, tal como un BAC, PAC, YAC o MAC.

Un vector puede mantenerse en la célula huésped como un elemento extracromosómico, donde se replica y producen copias adicionales de los polinucleótidos de la PGP sintasa. Alternativamente, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped y producir copias adicionales de los polinucleótidos de la PGP sintasa cuando la célula huésped se replica.

La invención proporciona vectores para el mantenimiento (vectores de clonación) o vectores para la expresión (vectores de expresión) de los polinucleótidos de la PGP sintasa. Los vectores puede funcionar en células procariotas o eucariotas o en ambas (vectores lanzadera).

Los vectores de expresión contienen regiones reguladores que actúan en cis que se unen en el vector de forma operativa con los polinucleótidos de la PGP sintasa de modo que se permita la transcripción de los polinucleótidos en la célula huésped. Los polinucleótidos pueden introducirse en la célula huésped con un polinucleótido separado capaz de afectar a la transcripción. De este modo, el segundo polinucleótido puede proporcionar un factor que actúe en trans que interaccione con la región control reguladora en cis para permitir la transcripción de los polinucleótidos de la PGP sintasa a partir del vector. Alternativamente, la célula huésped puede suministrar un factor que actúe en trans. Finalmente, el vector mismo puede producir un factor que actúe en trans.

Se entiende, sin embargo, que en algunas realizaciones, puede darse la transcripción y/o traducción de los polinucleótidos de la PGP sintasa en un sistema libre de células.

La secuencia reguladora a la que los polinucleótidos descritos en este documento pueden unirse de forma operativa incluye promotores para dirigir la transcripción del ARNm. Estos incluyen, pero sin limitaciones, el promotor izquierdo del bacteriófago \lambda, los promotores lac, TRP y TAC de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor inmediato temprano del CMV, los promotores temprano y tardío de adenovirus y las repeticiones largas terminales del retrovirus.

Además de las regiones control que promueven la transcripción, los vectores de expresión también pueden incluir regiones que modulen la transcripción, tales como sitios de unión del represor y potenciadores. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40, el potenciador inmediato temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma, los potenciadores de adenovirus y los potenciadores de la RLT del retrovirus.

Además de contener sitios para el inicio y control de la transcripción, los vectores de expresión también pueden contener secuencias necesarias para finalizar la transcripción, y en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. Otros elementos reguladores del control de la expresión incluyen codones de inicio y parada, así como señales de poliadenilación. El experto en la materia conocerá las numerosas secuencias reguladoras que son útiles en los vectores de expresión. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Pueden usarse diversos vectores de expresión para expresar un polinucleótido de la PGP sintasa. Estos vectores incluyen vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levaduras, de elementos cromosómicos de levaduras, incluyendo cromosomas artificiales de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus, virus de pseudorrabia y retrovirus. Los vectores también pueden derivar de combinaciones de estas fuentes, tales como los que derivan de elementos genéticos plasmídicos y bacteriófagos, por ejemplo, cósmidos y fagémidos. En Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, se describen vectores de clonación y de expresión apropiados para huéspedes procariotas y eucariotas.

La secuencia reguladora puede proporcionar una expresión constitutiva en una o más células huésped (es decir, específica de tejido) o puede proporcionar una expresión inducible en uno o más tipos de células, tal como mediante temperatura, adición de un nutriente o un factor exógeno, tal como una hormona u otro ligando. Los expertos en la materia conocen bien diversos los vectores que proporcionan expresión constitutiva e inducible en huéspedes procariotas y eucariotas.

Los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden insertarse en el ácido nucleico del vector mediante metodología bien conocida. Generalmente, la secuencia de ADN que finalmente se expresa se une a un vector de expresión mediante la escisión de la secuencia de ADN y el vector de expresión con una o más enzimas de restricción y, a continuación, ligando los fragmentos entre sí. Los expertos en la materia conocen bien los procedimientos de digestión con enzimas de restricción y de ligamiento.

El vector que contiene el polinucleótido apropiado puede introducirse en una célula huésped apropiada para su propagación o expresión usando técnicas bien conocidas. Las células bacterianas incluyen, pero sin limitaciones, E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium. Las células eucariotas incluyen, pero sin limitaciones, levadura, células de insecto tales como Drosophila, células animales, tales como células COS y CHO y células vegetales.

Como se describe en este documento, puede ser deseable expresar el polipéptido como una proteína de fusión. Por consiguiente, la invención proporciona vectores de fusión que permiten la producción de los polipéptidos de la PGP sintasa. Los vectores de fusión pueden aumentar la expresión de una proteína recombinante, aumentar la solubilidad de la proteína recombinante y ayudar a la purificación de la proteína actuando, por ejemplo, como ligando para purificación por afinidad. Puede introducirse un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión, de modo que el polipéptido deseado pueda separarse finalmente del resto de fusión. Las enzimas proteolíticas incluyen, pero sin limitaciones, el factor Xa, la trombina y la enterocinasa. Los vectores típicos de expresión de la fusión incluyen pGEX (Smith y col. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E o la proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana. Ejemplos de vectores de expresión inducible de E. coli no de fusión adecuado incluyen pTrc (Amann y col. (1988) Gene 69:301-315) y pET11d (Studier y col. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89).

La expresión de la proteína recombinante puede maximizarse en una bacteria huésped proporcionando un fondo genético en el que la célula huésped tenga la capacidad para escindir proteolíticamente la proteína recombinante alterada (Gottesman, S. (1990) Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 119-128). Alternativamente, la secuencia del polinucleótido de interés puede alterarse para proporcionar un uso de codones preferencial de una célula huésped específica, por ejemplo E. coli (Wada y col. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118).

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también pueden expresarse mediante vectores de expresión que son funcionales en levaduras. Los ejemplos de vectores para expresión en levadura, por ejemplo. S. cerevisiae, incluyen pYepSecI (Baldari y col. (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y col. (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y col. (1987) Gene 54: 113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Los polinucleótidos de la PGP sintasa también pueden expresarse en células de insecto usando, por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y col. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow y col. (1989) Virology 170:31-39).

En ciertas realizaciones de la invención, los polinucleótidos descritos en este documento se expresan en células de mamífero usando vectores de expresión de mamíferos. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y col. (1987) EMBO J. 6:187-195).

Los vectores de expresión enumerados en este documento se proporcionan a modo de ejemplo sólo de los vectores bien conocidos disponibles para los expertos en la materia que podrían ser útiles para expresar los polinucleótidos de la PGP sintasa. El experto en la materia conocerá otros vectores adecuados para mantener la propagación o la expresión de los polinucleótidos descritos en este documento. Estos se encuentran, por ejemplo en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

La invención también abarca vectores en los que las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento se clonaron en el vector en orientación inversa, pero unidas de forma operativa a una secuencia reguladora que permite la transcripción del ARN complementario. De este modo, puede producirse una transcripción complementaria de todas, o una parte, de las secuencias polinucleotídicas descritas en este documento, que incluyen tanto regiones codificadoras como no codificadoras. La expresión de este ARN complementario está sometida a cada uno de los parámetros descritos anteriormente en relación con la expresión del ARN sentido (secuencias reguladoras, expresión constitutiva o inducible, expresión específica de tejido).

La invención también se refiere a células huésped recombinantes que contienen los vectores descritos en este documento. Por tanto, las células huésped incluyen células procariotas, células eucariotas inferiores, tales como levaduras, otras células eucariotas, tales como células de insecto, y células eucariotas superiores, tales como células de mamíferos.

Las células huésped recombinantes se preparan introduciendo las construcciones del vector descritas en este documento dentro de las células mediante técnicas fácilmente disponibles para el experto en la materia. Estas incluyen, pero sin limitaciones, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, lipofección y otras técnicas tales como las que se encuentran en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Las células huésped pueden contener más de un vector. De este modo, pueden introducirse secuencias nucleotídicas diferentes en vectores diferentes de la misma célula. De forma similar, los polinucleótidos de la PGP sintasa pueden introducirse solos o con otros polinucleótidos que no están relacionados con los polinucleótidos de la PGP sintasa, tal como aquellos que proporcionar factores que actúan en trans para vectores de expresión. Cuando se introduce en una célula más de un vector, los vectores pueden introducirse independiente, conjuntamente o unidos al vector del polinucleótido de la PGP sintasa.

En el caso de vectores bacteriófagos y virales, estos pueden introducirse en las células como virus empaquetados o encapsulados mediante procedimientos convencionales para la infección y la transducción. Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación o de replicación defectuosa. En el caso en que la replicación vírica sea defectuosa, la replicación tendrá lugar en las células huésped que proporcionan las funciones que complementan a las deficiencias.

Los vectores generalmente incluyen marcadores seleccionables que permiten la selección de la subpoblación de células que contienen las construcciones de vectores recombinantes. El marcador puede estar contenido en el mismo vector que contiene los polinucleótidos descritos en este documento o puede estar en un vector independiente. Los marcadores incluyen genes de resistencia a tetraciclina o a ampicilina para células huésped procariotas y dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para células huésped eucariotas. Sin embargo, será eficaz cualquier marcador que proporcione selección de un rasgo fenotípico.

Mientras que las proteínas maduras pueden producirse en bacterias, levaduras, células de mamífero y otras células bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas, también pueden usarse sistemas de transcripción y traducción libres de células para producir estas proteínas usando ARN derivado de las construcciones de ADN descritas en este documento.

Cuando se desea la secreción del polipéptido, se incorporan al vector señales de secreción apropiadas. La secuencia señal puede ser endógena con respecto a los polipéptidos de la PGP sintasa o heteróloga con respecto a estos polipéptidos.

Cuando el polipéptido no se secreta al medio, la proteína puede aislarse a partir de la célula huésped mediante procedimientos de rotura convencionales, incluyendo congelación y descongelación, sonicación, rotura mecánica, uso de agentes de lisis y similares. A continuación, el polipéptido puede recuperarse y purificarse mediante procedimientos de purificación bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita, cromatografía en lectina o cromatografía líquida de alta resolución.

También se entiende que dependiendo de la célula huésped en la producción recombinante de los polipéptidos descritos en este documento, los polipéptidos pueden tener diversos patrones de glucosilación, dependiendo de la célula o pueden no estar glucosilados cuando se producen en bacterias. Además, los polipéptidos pueden incluir una metionina modificada inicial en algunos casos como resultado de un procedimiento mediado por el huésped.

Usos de los vectores y de las células huésped

Se entiende que "células huésped" y "células huésped recombinantes" se refiere no sólo a las células de un sujeto en particular sino también a la progenie y posible progenie de una célula de este tipo. Puesto que pueden darse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias ambientales, esta progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero siguen incluyéndose en el alcance del término como se usa en este documento. Una "preparación de células purificada", como se usa en este documento, se refiere, en el caso de células vegetales y animales, a una preparación de células in vitro y no a una planta o animal completo intacto. En el caso de células en cultivo o de células microbianas, está compuesta de una preparación de al menos el 10% y más preferiblemente el 50% de las células del sujeto.

Las células huésped que expresan los polipéptidos descritos en este documento, y especialmente las células huésped recombinantes, tienen diversos usos. En primer lugar, las células son útiles para producir proteínas o polipéptidos de PGP sintasa que pueden purificarse adicionalmente para producir cantidades deseadas de la proteína PGP sintasa o de sus fragmentos. De este modo, las células huésped que contienen vectores de expresión son útiles para la producción del polipéptido.

Las células huésped además son útiles para realizar ensayos basados en células que impliquen a la PGP sintasa o a fragmentos de la misma. De este modo, una célula huésped recombinante que expresa una PGP sintasa nativa es útil para el ensayo de compuestos que estimulan o inhiben la función de la PGP sintasa. Estos incluyen, pero sin limitaciones, aquellos descritos en este documento y anteriormente en los antecedentes.

Las células huésped también son útiles para identificar mutantes de la PGP sintasa en los que estas funciones están afectadas. Si los mutantes son naturales y dan origen a una patología, las células huésped que contienen las mutaciones son útiles para el ensayo de compuestos que tienen un efecto deseado sobre la PGP sintasa mutante (por ejemplo, función de estimulación o inhibición) que puede no estar indicado debido a su efecto sobre la PGP sintasa nativa.

Las células huésped recombinantes también son útiles para la expresión de los polipéptidos quiméricos descritos en este documento y evaluar compuestos que activan o suprimen la activación por medio de un dominio heterólogo, segmento, sitio o similar, como se describe en este documento.

Adicionalmente, puede diseñarse un mutante de PGP sintasa en el que se aumenta o disminuye una o más de las diversas funciones por ingeniería genética y usarlo para aumentar o sustituir las proteínas PGP sintasas en un individuo. De este modo, las células huésped pueden proporcionan un beneficio terapéutico sustituyendo una PGP sintasa anómala o proporcionando una PGP sintasa anómala que proporcione un resultado terapéutico. En una realización, las células proporcionan PGP sintasas que son anormalmente activas.

En otra realización, las células proporcionan PGP sintasas que son anormalmente inactivas. Estas PGP sintasas pueden competir con la PGP sintasa endógena en un individuo.

En una realización, las células que expresan la PGP sintasa que no es catalíticamente activa se introducen en un individuo para competir con la PGP sintasa endógena. Por ejemplo, en el caso en que cantidades excesivas de un sustrato o efector de la PGP sintasa es parte de una modalidad de tratamiento, puede ser necesario inactivar esta molécula en un punto específico del tratamiento. Podría ser beneficioso proporcionar células que compiten por la molécula, pero que no puedan verse afectadas por la activación de la PGP sintasa.

También pueden producirse de forma homóloga células huésped recombinantes que permitan la alteración in situ de las secuencias polinucleotídicas de la PGP sintasa endógena en el genoma en una célula huésped. La célula huésped incluye, pero sin limitaciones, un línea celular estable, una célula in vivo o un microorganismo clonado. Esta tecnología se describe más en profundidad en los documentos WO 93/09222, WO 91/12650, WO 91/06667, U.S. 5.272.071 y U.S. 5.641.670. Brevemente, se permite que las secuencias polinucleotídicas específicas que se corresponden con los polinucleótidos de la PGP sintasa o con secuencias próximas o distantes a un gen de la PGP sintasa se integren en el genoma de una célula huésped mediante recombinación homóloga donde la expresión del gen puede verse afectada. En una realización, se introducen secuencias reguladoras que aumentan o disminuyen la expresión de una secuencia endógena. Por consiguiente, puede producirse una proteína PGP sintasa en una células que normalmente no la produce. Alternativamente, la expresión elevada de la proteína PGP sintasa puede verse afectada en una célula que normalmente produce la proteína a un nivel específico. Adicionalmente, la expresión puede disminuir o eliminarse introduciendo una secuencia reguladora específica. La secuencia reguladora puede se heteróloga con respecto a la secuencia de la proteína PGP sintasa y puede ser una secuencia homóloga con una mutación deseada que afecta a la expresión. Alternativamente, puede delecionarse el gen completo. La secuencia reguladora puede ser específica para la célula huésped o capaz de funcionar en más de un tipo de célula. Aún más, pueden introducirse mutaciones específicas en cualquier región deseada del gen para producir proteínas PGP sintasa mutantes. Estas mutaciones podrían introducirse, por ejemplo, en las regiones funcionales específicas, tales como el sitio de unión al ligando.

En una realización, la célula huésped puede ser un ovocito fertilizado o una célula troncal embrionaria no humana que puede usarse para producir un animal transgénico que contiene el gen de la PGP sintasa alterado. Alternativamente, la célula huésped puede ser una célula troncal u otro precursor temprano de tejido que origine una subpoblación específica de células y pueden usarse para producir tejidos transgénicos en un animal. Véase también Thomas y col., Cell 51: 503 (1987) para una descripción de vectores recombinantes homólogos. El vector se introduce en una línea celular troncal embrionaria no humana (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el gen introducido se ha recombinado de forma homóloga con el gen endógeno de la PGP sintasa (véase, por ejemplo, Li, E. y col. (1992) Cell 69: 915). A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, editores (IRL, Oxford, 1987) pág. 113-152). A continuación, puede implantarse un embrión quimérico no humano en una hembra adoptiva seudopreñada adecuada y llevar a término el embrión. La progenie portadora del ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga por la transmisión a la línea germinal del transgén. Los procedimientos para construir vectores de recombinación homóloga y animales recombinantes homólogos se describen adicionalmente en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en las publicaciones internacionales PCT Nº WO 90/11354; WO 91/01140 y WO 93/04169.

Las células huésped manipuladas genéticamente pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Preferiblemente, el animal transgénico es un mamífero, por ejemplo, un roedor, tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Un transgén es un ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Estos animales son útiles para estudiar la función de una proteína PGP sintasa y para identificar y evaluar moduladores de la actividad de la proteína PGP sintasa.

Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos y anfibios.

En una realización, una célula huésped es un ovocito fertilizado o una célula troncal embrionaria no humana en la cual se han introducido las secuencias polinucleotídicas de la PGP sintasa.

Un animal transgénico puede producirse introduciendo un ácido nucleico en el pronúcleo masculino de un ovocito fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el ovocito se desarrolle en una hembra adoptiva seudopreñada. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la PGP sintasa puede introducirse como un transgén en el genoma de un animal no humano, tal como un ratón.

Cualquiera de las secuencias reguladoras u otras secuencias útiles en los vectores de expresión pueden formar parte de la secuencia transgénica. Esto incluye secuencias intrónicas y señales de poliadenilación, si todavía no se han incluido. Puede unirse de forma operativa al transgén una secuencia o secuencias reguladoras específicas de tejido para la expresión directa de la proteína PGP sintasa en células en particular.

Los procedimientos para la generación de animales transgénicos por medio de manipulación y microinyección del embrión, especialmente en animales como ratones, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder y col., Patente de EE.UU. Nº 4.873.191 de Wagner y col. y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). Se usan procedimientos similares para la producción de otros animales transgénicos. Un animal transgénico fundador puede identificarse en base a la presencia del transgén en su genoma y/o a la expresión del ARNm transgénico en los tejidos o células de los animales. A continuación, puede usarse un animal fundador para criar animales adicionales portadores del transgén. Además, los animales transgénicos portadores de un transgén puede cruzarse adicionalmente con otros animales transgénicos portadores de otros transgenes. Un animal transgénico también incluye animales en los que el animal completo, o los tejidos del animal se han producido usando las células huésped recombinantes de forma homóloga descritas en este documento.

En otra realización, pueden producirse animales transgénicos no humanos que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de este sistema es el sistema de la recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema de la recombinasa cre/loxP, véase, por ejemplo, Lakso y col. (1992) PNAS 89: 6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de la recombinasa FLP de S. cerevisiae (O'Gorman y col. (1991) Science 252:1351-1355. Si se usa el sistema de la recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgén, se requieren animales que contenga transgenes que codifiquen tanto la recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Estos animales pueden obtenerse mediante la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales transgénicos, uno que contenga un transgén que codifique una proteína seleccionada y el otro que contenga un transgén que codifique una recombinasa.

También pueden producirse clones de los animales transgénicos no humanos descritos en este documento, según los procedimientos descritos en Wilmut y col. (1997) Nature 385: 810-813 y en las publicaciones internacionales PCT Nº WO 97/07668 y WO 97/07669. Brevemente, puede aislarse una célula, por ejemplo, una célula somática, a partir de un animal transgénico e inducir su salida del ciclo de crecimiento y su entrada en la fase Go. A continuación, la célula en reposo se fusiona, por ejemplo, a través del uso de pulsos eléctricos, con un ovocito enucleado de un animal de la misma especie del que se ha aislado la célula en reposo. El ovocito reconstruido se cultiva a continuación de modo que se desarrolle a mórula o blastocisto y se transfiere luego a una hembra adoptiva seudopreñada. La descendencia nacida de esta hembra adoptiva será un clon del animal del cual se aísla la célula, por ejemplo, la célula
somática.

Los animales transgénicos que contienen células recombinantes que expresan los polipéptidos descritos en este documento, son útiles para realizar los ensayos descritos en este documento en un contexto in vivo. Por consiguiente, los diversos factores fisiológicos que se presentan in vivo y que podrían afectar a la unión al sustrato pueden no ser evidentes a partir de los ensayos in vitro libres de células o basados en células. Por tanto, es útil proporcionar animales transgénicos no humanos para analizar in vivo la función de la PGP sintasa, incluyendo interacciones con el sustrato, cofactor y transferencia del grupo fosfato sustituido. Podrían usarse procedimientos similares para determinar el efecto de un mutante específico de la PGP sintasa y el efecto de una PGP sintasa quimérica en estas funciones de la enzima. También es posible evaluar el efecto de mutaciones completas, que son mutaciones que eliminan sustancial o completamente una o más funciones de la PGP sintasa.

En general, los procedimientos para producir animales transgénicos incluyen introducir una secuencia de ácido nucleico según la presente invención, la secuencia de ácido nucleico capaz de expresar la proteína PGP sintasa en un animal transgénico, en una célula en cultivo o in vivo. Cuando se introduce in vivo, el ácido nucleico se introduce en un organismo intacto, tal como en uno o más tipos de células y, por tanto, uno o más tipos de tejidos expresan el ácido nucleico que codifica la proteína PGP sintasa. Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse en prácticamente todas las células de un organismo transfectando una célula en cultivo, tal como una célula troncal embrionaria no humana como se describe en este documento, para la producción de animales transgénicos y esta célula puede usarse para producir un organismo transgénico completo. Como se describe, en una realización adicional, la célula huésped puede ser un ovocito fertilizado. A continuación, se permite que estas células desarrollen el organismo transgénico en una hembra adoptiva.

Composiciones farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos y moduladores del polipéptido y de los anticuerpos de la PGP sintasa (también denominados en este documento como "compuestos activos") puede incorporarse a composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto, por ejemplo, un humano. Estas composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína, modulador o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "administrar" se usa es su sentido más amplio e incluye cualquier procedimientos para introducir las composiciones de la presente invención en un sujeto. Esto incluye producir polipéptidos o polinucleótidos in vivo mediante, por ejemplo, transcripción o traducción, in vivo, de polinucleótidos que se han introducido de forma exógena en un sujeto. De este modo, se incluyen en el término "administrar" los polipéptidos o ácidos nucleicos producidos en el sujeto a partir de las composiciones exógenas.

Según se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente sea incompatible con el compuesto activo, estos medios pueden usarse en las composiciones de la invención. También pueden incorporarse a las composiciones compuestos activos suplementarios.

Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con la vía de administración deseada. Los ejemplos de vías de administración incluyen la vía parenteral, por ejemplo, administración por vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un disolvente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilénglicoles, glicerina, propilénglicol y otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol de bencilo o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes, tales como ácido etilenaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para ajustar la tonicidad, tal como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple hechos de vidrio o de
plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debería estar estéril o debe ser fluida en tal grado que pueda cargarse fácilmente en una jeringa. Debería ser estable en las afecciones de fabricación y conservación, y debería protegerse de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contengan, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilénglicol y polietilénglicol líquido y similares) y mezclas adecuados de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como la lecitina, manteniendo el tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una proteína PGP sintasa o un anticuerpo anti-PGP sintasa) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según la necesidad, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son la desecación al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente esterilizada por filtración de la mis-
ma.

Las composiciones por vía oral, generalmente incluyen un disolvente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar incluidas en cápsulas de gelatina o estar comprimidas en comprimidos. Para la administración por vía oral, el agente puede estar contenido en formas entéricas para resistir en el estómago o estar recubierto o mezclado adicionalmente para liberarse en una región del tracto GI en particular, mediante procedimientos conocidos. Con el fin de la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo líquido para su uso como colutorio, en el que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral, se agita y escupe o traga. Como parte de la composición, también pueden incluirse agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, plastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa; un agente de desintegración, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina o un agente aromatizante, tal como menta piperita, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizado aerosol desde un recipiente o distribuidor presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que se quiere atravesar Generalmente, estos agentes penetrantes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograse mediante el uso de pulverizadores nasales o de supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, pomadas balsámicas, geles o cremas, generalmente conocidos en la técnica.

Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases para supositorio convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración por vía rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto de una rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo sistemas de implantes y de administración microencapsulada. Pueden usarse polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como acetato de etilénvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de estas formulaciones serán aparentes para un experto en la materia. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones de liposomas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales frente a antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. Nº 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para una fácil administración y una uniformidad de dosificación. Una "forma de dosificación unitaria", según se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adaptadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para que produzca el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La memoria descriptiva sobre las formas de dosificación unitarias de la invención está dictada y depende directamente de las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico en particular que se desea lograr y de las limitaciones inherentes en la técnica de composición de este compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en vectores y usarse como vectores para terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (documento U.S. 5.328.470), o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen y col. (1994) PNAS 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un disolvente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual esté incluido el vehículo de administración del gen. Alternativamente, cuando el vector de administración del gen completo pueda producirse intacto a partir de las células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de liberación del gen.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o distribuidor junto con las instrucciones para su administración.

Como se define en este documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (es decir, una dosis eficaz) oscila de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/kg, de 4 a 7 mg/kg o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal.

El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir sobre la dosis requerida para tratar de forma eficaz a un sujeto, incluyendo pero sin limitaciones, la gravedad de la enfermedad o del trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con un anticuerpo, proteína o polipéptido en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente durante 2 a 8 semanas, más preferiblemente durante aproximadamente 3 a 7 semanas e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. También se apreciará que la dosis eficaz de anticuerpo, proteína o polipéptido usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el curso de un tratamiento en particular. Los cambios en la dosis pueden resultar y ser aparentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en este documento.

Se describen agentes que modulan la expresión o actividad. Un agente puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña. Por ejemplo, estas moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitaciones, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, que incluyen compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de estos compuestos.

Se entiende que la dosis apropiada de los agentes de molécula pequeña depende de varios factores conocidos por el médico, veterinario o investigador experto. La dosis o las dosis de la molécula pequeña variará, por ejemplo, dependiendo de la identidad, tamaño y estado del sujeto o muestra que se está tratando, dependiendo adicionalmente de la vía por la cual la composición se administra, si es aplicable, y el efecto que el médico desea que la molécula pequeña tenga sobre el ácido nucleico o el polipéptido de la invención. Los ejemplos de dosis incluyen cantidades en miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de peso del sujeto o de la muestra (por ejemplo, de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente de 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o aproximadamente de 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo). Además se entiende que las dosis apropiadas de una molécula pequeña dependen de la potencia de la molécula pequeña con respecto a la expresión o actividad que se va a modular. Estas dosis apropiadas pueden determinarse usando los ensayos descritos en este documento. Cuando una o más de estas moléculas pequeñas se van a administrar a un animal (por ejemplo, un humano) para modular la expresión o actividad de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, un médico, veterinario o investigador puede, por ejemplo, prescribir inicialmente una dosis relativamente baja, aumentando posteriormente la dosis hasta que se obtengan una respuesta apropiada. Además, se entiende que el nivel de dosis específica de cualquier sujeto animal en particular dependerá de diversos factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, salud general, género y dieta del sujeto, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción, cualquier combinación de fármacos y el grado de expresión o actividad que se va a modular.

Otras realizaciones

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para analizar una variedad de sondas de captura. El procedimiento puede usarse, por ejemplo, para analizar la expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz bidimensional con una variedad de direcciones, cada una de ellas distinguibles por su posición de las demás direcciones de la variedad y teniendo cada dirección una única sonda de captura por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o peptídico; poner en contacto la matriz con un ácido nucleico, preferiblemente purificado, un polipéptido, preferiblemente purificado, o un anticuerpo, preferiblemente purificado de 27411 y evaluar, de este modo, la variedad de sondas de captura. La unión por hibridación, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, con una sonda de captura en una dirección de la variedad se detecta, por ejemplo, mediante una señal generada a partir de un marcador unido al ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 27411.

Las sondas de captura pueden ser un conjunto de ácidos nucleicos de una muestra seleccionada, por ejemplo, una muestra de ácidos nucleicos a partir de un control o de un tejido o célula no estimulada.

El procedimiento puede incluir poner en contacto el ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 27411 con una primera matriz que tenga una variedad de sondas de captura y una segunda matriz que tenga una variedad diferente de sondas de captura. Los resultados de cada hibridación pueden compararse, por ejemplo, para analizar diferencias en la expresión entre una primera o una segunda muestra. La primera variedad de sondas de captura puede ser de una muestra control, por ejemplo, una muestra de tipo silvestre, normal o no procedente de enfermedad ni estimulada, por ejemplo, una muestra de fluido biológico, tejido o célula. La segunda variedad de sondas de captura puede ser de una muestra experimental, por ejemplo, una muestra de tipo mutante, en riesgo, con una enfermedad o trastorno, o estimulada, por ejemplo, una muestra de fluido biológico, tejido o célula.

La variedad de sondas de captura puede ser una variedad de sondas de ácido nucleico, cada una de las cuales hibrida específicamente con un alelo de 27411. Estos procedimientos pueden usarse para diagnosticar a un sujeto, por ejemplo, para evaluar el riesgo a una enfermedad o trastorno, para evaluar lo apropiado de un tratamiento seleccionado para un sujeto, para evaluar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno. 27411 está asociada con la actividad PGP sintasa, por tanto, es útil para los trastornos asociados con una actividad de PGP sintasa, biosíntesis de cardiolipina y biosíntesis de PG anómalos.

El procedimiento puede usarse para detectar los SNP.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para analizar una variedad de sondas. El procedimiento es útil, por ejemplo, para analizar la expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz bidimensional con una variedad de direcciones, cada una de ellas distinguible por su posición de las demás direcciones de la variedad con una única sonda de captura, por ejemplo, en el que las sondas de captura son de una célula o sujeto que expresa o lo hace de forma anómala, 27411 o de una célula o sujeto en el que se ha obtenido una respuesta mediada por 27411, por ejemplo, mediante el contacto de la célula con el ácido nucleico o proteína 27411, o administrando a la célula o al sujeto un ácido nucleico o proteína 27411; poner en contacto la matriz con una o más sondas problema, en el que una sonda problema puede ser un ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo (que preferiblemente es distinta del ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo 27411); proporcionar una matriz bidimensional que tenga una variedad de direcciones, cada una de ellas distinguible por su posición de las demás dirección de la variedad y teniendo cada dirección de la variedad una única sonda de captura, por ejemplo, en el que las sondas de captura son de una célula o sujeto que no expresa 27411 (o no se expresa tanto como en el caso de la variedad positiva para 27411 de las sondas de captura) o de una célula o sujeto en el que no se ha producido una respuesta mediada por 27411 (o se ha producido en un grado menor que en la primera muestra); poner en contacto la matriz con una o más de las sondas problema (que preferiblemente es distinta del ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 27411) y, de este modo, evaluar la variedad de sondas de captura. La unión por hibridación, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, con una sonda de captura en una dirección de la variedad se detecta, por ejemplo, mediante una señal generada a partir de un marcador unido al ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 27411.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para analizar 27411, por ejemplo, analizar la estructura, función o relación con otras secuencias de ácido nucleico o aminoácidos. El procedimiento incluye: proporcionar una secuencia de ácido nucleico o aminoácido 27411; comparar la secuencia de 27411 preferiblemente con una o más de una variedad de secuencias de una colección de secuencias, por ejemplo, una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, para analizar de este modo 27411.

Las bases de datos preferidos incluyen GenBank^{TM}. El procedimiento puede incluir la evaluación de la identidad de secuencia entre una secuencia de 27411 y una secuencia de la base de datos. El procedimiento puede realizarse mediante el acceso a la base de datos en un segundo sitio, por ejemplo, en internet.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjunto de oligonucleótidos, útiles, por ejemplo, para identificar SNP o para identificar alelos específicos de 27411. El conjunto incluye una variedad de oligonucleótidos, cada uno de los cuales tiene un nucleótido diferente a una posición de interrogación, por ejemplo, un SNP o el sitio de una mutación. En una realización preferida, los oligonucleótidos de la variedad tienen una secuencia idéntica a otro (excepto por sus diferencias en longitud). Los oligonucleótidos pueden proporcionarse con diferentes marcadores, tales como un oligonucleótido que hibrida con uno alelo que proporciona una señal que es distinguible de un oligonucleótido que hibrida con un segundo alelo.

Procedimiento experimental Ejemplo 1 Identificación y caracterización de 27411, una PGP sintasa humana

La secuencia de la 27411 humana (Figura 1; ID SEC Nº 1), que tiene una longitud aproximada de 2.686 nucleótidos, incluyendo las regiones no traducidas, contiene una secuencia codificadora predicha que empieza con metionina de aproximadamente 1.671 nucleótidos (nucleótidos 315-1.985 de la ID SEC Nº 1; ID SEC Nº 3). La secuencia codificadora codifica una proteína de 556 aminoácidos (ID SEC Nº 2).

El análisis de PFAM indica que el polipéptido 27411 comparte un elevado grado de similitud de secuencia con los dominios de la fosfolipasa D de los aminoácidos 215-241 y 460-493 de la ID SEC Nº 2. Al dominio de la fosfolipasa D (HMM) se le ha asignado el número de registro PF00614 (http://pfam.wustl.edu/). Para información general con respecto a los identificadores PFAM, números de identificación del dominio prefijo PS y prefijo PF, consultar a Sonhammer y col. (1997) Protein 28:405-420 y http://www.psc.edu/general/software/packages/pfam/pfam.html.

En una realización, una proteína similar a 27411 incluye al menos un dominio transmembranal. Según se usa en este documento, la expresión "dominio transmembranal" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud que atraviesa la membrana fosfolipídica. Más preferiblemente, un dominio transmembranal incluye aproximadamente al menos 18, 20, 22, 24, 26 ó 27 restos de aminoácidos y atraviesa la membrana fosfolipídica. Los dominios transmembranales son ricos en restos hidrófobos y, típicamente, tienen una estructura de \alpha-hélice. En una realización preferida, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembranal es hidrófobo, por ejemplo, leucinas, isoleucinas, tirosina o triptófanos. Los dominios transmembranales se describen, por ejemplo, en http://pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc?name=7tm-1 y en Zagotta W. N. y col (1996) Annual Rev. Neuronsci. 19:235-63, cuyo contenido se incorpora a este documento por referencia.

En una realización preferida, un polipéptido o proteína similar a 27411 tiene al menos un dominio transmembranal o una región que incluye al menos 18, 20, 22, 24, 25, 26 ó 27 restos de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó 100% de identidad de secuencia con un "dominio transmembranal", por ejemplo, al menos un dominio transmembranal similar al de 27411 humano (por ejemplo, restos de aminoácidos 51 a 73 ó 469 a 485 de ID SEC Nº 2).

En otra realización, una proteína similar a 27411 incluye al menos un "dominio no transmembranal". Según se usa en este documento, los "dominios no transmembranales" son dominios que están fuera de la membrana. Cuando se hace referencia a membranas plasmáticas, los dominios no transmembranales incluyen dominios extracelulares (es decir, fuera de la célula) y dominios intracelulares (es decir, dentro de la célula). Cuando se hace referencia a proteínas unidas a membranas encontrada en orgánulos intracelulares (por ejemplo, mitocondria, retículo endoplásmico, peroxisomas y microsomas), los dominios no transmembranales incluyen aquellos dominios de la proteína que están en el citosol (es decir, el citoplasma), la luz de los orgánulos o la matriz o el espacio intermembranal (los dos últimos relacionados específicamente con los orgánulos mitocondriales). En una proteína similar a 27411 o similar a 27411 natural, el resto aminoacídico C-terminal de un dominio no transmembranal está adyacente a un resto aminoacídico N-terminal de un dominio transmembranal.

En una realización preferida, un polipéptido o proteína similar a 27411 tiene un "dominio no transmembranal" o una región que incluyen al menos los restos de aminoácidos 1-396, preferiblemente aproximadamente los restos 100-396, más preferiblemente aproximadamente los restos 200-350 e incluso más preferiblemente aproximadamente los restos 240-280 y tiene al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó 100% de identidad de secuencia con un "dominio no transmembranal", por ejemplo, un dominio no transmembranal similar al de la 27411 humana (por ejemplo, restos 1 a 51, 74 a 468, y 486 a 556 de la ID SEC Nº 2). Preferiblemente, un domino no transmembranal es capaz de tener actividad catalítica (por ejemplo, PGP sintasa).

Un dominio no transmembranal localizado en el extremo N-terminal de una proteína o polipéptido similar a 27411 se denomina en este documento "dominio N-terminal no transmembranal". Según se usa en este documento, un "dominio N-terminal no transmembranal" incluye una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 1-51, preferiblemente aproximadamente 10-45, más preferiblemente aproximadamente 20-40, o incluso más preferiblemente aproximadamente 20-35 restos de aminoácidos y se localiza fuera de los limites de la membrana. Por ejemplo, un dominio N-terminal no transmembranal se localiza de aproximadamente 1 a 50 restos de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

De forma similar, un domino no transmembranal localizado en el extremo C-terminal de una proteína o polipéptido similar a 27411 se denomina en este documento "dominio C-terminal no transmembranal". Según se usa en este documento, un "dominio C-terminal no transmembranal" incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de aproximadamente 1-71, preferiblemente aproximadamente 10-75, preferiblemente 20-60, más preferiblemente aproximadamente 25-45 restos de aminoácidos y se localiza fuera de los límites de la membrana. Por ejemplo, un dominio N-terminal no transmembranal se localiza aproximadamente en los restos de aminoácidos 486 a 556 de la ID SEC Nº 2.

Una molécula similar a 27411 puede incluir además una secuencia señal. Según se usa en este documento, una "secuencia señal" se refiere a un péptido de aproximadamente 20-80 restos de aminoácidos de longitud que aparece en el extremo N-terminal de proteínas secretoras e integrales de membrana y que contiene una mayoría de restos de aminoácidos hidrófobos. Por ejemplo, una secuencia señal contiene al menos aproximadamente de 12-25 restos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 30-70 restos de aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 68 restos de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente del 40-70%, más preferiblemente de aproximadamente el 50-65% y más preferiblemente de aproximadamente el 55-60% de restos de aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilanalina, tirosina, triptófano o prolina). Esta "secuencia señal" también se refiere en la técnica como "péptido señal", sirve para dirigir una proteína que contiene esta secuencia a una bicapa lipídica. Por ejemplo, en una realización, una proteína similar a 27411 contiene una secuencia señal de aproximadamente 1 a 68 aminoácidos de la ID SEC Nº 2. La "secuencia señal" puede escindirse durante el procesamiento de la pro-
teína madura. La proteína similar a 27411 madura se corresponde con los aminoácidos 69 a 556 de la ID SEC Nº 2.

La proteína 27411 muestra aproximadamente el 26% de identidad con los aminoácidos 88-522 de una secuencia consenso ProDom encontrada en la biosíntesis de fosfolípidos por la O-fosfatidiltransferasa CDP-diacilglicerol serina fosfatidilserina sintasa transferasa; aproximadamente el 31% de identidad de los aminoácidos 476-554 con una secuencia consenso ProDom encontrada en la proteína que interacciona con el receptor nuclear correpresor de N-cro retinoide X; aproximadamente el 31% de identidad con los aminoácidos 260-324 de una secuencia consenso ProDom encontrada en la fosforilación de la proteína SIP1 y aproximadamente el 38% de identidad de los aminoácidos 210-247 con una secuencia consenso ProDom encontrada en la proteína transferasa HPO19 transmembranal región intergénica CSGC-MDOG. Estas secuencias se identificaron mediante el programa ProDom, que está disponible en la INRA, GREC (107/94), MESR (ACC-SV13), la "iniciativa genoma" del CNRS y la Unión Europea. El programa ProDom (http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) permite analizar el reordenamiento de dominios en proteínas y familias de proteínas. Una descripción detallada del análisis ProDom puede encontrarse en Corpet y col. (1999) Nuc. Acids Res. 27: 263-267.

Ejemplo 2 Distribución tisular del ARNm de 27411

Los niveles de expresión de 27411 en diversos tejidos y tipos celulares se determinan mediante RT-PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa; Taqman®, nombre comercial del kit de PCR, Applied Biosystems). Las reacciones de la RT-PCR cuantitativa se realizaron según las instrucciones del fabricante incluidas en el kit. Los resultados del análisis por Taqman® se muestran en la Figura 5.

El análisis por Taqman de 27411 reveló la expresión en varios tejidos, incluyendo los siguientes: arteria, arteria enferma, vena, células del músculo liso coronario, HUVEC (células endoteliales de la vena del cordón umbilical), hemangioma, corazón, corazón con insuficiencia cardiaca congestiva, riñón, músculo esquelético, adiposo, páncreas, osteoblastos primarios, osteoclastos diferenciados, piel, médula espinal, córtex cerebral, hipotálamo cerebral, nervio, ganglio de la raíz dorsal, mama, tumor de mama, ovario, tumor ovárico, próstata, tumor de próstata, glándulas salivares, colon, tumor de colon, pulmón, tumor de pulmón, pulmón con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colon con enfermedad inflamatoria intestinal, hígado, fibrosis hepática, bazo, amígdala, ganglio linfático, intestino delgado, macrófagos, sinovio, células mononucleares de la médula ósea, células mononucleares activadas de sangre periférica neutrófilos, megacariocitos y tejido eritroide.

Las hibridaciones por transferencia de ARN total con varias muestras de ARN se realizaron en afecciones convencionales y se lavaron en afecciones rigurosas, es decir, SSC x0,2 a 65ºC. Puede usarse una sonda de ADN correspondiente a todo o a una porción del ADNc de 27411 (ID SEC Nº 1). El ADN se marcó radiactivamente con ^{32}P-dCTP usando el kit Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del proveedor. Los filtros que contenían el ARNm de tejidos hematopoyéticos y endocrinos de ratón y las líneas celulares de cáncer (Clontech, Palo Alto, CA) se incubaron con sonda en solución de hibridación ExpressHyb (Clontech) y se lavaron en afecciones de alta rigurosidad según las recomendaciones del fabricante.

Ejemplo 3 Expresión recombinante de 27411 en células bacterianas

En este ejemplo, la 27411 se expresa como un polipéptido de fusión recombinante con la glutatión-S-transferasa (GST) en E. coli y el polipéptido de fusión se aísla y caracteriza. Especialmente, 27411 se fusiona a GST y este polipéptido de fusión se expresa en E. coli, por ejemplo, la cepa PEB199. La expresión de la proteína de fusión GST-27411 en PEB199 se induce con IPTG. El polipéptido de fusión recombinante se purifica de los lisados bacterianos en bruto de la cepa PEB199 inducida mediante cromatografía de afinidad en perlas de glutatión. Usando análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado de los lisados bacteriano, se determina el peso molecular del polipéptido de fusión resultante.

Ejemplo 4 Expresión de la proteína recombinante 27411 en células COS

Para expresar el gen 27411 en células COS, se usó el vector pcDNA/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de resistencia a ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor de CMV seguido de una región polienlazadora y un intrón SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica la proteína 27411 completa y una etiqueta HA (Wilson y col. (1984) Cell 37:767) o una etiqueta FLAG fusionada en fase con el extremo 3' del fragmento se clona en la región polienlazadora del vector, situando de este modo la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor de CMV.

Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia del ADN de 27411 mediante PCR usando dos cebadores. El cebador 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido de aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia codificadora 27411 empezando a partir del codón de inicio; la secuencia 3' terminal contiene secuencias complementarias al otro sitio de restricción de interés, un codón de parada de la traducción, la etiqueta HA o la etiqueta FLAG y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificadora 27411. El fragmento amplificado por PCR y el vector pcDNA/Amp se digirieron con las enzimas de restricción apropiada y el vector se desfosforila usando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos sitios de restricción elegidos eran diferentes para que el gen 27411 se inserte en la orientación correcta. La mezcla de ligamiento se transforma en células de E. coli (pueden usarse las cepas HB101, DH5\alpha y SURE de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se pone en placas sobre medios con ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aísla de los transformantes y la presencia del fragmento correcto se examina mediante análisis de restricción.

Las células COS se transfectan posteriormente con el ADN del plásmido 27411-pcDNA/Amp usando los procedimientos de coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Otros procedimientos adecuados para la transfección de células huésped pueden encontrarse en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2º edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La expresión del polipéptido 27411 se detecta mediante radiomarcaje (puede usarse ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína disponibles en NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) usando un anticuerpo monoclonal específico de HA. Brevemente, las células se marcan durante 8 horas con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). A continuación, se recogen los medios de cultivo y las células se lisan usando detergentes (tampón RIPA, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo específico de HA. A continuación, los polipéptidos precipitados se analizan mediante SDS-PAGE.

Alternativamente, el ADN que contenía la secuencia codificadora de 27411 se clona directamente en el polienlazador del vector pcDNA/Amp usando los sitios de restricción apropiados. El plásmido resultante se transfecta a células COS de la forma descrita anteriormente y la expresión del polipéptido 27411 se detecta mediante radiomarcaje e inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal específico de 27411.

<110> Meyers, Rachel

\vskip0.400000\baselineskip

<120> 27411, Una nueva PGP sintasa humana

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 35800/209381

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, Version 4.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2.686

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ...(2.686)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

2

3

4

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 556

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) … (1.671)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Meyers, Rachel

\vskip0.400000\baselineskip

<120> 27411, Una nueva PGP sintasa humana

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 35800/209381

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US01/06501

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 02-28-2001

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/185.517

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 02-28-2001

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, Version 4.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2.686

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (315) … (1.985)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ...(2.686)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15, 39, 65, 66, 69, 102, 109, 111, 148, 152, 176, 185, 208, 223, 268

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

11

12

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 556

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) … (1.671)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

17

18

19

Claims (25)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre el grupo constituido por:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 90% idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o a las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa.

b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 450 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o a las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa

c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340;

d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en la que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 2 o de las secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa y

e) una molécula de ácido nucleico que comprende la molécula complementaria completa de a), b), c) o d).

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo constituido por:

a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, o una complementaria de las mismas; y

b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos codificadas por las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, o una complementaria de las mismas.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que adicionalmente comprende secuencias de vectores de ácido nucleico.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que adicionalmente comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

6. La célula huésped de la reivindicación 5 que es una célula huésped de mamíferos.

7. La célula huésped de la reivindicación 5 que es una célula huésped de mamíferos no humano que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

8. Un polipéptido aislado seleccionado entre el grupo constituido por:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340;

b) un polipéptido biológicamente activo que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a la longitud completa de un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 o las secuencias de nucleótidos de las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa;

c) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patente PTA-2011 o PTA-2340, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa y

d) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, en el que el polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa.

9. El polipéptido aislado de la reivindicación 8 que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

10. El polipéptido de la reivindicación 8 que adicionalmente comprende secuencias de aminoácidos heterólogas.

11. Un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido seleccionado entre el grupo de polipéptidos compuesto por:

(a)

el polipéptido de la reivindicación 8 y

(b)

el polipéptido de la reivindicación 9;

en el que dicho anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina o una porción de una molécula de inmunoglobulina.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11 que se selecciona entre el grupo constituido por:

(a)

anticuerpos policlonales;

(b)

anticuerpos monoclonales;

(c)

fragmentos F(ab);

(d)

fragmentos F(ab')_{2}.

13. El anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12 que se selecciona entre el grupo constituido por:

(a)

anticuerpos humanos;

(b)

anticuerpos humanizados;

(c)

anticuerpos quiméricos.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que se conjuga con una sustancia detectable.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14 en el que la sustancia detectable se selecciona entre el grupo constituido por:

(a)

enzimas;

(b)

grupos prostéticos;

(c)

materiales fluorescentes;

(d)

materiales luminiscentes;

(e)

materiales bioluminiscentes;

(f)

materiales radiactivos.

16. Un procedimiento para producir un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, o las secuencias que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340;

b) un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2011 o PTA-2340, en el que fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 2 o las secuencias de aminoácidos que codifican las inserciones de ADNc de los plásmidos depositados en la ATCC con los números de depósito de patentes PTA-2001 o PTA-2340, en el que polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfato sintasa y

c) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, en el que dicho polipéptido tiene actividad fosfatidilglicerolfosfatasa sintasa;

que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 5 en afecciones en las que el polipéptido se expresa.

17. Un procedimiento para detectar in vitro la presencia de un polipéptido de la reivindicación 8 en una muestra, que comprende:

a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la reivindicación 8 y

b) determinar si el anticuerpo se une al polipéptido en la muestra.

18. Un kit que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la reivindicación 8.

19. Un procedimiento para detectar in vitro la presencia de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una muestra, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la muestra con una sonda o cebador de ácido nucleico que hibrida selectivamente con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 y

b) determinar si la sonda o cebador del ácido nucleico se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico.

21. Un kit que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1

22. Un procedimiento para identificar in vitro un compuesto que se une a un polipéptido de la reivindicación 8 que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un polipéptido de la reivindicación 8 o una célula que expresa un polipéptido de la reivindicación 8 con un compuesto de ensayo y

b) determinar si el polipéptido se une al compuesto de ensayo.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la unión del compuesto de ensayo al polipéptido se detecta mediante un procedimiento seleccionado entre:

a) detección de la unión mediante detección directa de la unión compuesto de ensayo/polipéptido;

b) detección de la unión usando un ensayo de unión competitivo;

c) detección de la unión usando un ensayo para la transferencia del grupo fosfato mediada por la PGP sintasa.

24. Un polipéptido como se define en la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento de tratamiento terapéutico del organismo humano o animal.

25. Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad PGP sintasa de un polipéptido de la reivindicación 8, que comprende:

a) poner en contacto un polipéptido de la reivindicación 8 con un compuesto de ensayo y

b) determinar el efecto del compuesto de ensayo en la actividad PGP sintasa del polipéptido para identificar, de ese modo, un compuesto que modula la actividad PGP sintasa del polipéptido.