ES2286478T3 - Procedimiento para la carga de camaras de muestras con muestras de suspensiones. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la carga de una cámara de muestras (10) con una muestra de suspensión (20), en particular para la crioconservación de muestras biológicas, en la que en la cámara de muestras (10) se lleva a cabo un posicionamiento de muestras parciales (21, 22, 23, ...), que están separadas entre sí por espacios libres (30) llenos de gas.

Description

Procedimiento para la carga de cámaras de muestras con muestras de suspensiones.

La invención se refiere a un procedimiento para la carga de cámaras de muestras con muestras de suspensiones, en particular para la crioconservación de muestras biológicas, y dispositivos para el almacenamiento a baja temperatura (en particular crioalmacenamiento, crioconservación) de muestras de suspensiones, en particular un dispositivo de crioalmacenamiento para células biológicas suspendidas, grupos de células o componentes celulares.

El crioalmacenamiento de muestras biológicas posee numerosas aplicaciones, que están orientadas a una conservación duradera de las muestras manteniendo su estado de vitalidad. Los dispositivos utilizados para ello están adaptados a las muestras y a los requerimientos correspondientes en la manipulación de las muestras. A bajas temperaturas, por ejemplo, en la medicina de transplantes se pueden almacenar órganos o donaciones de sangre en la medicina de transfusión. Estas técnicas están limitadas al uso con volúmenes de muestra relativamente grandes (intervalo de ml a 1).

En la biología celular y cada vez más en la biotecnología molecular, sin embargo, existe el objetivo de almacenar y, dado el caso, procesar muestras biológicas muy pequeñas (células individuales, grupos de células o componentes celulares) en estado congelado. Se conoce depositar muestras para la crioconservación sobre superficies de sustrato (véanse, por ejemplo, las patentes EP804073, DE19921236). Esta técnica posee la ventaja de que las muestras se pueden proporcionar en muestras parciales, que posteriormente se pueden extraer individualmente. Sin embargo, se producen desventajas como consecuencia del elevado uso de espacio del sustrato y del peligro de contaminación.

Alternativamente a la deposición de muestras sobre sustratos es conocido el uso de cámaras de muestras criogénicas (por ejemplo, en forma de capilares o de tubos de pared delgada; véanse, por ejemplo, las patentes WO 02/46719, US4262494, WO99/20104). Las cámaras de muestras conforman un recipiente cerrado al menos parcialmente, y debido a ello ofrecen una protección mejorada para las muestras. Una desventaja general de las cámaras de muestras criogénicas, sin embargo, es que en éstas está descartado un porcionado en muestras parciales que se pueda reproducir. Un porcionado por medio de una destrucción mecánica de la cámara de muestras está unido, hasta el momento, forzosamente, con un peligro de contaminación. Por ejemplo, un corte de secciones de tubos flexibles lleva a un contacto de la muestra con la herramienta.

El objeto de la invención es proporcionar procedimientos mejorados para el crioalmacenamiento en cámaras de muestra, con los que se superen las desventajas de los dispositivos de crioalmacenamiento convencionales y que hagan posible, en particular, de modo que no se produzca contaminación, una extracción selectiva y parcial de componentes de muestras. Otro objetivo de la invención es proporcionar dispositivos de crioalmacenamientos mejorados.

Estos objetivos se alcanzan mediante procedimientos y dispositivos con las características según las reivindicaciones 1 ó 10. De las reivindicaciones subordinadas resultan formas de realización ventajosas y aplicaciones de la invención.

Una idea básica de la invención es mejorar la carga de una cámara de muestras, en particular para la crioconservación de muestras biológicas, con un dispositivo de alimentación, hasta tal punto que se deposite una muestra de suspensión en la cámara de muestras en forma de muestras parciales, que estén separadas entre sí por medio de espacios libres llenos de gas. La cámara de muestras posee en general una forma de canal extendida longitudinalmente, estando elegida la dimensión de la sección transversal de la forma del canal de tal manera que las muestras parciales se pueden depositar bajo el efecto de la tensión superficial y/o de fuerzas capilares entre las paredes de las cámaras de muestras en forma de gotas, sin que se produzca una desviación o confluencia de muestras parciales. El procedimiento conforme a la invención combina las ventajas de depósito sobre el sustrato convencional por lo que se refiere a la capacidad de dividir las muestras con las ventajas de las cámaras de muestras referidas al aislamiento de las muestras. Es especialmente ventajoso que el procedimiento de carga conforme a la invención se pueda realizar sin un coste técnico especial con técnicas de carga disponibles y convencionales. Las cámaras de muestras en forma de canal usadas según la invención poseen, a través de una longitud de la cámara que se puede escoger con un tamaño relativamente grande dependiendo del caso de aplicación, una capacidad volumétrica elevada. Al mismo tiempo, por medio de la invención se hace posible una deposición de muestras parciales separables en el interior del volumen de la cámara.

Según una forma de preferida realización de la invención, el procedimiento de carga comprende una sucesión de etapas en la que en primer lugar se introduce un dispositivo de alimentación en la cámara de muestras hasta una posición de salida determinada, en la que se deposita una primera muestra parcial en la cámara de muestras. A continuación se lleva a cabo un desplazamiento del dispositivo de alimentación o de la primera muestra parcial a una posición intermedia, donde se deposita, a una cierta distancia respecto a la primera muestra parcial, otra muestra parcial. Este proceso se puede repetir, de modo ventajoso, las veces que sean necesarias hasta que toda la cámara de muestras esté llenada con muestras parciales separadas entre sí.

Según la invención, el dispositivo de alimentación se puede desplazar durante el accionamiento de la deposición de muestras parciales en la cámara de muestras, por medio del ajuste de una determinada velocidad y/o duración de accionamiento se puede fijar el volumen de la muestra parcial de un modo definido.

Los espacios libres entre las muestras parciales se llenan, según la invención, preferentemente con un gas inerte. De esto pueden resultar ventajas para el mantenimiento de condiciones de conservación definidas y una durabilidad elevada.

Una ventaja especial de la invención reside en el hecho de que la carga se puede realizar con diferentes técnicas disponibles. El dispositivo de alimentación es, en general, un dispositivo con el que, ejerciendo una presión determinada (fuerza de sobrepresión o fuerza de absorción), se puede llevar una muestra de suspensión desde un depósito colector a la cámara de muestras. En caso de que el dispositivo de suministro se haya construido, por ejemplo, como una jeringuilla con un depósito de almacenamiento, desde la que, bajo el efecto de un émbolo se puede entregar la muestra de suspensión a través de un tubo flexible o una aguja de la jeringuilla, entonces, preferentemente, se lleva a cabo una carga de una cámara de muestras en forma de capilar, de tubo, o de tubo flexible. El dispensador del dispositivo de alimentación (tubo flexible o aguja de jeringuilla) posee una longitud que, preferentemente, es igual a la longitud de la cámara de muestras que se ha de cargar. El dispensador se introduce en un extremo de la cámara de muestras hasta la primera posición de salida en el extremo opuesto de la cámara de muestras. A continuación se realiza un movimiento de retirada del dispensador, que se acciona en intervalos de tiempo predeterminados, de manera que en determinadas posiciones intermedias se conforman las muestras parciales, y entre éstas, los espacios libres llenos de gas.

Al usar el dispositivo de alimentación accionado por presión con el dispensador de tubo flexible o de aguja, la cámara de muestras puede estar dividida, ventajosamente, en regiones de la cámara que están separadas entre sí por medio de regiones intermedias, y que poseen, cada una de ellas, un diámetro de la sección transversal mayor que la región intermedia. En este caso, las muestras parciales se depositan en las regiones mayores de la cámara. Esta forma de realización de la invención posee la ventaja de que las regiones intermedias conforman puntos de rotura controlada a través de los que se facilita la extracción de muestras parciales.

Según una forma de realización alternativa de la invención, la alimentación de muestras se realiza por medio de una aspiración desde un depósito colector de muestras. La cámara de muestras está construida, por ejemplo, como una jeringuilla de Hamilton, en la que el dispositivo de alimentación está conformado por medio del elemento de aspiración de la jeringuilla de Hamilton en combinación con un dispositivo de ajuste. Con el dispositivo de ajuste, la cámara de muestras se puede sumergir temporalmente en el depósito colector de muestras. El uso de jeringuilla de Hamilton como cámaras de muestras posee la ventaja de que para ésta, en la técnica de laboratorio están disponibles dispositivos adicionales, por ejemplo para la sujeción.

Según otra variante, la cámara de muestras puede estar conformada con un espacio interior en forma de cono, que se carga bajo el efecto de una presión negativa. La forma cónica puede poseer ventajas en la sujeción de la cámara de muestras en un sustrato.

Otro objetivo de la invención es un dispositivo de crioalmacenamiento que presenta al menos una cámara de muestras y una muestra de suspensión que está dispuesta en la cámara de muestras en forma de un gran número de muestras de suspensiones separadas. Las muestras parciales están separadas entre sí por medio de espacios libres llenos de gas. El dispositivo de crioalmacenamiento está unido, preferentemente, con un dispositivo de almacenamiento de datos.

Otras ventajas y particularidades de la invención se pueden ver a partir de la siguiente descripción de los dibujos anexos. Se muestra:

Figs. 1 a 4: diferentes formas de realización de dispositivos de crioalmacenamiento según la invención, en vistas seccionadas esquemáticas y aumentadas.

En la Fig. 1 se ilustran los principios del procedimiento conforme a la invención tomando el ejemplo de una cámara de muestras 10 en forma de tubo flexible, de modo esquemático. La cámara de muestras 10 está fabricada, preferentemente, de un tubo flexible, por ejemplo de polietileno, con un diámetro interior en el intervalo que va de 400 \mum a algunos mm, y con una longitud elegida dependiendo de la aplicación, en el intervalo que va, por ejemplo, de pocos centímetros a algunos metros. La cámara de muestras 10 se puede sujetar como parte de un dispositivo de crioconservación, o bien puede estar dispuestas suspendida en una sujeción (no ilustrado). Antes de la carga de la cámara de muestras, los extremos del tubo flexible están abiertos en primer lugar.

En el ejemplo representado, la unidad de alimentación 40 es una jeringuilla con un depósito colector de muestras 41, un dispensador 42 y un sello 43, con el que se da una muestra de suspensión 20 desde el depósito colector de muestras 41 a través del dispensador 42 a la cámara de muestras 10. El dispensador 42 es un componente extendido, en forma de tubo, fabricado con un material rígido o flexible, cuyo diámetro exterior, preferentemente, es menor que el diámetro interior de la cámara de muestras 10. Los diámetros exterior e interior pueden ser también iguales, ya que las ranuras pequeñas, por regla general, permiten una compensación de presión en la carga de las muestras. El dispensador 42 comprende, por ejemplo, una aguja hueca o, del mismo modo, un tubo flexible. La longitud del dispensador 42 es igual a la longitud de la cámara de muestras 10 (por razones de claridad se muestra sólo una parte del dispensador con una línea a trazos).

Para la carga de la cámara de muestras 10 se desplaza el dispensador 42 desde un extremo a través de la cámara de muestras 10 hasta el otro extremo en una posición de salida. Allí se realiza un primer accionamiento del émbolo 43, de manera que se deposita una primera muestras parcial 21. El dispositivo de alimentación 40 se puede retirar ya durante el accionamiento del sello 43. Despendiendo de las condiciones de funcionamiento del dispositivo de alimentación 40 (en particular, la cantidad entregada por unidad de tiempo, la velocidad de retroceso), y el diámetro interior de la cámara de muestras 10, la muestra parcial 21 posee un volumen definido.

El diámetro interior y el material de la pared (o la superficie interior) de la cámara de muestras 10 se eligen de tal manera que la muestra parcial 21 conforma bajo el efecto de la tensión superficial una gota que se extiende a lo largo de toda la superficie de la sección transversal de la cámara de muestras 10 (perpendicularmente a la extensión longitudinal), y en la dirección longitudinal de la cámara de muestras 10 se conforma, respectivamente, una superficie de gota estable cerrada. La cámara de muestras 10 está cerrada por medio de la muestra parcial 21 en la dirección axial.

Después de la entrega de la muestra parcial 21 se realiza un retroceso del dispensador 42 hasta una posición intermedia en la que se deposita la muestra parcial 22. La muestra parcial 22 se deposita de tal manera que entre las muestras parciales 21 y 22 se conforma un espacio libre 30. Puesto que el diámetro exterior del dispensador 42 es menor que el diámetro interior de la cámara de muestras 10, el espacio libre 30 se llena con un gas de modo correspondiente a la atmósfera que lo rodea, por ejemplo aire. Preferentemente, la carga se realiza bajo gas inerte (por ejemplo nitrógeno, argón), de manera que el espacio libre 30 está lleno, de modo correspondiente, con el gas inerte.

La deposición de muestras parciales se repite hasta que la cámara de muestras 10 está llena. A continuación se pueden cerrar los extremos de la cámara de muestras 10, por ejemplo, por medio de un aplastamiento o aplicación de una tapa o tapón de molde o sellado. A continuación tiene lugar la crioconservación por medio del paso a un estado de baja temperatura, tal y como es conocido en las técnicas criogénicas.

Alternativamente, la cámara de muestras 10, según la fig. 1, puede estar formada por un tubo, por ejemplo un tubo capilar con un diámetro interior que es tan pequeño que se fija una muestra de suspensión líquida bajo el efecto de fuerzas superficiales o capilares en el interior de la cámara de muestras 10. El tubo capilar está formado, por ejemplo, de cristal, un material semiconductor, cerámica, metal u otro material inerte.

El material de la pared de las cámaras de muestras puede estar conformado, según los requerimientos deseados para el crioalmacenamiento, de modo hermético a los líquidos o de manera permeable. En particular, se puede usar un material permeable a los iones, tal y como se conoce en los tubitos de diálisis. En el material de la pared de las cámaras de muestras, o sobre su superficie, pueden preverse, adicionalmente, sensores (por ejemplo, sensores de temperatura).

Según la invención, pueden estar previstas varias cámaras de muestras, que estén unidas en sus paredes exteriores entre sí, de manera que se conforme un bloque de cámaras de muestras integral, formado por ejemplo por varios tubos flexibles.

Según una forma de realización modificada de la invención, la cámara de muestras según la Fig. 2 puede presentar regiones de cámara 11 con un diámetro mayor, que estén separadas entre sí por medio de regiones intermedias 12 con un diámetro reducido. La vista lateral esquemática aumentada muestra que con un dispositivo de alimentación, por ejemplo según la Fig. 1, se pueden depositar muestras parciales 21, 22, respectivamente, en las regiones de la cámara 11. Los espacios libres 30 contienen, respectivamente, las regiones intermedias 12. En esta conformación se conforman a través de las regiones intermedias 12 puntos de rotura controlada, de modo ventajoso, que facilitan una extracción segura de muestras parciales.

Las regiones de la cámara y las regiones intermedias 11, 12 pueden estar preformadas. La carga de la cámara de muestras se realiza en este caso de modo correspondiente a las prescripciones geométricas a través de las regiones de la cámara 11. Por el contrario, según una forma de realización modificada, especialmente ventajosa por lo que se refiere a la carga, en primer lugar se carga una cámara de muestras con un diámetro constante según la Fig. 1 con muestras parciales. Después de la carga tiene lugar la deformación, de manera que entre las regiones de la cámara, con las muestras parciales se conforman las regiones intermedias de diámetro reducido.

La deformación se realiza, por ejemplo, en una cámara de muestras en forma de tubo flexible elaborada en un plástico deformable térmicamente con un dispositivo de apriete calentado, por ejemplo una punta con pinzas con una temperatura en el intervalo que va de 60ºC a 100ºC. En las almohadillas de gas que se conforman por medio de los espacios libres, se deforma la cámara de muestras de modo térmico (se comprimen), de manera que se conforman las regiones de la cámara como segmentos. Este procedimiento hace posible la elección libre de los volúmenes de las muestras parciales individuales. Adicionalmente, por medio de las almohadillas de gas se conforma un aislamiento térmico, de modo que las muestras parciales, al producirse la deformación de las cámaras de muestras, no se calientan para la conformación de las regiones intermedias.

Alternativamente al uso de un dispensador que penetre en la cámara de las muestras 10 (Figuras 1, 2), el dispositivo de alimentación 40 puede comprender un dispositivo de aspiración, con cuya ayuda se introduce por aspiración la muestra de suspensión a través de un extremo de entrada de la cámara de muestras dividida en muestras parciales. Para ello, el dispositivo de aspiración está equipado con un dispositivo de ajuste con el que se puede sumergir el extremo de entrada de la cámara de muestras temporalmente en un depósito colector de muestras. Las variantes de esta conformación se ilustran, en secciones, en las Figuras 3 y 4.

Según la forma de realización representada en la Fig. 3, la cámara de muestras 10 puede estar conformada como la punta de una denominada jeringuilla de Hamilton. En la cámara de muestras 10 en forma de un cilindro hueco recto o una aguja hueca está dispuesto un elemento de aspiración 44 alargado que se extiende hasta el extremo de entrada 13 de la cámara de muestras 10. El elemento de aspiración 44 se conforma, por ejemplo, como en el caso de una jeringuilla de Hamilton, por medio de un alambre, que al producirse un retroceso (hacia arriba, figura parcial derecha de la Fig. 3), ejerce un efecto de aspiración. Esta configuración posee la ventaja de que la cámara de muestras 10 se puede llenar de modo correspondiente al retroceso del alambre, de modo definido, con un volumen determinado. Alternativamente, se puede conseguir el efecto del alambre también por medio de un dispositivo de bombeo. Según la invención, al menos una cámara de muestras 10 puede estar unida con un dispositivo de almacenamiento de datos. Con el elemento de aspiración 44 se aspiran, respectivamente, muestras parciales a una distancia entre sí en la aguja hueca.

Según la Fig. 4, la cámara de muestras 10 se estructura con una forma cónica. La dimensión de la sección transversal aumenta desde el extremo de entrada 13 inferior hasta el extremo 14 superior. La forma interior y exterior cónica de la cámara de muestras 10 se conforma, por ejemplo, por medio del extremo de una punta de pipeta conocida de por sí. En el extremo de salida 14 de la cámara de muestras 10 está prevista una pieza de conexión con una geometría elegida dependiendo de la aplicación, con la que, por ejemplo, se puede unir un dispositivo para ejercer una presión negativa.

La forma de realización según la Fig. 4 posee la ventaja de que la muestra se puede alojar en la cámara de muestras 10, tal y como se conoce de las pipetas. La cámara de muestras 10 posee, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 2 cm. Se llena con un dispositivo de émbolo, y se inserta en un soporte o una sujeción 50. El soporte 50 es, por ejemplo, un sustrato con entalladuras conformadas de modo adaptado, que está unido con un dispositivo de almacenamiento de datos, o una sujeción en la que se pueden insertar cámaras de muestras 10 de modo suelto, como en un dispositivo de sujeción de vidrios de reactivos. La primera variante posee la ventaja adicional de que el soporte 50 conforma por medio de la forma exterior cónica de la cámara de muestras 10 al mismo tiempo una inmovilización, la cámara de muestras se asienta como una clavija fijamente en el soporte 50.

Las características de la invención dadas a conocer en la descripción previa, en las reivindicaciones y en los dibujos pueden ser importantes tanto individualmente como en combinación para la realización de la invención en sus diferentes configuraciones.

Claims (17)

1. Procedimiento para la carga de una cámara de muestras (10) con una muestra de suspensión (20), en particular para la crioconservación de muestras biológicas, en la que en la cámara de muestras (10) se lleva a cabo un posicionamiento de muestras parciales (21, 22, 23, ...), que están separadas entre sí por espacios libres (30) llenos de gas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el posicionamiento comprende las siguientes etapas:

(a)

Introducción de un dispositivo de alimentación (40) en la cámara de muestras (10) hasta una posición de salida predeterminada,

(b)

Accionamiento del dispositivo de alimentación (40) para el posicionamiento de una primera muestra parcial (21) y desplazamiento del dispositivo de alimentación (40) o de la primera muestra parcial (21) a una posición intermedia predeterminada, de manera que se origina el primer espacio libre (30),

(c)

Repetición, al menos una vez, del accionamiento del dispositivo de alimentación (40) para la entrega de otra muestra parcial (22, 23, ...) a la posición intermedia con un desplazamiento posterior del dispositivo de alimentación (40) o de las muestras parciales a otra posición intermedia, y

(d) retirada del dispositivo de suministro (40) de la cámara de muestras (10) después del posicionamiento de una última muestra parcial.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el dispositivo de alimentación (40) se desplaza durante el accionamiento para la entrega de la muestra parcial en la cámara de muestras (10).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que cada espacio libre (30) entre muestras parciales se llena con un gas inerte.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la cámara de muestras (10) está construida en forma capilar o en forma de tubo flexible, y como dispositivo de alimentación se usa un tubo flexible o una aguja de una jeringuilla (42).

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que las muestras parciales se depositan en regiones de la cámara (11) de la cámara de muestras, que poseen un diámetro mayor que las regiones intermedias (12) contiguas.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 3, en el que la cámara de muestras (10) está construida como una jeringuilla de Hamilton y el dispositivo de alimentación (40) presenta un elemento de aspiración (44) de una jeringuilla de Hamilton.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 3, en el que la cámara de muestras (10) está conformada en forma de cono y se usa como dispositivo de alimentación un dispositivo de aspiración.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que después de la carga se realiza un paso de la cámara de muestras (10) en un estado de baja temperatura por medio del posicionamiento de al menos una parte de la cámara de muestras en un medio criogénico.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que de la cámara de muestras (10), en el estado de baja temperatura, se desprende al menos una muestra parcial por medio de una separación mecánica.

10. Dispositivo de crioalmacenamiento (100), que presenta al menos una cámara de muestras (10) y una muestra de suspensión (20) que está dispuesta en la cámara de muestras (10) en forma de muestras parciales, que están separadas entre sí por medio de espacios libres (30) llenos de gas.

11. Dispositivo de crioalmacenamiento según la reivindicación 10, en el que la cámara de muestras posee la forma de un cilindro hueco, cono hueco, tubo, tubo flexible, canal o de una aguja hueca.

12. Dispositivo de crioalmacenamiento según la reivindicación 10, en el que la cámara de muestras (10) posee la forma de una jeringuilla de Hamilton.

13. Dispositivo de crioalmacenamiento según la reivindicación 10, en el que la cámara de muestras (10) presenta las regiones de la cámara (11) que están separadas entre sí por medio de regiones intermedias (12), y presentan un diámetro mayor que las regiones intermedias, estando dispuestas las muestras parciales en las regiones de la cámara (11).

14. Dispositivo de crioalmacenamiento según una de las reivindicaciones 10 a 13 precedentes, en el que la cámara de muestras (10) está fabricada con un material flexible.

15. Dispositivo de crioalmacenamiento según una de las reivindicaciones 10 a 14 precedentes, en el que la cámara de muestras (10) está equipada con al menos un sensor, en particular un sensor de temperatura y/o superficies de refrigeración.

16. Dispositivo de crioalmacenamiento según una de las reivindicaciones 10 a 15 precedentes, en el que están previstas varias cámaras de muestras (10) que están unidas entre sí por sus paredes exteriores, de manera que se conforma un bloque de cámara de muestras integral.