ES2287634T3 - Compuestos para hidrolizar acidos ribonucleicos (arn). - Google Patents

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Abstract

Un compuesto para hidrólisis de ácido nucleico, dicho compuesto tiene una estructura Oligo-Espaciador-Cortador En la cual El Oligo es un ácido ribonucleico de al menos 8 nucleótidos o imitación de éste, que es capaz de hibridizar a un ácido nucleico blanco de tal forma que el nucleótido terminal o imitación de éste hibridiza a un nucleótido al menos 4 nucleótidos y como más 8 alejados de la posición que va a ser hidrolizada, El Espaciador liga covalentemente el Cortador a dicho nucleótido terminal de dicho Oligo y comprende al menos 2 átomos en una cadena recta desde el Oligo al Cortador. El Cortador es una poliamina que tiene al menos 2 átomos de nitrógeno.

Description

Compuestos para hidrolizar ácidos ribonucleicos (ARN).
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con un método y compuestos para hidrolizar ácidos nucleicos, en particular éste se relaciona con compuestos que se pueden utilizar para la división preferencial de enlaces fosfodiéster en una posición específica en el ARN. La invención suministra así una herramienta útil para estudios que se relacionan con la ciencia de biología molecular, en el campo de la ingeniería de proteínas y en el campo médico, y en particular en vista de las estrategias contrasentido.
Antecedentes de la invención
La tecnología contrasentido está basada en el hallazgo de que la trascripción de ADN y/o ARN o la traducción se pueden modular utilizando un oligonucleótido que se une al ácido nucleico blanco. Tales oligonucleótidos contrasentido se entienden como nucleótidos que son complementarios a los ácidos nucleicos blancos ADN o ARN actuales y que tienen una secuencia orientada en la dirección opuesta. Cuando los oligonucleótidos naturales son utilizados en una estrategia contrasentido, es decir, los con bases naturales y estructura estándar, estos deben en general contener al menos 17 bases para activar efectivamente la actividad RNaseH y de esta manera tener un efecto de subregulación sobre la expresión del gen.
Como desarrollado en el campo, varias modificaciones de los oligonucleótidos se han propuesto los que los hacen más estables bajo las condiciones en que ellos son utilizados. En particular si los oligonucleótidos en contrasentido son introducidos en células intactas ellos son expuestos al ataque de nucleasas específicas de ARN y ADN que conducen a la pérdida de actividad. Las modificaciones para inhibir la degradación mediante nucleasas que han sido descritas son 2'-O-alquilo alquenilo(alilo) o alquinil nucleótidos, ácidos nucleicos asegurados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), fosforotioatos, morfolino, etc.
En otra dirección las ribonucleasas artificiales han atraído la atención por su uso potencial para manipulación genética. En particular las moléculas que dividen el ARN se han unido a los extremos terminales de los oligonucleótidos (ADN). Los oligonucleótidos se hibridizan como una secuencia específica en un ARN blanco seguido por la división del ARN en un sitio específico. A este respecto en particular la susceptibilidad de la unión fosfodiester entre la citosina y la adenosina (CA) a la hidrólisis por vía de la cooperación ácido-base intramolecular se ha explotado. La hidrólisis ocurre en el lado 3' del nucleótido citosina.
Komiyama et al. Reportó en J. Chem. Soc.,Chem, Común., 1995, 77-78 que un hibrido de dietilenotriamina (DETA) anclado a un extremo 5' de un 19 mer del ADN por medio de un ARN lineal hidrolizado con unión carbamato selectivamente en el extremo 3' de la citosina para dar enfriamiento a ARN 22 mer con un Terminal fosfato 3'. La decisión selectiva fue adscrita a una cooperación ácido-base intramolecular de un catión amonio y una amina neutra en la porción de etileno diamina {-N(CH_{2})_{2}NH_{2}} del adulto ADN-DETA. Solamente el 10% en molde ARN se hidrolizó después de la incubación a pH 8 durante 4 h a 50ºC.
También la JP 10 191970 describe una ribonucleasa artificial en donde el residuo de polietileno diamina (= cortador) está unido al sitio mediano del oligómero y está posicionado directamente adyacente a una posición que va a ser clivada en el ARN blanco.
En un intento para mejorar esto Verheijen describió un aducto de DETA con un 10 mer PNA (Angew, Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372). El PNA se seleccionó como el oligonucleótido porque este resiste la biodegradación y los PNA se unen más fuertemente al ARN (o ADN) que los oligonucleótidos naturales un oligómero de 10 PNA monómeros fue de longitud suficiente para hibridización. La porción de división de DETA se acopló al PNA por vía de la unión de urea. En el ARN blanco un sitio decisión adicional se introdujo mediante el reemplazo de guanosina para una citosina. De hecho el ARN blanco se hidrolizó en dos posiciones en la conversión total para la hidrólisis de ARN fue de aproximadamente 29% después de incubación a pH 7 durante 4 h a 40ºC (note que estas condiciones son mejor representación de las condiciones fisiológicas que aquellas empleadas por Komiyama).
La siguiente es una representación esquemática de estos documentos de la técnica anterior. Primero el complejo de ARN (30 mer) con ADN-DETA como se empleó por Komiyama et al, se describe seguido por el complejo de ARN (25 mer) con PNA-DETA de Verheijen. El DETA representa NH (CH_{2})_{2}NH(CH_{2})_{2})NH_{2}. Las unidades de nucleótido son escritas en letra mayúscula, las unidades de PNA en letra minúscula. La flecha marca la posición de división del ARN para hidrólisis mediante ADN-DETA o PNA-DETA. Note que la guanosina en el ARN de Komiyama es reemplazada en la posición 19 con una citosina en el ARN de Verheijen.
1
como ya se mencionó el ADN de Verheijen se hidroliza en dos posiciones, viz. En la otra esquina del C17 y C19. Después de 7 h de incubación, la proporción de ARN: PNA-DETA fue de 1: 33, aproximadamente 50% del ARN se hidrolizó: aproximadamente 15% en el lado 3' de C17 y aproximadamente 35% en el lado 3' De C19. Además Verheijen notó un producto de menor degradación que resulta de la decisión del lado 3' de U6. Esta decisión se adscribe al hecho de que el PNA-oligómero 10 mer corresponde a una vuelta de la hélice, que ubica en UN complejo ARN.PNA-ETA en residuo etilenodiamina en proximidad cercana a la unión fosfodiester entre U6 y
g7.
Otra técnica anterior relevante en este campo a considerar es Komiyama et al: "Molecular design of artificial hidrolytic nucleares and ribonucleases" in Nucleic Acids Symposium Series No. 29, 1993, 197-198. Este documento muestra que de dos enlaces fosfodiester posiblemente hidrolizables en un tARN blanco, el enlace más distante tres enlaces alejado del Terminal que hibridiza el nucleótido es más fácilmente hidrolizado que el enlace un nucleótido alejado de el nucleótido hibridizante Terminal. Se debe notar sin embargo que las nucleasas hidrolizantes artificiales de Komiyama et al son el resultado de los estudios de modulación molecular. Este enseña al experto que estas nucleasa son ya el resultado de la optimización de la posición de hibridización y la posición donde tiene lugar la
hidrólisis.
Las nucleasas de Komiyama han sido el punto de partida de Verheijen et al (ver anteriormente) y para Vlassov et al. ver Antisense Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7,39-42. Tanto Verheijen et al. como Vlassov et al. llegan a la misma conclusión que Komiyama de que las uniones fosfodieter hidrolizables más distantes son más fácilmente hidrolizadas. Vlassov et al sugiere que hay espacio para mejora de la hidrólisis o eficiencia de la división al optimizar la longitud y la rigidez de la estructura ligadora que une un grupo de división basado en poliamina a un oligonucleótido y optimizar el sitio de unión del ligador al oligonucleótido. No se sugiere variar adicionalmente la posición de hibridización del oligonucleótido a ARN blanco.
La presente invención tiene por objeto mejorar el estado de la técnica de los compuestos para hidrolizar ácidos nucleicos mediante una división mediada por poliamina al suministrar compuestos con eficiencia mejorada de hidrólisis de esa manera en particular incrementando la taza de la hidrólisis.
Resumen de la invención
Se ha encontrado que existe una relación entre la distancia de la porción de poliamina que es responsable por la hidrólisis de un ácido nucleico al oligonucleótido al cual está unida la poliamina y la posición donde el ácido nucleico es hidrolizado óptimamente. En lo sucesivo la porción poliamina que es la responsable de la hidrólisis es también denominada un Cortador. El oligonucleótido al cual el Cortador está unido es por lo tanto también acortado a Oligo. La distancia entre el Cortador y el Oligo se establece mediante un elemento de estructura covalentemente ligado los dos y posteriormente se denominará como un Espaciador. Más convenientemente la distancia establecida por el Espaciador se describe en términos del número de átomos desde el Oligo al Cortador. Los átomos que son contados son aquellos que forman una cadena recta desde el Oligo al Cortador. Los posibles sustituyentes o ramificaciones de tal cadena no contribuyen al número de átomos que está definido por el Espaciador.
De manera sorprendente la hidrólisis de un ARN sustrato del extremo 3' de la citosina en una secuencia citosina-Adenosina fue doblada comparada con los compuestos del estado de la técnica si están en relación con la posición proyectada que va a ser la complejación hidrolizada de los extremos de oligonucleótidos al menos 4 nucleótidos alejados, y la distancia entre la porción poliamina responsable por la hidrólisis y los oligonucleótidos es al menos 2 átomos en la cadena recta.
Así la invención se relaciona con un método para la hidrólisis de ácido ribonucleico en la cual un Oligo o imitante de este que es conjugado a un Cortador comprende al menos 2 átomos de nitrógeno, dichos 2 átomos de nitrógeno están involucrados en la hidrólisis de dicho ácido ribonucleico y existe un Espaciador que comprende al menos 2 átomos en una cadena recta que enlaza un nucleótido Terminal o se semeja a este a dicho Oligo y dicho Cortador, se hibridiza al menos 4 y como máximo 8 nucleótidos alejado de la posición proyectada que va a ser hidrolizada.
En un aspecto adicional la invención se relaciona con un compuesto para hidrólisis de ácido nucleico dicho compuesto tiene una estructura.
Oligo-Espaciador-Cortador
En la cual
El Oligo es un ácido ribonucleico de al menos 8 nucleótidos o un imitante de este, que es capaz de hidrolizar un ácido nucleico blanco de tal manera que el nucleótido térmico o imitante de este hibridiza a un nucleótido al menos 4 nucleótidos y como máximo 8 nucleótidos alejados de la posición que va a ser hidrolizada,
El Espaciador covalentemente liga al Cortador a dicho nucleótido terminal de dicho Oligo y comprende al menos 2 átomos en una cadena recta desde el Oligo al Cortador.
El Cortador es una poliamina que tiene al menos 2 átomos de nitrógeno.
Descripción detallada de la invención
En su búsqueda para métodos para modular eficiente y confiablemente la expresión de gen, los presentes inventores han investigado la posibilidad de hidrolizar selectivamente ácidos ribonucleicos blancos. En este aspecto se dirigió la atención a las nucleasas artificiales que actúan a través de división mediada por poliamina de uniones fosfodiester.
Aunque el sistema de la técnica anterior reportado por Verheijen (vide supra) después de incubación de 7 h hidrolizó una cantidad apreciable de aproximadamente 50% de un ácido nucleico blanco, después de 24 h de incubación solo el 85% del ácido nucleico blanco estaba hidrolizado. Además se nota que el ácido nucleico blanco contenía dos sitios de proyección para la hidrólisis y adicionalmente una tercer sitio de hidrólisis más accidental estaba presente. Así la eficiencia de la hidrólisis de estas nucleasas ratifícales de la técnica anterior dejan un lote para ser deseado, en particular con respecto a los ácidos nucleicos blanco que tienen 
\hbox{no tres o dos sino solamente un sitio
opcional para hidrólisis.}
Con base en los ácidos nucleicos blancos de la técnica anterior mencionados atrás las siguientes secuencias de ARN sintético se utilizaron:
2
La posición proyectada para la hidrólisis está subrayada. La hidrólisis ocurre en el extremo 3' de la citosina subrayada. Cuando el conteo del número de nucleótidos se aleja de la posición que va a ser hidrolizada está incluida la citosina o la adenosina, dependiendo en cual dirección, hacia el extremo 5' o 3' respectivamente, se hibridiza el Oligo. Así, en el ejemplo de la secuencia de ARN dada anteriormente, un Oligo del cual el nucleótido terminal o imitante de este hibridiza al menos 4 nucleótidos alejados de la posición que va ser hidrolizada, este nucleótido terminal hibridiza al primer uracilo (U13) en la dirección al extremo 5'. En la dirección al extremo 3' 4 nucleótidos alejados de la posición que va a ser hidrolizada es el uracilo en posición 22 (U22).
Para la hidrólisis de la posición proyectada en el ácido nucleico blanco dado anteriormente se utilizó etileno diamina como un Cortador. Para variar la longitud del Espaciador los residuos de lisina fueron infectados entre Oligo y el Cortador.
Los Oligos que hibridizaron dos y tres posiciones alejadas de la posición que va ser hidrolizada mostraron tasas similares de hidrólisis, sin importar la presencia de ninguno, uno o dos residuos de lisina en el Espaciador. La incubación en el pH 7 durante 7 h a 40ºC, con una proporción de ARN: Oligo-Espaciador-Cortador de 1:33 dio una hidrólisis modesta 10-20%. Después de incubación durante 24 h la hidrólisis varió entre 25-30%.
Sin embargo, un Oligo que hibridizó cuatro posiciones alejado de la posición que se hidroliza muestra una destacada mejora de la cantidad de ácido ribonucleoico objetivo que se hidroliza. En particular para un compuesto en el que el espaciador comprende 5 átomos la hidrólisis después de incubación pH 7 para 7 h a 40ºC, con una proporción de ARN:Oligo.Espaciador-Cortador de 1:33 es más del 50% y después de 24 h más de 95%.
El término "Oligo" utilizado aquí se refiere a un ácido ribonucleico o a un imitante de este. Este incluye derivados de ácido ribonucleico para hacer el oligo más estable bajo condiciones fisiológicas. Ejemplos de derivados adecuados son oligonucleótidos 2'-O-alquilo, alquenilo (alilo) o alquinilo, nucleótidos 2'-desoxi (ADN), y/o nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos 2'-O-metilo y 2'-O-alilo son los preferidos. Opcionalmente también o alternativamente el enlace fosfodiéster puede ser derivado, por ejemplo, como un fosfodiester O-alquilatado o preferiblemente un fosforotioato. Un Oligo que comprende imitante de nucleótidos se refiere a ácidos nucleicos asegurados que comprenden nucleótido (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), de morfolino etc.
Las bases adecuadas en el Oligo incluyen adenina, guaniuna, citosina, uracilo, timina, inosina, 2,6-diaminopurina, xantina, hipoxantina, y derivados adicionales de tales bases tal como alquilo, amino, aza y/o bases halo sustituidas o bases de aza. Las modificaciones adicionales de las bases pueden ser adecuadas también y son conocidas por aquellos expertos en la técnica.
El Oligo de acuerdo con esta invención tiene una longitud de al menos 8 nucleótidos o imitante de este. Usualmente para la hibridización suficiente una longitud de más de 25 nucleótidos (o imitante) no es necesaria. Una longitud de al menos 10 nucleótidos (o imitantes) es la preferida.
Un Oligo tiene dos posiciones donde posiblemente se puede unir un Espaciador. El Espaciador está unido al átomo 5'-O o 3'-O. En caso de que el Oligo comprenda un imitante de un nucleótido en cualquier extremo, el Espaciador está unido al átomo en el imitante del nucleótido que corresponde al átomo 5'-O o 3'-O.
El término "Espaciador" se utiliza aquí para definir una distancia entre el Oligo y el Cortador en término de número de átomos. El número de átomos es contado en una cadena recta desde el primer átomo que está unido al átomo 5'-O o 3'-O de un nucleótido terminal o un imitante de este en el Oligo al último átomo el cual el Cortador está acoplado. Los extremos Espaciadores en el primer átomo de nitrógeno del Cortador que está involucrado en la división de un enlace fosfodiester en un ARN a blanco. Los átomos en el Espaciador puede ser cualquier átomo adecuado conocido por la persona experta, preferiblemente los átomos en el Espaciador, pueden ser iguales o diferentes son seleccionados de C, O, S, N, y P.
El Espaciador se puede ramificar y/o los átomos en el Espaciador se pueden sustituir con grupos que tienen una funcionalidad. Tales sustituyentes pueden tener una funcionalidad para posibilitar la detección del compuesto de la invención, por ejemplo el Espaciador se puede sustituir con una marca fluorescente. Tales marcas son ampliamente conocidas. Alternativamente o adicionalmente el Espaciador se puede sustituir con un grupo que facilita el pasaje de la membrana celular. Tales grupos pueden ser grupos hidrófobos que interactúan fácilmente con la capa lípida de la membrana celular y/o pueden ser grupos que interactúan con receptotes p enzimas involucrados en el transporte a través de las membranas celulares.
Se debe entender que la porción Espaciador-Cortador por ejemplo completamente pueden consistir de polietileno amina. Como los primeros os átomos están unidos al nucleótido terminal o imitante de este en un Oligo son considerados por no estar involucrados en la hidrólisis del enlace fosfodiester y por lo tanto no son parte del Cortador.
El término "Cortador" como se utiliza aquí se refiere a una poliamina que tiene al menos dos átomos de nitrógeno. El Cortador comprende al menos un átomo de nitrógeno secundario o un átomo de nitrógeno terciario, opcionalmente el Cortador también comprende al menos un átomo de nitrógeno secundario o terciario adicional, preferiblemente el Cortador comprende al menos un átomo de nitrógeno primario adicional. La decisión mediada por poliamina de de los enlaces fosfodiesteres es un fenómeno bien conocido en la técnica y la persona experta será capaz de aplicar las porciones de Cortador adecuadas. Ejemplos de Cortadores adecuados son etileno diamina, dietileno triamina, tris(2-aminoetil)amina, etileno amina basada en dendrímeros, pentaeritril tetraamina, espermina, espermidina, compuestos diaza-, triaza-, o tetraazacicloalquilo, tal como por ejemplo piperazina, ciclen, tetraazaciclopentadecano, tetraazaciclotetradecano, tetraazaundecano, triazaciclononano, triazaciclododecano etc. y derivados de
estos.
En una modalidad, El Oligo en el compuesto de la invención comprende PNA como imitantes de nucleótido.
En otra modalidad el Oligo en el compuesto de la invención 2'-O-alquilo, preferiblemente metilo o alilo, fosforotioato como imitantes de nucleótido.
En una modalidad el compuesto de acuerdo con la invención es uno en donde dicho nucleótido o imitante terminal de este de dicho Oligo hibridiza cuatro posiciones alejadas de la posición que va ser hidrolizada y el número de átomos en la cadena recta del Oligo al Cortador es 4-6, preferiblemente 5.
Cuando el Oligo hibridiza más de 4 posiciones alejado de la posición proyectada a ser hidrolizada de un ácido ribonucleico se prefiere que el Espaciador se incremente en longitud. En una modalidad para cada posición más de 4 que el Oligo se hidrolizan alejados de la posición proyectada a ser hidrolizada el Espaciador se incrementa en el menos 6 átomos de longitud. Así para un Espaciador-Oligo que en el Cortador que hibridiza 5 átomos alejados de la posición proyectada a sido hidrolizada el Espaciador comprende preferiblemente al menos 8 átomos y el Oligo-Espaciador-Cortador que hibridiza 6 átomos alejado de la posición proyectada a ser hidrolizada el Espaciador comprende preferiblemente al menos 14 átomos, para un Oligo-Espaciador-Cortador que hibridiza 7 átomos alejado de la posición proyectada a ser hidrolizada el Espaciador comprende preferiblemente al menos 20 átomos, y para un Oligo-Espaciador-Cortador que hibridiza 8 átomos alejado de la posición proyectada a ser hidrolizada el Espaciador comprende preferiblemente al menos 26 átomos etc.
En una modalidad adicional el compuesto de acuerdo con la invención es uno en donde dicho nucleótido terminal o imitante de este de dicho Oligo hibridiza 5 posiciones alejado de la posición que va a ser hidrolizada y el número de átomos en la cadena recta del Oligo l Cortador es 10-12, preferiblemente 11.
En aún una modalidad adicional el compuesto de acuerdo con la invención es uno en donde dicho nucleótido terminal o imitante de este de dicho Oligo hibridiza 6 posiciones alejado de la posición que va ser hidrolizada y el número de átomos en la cadena recta del Oligo al Cortador es 16-18, preferiblemente 17.
En una modalidad adicional el compuesto de acuerdo con la invención es uno en donde dicho nucleótido terminal o imitante de este de dicho Oligo hibridiza 8 posiciones alejada de la posición que va ser hidrolizada y el número de átomos en una cadena recta del Oligo al Cortador es 22-24, preferiblemente 23.
En aún una modalidad adicional el compuesto de acuerdo con la invención es uno en donde dicho átomos de nucleótido terminal de este de dicho Oligo hibridiza 6 posiciones alejadas de la posición que va ser hidrolizada y la cantidad de átomos en la cadena recta del Oligo al Cortador es 28-30, preferiblemente 29.
La del limite superior de la posición de hibridización de nucleótido terminal o imitante de este alejado de la posición proyectada para ser hidrolizado es 8, preferiblemente 7, más preferiblemente 6. La longitud máxima del Espaciador es 30 átomos.
Los compuestos de esta invención se pueden sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente los compuestos son sintetizados utilizando procedimientos automatizados. Por ejemplo un Oligo de la longitud deseada y la composición se pueden preparar ordinariamente en un sintetizador de ADN/ARN. Es trabajo de rutina para la persona experta preparar el Espaciador-Cortador que comprende un Espaciador de una longitud deseada a la cual el Cortador deseada se acopla. Para un ejemplo ver por ejemplo Verheijen et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372) Tal parte del Espaciador-Cortador tiene una funcionalidad adecuada para acoplarse a un 3'-O o 5'-O (preferido) de un nucleótido o nucleósido terminal. Alternativamente es común practicar para la persona experta reemplazar un 5'-O con un 5'-N y unir un Espaciador -Cortador que tiene funcionalidad adecuada para acoplar a un nitrógeno, por ejemplo de acuerdo al método descrito por Komiyama que rediscutió anteriormente. Ver para los métodos adecuados J. Org. Chem. 2003, 14, 276-281. Alternativamente se puede utilizar un puente disulfuro que requiere la introducción de un 5'-S o por vía de acoplamiento de maleimida convencional. Alternativamente el método adecuado hace uso de la química de la fosforamidita para acoplar la parte Espaciadora-Cortadora a un nucleótido. Esto permite la incorporación de cualquier tipo de ribonucleótido (análogo) o imitación de éste en el compuesto de la invención, ver por ejemplo Bioconjugate Chem. 2002, 13 (5), 1071.
Un método adecuado para preparar un compuesto de la invención que comprende PNA como bloques que construyen nucleótido se describe en Verheijen que se discutió anteriormente.
La presente invención suministra compuestos útiles y métodos para una variedad de aplicaciones terapéuticas, diagnosticas, agrícolas, validación de blanco, descubrimiento genómico, ingeniería genética y farmacogenómica.
En un aspecto de la invención se relaciona con un método para hidrolizar ácido ribonucleico en una posición predeterminada en la cual el ácido ribonucleico blanco es puesto en contacto con un compuesto de acuerdo con la invención.
Los compuestos de la invención se pueden designar para inhibir la expresión de gen a través de dirigir una variedad de moléculas de ARN. En una modalidad, los compuestos de la invención son utilizados para apuntar varios ARN que corresponden al gen blanco. Ejemplos no limitantes de tales ARN incluyen ARN mensajero (mARN), variantes de empalme de ARN alternativo de gen(es) blanco, ARN posttranscripcionalmente modificados de gen(es) blanco, pre-mARN de gen(es) blanco. El empalme alternativo produce una familia de transcriptos que se distinguen mediante el uso de exones apropiados, la presente invención se puede utilizar para inhibir la expresión de gen a través de los exones apropiados para inhibir específicamente o para distinguir entre las función de los miembros de la familia de
gen.
Los compuestos de la invención se pueden utilizar como reactivos de diagnósticos, terapéuticos y de investigación y kits. Ellos se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas al agregar una cantidad efectiva de un compuesto de la invención a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. Ellos además se pueden utilizar para tratar organismos que tienen una enfermedad caracterizada por la producción indeseada de una proteína. El organismo se puede poner en contacto con un compuesto de la invención que tiene una secuencia que es capaz de hibridizar específicamente con una hebra de ácido nucleico blanco que codifica para la proteína indeseable. Así, para moldurar la expresión de gen, se prefiere que la porción de ARN que va a ser modulada sea preseleccionada para comprender esa porción de ARN que codifica para la proteína cuya formación va a ser modulada. Por lo tanto, el Oligo a ser empleado se designa para ser específicamente hibridizable a la porción preseleccionada del ARN blanco. En una modalidad el Oligo es aquel que se designa para unirse específicamente al mARN que codifica para la proteína cuyo producto va a ser modulado.
La formulación de las composiciones terapéuticas y su subsiguiente administración se cree que corresponde en aquella técnica. En general, para terapéuticos, un paciente necesitado de tal terapia se le administra un compuesto de acuerdo con la invención, comúnmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en dosis que varían desde 0.01 \mug a 100 g por kg de cuerpo dependiendo de la edad del paciente y la severidad del estado de enfermedad a ser tratado. Además, el tratamiento puede ser una dosis simple o puede ser un régimen que puede durar durante un periodo de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, su severidad y la condición total del paciente, y va a ser determinada por un practicante médico. En algunos casos puede ser más efectivo tratar un paciente con un compuesto de la invención en conjunto con otras modalidades terapéuticas tradicional.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en un número de formas dependiendo de si el tratamiento local o sistémico se desea y luego del área a ser tratada. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transervica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitorial o intramuscular o administración intratecal o intraventicular.
Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, geles, gotas, supositorios, pulverizados, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, de polvo o aceitosas, los espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Los condones recubiertos, guantes y similares también se pueden utilizar.
Las composiciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sacos o tabletas. Los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsificantes, ayudas de dispersión o ligadores pueden ser deseables.
Las composiciones para la administración intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que pueden también contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados.
Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados.
La presente invención se puede practicar en una variedad de organismos que varían desde procariótico unicelular y organismos eucarióticos a organismos eucarióticos multicelulares. Cualquier organismo que utilice la trascripción de ADN-ARN o la traducción de proteína de ARN como una parte fundamental de su maquinaria metabólica o celular hereditaria es susceptible a tales tratamientos terapéuticos y/o profilácticos. Con organismos aparentes diversos como bacterias, levaduras, protozoos, algas, plantas y formas de animales superiores, incluyendo animales de sangre caliente, se pueden tratar de esta manera. Además, en razón a que cada una de las células de las eucariotas multicelulares también incluyen tanto la trascripción de ADN-ARN, la traducción de ARN-proteína como una parte integral de su actividad celular, terapéuticas y/o diagnósticos se pueden practicar sobre tales poblaciones celulares. Adicionalmente, muchos de los organelos, por ejemplo, mitocondrias y cloroplastos, de las células eucarióticas, también incluyen mecanismos de trascripción y traducción. Como tales, las células simples, las poblaciones celulares o los organelos también se pueden incluir dentro de la definición de los organismos que son capaces de ser tratados con los compuestos terapéuticos o diagnósticos de la invención. Como se utiliza aquí, los terapéuticos significan o pretenden incluir tanto la erradicación de un estado de enfermedad, la muerte de un organismo, por ejemplo, bacterias, protozoos u otra infección o el control de un crecimiento o expresión celular aberrante o
indeseable.
Ejemplos
Ejemplo 1
Un bloque de construcción adecuado para ser utilizado en un sintetizador de ADN/ARN estándar automatizado se utiliza la fosforamidita descrita adelante. En la estructura de la izquierda por debajo del Ligador está la parte del Espaciador como se describió anteriormente y por lo tanto también se puede omitir de la estructura general presentada adelante. El PG representa un grupo protector, preferiblemente una base labil. El Ligador puede ser una porción de glicina y el PG puede ser Fmoc como se presenta en la estructura de adelante. La fosforamidita se puede incorporar en cualquier tipo de ARN (Oligo) o imitador de éste.
3
Después de la incorporación de la fosforamidita presente anteriormente en el cual el Espaciador tiene 10 átomos de incorporación en un Oligo se tiene la estructura representada delante a la izquierda. En este ejemplo el Espaciador tiene 10 átomos.
Por vía de ilustración el Oligo semeja 2'-O-metil fosforotioato el ARN y PNA están representados en la mitad y a la derecha respectivamente.
4
Como una alternativa se utiliza una porción Espaciadora-Cortadora que se puede ligar al terminal 5', ver adelante. La longitud Espaciadora en esta porción Espaciadora-Cortadora es variable. El ejemplo detallado de adelante del Espaciador tiene 4 y 10 átomos. Será clara la longitud Espaciadora que puede variar fácilmente.
5
Ejemplo 2
El ARN sintético (parte del tARN^{Phe} que tiene un punto de mutación: C-16 se reemplaza por G-16) utilizado para experimentos de división (subrayados: en lugar de división):
5' - UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G - 3'
Las siguientes secuencias PNA-cortadora fueron sintetizadas, donde el Gly representa glicina, n = 0 - 2 y el Cortador es:
6
El número (2), (3), (4), y (5) se refiere al número de posiciones que el Oligo hibridiza alejándose de la posición proyectada a ser hidrolizada. Cada una de las (2), (3), (4), y (5) variaron en la longitud Espaciadora que incorpora 0, 1 o 2 residuos Gly.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de PNA
Los PNA utilizados en este estudio fueron hechos mediante síntesis de fase sólida utilizando un sintetizador PNA (Perseptive Biosystem, Expedite^{TM} Nucleic Acid Síntesis System). Todos los solventes (Biosolve) se utilizaron como se recibieron. La síntesis de fase sólida se desarrollo sobre glóbulos de PEG-PS como soporte sólido con rink-amida como un ligador (carga: 0.17 \mumol\cdotmg^{-1}). El montaje de los PNA se estableció utilizando un protocolo estándar descrito en el manual del sintetizador, sobre una escala de 2 \mumol utilizando química Fmoc y monómeros en los cuales aminas exocíclicas fueron protegidas con Bhoc (Perseptive Biosystem). Los primeros acoplamientos fueron dobles. El Fmoc-Glicina y los bloques de construcción del Cortador protegidos con diBoc fueron acoplados al N-terminal (5') del PNA-oligómero mientras estaba en la bolsa de la resina, utilizando las posiciones disponibles en el sintetizador y el protocolo estándar para un acoplamiento doble. El bloque de construcción del Cortador protegido con DiBoc (HO_{2}CCH_{2}NBocCH_{2}CH_{2}NHBoc) se sintetizó mediante química orgánica de fase de solución directa y caracterizada completamente por su espectro de masa y espectro ^{1}H- y ^{13}C NMR.
Los oligómeros fueron divididos de la resina y desprotegidos completamente bajo condiciones ácidas (TFA/TIS/
H_{2}O, 9/1/1, v/v/v). La purificación RP-HPLC y el análisis fueron llevados a cabo sobre un sistema JASCO HPLC equipado con una columna Altima C18 (10 x 250 mm). El gradiente de dilución se desarrolló a 40ºC al construir un gradiente que parte con el amortiguador A 0.1% de TFA en agua) y aplicar el amortiguador B (0.1% TFA en acetonitrila/agua, 3/1, 3/v) con una tasa de flujo de 4 ml/min. Los PNA obtenidos fueron liofilizados y caracterizados mediante desorbsción / ionización láser asistida con matriz espectrometría de masa de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) y RP-HPLC).
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Experimentos de división
ARN marcado con ^{32}P 5' 25 mer fueron tratados con PNA-Cortador en un TRIS-amortiguador (10 mM, pH 7) que contiene NaCl (100 mM) y EDTA (0.1 mM) para dar las siguientes concentraciones [ARN] = 60 nM, [PNA-Cortador] = 2 \muM. Las muestras (70 \muL) fueron incubadas a 40ºC durante 7 o 24 h. Después de este tiempo el ARN se precipitó inmediatamente mediante la adición de NaOAc (3 M, pH 5, 7 \muL), EtOH (225 \muL) y 10 \mug/\muL tRNA (1 \muL). El ARN precipitado se recuperó mediante centrifugación, se secó y se redisolvió en agua (5 \muL) y amortiguador de carga (5 \muL). La soluciones fueron calentadas a 90ºC durante 1 minuto, centrifugadas y analizadas sobre un gel de electroforesis de poliacrilamina al 20% desnaturalizante que contiene (M de urea. Los controles utilizados fueron: ARN, escala con base en ARN y digestión T1 de ARN.
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Resultados
El ARN de control se hidrolizó en aproximadamente el 10% después de 7 y 24 horas de incubación. Para las series de compuesto (2) y (3) el ARN se hidrolizó a aproximadamente el 20% menos después de 7 horas de incubación y aproximadamente el 40% o menos después de 24 horas de incubación.
Solamente desde la serie de compuestos (4) el ARN se hidrolizó a una tasa razonable, viz. para N = 0, 1 y 2 el ARN se hidrolizó al menos aproximadamente el 30% después de 7 horas de incubación. Se obtuvo hidrólisis aproximadamente cuantitativa para el compuesto (4), n = 1 después de 24 horas de incubación.
La optimización con el compuesto (4), n = 1 reveló que después de 2 horas de incubación ya aproximadamente 50% del ARN se hidrolizó a una proporción de ARN/compuesto de la invención de 1:10. A una proporción de 1:40 después de 2 horas ya aproximadamente 75% estaba hidrolizado. Las proporciones de 1:10 y 1:20 después de 8 horas y 6 horas respectivamente el 75% o más del ARN estaba hidrolizado. Para la última proporción después de 24 horas de incubación se obtuvo una hidrólisis aproximadamente cuantitativa.
La hidrólisis óptima para la (5) series de compuestos inicia para n = 2
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Ejemplo 3
ARN sintético (parte de E. ColiAcpPmRNA) utilizado para experimentos de división (subrayado: en lugar de división):
5' - A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA- 3'
\newpage
Las siguientes secuencias de PNA Cortador se sintetizaron, en donde Gly representa glicina, y el Cortador es:
7
3'-H_{2}NCO-\ aaa\ ttc\ tca\ t - Cys(NHR)S-CH_{2}CO-Gly-NHCH_{2}CH_{2}-cortador
En donde R =
(A)Ac \hskip0,3cm o {}\hskip6,4cm
(B)CH_{2}NHCO(CH_{2})_{4}NH-Lys(PhePheLys)_{3} - NH_{2} \hskip0,3cm o
(C)CH_{2}(OCH_{2}CH_{2})_{2}NH-Lys(PhePheLys)_{3} - NH_{2} 
\hskip0,7cm
Note que los compuestos B y C comprenden el péptido Lys(PhePheLys)_{3} en el Espaciador para ayudar al compuesto a pasar la membrana celular.
Estudios de degradación de ARN in vitro
Todos los amortiguadores fueron hechos de agua Milli Q altamente purificada y se esterilizaron antes de uso. El ARN 25 mer radioactivamente y el conjugado a ser ensayado (a, B, C, como controles ARN ans C sin Cortador) fueron mezclados con un amortiguador Tris.HCL (10 mM, pH 7) que contiene NaCl (100 mM) y EDTa (0.1 mM) para dar las siguientes concentraciones. [ARN] = 60 nM, [Conjugados] = 2 \muM, como se determinó mediante las unidades A_{260}. Las muestras (70 \muM) fueron incubadas a 40ºC durante 16 h. Después de la incubación, el ARN fue inmediatamente precipitado mediante la adición de NaOAc 3 M (pH 5, 7 \muL9, EtOH (225 \muL) y 10 \mug \muL^{-1} tARN (1 \muL). El ARN precipitado se recuperó mediante centrifugación, se secó y luego se redisolvió en 5 \muL de H_{2}O y 5 \muL de amortiguador de carga. Las soluciones fueron calentadas a 80ºC durante 1 minuto, centrifugadas y analizadas sobre un gel de electroforesis desnaturalizante al 20%. El gel se expuso a una selección de fósforo (Molecular Dynamics) y la intensidad de los fragmentos de ARN se cuantificó al explorar la selección dispuesta sobre el sistema Personal Molecular Imager FX (Bio-Rad) seguido por análisis de computador con un software Quantity One
(Bio-Rad).
Resultados
Los compuestos A, B y C y los controles negativos fueron incubados con el ARN marcado con ^{32}P 25 mer que tiene una secuencia que semeja parte del E. Coli ACpP mARN. Después de 16 h a 40ºC y pH 7, los fragmentos de ARN se precipitaron, se aplicaron a un gel de electroforesis desnaturalizante al 20% y se cuantificaron.
Gratificantemente, la incubación del ARN con los conjugados B y C así como también el PNA-DETA A al que le falta el péptido, condujeron a la formación de los dos productos de degradación de ARN principales provenientes de la división de los sitios Ca y UA marcados. Los sitios de división se determinaron mediante comparación de la movilidad de las bandas con aquellos de un T1 digerido del ARN y una escala de hidrólisis básica. La intensidad de las manchas de fragmento revelaron que la incubación de un ARN con PNA-DETA A resultó en una división significativa (20%) del ARN comparado con los controles negativos (es decir el conjugado PNA-péptido sin el Cortador y el ARN sin ningún conjugado agregado) el cual solamente mostró división de transfondo de aproximadamente 3.5%. Una diferencia inesperada entre la eficiencia de la hidrólisis de los conjugados B y C se observó. El conjugado B mostró una eficiencia de división aun mejorada (30%) comparada con el control positivo 18 (20%), mientras el conjugado C dividió 10% del ARN blanco.
Ejemplo 4
Oligo que comprende Espaciador-Cortador en el terminal 3'
La resina comercialmente disponible que comprende un ligador Dde se utiliza para la síntesis PNA.
8
Partiendo de esta resina, una síntesis de PNA resistente resulta en el siguiente Oligo
3'-cortador-CH_{2}CH_{2}NH-(Gly)_{n}-CO-secuencia\ PNA-NHAc-5'
El Cortador aquí se define como:
9
El "CO" es el terminal 3' del PNA-oligo y el NHAc es el terminal 5'.
Para el Espaciador-Cortador en el terminal 3' del oligo basado en ADN/ARN se aplica la estrategia como se subrayo en el Ejemplo 1.

Claims (13)

1. Un compuesto para hidrólisis de ácido nucleico, dicho compuesto tiene una estructura
Oligo-Espaciador-Cortador
En la cual
El Oligo es un ácido ribonucleico de al menos 8 nucleótidos o imitación de éste, que es capaz de hibridizar a un ácido nucleico blanco de tal forma que el nucleótido terminal o imitación de éste hibridiza a un nucleótido al menos 4 nucleótidos y como más 8 alejados de la posición que va a ser hidrolizada,
El Espaciador liga covalentemente el Cortador a dicho nucleótido terminal de dicho Oligo y comprende al menos 2 átomos en una cadena recta desde el Oligo al Cortador.
El Cortador es una poliamina que tiene al menos 2 átomos de nitrógeno.
2. El compuesto de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual dicho Oligo comprende PNA como imitador de nucleótido.
3. El compuesto de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual dicho oligo comprende 2'-O-alquilo, preferiblemente metilo, fosfororioato como imitador de nucleótido.
4. El compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho Espaciador comprende uno o más aminoácidos, en particular glicina.
5. El compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho Espaciador se acopla a dicho Oligo por vía de una unión amida.
6. El compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho Cortador es etileno diamina.
7. El compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho nucleótido terminal o imitador de éste de dicho Oligo está 4 posiciones alejado de la posiciones que va a ser hidrolizada y el número de átomos en una cadena recta desde el oligo al Cortador es 4-6, preferiblemente 5.
8. El compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho nucleótido terminal o imitador de éste de dicho Oligo está 5 posiciones alejado de la posición que va a ser hidrolizada y el número de átomos en una cadena recta desde el Oligo al portador es de 10-12, preferiblemente 11.
9. Un método para el ácido ribonucleico hidrolizante in vitro a una posición predeterminada en la cual el ácido ribonucleico blanco se contacta con un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9 en el cual el ácido ribonucleico es ARN, en particular mARN.
11. La composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
12. Un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para uso como un medicamento.
13. Un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para uso como una herramienta de diagnóstico.
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