JP2007528224A - リボ核酸(rna)を加水分解するための化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、リボ核酸を加水分解するための方法及び化合物に関する。特に、RNAの特定の位置において、リン酸ジエステル結合の選択的な切断に使用される化合物に関する。
Description
本発明は核酸を加水分解するための方法及び化合物に関する。特に、RNAの特定の位置でリン酸ジエステル結合を選択的に切断することに使用可能な化合物に関する。よって、本発明は、タンパク質工学の分野及び医療の分野において、特にアンチセンス戦略の観点から、分子生物学的技術に関する研究のための有用なツールを提供する。
アンチセンス技術とは、DNA及び/又はRNAの転写又は翻訳が、標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドを使用して調節できる、という知見に基づいている。そのようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、実際のDNA又はRNA標的核酸に相補的であり、反対方向の配列を有するヌクレオチドとして理解されている。天然のオリゴヌクレオチドが、アンチセンス戦略において使用される場合、すなわち、標準、天然塩基及びバックボーンのオリゴヌクレオチドは、通常17個以上の塩基を含んでいて、リボヌクレアーゼH活性を効果的に活性化し、遺伝子発現をダウンレギュレートする。
当該分野が発展するにつれ、オリゴヌクレオチドに対し、それらを使用する条件下で、さらに安定化させる多様な修飾が提案されている。特に、アンチセンス・オリゴヌクレオチドをインタクトな細胞に導入する場合、活性化の減少を引き起こすRNA特異的ヌクレアーゼ及びDNA特異的ヌクレアーゼによる攻撃に曝される。ヌクレアーゼによる分解を抑制する修飾は公開されていて、2´−O-アルキル、アルケニル(アリル)又はアルキニル・ヌクレオチド、ロックト核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロチオエート、モルフォリノなどである。
一方、人工リボヌクレアーゼは、遺伝子操作において利用可能性があるために注目を集めている。特に、RNA切断分子は、オリゴヌクレオチド(DNA)の末端に結合している。オリゴヌクレオチドは、標的RNAにおける特定の配列にハイブリダイズし、後に特定部位で切断する。この点においては、特に、分子内の酸塩基協同を経て、シトシンとアデノシン(CA)間のリン酸ジエステル結合の加水分解に対する感受性を利用している。加水分解は3´側のシトシン・ヌクレオチドで起こる。
Komiyamaらは、カルバメート結合によってDNA19−merの5´末端に固定したジエチレントリアミン(DETA)のハイブリッドが、直鎖状のRNAを3´末端のシトシンで選択的に加水分解して、3´−リン酸末端を有する22−merRNA断片を得た、ということをJ. Chem. Soc., Chem. Commun, 1995, 77-78で報告している。その選択的切断は、アンモニウム・カチオン及びDNA−DETA付加体のエチレンジアミン[−N(CH2)2NH2]部分の中性アミンの分子内の酸塩基協同に起因していた。pH8、50°Cで4時間のインキュベーション後、加水分解していたのは、わずか10mol%RNAだけであった。
この状態を改善するために、Verheijenは10−merPNAを有するDETA付加体を開示している(Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372)。PNAは、生分解に抵抗性であるオリゴヌクレオチドとして選択され、天然のオリゴヌクレオチドよりも強くRNA(又はDNA)に結合するので、PNAモノマー10個のオリゴマーは、ハイブリダイズするのに充分な長さであった。DETA切断部分は尿素結合を経由してPNAと結合した。標的RNAでは、付加的な切断部位は、グアノシンをシトシンに置換することにより導入した。実際に、標的RNAは2箇所で加水分解され、RNA加水分解に対する総置換量は、pH7、40°Cで4時間インキュベーションした後では約29%であった(これらの条件は、Komiyamaが用いた条件よりも、生理的条件がより優れた条件であることに留意のこと)。
以下は、これら2つの先行文献の配列図である。最初に、Komiyamaらにより用いられたDNA−DETAを有するRNA(30−mer)の複合体を示し、次に、VerheijenらのPNA−DETAを有するRNA(25−mer)の複合体を示す。DETAはNH(CH2)2NH(CH2)2NH2を表す。ヌクレオチドユニットは大文字で記載し、PNAユニットは小文字で記載する。矢印は、DNA−DETA又はPNA−DETAによる加水分解のRNAにおける切断位置を示している。KomiyamaRNAのグアノシンは、19位でVerheijenRNAのシトシンと置換されていることに留意のこと。
上述のように、VerheijenRNAは、2箇所で、すなわち3´側のC17及びC19で加水分解される。7時間インキュベーションした後のRNA:PNA−DETAの割合は1:33であり、該RNAの約50%は加水分解され、3´側のC17では約15%、C19では約35%であった。さらに、Verheijenは、3´側のU6での切断に伴う微量な分解生成物に注目した。この切断は次に述べる事実に起因していて、それは、10−merのPNA−オリゴマーは1ヘリックス・ターンに相当し、RNA●PNA−DETA複合体、U6とG7のリン酸ジエステル結合の近くにあるエチレンジアミン残基に位置するという事実である。
他に、考慮の対象となる関連する先行技術としては、Nucleic Acids Symposium Series No. 29,1993, 197-198におけるKomiyamaらの「加水分解する人工ヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼの分子設計」がある。この文献では、標的tRNAにおける可能な2箇所の加水分解するリン酸ジエステル結合により、末端のハイブリダイズするヌクレオチドから3個離れた遠位結合が、末端のハイブリダイズするヌクレオチドから1個離れた結合よりも、さらに容易に加水分解する、ということを示している。しかし、Komiyamaらの加水分解する人工ヌクレアーゼは、分子モデル研究の成果であるということに留意すべきである。これらのヌクレアーゼは、ハイブリダイゼイションの位置及び加水分解する位置を最適化する結果から得られる、ということを当業者に教示している。
Komiyamaのヌクレアーゼは、Verheijenら(上記参照のこと)及びVlassovら(Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7,39-42参照のこと)の原点となっている。Verheijenら及びVlassovらは、加水分解するリン酸ジエステル結合が離れていればいるほど、容易に加水分解するというKomiyamaと同じ結論に達している。Vlassovらは、ポリアミンをベースとする切断基をオリゴヌクレオチドに結合するリンカー構造の長さと硬直性を最適化することにより、また、リンカーがオリゴヌクレオチドに付着する位置を最適化することにより、加水分解すなわち切断効率を改善する余地があることを示唆している。しかし、オリゴヌクレオチドが標的RNAにハイブリダイズする位置をさらに変更することを示唆しているのではない。
本発明の目的は、先行技術の化合物を改良して、加水分解効率が改善した化合物を提供することにより、ポリアミンが介する切断により核酸を加水分解すること、具体的には加水分解の速度を増加させることである。
Komiyama et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun.,1995,77-78 Verheijen, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372 Komiyama et al., Nucleic Acids Symposium Series No.29,1993, 197-198 Vlassov et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7, 39-42
Komiyama et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun.,1995,77-78 Verheijen, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372 Komiyama et al., Nucleic Acids Symposium Series No.29,1993, 197-198 Vlassov et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, vol. 7, 39-42
核酸からポリアミンが結合しているオリゴヌクレオチドへの加水分解に関与するポリアミン部分の距離と、核酸が最適に加水分解する位置に関連性があることが見い出された。これより以下、加水分解に関与するポリアミン部分を、カッターと名付ける。カッターが結合するオリゴヌクレオチドは、以下短縮してオリゴと名付ける。カッターとオリゴの距離は、その2つを共有結合的に結合する構造エレメントにより確立され、以下スペーサーと名付ける。スペーサーによって決定される距離は、オリゴからカッターの原子数によって便宜上記載する。数える原子はオリゴからカッターの直鎖を形成する原子である。あり得る置換基や鎖の枝分れは、スペーサーによって定義される原子数としては数えない。
意外なことに、ヌクレオチドが4個以上離れて、オリゴヌクレオチド末端の複合体が加水分解する予測位置、及び直鎖において原子が2個以上となる、加水分解に関与するポリアミン部分とオリゴヌクレオチドとの距離に関連する場合、シトシン−アデノシン配列の3´末端のシトシンにおける基質RNAの加水分解は、先行技術の化合物に比較して2倍であった。
よって、本発明は、リボ核酸の加水分解に関与する2個以上の窒素原子を含むカッターに結合し、並びに、オリゴ及び前記カッターの末端ヌクレオチド又はその模倣体(mimic)に結合する直鎖に2個以上の原子を含んだスペーサーを有するオリゴ又はその模倣体が、加水分解される予測位置から4〜8個離れてハイブリダイズする、リボ核酸加水分解の方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、
オリゴ−スペーサー−カッター
構造を有するリボ核酸加水分解のための化合物に関する。オリゴは、8個以上のヌクレオチド又はその模倣体のリボ核酸であって、末端ヌクレオチド又はその模倣体が加水分解される位置から4〜8個離れたヌクレオチドにハイブリダイズする方法によって標的核酸にハイブリダイズ可能となる。スペーサーは、カッターを前記オリゴの末端ヌクレオチドに共有結合的に結合させ、オリゴからカッターの直鎖に2個以上の原子を含み、カッターは2個以上の窒素原子を有するポリアミンである。
オリゴ−スペーサー−カッター
構造を有するリボ核酸加水分解のための化合物に関する。オリゴは、8個以上のヌクレオチド又はその模倣体のリボ核酸であって、末端ヌクレオチド又はその模倣体が加水分解される位置から4〜8個離れたヌクレオチドにハイブリダイズする方法によって標的核酸にハイブリダイズ可能となる。スペーサーは、カッターを前記オリゴの末端ヌクレオチドに共有結合的に結合させ、オリゴからカッターの直鎖に2個以上の原子を含み、カッターは2個以上の窒素原子を有するポリアミンである。
遺伝子発現を効率的に確実に制御する方法の研究において、本発明者らは、選択的に標的リボ核酸を加水分解する可能性を研究した。この点において、リン酸ジエステル結合の切断を媒介するポリアミンを介して反応する人工ヌクレアーゼを対象にした。
Verheijen (上記参照)により報告された先行技術のシステムでは、インキュベーション7時間後に相当な量である約50%の標的核酸が加水分解されたが、インキュベーション24時間後では85%の標的核酸が加水分解しただけであった。さらに、加水分解のための2箇所の予測部位に加えて、第3の予想外の加水分解部位を含む標的核酸が存在したことは、注目に値する。よって、この先行技術による人工ヌクレアーゼの加水分解効率には、改善の余地が多く残されている。具体的には、加水分解のための部位が、3箇所や2箇所ではなく、任意の1箇所のみである標的核酸についてである。
上記に記載した先行技術の標的核酸に基づき、以下の合成RNA配列が使用された。
加水分解のための予測位置には下線が引かれている。加水分解は、3´末端の下線を引いたシトシンで起こる。加水分解される位置からヌクレオチドが何個離れているかを数えると、シトシン又はアデノシンのどちらかが、それぞれ5´末端又は3´末端のどちらかの方向に応じて、オリゴのハイブリダイズに関与している。よって、上記のRNA配列の例では、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体は、加水分解される位置から4個以上離れた位置でハイブリダイズし、この末端ヌクレオチドは、5´末端方向にある第1のウラシル(U13)にハイブリダイズする。3´末端方向では、加水分解される位置から4個離れた位置が22位(U22)のウラシルである。
加水分解のための予測位置には下線が引かれている。加水分解は、3´末端の下線を引いたシトシンで起こる。加水分解される位置からヌクレオチドが何個離れているかを数えると、シトシン又はアデノシンのどちらかが、それぞれ5´末端又は3´末端のどちらかの方向に応じて、オリゴのハイブリダイズに関与している。よって、上記のRNA配列の例では、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体は、加水分解される位置から4個以上離れた位置でハイブリダイズし、この末端ヌクレオチドは、5´末端方向にある第1のウラシル(U13)にハイブリダイズする。3´末端方向では、加水分解される位置から4個離れた位置が22位(U22)のウラシルである。
上記エチレンジアミンを導入した標的核酸における予測位置の加水分解では、エチレンジアミンはカッターとして使用された。スペーサーの長さが多様であるために、グリシン残基をオリゴとカッターの間に挿入した。
加水分解される位置から2個又は3個離れた位置でハイブリダイズしたオリゴは、スペーサーにおけるグリシン残基が0、1又は2個にかかわりなく、同じような加水分解率を示した。RNA対オリゴ−スペーサー−カッターの割合が1対33、pH7、40℃で7時間インキュベーションし、中程度である10〜20%の加水分解率が得られた。24時間インキュベーション後の加水分解率は20〜30%の間で様々であった。
しかし、加水分解される位置から4位置離れてハイブリダイズしたオリゴでは、加水分解された標的リボ核酸の量において顕著な改善を示した。具体的には、スペーサーが5個の原子を含む化合物に対し、RNA対オリゴ−スペーサー−カッターの割合が1対33、pH7、40℃で7時間インキュベーション後、加水分解は50%を超え、また、24時間後では95%を超えていた。
本明細書で使用する用語「オリゴ」は、リボ核酸又はその模倣体に言及する。この用語には、生理条件下でオリゴをさらに安定化するリボ核酸の誘導体が含まれる。適切な誘導体としては、2´−O−アルキル、アルケニル(アリル)若しくはアルキニルヌクレオチド、2´−デオキシヌクレオチド(DNA)、及び/又は2´−デオキシ2´−フルオロヌクレオチドが挙げられ、2´−メチル及び2´−O−アリルヌクレオチドが好ましい。任意でも、又は代わりにリン酸ジエステル結合が誘導体化される可能性があり、例えば、O−アルキル化したリン酸ジエステル、又は好ましくはホスホロチエートとなることもある。ヌクレオチドの模倣体を含むオリゴは、ロックト核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、モルフォリノ等を含むヌクレオチドに言及する。
オリゴの適当な塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、2,6−ジアミノプリン、キサンチン、ヒポキサンチン、さらに、アルキル、アミノ、アザ及び/若しくはハロ置換塩基、又はデアザ(deaza)塩基等の塩基の誘導体がある。塩基のさらなる修飾は適していることもあり、当業者に公知である。
本発明のオリゴは、8個以上のヌクレオチド又はその模倣体の長さを有している。通常、充分なハイブリダイゼイションを行なうためには25個を超えるヌクレオチド(又はその模倣体)の長さは必要ではないが、10個以上のヌクレオチド(又はその模倣体)の長さが好ましい。
オリゴは、スペーサーが付着可能となる位置を2箇所有する。スペーサーは5´−O原子又は3´−O原子のどちらかに付着する。オリゴがその末端にヌクレオチドの模倣体を含む場合には、スペーサーは、5´−O原子又は3´−O原子に対応するヌクレオチドの模倣体の原子に付着する。
本明細書において使用される「スペーサー」という用語は、原子の数により、オリゴとカッターの距離を定義する。原子の数は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体の5´−O原子又は3´−O原子に結合する第1の原子から、カッターに結合する最後の原子までの直鎖において数える。スペーサーは、標的RNAにおけるリン酸ジエステル結合の切断に関与するカッターの第1の窒素原子で終わる。スペーサーの原子は、熟練技術者に公知である任意の適当な原子でもよく、同じであるか又は異なっていてもよく、C、O、S、N及びPから選択されることが好ましい。
スペーサーは分枝していてもよく、及び/又は、スペーサーの原子は官能基で置換されてもよい。そのような置換基は、本発明の化合物を検出可能とする官能性を有することもあり、例えば、蛍光標識でスペーサーを置換することも可能であり、そのような標識は周知となっている。代わりに又は加えて、スペーサーは細胞膜の通過を促進する基で置換されることもある。そのような基は、細胞膜の脂質二重層と容易に相互作用する疎水基でもよく、及び/又は、細胞膜を通過する運搬に関与する受容体若しくは酵素と相互作用する基でもよい。
スペーサー−カッター部分は、例えば、専らポリエチレンアミンからなる可能性もあるということが理解される。オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体に付着している始めの2個の原子は、リン酸ジエステル結合の加水分解に関与しているとは考えられず、よって、カッターの部分とはならない。
本明細書で使用する「カッター」という用語は、2個以上の窒素原子を有するポリアミンに言及する。カッターは少なくとも1個の二級窒素原子又は三級窒素原子を含み、任意でまた、少なくとも1個のさらなる二級窒素原子又は三級窒素原子を含み、好ましくは、少なくとも1個のさらなる一級の窒素原子を含む。リン酸ジエステル結合のポリアミンを介した切断は、当該分野で周知であり、熟練技術者は、適当なカッター部分を利用することができる。適当なカッターには、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス(2−アミノエチル)アミン、エチレンアミン系デンドリマー、ペンタエリスリチルテトラアミン、スペルミン、スペルミジン、ジアゾ−、トリアザ−、又はテトラアザシクロアルキル化合物、例えば、ピペラジン、サイクレン、テトラアザシクロペンタデカン、テトラアザシクロテトラデカン、テトラアザウンデカン、トリアザシクロノナン、トリアザシクロドデカン等、及びその誘導体が挙げられる。
ある実施形態では、本発明の化合物におけるオリゴは、ヌクレオチド模倣体として、PNAを含む。
別の実施形態では、本発明の化合物のオリゴは、ヌクレオチド模倣体として、2´−O−アルキル、好ましくはメチル又はアリル、ホスホロチエ−トを含む。
ある実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から4位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が4〜6個、好ましくは5個の化合物である。
リボ核酸が加水分解される予測位置からさらに4位置よりも離れて、オリゴがハイブリダイズする場合は、スペーサーの長さを延長することが好ましい。オリゴが加水分解される予測位置から離れて加水分解し、その位置が4位置を超えて離れる場合、その各位置に対するある実施形態では、スペーサーの長さを6個以上の原子で延長する。よって、加水分解される予測位置から原子が5個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは8個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が6個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは14個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が7個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは20個以上の原子を含み、加水分解される予測位置から原子が8個離れた位置でハイブリダイズするオリゴ−スペーサー−カッターでは、スペーサーは、好ましくは26個以上の原子を含む、等となる。
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から5位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が10〜12個、好ましくは11個の化合物である。
その上、さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から6位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が16〜18個、好ましくは17個の化合物である。
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から7位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が22〜24個、好ましくは23個の化合物である。
その上、さらなる実施形態では、本発明の化合物は、オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から6位置離れた位置でハイブリダイズし、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が28〜30個、好ましくは29個の化合物である。
末端ヌクレオチド又はその模倣体がハイブリダイズする、加水分解される予測位置から離れた位置の上限は、8位置であり、好ましくは、7位置、さらに好ましくは、6位置である。また、スペーサーの最大の長さは原子30個である。
本発明の化合物は、当該分野において公知の方法により合成可能である。化合物を合成するには、自動化手順を使用するのが好ましい。例えば、オリゴの望ましい長さ及び組成物は、通常DNA/RNAシンセサイザーで合成可能である。望ましいカッターに結合する望ましい長さのスペーサーを含むスペーサー−カッター部分を製造することは、当業者にとっては通常のことである。例として、Verheijen et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372)を参照のこと。そのようなスペーサー−カッター部分は、末端ヌクレオチド又はヌクレオシドの3´−O又は5´−O(好ましい)に結合し、望ましい機能を有している。また、当業者が、5´−Oを5´−Nに代えて、望ましい機能を有するスペーサー−カッター部分を付着して窒素に結合することは、一般的な方法であり、例えば、上記について論じたKomiyamaに開示された方法がある。適当な方法として、J.Org. Chem., 2000, 65, 4900-4907、Angew. Chem. hit. Ed., 2001, 40, 2004-2021、及びさらに具体的には、J. Org. Chem., 2003, 68, 609-612、Bioconjug. Chem., 2003, 14, 276- 281を参照のこと。別の方法として、5´−Sの導入、又は通常のマレイミド結合を介することが必要なジスルフィド架橋を使用することができる。また、適当な方法では、標準的なホスホラミダイト(phosphoramidite)化学を使用して、スペーサー−カッター部分をヌクレオシドに結合する。よって、本発明の化合物において、リボヌクレオチド(類似体)又はその模倣体のいずれのタイプも組み入れ可能である。例として、Bioconjugate, Chem. 2002, 13 (5), 1071を参照のこと。
ヌクレオチド・ビルディングブロックとしてPNAを含む本発明の化合物を製造する適当な方法は、上記のVerheijenに開示されている。
本発明は、多様な治療、診断、農業、標的の確認、ゲノムの発見、遺伝子操作、及び薬理ゲノミクスに利用するための有用な化合物及び方法を提供する。
ある態様においては、本発明は、標的リボ核酸が本発明の化合物に接触する所定の位置でリボ核酸を加水分解する方法に関する。
本発明の化合物は、多様なRNA分子を標的にすることにより、遺伝子発現を阻害するように設計可能である。ある実施形態では、本発明の化合物を使用することにより、標的遺伝子に対応する多様なRNAを標的としている。限定されないRNAの例としては、メッセンジャーRNA(mRNA)、標的遺伝子の選択的RNAスプライスバリアント、標的遺伝子の転写後のRNA修飾、標的遺伝子のpre−mRNAを含む。選択的スプライシングにより、適当なエクソンを使用することで区別される転写産物のファミリーが生成される場合、本発明を使用して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害又は区別する適当なエクソンにより、遺伝子発現を阻害することができる。
本発明の化合物は、診断、治療並びに研究用試薬及びキットに利用可能である。また、適当な医薬的に許容できる希釈液や担体に本発明の化合物の有効な量を加えることにより、医薬組成物として利用できる。さらに、望ましくないタンパク質の生成を特徴とする疾患を有する生物体を治療するために利用できる。望ましくないタンパク質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリッド形成可能な配列を有する本発明の化合物を、生物体と接触させることができる。よって、遺伝子発現を制御するためには、調節されるRNA部分は、前もって選択されていて、生成が調節されるタンパク質をコードするRNA部分を含むことが好ましい。したがって、使用するオリゴは、標的RNAの前もって選択された部分に特異的にハイブリダイズするように設計する。ある実施形態では、オリゴは、その生成が調節されるタンパク質をコードするmRNAに特異的に結合するように設計される。
医薬組成物の製剤及びその投与は、当該分野の技術範囲内で行なうことができる。一般的に、治療法により、そのような治療が必要とされる患者には、通常薬学的に許容できる担体で、患者の年齢及び治療する疾患状態の重症度に応じて、体重1kgあたり0.01/mgから100gの用量で、本発明の化合物を投与する。さらに治療は、単回投与のこともあり、又はある期間継続する治療のこともあり、特定の疾患の性質、疾患の重症度及び患者の全身状態に応じて異なっていて、医師により決定される。症例によっては、従来の治療方法と併用して、本発明の化合物により患者を治療することは、さらに効果的である。
本発明の医薬組成物は、局所または全身の治療を必要とするかどうかにより、また、治療する場所により、多くの方法で投与することが可能である。投与は、局所(眼、膣内、直腸、鼻腔内、経皮を含む)、経口又は非経口投与のこともある。非経口投与では、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、又はくも膜下若しくは脳室内投与がある。
局所投与の製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐薬、スプレー、液体、粉剤がある。従来の医薬担体、水溶性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが、必要とされるか又は望ましいこともある。また、塗布コンドーム、手袋などが有用のこともある。
経口投与の組成物には、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒体における懸濁液又は溶液、カプセル、小袋若しくは錠剤が含まれる。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、結合剤が望ましいこともある。
くも膜下又は脳室内投与のための組成物には、緩衝剤、希釈剤、及び他の適当な添加剤をさらに含むこともある無菌水溶液を含有していてもよい。
非経口投与の製剤には、緩衝剤、希釈剤、及び他の適当な添加剤をさらに含むこともある無菌水溶液を含有していてもよい。
本発明は、単細胞原核生物及び真核生物から多細胞真核生物の範囲にわたる多様な生物体において実施可能である。DNA−RNA転写又はRNA−タンパク質翻訳を、遺伝性、代謝性、又は細胞機構の基礎部分として利用する生物体はいずれも、このような治療及び/又は予防療法の影響を受けやすい。細菌、酵母、原生動物、藻、植物、及び温血動物を含む高等動物体などの様々な生物体が、このような方法で治療可能と思われる。さらに、多細胞真核生物の各細胞は、細胞活動の不可欠な部分として、DNA−RNA転写及びRNA−タンパク質翻訳に関与し、そのような治療及び/又は診断などは、そのような細胞集団においても実施可能である。さらにまた、真核細胞のミトコンドリア及び葉緑体などの多くの細胞小器官は、転写及び翻訳機序にも関与する。単細胞、細胞集団又は細胞小器官なども、本発明の治療又は診断の化合物で治療可能な生物体の定義内に含むことができる。ここで使用されているように、治療は、疾患状態の根絶、細菌、原生動物、若しくは他の感染症などの生物体の死滅、或は、異常な若しくは望ましくない細胞増殖又は細胞発現のコントロールの両方を意味する。
自動標準DNA/RNAシンセサイザーで使用する適当なビルディングブロックとして、以下に記載のホスホラミダイドを使用する。左下の構造式において、リンカーは上記に記載したようにスペーサーの部分であり、よって、以下の一般構造式から除かれることもある。保護基のPG鎖としては、塩基不安定性であることが好ましい。リンカーはグリシンの部分であってもよく、PGは以下の構造式にあるようにFmoc基のこともある。このホスホラミダイトは、RNA(オリゴ)又はその模倣体のいずれのタイプにも組み入れることができる。
スペーサーが10個の原子を組み入れている上記のホスホラミダイトを、オリゴに組み入れると、左下に表わされる構造が得られる。この実施例では、スペーサーは10個の原子を有している。オリゴ模倣体2´−O−メチルホスホロチエートの例として、RNA及びPNAは、それぞれ、中央と右に記載されている。
切断実験に使用された合成RNA(点変異を有するtRNAPheの部分:C−16はG−16により置換されている)(下線:切断の位置):
5’ - UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G - 3’
以下のPNA−カッター配列を合成した。Glyはグリシンを表し、n=0〜2、カッターは以下の通りである。:
3’ - H2NCO- ca caa gct agg (Gly)n-COCH2-cutter (2)
3’ - H2NCO- aca caa gct ag (Gly)n-COCH2-cutter (3)
3’ - H2NCO- g aca caa gct a (Gly)n-COCH2-cutter (4)
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)n-COCH2-cutter (5)
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)3-COCH2-cutter (5)
5’ - UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G - 3’
以下のPNA−カッター配列を合成した。Glyはグリシンを表し、n=0〜2、カッターは以下の通りである。:
3’ - H2NCO- aca caa gct ag (Gly)n-COCH2-cutter (3)
3’ - H2NCO- g aca caa gct a (Gly)n-COCH2-cutter (4)
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)n-COCH2-cutter (5)
3’ - H2NCO- gg aca caa gct (Gly)3-COCH2-cutter (5)
(2)(3)(4)及び(5)の番号は、加水分解される予測位置から離れた位置でオリゴがハイブリダイズする位置番号に言及している。(2)(3)(4)及び(5)の各々は、0.1又は2のGly残基を組み入れるスペーサーの長さにおいて変化した。
PNA合成
本研究で使用されたPNAは、PNAシンセサイザー(Perseptive Biosystem社製、Expedite Nucleic Acid Synthesis System)を使用して固相合成法により作製した。すべての溶剤(Biosolve)は一般に容認されたものを使用した。リンカーとしてリンク−アミドを有する固定担体としてPEG−PSビーズで、固相合成法を行なった(添加:0.17mmоl−mg−1)。シンセサイザーマニュアルに記載された標準プロトコルを使用して、Fmoc−chemistry及び環外アミンがBhocで保護されたモノマー(Perseptive Biosystems社製)を使用する2mmоlスケールで、PNAのアセンブリーを構築した。まず、カップリングを2回行なった。Fmoc-グリシン及びdiBocで保護されたカッター・ビルディングブロックは、シンセサイザー中で有効な位置及び2回のカップリングのための標準プロトコルを使用して、樹脂上に保持されたままのPNA−オリゴマーのN末端(5´)に結合した。diBocで保護されたカッター・ビルディングブロック(HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc)は、単純な液相有機化学により合成し、そのマススペクトル並びに1H−及び13C NMR−スペクトルにより完全に解析した。
本研究で使用されたPNAは、PNAシンセサイザー(Perseptive Biosystem社製、Expedite Nucleic Acid Synthesis System)を使用して固相合成法により作製した。すべての溶剤(Biosolve)は一般に容認されたものを使用した。リンカーとしてリンク−アミドを有する固定担体としてPEG−PSビーズで、固相合成法を行なった(添加:0.17mmоl−mg−1)。シンセサイザーマニュアルに記載された標準プロトコルを使用して、Fmoc−chemistry及び環外アミンがBhocで保護されたモノマー(Perseptive Biosystems社製)を使用する2mmоlスケールで、PNAのアセンブリーを構築した。まず、カップリングを2回行なった。Fmoc-グリシン及びdiBocで保護されたカッター・ビルディングブロックは、シンセサイザー中で有効な位置及び2回のカップリングのための標準プロトコルを使用して、樹脂上に保持されたままのPNA−オリゴマーのN末端(5´)に結合した。diBocで保護されたカッター・ビルディングブロック(HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc)は、単純な液相有機化学により合成し、そのマススペクトル並びに1H−及び13C NMR−スペクトルにより完全に解析した。
オリゴマーを、樹脂から切断し、酸性条件下で完全に脱保護した(TFA/TIS/H2O, 9/1/1, v/v/v)。RP−HPLC精製及び分析を、Altima C18カラム(10×250mm)を備えたJASCO HPLCシステムで行なった。勾配溶離は、緩衝液A(0.1%TFA水溶液)から開始する勾配で、緩衝液B(アセトニトリル/水が3/1,v/vにおける0.1%TFA溶液)を用いて、40°C、流速4mL/minで行なった。得られたPNAは、凍結乾燥し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI−TOF MS)及びRP−HPLCを用いて解析した。
切断実験
32P 5´−Labeled RNA 25−merを、NaCl(100mM)及びEDTA(0.1mM)を含むトリス緩衝液中(10mM、pH7)でPNAカッターを用いて処理し、以下の濃度を得た。[RNA]=60nM、[PNA−カッター]=2μM。サンプル(70μL)を40℃で7時間又は24時間インキュベート後、NaOAc (3M、pH5、7μL)、EtOH(225μL)及び10μg/μLのtRNA(1μL)を添加して、直ぐにRNAを沈殿させた。沈殿したRNAは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水(5μL)及び添加液(5μL)に再溶解した。これらの溶液を90℃で1分間加熱し、遠心分離し、尿素8Mを含む20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。使用したコントロールは、RNA、RNA塩基ラダー及びRNAのT1消化である。
32P 5´−Labeled RNA 25−merを、NaCl(100mM)及びEDTA(0.1mM)を含むトリス緩衝液中(10mM、pH7)でPNAカッターを用いて処理し、以下の濃度を得た。[RNA]=60nM、[PNA−カッター]=2μM。サンプル(70μL)を40℃で7時間又は24時間インキュベート後、NaOAc (3M、pH5、7μL)、EtOH(225μL)及び10μg/μLのtRNA(1μL)を添加して、直ぐにRNAを沈殿させた。沈殿したRNAは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水(5μL)及び添加液(5μL)に再溶解した。これらの溶液を90℃で1分間加熱し、遠心分離し、尿素8Mを含む20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。使用したコントロールは、RNA、RNA塩基ラダー及びRNAのT1消化である。
結果
インキュベーション7時間後及び24時間後に、コントロールRNAは約10%加水分解された。化合物(2)及び(3)におけるRNAは加水分解は、インキュベーション7時間後には約20%以下に、インキュベーション24時間後には約40%以下であった。化合物(4)におけるRNAのみが、適切な割合で加水分解された。すなわち、N=0、1及び2では、RNAはインキュベーション7時間後には少なくとも約30%加水分解され、インキュベーション24時間後に、化合物(4)、n=1については、ほぼ定量的に加水分解された。
インキュベーション7時間後及び24時間後に、コントロールRNAは約10%加水分解された。化合物(2)及び(3)におけるRNAは加水分解は、インキュベーション7時間後には約20%以下に、インキュベーション24時間後には約40%以下であった。化合物(4)におけるRNAのみが、適切な割合で加水分解された。すなわち、N=0、1及び2では、RNAはインキュベーション7時間後には少なくとも約30%加水分解され、インキュベーション24時間後に、化合物(4)、n=1については、ほぼ定量的に加水分解された。
化合物(4)、n=1の最適化により、インキュベーション2時間後には、既に約50%のRNAが、RNA対本発明の化合物の割合が1対10で加水分解された。1対40の割合では、2時間後には、約75%が加水分解された。1対10及び1対20の割合では、それぞれ8時間後及び6時間後には、75%あるいはそれ以上のRNAが加水分解された。後者の割合では、インキュベーション24時間後には、ほぼ定量的に加水分解された。
化合物(5)では、n=2で最適に加水分解が開始される。
切断実験で使用した合成RNA(E. Coli AcpP mRNAの部分)
(下線:切断部分):
5’ - A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA - 3’
以下のPNAカッター配列を合成した。Glyはグリシンを表わし、カッターは以下の通りである。:
3’ - H2NCO- aaa ttc tca t - Cys(NHR)S-CH2CO- Gly- NHCH2CH2-cutter
式中:R=Ac 又は (A)
CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 又は (B)
CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 (C)
化合物B及びCは、スペーサー内にペプチドLys(PhePheLys) 3を含み、細胞膜を通過する化合物を補助するということに注目のこと。
(下線:切断部分):
5’ - A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA - 3’
以下のPNAカッター配列を合成した。Glyはグリシンを表わし、カッターは以下の通りである。:
式中:R=Ac 又は (A)
CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 又は (B)
CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 (C)
化合物B及びCは、スペーサー内にペプチドLys(PhePheLys) 3を含み、細胞膜を通過する化合物を補助するということに注目のこと。
インビトロRNA分解研究
緩衝液はすべて、高純度ミリQ水で作製し、使用前に滅菌した。放射活性物質で標識したRNA25−mer及びテストする複合体(A、B、C、コントロールとしてRNA及びカッターを含まないC)を、NaCl(100mM)及びEDTA(0.1mM)を含むトリス塩酸緩衝液(10mM、pH7)に混合し、A260ユニットの測定により、次の濃度を得た。[RNA]=60nM、[複合体]=2μM。サンプル(70μL)を40℃で16時間インキュベーションした。インキュベーション後、3MのNaOAc(pH5、7μL)、EtOH(225μL)及び10μg μL−1、tRNA(1μL)を添加して、RNAを直ぐに沈殿させた。沈殿したRNAは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水(5μL)及び添加液(5μL)に再溶解した。これらの溶液を80℃で1分間加熱し、遠心分離し、20%変性ゲル電気泳動で分析した。ゲルを蛍光スクリ−ン(Molecular Dynamics)に曝露し、RNAフラグメントの強度を、Personal Molecular Imager FX System (Bio-Rad)で曝露したスクリーンをスキャンすることにより定量化し、次にQuantity One software (Bio-Rad)でコンピュータ解析した。
緩衝液はすべて、高純度ミリQ水で作製し、使用前に滅菌した。放射活性物質で標識したRNA25−mer及びテストする複合体(A、B、C、コントロールとしてRNA及びカッターを含まないC)を、NaCl(100mM)及びEDTA(0.1mM)を含むトリス塩酸緩衝液(10mM、pH7)に混合し、A260ユニットの測定により、次の濃度を得た。[RNA]=60nM、[複合体]=2μM。サンプル(70μL)を40℃で16時間インキュベーションした。インキュベーション後、3MのNaOAc(pH5、7μL)、EtOH(225μL)及び10μg μL−1、tRNA(1μL)を添加して、RNAを直ぐに沈殿させた。沈殿したRNAは、遠心分離により回収し、乾燥させ、水(5μL)及び添加液(5μL)に再溶解した。これらの溶液を80℃で1分間加熱し、遠心分離し、20%変性ゲル電気泳動で分析した。ゲルを蛍光スクリ−ン(Molecular Dynamics)に曝露し、RNAフラグメントの強度を、Personal Molecular Imager FX System (Bio-Rad)で曝露したスクリーンをスキャンすることにより定量化し、次にQuantity One software (Bio-Rad)でコンピュータ解析した。
結果
化合物A、B及びC並びにネガティブ・コントロールを、E. Coli AcpP mRNAの部分に類似する配列を有する25−mer32P標識したRNAでインキュベートした。pH7、40℃で16時間後、RNAフラグメントを沈殿させ、20%変性ゲル電気泳動を行なって定量した。有難いことに、RNAとペプチド欠損PNA−DETA Aと同様にB及びCの複合物とのインキュベーションでは、印を付けたCA及びUA部位の切断から生じるメジャーなRNA分解生成物が2個形成した。切断部位は、バンドの移動度を、RNAのT1消化及び塩基加水分解ラダーのバンドと比較することにより決定された。フラグメント・スポットの強度により、RNAとPNA−DETA Aのインキュベーションでは、約3.5%の切断のバックグランドを示すのみであるネガティブ・コントロール(すなわち、カッターを含まないPNA−ペプチド複合体及び複合体を含まないRNA)に比較して、RNAが有意に切断する(20%)とういことを、明らかにした。また、複合物BとCの加水分解効率が予想外に異なることが示された。複合物Cが標的RNAの10%を切断する一方で、ポジティブ・コントロール18(20%)と比較して、複合物Bは、同等の改善した切断効率(30%)を示した。
化合物A、B及びC並びにネガティブ・コントロールを、E. Coli AcpP mRNAの部分に類似する配列を有する25−mer32P標識したRNAでインキュベートした。pH7、40℃で16時間後、RNAフラグメントを沈殿させ、20%変性ゲル電気泳動を行なって定量した。有難いことに、RNAとペプチド欠損PNA−DETA Aと同様にB及びCの複合物とのインキュベーションでは、印を付けたCA及びUA部位の切断から生じるメジャーなRNA分解生成物が2個形成した。切断部位は、バンドの移動度を、RNAのT1消化及び塩基加水分解ラダーのバンドと比較することにより決定された。フラグメント・スポットの強度により、RNAとPNA−DETA Aのインキュベーションでは、約3.5%の切断のバックグランドを示すのみであるネガティブ・コントロール(すなわち、カッターを含まないPNA−ペプチド複合体及び複合体を含まないRNA)に比較して、RNAが有意に切断する(20%)とういことを、明らかにした。また、複合物BとCの加水分解効率が予想外に異なることが示された。複合物Cが標的RNAの10%を切断する一方で、ポジティブ・コントロール18(20%)と比較して、複合物Bは、同等の改善した切断効率(30%)を示した。
Claims (13)
- 下記構造を有し、核酸を加水分解する化合物であって、
オリゴ−スペーサー−カッター
オリゴは8個以上のヌクレオチド又はその模倣体のリボ核酸であり、
末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から4〜8個離れたヌクレオチドとハイブリダイズする方法で、標的核酸とハイブリダイズすることが可能であり、
スペーサーはカッターを前記オリゴの前記末端ヌクレオチドに共有結合させ、オリゴからカッターの直鎖に2個以上の原子を含み、
カッターは2個以上の窒素原子を有するポリアミンである化合物。 - オリゴがヌクレオチド模倣体としてPNAを含むことを特徴とする請求項1記載の化合物。
- オリゴがヌクレオチド模倣体として2´−O−アルキル、好ましくはメチル、ホスホロチオエートを含むことを特徴とする請求項1記載の化合物。
- スペーサーが1又は複数個のアミノ酸、とりわけグリシンを含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の化合物。
- スペーサーがアミド結合を介してオリゴと結合していることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の化合物。
- カッターがエチレンジアミンであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の化合物。
- オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から4位置離れていて、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が4〜6個、好ましくは5個であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の化合物。
- オリゴの末端ヌクレオチド又はその模倣体が、加水分解される位置から5位置離れていて、オリゴからカッターの直鎖における原子の数が10〜12個、好ましくは11個であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の化合物。
- 標的リボ核酸が請求項1〜8のいずれか記載の化合物と接触する所定の位置でリボ核酸を加水分解する方法。
- リボ核酸がRNA、とりわけmRNAであることを特徴とする請求項10記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか記載の化合物と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
- 薬物としての請求項1〜8のいずれか記載の化合物の使用。
- 診断ツールとしての請求項1〜8のいずれか記載の化合物の使用。
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