ES2289209T3 - Metodo y dispositivo para transferir sustancias medicamente activas a celulas. - Google Patents

Abstract

Un método para transferir sustancias médicamente activas en forma de moléculas a células vivas de ser humano, animales y/o plantas mediante cavitación provocada por energía acústica, y de hecho, in vitro como también ex vivo e in vivo, caracterizado porque mediante sensores adecuados se determina la vida útil de las burbujas de cavitación, que después a su vez sirve como criterio para controlar la intensidad acústica y por tanto la intensidad de la cavitación.

Description

Método y dispositivo para transferir sustancias médicamente activas a células.

La invención se refiere a un método y a un dispositivo para transferir sustancias médicamente activas (agentes) en forma de moléculas, como por ejemplo, ADN, a células de ser humano, animales y/o plantas mediante cavitación provocada por energía acústica, que se produce mediante la correspondiente intensidad de la energía acústica, y de hecho, tanto in vitro como también ex vivo e in vivo.

Un dispositivo correspondiente para la transferencia de moléculas a células de organismos humanos, animales y/o vegetales se describe y representa en la Solicitud PCT con el número de Publicación Internacional WO 01/48181 A2. El dispositivo dado a conocer mediante ese documento, que ya se ha limitado respecto a la amplia técnica antecedente correspondiente, que también se citó y describió en la publicación mencionada, se refiere a la transferencia de moléculas a células, en el que un medio en el que se encuentran las moléculas que se tienen que transferir y las células diana, se puede exponer en la zona del foco de una fuente de impulsos acústicos a estos impulsos acústicos.

La particularidad de este dispositivo consiste en que

- la fuente comprende una zona de foco lineal, en la que los pulsos acústicos sobrepasan una presión o presión negativa predeterminada y/o una intensidad predeterminada y

- se proporciona un dispositivo cilíndrico hueco en el que se introduce radialmente desde el exterior una pluralidad de impulsos acústicos equifásicos, en el que, en la zona alrededor del eje de rotación del cilindro hueco, se genera una zona reproducible de eventos de cavitación transitorios, y porque finalmente

- se prevé un dispositivo adicional, mediante el cual se puede realizar un movimiento relativo entre el medio y la zona focal.

Mediante cavitación, las células diana que se tienen que tratar se hacen permeables transitoriamente para las moléculas que se tienen que transferir de las sustancias activas médicas. Se tiene que tener en cuenta que la cavitación se tiene que controlar de la manera más eficaz posible, es decir, las células diana se tienen que hacer justo lo suficientemente permeables mediante la cavitación, es decir, de ningún modo se tienen que dañar por una modulación excesiva de la cavitación, sobre todo, no se tienen que dañar o incluso destruir permanentemente.

Por tanto, la invención tiene el objetivo de proponer un método y un dispositivo para controlar la cavitación, mediante los que se puedan realizar del modo más sencillo y fiable posible los objetivos que se han mencionado anteriormente.

Este objetivo se resuelve esencialmente porque, mediante sensores adecuados, sobre todo mediante sensores acústicos, se determina la vida útil de las burbujas de cavitación, que después sirve como criterio o como función para controlar la intensidad acústica, y por tanto, también la intensidad de la cavitación.

La invención se basa en el conocimiento considerable de que, respecto a las burbujas de cavitación, el tiempo entre su generación y su colapso es un indicador directo de la energía transformada en la burbuja de cavitación. Esto significa que con la determinación o la predeterminación de la vida útil de las burbujas de cavitación también se puede controlar de manera fiable la energía que se tiene que emplear para la respectiva transfección de células diana de forma óptima.

Para la solución práctica del objetivo de acuerdo con la invención se propone combinar o equipar el transductor acústico con sensores que puedan registrar las señales acústicas que se generan sobre todo durante la destrucción de las burbujas de cavitación, transferirlas a un dispositivo que las transforma en señales eléctricas, que a su vez permiten después deducciones directas de la actividad de cavitación.

A partir de la evaluación de las señales acústicas detectadas, además de la actividad de cavitación, también se puede determinar la vida útil de las burbujas de cavitación, el lugar de su generación, la posición de tubos de ensayo, etc.

Por lo demás, las señales detectadas en el marco de la invención también se pueden evaluar para la representación de imágenes a partir de las cuales se puede detectar el lugar exacto de las cavitaciones y las concentraciones acústicas, por ejemplos en una hoja de planta introducida, con lo que también se conoce la posición de las células transfectadas.

También es posible una regulación de la función de control y/o de la fuerza de la secuencia de los pulsos para optimizar el efecto al transferir células.

El desencadenamiento de las señales acústicas se realiza mediante un dispositivo de control, que, por ejemplo, también puede programar o emitir como preselección series, número de pulsos, etc., determinados.

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Mediante un sensor térmico proporcionado adicionalmente, el método de acuerdo con la invención se puede seguir optimizando de manera razonable. El sensor térmico permite la determinación exacta de la temperatura de ensayo, de manera que el líquido del entorno se puede atemperar o también se pueden ajustar los parámetros del pulso (frecuencia de la secuencia, longitud del pulso, amplitud), de manera que las células sensibles no se sobrecalienten.

De este modo también es posible mantener los artículos que se tienen que sonorizar en primer lugar en subenfriamiento, por ejemplo, con agua fría o similares, en un caso dado, incluso con nitrógeno líquido, y calentar solamente el sitio diana deseado mediante las señales acústicas de manera adecuada. También se puede generar una secuencia de señales adecuada, que, mediante superposición, provoca en primer lugar el calentamiento y en el momento adecuado desencadena las señales acústicas de transfección.

En un líquido con características conocidas, particularmente respecto al contenido de oxígeno, la viscosidad y la pureza, se pueden determinar de forma empírica los tiempos de colapso típicos de las burbujas de cavitación dependiendo de la intensidad del transductor acústico. Estos valores de medición se pueden usar después como valores iniciales en casos de aplicación práctica. En el caso opuesto también es posible formular afirmaciones mediante los tiempos de colapso determinados acerca del estado o la naturaleza de determinados líquidos. Por lo demás, se conoce que la cavitación en líquidos se puede dificultar o evitar mediante sobrepresión. También este conocimiento se puede tener en cuenta adicionalmente para controlar la cavitación.

En las Figuras se describen, mediante los dibujos, el método de acuerdo con la invención y los dispositivos para la realización del método mediante ejemplos de realización.

Se muestra:

En la Fig. 1, una representación gráfica de la evolución básica del radio de una burbuja de cavitación respecto al tiempo, y de hecho, desde su generación hasta su destrucción, con la que respectivamente se producen burbujas de cavitación cada vez menores en la secuencia.

En la Fig. 2, un dispositivo para la realización del método de acuerdo con la invención con un transductor acústico cilíndrico.

En la Fig. 3, el dispositivo de acuerdo con la Fig. 2 en otro estado de sonorización.

En la Fig. 4, un dispositivo para la realización del método de acuerdo con la invención con un transductor acústico con configuración con forma de bol.

En la Fig. 5, el dispositivo de acuerdo con la Fig. 4 en otro estado de sonorización.

En la Fig. 6, en la parte A, el desarrollo o la evolución de los radios relativos de las burbujas de cavitación respecto al tiempo; en la parte B se describe mediante un diagrama de presión/tiempo, cómo, al mismo tiempo que las burbujas de cavitación que están colapsando de acuerdo con la parte A, de forma correspondiente se liberan o se generan nuevas ondas de choque; la parte C muestra finalmente de forma esquemática, en qué tiempos se pueden recibir las señales de colapso en el lugar de los sensores.

En la Fig. 7, el tiempo de colapso como función del voltaje de control del transductor acústico en dos medios diferentes.

En la Fig. 8, un interruptor para el control de un transductor acústico.

De acuerdo con la Fig. 1 se produce una burbuja de cavitación en el momento t_{1}. Hasta su colapso en el momento t_{2}, su radio se corresponde a la evolución de la curva a a lo largo del tiempo t, donde en este documento se representa concretamente el radio relativo de las burbujas de cavitación r, respecto al radio R_{0} de la burbuja germinal como función del tiempo t. La generación de una burbuja de cavitación en el momento t_{1} sucede por la incidencia de la onda acústica sobre una burbuja germinal en el medio 2a (véase Fig. 2) o por sobrepasar el umbral de cavitación con la correspondiente intensidad acústica. La burbuja de cavitación generada en t_{1} colapsa de nuevo en el momento t_{2}. Se generan burbujas de cavitación cada vez menores con las evoluciones de curva b, c, d, etc. después de la respectiva burbuja que ha colapsado anteriormente, y de hecho, debido a su energía liberada respectivamente durante el colapso.

Básicamente, se puede determinar que cuando el radio de una burbuja de cavitación aumenta, también aumenta su vida útil. Dicho de otro modo, esto significa que las burbujas de cavitación con mayores radios y con correspondientemente mayor contenido de energía colapsan, de forma correspondiente a esto, más tarde. Por lo tanto, el tiempo de colapso es un indicador análogo de la energía transformada en la respectiva burbuja de cavitación.

En la Fig. 2 se muestra un transductor acústico 1a, que en su interior presenta una disposición homogénea, cilíndrica, a modo de ejemplo, una pluralidad de piezoelementos no representados de forma separada, cuyas líneas de fuerza se encuentran en la zona del eje central 7 del transductor acústico 1a. De este modo, el eje central 7 también forma al mismo tiempo la línea equidistante de una zona de foco lineal en el interior del espacio hueco cilíndrico 1b del transductor acústico 1a. Por lo tanto, durante la sonorización por el mismo se pueden generar, a lo largo de la zona de foco, burbujas de cavitación en el medio 2a. El medio 2a se puede encontrar directamente en el espacio hueco 1b o en tubo de ensayo que se puede introducir en el mismo. En el medio 2a se introducen células y/o moléculas 3 que se tienen que tratar, que en el marco de la invención se pueden exponer a una sonorización que se puede dosificar de manera especialmente exacta. Los tiempos de colapso de las burbujas de cavitación que se producen se registran por un sensor 4, que transmite sus señales a una unidad electrónica 5 para controlar el transductor acústico 1a.

El dispositivo de acuerdo con la Fig. 2 se encuentra en el estado no sonorizado. En el momento del colapso de una burbuja de cavitación, de forma correspondiente a la Fig. 3, se emite una señal acústica 6a, que, como también se puede observar en la Fig. 3, después del tiempo t_{2} + \Deltat alcanza un sensor 4, que la transmite para el procesado posterior a la unidad electrónica 5.

Mediante ensayos de laboratorio se puede comprobar que la zona de foco lineal con el eje central 7 tiene un diámetro de aproximadamente 2 mm. Como consecuencia de lo mismo, los recipientes, a modo de ejemplo, un tubo de ensayo de un plástico buen conductor acústico, por ejemplo, de poliuretano, en el que se encuentra el medio 2a con las células diana y/o moléculas 3 que se tienen que transferir, tienen un diámetro máximo de solamente 3-4 mm, para que durante una sonorización se detecte el máximo número de objetos diana. Esto último también se fomenta porque durante la sonorización por los mismos se genera un determinado arremolinamiento en el medio 2a.

El dispositivo de acuerdo con la Fig. 4 presenta un transductor acústico 8 con forma de bol, cuyas líneas de fuerza focalizan en la zona 9 con forma de punto. Cuando el medio 2b, de acuerdo con la Fig. 5, se somete a una sonorización durante la que se generan burbujas de cavitación, también en este caso las señales acústicas 6b emitidas por las burbujas de cavitación que colapsan, alcanzan después de un tiempo t_{2} + \Deltat el sensor 4. El transductor acústico 8 puede estar equipado en disposición homogénea con piezoelementos, o también se puede realizar en forma de un denominada EMSE de cúpula. También se puede concebir un transductor acústico magnetorestrictivo.

En la Fig. 6, la parte A muestra el radio relativo de las burbujas de cavitación r, respecto al radio de la burbuja germinal R_{0}, como función del tiempo t. Se puede partir de que los radios de las burbujas R_{0} son muy similares incluso después de pocos pulsos acústicos, y de este modo se consigue un tiempo de colapso bastante uniforme de todas las burbujas.

En el momento t_{1}, la burbuja se estimula por un impulso acústico, por ejemplo, una onda de choque, y por este motivo aumenta su radio. Por ello, el gas disuelto en el líquido y el vapor del líquido difunden a su interior. Después de un tiempo, que depende de las condiciones del entorno, por ejemplo, de la presión estática y de la viscosidad, como del impulso de estimulación, el radio de la burbuja disminuye con velocidad creciente y la burbuja colapsa en el momento t_{2}. En el momento del colapso t_{2}, la energía almacenada por una parte se libera en forma de una onda de choque. Esto se representa mediante la parte B de la Fig. 6 en el final de la burbuja a en el momento t_{2} como choque de presión p_{1}. La onda de choque generada de este modo se expande como onda esférica en el medio y alcanza en el momento t_{2} + \Deltat el sensor de medición. Éste se dispone a una distancia x del lugar del colapso esperado de la burbuja. Por tanto, las señales de colapso lo alcanzan después de un tiempo \Deltat = x/c, donde c es la velocidad acústica en el medio. Las señales de colapso en el lugar del sensor se representan en la parte C de la Fig. 6. Según la naturaleza del medio, la secuencia del aumento del radio y colapso se puede repetir varias veces, donde, de manera comparable a una pelota que bota, debido a efectos de amortiguación y pérdidas de radiación, cada vez hay menos energía disponible para la correspondiente burbuja, y por tanto, el radio y el tiempo hasta el siguiente colapso cada vez es menor. En un dispositivo con transductor focalizado de acuerdo con las Figuras 4 y 5, por norma los lugares de las cavitaciones se limitan a la zona focal de la fuente acústica y por tanto están aproximadamente a la misma distancia del sensor. De este modo se obtiene una señal acústica bastante corta.

En el caso del foco lineal de acuerdo con las Figuras 2 y 3 en la disposición del sensor en proximidad al eje, las señales de colapso de las burbujas llegarán en tiempos diferentes al sensor. En este caso se recibe una señal de colapso de mayor duración, similar a ruido. Es suficiente evaluar el momento del empleo de esta señal de acuerdo con la invención, ya que se espera que proceda de la burbuja más próxima al sensor, y porque la mayoría del resto de las burbujas se producen y se vuelven a destruir aproximadamente al mismo tiempo.

La siguiente descripción se refiere a una disposición con transductor acústico focalizado (distancia de foco 200 mm) de acuerdo con la Figura 4. El mismo transductor acústico que sirve para la generación de los impulsos acústicos que conducen a la cavitación también se usa para la recepción de las señales de cavitación.

Con ayuda de una sonda de alta tensión es posible seguir la evolución de la tensión en el piezotransductor. Ya que los piezoelementos también convierten de nuevo las señales acústicas recibidas a señales de tensión, se pueden recibir, por ejemplo, ecos de objetos en el campo acústico. Ya que el transductor focaliza de manera muy fuerte, se reproducen sobre todo ecos de la región de foco con gran amplitud. También es posible recibir las ondas de presión que se emiten de burbujas de cavitación que se están destruyendo particularmente en la zona focal.

Se analizó particularmente la señal ab 256 \mus después del desencadenamiento de los pulsos acústicos. Estos
256 \mus se corresponden con un radio de transductor de 195 mm y una velocidad acústica de 1523 m/s (a temperatura de agua de 35°C) exactamente al tramo recorrido desde la superficie del transductor al foco y de vuelta. 128 \mus después de su desencadenamiento, la señal acústica del transductor alcanza el foco. Si la señal se refleja en ese lugar por un obstáculo, alcanza de manera correspondiente después de otros 128 \mus de nuevo el transductor.

La secuencia temporal en agua se mide del siguiente modo:

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Si se sitúa un material de gel en el camino acústico (grosor 80 mm, velocidad acústica 1465 m/s, amortiguación 0,53 dB/cmMHz) entre el transductor y el foco, los tiempos de recorrido aumentan a 132 \mus, 264 \mus, 392 \mus, 528 \mus y 658 \mus. Una burbuja de cavitación se genera si la presión negativa sobrepasa la resistencia del agua a la rotura, lo que es el caso particularmente en el foco. En ese lugar se genera una burbuja, que, dependiendo de su tamaño, colapsa de nuevo después de un tiempo determinado. Se genera una onda de choque, el tamaño de la burbuja, y por tanto, el tiempo de colapso depende de la intensidad. El transductor acústico también recibe el colapso de la burbuja, y de hecho, 128 \mus después de forma correspondiente al tramo de recorrido desde el lugar de la generación al transductor.

En un ejemplo práctico se genera en agua una cavitación, lo que se puede demostrar mediante medición de las señales del transductor. En agua pura primero se encuentra la reflexión de la onda primaria en las burbujas que se están generando después de 262 \mus. Las amplitudes de las señales varían fuertemente, ya que la formación de burbujas es un fenómeno no lineal estadístico. Posteriormente llega, después de 340 \mus, al principio bastante débil, el eco de la superficie del agua separada 255 mm del cenit del transductor, después la señal de colapso (en el ejemplo después de 444 \mus) y después de 530 \mus una señal que se puede interpretar como eco de repetición entre la superficie del transductor y las burbujas de cavitación todavía existentes en el foco; el sonido generado en primer lugar por la burbuja llegó después de la reflexión en el transductor después de 393 \mus de nuevo al foco, donde la burbuja todavía existía (señal de colapso a 444 \mus llega 178 \mus después de la señal de generación).

El hecho de que la primera señal llegue después de 262 \mus indica que la generación de la cavitación se realizó exactamente en el foco geométrico de la estructura del transductor a 200 mm.

Con el colchón de gel en el camino acústico apenas se visualizan ecos de la superficie del agua, y también los ecos múltiples están muy amortiguados. Sin embargo, la señal del colapso de la burbuja todavía se puede detectar claramente. Frente al agua, por otra parte, la menor velocidad acústica en el gel es retardante.

La Figura 7 muestra el tiempo de colapso como función del voltaje de control del transductor, medido en dos medios diferentes de acuerdo con el método que se ha indicado anteriormente.

La Figura 8 muestra una conexión por bloques con un interruptor 11 para el control del transductor acústico, a modo de ejemplo, en forma de un circuito de impulsos. Un transductor acústico 12 comprende en su interior un sensor acústico 13 para las señales de colapso. Un circuito de evaluación 14 consiste esencialmente en un preamplificador y una compuerta de tiempo 14a y de un circuito de umbral 14b. Una conexión de disparo 15 sirve para el desencadenamiento de la señal de control para el transductor acústico.

Claims (6)

1. Un método para transferir sustancias médicamente activas en forma de moléculas a células vivas de ser humano, animales y/o plantas mediante cavitación provocada por energía acústica, y de hecho, in vitro como también ex vivo e in vivo, caracterizado porque mediante sensores adecuados se determina la vida útil de las burbujas de cavitación, que después a su vez sirve como criterio para controlar la intensidad acústica y por tanto la intensidad de la cavitación.

2. El dispositivo para la realización del método de acuerdo con la reivindicación 1, que se compone de un transductor acústico, de un medio para la transferencia acústica, en el que se encuentran las moléculas que se tienen que transferir y las células diana, y de hecho, en la zona focal del transductor acústico, en la que las células diana se pueden exponer a pulsos acústicos adecuados que generan la cavitación, caracterizado porque el transductor acústico (1a; 8) se une mediante sensores (4) con un componente electrónico (5) para la detección de los tiempos de colapso de las burbujas de cavitación y para controlar el transductor acústico (1a; 8) dependiendo de los tiempos de colapso.

3. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el transductor acústico (1a; 8) está equipado directamente con sensores acústicos.

4. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el transductor acústico (1a; 8) se configura de manera que puede funcionar, por conmutación manual y/o automática, como sensor.

5. El dispositivo de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el espacio hueco central (1b) del transductor acústico (1a) o un tubo de ensayo que se encuentra en el mismo tiene un diámetro máximo de entre 3 y 4 mm.

6. El dispositivo de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque el medio (2a, 2b), en el que se encuentran las células y moléculas que se tienen que tratar, está controlado mediante sensores térmicos, para, por un lado, evitar un sobrecalentamiento, y por otro lado, realizar la sonorización a la temperatura correcta o adecuada.