ES2290963T3 - Una composicion de celulasas mejorada para tratar materiales textiles que contienen celulosa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA COMPOSICION DE CELULASA PARA EL TRATAMIENTO Y FINALIZACION DE TEXTILES QUE CONTIENEN CELULOSA. LAS PROPIEDADES MEJORADAS DE LA COMPOSICION DE CELULASA SE BASAN EN UN ELEVADO CONTENIDO DE COMPONENTE TIPO ENDOGLUCANASA EGII EN UNA COMPOSICION POR OTRA PARTE COMPLETA DE CELULASA. CUANDO LA COMPOSICION CON CONTENIDOS ELEVADOS EN EGII SE USA, SE CONSIGUEN MEJORES PROPIEDADES DE COLOR, LIGEREZA AUMENTADA, MEJOR APARIENCIA VISUAL Y UNA REDUCCION DE LA TENDENCIA A DESCAMARSE. LAS PROPIEDADES DE RESISTENCIA DE LOS MATERIALES TEXTILES PERMANECEN ESENCIALMENTE INALTERADAS EN COMPARACION CON COMPOSICIONES DE CELULASA UTILIZADAS PREVIAMENTE.
Description
Una composición de celulasas mejorada para
tratar materiales textiles que contienen celulosa.
La presente invención se refiere a
procedimientos para tratar y dar acabado a materiales textiles que
contienen celulosa con una composición de celulasas que tiene un
contenido elevado de al menos 15 por ciento en peso de celulasa de
tipo EGII comparada con un medio completo que contiene
45-80% de CBHI, 10-25% de CBHI,
5-15% de EGI y 8-15% de EGII. Dicha
composición de celulasas puede obtenerse a partir de una cepa que
sobreproduce EGII, con lo que la composición de celulasas tiene una
proporción EG:CBH de 0,6:1 y una proporción CBHI:EG de
1-1,4:1 o añadiendo EGII al medio completo.
El tratamiento con celulasas de materiales
textiles que contienen celulosa durante su fabricación o acabado es
conocido per se en la técnica. El tratamiento enzimático para
dar acabado a los materiales textiles que contienen celulosa se
denomina bioacabado. El bioacabado se ha utilizado para eliminar
todo tipo de impurezas y terminaciones de fibras sueltas
individuales que sobresalen de la superficie del tejido. Las
ventajas clave que ofrece el bioacabado con celulasas son la mejora
permanente de resistencia a la formación de bolitas, estructura
superficial más limpia al eliminar la pelusa, mejor tacto de la
prenda, por ejemplo suavidad, tersura y un tacto más sedoso, mejor
caída y colores más vivos del tejido y una mejor capacidad de
absorber humedad.
Además, las celulasas se han utilizado para
conferir un aspecto de lavado a la piedra a los tejidos vaqueros.
La completa biodegradación de las celulasas es una ventaja del
tratamiento con celulasas, que de forma consistente destaca como
una alternativa al tratamiento químico buena para el
medioambiente.
La técnica anterior más similar, el documento WO
94 07983, describe la purificación de EGII y un experimento en el
que se analiza EGII (8-10 por ciento en peso) para
determinar su capacidad de conferir un aspecto de lavado a la
piedra a los tejidos vaqueros. La conclusión del experimento es que
debería aumentarse el contenido total en EG y debería disminuirse
el contenido en CBH.
La pérdida de resistencia de la tela es un
problema asociado al tratamiento con celulasas. La pérdida de
resistencia es provocada por la hidrólisis inducida por las
celulasas de los enlaces
beta-1,4-glucosídicos de la
celulosa, que a su vez provoca la degradación parcial del polímero
celulósico y además puede provocar la pérdida de resistencia de la
tela.
En el tratamiento de las telas, generalmente se
emplea la celulasa derivada de hongos, por ejemplo de Trichoderma
reesei, estando compuesta dicha celulasa por componentes de
tipo celobiohidrolasa (CBH), endoglucanasa (EG) y
beta-glucosidasa (BG). Los componentes CBH y de EG
pueden clasificarse además en los tipos CBHI y CBHII y en diversos
tipos de EG, siendo los principales de este EGI y EGII. Los
componentes BG no reaccionan con los polímeros celulósicos, sino
que descomponen más los productos de degradación, por ejemplo
celobiosa, que se forman como resultado del efecto sinérgico entre
los componentes CBH y EG.
El aislamiento de los componentes de la celulasa
de los hongos es conocido en la técnica. Véase, por ejemplo,
Bhikhabhai, R. y cols., (1984), Saloheimo, M., y cols., (1988), Wood
y cols., (1988), Bhat, K.M. y cols., (1989) y Schulein (1988).
Un procedimiento para tratar las telas de
algodón, antes del tintado y el acabado, con solución de celulasas
para eliminar las hilas y las fibras superficiales sueltas para
conferir un mejor aspecto a la tela se describe en la patente de
Estados Unidos n.º 5.232.851. La celulasa empleada puede ser
producida, por ejemplo, por especies de Trichoderma reesei,
T. koningii, Penicillium sp o Humicola insolens. En los
ejemplos que se citan, se usó CYTOLASE 123 -celulasa (Genencor
Int.) sin que se detalle la composición en dicha publicación.
Además de la celulasa, la solución de celulasas puede contener
tampones, tensioactivos, agentes abrasivos y similares. Después del
tratamiento, se reseña que la resistencia a la tracción de la tela
de algodón tejido era de al menos el 50 por ciento de la
resistencia a la tracción de la tela sin tratar.
La composición original de celulasa que puede
obtenerse del medio de fermentación, que se deriva directamente de
los microbios, por ejemplo del hongo T. reesei, tal cual
raramente es adecuada para obtener un resultado adecuado. La
composición de celulasas original puede comprender aproximadamente
45-80% de CBHI, 10-25% de CBHII,
5-15% de EGI y 8-15% de EGII del
contenido proteínico celulásico total. Por lo tanto, podría
cambiarse las interrelaciones entre los componentes CBH y EG
contenidos en una composición por diversos procedimientos conocidos
por las perso-
nas de experiencia en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, fraccionamiento e ingeniería genética.
nas de experiencia en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, fraccionamiento e ingeniería genética.
La patente de Estados Unidos n.º 5.120.463 por
ejemplo describe una composición de detergente que comprende un
tensioactivo y además de 0,002 a 10 por ciento en peso de celulasa
compuesta por los componentes de tipo CBHI y de tipo EG con una
relación entre CBHI y (EGI + EGII) de \geq 10:1.
La solicitud de patente internacional WO
93/22428 describe un procedimiento para tratar telas de algodón con
composiciones de celulasas fúngicas que comprenden componentes de
tipo CBHI y de tipo EG en una proporción en peso superior a 10:1.
La solicitud menciona que la resistencia a la tracción de la tela
tratada es de al menos el 50 por ciento de la resistencia a la
tracción de la tela sin tratar. Sin embargo no se proporcionan
resultados de las pruebas.
En la publicación de patente internacional WO
94/23113 se describe un procedimiento para tratar telas celulósicas
que contienen algodón y sin algodón durante la fabricación para
reducir la generación de hilas. Las composiciones de celulasas
contienen todo tipo componentes de tipo EG y todos los componentes
de tipo CBH en una proporción superior a 5:1.
En la publicación de patente internacional WO
92/06221 se dice que las telas que contienen algodón tratadas con
una solución de celulasas esencialmente libre de componentes de
celulasa de tipo CBHI muestran una menor pérdida de resistencia que
las telas tratadas con una solución de celulasa que contiene una
composición de celulasa completa.
Las celulasas se han empleado también para el
acabado de tejidos vaqueros o de prendas de tejido vaquero, para
conferir un aspecto de lavado a la piedra a la tela.
El lavado a la piedra se realizaba
tradicionalmente usando las denominadas piedras pómez. Sin embargo,
el uso de piedras pómez provoca a las lavanderías diversos
problemas, por ejemplo la pesadez del manejo de las piedras, la
laboriosa recolección a mano de las piedras de entre la ropa, un
desgaste significativo de las máquinas con los consiguientes costes
elevados de reparación e inversión en maquinaria, las crecientes
cantidades de residuos provocados por las piedras rotas y, además,
el complicado acceso a las piedras pómez, ya que la extracción de
piedra pómez está prohibida en algunos países por causas
medioambientales.
Un procedimiento para conferir un aspecto de
lavado a la piedra a las prendas de tejido vaquero mediante enzimas
celulasas se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos
n.º 4.832.864. También en este caso, el problema es el
debilitamiento, es decir la pérdida de resistencia, del tejido
vaquero provocada únicamente por el tratamiento enzimático que se
emplea para conferir un aspecto de lavado a la piedra a la tela.
También es conocido en la técnica que la
actividad de la composición de celulasas depende de la acidez del
ambiente en el que se realiza el tratamiento. De la forma más
general, la actividad es mayor a pH ligeramente ácidos, aunque
puedan emplearse composiciones que trabajan en un ambiente neutro, e
incluso se conocen composiciones de celulasas que actúan en
condiciones alcalinas. Sin embargo, las composiciones que se usan en
un entorno neutro o alcalino tienen un tiempo de reacción
prolongado, es decir las composiciones actúan más despacio. Dado
que el tiempo significa dinero, los tratamientos que llevan mucho
tiempo no son sólo menos eficaces en términos de tiempo, sino
también de dinero. O dicho de otro modo, se necesita más maquinaria
para tratar la misma cantidad de telas en el mismo tiempo. Esto
también es caro y requiere más espacio e instalaciones.
Naturalmente, se usan tampones conocidos por las personas de
experiencia en la técnica para ajustar la acidez de los medios de
tratamiento con celulasas, pero esto no resuelve todos los
problemas.
El problema de obtener unas mejores propiedades
de retención/renovación del color así como de mejorar las
propiedades de suavidad, tacto y aspecto visual a las telas de
algodón se ha analizado en diversas patentes y solicitudes de
patente.
En la patente de Estados Unidos n.º 5.090.474,
por ejemplo, se describe una composición de detergente que contiene
EGIII sustancialmente puro. La composición no contiene más del 5 por
ciento en peso de componentes de tipo CBHI.
La publicación de patente internacional WO
92/06210 describe una composición de celulasas, que está enriquecida
con componentes de tipo endoglucanasa no especificados. La
proporción entre los componentes de tipo EG y todos los componentes
de tipo CBHI es mayor de 5:1. Se dice que la composición confiere
propiedades suavizantes mejoradas así como propiedades de
retención/renovación a la composición de detergente cuando se usa en
medios de lavado ácidos, neutros o alcalinos.
La patente de Estados Unidos n.º 5.246.853
describe un procedimiento mejorado para tratar telas que contienen
algodón con composiciones de celulasas fúngicas que están
esencialmente libres de componentes de celulasas de tipo CBHI, pero
que contienen al menos el 10% de componentes de tipo EG basándose en
el peso total de las proteínas de la solución de celulasas.
En la publicación de patente internacional WO
92/06165 se describe una composición de celulasas que contiene 0,01
- 5 por ciento en peso de componentes de celulasas. Las
composiciones contienen uno o más componentes de tipo EG y de todos
los componentes de celulasas; menos del 5 por ciento en peso es de
componentes de tipo CBHI.
La publicación de patente internacional WO
95/25840 describe una composición de celulasas, que está
esencialmente libre de componentes de celulasas de tipo CBHI y
tiene una proporción en peso entre todos los componentes de tipo EG
y todos los componentes de tipo CBHI superior a 5:1. Dicha solicitud
de patente internacional corresponde a la patente de Estados Unidos
n.º 5.525.507, que describe una composición de utilidad para tratar
material sin algodón. La composición está esencialmente libre de
componentes de celulasas de tipo CBHI y las propiedades mejoradas
se logran modificando la composición de celulasas fúngicas natural
completa añadiendo al menos 10 por ciento de componentes de
endoglucanasas no especificados. La publicación de patente
internacional WO 92/17572 describe una composición de celulasas,
que está esencialmente libre de componentes de celulasas de tipo
CBHI y comprende al menos aproximadamente 20 por ciento en peso de
componentes de tipo EG no especificados. La publicación de patente
internacional WO 92/17574 describe una composición de celulasas, que
comprende uno o más componentes EG no especificados y otro
componente CBHI y la proporción entre todos los componentes EG y
todos los CBHI es superior a 5:1. La solicitud de patente
internacional WO 94/07983 describe EGII purificado y su uso en el
tratamiento de tejidos.
A la vista de lo anterior, el principal problema
de usar composiciones de celulasas en el tratamiento y acabado de
materiales textiles que contienen celulosa no sólo ha sido la
pérdida de resistencia de la tela provocada por el tratamiento con
celulasas sino también el hecho de que incluso al cambiar las
proporciones entre los componentes de tipo CBH y de tipo EG de las
formas más sutiles, tal como sugieren las patentes y solicitudes de
patente de la técnica anterior, no se han logrado cambios
significativos en las propiedades de bioacabado. Parece como si las
diferentes proporciones entre los componentes de tipo CBH y de tipo
EG se variaran de forma más o menos aleatoria y los resultados, por
ejemplo la eliminación de impurezas y los extremos de fibras
individuales sueltos que sobresalen de la superficie del tejido se
obtuvieran aleatoriamente. Las ventajas clave que reivindican las
patentes y solicitudes de patente usando diferentes proporciones de
componentes de tipo EG y CBH en el bioacabado, es decir la mejora
permanente de la resistencia a la formación de bolitas, estructura
superficial más limpia por la reducción de la pelusa, mejor tacto
del tejido, por ejemplo suavidad, tersura y un tacto más sedoso,
mejor caída y colores más vivos del tejido y mejor capacidad de
absorción de la humedad parecen no haber cambiado esencialmente
incluso al cambiar las proporciones entre EG y CBH. Además, la
eliminación de ciertos componentes y la adición de otros
componentes a la composición de celulasas fúngicas completas
naturales no es necesariamente lo suficientemente rentable.
Los presentes inventores han descubierto ahora
sorprendentemente que no son las diferentes proporciones entre los
componentes CBH y componentes EG lo que proporciona las propiedades
mejoradas en la fabricación y el acabado de textiles. El
responsable de la mejora es un mayor nivel de EGII. En cuanto se
añaden incluso pequeñas cantidades de componente(s) de tipo
EGII al entorno de la composición de celulasa completa natural se
obtienen los mismos o incluso mejores resultados en la fabricación
y acabado. Esta mejora es totalmente independiente de las
proporciones entre CBH y EG que se describen en la técnica
anterior.
Así, el objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para tratar materiales textiles que
contienen celulosa que confiera un tacto suave, un aspecto y
suavidad mejorados así como una permanente resistencia a la
formación de bolitas al tejido.
En particular, el objetivo de la presente
invención es proporcionar un procedimiento para tratar materiales
textiles que contienen celulosa que no produzca una pérdida de
resistencia significativa del tejido provocada por el
tratamien-
to.
to.
Además, el objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para conferir un aspecto aceptable de
lavado a la piedra a tejidos vaqueros y prendas de tejido vaquero
sin provocar una significativa pérdida de resistencia a los tejidos
vaqueros o a las prendas de tejido vaquero.
Además, el procedimiento de la presente
invención aplica un medio de tratamiento mejorado para los
materiales textiles que contienen celulosa que puede comprender,
además de la composición de celulasas de esta invención, por
ejemplo, tensioactivos, polímeros, tampones, agentes de carga,
conservantes, estabilizantes y/o agentes abrasivos.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento con un menor tiempo de reacción, es
decir composiciones que actúen más rápidamente. Lo que esto
significa es procedimientos de tratamiento más eficaces en términos
de tiempo y coste y ahorro en la maquinaria así como en las
instalaciones de tratamiento.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento mejorado para tratar materiales
textiles que contienen celulosa de forma que se mantengan las
propiedades de resistencia, así como obtener un mejor aspecto y
tacto suave del tejido.
Uno de los objetivos más importantes de la
presente invención es realizar la producción de forma más rentable.
La composición que se usa en el procedimiento de la presente
invención es más barata, porque se necesita una menor actividad,
debido a que la enzima es más eficaz que otras enzimas. Así, la
cantidad necesaria en el medio de tratamiento también es menor.
Un objetivo adicional del procedimiento de la
presente invención es obtener tonos de color que sean agradables
para los consumidores. Se ha demostrado que con la composición de la
presente invención pueden obtenerse los tonos grisáceos que son
especialmente agradables a la vista y que aprecian los
consumidores.
Los objetivos descritos del procedimiento de la
presente invención se han logrado empleando una composición de
celulasas que comprende cantidades elevadas de celulasa de tipo EGII
comparadas con composiciones de celulasas completas tal como se
define en las reivindicaciones.
La composición de celulasas que se usa en el
procedimiento de la presente invención puede obtenerse a partir de
una solución de celulasas producida cultivando hongos o bacterias y
recolectando el caldo o medio de fermentación usado esencialmente
libre de células que contiene los componentes de las celulasas de
fondo completos por ejemplo componentes CBH y EG, pero sobre todo
un contenido elevado en componentes EGII comparado con las
composiciones de celulasas naturales completas y las composiciones
de la técnica anterior de las celulasas con diferentes proporciones
entre CBH y EG. El contenido elevado en EGII debe ser tal que se
logren los efectos deseados. La celulasa de tipo EGII es el
componente que es esencial para obtener los objetivos y ventajas de
la presente invención.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para tratar materiales textiles que contienen celulosa
durante su fabricación o para su acabado. El procedimiento aplica
una composición de celulosas, que comprende un contenido elevado de
al menos un 15 por ciento en peso de componentes de tipo EGII
comparada con la composición de celulasas natural completa que
puede obtenerse de un medio de fermentación libre de células. Cuando
dichas composiciones de celulasas con un contenido elevado en EGII
se usan para tratar telas que contienen celulosa los resultados son
un mejor efecto de bioacabado y/o de aspecto de lavado a la piedra y
básicamente ninguna pérdida de resistencia en los materiales del
tejido comparada con los resultados que pueden obtenerse con las
composiciones de celulasas con proporciones modificadas o naturales
completas de la técnica anterior.
La composición de celulasas que se usa en el
procedimiento de la presente invención comprende un contenido
elevado del componente de tipo EGII comparado con composiciones de
celulasa completas y modificadas que se han usado anteriormente. La
cantidad de EGII es al menos del 15 por ciento en peso,
preferiblemente al menos 20 - 60 por ciento en peso, lo más
preferiblemente al menos 25 - 40 por ciento en peso de la
composición de celulasas. La proporción de EG:CBH en T.
reesei ALK03529, la cepa que sobreproduce EGII, se estima que
es de aproximadamente 0,6-1:1 y la proporción de
CBHI:EG se estima que es de aproximadamente
1-1,4:1.
La composición de celulasas que se usa en el
procedimiento de la presente invención puede obtenerse de hongos o
bacterias, especialmente de hongos por ejemplo del género
Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,
Humicola o Fusarium. La fuente más preferida de la
composición de celulasas es una especie de Trichoderma
reesei, especialmente cepas de Trichoderma reesei que
sobreproducen EGII.
En el procedimiento de la presente invención se
usa un medio de tratamiento (composición) mejorado para tratar
materiales textiles que contienen celulosa. Dicho medio de
tratamiento también contiene la composición de celulasas mejorada
con la cantidad de celulasa de tipo EGII aumentada comparada con las
composiciones de celulasas incompletas modificadas y naturales
completas de la técnica anterior. El medio de tratamiento que
contiene celulasas no sólo proporciona propiedades mejoradas
durante la fabricación y el acabado a los materiales textiles que
contienen celulosa sino que también tiene la misma o una menor
pérdida de resistencia comparado con los materiales que contienen
celulosa tratados en las mismas condiciones con composiciones de
celulasas sin el elevado contenido en EGII.
El medio de tratamiento es de utilidad para el
bioacabado de materiales textiles que contienen celulosa y para
conferir un aspecto de lavado a la piedra a tejidos o prendas
vaqueros. Dicho medio contiene tensioactivos, polímeros, tampones,
agentes de carga, conservantes, estabilizantes y/o agentes
abrasivos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para tratar materiales textiles que contienen
celulosa, en el que el medio que se define anteriormente se usa
para tratar o dar acabado a materiales textiles que contienen
celulosa. Dichos materiales textiles que contienen celulosa
modificables son algodón, lino, cáñamo, ramio, yute, viscosa,
Polynosic, Modal, Lyocell, Cupro, etc.
La Fig. 1 muestra el mapa del plásmido de
pALK537.
La Fig. 2 muestra el mapa del plásmido de
pALK540.
La Fig. 3 muestra el mapa del plásmido de
pALK546.
La Fig. 4 muestra el mapa del plásmido de
pALK543.
La Fig. 5 muestra la claridad de los tejidos
vaqueros después de 1 hora de tratamiento en una
Launder-Ometer con la preparación de celulasas
VTT-D-79125 y con la preparación de
celulasas VTT-D-79125 añadidas con
cantidades diferentes de celulasas de Trichoderma
purificadas.
La Fig. 6 muestra la claridad de los tejidos
vaqueros después de 2 horas de tratamiento en una
Launder-Ometer con la preparación de celulasas
VTT-D-79125 y con la preparación de
celulasas VTT-D-79125 añadidas con
cantidades diferentes de celulasas de Trichoderma
purificadas.
La Fig. 7 muestra la eliminación de las
pelotitas de telas de algodón tejidas después de 1 hora de
tratamiento en una Launder-Ometer con dosis
diferentes de preparaciones de celulasas de
VTT-D-79125, ALK03760, ALK03798,
ALK04097, ALK02656, ALK03529 y ALK03528.
En la descripción siguiente, se usan de forma
extensa una serie de términos empleados en la industria textil y la
tecnología enzimática así como en la ingeniería genética. Para
explicar de forma clara y consistente la memoria descriptiva y las
reivindicaciones, incluido el alcance que debe darse a dichos
términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
Materiales textiles o telas que contienen
celulosa. El término "materiales textiles o telas que
contienen celulosa" tal como se usa en la presente invención se
refiere a material textil compuesto única o parcialmente de fibras
celulósicas. El material textil incluye fibra, hilo, tela tejida,
punto o una prenda confeccionada, en cuya fabricación se ha usado
algodón, lino, cáñamo, ramio, yute o fibras celulósicas hechas por
el hombre, por ejemplo, viscosa, Polynosic, Modal, lyocell (por
ejemplo Tencel^{R}), Cupro, etc. Cuando se usen fibras sintéticas
fabricadas por el hombre, la cantidad de fibra celulósica del
material textil tiene que ser al menos del 30 por ciento,
preferiblemente superior al 50 por ciento.
Composición de celulasas completa. El
término "composición de celulasas completa" tal como se usa en
la presente memoria se refiere a celulasas derivadas de hongos, por
ejemplo de Trichoderma reesei. Dicha celulasa está compuesta
por componentes de tipo celobiohidrolasa (CBH), endoglucanasa (EG) y
beta-glucosidasa (BG). Los componentes CBH y de EG
pueden clasificarse además en los tipos CBHI y CBHII y en diversos
tipos de EG, siendo los principales de este EGI y EGII. Los
componentes BG no reaccionan con los polímeros celulósicos, sino
que descomponen más los productos de degradación, por ejemplo
celobiosa, que se forman como resultado del efecto sinérgico entre
los componentes de CBH y EG. Como ejemplo típico de dichas cepas de
Trichoderma reesei, se usa la cepa
VTT-D-79125 en la presente
invención.
La composición original de celulasas que puede
obtenerse del medio de fermentación, que se deriva directamente de
los microbios, por ejemplo del hongo T. reesei que tiene una
composición en celulasas que comprende aproximadamente
45-80% de CBHI, 10-25% de CBHII,
5-15% de EGI y 8-15% de EGII del
contenido proteínico en celulasas totales se considera que es la
composición de celulasa completa de acuerdo con la presente
invención. La proporción EG:CBH en T. reesei ALK03529, la
cepa que sobreproduce EGII, se estima que es de aproximadamente
0,6-1:1 y la proporción CBHI:EG se estima que es de
aproximadamente 1-1,4:1.
Composición de las celulasas modificadas.
El término "composición de celulasas modificadas" tal como se
usa en la presente memoria se refiere a la composición de celulasas
completa en la que las interrelaciones entre los componentes de CBH
y EG contenidos en una composición han sido modificadas por diversos
procedimientos conocidos por las personas de experiencia en la
técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo,
fraccionamiento e ingeniería genética así como la combinación de
diferentes soluciones de celulasas.
Esencialmente libre de componentes de tipo
CBH quiere decir que al menos un componente de tipo CBH que se
selecciona de un grupo constituido por CBHI, CBHII o ambos no están
presentes en la composición de celulasas, es decir dicha
composición es producida por un huésped del que se eliminan los
genes que codifican dichas proteínas.
Esencialmente libre de componentes de tipo
EG quiere decir que al menos un componente de tipo EG que se
selecciona de un grupo constituido por EGI, EGII, EGV o todos o una
combinación de dichas proteínas EG no están presentes en la
composición de celulasas, es decir dicha composición es producida
por un huésped del que se eliminan uno o más genes que codifican
dichas proteínas.
Nivel o cantidad de componentes de celulasa
de tipo EGII elevados quiere decir que la composición de
celulasas comprende al menos 15 - 100 por ciento en peso,
preferiblemente al menos 20 - 60 por ciento en peso, lo más
preferiblemente al menos 25 - 40 por ciento en peso de celulasa de
tipo EGII del peso total de proteínas celulásicas.
Biolavado a la piedra. El "biolavado a
la piedra" de telas o prendas quiere decir el uso de enzimas en
lugar o además del uso de piedras pómez para el tratamiento de
telas o prendas, especialmente de tejido vaquero.
Bioacabado. "Bioacabado" se refiere
al uso de enzimas en una hidrólisis controlada de fibras celulósicas
para modificar la superficie de la tela o el hilo de forma que
evite de forma permanente la formación de bolitas, mejore tacto de
la tela por ejemplo la suavidad y tersura, limpie la estructura
superficial reduciendo la formación de pelusa, que provoca el
aclarado de los colores, mejore la caída de la tela, mejore la
capacidad de absorción del agua y que pueda mejorar también la
capacidad de tinción.
Backstaining. El tinte que se libera
tiende a volverse a depositar sobre la superficie de las fibras de
la tela. Este efecto se denomina "backstaining."
Detergente. Por detergente se quiere
decir un agente limpiador que contiene agentes tensioactivos
(tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos y anfolíticos),
mejoradores y otros ingredientes opcionales por ejemplo agentes
contra la redeposición y de suspensión de la suciedad,
abrillantadores ópticos, agentes blanqueantes, tintes y pigmentos e
hidrolasas. Un listado adecuado del contenido de los detergentes
aparece en la patente de Estados Unidos n.º 5.433.750, un listado
adecuado de tensioactivos aparece en la patente de Estados Unidos
n.º 3.664.961.
Preparación enzimática. Por
"preparación enzimática" se quiere decir una composición que
contiene enzimas. Preferiblemente, las enzimas han sido extraídas
(purificadas parcial o completamente) de un microbio, del medio que
se usa para cultivar dicho microbio.
"Extraído de" quiere decir que las
enzimas deseadas se separan de la masa celular. Esto puede
realizarse mediante cualquier procedimiento que logre este
objetivo, incluyendo el lisado de células y también simplemente
retirando el medio de cultivo de las células usadas. Por lo tanto,
el término "preparación enzimática" incluye composiciones que
contienen medio usado previamente para cultivar un(os)
microbio(s) deseado(s) y cualesquiera enzimas que
hayan sido liberadas por las células microbianas a dicho medio
durante el cultivo o las etapas de procesamiento posteriores.
Con un huésped que es "sustancialmente
incapaz" de sintetizar una o más enzimas se quiere decir un
huésped en el que la actividad de una o más de las enzimas que se
enumeran se encuentra disminuida, deficiente o ausente cuando se
compara con el tipo silvestre.
Con una secuencia de aminoácidos que es
"equivalente" a una secuencia de aminoácidos se quiere
decir una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a la
secuencia de aminoácidos específica, sino que contiene al menos
algunos cambios en los aminoácidos (deleciones, sustituciones,
inversiones, inserciones, etc.) que no afectan esencialmente a la
actividad biológica de la proteína comparada con una actividad
similar de la secuencia de aminoácidos específica, cuando se usa
para un fin deseado. La actividad biológica de una celulasa, es su
actividad catalítica, y/o su capacidad de unirse a material
celulósico. Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos
"equivalente" contiene al menos 80%-99% de identidad a nivel
de los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos específica, lo
más preferiblemente al menos 90% y en una realización especialmente
preferible, una identidad de al menos 95%, a nivel de los
aminoácidos.
Vehículo de clonado. Un vehículo de
clonado es un plásmido o ADN de fagémido u otras secuencias de ADN
(por ejemplo un ADN lineal) que proporciona un entorno de vehículo
de ácido nucleico apropiado para la transferencia de un gen de
interés a una célula huésped. Los vehículos de clonado de la
invención pueden diseñarse para que se repliquen de forma autónoma
en huéspedes procariotas y eucariotas. En los huéspedes fúngicos por
ejemplo Trichoderma, los vehículos de clonado generalmente
no se replican de forma autónoma y en vez de ello, únicamente
proporcionan un vehículo para el transporte del gen de interés al
huésped Trichoderma para la posterior inserción en el genoma
de Trichoderma. El vehículo de clonado puede caracterizarse
además por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de
endonucleasas donde dichas secuencias de ADN pueden escindirse de
una forma determinable sin pérdida de ninguna función biológica
esencial del vehículo, y en el que puede introducirse ADN para
provocar la replicación y el clonado de dicho ADN. El vehículo de
clonado puede contener además un marcador adecuado para la
identificación de células transformadas con el vehículo de clonado.
Los marcadores, por ejemplo, son de resistencia a antibióticos. De
forma alternativa, dichos marcadores pueden proporcionarse en un
vehículo de clonado que esté separado del que proporciona el gen de
interés. La palabra "vector" se usa algunas veces para
"vehículo de clonado."
Vehículo de expresión. Un vehículo de
expresión es un vehículo de clonado o vector similar a un vehículo
de clonado pero que es capaz de expresar un gen de interés, después
de la transformación en un huésped deseado. Cuando se usa un
huésped fúngico, el gen de interés preferiblemente se proporciona a
un huésped fúngico como parte de un vehículo de clonado o de
expresión que se integra en el cromosoma fúngico, o que permite que
el gen de interés se integre en el cromosoma huésped. Las
secuencias que forman parte del vehículo de clonado o del vehículo
de expresión también pueden integrarse en el gen de interés durante
el proceso de integración. En T. reesei, los sitios de
integración a los que puede dirigirse el gen de interés incluyen los
locus cbh y/o egl. Lo más preferiblemente, el gen de interés se
dirige a la sustitución de uno o más genes que codifican
características no deseables.
El gen de interés también preferiblemente se
sitúa de forma que esté controlado (es decir, ligado de forma
operable) a ciertas secuencias de control por ejemplo secuencias
promotoras que proporciona el vector (que se integran con el gen de
interés). De forma alternativa, las secuencias de control pueden ser
aquellas que están en el sitio de inserción.
La expresión secuencias de control de un vector
de expresión variará dependiendo de si el vector está diseñado para
que exprese un cierto gen en un huésped procariota o eucariota (por
ejemplo, un vector lanzadera puede proporcionar un gen para la
selección de huéspedes bacterianos). Las secuencias de control de la
expresión pueden contener elementos de regulación transcripcional
por ejemplo, promotores, elementos potenciadores y secuencias de
terminación de la transcripción, y/o elementos de regulación de la
traducción, tales como, por ejemplo, sitios de iniciación y
terminación de la traducción.
En la fabricación o el acabado de materiales
textiles que contienen celulosa, se encontró inesperadamente que al
usar una composición de celulasas, que comprendía una cantidad mayor
de un componente de celulasa de tipo EGII en una composición de
celulasa que por lo demás era natural completa, podía producirse un
producto de un tejido que contiene celulosa con esencialmente las
mismas o mejores propiedades. También el material textil que
contenía algodón tenía un mejor aspecto y tacto agradable y mostraba
una menor tendencia a la formación de bolitas, y además mantenía su
resistencia. También los tejidos vaqueros y las prendas de tejido
vaquero tratados con la composición de celulasas que contiene
cantidades elevadas de EGII lograron el mismo o un mejor aspecto de
lavado a la piedra comparado con composiciones de celulasas
modificadas y naturales completas.
Para obtener los resultados mejorados de la
presente invención durante la fabricación y el acabado, la
composición de celulasas o las composiciones que contienen el medio
de tratamiento deberían tener un contenido en EGII más o menos
elevado.
Se ha demostrado que usando la composición de
celulasas de la presente invención se logra un aspecto, suavidad,
caída, absorción de humedad mejorados y colores más vivos en
materiales textiles que contienen celulosa. También se consigue una
menor tendencia a formar bolitas y pelusa. Además, la composición de
celulasas de esta invención puede usarse en el acabado de los
denominados tejidos vaqueros para crear un aspecto mejorado de lo
que se denomina lavado a la piedra.
Pueden usarse hongos y bacterias como material
fuente para producir la composición de celulasas de la presente
invención. Preferiblemente las composiciones de celulasas de esta
invención se derivan de hongos, por ejemplo de especies del género
Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,
Humicola o Fusarium. Trichoderma reesei es el
hongo de preferencia para producir la composición de celulasas. De
acuerdo con de la técnica anterior, las composiciones de celulasas
naturales completas que comprenden componentes CBH y diversos
componentes EG, no son en sí aplicables al tratamiento de
materiales textiles que contienen celulosa para producir el
resultado final deseado. Tampoco son necesarios los procedimientos
sugeridos para producir composiciones modificadas para conseguir
diferentes proporciones entre CBH y EG para lograr los resultados
deseados. Un contenido elevado en EGII en la composición de
celulasas de fondo completa es la única cosa necesaria para obtener
los resultados deseados.
Cuando se usa alguna otra cepa distinta de
Trichoderma para obtener la composición de celulasas, es
posible, de manera similar, modificar las proporciones de los tipos
de celulasas producidos empleando la cepa que produce celulasas que
corresponden funcionalmente a las producidas por Trichoderma
y añadiendo una cantidad adecuada de EGII, logrando el resultado
deseado.
Para obtener un resultado final deseado y bueno,
es esencial que la composición de celulasas contenga una cantidad
más o menos aumentada significativamente de endoglucanasas de tipo
EGII de Trichoderma. Si la composición de celulasas se
deriva de Trichoderma, la composición de celulasas de la
presente invención comprende además del elevado contenido en EGII,
componentes de EGI y posiblemente cantidades menores de otros
componentes de EG, por ejemplo EGIII y EGV así como CBHI y quizás
componentes de CBHII, pero dichos componentes de EG y de CBH más o
menos indeseados, cuya proporción no es de mayor importancia,
también pueden eliminarse usando técnicas de recombinación y
fraccionamiento convencionales. La proporción EG:CBH en T.
reesei ALK03529, la cepa que sobreproduce EGII, se estima que
es de aproximadamente 0,6-1:1 y la proporción
CBHI:EG se estima que es de aproximadamente
1-1,4:1.
El contenido aumentado en EGII puede
proporcionarse a las composiciones de celulasas con una proporción
relativa entre CBHI o EGI y otros componentes que se aumenta o se
disminuye por procedimientos conocidos per se en la técnica
pero, tal como se describe anteriormente no es un requisito previo
para obtener los resultados deseados. En la composición de
celulasas de la presente invención, las proporciones entre los pesos
de los componentes CBH y EG no son cruciales. Es más importante que
la cantidad de componentes de tipo EGII de la composición esté más
o menos elevada significativamente sobre el nivel normal de una
composición de celulasas completa. Esto quiere decir que la
proporción de EGII debería ser al menos el 15 por ciento en peso del
peso total de la composición completa de proteínas de celulasas.
Más preferiblemente, la cantidad de EGII debería ser al menos
20-60 por ciento en peso, y lo más preferiblemente
al menos 25-40 por ciento en peso de la composición
de celulasas. Naturalmente, la composición de celulasas puede
comprender casi el 100 por ciento en peso de EGII del contenido
total en celulasas, pero en modo alguno es la realización preferida
y no se requiere necesariamente para obtener los resultados
deseados. El modo preferido de la presente invención es una
composición de celulasas de fondo natural completa con un contenido
en EGII elevado.
La actividad enzimática es un concepto que se
aplica para determinar las propiedades de las enzimas. Las
actividades enzimáticas que se usan en la presente solicitud de
patente son ECU, FPU y MUL, que se definen de la siguiente
manera:
La
endo-1,4-beta-glucanasa
de la muestra hidroliza el sustrato de hidroxietilcelulosa, y las
azúcares reductoras resultantes se analizan
espectrofotométricamente usando un reactivo de ácido
dinitrosalicílico (DNS). Una unidad de
endo-1,4-beta-glucanasa
se define como la cantidad de enzima que produce un nmol de azúcares
reductoras en un segundo (1 ECU = 1 nkat), (Bailey, M. y
Nevalainen, H., 1981).
La celulasa de la muestra hidroliza el papel de
filtro que se usa como sustrato y los azúcares reductores
resultantes se analizan espectrofotométricamente usando un reactivo
de DNS. La actividad de degradación del papel de filtro se describe
en unidades de FPU. El cálculo se basa en la definición de la Unidad
internacional (UI). 1 UI = 1 micromol min^{-1} de producto
formado (azúcares reductoras como la glucosa) (IUPAC, 1984).
La celobiohidrolasa (CBHI) y la endoglucanasa
(EGI) de la muestra hidrolizan el
4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido
que actúa como sustrato, liberando metilumbeliferona que puede
medirse espectrofotométricamente. El procedimiento puede aplicarse
para determinar la actividad de la celobiohidrolasa I (CBHI). El
procedimiento también mide la actividad de la endoglucanasa I
(EGI), cuya proporción puede determinarse inhibiendo la actividad de
la celobiohidrolasa usando celobiosa 5 mM. Una unidad MUL es la
cantidad de actividad enzimática que en un segundo en las
condiciones de determinación, libera 1 nmol de metilumbeliferona a
partir de
4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido
(van Tilbeurgh y cols., 1988).
\newpage
El tratamiento de materiales textiles que
contienen celulosa con la composición de celulasas de la presente
invención confiere un tacto suave, resistencia a la formación de
bolitas, suavidad y buen aspecto a los textiles. Las fibras que
contienen algodón tratadas con la composición de esta invención han
mantenido su estructura tan bien o mejor que las composiciones de
celulasas que comprenden composiciones de celulasas anteriores o
convencionales.
También ha sido posible mostrar que las
propiedades de resistencia de los materiales textiles que contienen
celulosa, es decir la resistencia al estallido, la resistencia a la
rotura y la resistencia al desgarro han seguido tan bien como en
los materiales textiles tratados con las composiciones de la técnica
anterior, incluyendo la composición de celulasa completa.
Debido a que el efecto deseado se obtiene con
tiempos de tratamiento más cortos, las propiedades de resistencia
pueden ser incluso mejores que con las composiciones de la técnica
anterior.
Los medios de tratamiento de los materiales
textiles que contienen celulosa con las composiciones que se
describen en la presente invención pueden contener, además de
enzimas, por ejemplo tensioactivos, polímeros tales como por
ejemplo polímeros de PVA y PVP, tampones como por ejemplo citratos,
acetatos y fosfatos para regular la acidez de las soluciones,
posiblemente agentes de carga, agentes conservantes convencionales,
estabilizantes y agentes abrasivos.
La dosis de los productos de celulasa de una
solución depende del resultado que se desee, de la aplicación, de
la actividad del producto de celulasa, etc. Las dosis de celulasa
adecuadas que se describen en la presente invención, corresponden a
las dosis de las celulasas líquidas comerciales habituales, como por
ejemplo Ecostone L, Ecostone L 20, Biotouch L (Primalco Ltd,
Biotec, Nurmijärvi, Finlandia). Las dosis adecuadas, por lo tanto
varían en el intervalo de 0,05 a 15 por ciento, más preferiblemente
del 0,5 al 6 por ciento del peso del material textil que se esté
tratando.
Las dosis de enzimas adecuadas para conferir un
tratamiento de bioacabado a materiales textiles dependen del
resultado que se desee, del procedimiento de tratamiento y de la
actividad del producto enzimático. Las dosis son de aproximadamente
0,05 a 10 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 5
por ciento del peso del material textil tratado, estas dosis
corresponden a las dosis de las celulasas líquidas comerciales
habituales, como por ejemplo Biotouch L, Biotouch C 601, Ecostone L
20 o Ecostone C 80 (Primalco Ltd, Biotec, Nurmijärvi,
Finlandia).
Para conferir un aspecto de lavado a la piedra a
tejidos vaqueros, las composiciones de celulasas de esta invención
pueden emplearse con éxito para sustituir el uso de piedra pómez. El
resultado es un aspecto de lavado a la piedra de alta calidad y
unas propiedades de resistencia esencialmente iguales o mejores que
las que se logran en las telas tratadas con medios de tratamiento
textil que no contienen cantidades elevadas de componentes
EGII.
Las dosis de enzimas adecuadas para conferir un
aspecto de lavado a la piedra a la tela dependen del resultado que
se desee, del procedimiento de tratamiento y de la actividad del
producto enzimático y son de aproximadamente 0,05 a 5 por ciento,
más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 2 por ciento del peso
de la tela tratada, correspondiendo estas dosis a las dosis de las
celulasas líquidas comerciales habituales, como por ejemplo
Ecostone L, Ecostone L 20, Ecostone L Plus (Primalco Ltd, Biotec,
Nurmijärvi, Finlandia).
El intervalo de pH para aplicar la composición
de celulasas de esta invención depende del perfil de pH de
actividad de la enzima. Cuando se emplean enzimas que trabajan a pH
ácidos, el pH del entorno de aplicación está preferiblemente en el
intervalo de 3,5 a 7, más preferiblemente en el intervalo de 4 a
5,5.
La composición de celulasas que contiene
cantidades considerables de endoglucanasas de tipo EGII de
Trichoderma, puede producirse por ejemplo mediante
fraccionamiento o mutación de la cepa de producción que se use o
mediante ingeniería genética. Del mismo modo puede prepararse una
composición de celulasas con cantidades elevadas de endoglucanasas
de tipo EGII. La forma más conveniente de producir un producto con
una mayor cantidad de proteína EGII es añadir copias del gen que
codifica la proteína EGII a la cepa de producción, por ejemplo a la
cepa de Trichoderma, tal como se describe en el Ejemplo 1. La
cepa de Trichoderma seleccionada u de otro organismo de
producción que se emplee puede ser una cepa de tipo silvestre, o una
cepa más adecuada para usar como organismo de producción
desarrollado a partir de la cepa de tipo silvestre mediante mutación
o ingeniería genética ulterior. En lo que respecta a Trichoderma
reesei, las cepas adecuadas incluyen, por ejemplo, la cepa
T. reesei QM6a silvestre y las cepas mutantes derivadas, por
ejemplo QM9414 y RutC-30, desarrolladas para la
producción de celulasas, y las cepas desarrolladas ulteriormente a
partir de estas, en las que por ejemplo se ha elevado más el nivel
de celulasa y/o hemicelulasa y/o en las que se ha reducido el nivel
de proteasas producidas. VTT-D-79125
y ALK02221 (una cepa mutante con un nivel bajo de producción de
proteasas) y sus derivados, como por ejemplo la cepa que
superproduce la enzima EGII, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 1, son ejemplos de cepas que se han desarrollado
ulteriormente. En dichas cepas uno o más genes que codifican CBH o
EG distintas de EGII pueden sustituirse por un gen que codifica
EGII.
A continuación se detalla una descripción
general de los procedimientos para insertar el gen que codifica la
proteína EGII, y del procedimiento para aumentar el nivel de
producción de la proteína EGII en Trichoderma reesei.
Aplicando el mismo procedimiento, es posible cambiar las
proporciones de las celulasas también en otras especies y, por
ejemplo, añadir copias de genes que codifican celulasa(s) de
tipo EGII de Trichoderma o sustituir algunos genes naturales
por genes que codifican celulasa(s) de tipo EGII de
Trichoderma.
El gen que codifica la proteína EGII (egl2;
Saloheimo y cols., 1988; en la publicación el gen egl2 se denomina
egl3, que es el nombre original del gen) puede insertarse en la cepa
de Trichoderma o por ejemplo, sustituir un gen que codifica
EGI (egl1; Penttil\ring{a} y cols., 1986), u otro gen que codifica
una proteína no necesaria o simplemente añadir el número de copias
mediante inserciones sin borrar nada. Cuando el gen eg12 sustituye,
por ejemplo al gen egll, la actividad de EGII de la mezcla de
enzimas producida por la cepa es mayor en la mezcla de enzimas
producida por las cepas de las que se ha eliminado el gen eg12 o del
que sólo existe una copia. Puede emplearse cualquier marcador
adecuado para Trichoderma como gen marcador, como por ejemplo
amdS (por ejemplo del plásmido p3SR2; Kelly y Hynes, 1985), hygB
(por ejemplo del plásmido pRLMex30; Mach y cols., 1994) y ble (por
ejemplo del plásmido pAN8-1, Mattern y Punt, 1988).
Para las cepas auxotróficas, el gen complementario para la
auxotrofía de que se trate también puede emplearse como
marcador.
El gen marcador seleccionado y el gen egl2, se
ligan entre las regiones flanqueantes en 5' y 3' del gen diana
formando un plásmido dirigido. Usando las regiones flanqueantes,
puede producirse una recombinación homóloga y los genes deseados
pueden dirigirse proporcionando un lugar para insertar un gen eg12.
El principio de la sustitución de genes es descrito por Suominen y
cols. (1993). Para que la frecuencia de la diana sea
satisfactoriamente elevada, las regiones flanqueantes deben ser lo
suficientemente largas, por ejemplo en Trichoderma de al
menos 1,5 kb de longitud; ejemplos de regiones flanqueantes
adecuadas para sustituir los genes de celulasa han sido descritos
por Suominen y cols. (1993). Las regiones flanqueantes necesarias
del gen de celulasa pueden aislarse de la genoteca de
Trichoderma.
Las cepas de fenotipos que superproducen EGII
pueden seleccionarse de entre los transformantes, por ejemplo,
analizando el medio de cultivo basándose en su mayor actividad de
endoglucanasa comparada con la cepa huésped (ECU activity, Bailey y
Nevalainen, 1981).
El nivel de producción de la proteína EGII puede
aumentarse en una cepa seleccionada, por ejemplo en la cepa de
Trichoderma reesei (anteriormente se han citado ejemplos de
cepas de T. reesei aplicables) mediante mutación o
aumentando el número de copias del gen egl2, tal como se describe en
el ejemplo 1A. Además del promotor cbhl, también pueden usarse
otros promotores, adecuados para la cepa seleccionada, para la
expresión del gen egl2. Como gen marcador en la transformación
puede usarse cualquier marcador adecuado para Trichoderma,
tal como se ha descrito anteriormente.
Las fuentes a las que se hace referencia en la
descripción anterior se recogen en el listado de referencias al
final de la memoria descriptiva.
Los siguientes ejemplos y figuras proporcionan
más detalles sobre la preparación de la composición de celulasas de
la presente invención, y sobre el efecto de la composición de
celulasas en las propiedades de los materiales textiles que
contienen celulosa.
Se construyeron cepas de Trichoderma
reesei que superproducen cada una de las principales celulasas
de Trichoderma: endoglucanasas I y II (EGI y EGII) y
celobiohidrolasas I y II (CBHI y II), para la producción de
diferentes preparaciones de celulasas.
En la construcción de la cepa de Trichoderma
reesei que sobreproduce EGII, se transformó la cepa progenitora
T. reesei VTT-D-79125 con el
casete de expresión del plásmido pALK537 (Fig. 1). En el casete,
EGII se expresa a partir del potente promotor cbh1. T.
reesei VTT-D-79125 es una cepa
mutante hipercelulolítica que contiene las principales celulasas de
Trichoderma (Nevalainen, 1985).
El plásmido pALK537 contiene:
* El promotor cbh1 (celobiohidrolasa 1) de T.
reesei de Trichoderma reesei
VTT-D-80133 (Teeri y cols., 1983).
En la construcción se usó el fragmento EcoRI - SaCII de 2,2 kb. La
secuencia de la zona del promotor que precede a ATG fue publicada
por Shoemaker y cols. (1983). Los últimos 15 nucleótidos del
promotor cbh1 de T. reesei L27 (el sitio SacII está
subrayado) son CCGCGGACTGGCATC (Shoemaker y cols., 1983). El
promotor cbhl de la cepa VTT-D 80133 de T.
reesei ha sido secuenciado en el laboratorio de Primalco Ltd. y
se ha observado una diferencia de un nucleótido en la secuencia del
ADN en la región mencionada anteriormente. En el T. reesei
VTT-D-80133 la secuencia que precede
a ATG es CCGCGGACTGCGCATC.
Se añadieron los nucleótidos que faltan del
promotor (10 pb desde después del SacII hasta ATG) y se realizó la
fusión exacta del promotor a la secuencia del ADNc de señal de egl2
(endoglucanasa 2) usando el procedimiento de la PCR (reacción en
cadena de la polimerasa). Se secuenciaron la fusión y el fragmento
de la PCR para asegurarse de que no se habían producido errores en
la reacción.
\newpage
* ADNc de eg12 (endoglucanasa 2, originariamente
denominada eg13) de T. reesei. La secuencia nucleotídica del
ADNc de egl2 se describe en Saloheimo y cols. (1988). En el plásmido
pALK537 se usó un fragmento de 1,4 kb (desde la secuencia de señal
al sitio EcoRI).
* Secuencia de terminación de cbh1 de T.
reesei VTT-D-80133 (Teeri y
cols., 1983). Se añadió el fragmento AvaII de 739 pb que se inicia
113 pb antes del codón de STOP del gen cbh1 después del ADNc de
egl2.
* Fragmento 3' de cbh1: El fragmento BamHI -
EcoRI de 1,4 kb se aisló de T. reesei ALK02466 (Suominen y
cols., 1993). El fragmento 3' puede usarse junto con el área del
promotor para dirigir el ADNc de eg12 al locus cbh1 mediante
recombinación homóloga.
* Gen amdS: El gen ha sido aislado de
Aspergillus nidulans y codifica acetamidasa (Hynes y
cols., 1983). La acetamidasa permite a la cepa crecer usando
acetamida como única fuente de nitrógeno y se ha usado esta
característica para seleccionar los transformantes. En el plásmido
pALK537 se usó el fragmento SpeI-XbaI de 3,1 kb del
plásmido p3SR2 (Kelly y Hynes, 1985).
Se usaron los procedimientos de ingeniería
genética estándar descritos por Maniatis y cols. (1982) en la
construcción de los vectores. Las enzimas de restricción, ADN
ligasa de T4, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y fosfatasa
alcalina de intestino de ternero que se usó en las manipulaciones de
ADN eran de Boehringer (Alemania) y New England Biolabs (EE. UU.).
Cada enzima se usó de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Se aisló el ADN plasmídico de E. coli usando las columnas
Qiagen (Diagen GmbH, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del
proveedor. Los fragmentos de ADN para clonar o las transformaciones
se aislaron de geles de agarosa con bajo punto de fusión (FMC
Bioproducts, EE. UU.) mediante el procedimiento de congelado y
descongelado en fenol (Benson, 1984). Los oligonucleótidos que se
usaron en las reacciones de PCR y en las reacciones de secuenciación
fueron sintetizados por ABI (Applied Biosystems, EE. UU.). La
secuenciación de la fusión se realizó mediante el secuenciador
automatizado (Applied Biosystems 373A, EE. UU.).
T. reesei
VTT-D-79125 se transformó con el
fragmento NotI lineal de 9,2 kb de pALK537 tal como describen
Penttilä y cols. (1987). Los transformantes de T. reesei se
transfirieron a un medio selectivo y se purificaron mediante
conidia. Los transformantes purificados se cultivaron en matraces
agitados en un medio que contenía suero de leche al 4%, fuente de
nitrógeno complejo derivado de grano al 1,5%, KH_{2}PO_{4} al
1,5% y (NH_{4})_{2}SO_{4} al 0,5%, a pH 5,5. Los
cultivos se cultivaron a 30ºC y 250 rpm durante 7 días. Se midió la
actividad contra hidroxietilcelulosa (HEC) en el medio de cultivo
de los transformantes. En el transformante ALK03529, la actividad
contra HEC (3400 ECU/ml) era aproximadamente de 3 veces comparada
con la cepa progenitora VTTD-79125 (1200 ECU/ml).
De acuerdo con el análisis de transferencia Southern, la cepa
ALK03529 tiene al menos dos copias en tándem del fragmento del
vector transformado que contiene el casete de expresión de egl2.
ECU: Una unidad de actividad de ECU
(endo-1,4-beta-glucanasa)
se define como la cantidad de enzima que produce un nmol de
azúcares reductoras como la glucosa en un segundo a partir del
sustrato hidroxietilcelulosa (HEC) 1 ECU = 1 nkat (Bailey, M.and
Nevalainen, 1981).
La construcción de la cepa de T. reesei
ALK02656 EGI que sobreproduce EGI, en la que se ha eliminado el gen
CBHI, se describe en Karhunen y cols. (1993).
Para la superproducción de EGI y EGII de T.
reesei sin CBHI y CBHII, se transformó el casete de expresión
del plásmido pALK540 (Fig. 2) en T. reesei ALK02698 (Karhunen
y cols., 1993). ALK02698 es una superproductora de EGI que no
contiene el gen cbh1. En el casete de pALK540, EGII se expresa a
partir del potente promotor cbh1.
El plásmido pALK540 contiene:
* El promotor cbh1 de T. reesei, la
secuencia de terminación y el ADNc de eg12 tal como se describe en
el ejemplo 1A.
* Gen ble. El gen ha sido aislado de
Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt y cols. 1990). El
gen confiere resistencia a bleomicina y los antibióticos
relacionados, bleomicina y talisomicina. La resistencia a bleomicina
se ha usado para seleccionar a los transformantes. En pALK540 se
usó el fragmento XbaI-B g12 de 3,3 kb del plásmido
pAN8-1 (Mattern y cols., 1987). El fragmento
contiene el gen de bleomicina (ble), flanqueado por las regiones
promotora gpdA de Aspergillus nidulans y de
terminación trpC.
* Fragmento 5' de cbh2 de T. reesei. El
fragmento se aisló de T. reesei cepa
VTT-D-80133 (Teeri y cols., 1987).
Se usó un fragmento XhoI - PvuII de 3,4 kb que se iniciaba 1,4 kb
aguas arriba del gen cbh2 para dirigir, junto con el fragmento 3'
de cbh2, el casete de expresión al locus cbh2.
\newpage
* Fragmento 3' de T. reesei. El fragmento
se aisló de T. reesei cepa
VTT-D-80133 (Teeri y cols., 1987).
Se usó un fragmento XbaI - BglII de 1,6 kb que se iniciaba 1,1 kb
aguas abajo del gen cbh2 para dirigir, junto con el fragmento 5' de
cbh2, el casete de expresión al locus cbh2.
Se usaron los mismos procedimientos que se
describen en el ejemplo 1A en la construcción de los vectores.
T. reesei ALK02698 se transformó con el
fragmento ClaI - PvuI de 11,6 kb de pALK540 tal como describen
Penttilä y cols. (1987). Los protoplastos transformados se
plaquearon sobre la superficie de las placas MnR estabilizadas
osmóticamente con sacarosa 0,44 M y se incubaron durante 6 horas a
30ºC, antes de la adición de 5 ml de MnR fundido a modo de
recubrimiento que contenía 300 mg/ml de bleomicina (Cayala,
Francia). Los transformantes se purificaron en medio MnR selectivo
suplementado con 50 mg/ml de bleomicina mediante una única espora
antes de transferir a cultivos inclinados de MnR que contenían 50
mg/ml de bleomicina durante tres generaciones y después de eso a
cultivos inclinados de PD. Los transformantes purificados se
cultivaron en placas de microvaloración para detectar la proteína
CBHII mediante transferencia Western con anticuerpo monoclonal
contra CBHII. ALK03528 era uno de los transformantes negativos para
CBHII y contiene una copia del casete de expresión eg12 en lugar de
cbh2 (transferencia Southern). El transformante ALK03528 se cultivó
como en el ejemplo 1A para medir la actividad contra HEC (ECU/ml)
del medio de cultivo. La actividad contra HEC había aumentado
aproximadamente 2 veces en la cepa ALK03528 comparada con la de la
cepa progenitora ALK02698 y 4 veces comparada con la de la cepa
VTT-D-79125 que es una cepa
progenitora de ALK02698.
La construcción de la cepa de T. reesei
ALK03760 que sobreproduce CBHI se describe en la publicación de la
solicitud de patente internacional WO 96/34945 que se incorpora por
la presente por referencia.
Para la superproducción del casete de expresión
de CBHII de T. reesei del plásmido pALK546 (Fig. 3) se
transformó T. reesei ALK02221 (cepa mutante de
VTT-D-79125 que posee un bajo nivel
de actividad de proteasas). En el casete de pALK546, CBHII se
expresa a partir del potente promotor cbh1.
El plásmido pALK546 contiene:
* El promotor cbh1, la secuencia de terminación
de T. reesei tal como se describe en el ejemplo 1A.
* Gen cbh2. El gen cbh2 era de la cepa
VTT-D-80133 de T. reesei
(Teeri y cols., 1987). El fragmento que contiene el gen cbh2 es de
aproximadamente 2,2 kb de longitud, 1,5 kb de las cuales son la zona
codificante.
* el gen ble, el promotor gpdA y la secuencia de
terminación trpC tal como se describe en el ejemplo 1C.
* El fragmento 5' de eg12 se aisló de la cepa
VTT-D-79125 de T. reesei y se
subclonó de un clon \lambda, originariamente denominado eg13,
aislado por Saloheimo y cols. (1988). pALK546 contiene el fragmento
XhoI - SacI de 1,4 kb, aproximadamente 2,2 kb aguas arriba del gen
eg12. Este fragmento puede usarse junto con el fragmento 3' de eg12
para dirigir el casete de expresión al locus eg12.
* El fragmento 3' de eg12. Se usó el fragmento
AvrII - SmaI de 1,6 kb a aproximadamente 0,2 kb del final del gen
eg12 en pALK546. El fragmento origina el mismo clon que el fragmento
5'.
Se construyó pALK546 de acuerdo con los ejemplos
1A y 1C.
T. reesei ALK02221 se transformó con el
fragmento EcoRI - BamHI de 1,8 kb de pALK546 de acuerdo con el
ejemplo 1C. Los transformantes purificados se cultivaron como en el
ejemplo 1A y se cuantificó la cantidad de celulasa CBHII segregada
mediante un procedimiento ELISA (Buehler, 1991) con anticuerpo
monoclonal contra CBHII. En el transformante ALK03798, la cantidad
de proteína CBHII aumentó 4 veces comparada con la cepa progenitora
ALK02221. De acuerdo con el análisis de transferencia Southern
ALK03798 contiene una copia del casete de expresión cbh2.
Para la superproducción de CBHI y CBHII de T.
reesei sin EGI y EGII, se transformó el casete de expresión del
plásmido pALK543 (Fig. 4) en el locus eg12 de T. reesei
ALK03761. ALK03761 es una cepa que sobreproduce CBHI y negativa
para EGI. La construcción de la cepa ALK03761 se describe en el
documento WO 96/34945, que se incorpora por la presente por
referencia, pero los transformantes negativos para EGI se cribaron
mediante transferencia Western con anticuerpo monoclonal contra
EGI. AL-K03761 contiene una copia del casete de
expresión en el locus egl1 y la cantidad segregada de la celulasa
CBHI aumentó con respecto a la cepa progenitora ALK02221. En el
casete de pALK543, cbh2 se expresa mediante su propio promotor.
\newpage
El plásmido pALK543 contiene:
* promotor cbh2, gen y la secuencia de
terminación de la cepa VTT-D-80133
de T. reesei (Teeri y cols., 1987). El fragmento SphI -
SacII de 4,7 kb que se usa en pALK543 contiene aproximadamente 1,5
kb de área codificante, aproximadamente 2,5 kb de región promotora
y aproximadamente 0,7 kb de la región de la secuencia de
terminación.
* el gen ble, el promotor gpdA y la secuencia de
terminación trpC tal como se describe en el ejemplo 1C.
* los fragmentos 5' y 3' de eg12 tal como se
describe en el ejemplo 1E.
Se construyó pALK543 de acuerdo con los ejemplos
1A y 1C.
T. reesei ALK03761 se transformó con el
fragmento BamHI de 11,2 kb de pALK543 y los transformantes se
cribaron de acuerdo con los ejemplos 1C y 1E. ALK04097 era uno de
los transformantes negativos para EGII y de acuerdo con el análisis
por transferencia Southern, contiene 1 copia del casete de expresión
cbh2 en el locus cbh2. En ALK04097, la cantidad de proteína CBHII
segregada aumentó 3 veces comparada con la cepa progenitora
ALK03761.
En este experimento se estudian los efectos de
lavado a la piedra de la preparación de celulasas derivada de la
cepa VTT-D-79125 de Trichoderma
reesei mediante la adición de diferentes celulasas purificadas
de Trichoderma: celulasas CBHI (celobiohidrolasa I), CBHII,
EGI (endoglucanasa I) y EGII.
VTT-D-79125 es una cepa mutante
hipercelulolítica de Trichoderma reesei, (Nevalainen,
1985).
Se realizó un prelavado de tela vaquera 10
minutos a 60ºC con Ecostone A 200 (1 ml/litro, Primalco Ltd, Biotec,
Finlandia). Después la tela se cortó en trozos de 12 x 12 cm. El
color de la tela se midió en términos de valores de reflectancia
con el sistema Chroma Meter 1000R L*a*b* Minolta (Osaka, Japón).
Los tratamientos con las celulasas se realizaron
en la LP-2 Launder-Ometer (Atlas,
Illinois, EE. UU.) de la forma siguiente. Se cargaron
aproximadamente 7 g de los trozos de tejido vaquero en el recipiente
de 1,2 litros que contenía 200 ml de tampón de citrato 0,05 M a pH
5. Se añadió una cantidad de bolas de acero a cada recipiente para
ayudar a eliminar el color. Se usó la preparación
VTT-D-79125 como unidad de
endoglucanasa (ECU/ml, ejemplo 1). Se usaron 300 ECU por g de tela
en cada prueba y se añadieron las celulasas CBHI, CBHII, EGI o EGII
purificadas a 1 ó 2 mg por g tela. Después se cerraron los
recipientes y se cargaron en un baño de
Launder-Ometer a 50ºC. La
Launder-Ometer se conectó a 42 rpm durante 1 y 2
horas.
Después de retirar los trozos de tela de los
recipientes, se sumergieron durante 10 minutos en 200 ml de NaOH
0,01 M y se enjuagaron durante 2 x 5 minutos con agua fría. Los
trozos de tela después se secaron durante 1 hora a 105ºC y se
secaron al aire toda la noche a temperatura ambiente. Se midió el
color de los dos lados de los trozos de tela con el Minolta Chroma
Meter. Los resultados de las mediciones del color de los tejidos
vaqueros tratados se muestran en la Tabla I. Las figuras 5 y 6
muestran el aumento de la claridad en el derecho de la tela después
de 1 y 2 horas de tratamiento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
* Preparación
VTT-D-79125 pura
De estos valores se ha restado el efecto del
tampón sobre los colores.
L: Unidad de claridad de la tela después del
tratamiento menos unidad de claridad de la tela antes del
tratamiento
b: Unidad de grado de azul de la tela después
del tratamiento menos unidad de grado de azul de la tela antes del
tratamiento
deltaE: Diferencia del color en el espacio de
color L*a*b* entre el color de la muestra y el color diana (diana=
tela vaquera sin tratar)
Los resultados muestran que la adición de
celulasa EGII a la preparación de
VTT-D-79125 aumentó la claridad
(efecto de lavado a la piedra) de los tejidos vaqueros en el mayor
grado comparado con la adición de otras celulasas purificadas. La
adición de CBHI o EGI mejoró el efecto de lavado a la piedra
comparado con la preparación de
VTT-D-79125 pura pero menos que con
EGII. Para obtener el mismo efecto de lavado a la piedra después de
1 hora de tratamiento era necesario doblar la cantidad de CBHI o EGI
comparada con la de EGII. La adición de CBHII proporcionó el mismo
efecto de lavado a la piedra que la preparación de
VTT-D-79125 pura.
En este ejemplo se estudian los efectos de
lavado a la piedra de preparaciones de celulasas derivadas de las
cepas de Trichoderma reeseis ALK03760, ALK03798, ALK0 4097,
ALK02656, ALK03529, ALK03528 y
VTT-D-79125 (ejemplo 1).
El procedimiento del experimento fue como el del
ejemplo 2. Se usaron 3 y 6 mg de proteína total de las preparaciones
de celulasas por g de tela en cada experimento. Los tiempos de
lavado fueron de 1 y 2 horas a 50ºC.
Los resultados de las mediciones de color se
muestran en la Tabla II.
NM = no medido
De estos valores se ha restado el efecto del
tampón sobre los colores.
L: Unidad de claridad de la tela después del
tratamiento menos unidad de claridad de la tela antes del
tratamiento
b: Unidad de grado de azul de la tela después
del tratamiento menos unidad de grado de azul de la tela antes del
tratamiento
deltaE: Diferencia del color en el espacio de
color L*a*b* entre el color de la muestra y el color diana (diana=
tela vaquera sin tratar)
Los resultados muestran que después de 1 hora de
tratamiento con una dosis de 3 mg/g el efecto de lavado a la piedra
medido en términos de unidades de claridad es casi igual con las
preparaciones de celulasas
VTT-D-79125, ALK03528, ALK03760,
ALK03529 y ALK03798. Con las preparaciones ALK04097 o ALK02656 no se
obtiene un aumento patente en unidades claridad. Con la dosis de 6
mg/g después de 1 hora de tratamiento, ALK03529 muestra el mayor
aumento en unidades de claridad comparada con las preparaciones
VTT-D-79125, ALK03528, ALK04097 o
ALK03760. Después de 2 horas de tratamiento con una dosis de 3
mg/g, el mejor efecto de lavado a la piedra medido en unidades de
claridad se obtiene con la preparación ALK03529.
Tela tejida de algodón 100% (obtenida de
Pirkanmaan Uusi Värjäämö Ltd, Finlandia) se sometió a tratamiento
con las preparaciones de celulasas
VTT-D-79125, ALK02656, ALK03529,
ALK03528, ALK03760, ALK03798, ALK04097 (ejemplo 1) en una
Launder-Ometer. Se usaron 20 g de tela prelavada sin
teñir en cada experimento. Las condiciones del tratamiento con
celulasas son las que se describen en el ejemplo 2, pero la
proporción de líquido (volumen de líquido por peso de tela) era de
1:15. Se usaron 2 y 6 mg de proteína total de las preparaciones de
celulasa por g de tela en cada experimento. El tiempo de lavado fue
de 1 hora a pH 5, 50ºC. Después de enjuagar con álcali y agua, las
telas tratadas se secaron en una secadora (Cylinda 7703,
Suecia).
Se usaron los siguientes procedimientos para
evaluar los efectos de los tratamientos de celulasa sobre las telas
de algodón: la pérdida de peso en las telas tratadas se definió en
términos del porcentaje en peso de la tela antes y después de la
prueba (antes de pesar, las telas se acondicionaron en una atmósfera
de 21+/-2ºC y 50+/-2% de HR). La pérdida de peso se usó para
describir la cantidad de pelusa eliminada de la superficie de la
tela.
La estimación del aspecto visual de las telas
tratadas con enzimas se realizó mediante un grupo de cinco personas.
Las telas se clasificaron puntuando de 1 a 5, donde 5 suponía una
superficie limpia sin pelusa ni bolitas y la textura de la tela era
más obvia. Un puntuación de 1 suponía muchas bolitas y pelusa.
Se usó el procedimiento de frotado de Martindale
(SFS-4328) para la evaluación de la formación de
bolitas. La formación de bolitas se evaluó puntuando de 1 a 5 con
un grupo de personas después de 200 ciclos de abrasión (1 = muchas
bolitas, 5 = ninguna bolita). Los resultados se muestran en la Tabla
III y en la Fig. 7.
Los resultados muestran que el mejor aspecto
visual y la mayor reducción de la tendencia a la formación de
bolitas se logran con la preparación de celulasas ALK03529 comparada
con las mismas dosis de diferentes preparaciones. También para
obtener el mismo nivel de eliminación de las bolitas (por ejemplo
4,3) se necesita ALK0 3529 en dosis considerablemente menores que
de las otras preparaciones.
Tela tejida de algodón 100% (obtenida de
Pirkanmaan Uusi Värjäämö Ltd, Finlandia) se sometió a tratamiento
con las preparaciones de celulasas
VTT-D-79125, ALK03760, ALK03798,
ALK02656, ALK03529 y ALK03528 (ejemplo 1) en una Gavazzi s.r.l.
Campiocolor mod. RD/1 (Italia). Se usaron aproximadamente 25 g de
tela prelavada sin teñir y 10 litros de agua en cada experimento a
pH 5. Las dosis de enzima eran de 6 y 12 mg de proteína total en
las preparaciones de celulasas por g de tela.
El tiempo de lavado fue de 1 hora a pH 5,
50ºC.
Para la evaluación de los efectos de los
tratamientos con las celulasas sobre las telas de algodón, se usaron
los mismos procedimientos que se describen en el ejemplo 4. La
resistencia a la tracción se midió de acuerdo con la norma SFS
3981. Los resultados se muestran en la Tabla VI.
El mejor aspecto visual y la mayor reducción de
la tendencia a la formación de bolitas se logró con la preparación
de celulasas ALK03529.
Tejido de punto de algodón 100% (obtenido de
Apropos Finland, Ltd, Finlandia) se sometió a tratamiento con las
preparaciones de celulasas
VTT-D-79125, ALK02656, ALK03529,
ALK03528, ALK03760, ALK03798 y ALK04097 (ejemplo 1) en una
Launder-Ometer. Se usaron 20 g de tela de punto sin
teñir en cada experimento y las condiciones del tratamiento con
celulasas son las que se describen en el ejemplo 2, pero la
proporción de líquido (volumen de líquido por peso de tela) era de
1:15. Se usaron 1, 2 y 4 mg de proteína total de las preparaciones
de celulasas por g de tela en cada experimento. El tiempo de lavado
fue de 1 hora a pH 5, 50ºC. Después de enjuagar con álcali y agua,
las telas de punto tratadas se secaron en una secadora.
Para la evaluación de los efectos de los
tratamientos con las celulasas sobre las telas de punto de algodón,
se usaron los mismos procedimientos que se describen en el ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que después de 1 hora de
tratamiento de media el aspecto visual mejor y casi igual se obtuvo
con las telas de punto tratadas con las celulasas ALK02656, ALK03529
o ALK03528. Sin embargo, de media, la mayor reducción de la
tendencia a la formación de bolitas se obtuvo con las telas de punto
tratadas con ALK03529.
Tejido de punto de algodón 100% (obtenido de
Apropos Finland, Ltd, Finlandia) se sometió a tratamiento con las
preparaciones de celulasas
VTT-D-79125, ALK02656, ALK03529,
ALK03528, ALK03760 y ALK03798 (ejemplo 1) en una Gavazzi s.r.l.
Campiocolor mod. RD/1 (Italia). Se usaron aproximadamente 230 g de
tejido de punto y 10 litros de agua en cada experimento a pH 5. La
dosis de enzima era de 6 mg de proteína total en las preparaciones
de celulasas por g de tela. El tiempo de lavado fue de 1 hora a
50ºC.
Para la evaluación de los efectos de los
tratamientos con las celulasas sobre las telas de punto de algodón,
se usaron los mismos procedimientos que se describen en el ejemplo
4.
Los resultados se muestran en la Tabla VI.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla VI se muestra que en el tratamiento
del punto de algodón, el mejor aspecto visual y la mayor reducción
de la tendencia a la formación de bolitas se lograron con la
preparación de celulasas ALK03529.
Tela tejida de algodón 100% (obtenida de
Pirkanmaan Uusi Värjäämö Ltd, Finlandia) se sometió a tratamiento
con las preparaciones de celulasas ALK03529, ALK03760 y ALK03798 en
una lavadora de tambor semiindustrial, Esteri 20
HS-P. Se usaron aproximadamente 1,5 kg de tela en
cada experimento. La carga de agua de la máquina era de
aproximadamente 100 litros. El pH se ajustó a 5, el tiempo de
tratamiento fue de 45 minutos a 50ºC. La dosis de enzima era de 6
mg de proteína total en las preparaciones de celulasas por g de
tela.
Después del tratamiento enzimático, las telas se
tiñeron con tres tintes reactivos diferentes Remazol (Bayer),
Levafix (Bayer) y Cibacron (Ciba) usando procedimientos de tinción
normales.
Los efectos de los tratamientos con celulasa
sobre las telas de algodón teñidas fueron evaluadis por el grupo de
personas según el aspecto visual. Los resultados se muestran en la
Tabla VII.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que el mejor aspecto
visual se obtuvo con ALK03529 en todas las telas.
Se usaron las preparaciones de celulasas
ALK03760, ALK03798, ALK04097, ALK03529, ALK02656 y
ALK03528 (ejemplo 1) en el control de las fibrillas y en el bioacabado de Tencel^{R} (lyocell) 100%. Antes del tratamiento enzimático, la tela se sometió a formación de fibrillas en una lavadora de tambor semiindustrial (Esteri 20 HS-P) con 2,5 g/l de carbonato sódico a 60ºC. Los tratamientos con celulasa se realizaron en una Gavazzi s.r.l. Campiocolor mod. RD/1 (Italia). Se usaron aproximadamente 70 g de tela sometida a la formación de fibrillas de punto y 10 litros de agua en cada experimento a pH 5. La dosis de enzima era de 6 mg de proteína total en las preparaciones de celulasas por g de tela. El tiempo de lavado fue de 2 horas a pH 5, 50ºC.
ALK03528 (ejemplo 1) en el control de las fibrillas y en el bioacabado de Tencel^{R} (lyocell) 100%. Antes del tratamiento enzimático, la tela se sometió a formación de fibrillas en una lavadora de tambor semiindustrial (Esteri 20 HS-P) con 2,5 g/l de carbonato sódico a 60ºC. Los tratamientos con celulasa se realizaron en una Gavazzi s.r.l. Campiocolor mod. RD/1 (Italia). Se usaron aproximadamente 70 g de tela sometida a la formación de fibrillas de punto y 10 litros de agua en cada experimento a pH 5. La dosis de enzima era de 6 mg de proteína total en las preparaciones de celulasas por g de tela. El tiempo de lavado fue de 2 horas a pH 5, 50ºC.
Para la evaluación de los efectos de los
tratamientos con celulasa en telas de Tencel^{R} se usaron los
siguientes procedimientos:
* La estimación del aspecto visual de las telas
tratadas con enzimas se realizó mediante un grupo de cinco
personas. Las telas se clasificaron puntuando de 1 a 5, donde 5
suponía una superficie limpia sin pelusa, fibrillas, ni bolitas. Un
puntuación de 1 suponía muchas bolitas, fibrillas y pelusa.
* Eliminación de las fibrillas (índice): Se
tomaron pelillos de la tela y se introdujeron en agua sobre un
porta. Esto se llevó al microscopio óptico y se observaron diez
áreas de los portas y se promediaron los resultados. Cuando menor
sea el índice de fibrillas, más eficaz es la enzima.
Los resultados se muestran en la Tabla VIII.
El índice de fibrillas es la media de dos
análisis.
El aspecto visual es la media del derecho y del
revés de las telas.
El mejor aspecto visual se obtuvo con ALK03529.
La eliminación de las fibrillas fue más eficaz con las preparaciones
ALK03760, ALK03528 y ALK03529.
Las referencias que se mencionan en la
descripción general y los ejemplos se enumeran a continuación:
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Claims (13)
1. Un procedimiento para tratar un material
textil que contiene celulosa con un medio de tratamiento que
comprende una composición de celulasas que confiere al material
textil que contiene celulosa propiedades mejoradas, que incluyen un
aspecto y tacto mejorados, menor tendencia a formar bolitas y
mantenimiento de la resistencia o aspecto de lavado a la piedra
mejorado, comparado con un medio completo, caracterizado
porque el material textil se trata con una composición de celulasas
que tiene un contenido en EGII elevado, siendo la composición de
celulasas un medio completo que contiene 45-80% de
CBHI, 10-25% de CBHII, 5-15% de EGI
y 8-15% de EGII, y a esta composición se añade EGII
para proporcionar el contenido en EGII elevado de al menos un 15 por
ciento en peso del peso total de proteínas de celulasa o una
composición de celulasas obtenida a partir de una cepa que
sobreproduce EGII, con lo que la composición de celulasas tiene una
proporción de EG:CBH de 0,6-1:1 y una proporción de
CBHI:EG de 1-1,4:1.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas comprende al menos 20-60 por ciento en
peso del tipo EGII de celulasa de la proteína celulásica total.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas comprende al menos 25-40 por ciento en
peso del tipo EGII de celulasa de la proteína celulásica total.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas puede obtenerse de hongos o bacterias.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas puede obtenerse de hongos de los géneros
Trichoderma, Penicillium, Humicola o
Fusarium.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas puede obtenerse de una especie de Trichoderma
reesei.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la composición de
celulasas puede obtenerse de una cepa de Trichoderma reesei
que superproduce EGII.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la proporción de fibra
celulósica en el material textil es al menos del 30 por ciento.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la proporción de fibra
celulósica en el material textil es al menos del 50 por ciento.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la fibra celulósica en
el material textil que contiene celulosa se selecciona a partir de
un grupo constituido por algodón, lino, ramio, yute, viscosa,
modal, lyocell y cupro.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la fibra celulósica
del material textil que contiene celulosa es algodón.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el material textil que
contiene celulosa es tejidos o prendas vaqueras.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el medio de
tratamiento comprende tensioactivos, polímeros, tampones, agentes
de carga, conservantes, estabilizantes y/o agentes abrasivos.
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