ES2964695T3 - Conjugados de oligonucleótidos peptídicos - Google Patents

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ES2964695T3 ES16797300T ES16797300T ES2964695T3 ES 2964695 T3 ES2964695 T3 ES 2964695T3 ES 16797300 T ES16797300 T ES 16797300T ES 16797300 T ES16797300 T ES 16797300T ES 2964695 T3 ES2964695 T3 ES 2964695T3
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Ming Zhou
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Abstract

En el presente documento se proporcionan oligonucleótidos, péptidos y conjugados de péptido-oligonucleótido. También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto oligonucleótidos, péptidos y conjugados péptido-oligonucleótido descritos en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de oligonucleótidos peptídicos
SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reclama prioridad sobre la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/163,960, presentada el 19 de mayo de 2015, y la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/337,536, presentada el 17 de mayo de 2016.LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud se presenta junto con un Listado de secuencias en formato legible por computadora. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado 581432_SPT-001-2_sequence_listing_ST25.txt, creado el 13 de mayo de 2016, que tiene un tamaño de 4.227 bytes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La tecnología antisentido proporciona un medio para modular la expresión de uno o más productos genéticos específicos, incluidos productos de empalme alternativos, y es excepcionalmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. El principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido, por ejemplo, un oligonucleótido, el cual se hibrida con un ácido nucleico diana, modula las actividades de expresión génica tales como la transcripción, el empalme o la traducción a través de cualquiera de varios mecanismos antisentido. La especificidad de secuencia de los compuestos antisentido los hace atractivos como herramientas para la validación de dianas y la funcionalización de genes, así como terapias para modular selectivamente la expresión de genes implicados en enfermedades.
Aunque se han logrado avances significativos en el campo de la tecnología antisentido, sigue existiendo una necesidad en la técnica de oligonucleótidos y conjugados de péptido-oligonucleótido con un rendimiento antisentido o antigénico mejorado. Tal rendimiento antisentido o antigénico mejorado incluye, al menos, por ejemplo: menor toxicidad, mayor afinidad por el ADN y el ARN sin comprometer la selectividad de la secuencia, farmacocinética y distribución tisular mejoradas, administración celular mejorada y distribución in vivo confiable y controlable.
El documento WO 2013/086441 A2 describe oligonucleótidos antisentido dirigidos a LMNA para reducir la expresión de una o más isoformas de ARNm de LMNA empalmadas de manera aberrante que codifican progerina.
El documento WO 2012/150960 A1 describe análogos de oligonucleótidos conjugados con péptidos portadores útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades en las que la inhibición de la expresión de proteínas o la corrección de productos de empalme de ARNm aberrantes produce efectos terapéuticos beneficiosos.
El documento WO 2010/048586 A1 describe moléculas antisentido capaces de unirse a un sitio diana seleccionado en el gen de la distrofina humana para inducir la omisión de exones y el uso del mismo para tratar la distrofia muscular.
Jarver et al (Molecular Therapy- Nucleic Acids, 1, 6, 2012, p27) describe oligonucleótidos antisentido y el uso de péptidos naturales y sintéticos para mejorar la captación celular o la focalización celular.
El documento WO 2012/144906 A1 describe compuestos que comprenden una secuencia de oligonucleótidos para tratar, retrasar y/o prevenir un trastorno genético humano tal como la distrofia miotónica tipo 1 (DM1).
Spokoyny et al (Journal of the American Chemical Society, 135, 16, 2013, p5946-5949) y Zou et al (Organic & Biomolecular Chemistry, 12, 4, 2014, p566-573) describen varios vehículos y el uso de sus propiedades de transporte.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se proporcionan péptidos, oligonucleótidos y conjugados de péptido-oligonucleótido. También se proporcionan en el presente documento conjugados de péptido-oligonucleótido para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita.
Por consiguiente, en un aspecto, en el presente documento se proporciona un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En una realización, el conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula Ia:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otra realización, el conjugado péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado péptido-oligonucleótido de Fórmula Ib:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula Ic:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula Id:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula Ie:
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula IV
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula V:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En otro aspecto más, se proporcionan en el presente documento conjugados de péptido-oligonucleótido de la presente divulgación para usarse en el tratamiento de una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana en un sujeto que lo necesita.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
LaFigura 1muestra el grado de penetración de oligonucleótidos, péptidos y conjugados de péptidooligonucleótido seleccionados en células HeLa basándose en experimentos de citometría de flujo.
LaFigura 2Aes una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5.
Figura 2Bes una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 6.
Figura 2Ces una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 8.
Figura 2Des una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 10.
LaFigura 3Aes una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5.
Figura 3Bes una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 7.
Figura 3Ces una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 9.
Figura 3Des una transferencia Western que muestra niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 11.
Figura 4Amuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo).
Figura 4Bmuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 6.
Figura 4Cmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo).
Figura 4Dmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 6; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
Figura 5Amuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 8.
Figura 5Bmuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 10.
Figura 5Cmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 8; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
Figura 5Dmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 10; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
Figura 6Amuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo).
Figura 6Bmuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 7.
Figura 6Cmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo).
Figura 6Dmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 7; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
Figura 7Amuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 9.
Figura 7Bmuestra la cuantificación de los niveles de distrofina en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 11.
Figura 7Cmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 9; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
Figura 7Dmuestra la cuantificación de la omisión del Exón23 (%) en tejido del cuádriceps de ratón después de la administración de PPMO 5 (dos replicaciones del mismo ensayo) o PPMO 11; se utilizaron ratones de tipo salvaje y mdx como controles.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se proporcionan péptidos, oligonucleótidos y conjugados de péptido-oligonucleótido. También se proporcionan en el presente documento conjugados de péptido-oligonucleótido para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Los oligonucleótidos, y por lo tanto los conjugados péptido-oligonucleótido, descritos en el presente documento muestran una mayor afinidad por el ADN y el ARN sin comprometer la selectividad de secuencia, en relación con los oligonucleótidos nativos o no modificados. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de la divulgación minimizan o previenen la escisión por la RNasa H. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido de la divulgación no activan la RNasa H.
Los péptidos descritos en el presente documento imparten a sus correspondientes conjugados péptido-oligonudeótido una menor toxicidad, mejoran la actividad del oligonucleótido, mejoran la farmacocinética y la distribución tisular, mejoran la administración celular e imparten una distribución in vivo tanto fiable como controlable.
Definiciones
A continuación, se enumeran las definiciones de varios términos utilizados para describir esta divulgación. Estas definiciones se aplican a los términos tal como se utilizan a lo largo de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, a menos que se limiten de otro modo en casos específicos, ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande.
El término "aproximadamente" lo entenderán los expertos en la técnica y variará hasta cierto punto según el contexto en el que se utilice. Tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, el término "aproximadamente" pretende abarcar variaciones de ±20 % o ±10 %, incluyendo ±5 %, ±1 %, y ±0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.
El término "alquilo" se refiere a restos hidrocarbonados saturados, de cadena lineal o ramificada que contienen, en determinadas realizaciones, entre uno y seis, o uno y ocho átomos de carbono, respectivamente. Ejemplos de restos de alquilo de C1-6 incluyen, pero no se limitan a, restos de metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, ter-butilo, neopentilo y nhexilo; y ejemplos de restos de alquilo de C1-8 incluyen, pero no se limitan a, restos de metilo, etilo, propilo, isopropilo, nbutilo, ter-butilo, neopentilo, n-hexilo, heptilo y octilo.
El número de átomos de carbono en un sustituyente alquilo se puede indicar mediante el prefijo "Cx-y," donde x es el número mínimo e y es el número máximo de átomos de carbono en el sustituyente. Asimismo, una cadena Cx significa una cadena alquílica que contiene x átomos de carbono.
El término "heteroalquilo" por sí solo o en combinación con otro término significa, a menos que se indique lo contrario, un grupo alquilo estable de cadena lineal o ramificada que consiste en el número indicado de átomos de carbono y uno o dos heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S, y donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El heteroátomo(s) pueden colocarse en cualquier posición del grupo heteroalquilo, incluso entre el resto del grupo heteroalquilo y el fragmento al que está unido, así como también unidos al átomo de carbono más distal del grupo heteroalquilo. Ejemplos incluyen: -O-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, y -CH2-CH2-S(=O)-CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, como, por ejemplo -CH2-NH-OCH3, o -CH2-CH2-S-S-CH3.
El término "arilo", empleado solo o en combinación con otros términos, significa, a menos que se indique lo contrario, un sistema aromático carbocíclico que contiene uno o más anillos (típicamente uno, dos o tres anillos), donde dichos anillos pueden estar unidos entre sí en una de manera colgante, tal como un bifenilo, o puede estar fusionado, tal como naftaleno. Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, antracilo y naftilo. En diversas realizaciones, los ejemplos de un grupo arilo pueden incluir fenilo (p. ej., arilo de C6) y bifenilo (p. ej., arilo de C12). En algunas realizaciones, los grupos arilo tienen de seis a dieciséis átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos arilo tienen de seis a doce átomos de carbono (por ejemplo, arilo de C6-12). En algunas realizaciones, los grupos arilo tienen seis átomos de carbono (por ejemplo, arilo de C6).
Como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" o "heteroaromático" se refiere a un heterociclo que tiene carácter aromático. Los sustituyentes heteroarilo pueden definirse por el número de átomos de carbono, por ejemplo, heteroarilo de C1-9 indica el número de átomos de carbono contenidos en el grupo heteroarilo sin incluir el número de heteroátomos. Por ejemplo, un heteroarilo de C1-9 incluirá de uno a cuatro heteroátomos adicionales. Un heteroarilo policíclico puede incluir uno o más anillos que están parcialmente saturados. Los ejemplos no limitantes de heteroarilos incluyen piridilo, pirazinilo, pirimidinilo (incluyendo, por ejemplo, 2- y 4-pirimidinilo), piridazinilo, tienilo, furilo, pirrolilo (incluyendo, por ejemplo, 2-pirrolilo), imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazolilo (incluyendo, por ejemplo, 3- y 5-pi razolilo), isotiazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,3,4-triazolilo, tetrazolilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo y 1,3,4-oxadiazolilo.
Los ejemplos no limitantes de heterociclos y heteroarilos policíclicos incluyen indolilo (que incluye, por ejemplo, 3-, 4-, 5-, 6- y 7-indolilo), indolinilo, quinolilo, tetrahidroquinolilo, isoquinolilo (que incluye, por ejemplo, 1- y 5- isoquinolilo), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolilo, cinolinilo, quinoxalinilo (que incluye, por ejemplo, 2- y 5-quinoxalinilo), quinazolinilo, ftalazinilo, 1,8-naftiridinilo, 1,4-benzodioxanilo, cumarina, dihidrocumarina, 1,5-naftiridinilo, benzofurilo (que incluye, por ejemplo, 3-, 4-, 5-, 6- y 7-benzofurilo), 2,3-dihidrobenzofurilo, 1,2-bencisoxazolilo, benzotienilo (que incluye, por ejemplo, 3-, 4 -, 5-, 6- y 7- benzotienilo), benzoxazolilo, benzotiazolilo (que incluye, por ejemplo, 2-benzotiazolilo y 5-benzotiazolilo), purinilo, bencimidazolilo (que incluye, por ejemplo, 2-bencimidazolilo), benzotriazolilo, tioxantinilo, carbazolilo, carbolinilo, acridinilo, pirrolizidinilo y quinolizidinilo.
El término "grupo protector" o "grupo protector químico" se refiere a restos químicos que bloquean algunos o todos los restos reactivos de un compuesto y evitan que dichos restos participen en reacciones químicas hasta que se elimine el grupo protector, por ejemplo, aquellos restos enumerados y descritos. en T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3° ed. John Wiley & Sons (1999). Puede ser ventajoso, cuando se emplean diferentes grupos protectores, que cada grupo protector (diferente) pueda eliminarse por medios diferentes. Los grupos protectores que se escinden en condiciones de reacción totalmente diferentes permiten una eliminación diferencial de dichos grupos protectores. Por ejemplo, los grupos protectores pueden eliminarse mediante ácido, base e hidrogenólisis. Grupos tales como tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, acetal y ter-butildimetilsililo son lábiles a ácidos y pueden usarse para proteger restos reactivos carboxi e hidroxi en la presencia de grupos amino protegidos con grupos Cbz, que son eliminables mediante hidrogenólisis, y grupos Fmoc, que son lábiles a bases. Los restos de ácido carboxílico se pueden bloquear con grupos lábiles a bases tales como, sin limitación, metilo o etilo, y los restos reactivos con hidroxi se pueden bloquear con grupos lábiles a bases tales como acetilo en presencia de aminas bloqueadas con grupos lábiles a ácidos tales como carbamato de ter-butilo o con carbamatos que son tanto ácidos como básicos estables pero hidrolíticamente eliminables.
Los restos reactivos de ácido carboxílico e hidroxilo también se pueden bloquear con grupos protectores eliminables hidrolíticamente, como el grupo bencilo, mientras que los grupos amina se pueden bloquear con grupos lábiles a bases, tales como Fmoc. Un grupo protector de amina particularmente útil para la síntesis de compuestos de Fórmula (I) es la trifluoroacetamida. Los restos reactivos del ácido carboxílico se pueden bloquear con grupos protectores que se pueden eliminar por oxidación, tal como el 2,4-dimetoxibencilo, mientras que los grupos amino coexistentes se pueden bloquear con carbamatos de sililo lábiles al fluoruro.
Los grupos bloqueadores alilo son útiles en presencia de grupos protectores de ácidos y bases, ya que los primeros son estables y pueden eliminarse posteriormente mediante catalizadores metálicos o pi-ácidos. Por ejemplo, un ácido carboxílico bloqueado con alilo se puede desproteger con una reacción catalizada por paladio (0) en presencia de grupos protectores de carbamato de t-butilo lábil a ácidos o de acetato de amina lábiles a bases. Otra forma más de grupo protector es una resina a la que se puede unir un compuesto o intermedio. Mientras el residuo esté adherido a la resina, ese grupo funcional queda bloqueado y no puede reaccionar. Una vez liberado de la resina, el grupo funcional está disponible para reaccionar.
El término "nucleobase", "resto de emparejamiento de bases", "resto de emparejamiento de nucleobases" o "base" se refiere a la porción del anillo heterocíclico de una subunidad de nucleósido, nucleótido y/o morfolino. Las nucleobases pueden ser naturales, o pueden ser modificadas o análogas de estas nucleobases naturales, por ejemplo, uno o más átomos de nitrógeno de la nucleobase pueden ser reemplazados independientemente en cada ocurrencia por carbono. Los análogos ejemplares incluyen hipoxantina (el componente básico del nucleósido inosina); 2, 6-diaminopurina; 5-metilcitosina; pirimidinas modificadas con propinilo de<c>5; 10-(9-(aminoetoxi)fenoxazinilo) (pinza G) y similares.
Otros ejemplos de restos de emparejamiento de bases incluyen, pero no se limitan a, uracilo, timina, adenina, citosina, guanina e hipoxantina que tienen sus respectivos grupos amino protegidos por grupos protectores acilo, 2-fluorouracilo, 2-fluorocitosina, 5-bromouracilo, 5- yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, análogos de pirimidina tales como pseudoisocitosina y pseudouracilo y otras nucleobases modificadas tales como purinas 8-sustituidas, xantina o hipoxantina (siendo las dos últimas los productos de degradación natural). Las nucleobases modificadas descritas en Chiu y Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar y Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313.
Otros ejemplos de restos de emparejamiento de bases incluyen, pero no se limitan a, nucleobases de tamaño expandido a las que se han añadido uno o más anillos de benceno. Reemplazos de bases nucleicas descritos en el catálogo de Glen Research (www.glenresearch.com); Krueger AT et al., Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627, se consideran útiles para la síntesis de los oligómeros descritos en el presente documento. A continuación, se muestran ejemplos de nucleobases de tamaño expandido:
Los términos "oligonudeótido" u "oligómero" se refieren a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos, nucleótidos o una combinación de nucleósidos y nucleótidos unidos. En realizaciones específicas proporcionadas en el presente documento, un oligonucleótido es un oligonucleótido morfolino.
La frase "oligonucleótido de morfolino" u "PMO" se refiere a un oligonucleótido modificado que tiene subunidades de morfolino unidas entre sí mediante enlaces fosforamidato o fosforodiamidato, uniendo el nitrógeno de morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente. Cada subunidad de morfolino comprende un resto de emparejamiento de nucleobase eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de nucleobase, a una nucleobase en una diana.
Los términos "oligómero antisentido", "compuesto antisentido" y "oligonucleótido antisentido" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de subunidades, cada una de las cuales lleva un resto de emparejamiento de bases, unidas por enlaces entre subunidades que permiten que los restos de emparejamiento de bases se hibriden con un secuencia diana en un ácido nucleico (típicamente un ARN) mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick, para formar un heterodúplex de ácido nucleico:oligómero dentro de la secuencia diana. El oligómero puede tener una complementariedad de secuencia exacta (perfecta) o casi (suficiente) con la secuencia diana; Las variaciones en la secuencia cerca de los extremos de un oligómero son generalmente preferibles a las variaciones en el interior.
Un oligómero antisentido de este tipo puede diseñarse para bloquear o inhibir la traducción de ARNm o para inhibir/alterar el procesamiento de empalme previo a ARNm natural o anormal, y puede decirse que está "dirigido a" o "dirigido contra" una secuencia diana con la que se hibrida. La secuencia diana suele ser una región que incluye un codón de inicio AUG de un ARNm, un oligómero supresor de la traducción, o un sitio de empalme de un ARNm preprocesado, un oligómero supresor de corte y empalme (SSO por sus siglas en inglés). La secuencia diana para un sitio de empalme puede incluir una secuencia de ARNm que tiene su extremo 5' de 1 a aproximadamente 25 pares de bases corritente abajo de una unión aceptora de corte y empalme normal en un ARNm preprocesado. En diversas realizaciones, una secuencia diana puede ser cualquier región de un ARNm preprocesado que incluya un sitio de empalme o esté contenida completamente dentro de una secuencia codificante de exón o abarque un sitio donante o aceptor de empalme. Más generalmente se dice que un oligómero está "dirigido contra" una diana biológicamente relevante, tal como una proteína, virus o bacteria, cuando está dirigido contra el ácido nucleico de la diana de la manera descrita anteriormente.
El oligonucleótido antisentido y el ARN diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí, de manera que se produce una unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana. Por lo tanto, "específicamente hibridable" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso de modo que se produzca una unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana. Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un oligonucleótido sea 100 % complementaria a la de su secuencia diana para que sea específicamente hibridable. Un oligonucleótido es hibridable específicamente cuando la unión del oligonucleótido a la molécula diana interfiere con la función normal del ARN diana, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido antisentido a secuencias no diana en condiciones en qué se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayosin vivoo tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayosin vitro,en las condiciones en las que se realizan los ensayos.
Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "base"). Los oligonucleótidos que contienen una base modificada o sustituida incluyen oligonucleótidos en los que una o más bases de purina o pirimidina que se encuentran más comúnmente en los ácidos nucleicos se reemplazan con bases menos comunes o no naturales. En algunas realizaciones, la nucleobase está unida covalentemente en el átomo N9 de la base purina, o en el átomo N1 de la base pirimidina, al anillo de morfolina de un nucleótido o nucleósido.
Las bases purina comprenden un anillo de pirimidina fusionado a un anillo de imidazol, como se describe en la fórmula general:
La adenina y la guanina son las dos nucleobases purínicas que se encuentran con mayor frecuencia en los ácidos nucleicos. Estas pueden sustituirse por otras purinas naturales, incluidas, pero no limitadas a, N6-metiladenina, N2-metilguanina, hipoxantina y 7-metilguanina.
Las bases de pirimidina comprenden un anillo de pirimidina de seis miembros como se describe en la fórmula general:
La citosina, el uracilo y la timina son las bases pirimidínicas que se encuentran con mayor frecuencia en los ácidos nucleicos. Estos pueden sustituirse por otras pirimidinas naturales, incluidas, pero no limitadas a, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, pseudouracilo y 4-tiouracilo. En una realización, los oligonucleótidos descritos en el presente documento contienen bases de timina en lugar de uracilo.
Otras bases modificadas o sustituidas incluyen, pero no se limitan a, 2,6-diaminopurina, ácido orótico, agmatidina, lisidina, 2-tiopirimidina (por ejemplo, 2-tiouracilo, 2-tiotimina), pinza G y sus derivados, primidina 5-sustituida (p. ej., 5-halouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 5-aminometiluracilo, 5-hidroximetiluracilo, 5-aminometilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, Super T), 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 7-aza-2,6 -diaminopurina, 8-aza-7-desazaguanina, 8-aza-7-desazaadenina, 8-aza-7-deaza-2,6-diaminopurina, Super G, Super A y N4-etilcitosina, o derivados de los mismos; N2-ciclopentilguanina (cPent-G), N2-ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP) y N2-propil-2-aminopurina (Pr-AP), pseudouracilo o derivados de los mismos; y bases degeneradas o universales, como 2,6-difluorotolueno o bases ausentes como sitios abásicos (por ejemplo, 1-desoxirribosa, 1,2-didesoxirribosa, 1-desoxi-2-O-metilribosa; o derivados de pirrolidina en los que el oxígeno del anillo ha sido reemplazado con nitrógeno (azaribosa)). El pseudouracilo es una versión isomerizada natural del uracilo, con un glucósido C en lugar del glucósido N normal como en la uridina.
Ciertas nucleobases modificadas o sustituidas son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los oligonucleótidos antisentido de la divulgación. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. En diversas realizaciones, las nucleobases pueden incluir sustituciones de 5-metilcitosina, que se ha demostrado que aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C.
En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas o sustituidas son útiles para facilitar la purificación de oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden contener tres o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6 o más) bases de guanina consecutivas. En ciertos oligonucleótidos antisentido, una cadena de tres o más bases de guanina consecutivas puede dar como resultado la agregación de los oligonucleótidos, lo que complica la purificación. En dichos oligonucleótidos antisentido, una o más de las guaninas consecutivas pueden sustituirse con hipoxantina. La sustitución de una o más guaninas por hipoxantina en una cadena de tres o más bases de guanina consecutivas puede reducir la agregación del oligonucleótido antisentido, facilitando así la purificación.
Los oligonucleótidos proporcionados en el presente documento se sintetizan y no incluyen composiciones antisentido de origen biológico. Las moléculas de la divulgación también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la absorción, distribución o absorción, o una combinación de los mismos.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a oligonucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "T-G-A (5'-3')" es complementaria de la secuencia "T-C-A (5'-3')". La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden según las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad "completa", "total" o "perfecta" (100 %) entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre cadenas de ácidos nucleicos. Si bien a menudo se desea una complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o más, pero preferiblemente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 desemparejamientos con respecto al ARN diana. Tal hibridación puede ocurrir con una complementariedad "cercana" o "sustancial" del oligómero antisentido con la secuencia diana, así como con una complementariedad exacta. En algunas realizaciones, un oligómero puede hibridarse con una secuencia diana con aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de complementariedad. Se incluyen variaciones en cualquier ubicación dentro del oligómero. En ciertas realizaciones, las variaciones en la secuencia cerca de los extremos de un oligómero son generalmente preferibles a las variaciones en el interior y, si están presentes, típicamente están dentro de aproximadamente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido del extremo 5', extremo 3', o ambos extremos.
El término "péptido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de aminoácidos unidos. Los péptidos proporcionados en el presente documento pueden considerarse péptidos que penetran en las células.
Los términos "péptido que penetra en las células" y "CPP" se usan indistintamente y se refieren a péptidos catiónicos que penetran en las células, también llamados péptidos de transporte, péptidos portadores o dominios de transducción de péptidos. Los péptidos, proporcionados en el presente documento, tienen la capacidad de inducir la penetración celular dentro del 100 % de las células de una población de cultivo celular determinada y permiten la translocación macromolecular dentro de múltiples tejidosin vivotras la administración sistémica. En diversas realizaciones, una realización de CPP de la divulgación puede incluir un péptido rico en arginina como se describe más adelante.
El término "tratamiento" se refiere a la aplicación de uno o más procedimientos específicos utilizados para mejorar una enfermedad. En determinadas realizaciones, el procedimiento específico es la administración de uno o más agentes farmacéuticos. "Tratamiento" de un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) o una célula es cualquier tipo de intervención utilizada en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica y puede realizarse de forma profiláctica o posterior al inicio de un evento patológico o al contacto con un agente etiológico. El tratamiento incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o patología de una enfermedad o afección y puede incluir, por ejemplo, cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando. También se incluyen tratamientos "profilácticos", que pueden estar dirigidos a reducir la tasa de progresión de la enfermedad o afección que se está tratando, retrasar la aparición de esa enfermedad o afección o reducir la gravedad de su aparición. Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de compuesto terapéutico, tal como un oligómero antisentido, administrado a un sujeto mamífero, ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis, lo cual es eficaz para producir un efecto terapéutico deseado.
El término "mejora" significa una disminución de la gravedad de al menos un indicador de una afección o enfermedad. En determinadas realizaciones, la mejora incluye un retraso o una desaceleración en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas que son conocidas por los expertos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los oligonucleótidos divulgados donde el oligonucleótido padre se modifica convirtiendo un resto ácido o base existente en su forma de sal. Se encuentran listas de sales adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 y Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977).
Conjugados péptido-oligonucleótido
En el presente documento se proporcionan oligonucleótidos unidos químicamente a uno o más restos, tales como un péptido que penetra en las células, que mejoran la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligonucleótido. Los oligonucleótidos pueden además estar unidos químicamente a uno o más restos heteroalquilo (por ejemplo, polietilenglicol) que mejoran aún más la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligonucleótido. En una realización ejemplar, el polipéptido rico en arginina está acoplado covalentemente en su residuo N-terminal o C-terminal a cualquiera de los extremos, o a ambos extremos, del compuesto antisentido.
Por tanto, en un aspecto, en el presente documento se proporciona un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
A' se selecciona de -NHCH2C(O)NH2, -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
en donde
R5 es -C(O)(O-alquil)x-OH, donde x es 3-10 y cada grupo alquilo es independientemente en cada aparición alquilo de C2-6, o R5 se selecciona de -C(O)alquilo de C1-6, tritilo, monometoxitritilo, -(alquilo de C1-6)R6, -(heteroalquilo de C1-6)-R6, aril-R6, heteroaril-R6, -C(O)O-(alquilo de C1-6)-R6, -C(O)O-aril-R6, -C(O)O-heteroaril-R6, y
donde R6 se selecciona entre OH, SH y NH2 o R6 es O, S o NH, unido covalentemente a un soporte sólido; cada R1 se selecciona independientemente entre OH y -NR3R4, donde cada R3 y R4 son independientemente en cada aparición -alquilo de C1-6;
cada R2 se selecciona independientemente entre H, una nucleobase y una nucleobase funcionalizada con un grupo químico protector, donde la nucleobase comprende independientemente en cada aparición un anillo heterocíclico de C3-6 seleccionado entre piridina, pirimidina, triazinano, purina y deaza-purina;
z es 8-40; y
E' se selecciona de H, -alquilo de C1-6, -C(O)alquilo de C1-6, benzoilo, estearoilo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo,
en donde
Q es -C(O)(CH2)6C(O)- o -C(O)(CH2)2S2(CH2)2CO)-,
R7 es -(CH2)2OC(O)N(R8)2, donde R8 es -(CH2)6NHC(=NH)NH2, y
R11 se selecciona entre OH y -NR3R4,
donde L está unido covalentemente mediante un enlace amida al extremo carboxi de J, y L se selecciona de -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-, y
t es 4-9;
cada J se selecciona independientemente en cada aparición de cisteína y arginina donde dos o más grupos de cadena lateral de aminoácidos independientemente en cada aparición comprenden un azufre, donde dos de los átomos de azufre, junto con los átomos a los que están unidos, forman la estructura
donde d es 0 o 1, y M se selecciona entre:
, donde cada R10 es independientemente en cada aparición H o un halógeno; y G está unido covalentemente al extremo amino de J, y G se selecciona de H, -C(O)alquilo de C1-6, benzoilo y estearoilo, y
donde al menos una de las siguientes condiciones es verdadera:
1) A' es
2) E' es
o 3) E' es
En una realización, E' se selecciona de H, -alquilo de Ci-6, -C(O)alquilo de Ci-6, benzoilo, estearoilo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo y
En otra realización, sólo uno de A' es
E' es
o E' es
En otra realización más, A' es
o E' es
En otra realización más, A' se selecciona de -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
En otra realización E' se selecciona de H, -C(O)CH3, tritilo, 4-metoitritilo, benzoilo, stearoilo, y
En otra realización más, A' se selecciona de -N(alquil de Ci-6)CH2C(O)NH2,
En otra realización más, A' es
En otra realización, E' se selecciona de H, -C(O)CH3, tritilo, 4-metoxitritilo, benzoilo y estearoilo.
En otra realización más, E' se selecciona entre H y -C(O)CH3..
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula Ia:
En una realización de Fórmula I y la, R5 es -C(O)(O-alquil)xOH, donde cada grupo alquilo es independientemente para cada aparición de alquilo de C2-6.
En otra realización de Fórmula I y Ia, R5 es -C(O)(O-CH2CH2)3OH.
En otra realización, el conjugado péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado péptido-oligonucleótido de Fórmula Ib:
En otra realización de Fórmula I y Ib, E' se selecciona de H y -C(O)CH3.
En una realización de Fórmula I, Ia y Ib, cada R10 es independientemente un halógeno seleccionado entre flúor, cloro, bromo y yodo.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, cada R10 es flúor.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, M es
En otra realización de las Fórmulas I, Ia y Ib, dos grupos de cadena lateral de aminoácidos son independientemente en cada caso grupos de cadena lateral de aminoácidos de cisteína u homocisteína.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, dos grupos J son cisteína.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, z es 8-25.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, z es 15-25.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, z es 10-20.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, cada R1 es independientemente NR3R4, donde cada R3 y R4 son independientemente en cada aparición alquilo de C1-3.
En aún otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, cada R1 es N(CH3)2.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, cada R2 es una nucleobase, donde la nucleobase independientemente en cada aparición comprende un anillo heterocíclico de C4-6 seleccionado entre piridina, pirimidina, triazinano, purina y deazapurina.
En otra realización de Fórmula I, la y Ib, cada R2 es una nucleobase, donde la nucleobase independientemente en cada aparición comprende un anillo heterocíclico de C4-6 seleccionado entre pirimidina, purina y deaza-purina.
En aún otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, cada R2 es una nucleobase independientemente en cada aparición seleccionada de adenina, 2,6-diaminopurina, 7-deaza-adenina, guanina, 7-deaza-guanina, hipoxantina, citosina, 5-metilcitosina, timina, uracilo e hipoxantina.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, cada R2 es una nucleobase independientemente en cada aparición seleccionada de adenina, guanina, citosina, 5-metilcitosina, timina, uracilo e hipoxantina.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, L se selecciona de -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-, y
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, L se selecciona de glicina y
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, L es glicina.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, G se selecciona de H, C(O)CH3., benzoilo y estearoilo.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, G es H o -C(O)CH3.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, G es -C(O)CH3.
En otra realización de Fórmula I, Ia y Ib, d es 1.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib, d es 0.
En otra realización más de Fórmula I, Ia y Ib,
se selecciona de:
y
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula Ic:
En otra realización más, el conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado de péptido-oligonucleótido de Fórmula Id:
En otra realización, el conjugado péptido-oligonudeótido de Fórmula I es un conjugado péptido-oligonudeótido de Fórmula le:
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula IV:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
A' se selecciona de -NHCH2C(O)NH2, -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
en donde
R5 es -C(O)(O-alquil)x-OH, donde x es 3-10 y cada grupo alquilo es independientemente en cada aparición alquilo de C2-6, o R5 se selecciona de -C(O)alquilo de C1-6, tritilo, monometoxitritilo, -(alquilo de C1-6)R6, -(heteroalquilo de C1-6)-R6, aril-R6, heteroaril-R6, -C(O)O-(alquilo de C1-6)-R6, -C(O)O-aril-R6, -C(O)O-heteroaril-R6, y
donde R6 se selecciona entre OH, SH y NH2 o R6 es O, S o NH, unido covalentemente a un soporte sólido; cada R1 se selecciona independientemente entre OH y -NR3R4, donde cada R3 y R4 son independientemente en cada aparición -alquilo de C1-6;
cada R2 se selecciona independientemente entre H, una nucleobase y una nucleobase funcionalizada con un grupo químico protector, donde la nucleobase comprende independientemente en cada aparición un anillo heterocíclico de C3-6 seleccionado entre piridina, pirimidina, triazinano, purina y deaza-purina;
z es 8-40; y
E' se selecciona de H, -alquilo de C1-6, -C(O)alquilo de C1-6, benzoilo, estearoilo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo,
en donde
Q es -C(O)(CH2)6C(O)- o -C(O)(CH2)2S2(CH2)2CO)-,
R7 es -(CH2)2OC(O)N(R8)2, donde R8 es -(CH2)6NHC(=NH)NH2 y R11 se selecciona entre OH y -NR3R4, donde L está unido covalentemente mediante un enlace amida al extremo carboxi de J, y L se selecciona de -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-, y
t es 4-9;
cada J se selecciona independientemente en cada aparición de cisteína y arginina donde dos o más grupos de cadena lateral de aminoácidos independientemente en cada aparición comprenden un azufre, donde dos de los átomos de azufre, junto con los átomos a los que están unidos, forman la estructura
y
G está unido covalentemente al extremo amino de J, y G se selecciona de H, -C(O)alquilo de Ci-6, benzoilo y estearoilo, y
donde al menos una de las siguientes condiciones es verdadera: 1) A' es
2) E' es
o 3) E' es
En una realización de la Fórmula IV, d es 1.
En otra realización de la Fórmula IV, E' se selecciona de H, -C(O)CH3, y
En otra realización más de la Fórmula IV, A' se selecciona de -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
En otra realización más de la Fórmula IV, A' es
En otra realización de la Fórmula IV, E' se selecciona entre H y -C(O)CH3..
En otra realización de la Fórmula IV, z es 15-25.
En otra realización más de la Fórmula IV, z es 10-20.
En otra realización más de la Fórmula IV, cada R1 es N(CH3)2.
En otra realización más de la Fórmula IV, cada R2 es una nucleobase independientemente en cada aparición seleccionada de adenina, guanina, citosina, 5-metilcitosina, timina, uracilo e hipoxantina.
En otra realización más de la Fórmula IV, L es glicina.
En otra realización de la Fórmula IV, G se selecciona de H, C(O)CH3, benzoilo y estearoilo.
En otra realización más de la Fórmula IV, G es -C(O)CH3.
En otra realización más, el oligonucleótido comprende una secuencia de direccionamiento que tiene complementariedad de secuencia con una diana de ARN. En una realización específica, la diana de ARN es una diana de A r N celular. En otra realización específica, la secuencia de direccionamiento tiene suficiente complementariedad de secuencia para unirse a la diana de ARN. En aún otra realización específica, la secuencia dirigida tiene una complementariedad de secuencia perfecta con la diana de ARN.
Restos representativos
de la divulgación incluyen, entre otros, restos de las siguientes fórmulas:
��
��
��
��
5 y
Los conjugados de péptido-oligonudeótido representativos de la divulgación incluyen, entre otros, conjugados de péptidooligonudeótido de las siguientes estructuras:
��
��
��
��
��
��
��
, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde
G se selecciona entre H y -C(O)CH3, y
E' se selecciona entre H y -C(O)CH3.
En una realización de los conjugados péptido-oligonudeótido de la divulgación, G es H.
En otra realización de los conjugados péptido-oligonudeótido de la divulgación, G es -C(O)CH3..
En otra realización más de los conjugados péptido-oligonucleótido de la divulgación, E' es H.
En otra realización más de los conjugados péptido-oligonucleótido de la divulgación, E' es -C(O)CH3..
En otra realización más de los conjugados péptido-oligonucleótido de la divulgación, E' y G son -C(O)CH3..
En otra realización más de los conjugados péptido-oligonucleótido de la divulgación, G es -C(O)CH3 y E' es H.
En algunas realizaciones, los conjugados de péptido-oligonucleótido descritos en el presente documento no están solvatados. En otras realizaciones, uno o más de los conjugados péptido-oligonucleótido están en forma solvatada. Como se sabe en la técnica, el solvato puede ser cualquiera de los disolventes farmacéuticamente aceptables, tales como agua, etanol y similares.
Aunque los conjugados de péptido-oligonucleótido de Fórmulas I, Ia, Ib, Ic, Id, Ie y IV se representan en sus formas neutras, en algunas realizaciones, estos conjugados de péptido-oligonucleótido se usan en una forma de sal farmacéuticamente aceptable.
Oligonucleótidos
Las propiedades importantes de las subunidades basadas en morfolino incluyen: 1) la capacidad de unirse en forma oligomérica mediante enlaces estructurales estables, sin carga o con carga positiva; 2) la capacidad de soportar una base de nucleótidos (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, uracilo, 5-metilcitosina e hipoxantina) de modo que el polímero formado pueda hibridarse con un ácido nucleico diana de base complementaria, incluido el ARN diana, valores de T<m>superiores a aproximadamente 45 °C en oligonucleótidos relativamente cortos (por ejemplo, 10-15 bases); 3) la capacidad del oligonucleótido para ser transportado activa o pasivamente al interior de células de mamíferos; y 4) la capacidad del oligonucleótido y del oligonucleótido:heterodúplex de ARN para resistir la degradación de la ARNasa y la ARNasa H, respectivamente.
La estabilidad del dúplex formado entre un oligómero y una secuencia diana es función de la unión T<m .>y la susceptibilidad del dúplex a la escisión enzimática celular. El T<m>de un oligómero con respecto al ARN de secuencia complementaria puede medirse mediante métodos convencionales, tales como los descritos por Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, págs. 107-108 o como se describe en Miyada C. G. y Wallace R. B. , 1987, Oligomer Hybridization Techniques, Methods Enzymol. vol. 154 págs. 94-107. En determinadas realizaciones, los oligómeros antisentido pueden tener una unión T<m .>, con respecto a un ARN de secuencia complementaria, de temperatura superior a la corporal y, en algunas realizaciones, superior a aproximadamente 45 °C o 50 °C. T<m>también incluye temperaturas en el intervalo de 60 80 °C o más. Según principios bien conocidos, el T<m>de un oligómero, con respecto a un híbrido de ARN de base complementaria, se puede aumentar aumentando la proporción de bases emparejadas C:G en el dúplex, o aumentando la longitud (en pares de bases) del heterodúplex, o ambos. Al mismo tiempo, con el fin de optimizar la absorción celular, puede resultar ventajoso limitar el tamaño del oligómero. Por esta razón, los compuestos de la divulgación incluyen compuestos que muestran una alta T<m .>(45-50 °C o más) con una longitud de 25 bases o menos.
La longitud de un oligonucleótido puede variar siempre que sea capaz de unirse selectivamente a la ubicación deseada dentro de la molécula de pre-ARNm. La longitud de dichas secuencias se puede determinar de acuerdo con los procedimientos de selección descritos en el presente documento. Generalmente, el oligonucleótido tendrá una longitud de aproximadamente 8 nucleótidos hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la longitud del oligonucleótido (z) puede ser 8-38, 8-25, 15-25, 17-21 o aproximadamente 18. Sin embargo, se apreciará que se puede utilizar cualquier longitud de nucleótidos dentro de este intervalo para los usos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido contienen modificaciones o sustituciones de bases. Por ejemplo, se pueden seleccionar ciertas nucleobases para aumentar la afinidad de unión de los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina y 2,6-diaminopurina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico entre 0,6 y 1,2 °C y pueden incorporarse a los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento. En una realización, al menos una base de pirimidina del oligonucleótido comprende una base de pirimidina 5-sustituida, donde la base de pirimidina se selecciona del grupo que consiste en citosina, timina y uracilo. En una realización, la base de pirimidina 5-sustituida es 5-metilcitosina. En otra realización, al menos una base de purina del oligonucleótido comprende una base de purina N-2, N-6 sustituida. En una realización, la base de purina N-2, N-6 sustituida es 2, 6-diaminopurina.
Los oligómeros basados en morfolino (incluidos los oligómeros antisentido) se detallan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 5.698.685; 5.217.866; 5.142.047; 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.521.063; 5.506.337 y las solicitudes de patente estadounidenses pendientes Nos. 12/271.036; 12/271.040; y Publicación PCT No. WO/2009/064471 y WO/2012/043730 y Summerton et al. 1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187 195.
Por consiguiente, en un aspecto, en el presente documento se proporciona un oligonucleótido de Fórmula II:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde
A se selecciona del grupo que consiste en OH, -NHCH2C(O)NH2, -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2, y
R5 es -C(O)(O-alquil)xOH, donde x es 3-10 y cada grupo alquilo es independientemente en cada aparición -alquilo de C2-6, o R5 se selecciona del grupo que consiste en -C(O)alquilo de C1-6, tritilo, monometoxitritilo, -alquilo de C1-6-R6, -heteroalquilo de C1-6-R6, -aril-R6, -heteroaril-R6,-C(O)Oalquilo de C1-6-R6, -C(O)O-aril-R6y -C(O)O-heteroaril-R6;
R6 se selecciona del grupo que consiste en OH, SH y NH2, o R6 es O, S o NH, unido covalentemente a un soporte sólido;
cada R1 es independientemente OH o -NR3R4;
cada R3 y R4 son independientemente en cada aparición -alquilo de C1-6;
cada R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, una nucleobase y una nucleobase funcionalizada con un grupo químico protector, donde la nucleobase comprende independientemente en cada aparición un anillo heterocíclico de C3-6 seleccionado del grupo que consiste en piridina, pirimidina, triazinano, purina y deaza-purina;
z es 8-40;
E se selecciona del grupo que consiste en H, -alquilo de C1-6, -C(O)alquilo de C1-6, benzoilo, estearoilo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo,
Q es -C(O)(CH2)6C(O)- o -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-;
R7 es -(CH2)2OC(O)N(R8)2;
R8 es -(CH2)6NHC(=NH)NH2;
R12 es -C(O)NHalquilo de Ci-6 o -C(O)Oalquilo de Ci-6; y
R13 se selecciona del grupo que consiste en tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo y trimetoxitritilo.
En una realización de la Fórmula II, A es
E se selecciona del grupo que consiste en H, -C(O)CH3, benzoilo y estearoilo;
R5 es -C(O)(O-alquil)x-OH, donde cada grupo alquilo es independientemente en cada aparición -alquilo de C2-6, tritilo y 4-metoxitritilo; y
cada R2 es independientemente una nucleobase, donde la nucleobase independientemente en cada aparición comprende un anillo heterocíclico de C4-6 seleccionado del grupo formado por piridina, pirimidina, purina y deazapurina.
En otra realización de la Fórmula II, R5 es C(O)(O-CH2CH2)3-OH; y
cada R2 es independientemente una nucleobase, donde la nucleobase independientemente en cada aparición comprende una pirimidina o una purina.
En aún otra realización, el oligonucleótido de Fórmula II es un oligonucleótido de Fórmula IIa:
En una realización de Fórmula II y IIa, R2 es independientemente en cada aparición adenina, 2,6-diaminopurina, guanina, hipoxantina, citosina, 5-metilcitosina, timina, uracilo e hipoxantina; y
cada R1 es -N(CH3)2.
En la Tabla 1 se proporcionan diversas realizaciones de restos de nucleótidos como se describe en el presente documento.
Table 1:Various embodiments of nucleotide moieties
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos descritos en el presente documento no están solvatados. En otras realizaciones, uno o más de los oligonucleótidos están en forma solvatada. Como se sabe en la técnica, el solvato puede ser cualquiera de los disolventes farmacéuticamente aceptables, tales como agua, etanol y similares.
Aunque los oligonucleótidos de Fórmulas II y IIa se representan en sus formas neutras, en algunas realizaciones, estos oligonucleótidos se usan en una forma de sal farmacéuticamente aceptable.
Péptidos
Los oligonucleótidos proporcionados en el presente documento incluyen un resto de oligonucleótido conjugado con un CPP. En algunas realizaciones, el CPP puede ser un resto transportador de péptidos rico en arginina eficaz para mejorar el transporte del compuesto al interior de las células. En algunas realizaciones, el resto de transporte está unido a un extremo del oligómero. Los péptidos tienen la capacidad de inducir la penetración celular dentro del 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de las células de una población de cultivo celular determinada, incluidos todos los números enteros intermedios, y permiten translocación macromolecular dentro de múltiples tejidosin vivotras la administración sistémica. En una realización, el péptido que penetra en las células puede ser un transportador peptídico rico en arginina. En diversas realizaciones, un conjugado de péptido-oligonucleótido de la presente divulgación puede utilizar glicina como conector entre el CPP y el oligonucleótido antisentido.
Se ha demostrado que los restos de transporte descritos anteriormente mejoran en gran medida la entrada celular de oligómeros unidos, en relación con la absorción del oligómero en ausencia del resto de transporte unido. La absorción puede mejorarse al menos diez veces y, en algunas realizaciones, veinte veces, con respecto al compuesto no conjugado. El uso de transportadores de péptidos ricos en arginina (es decir, péptidos que penetran en las células) es particularmente útil en la práctica de la presente divulgación. Se ha demostrado que ciertos transportadores de péptidos son muy eficaces en la administración de compuestos antisentido a las células primarias, incluidas las células musculares. Además, en comparación con otros transportadores peptídicos conocidos, como la penetratina y el péptido Tat, los transportadores peptídicos descritos en el presente documento, cuando se conjugan con una PMO antisentido, demuestran una capacidad mejorada para alterar el empalme de varios transcritos de genes.
Por lo tanto, en un aspecto, en el presente documento se proporciona un péptido de Fórmula III:
G-(J)t-L (III)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde
G se selecciona del grupo que consiste en H, C(O)alquilo de C1-6, benzoilo y estearoilo;
cada J se selecciona independientemente en cada aparición entre cisteína y arginina
donde dos o más grupos de cadena lateral de aminoácidos de forma independiente en cada aparición comprenden un tiol o un tiol funcionalizado con un grupo protector químico;
L se selecciona del grupo que consiste en -NH(CH2)1-6C(O)OH, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)OH, y
cada uno de los cuales puede estar unido covalentemente a un soporte sólido; y
t es 4-9.
En una realización, dos grupos de cadena lateral de aminoácidos, donde cada uno de los dos grupos de cadena lateral de aminoácidos comprende independientemente un azufre, junto con los átomos a los que están unidos, forman la estructura
M se selecciona del grupo que consiste en
d es 0 o 1.
En otra realización, M es
En otra realización más, dos grupos de cadena lateral de aminoácidos son independientemente en cada aparición grupos de cadena lateral de aminoácidos de cisteína u homocisteína.
En otra realización más, dos grupos J son cisteína.
En aún otra realización, L se selecciona de -NH(CH2)1-6C(O)OH y
En otra realización más, L es NHCH2C(O)OH.
En otra realización más, G se selecciona del grupo que consiste en H, C(O)CH3, benzoilo y estearoilo.
En otra realización más, G es C(O)CH3. o estearoilo.
En otra realización, G es C(O)CH3..
En otra realización más, G está unido covalentemente al extremo amino de J. En una realización adicional, L está unido covalentemente mediante un enlace amida al extremo carboxi de J.
En otra realización, d es 0.
En otra realización más, d es 1.
En la Tabla 2 se proporcionan péptidos representativos como se describe en el presente documento.
T l 2:P i m l r
En algunas realizaciones, los péptidos descritos en el presente documento no están solvatados. En otras realizaciones, uno o más de los péptidos están en forma solvatada. Como se sabe en la técnica, el solvato puede ser cualquiera de los disolventes farmacéuticamente aceptables, tales como agua, etanol y similares.
Aunque los péptidos de Fórmula III se representan en sus formas neutras, en algunas realizaciones, estos oligonucleótidos se usan en una forma de sal farmacéuticamente aceptable.
Esquemas sintéticos generales
Esquema le: Conjugación de peptido al extremo de PIvlO
El proceso del Esquema Ila es aplicable a la conjugación del péptido al extremo 5' del PMO en condiciones similares (ver Esquema Ic).
Esquema Illa: Conjugación de un recipiente y engrapado con peptido y PMO
En el presente documento se proporcionan conjugados de péptido-oligonudeótido descritos en el presente documento para usarse en el tratamiento de una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana en un sujeto que lo necesita.
En una realización, la enfermedad muscular es distrofia muscular de Duchenne.
En otra realización, la infección viral es causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de Marburg, virus del Ébola, virus de la influenza y virus del dengue.
En otra realización, la infección bacteriana es causada porMycobacterium tuberculosis.
El sujeto considerado en el presente documento es típicamente un ser humano. Sin embargo, el sujeto puede ser cualquier mamífero para el que se desee tratamiento. Por lo tanto, los usos descritos en el presente documento se pueden aplicar tanto a aplicaciones humanas como veterinarias.
Administración/Dosis
La formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración (dosificación) está dentro de la experiencia de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado patológico a tratar, durando el curso del tratamiento desde varios días hasta varios meses, o hasta que se logre una disminución suficiente del estado patológico. Los esquemas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente.
Las personas con conocimientos habituales pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligómeros individuales y, en general, pueden estimarse basándose en EC50s demostrado que es eficaz en modelos animalesin vitroein vivo.En general, la dosis es de 0,01 |jg a 100 g/kg de peso corporal y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensual o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Las personas con conocimientos ordinarios en la técnica pueden estimar fácilmente las tasas de repetición de la dosificación basándose en los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, donde el oligómero se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan entre 0,01 jg y 100 g/kg de peso corporal, una o más veces al día, a una vez cada 20 años.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido (un oligonucleótido de Fórmulas II o Ila) se administra solo.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido se administra en una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un oligonucleótido de Fórmula II o IIa que, cuando se administra solo a un paciente, trata eficazmente una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana. Una cantidad que demuestra ser una "cantidad terapéuticamente eficaz" en un caso dado, para un sujeto en particular, puede no ser eficaz para el 100 % de los sujetos tratados de manera similar para la enfermedad o afección en consideración, incluso aunque dicha dosis se considere una "cantidad terapéuticamente eficaz" por profesionales expertos. La cantidad de oligonucleótido que corresponde a una cantidad terapéuticamente eficaz depende en gran medida del tipo de enfermedad, el estadio de la enfermedad, la edad del paciente que se está tratando y otros hechos.
En diferentes realizaciones, dependiendo del oligonucleótido de Fórmulas II o IIa y de las cantidades eficaces utilizadas, los oligonucleótidos pueden modular la expresión de un gen implicado en una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana.
Si bien las cantidades de un oligonucleótido de Fórmulas II o IIa deberían dar como resultado el tratamiento eficaz de una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana, las cantidades preferiblemente no son excesivamente tóxicas para el paciente (es decir, las cantidades están preferiblemente dentro de límites de toxicidad establecidos por las directrices médicas). En algunas realizaciones, ya sea para prevenir una toxicidad excesiva o proporcionar un tratamiento más eficaz, o ambos, de una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana, se proporciona una limitación en la dosis total administrada. Normalmente, las cantidades del presente documento consideradas son por día; sin embargo, en el preente documento también se consideran ciclos de medio día y de dos o tres días.
Se pueden usar diferentes regímenes de dosificación para tratar una enfermedad muscular, una infección viral o una infección bacteriana. En algunas realizaciones, una dosis diaria, tal como cualquiera de las dosis ejemplares descritas anteriormente, se administra una, dos, tres o cuatro veces al día durante tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez días. Dependiendo de la etapa y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, se puede emplear un tiempo de tratamiento más corto (por ejemplo, hasta cinco días) junto con una dosis alta, o un tiempo de tratamiento más largo (por ejemplo, diez o más días, o semanas, o un mes, o más) se pueden emplear junto con una dosis baja. En algunas realizaciones, se administra una dosis una o dos veces al día en días alternos.
Los oligonucleótidos de Fórmula II y IIa, o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en forma pura o en una composición farmacéutica apropiada, pueden administrarse mediante cualquiera de los modos de administración aceptados o agentes conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos se pueden administrar, por ejemplo, por vía oral, nasal, parenteral (intravenosa, intramuscular o subcutánea), tópica, transdérmica, intravaginal, intravesical, intracistemal o rectal. La forma de dosificación puede ser, por ejemplo, un polvo sólido, semisólido, liofilizado o formas de dosificación líquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas de gelatina blandas, elásticas o duras, polvos, soluciones, suspensiones, supositorios, aerosoles, o similares, por ejemplo, en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración sencilla de dosificaciones precisas. Una vía de administración particular es la oral, particularmente aquella en la que se puede ajustar un régimen de dosificación diario conveniente según el grado de gravedad de la enfermedad a tratar.
Los agentes auxiliares y adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, agentes conservantes, humectantes, suspensores, edulcorantes, aromatizantes, perfumantes, emulsionantes y dispensadores. La prevención de la acción de los microorganismos generalmente se proporciona mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También pueden incluirse agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Los agentes auxiliares también pueden incluir agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes amortiguadores del pH y antioxidantes, tales como, por ejemplo, ácido cítrico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, hidroxitolueno butilado y similares.
Se pueden preparar formas de dosificación sólidas con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. Pueden contener agentes pacificantes y pueden tener una composición tal que liberen el oligonucleótido u oligonucleótidos activos en una determinada parte del tracto intestinal de forma retardada. Ejemplos de composiciones embebidas que pueden usarse son sustancias poliméricas y ceras. Los oligonucleótidos activos también pueden estar en forma microencapsulada, si corresponde, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Dichas formas de dosificación se preparan, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., los inhibidores de HDAC o ácido retinoico descritos en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares; agentes solubilizantes y emulsionantes, como por ejemplo alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida; aceites, en particular, aceite de semilla de algodón, aceite de maní, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán; o mezclas de estas sustancias, y similares, para formar de ese modo una solución o suspensión.
Generalmente, dependiendo del modo de administración previsto, las composiciones farmacéuticamente aceptables contendrán aproximadamente del 1 % al 99 % en peso de los oligonucleótidos descritos en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y del 99 % al 1 % en peso de un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, la composición estará entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 75 % en peso de un oligonucleótido descrito en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, siendo el resto excipientes farmacéuticos adecuados.
Los métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica. Se hace referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1990).
Kits
En otras realizaciones, se proporcionan kits. Los kits según la divulgación incluyen paquetes que comprenden oligonucleótidos, péptidos, conjugados de péptido-oligonucleótido o composiciones de la divulgación. En algunas realizaciones, los kits comprenden un conjugado de péptido-oligonucleótido de acuerdo con las Fórmulas I, la, Ib, Ic, Id, le o V, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras realizaciones, los kits comprenden un oligonucleótido según las Fórmulas II o IIa, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Aún en otras realizaciones, los kits comprenden un péptido según la Fórmula III, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La frase "paquete" significa cualquier recipiente que contenga oligonucleótidos o composiciones presentadas en el presente documento. En algunas realizaciones, el paquete puede ser una caja o un envoltorio. Los materiales de envasado para usarse en el envasado de productos farmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo de administración y tratamiento previsto.
El kit también puede contener elementos que no están contenidos dentro del paquete, pero que están unidos al exterior del envasado, por ejemplo, pipetas.
Los kits pueden contener además instrucciones para administrar oligonucleótidos o composiciones de la divulgación a un paciente. Los kits también pueden comprender instrucciones para usos aprobados de oligonucleótidos en el presente documento por agencias reguladoras, como la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Los kits también pueden contener etiquetas o inserciones de productos para los oligonucleótidos. Los paquetes o cualquier prospecto del producto, o ambos, pueden ser aprobados por las agencias reguladoras. Los kits pueden incluir oligonucleótidos en fase sólida o en fase líquida (como los amortiguadores proporcionados) en un paquete. Los kits también pueden incluir amortiguadores para preparar soluciones para realizar los usos y pipetas para transferir líquidos de un recipiente a otro.
EJEMPLOS
A continuación, se exponen ejemplos con fines ilustrativos y para describir ciertas realizaciones específicas de la divulgación. Sin embargo, el alcance de las reivindicaciones no debe verse limitado de ninguna manera por los ejemplos establecidos en el presente documento. Varios cambios y modificaciones a las realizaciones divulgadas serán evidentes para los expertos en la técnica y dichos cambios y modificaciones, incluidos, sin limitación, los relacionados con las estructuras químicas, sustituyentes, derivados, formulaciones o métodos de la divulgación, se pueden realizar sin apartarse de la divulgación y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las definiciones de las variables en las estructuras de los esquemas del presente documento son proporcionales a las de las posiciones correspondientes en las fórmulas presentadas en el presente documento.
Ejemplo 1: Un protocolo para el grapado de péptidos con hexafluorobenceno
Al péptido disulfuro cíclico Ac-CRRRCRRRG-OH (74,8 mg, 38,5 pmol) (SEQ ID NO:3) en un vial de vidrio se le añade una solución de base TRIS (8 mL, 50 mM en DMF) y hexafluorobenceno (111 pl, 962 pmol). A esta solución, se le añade una solución de TCEP en H2O (136 pL, 0,71 M, pH = 8) para reducir el enlace disulfuro e iniciar la reacción. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 7 horas y se controla por LC-MS. La mezcla resultante se diluye con 40 mL de TFA al 0,1 % en agua, se centrifuga, se filtra y se somete a purificación por HPLC. Las fracciones que contienen el producto peptídico (analizado por LC-MS) se combinan y se liofilizan para dar el péptido perfluoroarilo deseado (19,9 mg, 8,9 ^mol, rendimiento del 23 %).
Ejemplo 2: Un protocolo para el grapado de péptidos con decafluorobifenilo
En un vial de vidrio, el péptido disulfuro cíclico Ac-CRRRCRRRG-OH (74,5 mg, 38,4 ^mol) (SEQ ID NO:3) y decafluorobifenilo (25,6 mg, 76,7 |jmol se disuelven en una solución de base TRIS en DMF (8 mL, 50 mm). A esta solución se le añade una solución de TCEP en H2.O (135 ^L, 0,71 M, pH ~ 8) para reducir el enlace disulfuro e iniciar la reacción. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 7 horas y se controla por LC-MS. La mezcla resultante se diluye con TFA en agua (40 mL al 0,1%), se centrifuga, se filtra y se somete a purificación por HPLC. Las fracciones que contienen el producto peptídico se analizan mediante LC-MS, se combinan y se liofilizan para dar el péptido perfluoroarilo final (20 mg, 8,9 ^mol, rendimiento del 23 %).
Ejemplo 3: Un protocolo para la conjugación de péptidos
A una mezcla de la PMO (secuencia de nucleobases (R2) es: GCT ATT ACC TTA ACC CAG (SEQ ID NO:9); 10,7 mg, 1,72 ^mol) y al péptido decafluorobifenilo Ac-CRRRCRRRG-OH (5,9 mg, 2,64 ^mol) en un tubo Eppendorf de plástico se le añade DM<s>O (0,4 mL), HATU en DMSO (6,6 |<j>L, 2,64 |jmol, 0,4 M) y DIPEA (2,3 |<j>L, 13,2 |jmol). Se mezcla el contenido del tubo y se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla resultante se diluye con agua (8 mL) y se somete secuencialmente a intercambio catiónico débil (CM Sepharose) y extracción en fase sólida (Amberchrom CG 300M). El producto resultante se analiza mediante LC-MS y<m>A<l>DI-TOF MS, y se liofiliza para dar el conjugado PMO-péptido (9,8 mg, 1,26 ^mol, rendimiento 73 %).
Ejemplo 4: Un protocolo para la conjugación en un solo recipiente de PMO con un péptido disulfuro cíclico seguido de grapado de péptidos
A una solución de PMO (85 mg, 0,01 mmol, 1 eq; secuencia de nucleobases (R2): GCT ATT ACC TTA ACC CAG (SEQ ID NO:9)), el péptido (Ac-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-OH o Ac-Cys-Arg-Arg-Arg- A Cys-Arg-Arg-Arg-Gly-OH, 37 mg, cada uno con un puente disulfuro, 2 eq) y HATU (8 mg, 2 eq) en DMS<o>(2 mL) se le añade diisopropiletilamina (9 |jL, 5 eq). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 horas. Después de agregar 50 mM de ditiotreitol (DTT) en solución de DMSO (1 ml, 5 eq), 50 mM de TRIS en solución de DMSO (1 ml, 5 eq), seguido de hexafluorobenceno (60 jl, 25 eq), la solución de reacción se agitó durante otras 5 horas. El producto deseado se obtiene mediante cromatografía de intercambio catiónico débil (CM-Sepharose) seguido de extracción en fase sólida (Amberchrome CG300M) para desalar y finalmente liofilización. Espectro de masas MALDI/TOF (m/z): calculado: 9975; encontrada: 9976 (M+H).
Ejemplo 5: Ensayo de células HeLa
El gráfico de la Figura 1 (ver también la Tabla 3) muestra en el eje y la "intensidad de fluorescencia media" de la emisión de fluorescencia verde de la proteína e-GFP leída de cada célula individual mediante un citómetro de flujo Accuri C6 y resumida por el software de procesamiento. La altura de las barras de señal fluorescentes verdes indica diferentes intensidades con base en el nivel de omisión de exones que se produce en el núcleo de las células HeLa-654, ya sea que las células estén tratadas o no con compuestos de prueba. La intensidad de la señal o el tamaño de la barra también corresponde a la eficacia de la absorción celular (es decir,administración al interior de la célula).El eje x muestra los compuestos de prueba ensayados con una variedad de regímenes de tratamiento diferentes. Los diversos regímenes de tratamiento incluyen el tratamiento continuo de células HeLa-654 a lo largo del tiempo o tratamientos de seguimiento de pulsos en los que un compuesto de prueba se incuba con células y luego, después de un período de tiempo (3 horas), se elimina por lavado de las células y se agrega un medio fresco libre del compuesto de prueba.
Resultados:Se muestra la actividad inicial de PMO no conjugada y de células no tratadas. Todos los conjugados péptido/PMO (PPMO) de la presente divulgación muestran una mayor absorción celular que: 1) PMO no conjugado y 2) células no tratadas (las cuales revelan la señal de fondo fluorescente verde). Esta diferencia en la intensidad de fluorescencia entre los conjugados de péptido/PMO de la presente invención y el fondo o PMO no conjugado indica una actividad farmacológica significativa de los conjugados de péptido/PMO grapados.
En cada caso, la PMO tiene la siguiente estructura:
donde la secuencia de nucleobases (que comprende cada aparición de R2 seleccionándose independientemente de una nucleobase seleccionada de A, G, C o T) es: G<c>T ATT ACC TTA ACC CAG (SEQ ID NO:9).
T l : A mini r i n l l r n i - li n l i Fi r 1
PPMO 3 se refiere a la siguiente estructura:
donde la secuencia de nucleobases (que comprende cada aparición de R2 seleccionándose independientemente de una nucleobase seleccionada de A, G, C o T) es: Gc T ATT ACC TTA ACC CAG (SEQ ID NO:9).
PPMO 4 se refiere a la siguiente estructura:
donde la secuencia de nucleobases (que comprende cada aparición de R2 seleccionándose independientemente de una nucleobase seleccionada de A, G, C o T) es: Gc T ATT ACC TTA ACC CAG (SEQ ID NO:9).
Ejemplo 6: Omisión de proteínas y exones in vivo
Se trataron 14 grupos de 5 ratones cada uno (70 ratones en total; 65 mdx, 5 wt) como se describe a continuación y luego se analizaron para determinar la proteína distrofina y la omisión de exones.
A los ratones se les administró un bolo de 200 ^L de compuesto mediante inyección en la vena de la cola y luego se les practicó la eutanasia 8 días después de la inyección. Se recogieron, lisaron y analizaron tejidos del cuádriceps, el diafragma, el corazón y el cerebro (estructuras individuales) para detectar la proteína distrofina mediante transferencia Western tradicional, y se analizaron para detectar la omisión de exones mediante RT-PCR y Caliper (consulte las Figuras 2-7).
Se probaron realizaciones de compuestos de la presente divulgación para determinar su capacidadin vivopara efectuar la remodelación de ARNm y proteínas. Al final, estos compuestos probados mostraron actividad en el ratón mdx, provocando aumentos sustanciales en la omisión del exón 23 y la expresión de la proteína distrofina, como lo muestran la RT-PCR y la transferencia Western, respectivamente. Esta actividad es especialmente pronunciada cuando se mide contra el fondo de experimentos de control negativo en los que al ratón mdx se le administró solución salina, una condición que produjo esencialmente cero omisión del exón 23 y distrofina (Figuras 4D, 5C, 5D, 6D, 7C y 7D). Cuando se compararon con los dos controles positivos, ratones de tipo salvaje y ratones mdx a los que se les administró un compuesto activo conocido Ac-R6-Gly-M23D(+7-18) (PPMO 5), los compuestos probados fueron claramente activos. En algunos casos la actividad fue mayor que el control; por ejemplo, PPMO 11 (Tabla 4) produjo respuestas mucho mayores en la omisión de exones y la expresión de distrofina en dosis más bajas que el compuesto de control positivo (Figuras 7B y 7D). Por lo tanto, los compuestos probados cumplen la condición de provocar respuestas farmacológicas positivas en el contexto de un ensayo de detecciónin vivode siete días.
Las realizaciones de compuestos (PPMO) de la presente divulgación utilizadas en estos estudios tienen una estructura según la Fórmula V:
la secuencia de nucleobases (que comprende cada aparición de R2 seleccionándose independientemente de una nucleobase seleccionada de A, G, C o T) es: 5'- GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG Aa A T-3' (SEQ ID NO: 14); y
R14 es como se define en la Tabla 4.
Los compuestos de la Tabla 4 se prepararon según los Ejemplos 1-4 anteriores.
Tabla 4
Protocolo de transferencia W estern de distrofina:
1. El tejido se retiró a -80 °C y se cortó manualmente en trozos pequeños, se agregaron entre 400 y 800 pL de amortiguador de lisis RIPA según el tipo de tejido.
a. TA: 400 pl, control de calidad: 800 pL, Corazón: 400 pL
b. Amortiguador de lisis: Amortiguador RIPA (Pierce, cat# 89901) y cóctel inhibidor de proteinasa (Roche, cat# 04693124001)
2. Se añadieron al tubo aproximadamente diez perlas de circonio de 2,0 mm (Biospec, Cat# 11079124zx) y los tejidos se lisaron con MagNA Lyser (Roche) de la siguiente manera:
a. 5.000 rpm, 30-40 s, enfriado durante 2 min en hielo. Los ciclos se repitieron hasta que los tejidos estuvieron completamente lisados.
Como alternativa a las perlas de circonio, se usaron perlas de metal (3-5 perlas), 3000 rpm, 20 s por ciclo (enfriadas en hielo entre ciclos durante 3-5 minutos o hasta que estén frías al tacto).
3. Después de la lisis, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se realizó un ensayo BCA para cuantificar los niveles de proteína.
4. Electroforesis en gel:
a. Se cargó el marcador (Invitrogen, cat# P/NLC5699) y se cargaron 100 |jg de proteína por carril, y las muestras se procesaron en un gel de Tris acetato al 3-8 % (gel midi, Biorad, cat# 345-0130) a 50 v, 5 min; 150 v, 1 h y luego 200 v durante 1,5 h (el marcador de 71 kD estaba en el fondo del gel).
5. Transferir:
Transferencia húmeda durante la noche (16-18 h) a 4 °C, constante 100 mA (~25 v), membrana de PVDF de 0,45 m (Biorad, cat# 1620261).
6. La membrana se lavó en TBST durante 5 minutos y se bloqueó en leche al 10 % (Biorad, cat# 170-6404) en TBST durante 1-2 horas a temperatura ambiente (RT por sus siglas en inglés).
7. La membrana de PVDF se enjuagó con TBST 2-3 veces y luego se incubó con anticuerpo primario en BSA al 5 % en PBS durante la noche a 4 °C.
a. Dys2 (Novocastra, Leica Biosystem, cat#NCL-DYS2) 1:30
b. Dys1 (Novocastra, Leica Biosystem, cat#NCL-DYS1) 1:1000
c. Mandys8 (Sigma, cat#D8168) 1:3000.
8. La membrana se lavó con TBST (10 min cada vez, 3 veces), se añadió anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con HRP (BioRad, cat# 1706516, 1:10000), se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó con TBST (10 min por cada vez, 3 veces).
9. Se añadió el sustrato Clarity Western ECL (Biorad) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego se visualizó con el sistema de imágenes táctiles Chemidoc.
10. La membrana se despojó con NaOH 0,2 N durante 7 min y luego se equilibró en TBST durante al menos 10 min.
La transferencia se bloqueó con leche al 10 % en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
11. Se añadió anticuerpo a-actinina2 (Abcam, conejo, cat# ab68168, 1:15000) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
12. Se lavó con TBST (10 min por cada vez, 3 veces) y luego se incubó con el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP (BioRad, cat# 1706515, 1:10000) durante 1 hora a temperatura ambiente.
13. La membrana se lavó extensamente con TBST y luego se tomaron imágenes como se describe anteriormente.M étodo de extracción de A R N para te jidos de ratón:
1. Se homogeneizaron trozos de tejido completo (medio cuádriceps, medio corazón, TA completo...) con MagNA Lyser y perlas metálicas a 3.000 rpm, 20 por ciclo hasta que los tejidos se lisaron bien (las muestras se enfriaron en hielo entre ciclos durante 3-5 minutos o hasta que esté frío al tacto). Se transfirieron 50-100 jL de lisado completo a una nueva placa de 96 pocillos y se mezclaron con el mismo volumen de amortiguador RA4 (del kit GE ARNspin); luego, la mezcla de lisado se cargó en la placa ARNspin de 96 pocillos para los pasos de purificación restantes. El lisado no utilizado (en amortiguador RA1) se almacenó a -80 °C durante un año según el protocolo del kit.
2. Las muestras se centrifugaron durante 2 min a 5.200 g. Se añadieron 500 jL de RA3 a cada pocillo de la placa de unión de ARN y la placa se centrifugó durante 2 minutos a 5.200 g. El flujo fue descartado.
3. La membrana se lavó añadiendo 500 jL de RA2 a cada pocillo de la placa de unión de ARN y se centrifugó durante 2 minutos a 5.200 g.
4. Se añadieron 800 jL de RA3 a cada pocillo y se centrifugaron durante 2 minutos a 5.200 g.
5. Se añadieron 500 jL de RA4 a cada pocillo y se centrifugaron durante 10 minutos a 5.200 g.
6. Las muestras se eluyeron en una placa de PCR (con pocillos cónicos) pipeteando 50 jL de agua libre de ARNsa en el fondo de cada pocillo, asegurando que la membrana estuviera completamente humedecida. Las muestras se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 5.200 g durante 3 minutos. Si quedaba algo de líquido en el pocillo, las muestras se incubaron durante 2 minutos adicionales a temperatura ambiente y se centrifugaron nuevamente a 5.200 g durante 3 minutos.
7. Luego se midió la concentración de ARN en un espectrofotómetro Nanodrop 2000.
Protocolo RT-PCR:
Los cebadores utilizados para RT-PCR fueron los siguientes: Distrofina exterior delantera: 5'-CAAT GTTT CT GGAT GCAGACTTT GTGG-3' (SEQ ID NO:10); Distrofina exterior inversa: 5'-GTT CAGCTT CACT CTTT AT CTT CT GCC-3' (SEQ ID NO:11); Distrofina Interior Delantera: 5'-CACATCTTTGATGGGTGAGG-3' (SEQ ID NO:12); y Distrofina interna inversa: 5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG-3' (SEQ ID NO:13).
Se prepararon reacciones de 25 |jL (Tabla 5) para RT-PCR y amplificación primaria. El programa de RT-PCR se realizó de acuerdo con la Tabla 6.
Tabla 5:Mezcla de reacción de RT-PCR
T l :Pr r m RT- P R m lifi i n rim ri
Protocolo de calibre:
Una vez completada la RT-PCR, se añadieron 25<j>L de amortiguador de PCR y los 50<j>L totales de la mezcla de reacción se transfirieron a una placa Caliper. El bioanálisis de Caliper LabChip se realizó según el protocolo recomendado por los fabricantes. El producto de la<p>C<r>del transcrito de distrofina de longitud completa es de 445 bps y de 232 bps del ARNm omitido en el exón 23.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un conjugado de péptido-oligonudeótido de Fórmula I:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: A' se selecciona de -NHCH2C(O)NH2, -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
    donde R5 es -C(O)(O-alquil)x-OH, en donde x es 3-10 y cada grupo alquilo es independientemente en cada aparición alquilo de C2-6, o R5 se selecciona de -C(O)alquilo de C1-6, tritilo, monometoxitritilo, -(alquilo de C1-6)R6, -(heteroalquilo de C1-6)-R6, aril-R6, heteroaril-R6, -C(O)O-(alquilo de C1-6)-R6 , -C(O)O-aril-R6, -C(O)O-heteroaril-R6, y
    en donde R6 se selecciona entre OH, SH y NH2, o R6 es O, S o NH, unido covalentemente a un soporte sólido; cada R1 se selecciona independientemente entre OH y -NR3R4, en donde cada R3 y R4 son independientemente en cada aparición -alquilo de C1-6; cada R2 se selecciona independientemente entre H, una nucleobase y una nucleobase funcionalizada con un grupo protector químico, donde la nucleobase comprende independientemente en cada aparición un anillo heterocíclico de C3-6 seleccionado entre piridina, pirimidina, triazinano, purina y deazapurina; z es 8-40; y E' se selecciona de H, -alquilo de C1-6, -C(O)alquilo de C1-6, benzoílo, estearoílo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo,
    en donde Q es -C(O)(CH2)6C(O)- o -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-, R7 es -(CH2)2OC(O)N(R8)2, donde R8 es -(CH2)6NHC(=NH)NH2, y R11 se selecciona entre O<h>y -NR3R4, donde L está unido covalentemente mediante un enlace amida al extremo carboxi de J, y L se selecciona de -NH(CH2)1-6C(O)-, -NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-, y
    cada J se selecciona independientemente en cada aparición de cisteína y arginina donde dos o más grupos de cadena lateral de aminoácidos independientemente en cada aparición comprenden un azufre, donde dos de los átomos de azufre, junto con los átomos a los que están unidos, forman la estructura
    donde d es 0 o 1, y M se selecciona entre:
    donde cada R10 es independientemente en cada aparición H o un halógeno; y G está unido covalentemente al extremo amino de J, y G se selecciona de H, -C(O)alquilo de C1-6, benzoílo y estearoílo, y donde al menos una de las siguientes condiciones es verdadera: 1) A' es
  2. 2) E' es
    o 3) E' es
    2. El conjugado péptido-oligonudeótido de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde E' se selecciona de H, -alquilo de C1-6, -C(O)alquilo de C1-6, benzoilo, estearoilo, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, y
  3. 3. El conjugado péptido-oligonucleótido de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde A' se selecciona de -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
  4. 4. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde A' se selecciona de -N(alquilo de C1-6)CH2C(O)NH2,
    y E' es
    o en donde A' es
    y E' se selecciona entre H, -C(O)CH3, tritilo, 4-metoxitritilo, benzoílo y estearoílo.
  5. 5. El conjugado péptido-oligonudeótido de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde el conjugado péptido-oligonucleótido de Fórmula I es un conjugado péptido-oligonucleótido seleccionado entre:
  6. 6. El conjugado péptido-oligonucleótido de la reivindicación 1 ó 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde el conjugado péptido-oligonucleótido es de fórmula (Ia) y R5 es -C(O)(O-CH2CH2)3OH. o donde el conjugado péptido-oligonudeótido es de fórmula (Ib) y E' se selecciona entre H, alquilo de Ci-6, -C(O)CH3, benzoilo y estearoilo.
  7. 7. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada R10 es flúor y donde M es
  8. 8. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde z es 8-25.
  9. 9. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada R2 es una nucleobase independientemente en cada aparición seleccionada de adenina, guanina, citosina, 5-metilcitosina, timina, uracilo e hipoxantina.
  10. 10. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde L se selecciona de -NH(CH2)1-aC(O)-, -NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-, y
  11. 11. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde G se selecciona de H, C(O)CH3, benzoilo y estearoilo.
  12. 12. El conjugado péptido-oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde
    se selecciona de:
    5 y
  13. 13. El conjugado péptido-oligonudeótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde el conjugado péptido-oligonudeótido se selecciona de:
    ��
    ��
    , donde G se selecciona entre H y -C(O)CH3, y E' se selecciona entre H y -C(O)CH3.
  14. 14. El conjugado péptido-oligonudeótido de la reivindicación 13, donde E' y G son -C(O)CH3. o donde G es -C(O)CH3 y E' es H.
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