KR102644053B1 - 펩티드 올리고뉴클레오티드 콘주게이트 - Google Patents

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Abstract

올리고뉴클레오티드, 펩티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트가 본 명세서에 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 근육 질환, 바이러스성 감염, 또는 박테리아 감염을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

펩티드 올리고뉴클레오티드 콘주게이트
관련 출원
본원은 2015년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/163,960 및 2016년 5월 17일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/337,536에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
서열목록
본원은 컴퓨터 판독가능한 포맷인 서열목록과 함께 출원되어 진다. 본 서열목록은 4,227 바이트의 크기로 2016년 5월 13일 제작된 파일명 581432_SPT-001-2_sequence_listing_ST25.txt로 제공된다. 본 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 포맷의 정보는 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
안티센스 기술은 대안적인 스플라이스 생성물을 포함하여 1종 이상의 특정 유전자 생성물의 발현을 조절하는 수단을 제공하며, 그리고 수많은 치료제, 진단, 및 연구 분야에서 유일하게 유용하다. 안티센스 기술 후면의 원리는 표적 핵산에 하이브리드화하는 안티센스 화합물, 예를 들면 올리고뉴클레오티드가 수많은 안티센스 기전 중 임의의 하나를 통해 전사, 스플라이싱 또는 번역과 같은 유전자 발현 활성을 조절한다는 것이다. 안티센스 화합물의 서열 특이성은 이들을 표적 검증 및 유전자 작용화를 위한 도구뿐만 아니라 질병과 관여된 유전자의 발현을 선택적으로 조절하는 치료제로서 매력적으로 한다.
상당한 진전이 안티센스 기술의 분야에서 이루어졌었지만, 당해 기술에서는 개선된 안티센스 또는 항원 성능을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트에 대한 요구가 남아 있다. 이러한 개선된 안티센스 또는 항원 성능은 적어도, 예를 들면: 더 낮은 독성, 서열 선택성을 손상시키지 않으면서 DNA 및 RNA에 대한 보다 강한 친화도, 개선된 약동학 및 조직 분포, 개선된 세포 전달, 및 신뢰할 수 있고 통제가능 생체내 분포를 포함한다.
선행기술문헌
US 2014/0303238 A1
US 2011/0269665 A1
US 2002/0156235 A1
US 10,675,356 B2
US 11,097,011 B2
US 2002/0156235 A1
US 2011/0269665 A1
US 2013/0190390 A1
US 2014/0024821 A1
US 2014/0303238 A1
EP 2 623 507 A1
JP 2012-506703 A
JP 2014-513946 A
JP 2014-515762 A
JP 2015-501817 A
WO 2010/048586 A1
WO 2012/144906 A1
WO 2012/150960 A1
WO 2013/086441 A2
WO 2014/144978 A2
WO 2016/138534 A2
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펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트가 본 명세서에 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서의 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 일 측면에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00001
(I)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다,
일 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ia의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00002
(Ia)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ib의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00003
(Ib)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ic의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00004
(Ic)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Id의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00005
(Id)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ie의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00006
(Ie)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
또 다른 측면에서, 식 IV의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00007
(IV)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 측면에서, 식 IV의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00008
(V)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 대상체에서의 근육 질환, 바이러스성 감염, 또는 박테리아 감염을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
도 1은 유세포측정 실험에 기초하여 HeLa 세포 안으로 선택된 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 침투의 정도를 도시한다.
도 2a는 PPMO 5의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 2b는 PPMO 6의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 2c는 PPMO 8의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 2d는 PPMO 10의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 3a는 PPMO 5의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 3b는 PPMO 7의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 3c는 PPMO 9의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 3d는 PPMO 11의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준을 보여주는 웨스턴 블랏이다.
도 4a는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본)의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 4b는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 6의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 4c는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본)의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다.
도 4d는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 6의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 5a는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 8의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 5b는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 10의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 5c는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 8의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 5d는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 10의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 6a는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본)의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 6b는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 7의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 6c는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본)의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다.
도 6d는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 7의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 7a는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 9의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 7b는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 11의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 디스트로핀 수준의 정량화를 도시한다.
도 7c는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 9의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 7d는 PPMO 5 (동일한 검정의 2개 복제본) 또는 PPMO 11의 투여에 따른 마우스 사두근 조직에서 엑손23 스키핑 (%)의 정량화를 도시한다; 야생형 및 mdx 마우스가 대조군으로 사용되었다.
펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트가 본 명세서에 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드, 및 이에 의한 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 원상태 또는 비변형된 올리고뉴클레오티드에 비하여 서열 선택성을 손상시키지 않으면서 DNA 및 RNA에 대한 보다 강한 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 RNase H에 의한 절단을 최소화 또는 방지한다. 일부 구현예에서, 개시내용의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 활성화하지 않는다.
본 명세서에 기재된 펩티드는 이의 대응하는 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트에 더 낮은 독성을 부여하고, 올리고뉴클레오티드의 활성을 고양하고, 약동학 및 조직 분포를 개선하고, 세포 전달을 개선하고, 그리고 신뢰할 수 있으면서 통제가능 생체내 분포를 부여한다.
정의
본 개시내용을 기술하기 위해 사용된 다양한 용어들의 정의가 하기에 열거된다. 이들 정의는 특정한 경우에 달리 제한되지 않는 한, 개별적으로 또는 더 큰 그룹의 일부로, 본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같은 용어에 적용된다.
용어 "약"은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 것이며, 그것이 사용되는 맥락에 따라 어느 정도까지 변할 것이다. 양, 일시적 지속기간, 및 기타 동종의 것과 같 측정가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하기에 적절한 바와 같이, ± 5%, ± 1%, 및 ±0.1%를 포함하는, ±20% 또는 ±10%의 변동을 포괄하는 것으로 의미된다.
용어 "알킬"은, 특정 구현예에서, 각각 1 내지 6, 또는 1 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화된, 곧은- 또는 분지형-사슬 탄화수소 모이어티를 지칭한다. C1-6-알킬 모이어티의 예는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, n-헥실 모이어티을 포함하고; 그리고 C1 -8-알킬 모이어티의 예는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, n-헥실, 헵틸, 및 옥틸 모이어티를 포함한다.
알킬 치환체에서 탄소 원자의 수는 접두어 "Cx -y"에 의해 표시될 수 있고 여기서 x는 치환체에서 탄소 원자의 최소이고 및 y는 최대 수이다. 마찬가지로, Cx 사슬은 x 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬을 의미한다.
용어 "헤테로알킬"은 그것만으로 또는 또 다른 용어와 함께, 달리 언급되지 않는 한, 언급된 수의 탄소 원자 및 O, N, 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 1 또는 2 헤테로원자로 구성된 무변성인 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미하고 그리고 여기서 상기 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 사원화될 수 있다. 헤테로원자(들)는, 헤테로알킬기의 나머지와 헤테로알킬기의 가장 먼 원위 탄소 원자에 부착될 뿐만 아니라 부착된 단편 사이에 포함하는 헤테로알킬기의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 그 예는 하기를 포함한다: -O-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, 및 -CH2-CH2-S(=O)-CH3. 최대 2개의 헤테로원자는 예를 들면, -CH2-NH-OCH3, 또는 -CH2-CH2-S-S-CH3와 같이 연속적일 수 있다.
단독으로 또는 다른 용어들과 조합하여 이용된 용어 "아릴"은, 달리 언급되지 않는 한, 하나 이상의 고리 (전형적으로 1, 2 또는 3 고리)를 함유하는 탄소환형 방향족 시스템을 의미하고, 여기서 이러한 고리는 바이페닐과 같이 매달린 방식으로 함께 부착될 수 있거나, 또는 나프탈렌과 같이 융합되어 질 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 안트라실, 및 나프틸을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아릴기의 예는 페닐 (예를 들면, C6-아릴) 및 바이페닐 (예를 들면, C12-아릴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 내지 16 탄소 원자를 가진다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 내지 12 탄소 원자를 가진다 (예를 들면, C6-12-아릴). 일부 구현예에서, 아릴기는 6 탄소 원자를 가진다 (예를 들면, C6-아릴).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 방향족성을 갖는 복소환을 지칭한다. 헤테로아릴 치환체는 탄소 원자의 수에 의해 한정될 수 있는데, 예를 들면, C1-9-헤테로아릴은 헤테로원자의 수를 포함함이 없이 헤테로아릴기에 함유된 탄소 원자의 수를 나타낸다. 예를 들면, C1-9-헤테로아릴은 추가의 1 내지 4 헤테로원자를 포함할 것이다. 다환형 헤테로아릴은 부분적으로 포화된 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 헤테로아릴의 비-제한적인 예는 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐 (예를 들면, 2- 및 4-피리미디닐을 포함함), 피리다지닐, 티에닐, 퓨릴, 피롤릴 (예를 들면, 2-피롤릴을 포함함), 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴 (예를 들면, 3- 및 5-피라졸릴을 포함함), 이소티아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴 및 1,3,4-옥사디아졸릴을 포함한다.
다환형 복소환 및 헤테로아릴의 비-제한적인 예는 인돌릴 (예를 들면, 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-인돌릴을 포함함), 인돌리닐, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 이소퀴놀릴 (예를 들면, 1- 및 5-이소퀴놀릴을 포함함), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐 (예를 들면, 2- 및 5-퀴녹살리닐을 포함함), 퀴나졸리닐, 프탈라지닐, 1,8-나프티리디닐, 1,4-벤조디옥사닐, 쿠마린, 디하이드로쿠마린, 1,5-나프티리디닐, 벤조퓨릴 (예를 들면, 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-벤조퓨릴을 포함함), 2,3-디하이드로벤조퓨릴, 1,2-벤즈이속사졸릴, 벤조티에닐 (예를 들면, 3-, 4-, 5-, 6-, 및 7-벤조티에닐을 포함함), 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴 (예를 들면, 2-벤조티아졸릴 및 5-벤조티아졸릴을 포함함), 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴 (예를 들면, 2-벤즈이미다졸릴을 포함함), 벤조트리아졸릴, 티옥산티닐, 카바졸릴, 카볼리닐, 아크리디닐, 피롤리지디닐, 및 퀴놀리지디닐을 포함한다.
용어 "보호기" 또는 "화학 보호기"는 화합물의 일부 또는 모든 반응성 모이어티를 차단하고 그리고 이러한 모이어티는 보호기가 제거될 때까지 화학 반응에 참여하는 것이 방지되는 화학 모이어티를 지칭하고, 예를 들면, 이들 모이어티는 문헌 [T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. John Wiley & Sons (1999)]에 열거되고 기재된다. 상이한 보호기가 이용되는 경우, 각각의 (상이한) 보호기는 상이한 수단에 의해 제거가능한 것이 유리할 수 있다. 전적으로 다른 반응 조건하에서 분해되는 보호기는 그러한 보호기의 차별적인 제거를 허용한다. 예를 들면, 보호기는 산, 염기 및 수소화분해에 의해 제거될 수 있다. 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 아세탈 및 tert-부틸디메틸실릴과 같은 기는 산 불안정성이며, 수소화분해에 의해 제거가능한 Cbz 기로 보호된 아미노 기 및 염기 불안정성인 Fmoc 기의 존재에서 카복시 및 하이드록시 반응성 모이어티를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 카복실산 모이어티는 염기 불안정성기 예컨대, 비제한적으로, 메틸, 또는 에틸로 차단될 수 있고 그리고 하이드록시 반응성 모이어티는 산 및 염기 모두에 무변성이지만 가수분해적으로 제거가능한 카바메이트로 또는 산 불안정성 기 예컨대 tert-부틸 카바메이트로 차단된 아민의 존재에서 염기 불안정성기 예컨대 아세틸로 차단될 수 있다.
카복실산 및 하이드록실 반응성 모이어티는 또한 가수분해적으로 제거가능 보호기 예컨대 벤질기로 차단될 수 있는 반면, 아민기는 염기 불안정성기 예컨대 Fmoc로 차단될 수 있다. 식 (i)의 화합물의 합성을 위해 특별하게 유용한 아민 보호기는 트리플루오로아세트아미드이다. 카복실산 반응성 모이어티는 산화적으로-제거가능 보호기 예컨대 2,4-디메톡시벤질로 차단될 수 있는 반면, 함께 존재하는 아미노기는 플루오라이드 불안정성 실릴 카바메이트로 차단될 수 있다.
알릴 차단기는 산- 및 염기-보호기의 존재하에 유용한데, 이것은 전자는 무변성이고 그리고 그 뒤에 금속 또는 파이-산 촉매에 의해 제거될 수 있기 때문이다. 예를 들면, 알릴-차단된 카복실산은 산 불안정성 t-부틸 카바메이트 또는 염기-불안정성 아세테이트 아민 보호기의 존재하에 팔라듐(0)-촉매 반응으로 탈보호될 수 있다. 보호기의 또 다른 형태는 화합물 또는 중간체가 부착될 수 있는 수지이다. 잔류물이 수지에 부착되어있는 한, 그 작용기는 차단되어 반응할 수 없다. 일단 수지로부터 방출되면, 작용기는 반응할 수 있다.
용어 "핵염기", "염기 짝짓기 모이어티", "핵염기-짝짓기 모이어티", 또는 "염기"는 뉴클레오사이드, 뉴클레오티드, 및/또는 모폴리노 소단위의 복소환형 고리 부분을 지칭한다. 핵염기는 천연 발생일 수 있거나, 또는 이들 천연 발생 핵염기의 변형 또는 유사체일 수 있는데, 예를 들면, 핵염기의 1종 이상의 질소 원자는 각 경우에 독립적으로 탄소로 대체될 수 있다. 예시적인 유사체는 하이포잔틴 (뉴클레오사이드 이노신의 염기 구성요소); 2, 6-디아미노퓨린; 5-메틸 시토신; C5-프로피닐-변형된 피리미딘; 10-(9-(아미노에톡시)펜옥사지닐) (G-클램프) 및 기타 동종의 것을 포함한다.
염기 짝짓기 모이어티의 추가의 예는, 비제한적으로, 아실 보호기에 의해 보호된 이의 각각의 아미노기를 갖는 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 하이포잔틴, 2-플루오로우라실, 2-플루오로시토신, 5-브로모우라실, 5-아이오도우라실, 2,6-디아미노퓨린, 아자시토신, 피리미딘 유사체 예컨대 슈도이소시토신 및 슈도우라실 및 다른 변형된 핵염기 예컨대 8-치환된 퓨린, 잔틴, 또는 하이포잔틴 (후자 두 개는 천연 분해 생성물임)을 포함한다. 문헌 [Chiu and Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196] 및 문헌 [Revankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313]에 개시된 변형된 핵염기가 또한 고려되고, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
염기 짝짓기 모이어티의 추가의 예는, 비제한적으로, 1종 이상의 벤젠 고리가 첨가되어 진 팽창된-크기 핵염기를 포함한다. 문헌 [Glen Research catalog (www.glenresearch.com); Krueger AT et al., Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627]에 기재된 핵 염기 대체가 본 명세서에 기재된 올리고머의 합성에 유용한 것으로 고려되고, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다. 팽창된-크기 핵염기의 예는 아래에 도시된다:
용어들 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 복수의 연결된 뉴클레오사이드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오사이드와 뉴클레오티드 양자의 조합을 포함하는 화합물을 지칭한다. 본 명세서에서 제공된 특정한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 모폴리노 올리고뉴클레오티드이다.
어구 "모폴리노 올리고뉴클레오티드" 또는 "PMO"는 하나의 소단위의 모폴리노 질소를 인접한 소단위의 5'-고리외 탄소에 결합하는, 포스포르아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 연결기에 의해 함께 연결된 모폴리노 소단위를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 모폴리노 소단위는 표적 내의 핵염기에 핵염기-특이적 수소 결합함에 의해, 결합에 효과적인 핵염기-짝짓기 모이어티를 포함한다
용어들 "안티센스 올리고머", "안티센스 화합물" 및 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고 염기쌍 형성 모이어티을 각각 함유하는 소단위의 서열을 지칭하며, 염기쌍 형성 모이어티가 표적 서열 내에서 핵산:올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하도록 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 핵산 (전형적으로는 RNA) 내 표적 서열에 하이브리드되도록 하는 상호간소단위 연결기에 의해 연결된다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 (완벽한) 또는 거의 (충분한) 서열 상보성을 가질 수 있다; 올리고머의 말단 근처에서의 서열의 변화는 일반적으로 내부의 변형보다 바람직하다.
그와 같은 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 억제하거나 또는 천연 또는 비정상적 pre-mRNA 스플라이싱 처리를 억제/변경하도록 설계될 수 있으며, 이것이 하이브리드하는 표적 서열에 "지향" 또는 "표적화"된다고 할 수 있다. 표적 서열은 전형적으로 mRNA의 AUG 개시 코돈, 번역 억제 올리고머 또는 전-처리된 mRNA의 스플라이싱 부위, 스플라이싱 억제 올리고머 (SSO)를 포함하는 영역이다. 스플라이싱 부위에 대한 표적 서열은 전-처리된 mRNA에서 정상 스플라이싱 수용체 접합의 그 5' 말단의 1 내지 약 25 염기쌍 다운스트림을 갖는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 표적 서열은 스플라이싱 부위를 포함하거나 전적으로 엑손 코딩 서열 내에 함유되거나 또는 스플라이싱 수용체 또는 공여체 부위에 걸쳐있는 전-처리된 mRNA의 임의의 영역일 수 있다. 올리고머는 상기 기재된 방식으로 표적의 핵산에 대해 표적화될 때, 생물학적으로 관련된 표적, 예컨대 단백질, 바이러스, 또는 박테리아"에 대해 표적화"된다고 보다 일반적으로 알려져있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA는 각각의 분자에서 충분한 수의 상응하는 위치가 올리고뉴클레오티드와 표적 사이에서 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때 서로에 대해서 상보적이다. 따라서, "구체적으로 혼성화가능한" 및 "상보적"은 올리고뉴클레오티드와 표적 간에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 짝짓기를 나타내는데 사용되는 용어들이다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 구체적으로 혼성화가능할 수 있는 이의 표적 서열의 것에 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 당해 기술에서 이해된다. 올리고뉴클레오티드는 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 RNA의 정상 기능을 방해할 때 구체적으로 혼성화가능하며, 그리고, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에서, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처치의 경우에는 생리적 조건하에서, 그리고 시험관내 검정의 경우에는 검정이 수행되는 조건하에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (당해 기술에서 단순히 때로는 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형된 또는 치환된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 핵산에서 가장 통상적으로 발견되는 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 염기가 덜 공통적인 또는 비-천연 염기로 대체되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵염기는 퓨린 염기의 N9 원자 또는 피리미딘 염기의 N1 원자에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오사이드의 모폴린 고리에 공유결합된다.
퓨린 염기는 다음 일반 식에 의해 기재된 바와 같이, 이미다졸 고리에 융합된 피리미딘 고리를 포함한다:
퓨린
아데닌 및 구아닌은 핵산에서 가장 통상적으로 발견된 두 퓨린 핵염기이다. 이들은 비제한적으로 N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이포잔틴, 및 7-메틸구아닌을 포함하는 다른 천연 발생 퓨린으로 치환될 수 있다.
피리미딘 염기는 다음 일반 식에 의해 기재된 바와 같이, 6-원 피리미딘 고리를 포함한다:
피리미딘
시토신, 우라실, 및 티민은 핵산에서 가장 통상적으로 발견된 피리미딘 염기이다. 이들은 비제한적으로 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈도우라실, 및 4-티오우라실을 포함하는 다른 천연 발생 피리미딘으로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드는 우라실 대신에 티민 염기를 함유한다.
다른 변형된 또는 치환된 염기는, 비제한적으로, 2,6-디아미노퓨린, 오로트산, 아그마티딘, 라이시딘, 2-티오피리미딘 (예를 들면 2-티오우라실, 2-티오티민), G-클램프 및 이의 유도체, 5-치환된 피리미딘 (예를 들면 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈퍼 T), 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 슈퍼 G, 슈퍼 A, 및 N4-에틸시토신, 또는 이의 유도체; N2-사이클로펜틸구아닌 (cPent-G), N2-사이클로펜틸-2-아미노퓨린 (cPent-AP), 및 N2-프로필-2-아미노퓨린 (Pr-AP), 슈도우라실 또는 이의 유도체; 및 2,6-디플루오로톨루엔 같은 퇴화 또는 보편적인 염기, 또는 무염기성 부위 (예를 들면 1-데옥시리보스, 1,2-디데옥시리보스, l-데옥시-2-O-메틸리보오스; 또는 고리 산소가 질소로 대체되어 진 피롤리딘 유도체 (아자리보오스)) 같은 부재 염기를 포함한다. 슈도우라실은 우리딘에서와 같은 규칙적 N-글리코사이드보다는 C-글리코사이드를 갖는, 자연적으로 발생되는 우라실의 이성질체화된 버전이다.
특정의 변형된 또는 치환된 핵염기는 본 개시내용의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 다양한 구현예에서, 핵염기는 0.6-1.2℃만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀진 5-메틸시토신 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 또는 치환된 핵염기는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 정제를 용이하게 하는데 유용하다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 셋 또는 그 초과 (예를 들면 , 3, 4, 5, 6 또는 그 초과)의 연속적인 구아닌 염기를 함유할 수 있다. 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 3개 이상의 연속적인 구아닌 염기의 스트링은 올리고뉴클레오티드의 응집을 초래하여 정제를 복잡하게 한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 연속적인 구아닌 중 하나 이상은 하이포잔틴으로 치환될 수 있다. 3개 이상의 연속적인 구아닌 염기의 스트링에서 하나 이상의 구아닌에 대한 하이포잔틴의 치환은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 응집을 감소시킬 수 있고, 이로써 정제를 용이하게 한다.
본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 합성되고 생물학적 기원의 안티센스 조성물을 포함하지 않는다. 본 개시내용의 분자는 또한 섭취, 분포, 또는 흡수를 보조하기 위해, 예를 들면, 리포솜, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형, 또는 이들의 조합으로, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리는 연계되어 질 수 있다.
용어들 "상보적"및 "상보성"은 염기쌍 형성 규칙에 의해 관련된 올리고뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 예를 들면, 서열 "T-G-A (5'-3')"은 서열 "T-C-A (5'-3')"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있어, 핵산의 염기 중 일부만이 염기 짝짓기 규칙에 따라 매칭된다. 또는, 핵산 간의 "완전한", "전적인" 또는 "완벽한"(100%) 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 하이브리드화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다. 완벽한 상보성이 종종 요구되는 반면, 일부 구현예는 표적 RNA에 대해 하나 이상이지만 그러나 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 이러한 하이브리드화는 정확한 상보성뿐만 아니라 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성으로 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상보성으로 표적 서열에 하이브리드화할 수 있다. 올리고머 내의 임의의 위치에서 변동이 포함된다. 특정 구현예에서, 올리고머의 말단 근처에 서열에서의 변동이 내부에서의 변동보다 일반적으로 바람직하고, 그리고 만일 존재하면 5'-말단, 3'-말단, 또는 둘 모두 말단의 약 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 뉴클레오티드 내에서 전형적으로 된다.
용어 "펩티드"는 복수의 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 본 명세서에 제공된 펩티드는 세포 침투 펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
용어들 "세포 침투 펩티드" 및 "CPP"는 상호교환적으로 사용되고 양이온성 세포 침투 펩티드, 또한 소위 이동 펩티드, 캐리어 펩티드, 또는 펩티드 형질도입 도메인을 지칭한다. 본 명세서에 제공된 펩티드는 소정의 세포 배양 집단의 세포의 100% 내에서 세포 침투를 유도하는 능력을 가지고 전신 투여시 생체 내 다수의 조직 내에서 거대분자 전좌를 가능하게 한다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 CPP 구현예는 아래에 추가로 기재된 바와 같이 아르기닌-풍부 펩티드를 포함할 수 있다.
용어 "치료"는 질환의 완화를 위해 사용되는 하나 이상의 특정 절차의 적용을 지칭한다. 특정 구현예에서, 특정 절차는 1종 이상의 약제의 투여이다. 개체 (예를 들면 포유동물, 예컨대 인간) 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연스로운 경과를 변경하려는 시도에 사용되는 임의의 유형의 중재술이다. 치료는 비제한적으로, 약제학적 조성물의 투여를 포함하고, 예방적으로 또는 병리적 사건의 개시 또는 병인적 제제와의 접촉 후에 수행될 수 있다. 치료는 질환 또는 병태의 증상 또는 병리학에 대한 임의의 바람직한 효과를 포함하며, 예를 들면 치료되는 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정가능한 마커에서의 최소 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. 또한, 치료되는 질환 또는 병태의 진행 속도를 줄이거나, 그 질환 또는 병태의 발병을 지연시키거나, 또는 그 발병의 중증도를 줄이기 위해 지향될 수 있는 "예방적" 치료가 포함된다. "효과적인 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 요망된 치료 효과를 생성시키는 데 효과적인 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 포유동물 대상체에게 투여되는 치료 화합물, 예컨대 안티센스 올리고머의 양을 지칭한다.
용어 "완화"는 상태 또는 질환의 적어도 하나의 지표의 중증도를 줄이는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 완화는 상태 또는 질환의 하나 이상의 지표의 진행을 지연시키거나 느리게 하는 것을 포함한다. 지표의 중증도는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 주관적 또는 객관적 측정에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"은 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환함에 의해 모 올리고뉴클레오티드가 변형된 개시된 올리고뉴클레오티드의 유도체를 지칭한다. 적합한 염의 목록은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418] 및 문헌 [Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
펩티드- 올리고뉴클레오티드 - 콘주게이트
올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 증진하는, 1종 이상의 모이어티, 예컨대 세포 침투 펩티드에 화학적으로-연결된 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에 제공된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 더욱 증진하는, 1종 이상의 헤테로알킬 모이어티 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)에 추가로 화학적으로-연결될 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 아르기닌-풍부 폴리펩티드가 안티센스 화합물의 어느 하나의 말단, 또는 양 말단에 이의 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 공유결합된다.
따라서, 일 측면에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00012
(I)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공되고,
식 중:
A'는 -NHCH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,
및 으로부터 선택되고, 여기서
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 여기서 x는 3-10이고 그리고 각각의 알킬기는 독립적으로 각 경우에 C2-6-알킬이거나, 또는 R5는 -C(O)C1- 6알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1 -6-알킬)R6, -(C1 -6 헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6,-C(O)O-(C1-6 알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 으로부터 선택되고;
여기서 R6는 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, 또는 R6는 고형 지지체에 공유결합된 O, S, 또는 NH이고;
각각의 R1은 OH 및 -NR3R4로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 각 경우에 -C1-6 알킬이고;
각각의 R2는 H, 핵염기, 및 화학 보호기로 작용화된 핵염기로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택된 C3-6 복소환형 고리를 포함하고;
z는 8-40이고; 그리고
E'는 H, -C1-6 알킬, -C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸,
로부터 선택되고,
여기서
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고,
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2로, 여기서 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고, 및
R11은 OH 및 -NR3R4로부터 선택되고,
여기서 L은 아미드 결합에 의해 J의 카복시-말단에 공유결합되고, 그리고 L은 -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1- 6C(O)NH(CH2)1 -6C(O)-, 및 로부터 선택되고;
t는 4-9이고;
각각의 J는 독립적으로 각 경우에 구조 의 아미노산으로부터 선택되고,
식 중:
r 및 q 각각은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; 및
각각의 R9은 독립적으로 각 경우에 H, 아미노산 측쇄, 및 화학 보호기로 작용화된 아미노산 측쇄로부터 선택되고,
여기서 R9의 둘 이상의 아미노산 측쇄기는 독립적으로 각 경우에 황을 포함하고, 여기서 2개의 황 원자는, 이들이 부착되는 원자와 함께 구조 를 형성하고;
여기서 d는 0 또는 1이고, M은 다음으로부터 선택되고:
여기서 각각의 R10은 독립적으로 각 경우에 H 또는 할로겐이고; 및
G는 J의 아미노-말단에 공유결합되고 그리고 G는 H, C(O)C1- 6알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고, 그리고
여기서 하기 조건 중 적어도 하나는 사실이다:
1) A'는 이거나; 2) E'는 이거나; 또는 3) E'는 임.
일 구현예에서, E'는 H, -C1-6 알킬, -C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, A'는 이거나, E'는 이거나, 또는 E'는 인 것 중 단 하나이다.
또 다른 구현예에서, A'는 이거나 E'는 이다.
또 다른 구현예에서, A'는 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,
로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서 E'는 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 스테아로일, 및 로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, A'는 -N(C1 -6-알킬)CH2C(O)NH2, 으로부터 선택되고; 그리고
E'는 이다.
또 다른 구현예에서, A'는 이다.
또 다른 구현예에서, E'는 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, E'는 H 및 -C(O)CH3로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ia의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이다:
(Ia)
식 I 및 Ia의 일 구현예에서, R5는 -C(O)(O-알킬)xOH이고, 여기서 각각의 알킬 기는 독립적으로 각 경우에 대해 C2-6-알킬이다.
식 I 및 Ia의 또 다른 구현예에서, R5는 -C(O)(O-CH2CH2)3OH이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ib의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이다:
(Ib).
식 I 및 Ib의 일 구현예에서, E'는 H, C1-6 알킬, -C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
식 I 및 Ib의 또 다른 구현예에서, E'는 H 및 -C(O)CH3로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 일 구현예에서, 각각의 R10은 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 및 요오드로부터 선택된 할로겐이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R10은 불소이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, M은 또는 이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 두 아미노산 측쇄기는 독립적으로 각 경우에 시스테인 또는 호모시스테인 아미노산 측쇄기이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 J는 독립적으로 각 경우에 α-아미노산, β2-아미노산, 및 β3-아미노산으로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, r 및 q 각각은 0이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, J는 독립적으로 시스테인 및 아르기닌으로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 2개의 J기는 시스테인이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, z는 8-25이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, z는 15-25이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, z는 10-20이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 NR3R4이고, 여기서 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 각 경우에 C1 -3-알킬이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R1은 N(CH3)2이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R2는 핵염기이고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택된 C4 -6-복소환형 고리를 포함한다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R2는 핵염기이고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택된 C4 -6-복소환형 고리를 포함한다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R2는 독립적으로 각 경우에 아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 구아닌, 7-데아자-구아닌, 하이포잔틴, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포잔틴으로부터 선택된 핵염기이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, 각각의 R2는 독립적으로 각 경우에 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포잔틴으로부터 선택된 핵염기이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, L은 -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-, 및 로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, L은 글리신 및 로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, L은 글리신이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, G는 H 또는 -C(O)CH3이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, G는 -C(O)CH3이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, d는 1이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서, d는 0이다.
식 I, Ia, 및 Ib의 또 다른 구현예에서,
는
,
,
, 및 으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ic의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이다:
(Ic).
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Id의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이다:
(Id).
또 다른 구현예에서, 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 Ie의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이다:
(Ie).
또 다른 측면에서, 식 IV의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
(IV)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공되고,
식 중:
A'는 -NHCH2C(O)NH2, -N(C1 -6-알킬)CH2C(O)NH2,
및 으로부터 선택되고, 여기서
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 여기서 x는 3-10이고 그리고 각각의 알킬기는 독립적으로 각 경우에 C2 -6-알킬이거나, 또는 R5는 -C(O)C1- 6알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1 -6-알킬)R6, -(C1 -6 헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6,-C(O)O-(C1-6 알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및
으로부터 선택되고;
여기서 R6는 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, 또는 R6는 고형 지지체에 공유결합된 O, S, 또는 NH이고;
각각의 R1은 OH 및 -NR3R4로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 각 경우에 -C1 -6 알킬이고;
각각의 R2는 H, 핵염기, 및 화학 보호기로 작용화된 핵염기로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택된 C3 -6 복소환형 고리를 포함하고;
z는 8-40이고; 그리고
E'는 H, -C1 -6 알킬, -C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸,
로부터 선택되고,
여기서
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고,
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2로, 여기서 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고, 그리고 R11은 OH 및 -NR3R4로부터 선택되고,
여기서 L은 아미드 결합에 의해 J의 카복시-말단에 공유결합되고, 그리고 L은 -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1- 6C(O)NH(CH2)1 -6C(O)-, 및 로부터 선택되고;
t는 4-9이고;
각각의 J는 독립적으로 각 경우에 구조 의 아미노산으로부터 선택되고,
식 중:
r 및 q 각각은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; 및
각각의 R9은 독립적으로 각 경우에 H, 아미노산 측쇄, 및 화학 보호기로 작용화된 아미노산 측쇄로부터 선택되고,
여기서 R9의 둘 이상의 아미노산 측쇄기는 독립적으로 각 경우에 황을 포함하고, 여기서 2개의 황 원자는, 이들이 부착되는 원자와 함께 구조 를 형성하고; 그리고
G는 J의 아미노-말단에 공유결합되고 그리고 G는 H, C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고, 그리고
여기서 하기 조건 중 적어도 하나는 사실이다:
1) A'는 이거나; 2) E'는 이거나; 또는 3) E'는 임.
식 IV의 일 구현예에서, d는 1이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, E'는 H, -C(O)CH3, 및 로부터 선택된다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, A'는 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, 으로부터 선택되고; 그리고
E'는 이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, A'는 이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, E'는 H 및 -C(O)CH3로부터 선택된다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, M은 또는 이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, 각각의 J는 독립적으로 각 경우에 α-아미노산, β2-아미노산, 및 β3-아미노산으로부터 선택된다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, r 및 q 각각은 0이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, J는 독립적으로 시스테인 및 아르기닌으로부터 선택된다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, z는 15-25이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, z는 10-20이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, 각각의 R1은 N(CH3)2이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, 각각의 R2는 독립적으로 각 경우에 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포잔틴으로부터 선택된 핵염기이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, L은 글리신이다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
식 IV의 또 다른 구현예에서, G는 -C(O)CH3이다.
또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 표적에 서열 상보성을 갖는 표적화 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RNA 표적은 세포 RNA 표적이다. 또 다른 특정 구현예에서, 표적화 서열은 RNA 표적에 결합하기에 충분한 서열 상보성을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 표적화 서열은 RNA 표적에 완전한 서열 상보성을 갖는다.
본 개시내용의 대표적인 모이어티는 다른 것 중에서도 하기 식의 모이어티를 포함한다:
Figure 112017123844969-pct00068
Figure 112017123844969-pct00069
Figure 112017123844969-pct00070
Figure 112017123844969-pct00071
Figure 112017123844969-pct00072
Figure 112017123844969-pct00073
Figure 112017123844969-pct00074
및
Figure 112017123844969-pct00075
.
본 개시내용의 대표적인 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 다른 것 중에서도, 하기 구조의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트:
Figure 112017123844969-pct00076
Figure 112017123844969-pct00077
Figure 112017123844969-pct00078
Figure 112017123844969-pct00079
Figure 112017123844969-pct00080
Figure 112017123844969-pct00081
Figure 112017123844969-pct00082
Figure 112017123844969-pct00083
Figure 112017123844969-pct00084
Figure 112017123844969-pct00085
Figure 112017123844969-pct00086
Figure 112017123844969-pct00087
Figure 112017123844969-pct00088
Figure 112017123844969-pct00089
Figure 112017123844969-pct00090
Figure 112017123844969-pct00091
, 및
Figure 112017123844969-pct00092
, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 여기서
G는 H 및 -C(O)CH3으로부터 선택되고, 그리고
E'는 H 및 -C(O)CH3으로부터 선택된다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, G는 H이다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, G는 -C(O)CH3이다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, E'는 H이다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, E'는 -C(O)CH3이다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, E' 및 G는 -C(O)CH3이다.
본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 일 구현예에서, G는 -C(O)CH3이고 E'는 H이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 불용매화된다. 다른 구현예에서, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트 중 하나 이상은 용매화된 형태이다. 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 용매화물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물, 에탄올, 및 기타 동종의 것일 수 있다.
비록 식 I, Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 및 IV의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트가 이의 중성 형태로 묘사되지만, 일부 구현예에서, 이들 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 약제학적으로 허용가능한 염 형태로 사용된다.
올리고뉴클레오티드
모폴리노-기재 소단위의 중요한 특성은 하기를 포함한다: 1) 무변성인, 비하전된 또는 양으로 하전된 골격 연결기에 의해 올리고머성 형태로 연결되는 능력; 2) 형성된 폴리머가 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 10-15 염기)에서 약 45℃ 이상의 TM 값인, 표적 RNA를 포함하여 상보적-염기 표적 핵산과 하이브리드화될 수 있도록 뉴클레오티드 염기 (예를 들면 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실, 5-메틸-시토신 및 하이포잔틴)를 지지하는 능력; 3) 올리고뉴클레오티드가 포유동물 세포로 능동적으로 또는 수동적으로 수송되는 능력; 및 4) RNAse 및 RNase H 분해를 각각 저지하는 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드:RNA 헤테로듀플렉스의 능력.
올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 TM 및 세포 효소 절단에 대한 듀플렉스의 감수성의 함수이다. 상보적-서열 RNA에 대한 올리고머의 TM은 문헌 [Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108]에 기술된 것과 같은 또는 문헌 [Miyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligomer Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107]에서 기재된 바와 같은 종래의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 상보적-서열 RNA에 대하여 체온보다 더 큰, 일부 구현예에서 약 45℃ 또는 50℃보다 더 큰 결합 TM을 가질 수 있다. 범위에 있어서 TM은 60-80℃이거나 또는 그 초과가 포함된다. 공지된 원리에 따르면, 상보적-기재 RNA에 대한 올리고머의 TM은 듀플렉스에서 C:G 쌍으로 된 염기의 비율을 증가시키거나 헤테로듀플렉스의 길이 (염기쌍에서)를 증가시키거나 둘 모두에 의해 증가될 수 있다. 동시에, 세포 흡수를 최적화하기 위해, 올리고머의 크기를 제한하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 이유로, 본 개시내용의 화합물은 25 염기 이하의 길이에서 높은 TM (45-50℃ 이상)을 나타내는 화합물을 포함한다.
올리고뉴클레오티드의 길이는 이것이 pre-mRNA 분자 내의 의도된 위치에 선택적으로 결합할 수 있는 한 다양할 수 있다. 그러한 서열의 길이는 본 명세서에 기재된 선택 절차에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 8 뉴클레오티드 내지 길이가 최대 약 50 뉴클레오티드일 것이다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 (z)의 길이는 8-38, 8-25, 15-25, 17-21 또는 약 18일 수 있다. 그러나 이 범위 내의 임의의 길이의 뉴클레오티드가 본 명세서에서 기재된 방법에 사용될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 염기 변형 또는 치환을 함유한다. 예를 들면, 특정 핵-염기는 본 명세서에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가하기 위해 선택될 수 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하여, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃ 만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가하는 것으로 나타났고 본 명세서에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드 안으로 편입될 수 있다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종의 피리미딘 염기는 5-치환된 피리미딘 염기를 포함하고, 여기서 상기 피리미딘 염기는 시토신, 티민 및 우라실로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 5-치환된 피리미딘 염기는 5-메틸시토신이다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종의 퓨린 염기는 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기를 포함한다. 일 구현예에서, N-2, N-6 치환된 퓨린 염기는 2, 6-디아미노퓨린이다.
모폴리노-기재 올리고머 (안티센스 올리고머를 포함함)는, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,698,685; 5,217,866; 5,142,047; 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,521,063; 5,506,337 및 계류중인 미국 특허 출원 번호 12/271,036; 12/271,040; 및 PCT 공개 번호 WO/2009/064471 및 WO/2012/043730 그리고 문헌 [Summerton et al. 1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195]에 상세히 기술되고, 이것은 그 전문이 참고로 여기에 편입된다.
따라서, 일 측면에서, 식 II의 올리고뉴클레오티드:
Figure 112017123844969-pct00093
(II)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공되고,
여기서
A는 OH, -NHCH2C(O)NH2, -N(C1 -6-알킬)CH2C(O)NH2, 및
Figure 112017123844969-pct00094
로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 -C(O)(O-알킬)xOH이고, 여기서 x는 3-10이고 그리고 각각의 알킬기는 독립적으로 각 경우에 C2 -6-알킬이거나, 또는 R5는 -C(O)C1-6-알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -C1 -6-알킬-R6, -C1 -6 헤테로알킬-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6, -C(O)O-C1 -6 알킬-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6로 구성된 군으로부터 선택되고;
R6는 OH, SH, 및 NH2로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 R6는 고형 지지체에 공유결합된 O, S, 또는 NH이고;
각각의 R1은 독립적으로 OH 및 -NR3R4이고;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 각 경우에 -C1 -6-알킬이고;
각각의 R2는 H, 핵염기, 및 화학 보호기로 작용화된 핵염기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로 구성된 군으로부터 선택된 C3 -6 복소환형 고리를 포함하고;
z는 8-40이고;
E는 H, -C1 -6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸,
Figure 112017123844969-pct00095
및
Figure 112017123844969-pct00096
로 구성된 군으로부터 선택되고,
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고;
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2이고;
R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고;
R12는 -C(O)NHC1-6-알킬 또는 -C(O)OC1-6-알킬이고; 그리고
R13은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 및 트리메톡시트리틸로 구성된 군으로부터 선택된다.
식 II의 일 구현예에서, A는
Figure 112017123844969-pct00097
이고;
E는 H, -C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로 구성된 군으로부터 선택되고;
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 여기서 각각의 알킬기는 독립적으로 각 경우에 -C2-6-알킬, 트리틸, 및 4-메톡시트리틸이고; 그리고
각각의 R2는 독립적으로 핵염기이고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로 구성된 군으로부터 선택된 C4 -6 복소환형 고리를 포함한다.
식 II의 또 다른 구현예에서, R5는 C(O)(O-CH2CH2)3-OH이고; 그리고
각각의 R2는 독립적으로 핵염기이고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리미딘 또는 퓨린을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 식 II의 올리고뉴클레오티드는 식 IIa의 올리고뉴클레오티드이다:
Figure 112017123844969-pct00098
(IIa).
식 II 및 IIa의 일 구현예에서, R2는 독립적으로 각 경우에 아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 구아닌, 하이포잔틴, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포잔틴이고; 그리고
각각의 R1은 -N(CH3)2이다.
본 명세서에서 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 모이어티의 다양한 구현예가 표 1에 제공된다.
표 1: 뉴클레오티드 모이어티의 다양한 구현예.
Figure 112017123844969-pct00099
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드는 불용매화된다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 용매화된 형태로 된다. 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 용매화물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물, 에탄올, 및 기타 동종의 것일 수 있다.
비록 식 II 및 IIa의 올리고뉴클레오티드가 이의 중성 형태로 묘사되지만, 일부 구현예에서, 이들 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 염 형태로 사용된다.
펩티드
본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드는 CPP에 접합된 올리고뉴클레오티드 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, CPP는 세포안으로 화합물의 이송을 증진하기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드 이송 모이어티일 수 있다. 이송 모이어티는, 일부 구현예에서, 올리고머의 말단에 부착된다. 펩티드는, 그 사이의 모든 정수를 포함하여, 소정의 세포 배양 집단의 세포의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 내에서 세포 침투를 유도하는 능력을 가지고, 전신 투여시 생체 내 다수의 조직 내에서 거대분자 전좌를 가능하게 한다. 일 구현예에서, 세포-침투 펩티드는 아르기닌-풍부 펩티드 수송체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 CPP와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이의 링커로서 글리신을 이용할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같은 이송 모이어티는 부착된 이송 모이어티의 부재에서 올리고머의 흡수에 비교하여 부착된 올리고머의 세포 도입을 크게 증가하는 것으로 나타났다. 흡수는 비접합된 화합물에 비하여 적어도 열 배, 그리고 일부 구현예에서, 이십배 향상될 수 있다.
아르기닌-풍부 펩티드 수송체 (즉, 세포-침투 펩티드)의 사용은 본 개시내용을 실행하는데 특히 유용하다. 특정 펩티드 수송체는 근육 세포를 포함하는 1차 세포 안으로 안티센스 화합물의 전달에 아주 효과적인 것으로 나타났다. 더욱이, 다른 공지된 펩티드 수송체 예컨대 Penetratin 및 Tat 펩티드에 비교하여, 본 명세서에 기재된 펩티드 수송체는, 안티센스 PMO에 접합될 때, 몇 개의 유전자 전사체의 스플라이싱을 변경하는 향상된 능력을 입증한다.
따라서, 일 측면에서, 식 III의 펩티드:
Figure 112017123844969-pct00100
(III)
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공되고,
여기서
G는 H, C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 및 스테아로일로 구성된 군으로부터 선택되고;
각각의 J는 독립적으로 각 경우에 구조 의 아미노산으로부터 선택되고;
각각의 R9은 독립적으로 각 경우에 H, 아미노산 측쇄, 및 화학 보호기로 작용화된 아미노산 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고;
여기서 R9의 2종 이상의 아미노산 측쇄기는 독립적으로 각 경우에 티올 또는 화학 보호기로 작용화된 티올을 포함하고;
r 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
L은 -NH(CH2)1-6C(O)OH, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)OH,
Figure 112017123844969-pct00102
로 구성된 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 고형 지지체에 공유로-연결되고; 그리고
t는 4-9이다.
일 구현예에서, 각각의 2개의 아미노산 측쇄기가 독립적으로 황을 포함하는 2개의 아미노산 측쇄기는 이들이 부착되는 원자와 함께 구조
Figure 112017123844969-pct00103
를 형성하고
M은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되고
Figure 112017123844969-pct00104
Figure 112017123844969-pct00105
; 그리고
d는 0 또는 1이다.
또 다른 구현예에서, M은
Figure 112017123844969-pct00106
또는
Figure 112017123844969-pct00107
이다.
또 다른 구현예에서, 2개의 아미노산 측쇄기는 독립적으로 각 경우에 시스테인 또는 호모시스테인 아미노산 측쇄기이다.
또 다른 구현예에서, 각각의 J는 독립적으로 각 경우에 α-아미노산, β2-아미노산, 및 β3-아미노산으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, r 및 q 각각은 0이다.
또 다른 구현예에서, J는 독립적으로 시스테인 및 아르기닌으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 2개의 J기는 시스테인이다.
또 다른 구현예에서, L은 -NH(CH2)1-6C(O)OH 및
Figure 112017123844969-pct00108
으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, L은
Figure 112017123844969-pct00109
이다.
또 다른 구현예에서, L은 NHCH2C(O)OH이다.
또 다른 구현예에서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, G는 C(O)CH3 또는 스테아로일이다.
또 다른 구현예에서, G는 C(O)CH3이다.
또 다른 구현예에서, G는 J의 아미노-말단에 공유결합된다. 추가 구현예에서, L은 J의 카복시-말단에 아미드 결합에 의해 공유결합된다.
또 다른 구현예에서, d는 0이다.
또 다른 구현예에서, d는 1이다.
본 명세서에서 기재된 바와 같은 대표적인 펩티드는 표 2에 제공된다.
표 2: 예시적인 펩티드
Figure 112017123844969-pct00110
Figure 112017123844969-pct00111
Figure 112017123844969-pct00112
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 펩티드는 불용매화된다. 다른 구현예에서, 펩티드 중 하나 이상은 용매화된 형태이다. 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 용매화물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물, 에탄올, 및 기타 동종의 것일 수 있다.
비록 식 III의 펩티드가 이의 중성 형태로 묘사되었지만, 일부 구현예에서, 이들 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 염 형태로 사용된다.
일반적인 합성식
반응식 Ia: 펩티드의 스테이플링
Figure 112017123844969-pct00113
반응식 Ib: PMO의 3' 말단에 펩티드의 콘주게이션
Figure 112017123844969-pct00114
반응식 Ic: PMO의 5' 말단에 펩티드의 콘주게이션
Figure 112017123844969-pct00115
반응식 IIa: PMO의 3' 말단에 디설파이드 펩티드의 콘주게이션
Figure 112017123844969-pct00116
반응식 IIa의 공정은 유사한 조건하에서 PMO의 5' 말단에 펩티드의 콘주게이션에 적용가능하다 (반응식 Ic 참조).
반응식 IIb: 펩티드-PMO-콘주게이트의 스테이플링
Figure 112017123844969-pct00117
반응식 IIb의 공정은 유사한 조건하에서 PMO의 5' 말단에 펩티드의 콘주게이션에 적용가능하다.
반응식 IIIa: 펩티드와 PMO로 원-포트 콘주게이션 및 스테이플링
Figure 112017123844969-pct00118
반응식 IIIb: 펩티드와 PMO로 원-포트 콘주게이션 및 스테이플링
Figure 112017123844969-pct00119
방법
본 명세서에서는 식 I, Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 또는 V의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 근육 질환, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염을 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 일 측면에서, 본 명세서에서는 본 개시내용의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 근육 질환, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염을 치료하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 근육 질환은 뒤센 근육 이상증이다.
또 다른 구현예에서, 바이러스성 감염은 마르부르그 바이러스, 에볼라 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 및 뎅기열 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 야기된다.
또 다른 구현예에서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 의해 야기된다.
본 명세서에서 고려된 대상체는 전형적으로 인간이다. 그러나, 상기 대상체는 치료가 요망되는 임의의 포유동물일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 방법은 인간 및 수의과 적용 모두에 적용할 수 있다.
투여/용량
치료 조성물의 제형 및 이의 차후의 투약 (투여)는 당해 기술의 숙련가의 기술 내에 있다. 투여는, 며칠에서 몇 개월까지 지속되거나 또는 질환 상태의 충분한 감소가 달성될 때까지의 치료 과정으로, 치료되는 질환 상태의 중증도 및 반응성에 의존적이다. 최적의 투약 계획은 환자 몸의 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다.
통상적인 기술자는 최적의 복용량, 투여 방법론 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다. 최적의 복용량은 개별적인 올리고머의 상대적 효력에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 기초하여 추정될 수 있다. 일반적으로, 복용량은 0.01μg 내지 100g/체중 kg이고, 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 또는 2년 내지 20년마다 1회로 제공될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 체액 또는 조직 내에서 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여에 대한 반복률을 쉽게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후, 질환 상태의 재발을 방지하기 위해 환자에게 유지 요법을 실시하게 하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 상기 올리고머는 0.01μg 내지 100 g/체중 kg의 범위인 유지 용량으로 매일 1회 또는 그 초과에서 20년에 한 번으로 투여된다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 (식 II 또는 IIa의 올리고뉴클레오티드)는 단독 투여된다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 치료적으로 효과적인 양 또는 복용량으로 투여된다. "치료적으로 효과적인 양"은 환자에게 그것만으로 투여될 때 근육 질환, 바이러스성 감염 또는 박테리아 감염을 효과적으로 치료하는 식 II 또는 IIa의 올리고뉴클레오티드의 양이다. 특정한 대상체에 대해 주어진 사례에서 "치료적으로 효과적인 양"으로 입증된 양은 고려되는 질환 또는 병태에 대해 유사한 치료를 받은 대상체의 100%에게 효과적이지 않을 수 있지만, 그러한 복용량은 당업자에 의해 "치료적으로 효과적인 양"으로 간주된다. 치료적으로 효과적인 양에 해당하는 올리고뉴클레오티드의 양은 질환의 유형, 질환의 단계, 치료되는 환자의 나이 및 다른 사실에 강하게 의존한다.
상이한 구현예에서, 식 II 또는 IIa의 올리고뉴클레오티드 및 사용된 효과적인 양에 따라, 올리고뉴클레오티드는 근육 질환, 바이러스성 감염 또는 박테리아 감염과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
식 II 또는 IIa의 올리고뉴클레오티드의 양은 근육 질환, 바이러스성 감염, 또는 박테리아 감염의 효과적인 치료를 초래하여야 하는 반면, 그 양은 바람직하게는 환자에게 과도하게 독성이 없다 (즉, 양은 바람직하게는 의료 지침에 의해 확립된 독성 한계 이내임). 일부 구현예에서, 근육 질환, 바이러스성 감염, 또는 박테리아 감염의 과도한 독성을 방지하거나 보다 효과적인 치료 또는 둘 모두를 제공하기 위해, 총 투여된 복용량에 대한 제한이 제공된다. 전형적으로, 본 명세서에서 고려된 양은 1일당이다; 그러나 반나절 및 2-일 또는 3-일 주기도 또한 본 명세서에서 고려된다.
상이한 복용 요법이 근육 질환, 바이러스성 감염, 또는 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1일 복용량, 예컨대 상기에 기재된 임의의 예시적인 복용량이 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 1회, 2회, 3회, 또는 4회/1일 투여된다. 치료되는 질환의 상태 및 중증도에 의존하여, 보다 짧은 치료 시간 (예를 들면, 최대 5일)이 고복용량으로 이용될 수 있거나, 또는 더 긴 치료 시간 (예를 들면, 10 또는 그 초과 일, 또는 주, 또는 개월, 또는 그 이상)이 저복용량으로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1회- 또는 2회-1일 복용량이 하루 걸러 투여된다.
순수한 형태 또는 적절한 약제학적 조성물로, 식 II 및 IIa의 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태는 당해 기술에 공지된 임의의 허용된 투여 방식 또는 제제를 통해 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 경구로, 비강으로, 비경구로 (정맥내, 근육내, 또는 피하), 국소로, 경피로, 질내로, 방광내로, 대장내로, 또는 직장으로 투여될 수 있다. 복용 형태는, 정확한 복용량의 간단한 투여에 적합한 단위 투여 형태로, 예를 들면, 고형, 반-고형, 동결건조된 분말, 또는 액체 복용 형태, 예컨대 예를 들면, 정제, 알약, 연질 탄성 또는 경질 젤라틴 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 좌약, 에어로졸, 등일 수 있다. 특정한 투여 경로는, 특히 편리한 1일 복용량 요법이 치료될 질환의 중증도에 따라 조정될 수 있는 것인, 경구이다.
보조 및 아쥬반트 제제는 예를 들면 보존제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 향료, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 일반적으로 다양한 항균 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 및 기타 동종의 것에 의해 제공된다. 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨, 및 기타 동종의 것이 또한 포함될 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다. 보조제는 또한 습윤제, 유화제, pH 완충제, 및 산화 방지제, 예컨대, 예를 들면, 시트르산, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 및 기타 동종의 것을 포함할 수 있다.
고형 복용 형태는 코팅물 및 쉘, 예컨대 장용 코팅 및 당해 기술에 널리 공지된 다른 것으로 제조될 수 있다. 이들은 진정제를 함유할 수 있고, 이들이 지연 방식으로 장관의 특정 부분에서 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 방출하는 그런 조성물의 것일 수 있다. 사용될 수 있는 포매된 조성물의 예는 폴리머 서브스턴스 및 왁스이다. 활성 올리고뉴클레오티드는 또한, 적절하다면, 상기-언급된 부형제 중 하나 이상과 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여용 액체 복용 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 복용 형태는 예를 들면, 본 명세서에 기재된 HDAC 억제제 또는 레티노산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 캐리어, 예컨대, 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 및 기타 동종의 것; 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 아세트산에틸, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3- 부틸렌글리콜, 디메틸 포름아미드와 같은 것; 오일, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배아 오일, 올리브 오일, 피마자유 및 참께 오일, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르; 또는 이들 물질의 혼합물, 및 기타 동종의 것 내에 선택적인 약제학적 아쥬반트를 용해, 분산 등을 함에 의해 제조되어, 이로써 용액 또는 현탁액을 형성한다.
일반적으로, 의도된 투여 방식에 따라, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 약 1 내지 약 99중량%의 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 99 내지 1중량%의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 것이다. 일 예에서, 조성물은 약 5 내지 약 75중량% 사이의 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 나머지의 적합한 약제학적 부형제를 갖는 것일 것이다.
이러한 복용 형태를 제조하는 실제의 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있거나 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)]이 참조된다.
키트
다른 구현예에서, 키트가 제공된다. 본 개시내용에 따른 키트는 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 조성물을 포함하는 패키지(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 식 I, Ia, Ib, Ic, Id, Ie, 또는 V에 따른 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 식 II 또는 IIa에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 식 III에 따른 펩티드, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
어구 "패키지"는 본 명세서에 제시된 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 함유하는 임의의 용기를 의미한다. 일부 구현예에서, 패키지는 박스 또는 포장일 수 있다. 의약품 포장에 사용하기 위한 포장재는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져있다. 약제학적 포장재의 예는, 비제한적으로, 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료의 방식에 적합한 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병 및 임의의 포장재를 포함한다.
키트는 또한 패키지 내에 포함되어 있지 않지만 패키지 외부에 부착된 품목, 예를 들면, 피펫을 함유할 수 있다.
키트는 환자에게 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 투여하기 위한 지침을 더 포함할 수 있다. 키트는 또한 관리 기관, 예컨대 미국 식품의약품안전청에 의해 본 명세서에서 올리고뉴클레오티드의 승인된 사용에 대한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 올리고뉴클레오티드에 대한 라벨링 또는 제품내 삽입물이 함유할 수 있다. 패키지(들) 또는 임의의 제품내 삽입물(들), 또는 둘 모두가 관리 기관에 의해 자체 승인될 수 있다. 키트는 패키지 내의 고상 또는 액상 (예컨대 제공된 완충액)으로 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 또한 방법을 수행하기 위한 용액을 제조하기 위한 완충액 및 한 용기에서 다른 용기로 액체를 이동하기 위한 피펫을 포함할 수 있다.
실시예
실시예는 설명의 목적으로 그리고 본 개시내용의 어떤 특정한 구현예를 기술하기 위해 아래에 제시되었다. 그러나, 청구항의 범위는 본 명세서에 제시된 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않아야 한다. 개시된 구현예에 대한 다양한 변경 및 변형은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이며, 비제한적으로, 본 개시내용의 화학 구조, 치환체, 유도체, 제형 또는 방법에 관한 것들을 포함하여 그러한 변경 및 변형은 개시내용의 기술사상 및 첨부된 청구항들의 범위에서 벗어남이 없이 될 수 있다. 본 명세서에서 반응식에서의 구조의 변수의 정의는 본 명세서에 제시된 식에서 대응하는 위치의 것과 상응한다.
실시예 1: 헥사플루오로벤젠과 펩티드 스테이플링을 위한 프로토콜
Figure 112017123844969-pct00120
유리 바이알 내 환형 디설파이드 펩티드 Ac-CRRRCRRRG-OH (74.8mg, 38.5μmol) (서열식별번호:3)에 트리스 염기 (8mL, DMF 내 50mM) 및 헥사플루오로벤젠 (111μL, 962μmol)의 용액을 첨가한다. 이 용액에, H2O 내 TCEP 용액 (136μL, 0.71M, pH = 8)을 첨가하여 디설파이드 결합을 감소시키고 반응을 개시한다. 반응 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하고, LC-MS로 모니터링하였다. 수득한 혼합물을 물 중 0.1% TFA 40mL로 희석하고, 원심분리하고, 여과하고, HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드 생성물을 함유하는 분획 (LC-MS로 분석함)을 조합하고 동결건조하여 요망된 퍼플루오로아릴 펩티드를 수득하였다 (19.9mg, 8.9μmol, 23% 수율).
실시예 2: 데카플루오로바이페닐과 펩티드 스테이플링을 위한 프로토콜
Figure 112017123844969-pct00121
유리 바이알 내에, 환형 디설파이드 펩티드 Ac-CRRRCRRRG-OH (74.5mg, 38.4μmol) (서열식별번호:3) 및 데카플루오로바이페닐 (25.6mg, 76.7μmol을 DMF 내 트리스 염기의 용액(8mL, 50mM)에 용해시킨다. 디설파이드 결합을 감소시키고 반응을 개시하기 위해, 이 용액에 H2O 내 TCEP 용액 (135μL, 0.71M, pH ~ 8)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하고, LC-MS로 모니터링하였다. 수득한 혼합물을 물 중 TFA (0.1%의 40mL)로 희석하고, 원심분리하고, 여과하고, HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드 생성물을 함유하는 분획은 LC-MS로 분석하여, 조합하고 그리고 동결건조하여 최종 퍼플루오로아릴 펩티드를 수득하였다 (20mg, 8.9μmol, 23% 수율).
실시예 3: 펩티드 콘주게이션을 위한 프로토콜
Figure 112017123844969-pct00122
(PPMO 1)
플라스틱 에펜도르프 튜브 내의 PMO (핵염기 서열 (R2)은: GCT ATT ACC TTA ACC CAG (서열식별번호:9)임; 10.7mg, 1.72μmol) 및 데카플루오로바이페닐 펩티드 Ac-CRRRCRRRG-OH (5.9mg, 2.64umol)의 혼합물에 DMSO (0.4mL), DMSO 내 HATU (6.6μL, 2.64μmol, 0.4M), 및 DIPEA (2.3μL, 13.2μmol)를 첨가한다. 튜브의 내용물을 혼합하고 실온에서 2시간 동안 정치한다. 수득한 혼합물을 물 (8mL)로 희석하고 약한 양이온 교환 (CM 세파로오스) 및 고상 추출 (Amberchrom CG 300M)에 순차적으로 처리하였다. 수득한 생성물을 LC-MS 및 MALDI-TOF MS로 분석하고, 동결건조하여 PMO-펩티드 콘주게이트를 수득하였다 (9.8mg, 1.26μmol, 73% 수율).
실시예 4: 환형 디설파이드 펩티드 그 다음 펩티드 스테이플링으로 PMO 의 단일 포트 콘주게이션을 위한 프로토콜
Figure 112017123844969-pct00123
(PPMO 2)
DMSO (2mL) 내 PMO (85mg, 0.01mmol, 1eq; 핵염기 서열 (R2): GCT ATT ACC TTA ACC CAG (서열식별번호:9)), 펩티드 (Ac-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-OH 또는 Ac-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Gly-OH, 37mg, 각각 디설파이드 브릿지을 가짐, 2eq) 및 HATU (8mg, 2eq)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (9μL, 5eq)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반한다. 50mM의 DMSO 용액 내 디티오트레이톨 (DTT) (1mL, 5eq), 50mM의 DMSO 용액 내 트리스 (1mL, 5eq), 그 다음 헥사플루오로벤젠 (60μL, 25eq)을 부가한 후, 반응 용액을 5시간 동안 더 교반한다. 요망된 생성물은 약한 양이온 교환 크로마토그래피 (CM-세파로오스), 그 다음 고상 추출 (Amberchrome CG300M)에 의해 탈염하고 마지막으로 동결건조에 의해 수득한다. MALDI/TOF 질량 스펙트럼 (m/z): 계산치: 9975; 실측치: 9976 (M+H).
실시예 5: HeLa 세포 검정
도 1의 그래프 (또한 표 3 참조)는 Accuri C6 유동 세포측정기에 의해 각각의 개별적인 세포로부터 판독되고 처리 소프트웨어에 의해 적산된 e-GFP 단백질 녹색 형광 방출의 y 축 "평균 형광 강도"를 나타낸다. 녹색 형광 신호 막대의 높이는, 세포가 시험 화합물로 처리되는지 또는 처리되지 않는지 여부로, HeLa-654 세포의 핵에서 발생하는 엑손 건너뛰기의 수준에 기반된 상이한 강도를 나타낸다. 막대의 신호 강도 또는 크기는 또한 세포 흡수 (즉, 세포 내로의 전달)의 유효성에 상응한다. x 축은 다양한 상이한 치료 요법으로 시험된 시험 화합물을 나타낸다. 다양한 치료 요법은 경시적으로 HeLa-654 세포의 연속 처리 또는 시험 화합물이 세포와 함께 인큐베이션되고 그 다음 일정 기간 (3시간) 후 세포로부터 세정되고, 그리고 신선한, 시험 화합물-없는 배지가 추가된 펄스-추적 처리를 포함한다.
결과: 비접합된 PMO 및 미처리된 세포의 기준선 활성이 도시되어 있다. 본 개시내용의 펩티드/PMO (PPMO) 콘주게이트는 모두: 1) 비접합된 PMO 및 2) 미처리된 세포 (녹색 형광 배경 신호를 나타내는 것)보다 더 큰 세포 흡수를 나타낸다. 본 발명의 펩티드/PMO 콘주게이트와 배경 또는 비접합된-PMO 사이의 형광 강도에서의 이 차이는 스테이플링된 펩티드/PMO 콘주게이트의 상당한 약리적 활성을 나타낸다.
각 경우에, PMO는 하기 구조의 것이다:
Figure 112017123844969-pct00124
여기서 핵염기 서열 (각 경우에 A, G, C 또는 T로부터 선택된 핵염기로부터 독립적으로 선택된 R2를 포함함)은: GCT ATT ACC TTA ACC CAG (서열식별번호:9)이다.
표 3: 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트의 세포 전달 (도 1)
Figure 112017123844969-pct00125
PPMO 3는 하기 구조를 지칭한다:
Figure 112017123844969-pct00126
여기서 핵염기 서열 (각 경우에 A, G, C 또는 T로부터 선택된 핵염기로부터 독립적으로 선택된 R2를 포함함)은: GCT ATT ACC TTA ACC CAG (서열식별번호:9)이다.
PPMO 4는 하기 구조를 지칭한다:
Figure 112017123844969-pct00127
여기서 핵염기 서열 (각 경우에 A, G, C 또는 T로부터 선택된 핵염기로부터 독립적으로 선택된 R2를 포함함)은: GCT ATT ACC TTA ACC CAG (서열식별번호:9)이다.
실시예 6: 생체내 단백질 및 엑손 건너뛰기
각각 5마리 마우스의 14 그룹 (총 70 마우스; 65 mdx, 5 wt)을 아래에 기재된 바와 같이 처리하고, 그런 다음 디스트로핀 단백질 및 엑손 건너뛰기에 대해 분석하였다.
마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 200μL 볼러스의 화합물을 투여하고 그런 다음 주사 후 8일에 안락사시켰다. 사두근, 횡격막, 심장 및 뇌 조직 (개별적인 구조)을 수집하고, 용해시키고, 전통적인 웨스턴 블랏을 사용하여 디스트로핀 단백질을 분석하고, RT-PCR 및 캘리퍼스를 사용하여 엑손 건너뛰기를 분석하였다 (도 2-7 참조).
본 개시내용의 화합물의 구현예는 생체 내에서 mRNA 및 단백질 재구성에 영향을 미치는 이의 능력에 대해 시험되었다. 본 경우에, 이들 시험된 화합물은 mdx 마우스에서 활성을 나타내어, RT-PCR 및 웨스턴 블랏으로 각각 보여지는 바와 같이 엑손 23 건너뛰기 및 디스트로핀 단백질 발현에서의 실질적인 증가를 야기하였다. 이 활성은, 본질적으로 제로의 엑손 23 건너뛰기와 디스트로핀을 생성하는 상태인, mdx 마우스가 염수로 복용된 음성 대조군 실험의 배경에 대해 측정될 때 특히 확연하였다 (도 4D, 5C, 5D, 6D, 7C, 및 7D). 야생형 마우스 및 공지된 활성 화합물 Ac-R6-Gly-M23D(+7-18) (PPMO 5)로 복용된 mdx 마우스인, 2개의 양성 대조군과 비교될 때, 시험된 화합물은 명확히 활성이었다. 일부 경우에 활성은 대조군보다 더 컸다; 예를 들면, PPMO 11 (표 4)은 양성 대조군 화합물 (도 7B 및 7D)보다 더 낮은 용량에서 엑손 건너뛰기 및 디스트로핀 발현에서 훨씬 더 큰 반응을 생성하였다. 따라서, 시험된 화합물은 7일 생체내 선별 검정의 맥락에서 긍정적인 약리적 반응을 유도하는 조건을 충족한다.
이들 연구에 사용된 본 개시내용의 화합물 (PPMO)의 구현예는 식 V에 따른 구조를 갖는다:
Figure 112017123844969-pct00128
(V);
여기서
핵염기 서열 (각 경우에 A, G, C 또는 T로부터 선택된 핵염기로부터 독립적으로 선택된 R2를 포함함)은: 5'- GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG AAA T-3' (서열식별번호:14)이고; 그리고
R14은 표 4에서 정의된 바와 같다.
표 4의 화합물은 상기 실시예 1-4에 따라 제조되었다.
표 4
Figure 112017123844969-pct00129
디스트로핀 웨스턴 블랏 프로토콜:
1. 조직을 -80℃로부터 제거하고 수작업으로 작은 조각으로 세절하고, 조직 유형에 따라 400-800 μL의 RIPA 세포용해 버퍼를 첨가한다.
a. TA: 400μL, QC: 800μL, 심장: 400μL
b. 세포용해 버퍼: RIPA 완충액 (Pierce, cat# 89901) 및 프로테이나제 억제제 칵테일 (Roche, cat# 04693124001)
2. 약 10개의 2.0mm 지르코니아 비드 (Biospec, Cat# 11079124zx)를 튜브에 첨가하고, 조직을 아래와 같이 MagNA Lyser (Roche)로 용해시켰다:
a. 5,000rpm, 30-40초간, 얼음 위에서 2분 동안 냉각시켰다. 사이클은 조직이 완전히 용해될 때까지 반복하였다.
지르코니아 비드에 대신하여, 금속 비드 (3-5개의 비드)를 3000rpm, 사이클 당 20초 사용한다 (3-5분 동안 또는 접촉시 차가울 때까지 사이클 사이에 얼음 위에서 냉각됨).
3. 용해 후, 샘플을 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 신선한 튜브로 옮기고 그리고 BCA 검정을 수행하여 단백질 수준을 정량화한다.
4. 겔 전기영동:
a. 마커를 장입하고 (Invitrogen, cat# P/NLC5699), 100μg의 단백질을 레인 당 장입하고, 샘플을 50 v, 5분; 150 v, 1시간 및 그 다음 200 v 1.5시간으로 트리스 아세테이트 겔 (midi gel, Biorad, cat# 345-0130) 상에서 처리하였다 (71 kD 마커는 겔의 바닥면에 있음).
5. 이송:
4℃, 일정한 100mA (~25 v), 0.45μm PVDF 막 (Biorad, cat# 1620261)에서 밤새 습식 이송 (16-18시간).
6. 막을 TBST에서 5분 동안 세정하고, 실온 (RT)에서 1-2시간 동안 TBST 내 10% 밀크 (Biorad, cat#170-6404)에서 블로킹시켰다.
7. PVDF 막을 TBST로 2-3회 린스하고, 그런 다음 PBS 중 5% BSA 내의 1차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션한다.
a. Dys2 (Novocastra, Leica Biosystem, cat# NCL-DYS2) 1:30
b. Dys1 (Novocastra, Leica Biosystem, cat# NCL-DYS1) 1:1000
c. Mandys8 (Sigma, cat # D8168) 1:3000.
8. 막을 TBST로 세정하고(매회 10분, 3회), HRP 접합된 염소 항-마우스 (BioRad, cat# 1706516, 1:10000) 2차 항체를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고 그 다음 TBST로 세정 (매회 10분, 3회)한다.
9. Clarity Western ECL 기질 (Biorad)을 첨가하고 RT에서 5분간 인큐베이션하고 그 다음 Chemidoc 터치 이미지형성 시스템으로 시각화한다.
10. 막을 0.2N NaOH로 7분간 박리하고, 그런 다음 TBST 중에서 적어도 10분 동안 평형화시킨다. 블랏을 TBST 중 10% 밀크로 RT에서 1시간 동안 차단한다.
11. α-actinin2 항체 (Abcam, 토끼, cat# ab68168, 1:15000)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
12. TBST로 세정하고 (매회 10분, 3회), 그 다음 RT에서 1시간 동안 HRP 접합된 염소 항-토끼 (BioRad, cat# 1706515, 1:10000) 2차 항체와 함께 인큐베이션한다.
13. 막을 TBST로 광범위하게 세정하고 그 다음 상기에 기재된 바와 같이 화상형성한다.
마우스 조직에 대한 RNA 추출 방법:
1. 조직이 잘 용해될 때까지 전체의 조직 조각 (절반 사두근, 절반 심장, 전체 TA ...)을 3000rpm, 사이클 당 20에서 MagNA Lyser 및 금속 비드로 균질화한다 (샘플은 3-5분 동안 또는 접촉시 차가울 때까지 사이클 사이에 얼음 위에서 냉각된다). 50-100μL의 전체 용해물을 신규한 96 웰 플레이트로 옮기고 (GE RNAspin Kit로부터의) 동일한 용적의 RA4 완충액과 혼합하고, 용해물 혼합물은 그런 다음 나머지 정제 단계를 위해 96 웰 RNAspin 플레이트에 장입한다. (RA1 완충액 내) 미사용된 용해물은 키트 프로토콜에 따라 1년 동안 -80℃에서 저장한다.
2. 샘플을 5200g에서 2분간 원심분리한다. RNA 결합 플레이트의 각 웰에 500μL RA3를 첨가하고 플레이트를 5200g에서 2분간 원심분리한다. 통과액은 폐기한다.
3. RNA 결합 플레이트의 각 웰에 500μL RA2를 부가하여 막을 세정하고, 5200g에서 2분간 원심분리한다.
4. 800μL RA3를 각 웰에 첨가하고 5200g에서 2분간 원심분리한다.
5. 500μL RA4를 각 웰에 첨가하고 5200g에서 10분간 원심분리한다.
6. 각각의 웰의 바닥면에 50μL RNase가 없는 물을 피펫팅하여 (원뿔형 웰들을 갖는) PCR 플레이트 안으로 샘플을 용출하여, 막이 완전히 젖었는지 확인한다. 샘플을 RT에서 2분간 인큐베이션하고 5200g에서 3분간 원심분리한다. 만일 웰에 임의의 액체가 남아있는 경우에는, 샘플을 RT에서 추가 2분 동안 인큐베이션하고 다시 5200g에서 3분간 원심분리한다.
7. 그런 다음 RNA 농도를 Nanodrop 2000 분광측정기로 측정한다.
RT- PCR 프로토콜:
RT-PCR을 위해 사용된 프라이머는 아래와 같다: 디스트로핀 외부 정방향: 5'-CAATGTTTCTGGATGCAGACTTTGTGG-3' (서열식별번호:10); 디스트로핀 외부 역방향: 5'-GTTCAGCTTCACTCTTTATCTTCTGCC-3' (서열식별번호:11); 디스트로핀 내부 정방향: 5'-CACATCTTTGATGGTGTGAGG-3' (서열식별번호:12); 및 디스트로핀 내부 역방향: 5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG-3' (서열식별번호:13).
RT-PCR 및 1차 증폭을 위해 25 μL 반응물 (표 5)을 제조하였다. RT-PCR 프로그램은 표 6에 따라 수행되었다.
표 5: RT-PCR 반응 혼합물
Figure 112017123844969-pct00130
표 6: RT-PCR 및 1차 증폭 프로그램
Figure 112017123844969-pct00131
캘리퍼스 프로토콜:
RT-PCR이 완료된 후, 25uL의 PCR 완충액을 첨가하고 총 50uL의 반응 혼합물을 캘리퍼스 플레이트 안으로 옮긴다. 캘리퍼스 LabChip 바이오분석은 제조자의 권고된 프로토콜에 기반하여 수행한다. 전장 디스트로핀 전사체로부터 PCR 생성물은 445 bps이고, 그리고 엑손 23-건너뛰기된 mRNA로부터는 232 bps이다.
참고에 의한 편입
본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조 (참고 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동-계류중인 특허 출원을 포함함)의 내용은 이로써 본 명세서에 이의 전체로 명확히 편입된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 기술에서 통상적인 기술을 갖는 이에게 통상적으로 공지된 의미와 일치한다.
균등물
당해 분야의 숙련가는 보다 적은 일상적인 실험과정을 사용하여, 본 명세서에 기재된 개시내용의 특정 구현예의 많은 균등물을 인식할 것이거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구항에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Sarepta Therapeutics, Inc. <120> PEPTIDE OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES <130> IPA171265-US <150> 62/163,960 <151> 2015-05-19 <150> 62/337,536 <151> 2016-05-17 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 1 Cys Arg Arg Arg Cys Arg Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 2 Cys Arg Arg Arg Cys Arg Arg Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 3 Cys Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Gly 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 4 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 5 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 6 Cys Arg Arg Arg Arg Cys Gly 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 7 Cys Arg Arg Arg Cys Gly 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide; see specification for cysteine modifications <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 8 Cys Arg Arg Cys Gly 1 5 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphorodiamidate-linked morpholino oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> phosphorodiamidate-linked morpholino residues <400> 9 gctattacct taacccag 18 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystrophin outer forward primer <400> 10 caatgtttct ggatgcagac tttgtgg 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystrophin outer reverse primer <400> 11 gttcagcttc actctttatc ttctgcc 27 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystrophin inner forward primer <400> 12 cacatctttg atggtgtgag g 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystrophin inner reverse primer <400> 13 caacttcagc catccatttc tg 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphorodiamidate-linked morpholino oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorodiamidate-linked morpholino residues <400> 14 ggccaaacct cggcttacct gaaat 25 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly 1 5

Claims (33)

  1. 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112023130442744-pct00132

    (I)
    식 중:
    A'는 -NHCH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,
    및 으로부터 선택되고, 여기서
    R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 여기서 x는 3 내지 10이고, 각각의 알킬기는 독립적으로 각 경우에 C2-6-알킬이거나, 또는 R5는 -C(O)C1-6알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1-6-알킬)R6, -(C1-6 헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6,-C(O)O-(C1-6 알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 으로부터 선택되고;
    여기서 R6는 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, 또는 R6는 고형 지지체에 공유결합된 O, S, 또는 NH이고;
    각각의 R1은 OH 및 -NR3R4로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 각 경우에 -C1-6 알킬이고;
    각각의 R2는 H, 핵염기, 및 화학 보호기로 작용화된 핵염기로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 상기 핵염기는 독립적으로 각 경우에 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6 복소환형 고리를 포함하고;
    z는 8 내지 40이고;
    E'는 H, -C1-6 알킬, -C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸,
    로부터 선택되고,
    여기서
    Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고,
    R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2로, 여기서 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고, 및
    R11은 OH 및 -NR3R4로부터 선택되고,
    여기서 L은 아미드 결합에 의해 J의 카복시-말단에 공유결합되고, L은 -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-, 및 로부터 선택되고;
    t는 4 내지 9이고;
    각각의 J는 독립적으로 각 경우에 시스테인 및 아르기닌으로부터 선택되고, 여기서 둘 이상의 아미노산 측쇄기가 독립적으로 각 경우에 황을 포함하고, 여기서 2개의 황 원자는, 이들이 부착되는 원자와 함께 구조 를 형성하고;
    여기서 d는 0 또는 1이고, M은 다음으로부터 선택되고:


    여기서 각각의 R10은 독립적으로 각 경우에 H 또는 할로겐이고;
    G는 J의 아미노-말단에 공유결합되고, G는 H, -C(O)C1-6알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고,
    여기서 하기 조건 중 적어도 하나는 사실이다:
    1) A'는 이거나; 2) E'는 이거나; 또는 3) E'는 임.
  2. 제1항에 있어서, E'는 H, -C1-6 알킬, -C(O)C1-6 알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및
    Figure 112023130442744-pct00145
    로부터 선택되고, 여기서 L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, A'는
    Figure 112023130442744-pct00146
    이거나, 또는 E'는
    Figure 112023130442744-pct00147
    이고, 여기서 L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, A'는 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,
    Figure 112023130442744-pct00148
    및
    Figure 112023130442744-pct00149
    로부터 선택되고, 여기서 R2, L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, E'는 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 스테아로일, 및
    Figure 112023130442744-pct00150
    로부터 선택되고, 여기서 L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A'는 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,
    Figure 112023130442744-pct00151
    및
    Figure 112023130442744-pct00152
    로부터 선택되고;
    E'는
    Figure 112023130442744-pct00153
    이고, 여기서 R2, L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항에 있어서, A'는
    Figure 112023130442744-pct00154
    이고,
    E'는 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고, 여기서 L, J, G, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는:
    Figure 112023130442744-pct00155

    (Ia); 및
    Figure 112023130442744-pct00156

    (Ib)
    로부터 선택되는 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트이고, 여기서 R1, R2, R5, L, J, G, E', z, 및 t는 제1항에서 정의된 바와 같은, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 (Ia)의 것이고 R5는 -C(O)(O-CH2CH2)3OH인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는 식 (Ib)의 것이고 E'는 H, C1-6 알킬, -C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R10은 불소인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, M은
    Figure 112023130442744-pct00157
    또는
    Figure 112023130442744-pct00158
    인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  13. 삭제
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 J기는 시스테인인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, z는 8 내지 25인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1은 N(CH3)2인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R2는 독립적으로 각 경우에 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포잔틴으로부터 선택되는 핵염기인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-, 및
    Figure 112023130442744-pct00159
    로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L은 글리신 및
    Figure 112023130442744-pct00160
    로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L은 글리신인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, G는 H 또는 -C(O)CH3인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, G는 -C(O)CH3인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, d는 1인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, d는 0인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure 112023130442744-pct00161
    는:

    Figure 112023130442744-pct00162

    Figure 112023130442744-pct00163

    Figure 112023130442744-pct00164

    Figure 112023130442744-pct00165

    Figure 112023130442744-pct00166

    Figure 112023130442744-pct00167

    Figure 112023130442744-pct00168
    및
    Figure 112023130442744-pct00169

    로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트는:
    Figure 112023130442744-pct00170

    Figure 112023130442744-pct00171

    Figure 112023130442744-pct00172

    Figure 112023130442744-pct00173

    Figure 112023130442744-pct00174

    Figure 112023130442744-pct00175

    Figure 112023130442744-pct00176


    Figure 112023130442744-pct00177

    Figure 112023130442744-pct00178

    Figure 112023130442744-pct00179

    Figure 112023130442744-pct00180

    Figure 112023130442744-pct00181

    Figure 112023130442744-pct00182

    Figure 112023130442744-pct00183

    Figure 112023130442744-pct00184

    Figure 112023130442744-pct00185
    , 및
    Figure 112023130442744-pct00186

    로부터 선택되고,
    여기서
    R2 및 z는 제1항에서 정의된 바와 같고,
    G는 H 및 -C(O)CH3로부터 선택되고,
    E'는 H 및 -C(O)CH3로부터 선택되는, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  28. 제27항에 있어서, G는 H인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
  29. 제27항에 있어서, G는 -C(O)CH3인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
  30. 제27항에 있어서, E'는 H인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
  31. 제27항에 있어서, E'는 -C(O)CH3인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
  32. 제27항에 있어서, E' 및 G는 -C(O)CH3인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
  33. 제27항에 있어서, G는 -C(O)CH3이고 E'는 H인, 펩티드-올리고뉴클레오티드-콘주게이트.
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