ES2292182T3

ES2292182T3 - Compuestos heterociclicos y su empleo en la deteccion de acidos nuclecicos.

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Publication number: ES2292182T3
Application number: ES97909251T
Authority: ES
Inventors: Klaus Muhlegger; Herbert Von Der Eltz
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: JP2001502665A; US6403786B1; US6875859B2; US20050222056A1; EP0927180B1; DE19637042A1; US20020099202A1; WO1998011104A1; EP0927180A1; JP4281976B2; CA2265727A1; US8013147B2; ATE369360T1; DE59712871D1

Abstract

LA INVENCION TRATA DE COMPUESTOS DE FORMULA GENERAL (I), SIENDO LOS RADICALES R 1 HASTA R 7 LOS SIGNIFICADOS INDICADOS EN LA SOLICITUD, ASI COMO PROCEDIMIENTOS PARA SU PREPARACION. LOS COMPUESTOS SON EN PARTICULAR APROPIADOS COMO SUSTRATOS PARA POLIMERASAS DE RNA O DE DNA, Y POR TANTO SE PUEDEN INTRODUCIR EN LOS OLIGONUCLEOTIDOS DE RNA O DE DNA, Y SON APROPIADOS EN PARTICULAR PARA EL MARCADO Y PARA LA DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS O PARA LA SECUENCIACION DE DNA.

Description

Compuestos heterocíclicos y su empleo en la detección de ácidos nucleicos.

La invención se refiere a compuestos heterocíclicos, que pueden emplearse para el marcado, detección y secuenciación de ácidos nucleicos.

Los ácidos nucleicos tienen como portador o respectivamente, como transmisor de la información genética, una importancia capital en la Naturaleza viviente. Por este motivo, desde su descubrimiento por F. Miescher, han despertado el más amplio interés de las Ciencias Naturales y han conducido al esclarecimiento de su función, estructura y forma de actuar.

Una herramienta esencial para el esclarecimiento de estas relaciones y la solución de los problemas ha sido y es la detección de los ácidos nucleicos, tanto lo que hace referencia a su detección específica como también a su secuencia, a saber, su estructura primaria.

La detectabilidad específica de los ácidos nucleicos se basa en la propiedad de estas moléculas de entrar en reciprocidad con otros ácidos nucleicos mediante la formación de pares de bases unidos mediante puentes de hidrógeno, para "hibridar". De manera adecuada, pueden emplearse ácidos nucleicos marcados, es decir, provistos de grupos indicadores ("sondas"), para la detección de ácidos nucleicos complementarios ("diana").

La determinación de la estructura primaria ("secuencia"), a saber la sucesión de bases heterocíclicas de un ácido nucleico tiene lugar mediante la técnica de "secuenciación". Este conocimiento de la secuencia es de nuevo la condición fundamental para el empleo selectivo y específico de los ácidos nucleicos en el planteamiento de cuestiones de biología molecular y técnicas de trabajo. La secuenciación se sirve finalmente también del principio de la hibridación específica de los ácidos nucleicos entre sí. A este respecto, se emplean también, como se ha dicho más arriba, fragmentos de ácidos nucleicos marcados.

El adecuado marcado de los ácidos nucleicos es también una condición indispensable de cualquier método de detección.

Desde hace tiempo se ha empleado para ello ante todo el marcado radiactivo con isótopos apropiados, como el P^{32} ó el S^{35}. Los inconvenientes del empleo de reactivos radiactivos son claramente evidentes: los trabajos correspondientes necesitan instalaciones especiales espaciosas, autorizaciones especiales, así como una evacuación controlada y costosa de los residuos radiactivos. Los reactivos para el marcado radiactivo son caros. Un almacenamiento largo en el tiempo, de esta clase de sondas marcadas no es posible a causa del corto tiempo de media reacción de los anteriores núclidos.

Por estos motivos no han faltado en estos últimos años ensayos para solventar estas desventajas, es decir, prescindir de un marcado radiactivo. A este respecto debe mantenerse al máximo posible la alta sensibilidad de este tipo de marcado.

Se han logrado efectivamente grandes progresos [véase p. ej., "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules" ("Marcado no radiactivo y detección de biomoléculas") Kessler, C., Hrsg.), editorial Springer, Berlin, Heidelberg 1992].

Una condición indispensable de toda detección de un ácido nucleico es el propio marcado previo. Como se ha indicado más arriba es deseable que esto se logre de manera no radiactiva. Durante el marcado radiactivo de los ácidos nucleicos por regla general tiene lugar mediante la construcción enzimáticamente catalizada del correspondiente nucleósidotrifosfato radiactivo, un marcado no radiactivo se logra mediante la inserción de una señal adecuada o grupo informador.

Como moléculas indicadoras no radiactivas se han acreditado entre otros, principalmente los haptenos (como la biotina o la digoxigenina), enzimas (como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa) o colorantes de fluorescencia (como la fluoresceína o la rodamina). Estos grupos señalizadores pueden aplicarse por distintos métodos a ó en los ácidos nucleicos.

Un procedimiento relativamente sencillo es p. ej., el marcado en el extremo 5' de un oligonucleótido provisto de una función amino en el extremo, mediante una molécula activada de indicador del tipo indicado más arriba. Sin embargo, esto permite solamente la introducción de una o pocas moléculas indicadoras en un oligómero de bajo peso molecular, mientras que un marcado más denso de ácidos nucleicos de alto peso molecular de cadena larga con el objetivo de obtener una alta sensibilidad debe lograrse por regla general mediante la introducción de nucleósido-trifosfatos provistos de grupos informadores mediante polimerasas en el sentido de una síntesis de novo.

Estos procedimientos habituales son conocidos por el experto como "nick translation" ("desplazamiento de la mella") [Rigby, P.W. et al. (1977) J. Mol. Biol.. 113, 237] y "random primed labeling" ("marcado encebado al azar") [Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1984) Anal. Biochem. 137, 266]. Otro método es el llamado reacción de la cola 3' con ayuda de la enzima "transferasa terminal" [p. ej., Schmitz, G. et al. (1991) Anal. Biochem. 192, 222].

Los nucleósido-trifosfatos empleados hasta el presente en este procedimiento son casi exclusivamente los correspondientes derivados modificados de las bases heterocíclicas de la serie adenina, guanina, citosina y timina en el desoxirribonucleótido, o respectivamente adenina, guanina, citosina y uracilo en la serie de ribonucleótidos. Estos derivados están descritos p. ej., por Langer et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6635 (1981), Mühlegger et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371, 953 (1990) y en EP 0 063 879. En este caso, los grupos constitutivos que se encuentran de forma natural en el ADN y ARN, se emplean en forma marcada, es decir, provistos de grupos señalizadores.

Las desventajas esenciales de estos N-nucleósidos residen en la sensibilidad de la unión N-glicosídica frente a condiciones de pH ácido y a la disgregación por nucleasas.

Los C-nucleósidos individuales son ya conocidos desde hace mucho tiempo (véase p. ej., Suhadolnik, R.J. en "Nucleoside Antibiótics" ("Antibióticos nucleósidos"), Wiley-Interscience, Nueva York 1970) y su empleo en el campo terapéutico (antivíricos o cancerostáticos).

Además, se describen derivados fluorescentes de C-nucleósidos y su incorporación en oligonucleótidos de ADN ó respectivamente ARN (WO 93/16094). La llamada auto fluorescencia de estos C-nucleósidos es sin embargo con respecto a la producción en cuantos, un múltiplo menor que los fluoróferos especiales como p. ej., la fluoresceína o los correspondientes derivados de rodaminas. Otra desventaja de los C-nucleósidos autofluorescentes reside en su relativamente pequeña longitud de onda de excitación y emisión. Esto tiene como consecuencia que los sistemas de detección, que se basan en estos derivados, tienen solamente una pequeña sensibilidad a la detección y por otra parte, son muy notables los efectos perturbadores espectrales de la medición por el ambiente en que se encuentran (como es el caso p. ej., de un material biológico, autofluorescencia de matrices de gel, etc).

Los nucleósidos o respectivamente derivados de nucleósidos ya conocidos presentan una serie de desventajas, las cuales actúan negativamente, en particular para la detección de ácidos nucleicos. La invención toma como base la tarea de proporcionar la detección de ácidos nucleicos con derivados de nucleósidos modificados con grupos señalizadores, que no presente ninguno de los inconvenientes mencionados, es decir, en particular, que sean particularmente estables así como a la vez enzimáticamente procesables y sean apropiados para la detección de ácidos nucleicos mediante una longitud de onda practicable.

El problema se soluciona mediante compuestos heterocíclicos de fórmula general I:

1

en la cual,

R_{1} y R_{2}, los cuales pueden ser iguales o diferentes, representan hidrógeno, oxígeno, halógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino substituido, carboxilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, arilo alquiloxilo inferior, ariloxilo, aralquilo, aralquiloxilo o un grupo informativo,

R_{3} y R_{4} representan cada uno de ellos, hidrógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo inferior, un grupo de protección o un grupo informativo,

R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o grupo amino substituido, grupo fosfórico unido por 3- ó 5- a un grupo reactivo, como p. ej., una función fosforamidita o una función H-fosfonato, un radical éster ó amida escindible, o un grupo informativo,

R_{4} y R_{5} forman juntamente, otro enlace entre el C-2' y C-3', ó una función acetal,

R_{6} representa hidrógeno o hidroxilo, grupo tio o tio substituido, amino o amino substituido,

R_{7} representa hidrógeno, un grupo mono, di o trifosfato, o los análogos alfa, beta o gamma tiosfato de estos ésteres de ácido fosfórico o un grupo de protección,

así como posibles tautómeros y sales de los mismos.

X significa metileno o metino substituido con halógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino substituido, carboxilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, arilo, alquiloxilo inferior, ariloxilo, aralquilo, aralquiloxilo o un grupo informativo, u oxígeno, y n = 0 ó 1,

Z significa nitrógeno o carbono con la condición de que cuando Z significa nitrógeno, m es cero (0), y cuando X significa metileno, metileno substituido, o metino substituido, Z no puede ser carbono, y cuando X significa oxígeno Z no puede ser nitrógeno, estando el compuesto modificado con un grupo informativo. Como grupo informativo entran en consideración aquellos grupos detectables como en particular hapteno, un fluoróforo, un grupo delator de metales, un lumíforo, un intercalador de proteína o un intercalador.

Se prefieren aquellos compuestos de fórmula general I, en los cuales la función acetal de los radicales R_{4} y R_{5} está substituida con un grupo informador. El grupo informador puede estar unido directamente o indirectamente, es decir, mediante una función de engarce. Además, estos compuestos de fórmula general I se ha acreditado como particularmente apropiados, en los cuales R_{1} puede representar oxígeno, R_{2} hidrógeno o un grupo informativo, R_{3} y R_{4}, hidrógeno, R_{5} hidroxilo, hidrógeno un grupo fosfórico reactivo de unión a 3- ó 5-, R_{6} hidrógeno y R_{7} hidrógeno, grupos mono, di y trifosfato.

Además, se prefieren los compuestos de fórmula general I, en los cuales el grupo informativo está unido mediante un llamado grupo de engarce, al anillo heterocíclico o respectivamente tetrahidrofurano. Grupos correspondientes de engarce son ya conocidos por el experto (véase p. ej., Mühlegger, K et al. (1990) Biol.. Chem. Hoppe-Seyler 371, 953-965 ó Livak, K. J. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20, 4831-4837).

Además, se prefieren los compuestos de fórmula general I, en donde R_{1} representa hidrógeno, hidroxilo, un grupo amino, un grupo amino eventualmente substituido o un grupo informador, R_{2} representa un grupo amino eventualmente substituido o un grupo informador, R_{3} representa hidrógeno, R_{4} representa hidrógeno, hidroxilo, amino o amino substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo inferior, R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio, un grupo amino eventualmente substituido, una fosforamidita o un grupo informador, R_{4} y R_{5} juntamente representan una función acetal, R_{6} representa hidrógeno y R_{7} representa una función trifosfato.

Son preferidos también, los compuestos según la fórmula I, en la cual X significa oxígeno y al mismo tiempo Z representa carbono substituido con R_{2}, ó Z significa nitrógeno y al mismo tiempo X significa metileno o metino substituido con amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informador.

Otra versión preferida son los compuestos de fórmula I, en los cuales X = 0 y Z representa metino substituido con amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informativo.

La síntesis de los compuestos según la invención puede efectuarse de diferentes maneras. En parte, puede partirse de precursores que se encuentran en la naturaleza, como por ejemplo la 3-(3,4-dihidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-pirrol-2,5-diona ó la 3-(3,4-dihidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-oxazin-2,6-diona. La síntesis de los importantes derivados del 3-(3-desoxi-4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetrahidrofuran-2-ilo) tiene lugar a partir de estos precursores mediante desoxigenación, de preferencia según Barton (Barton, D.H.R.& Motherwell, W.B. (1981) Pure Appl. Chem. 53,15).

Además, la síntesis química de los nuevos compuestos heterocíclicos, puede efectuarse como se describe por ejemplo detalladamente por K. A. Watanabe en "Chemistry of Nucleosides and Nucleotides" ("Química de los nucleósidos y nucleótidos"), 3, 421-535 (L. B. Townsend, Hrsg), imprenta Plenum, Nueva York y Londres, 1994.

Otras síntesis de los llamados compuestos de partida han sido descritas por ejemplo por Hosmane, R y S. et al. en Bioorg. & Med. Chem. Lett. 3, 2847 (1993) y por Townsend L. B. et al. en Tetrahedron Lett. 36, 8363 (1995).

El empleo de los compuestos según la invención para el marcado de ácidos nucleicos con diversos, definidos grupos de señalización y con ello, la detección y secuenciación de los ácidos nucleicos, se ha mostrado como particularmente ventajoso.

Las substancias según la invención, de fórmula general I, poseen en particular frente a los clásicos nucleósidos y nucleótidos como adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina, etc. o respectivamente sus correspondientes ésteres de ácido fosfórico, una serie de ventajas.

Una ventaja es la estabilidad química p. ej., frente a condiciones de pH ácido. Otra ventaja esencial es la estabilidad de estos compuestos frente a la degradación enzimática mediante endo y exonucleasas. Estas enzimas están contenidas normalmente en el material biológico y pueden estorbar sensiblemente la detección del ácido nucleico. Por otra parte, es sabido que la ADN-polimerasa y ARN-polimerasa son críticas con respecto a la aceptación de los nucleósido-5'-trifosfatos más o menos modificados, es decir, en la síntesis de novo, el reconocimiento de estos nucleótidos como substratos y su incorporación. En particular, la ligazón de los grupos de señalización en el nucleótido influye sobre la incorporación según la invención y la velocidad de incorporación.

El que los derivados según la invención se introduzcan de manera muy eficiente mediante polimerasas apropiadas, en ácidos nucleicos como p. ej., mediante los métodos mostrados más arriba de la "nick translation" ("desplazamiento de mella") o de la "random primed labelling" ("marcado encebado al azar"), no puede deducirse del estado actual de la ciencia y por ello se considera por el experto como sorprendente.

El citado procedimiento sirve muy en general para la detección de ácido nucleico, p. ej., para la detección cuantitativa mediante las técnicas de transferencia por difusión sobre membranas o también en placas de microtitulación.

En la secuenciación, es decir, en la detección de la secuencia de un ácido nucleico, se sintetiza una cadena nueva opuesta complementaria en el ácido nucleico que hay que secuenciar, con la ayuda de un corto oligonucleótido (de partida) (cebador), la adición de un nucleósido trifosfato y una polimerasa, a continuación se efectúan las mencionadas reacciones de terminación y se separan los fragmentos de ácido nucleico creados, por cromatografía sobre
gel.

En la hibridación in situ para la detección de determinados genes o fragmentos de genoma, tiene lugar lo mismo en principio en la célula, a saber la introducción específica de nucleótidos marcados.

Los cebadores mencionados más arriba, es decir, los oligonucleótidos de cadena corta deben generar, para garantizar una función óptima, tanto pares de bases estables con la cadena matriz, como también no han de ser atacados por las nucleasas endógenas.

Estas condiciones se cumplen por los oligonucleótidos, los cuales en lugar de los clásicos nucleósidos, contienen los compuestos según la invención como elementos constitutivos.

Lo mismo sirve para los polinucleótidos y nucleótidos de cadena larga que contienen dichos elementos constitutivos. También éstos, son objeto de la presente invención.

Los correspondientes oligonucleótidos así como sus precursores preparativos, en forma de los llamados fosforoamiditas y H-fosfonatos son también igualmente objeto de la invención. Los oligonucleótidos se obtienen hoy en día por regla general, según métodos ya conocidos en aparatos de síntesis de ADN/ARN que trabajan automáticamente en base a una síntesis en fase sólida. Estos procedimientos de síntesis se basan en esencia en la reacción por pasos de la fosforamidita ó el H-fosfonato más arriba citados y con ello el empalme consecutivo de estos elementos constitutivos de monómeros en oligómeros (véase p. ej., T. Brown en "Oligonukleotides and Analogues - A Practical Approach" ("Oligonucleótidos y análogos - Método práctico") (1991) (Eckstein, F., Hrsg.), imprenta IRL en la Imprenta de la Universidad de Oxford, Oxford, Nueva York, Tokio).

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Leyenda

Figura 1

I y II significan pBR 328-ADN, marcado con el inserto DIG-dUTP (estándar), y III pBR 328-ADN, marcado con el compuesto obtenido según el ejemplo 6, 3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigenil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona. La aplicación sobre el gel se hizo en concentraciones de 10 a
0,01 pg.

Los siguientes ejemplos aclaran la invención con más detalle:

Ejemplo 1

Ejemplo 1.1

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-pirrol-2,5-diona

El compuesto se obtuvo en una síntesis de novo según Hosmane, R.S. et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 3, 2847 (1993).

Alternativamente, puede obtenerse mediante desoxigenación Barton [Barton, D. H. R. & Motherwell, W.B. (1981) Pure Appl. Chem. 53, 15] a partir del derivado 3,4-dihidroxilo (Showdomicina) obtenido por fermentación.

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Ejemplo 1.2

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-4-bromo-pirrol-2,5-diona

213 mg (1 mmoles) de 3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-pirrol-2,5-diona obtenida según el ejemplo 1.1, se disuelven en 25 ml con bromo a RT de agua saturada, y se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de esto, se observó por control con DC la existencia de muy poco material de partida. La solución se liberó del bromo en exceso por vacío, se ajustó a pH 7 y se evaporó hasta conseguir un aceite. Se disolvió en poco metanol, y se separó en una columna de silicagel con una mezcla de cloroformo/metanol 8:2. Después de evaporar las fracciones se obtuvieron 140 mg (48%) de un aceite de color amarillo pálido.

Análisis elemental C_{9}H_{10}NO_{3}Br (p.m. 292,2): C_{calc} 36,9; H_{calc} 3,4; N_{calc} 4,8; Br_{calc} 27,4; C_{enc} 37,35; H_{enc} 3,6; N_{enc} 4,5; Br_{enc} 27,8.

Ejemplo 1.3

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(1,5-diaminopentil)-pirrol-2,5-diona

140 mg (aproximadamente 0,5 mmoles) del compuesto de bromo del ejemplo 12 se disuelven en 50 ml de etanol, se mezclan con 1,75 g (aproximadamente 10 mmoles) de dihidrocloruro de diaminopentano y se calienta durante 5 horas a reflujo. A continuación se controla mediante DC (silicagel, cloroformo/metanol 8:2) que la reacción se ha efectuado casi cuantitativamente (en comparación con la mancha que está debajo del compuesto de bromo), positiva con ninhidrina). La mezcla de reacción se evapora al vacío y sin más purificación se emplea en el ejemplo 1.4.

Ejemplo 1.4

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(N-trifluoracetamidopentil)-amino-pirrol-2,5-diona

El residuo aceitoso del ejemplo 1.3 (aproximadamente 2 g) se disuelve en 50 ml de piridina anhidra, se aspira la parte no disuelta y el filtrado se concentra al vacío hasta sequedad. Se disuelve en 50 ml de piridina absoluta y se mezcla con 0,75 ml (aproximadamente 5 mmoles) de anhídrido trifluoracético. Después de un reposo de 5 horas a temperatura ambiente, se controló por DC que la acilación había sido completa. La solución de reacción se evaporó a continuación al vacío y se coevaporó tres veces con metanol. Se disolvió en aproximadamente 20 ml de etanol, se filtró y cromatografió sobre silicagel con una mezcla de cloroformo/metanol (9:1). Las fracciones reunidas se evaporaron, el residuo se disolvió en dioxano y se liofilizó. Se obtuvieron 110 mg (53% del valor teórico) del compuesto deseado.

Análisis elemental C_{16}H_{23}N_{3}O_{6}F_{3} (p.m. 410,4): C_{calc} 46,8; H_{calc} 5,6; N_{calc} 10,2; F_{calc} 13,9; C_{enc} 47,35; H_{enc} 5,9; N_{enc} 10,5; F_{enc} 13,8.

Ejemplo 1.5

3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(N-trifluoracetamidopentil)-amino-pirrol-2,5-diona

40 mg (0,1 mmoles) del nucleósido protegido del ejemplo 1.4 se transforman según el método de Yoshikawa et al. [Tetrahedron Lett. 50, 5065 (1967)] mediante fosforilación con POCl_{3} en el 5'-monofosfato; a partir del cual en correspondencia con el procedimiento de Hoard & Ott [J. Am. Chem. Soc. 87, (1965)] después de la activación con carbonildiimidazol y reacción con ácido pirofosfórico y subsiguiente cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex, se obtiene el trifosfato deseado con un rendimiento de 30 mg (46%).

P^{31} RMN (0,1 M EDTA/D_{2}O/Eth_{3}N): -5,2 (d,P-\gamma): -10,3 (d,P-\alpha); -21,0 (t,P-\beta).

Ejemplo 1.6

3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(N-fluoresceinil-carboxamido-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona

25 mg (0,038 mmoles) del compuesto protegido con trifluoracetilo del ejemplo 1.5 se dejan en reposo 1 hora a temperatura ambiente en 5 ml de solución concentrada de amoníaco, y a continuación se evapora al vacío. El resíduo se disuelve en 5 ml de tampón de borato 0,1M, pH 8,5 y se mezcla con una solución de 25 mg (0,05 mmoles) de éster de 5(6)-carboxi-fluorescein-N-hidroxi-succinimida en 5 ml de dimetilformamida exenta de amina. Se deja durante la noche a temperatura ambiente en reposo. La mezcla de reacción se añade a una columna DEAE-Sefadex (30 x 1 cm) y se eluye con un gradiente lineal de LiCl (cada vez 200 ml de H_{2}O sobre LiCl 0,4M). Después de purificar las correspondientes fracciones, evaporar, precipitar el concentrado en acetona/etanol (2:1) y secar, se obtienen 25 mg (aproximadamente 50%) de la substancia del título.

Datos espectrales (tampón de fosfato 0,1M, pH 9,0:

Excitación_{máx} [nm]: 495;

Emisión_{máx} [nm]: 521.

Correspondientemente se obtuvo por reacción del compuesto del ejemplo 1.5 con el éster N-hidroxi-succinimida del ácido digoxigenin-3-O-succinil-aminocaprónico, el 3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigeni-
nil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona.

Ejemplo 2

Ejemplo 2.1

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-1,3-oxacin-2,6-diona

El compuesto se obtuvo mediante desoxigenación Barton (Barton D.H.R. & Motherwell, W. B. (1981) Pure Appl. Chem. 53, 15] a partir de la fermentación del derivado 3,4-dihidroxilo obtenido.

Ejemplo 2.2

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-4-bromo-1,3-oxacin-2,6-diona

El derivado se obtuvo mediante bromación del compuesto de partida del ejemplo 2.1. como se ha descrito en el ejemplo 1.2.

Ejemplo 2.3

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(1,5-diaminopentil)-1,3-oxacin-2,6-diona

150 mg (0,5 mmoles) del compuesto bromado del ejemplo 2.2 se transformaron análogamente al procedimiento del ejemplo 1.3, en el compuesto del título. Este se hizo reaccionar sin ninguna purificación análogamente al procedimiento de los ejemplos 1.4, 1.5 y 1.6, finalmente con trifosfato marcado con fluoresceína.

Ejemplo 3

Ejemplo 3.1

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-diamino-5-cloro-pirazina

El derivado se sintetizó de acuerdo con Townsend, L. B. et al. Tetrahedron Lett. 36, 8363 (1995).

Ejemplo 3.2

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-dihidroxi-5-cloro-pirazina

264 mg (1 mmoles) de 3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-diamino-5-cloro-pirazina del ejemplo 3.1 se sometieron a una reacción de desaminación en una mezcla de 50 ml de ácido acético al 80% y 700 mg (10 mmoles) de NaNO_{2}. Después de 5 horas en reposo a temperatura ambiente la reacción controlada por DC fue casi completa. A la mezcla de reacción se añadieron 2 g de urea para la descomposición del nitrito en exceso y se agitó otras 3 horas a temperatura ambiente. A continuación se añadió la solución a una columna de carbón activo (Carboraffin C, aproximadamente 50 ml de volumen), se lavó suficientemente y el producto deseado se eluyó con etanol/agua/amoníaco. Después de evaporar se obtuvieron 230 mg (aproximadamente 87%) de un aceite viscoso, el cual sin posterior purificación se empleó en el próximo paso.

Ejemplo 3.3

3-(4-hidroxi-5-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-dihidroxi-5-(1,8-diamino-3,6-dioxa-octil)-pirazina

200 mg (0,75 mmoles) del aceite del ejemplo 11 se disolvieron en 30 ml de etanol, se mezclaron con 555 mg (3,75 mmoles) de 1,8-diamino-3,6-dioxa-octano y se calentaron 3 horas a aproximadamente 60ºC.

A continuación se eliminaron el disolvente y la amina al vacío con bomba de aceite, y el residuo, sin posterior purificación, se hizo reaccionar de nuevo con anhídrido trifluoracético en piridina como se ha descrito en el ejemplo 1.4.

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Ejemplo 3.4

3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-dihidroxi-5-[N-trifluoracetamido-(3,6-dioxa)-octil]-amino- pirazina

150 mg del derivado trifluoracetilado del ejemplo 3.3 se transformaron según Yohikawa y Hoard & Ott como se describe en el ejemplo 1.5, en el compuesto del título. Después de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sefadex dio como resultado el trifosfato deseado con un rendimiento de 120 mg (40%).

P^{31} RMN (0,1 M EDTA/D_{2}O/Eth_{3}N): -5,1 (d,P-\gamma); -10,6 (d,P-\alpha); -20,8 (t,P-\beta).

Ejemplo 3.5

3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-2,6-dihidroxi-5-[N-tetrametil-rodaminil-5,6-carboxamido-(3,6- dioxa)-octil]-amino-pirazina

20 mg del trifosfato del ejemplo 3.4 se hicieron reaccionar, después de escindir el grupo de protección trifluoracetilo, con solución de amoníaco (como en el ejemplo 1.6 descrito) - con 20 mg del éster N-hidroxisuccinimido del ácido tetrametilrodamin-5(6)-carboxílico, en tampón de borato Na 0,1M, pH 8,5/DMF, como se ha descrito en el ejemplo 1.6, y se purificaron. Se obtuvieron 12 mg del producto marcado con TMR.

Datos espectrales (tampón de borato de Na 0,1M, pH 8,5)

Excitación_{máx} [nm]: 551;

Emisión_{máx} [nm]: 575.

Ejemplo 4 Marcado con ADN no radiactivo y detección mediante la inserción de la 3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigeninil-3-O-succinil-aminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona

El marcado con ADN y la detección del ADN se efectuaron con el kit comercialmente adquirible, de la Firma Boehringer Mannheim (catálogo nº 1093 657). La prescripción de trabajo reproduce todos los pasos de trabajo esenciales.

Para la reacción de marcado se intercambió en la mezcla de dNTP del kit, el DIG-dUTP por una 3-(4-hidroxi-5-trifosforil-tetrahidrofuran-2-il)-4-(digoxigeninil-3-O-succi-nilaminocaproilamino-pentil)-amino-pirrol-2,5-diona (obtenida como se ha descrito en el ejemplo 1).

La reacción de detección inmunológica indicó que la inserción del compuesto según la invención según el ejemplo 1 proporciona una sensibilidad a la detección del marcado con ADN análoga al empleo del DIG-dUTP.

La demostración del resultado de la detección y la sensibilidad alcanzada del sistema pueden deducirse de la
figura 1.

Claims

1. Compuestos de fórmula general

2

en donde

R_{1} y R_{2} que pueden ser iguales o diferentes, representan hidrógeno, oxígeno, halógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o amino substituido, carboxilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, arilo, alquiloxilo inferior, ariloxilo, aralquilo, aralquiloxilo o un grupo informativo,

R_{5} representa hidrógeno, hidroxilo, tio o tio substituido, amino o grupo amino substituido, un grupo fosfórico reactivo unido por 3- ó 5-, como p. ej., una función fosforamidita o una función H-fosfonato, un radical éster ó amida escindible, o un grupo informativo,

R_{6} representa hidrógeno o un hidroxilo, grupo tio o tio substituido, amino o amino substituido,

R_{7} representa hidrógeno, un grupo mono, di o trifosfato, o los análogos alfa, beta o gamma tiofosfato de estos ésteres de ácido fosfórico o un grupo de protección,

así como posibles tautómeros y sales de los mismos.

Z significa nitrógeno o carbono con la condición de que cuando Z significa nitrógeno, m es cero (0), y cuando X significa metileno, metileno substituido, o metino substituido, Z no puede ser carbono, y cuando X significa oxígeno, Z no puede ser nitrógeno,

en donde el compuesto está modificado con un grupo informativo.

2. Compuestos según la reivindicación 1, en donde R_{1} puede representar oxígeno, R_{2} hidrógeno o un grupo informativo, R_{3} y R_{4}, hidrógeno; R_{5} hidroxilo, hidrógeno; un grupo fosfórico reactivo de unión a 3- ó 5-, R_{6} hidrógeno y R_{7} hidrógeno; grupos mono, di y trifosfato.

3. Compuestos según la reivindicación 1, en donde R_{1} representa hidrógeno, hidroxilo, un grupo amino, un grupo amino eventualmente substituido o un grupo informativo, R_{2} un grupo amino eventualmente substituido o un grupo informativo, R_{3} hidrógeno, R_{4} hidrógeno, hidroxilo, amino o amino substituido, alquiloxilo inferior, alquenoxilo inferior, alquinoxilo inferior, R_{5} hidrógeno, hidroxilo, tio, un grupo amino eventualmente substituido, una fosforamidita o un grupo informativo, R_{4} y R_{5} juntamente una función acetal, R_{6} hidrógeno y R_{7} una función trifosfato.

4. Compuestos según la reivindicación 1, en donde X significa oxígeno y al mismo tiempo Z representa carbono substituido con R_{2}, ó Z significa nitrógeno y al mismo tiempo X significa metileno o metino substituido con amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informativo.

5. Compuestos según la reivindicación 1, en donde X = 0 y Z representa metino substituido con amino o amino substituido, carboxilo o un grupo informativo.

6. Compuestos según la reivindicación 1, en donde la función acetal de los radicales R_{4} y R_{5} está substituida con un grupo informativo.

7. Compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo informativo significa un hapteno, un fluoróforo, un grupo delator de metal, un luminóforo, una proteína o un intercalador.

8. Compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el grupo informativo está empalmado mediante un grupo de engarce.

9. Empleo de los compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 8, como substrato para ADN y ARN polimerasas.

10. Empleo de los compuestos según las reivindicaciones 1 a 8, para el marcado de ácidos nucleicos.

11. Empleo de los compuestos según las reivindicaciones 1 a 8, para la detección de ácidos nucleicos.

12. Empleo de los compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la secuenciación del ADN.

13. Empleo de los compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la hibridación in situ.

14. Empleo de los compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 8, en los cuales R_{7} representa una fosforamidita o un H-fosfonato, para la síntesis química de oligonucleótidos.

15. Oligonucleótidos, los cuales contienen uno o varios de los compuestos mencionados en las reivindicaciones
1 a 8.

16. Ácidos nucleicos, los cuales contienen uno o varios de los compuestos mencionados en las reivindicaciones
1 a 8.