ES2286030T3 - Procedimiento de busqueda de una resistencia frente a las antiproteasas de una cepa del virus vih-2 procedente de una muestra tomada de un paciente. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de búsqueda, en una muestra biológica tomada de un paciente contaminado por VIH-2 que contiene por lo menos una cepa viral de VIH-2, de una eventual resistencia de dicha cepa viral de VIH-2 frente a un tratamiento mediante un agente antiproteasa, en el que se busca, según los procedimientos conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de las posiciones 45, 54, 64, 84 y 90 de la secuencia proteica de la proteasa de dicha cepa viral, habiéndose reconocido previamente dicha mutación como que induce dicha resistencia, y en el que se concluye, en el caso en el que se encuentra una mutación de este tipo, la existencia de una cepa viral resistente frente a dicho agente antiproteasa en el paciente considerado.
Description
Procedimiento de búsqueda de una resistencia
frente a las antiproteasas de una cepa del virus
VIH-2 procedente de una muestra biológica tomada de
un paciente.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de búsqueda de una resistencia del virus
VIH-2 frente a un tratamiento mediante una
antiproteasa, en un paciente contaminado por el
VIH-2, así como a sondas nucleotídicas utilizables
en una búsqueda de este tipo.
Dos virus son la causa del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (sida): VIH-1 y
VIH-2. El VIH-1 está presente en
todo el mundo mientras que el VIH-2 está presente
principalmente en África occidental.
Desde 1996 se utilizan ampliamente tratamientos
antivirales eficaces en los países desarrollados en los que el
virus presente es el VIH-1. El coste de estos
tratamientos no permite su utilización en los países en vías de
desarrollo en los que está presente el VIH-2.
Los tratamientos antirretrovirales se dividen en
3 clases: antiproteasa (indinavir, ritonavir, saquinavir,
nelfinavir y amprenavir), inhibidores nucleosídicos de transcriptasa
inversa, denominada RT (zidovudina, didanosina, zalcitabina,
lamivudina, estavudina, abacavir, FTC y adefovir) e inhibidores no
nucleosídicos de RT (nevirapina, delavirdina y efavirenz). Estos
tratamientos se realizan a menudo conjuntamente; en ese caso se
habla de multite-
rapias.
rapias.
Las antiproteasas inducen mutaciones primarias
que confieren un grado elevado de resistencia pero alteran la
capacidad de replicación del virus. El virus necesita seleccionar
mutaciones secundarias para ser resistente y a la vez poder
replicarse activamente. Además, se han descrito mutaciones de la
transcriptasa inversa en el caso de la utilización conjunta de
inhibidores nucleosídicos de la RT.
Durante el tratamiento de la infección por
VIH-1, especialmente si la concentración circulante
de los agentes de tratamiento es insuficiente, la replicación viral
no resulta lo suficientemente inhibida o vuelve a aumentar por
encima del umbral de detección de las técnicas de carga viral
disponibles (la "carga viral" es la medida de la cantidad de
los genomas de virus circulantes). Debido a la tasa de error elevada
de la transcripción inversa, esto se traduce en la aparición de
mutaciones en los genes que son la diana de los tratamientos: la
proteasa y la transcriptasa inversa. Ciertas mutaciones conllevan la
aparición de resistencias, en diversos grados, frente a agentes
antivirales. Se llega a situaciones de fracaso virológico en del 20
al 40% de los pacientes tratados mediante las multiterapias puestas
en práctica actualmente.
La detección de virus resistentes frente a una o
varias moléculas en un paciente antes del tratamiento o durante un
nuevo aumento de la carga viral permite elegir la mejor asociación
de moléculas para tratar el VIH-1.
Por ejemplo, se describen procedimientos de
identificación de mutantes del virus VIH-1
resistentes frente a los tratamientos mediante antiproteasas que
comprenden la identificación de mutaciones en la secuencia peptídica
de la proteasa del VIH-1 implicada en la
resistencia en el documento WO96/08580, por Melnick et al.
(Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 1998, 42(12):
3256-65) y Maschera et al. (Journal of
Virology, 1995, 69(9): 5431-6). Estos
procedimientos se basan en la construcción y la exploración de una
biblioteca de variantes de proteasas del VIH-1 que
comprenden diferentes mutaciones.
Igualmente se han desarrollado otros
procedimientos, basados en el análisis de la sensibilidad de una
enzima de restricción, Hind II (Vasudevachari et al. (Anti
Microbial Agent and Chemotherapy, 1996, 40(11):
2535-41).
Estos procedimientos han permitido la
identificación de mutantes, por ejemplo en la posición 82 ó 90 que
presentan una resistencia aumentada frente a los inhibidores de
proteasas.
Actualmente no hay datos publicados referentes a
la presencia de mutaciones en el genoma del VIH-2,
debidas a la utilización de antiproteasas.
Los tratamientos mediante los agentes
antiproteasas, activos para VIH-1, también lo son
para VIH-2. No obstante, no hay ningún
procedimiento disponible para ayudar al médico a determinar la
resistencia frente a los tratamientos mediante antiproteasas en los
pacientes contaminados por el VIH-2.
Se conoce la secuencia de ácidos aminados de la
proteasa de VIH-2. En la presente solicitud, la
numeración de los ácidos aminados de esta secuencia puede deducirse
a partir de la descrita en Human Retroviruses and Aids, 1997, Los
Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo México, Capítulo II,
págs. B10 y B11. El primer ácido aminado de la secuencia de la
proteasa, que se considera como la posición 1 en la presente
solicitud, es la prolina en la posición 86 de la poliproteína PoL
de la cepa ROD.
Actualmente se ha descubierto que los
tratamientos con antiproteasas son susceptibles de hacer aparecer
mutaciones en las posiciones 45, 54, 64, 84 y 90, así como en las
posiciones 10, 46 y 82 de la proteasa de VIH-2, y
que las cepas virales mutadas que aparecen de ese modo son
generalmente resistentes frente a por lo menos uno de los agentes
antiproteasas utilizados.
El objeto de la presente invención es por tanto
un procedimiento de búsqueda de una eventual resistencia de una
cepa viral VIH-2 frente a un tratamiento mediante un
agente antiproteasa.
En una fase preliminar de la búsqueda, se trata
de un procedimiento en el que:
- a)
- se busca, según los procedimientos conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de las posiciones 45, 54, 64, 84 y 90 o en una de las posiciones 10, 46 y 82 de la secuencia proteica de la proteasa de dicha cepa viral procedente de una muestra biológica tomada de un paciente contaminado por VIH-2,
- b)
- se selecciona, de las mutaciones encontradas en a), las que, tras la clonación en un virus VIH-2, no impiden que el clon viral obtenido se multiplique en cultivo en presencia de dicho agente antiproteasa, y
- c)
- en el caso en el que se selecciona por lo menos una mutación en la etapa b), se concluye la existencia de una resistencia frente a dicho agente antiproteasa mencionado en b).
Se selecciona, de entre las mutaciones halladas
en a), las que, cuando están presentes en un gen clonado en un
virus VIH-2, confieren al clon viral la propiedad de
no resultar significativamente afectado en su capacidad de
multiplicarse en presencia de dicho agente antiproteasa. Para poner
en práctica la etapa b), puede trabajarse tal como se indica a
continuación. Las mutaciones que van a someterse a prueba se
introducen individualmente en un clon de virus mediante mutagénesis
dirigida según el procedimiento descrito en el artículo de Kemp
et al, J. Virol., 72(6), págs.
5093-5098, 1998. Los clones así obtenidos se ponen
en cultivo con un clon de tipo natural del virus como referencia,
es decir no mutado, en presencia de los diferentes fármacos
antiproteasas susceptibles de actuar contra el virus
VIH-2. Una medición de la CI_{50}, por ejemplo con
una prueba colorimétrica (véase la publicación de Kemp mencionada
anteriormente), permite determinar la importancia de la mutación
(menor o mayor) frente a diferentes fármacos sometidos a prueba. De
ese modo pueden seleccionarse las mutaciones que permiten al virus
multiplicarse en presencia de un agente antiproteasa, haciendo
surgir estas mutaciones cepas resistentes frente a esta
antiproteasa.
Obviamente, en el caso previsto en c), debe
considerarse el tratamiento del paciente, en el futuro, con un
agente antiproteasa distinto a aquel para el que se ha revelado de
este modo la existencia de una resistencia en el paciente
considerado.
En el caso en el que la etapa b) no ha permitido
seleccionar una mutación encontrada en la etapa a), puede
concluirse que la mutación considerada no ha inducido una
resistencia del virus VIH-2 frente al agente
antiproteasa sometido a prueba en el paciente considerado.
Resulta evidente que, cuando la etapa b) ha
permitido identificar una mutación que genera una resistencia
frente a un agente antiproteasa dado, no es necesario poner en
práctica posteriormente la etapa b) del procedimiento descrito
anteriormente. En ese caso, la etapa a) es suficiente ya que,
habiéndose establecido la relación entre la mutación y la
resistencia frente al agente antiproteasa, de una vez para todas,
puede pasarse directamente a la etapa c) y concluir la existencia
de una resistencia frente al agente antiproteasa estudiado.
La invención se refiere especialmente a un
procedimiento de búsqueda de una eventual resistencia de una cepa
viral VIH-2 frente a un tratamiento mediante un
agente antiproteasa, en el que se busca la presencia de por lo
menos una mutación seleccionada de las mutaciones siguientes:
K 45 R, I 54 M, I 64 V, I 84 L y L 90 M, o bien
incluso V 10 I, I 46 V e I 82 M,
en la secuencia proteica de la proteasa de dicha
cepa viral, y en el que se concluye la existencia de dicha
resistencia en caso de presencia de dicha mutación o de dichas
mutaciones.
La representación convencional utilizada en la
presente solicitud para describir una mutación es la siguiente: el
número indica la posición en la secuencia de ácidos aminados de la
proteasa de VIH-2. La letra situada a la izquierda
del número indica el ácido aminado de la cepa de tipo natural según
la clasificación internacional, con el código de una letra. La
letra situada a la derecha del número indica el ácido aminado, según
la misma clasificación, que resulta de la aparición de una
mutación.
Por "cepa" de tipo natural, se entiende una
cepa de virus que no se ha mutado tras un tratamiento con una
antiproteasa.
Para buscar una mutación de la secuencia
proteica de la proteasa de la cepa viral considerada, se trabaja
preferentemente buscando una mutación correspondiente en la
secuencia nucleotídica del gen de dicha proteasa. La búsqueda de
estas mutaciones puede realizarse en el ADN o el ARN. Obviamente, en
esta búsqueda de una mutación en la secuencia proteica mediante
búsqueda de mutación en la secuencia nucleotídica, se tendrá en
cuenta la degeneración del código genético, es decir que un mismo
ácido aminado puede estar codificado por codones diferentes. Puede
realizarse esta búsqueda de mutación en la secuencia nucleotídica
según los procedimientos conocidos, en particular mediante las
técnicas de hibridación o de secuenciación.
En un primer modo de realización de la
invención, se pone en práctica un procedimiento de hibridación con
ayuda de sondas específicas para la búsqueda de la o las
mutación/mutaciones.
Un modo de realización particular que utiliza un
procedimiento de hibridación consiste en obtener un polinucleótido
que contiene todo o parte del gen de la proteasa, y que comprende la
secuencia de interés correspondiente a la región que contiene la
mutación que se busca. Un polinucleótido de este tipo puede
obtenerse especialmente mediante amplificación enzimática. El
procedimiento utilizado comprende entonces las etapas que consisten
a poner en contacto dicho polinucleótido con una sonda nucleotídica,
fijada o susceptible de fijarse sobre un soporte sólido, y que
puede hibridarse específicamente con un polinucleótido de este tipo
únicamente en el caso en el que el polinucleótido comprende la
mutación estudiada; después revelar, según los procedimientos
conocidos, la presencia eventual del polinucleótido, fijado al
soporte sólido especialmente por medio de la sonda de captura. Para
ello, puede someterse el soporte sólido a una etapa de lavado, tras
lo cual se revela la presencia del polinucleótido, en estado fijado
sobre el soporte, o bien mediante un procedimiento físico, o bien
con ayuda de un marcador apropiado.
La fijación de la sonda puede realizarse
directamente mediante adsorción o mediante covalencia. La fijación
también puede realizarse indirectamente por medio de una reacción
del tipo ligando/antiligando tal como el par biotina/estreptavidina
o hapteno/anticuerpo, estando el antiligando fijado, por ejemplo,
sobre el soporte sólido y estando el ligando fijado sobre la
sonda.
El polinucleótido también puede marcarse durante
la etapa de amplificación enzimática, por ejemplo utilizando un
nucleósido trifosfato marcado para la reacción de amplificación. El
nucleótido marcado será un desoxirribonucleótido en los sistemas de
amplificación que generan un ADN, tales como la PCR, o un
ribonucleótido en las técnicas de amplificación que generan un ARN,
tales como las técnicas TMA o NASBA.
El polinucleótido también puede marcarse tras la
etapa de amplificación, por ejemplo hibridando una sonda marcada
según la técnica de hibridación de tipo sándwich descrita en el
documento WO 91/19812.
Un modo particular de marcaje de polinucleótidos
se describe en la solicitud FR 98 07870 del solicitante.
Como variante, puede prepararse el
polinucleótido que comprende todo o parte del gen de la proteasa
mediante amplificación enzimática, procediendo mediante
alargamiento de cebadores que comprenden un ligando. El
polinucleótido obtenido, que comprende por tanto el ligando, puede
fijarse sobre el soporte sólido mediante interacción con un
antiligando correspondiente. A continuación se pone en contacto el
soporte sólido, sobre el cual está fijado el polinucleótido, con
por lo menos una sonda que puede fijarse sobre el polinucleótido de
manera específica, únicamente si contiene la mutación estudiada o
buscada. En el caso en el que esta mutación esté presente, la sonda
se encuentra fijada al soporte sólido por medio del híbrido que
forma con el propio polinucleótido fijado. Por tanto falta revelar
la presencia del híbrido así formado, según los procedimientos
conocidos.
En otro modo de realización, se utiliza un
procedimiento de hibridación que comprende las etapas que consisten
en amplificar enzimáticamente todo o parte del gen de la proteasa
con ayuda de cebadores que llevan un ligando para generar un
polinucleótido que comprende por lo menos un ligando, en fijar el
polinucleótido sobre un soporte sólido mediante interacción con un
antiligando tal como se describió anteriormente, en poner en
contacto dicho polinucleótido fijado con por lo menos una sonda que
puede hibridarse específicamente con el mismo, y en revelar el
híbrido eventualmente formado. La sonda sólo debe hibridarse si el
polinucleótido contiene la mutación buscada.
Pueden considerarse otros procedimientos de
detección mediante hibridación tal como se describe en Kricka et
al., Clinical Chemistry, 45(4), págs.
453-458, 1999, o Keller G.H. et al., DNA
Probes, 2ª Ed., Stockton Press, 1993, secciones 5 y 6, págs.
173-249.
El término "soporte" sólido tal como se
utiliza en la presente memoria incluye todos los materiales sobre
los que puede inmovilizarse un polinucleótido. Pueden utilizarse
materiales de síntesis, o materiales naturales, eventualmente
modificados químicamente, como soporte sólido, especialmente los
polisacáridos tales como los materiales basados en celulosa, por
ejemplo papel, derivados de celulosa tales como acetato de celulosa
y nitrocelulosa, o dextrano; polímeros, copolímeros, especialmente
basados en monómeros de tipo estireno, fibras naturales tales como
el algodón, y fibras sintéticas tales como el nilón; materiales
minerales tales como la sílice, el cuarzo, vidrios, cerámicas;
látex; partículas magnéticas; derivados metálicos, geles, etc. El
soporte sólido puede estar en forma de placa de microtitulación, de
membrana tal como se describe en la solicitud WO 9412670, de
partícula o de biochip.
Por "biochip", se entiende un soporte
sólido de dimensión reducida en el que se fija una multitud de
polinucleótidos en posiciones predeterminadas.
Ejemplos de estos biochips se facilitan por
ejemplo en las publicaciones de G. Ramsay. Nature Biotechnology,
16, págs. 40-44, 1998: F. Ginot, Human Mutation, 10,
págs. 1-10. 1997; J. Cheng et al, Molecular
diagnosis, 1(3), págs. 183-200, 1996; T.
Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), págs.
2915-2921, 1994; J. Cheng et al, Nature
Biotechnology, 16, págs. 541-546, 1998. La propiedad
principal del soporte sólido debe ser conservar las características
de hibridación de las sondas sobre la diana y permitir un ruido de
fondo mínimo para el procedimiento de detección. Una ventaja de los
biochips es que simplifican la utilización de numerosas sondas que
tienen en cuenta el polimorfismo del virus en las zonas próximas a
la mutación que va a buscarse. Un biochip que permite verificar la
presencia o ausencia de mutaciones puede realizarse según el
procedimiento descrito por Kozal M. et al. Nature Medicine,
2, págs. 753-759, 1996, en función de las
alineaciones de las secuencias conocidas para las diferentes cepas
del VIH-2.
Por "marcador", se entiende un trazador que
puede generar una señal. Una lista no limitativa de estos trazadores
comprende las enzimas que producen una señal detectable por ejemplo
mediante colorimetría, fluorescencia o luminiscencia, tales como la
peroxidasa del rábano, la fosfatasa alcalina, la betagalactosidasa,
la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa; los cromóforos tales como los compuestos
fluorescentes, luminescentes o colorantes; los agrupamientos con
densidad electrónica detectables mediante microscopía electrónica o
mediante sus propiedades eléctricas tales como la conductividad,
mediante los procedimientos de amperometría o de voltimetría, o
mediante mediciones de impedancia; los agrupamientos detectables
mediante procedimientos ópticos tales como la difracción, la
resonancia de plasmón superficial, la variación de ángulo de
contacto o mediante procedimientos físicos tales como la
espectroscopia de fuerza atómica, el efecto túnel, etc.; las
moléculas radioactivas tales como ^{32}P, ^{35}S o
^{125}I.
Pueden utilizarse sistemas de amplificación de
la señal tal como se describe en el documento WO/9508000 y en este
caso, la reacción preliminar de amplificación enzimática puede no
ser necesaria.
El término "cebador" designa una secuencia
oligonucleotídica que puede hibridarse con una secuencia nucleica
de interés y servir como punto de partida para una reacción de
alargamiento enzimático para producir un fragmento de ácido
nucleico complementario de una diana de interés, tal como el gen de
la proteasa o una parte de este gen. El cebador tiene un tamaño
comprendido por ejemplo entre 5 y 50 nucleótidos, en particular
entre 10 y 30 nucleótidos. Preferentemente, los cebadores se
seleccionarán en regiones conservadas del virus
VIH-2 para permitir la amplificación de todas las
cepas del virus susceptibles de encontrarse en un paciente, y por
tanto hacer frente al polimorfismo inherente al virus
VIH-2.
Las sondas que permiten detectar una mutación en
las posiciones 45 y/o 54 y/o 64 y/o 84 y/o 90, así como las que
permiten detectar una mutación en las posiciones 10 y/o 46 y/o 82
hibridándose en todo o parte del gen de la proteasa del virus
VIH-2 presente en una muestra biológica, también son
un objeto de la presente invención.
El término "sonda" hace referencia a una
secuencia oligonucleotídica que puede hibridarse específicamente
con una secuencia nucleica de interés. En este caso, al ser el
objetivo de la presente invención distinguir una mutación puntual
en el gen de la proteasa del VIH-2, la sonda debe
permitir, en las condiciones de hibridación o de lavado
predeterminadas, diferenciar una mutación puntual. El tamaño de
estas sondas está comprendido entre 5 y 40 nucleótidos, y
especialmente entre 9 y 25 nucleótidos. Se describen procedimientos
de determinación de estas sondas por ejemplo en la solicitud de
patente WO 97/27332. La sonda se construirá por ejemplo de tal
manera que la posición de la mutación que va a detectarse esté
sensiblemente en el centro de la sonda.
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores o
sondas pueden comprender nucleótidos naturales o modificados tales
como fosforotioatos, H-fosfonatos,
alquilfosforotioatos, o análogos de nucleótidos que contienen bases
tales como la inosina o la nebularina en lugar de las bases púricas
o pirimídicas presentes en los nucleótidos A, T, C, G, U.
Estos cebadores o sondas también pueden estar
compuestos total o parcialmente por nucleósidos de anomería alfa o
beta o por isómeros de la serie D o L, o incluso por PNA (Nielsen
et al, Nucleic Acid Research, 21(2), págs.
197-200, 1993).
En otro modo de realización de la invención, se
busca la o las mutaciones mediante secuenciación de todo o parte del
gen de la proteasa.
Los diferentes procedimientos de secuenciación
se conocen bien: pueden utilizarse especialmente los procedimientos
de secuenciación de Sanger, los procedimientos de secuenciación que
utilizan 4 pocillos para la reacción de las secuencias estudiadas
con los cebadores de secuenciación marcados mediante 4 fluoróforos
diferentes (Procedimiento "ABI Prism Dye Primer" de Perkin
Elmer), o el procedimiento descrito en la patente US nº
5.795.722 (Visible Genetics), o bien el procedimiento que no
utiliza cebadores marcados sino nucleótidos marcados (procedimiento
"ABI Prism Dye Terminator", Perkin Elmer). Los procedimientos
de secuenciación se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 13.
En un modo particular de realización de la
invención, se busca únicamente la presencia de una o varias
mutaciones dadas. En otro modo de realización de la invención, se
busca a la vez la secuencia nucleotídica mutada y la secuencia
nucleotídica de tipo natural (no mutada). En el caso en el que se
pone en práctica un procedimiento de hibridación, se definen
entonces para cada posición susceptible de mutar por lo menos dos
tipos de sondas: un tipo de sondas específico de la secuencia
mutada y un tipo de sondas específico de la secuencia de tipo
natural. La utilización de estos dos tipos de sondas permite
controlar el procedimiento, ya que por lo menos uno de los dos
tipos de sondas debe reaccionar. Otra ventaja es detectar, dado el
caso, la presencia a la vez de cepas mutadas y de cepas de tipo
natural en un paciente.
Preferentemente, el ácido nucleico diana se
somete a una reacción preliminar de amplificación enzimática para
aumentar la sensibilidad de la prueba, pero puede considerarse
detectar directamente el ácido nucleico diana. Los artículos de
Lewis (1992. Genetic Engineering News, 12, 1-9) por
una parte, y de Abramson y Myers (1993. Curr. Opin. Biotechnol., 4,
41-47), por otra parte, facilitan ejemplos de
amplificación de diana. Por ejemplo, se selecciona la técnica de
amplificación enzimática de las técnicas NASBA (Nucleic Acid
Sequence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated
Amplification), RT-PCR (Reverse
Transcriptase-Polimerase Chain Reaction), SDA
(Strand Displacement Amplification) o LCR (Ligase Chain
Reaction).
La búsqueda de cepas virales mutantes se realiza
a partir de una muestra biológica eventualmente tratada de manera
previa. Por "tratamiento previo", se entienden las diferentes
etapas de tratamiento de la muestra para hacer accesible el ácido
nucleico diana, es decir el gen de la proteasa, tales como por
ejemplo, la lisis, la fluidificación, la concentración, la captura
(véanse por ejemplo las patentes US nº 5.750.338 y US nº
5.766.849) según los procedimientos conocidos en sí mismos.
Para extraer el ARN viral, puede utilizarse por
ejemplo el reactivo comercializado por la sociedad Boeringher
Mannheim (High Pure Viral RNA, referencia 1858882) o el kit Quiagen
(Viral RNA, referencia 29504). Se describen otros procedimientos en
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. La muestra
biológica puede ser una toma de muestras cualquiera del cuerpo
humano o eventualmente una toma de muestras enriquecida mediante
cultivo, tal como por ejemplo, sangre, esperma, tejido cutáneo,
lavado broncoalveolar, biopsia, orina, colonias, cultivo líquido,
etc.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Se ha realizado un estudio sobre tres pacientes
contaminados por el VIH-2. Los pacientes 1 y 2 no
habían recibido nunca antiproteasas. El paciente 3 ya había
recibido Ritonavir durante 8 meses, y este tratamiento se había
detenido 5 meses antes del comienzo del estudio. La primera muestra
estudiada se tomó antes del comienzo del tratamiento, en los
pacientes 1 y 2, y 6 semanas tras el comienzo del tratamiento
mediante Ritonavir en el paciente 3. En los pacientes 1 y 2, se
estudiaron muestras tomadas respectivamente 2 meses y 5 meses tras
el comienzo del tratamiento. Para el paciente 3, se analizaron dos
muestras (8 meses y 11 meses). El tratamiento estaba compuesto por
Ritonavir para el paciente 2 y por Ritonavir/Saquinavir para los
pacientes 1 y 3, a las dosis recomendadas.
Los plasmas se obtuvieron mediante
centrifugación de la sangre total a 800 x g durante 10 minutos y se
clarificaron mediante una segunda centrifugación a 3.000 x g
durante 15 minutos.
Se añadieron 500 microlitros de plasma puro a
1,5 mililitros de cultivo de linfocitos frescos estimulados
mediante PHA (10^{6} células/placa). Se realizó un seguimiento de
la replicación viral en el sobrenadante dos veces por semana
mediante la medición de la concentración de antígeno P 24 de VIH
(ELAVIA Ag I, Sanofi Diagnostics Pasteur). Se almacenaron los
sobrenadantes positivos a - 80ºC. Tras la ultracentrifugación de 1
mililitro de sobrenadante (23-500 x g durante 1
hora), se extrajo el ARN de VIH-2 con ayuda del kit
Amplicor HCV Spécimen Préparation
(Roche).
(Roche).
Se retrotranscribió el gen de la proteasa a
partir de 10 microlitros de la disolución de ARN viral y se
amplificó con el kit Titan One Tube RT-PCR (Roche
Molecular Diagnostics). La transcripción inversa y la primera
amplificación se realizaron con los cebadores 3' Prot y 5' RT 3
(véase a continuación). La reacción a 50ºC durante 30 minutos se
sigue por una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos y
después 40 ciclos (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 90
segundos a 68ºC) y finalmente a 68ºC durante 7 minutos. La segunda
etapa de la PCR se realizó con 5 microlitros del producto de la
primera etapa con los cebadores 3' RTD y 5' Prot 2.1, con una
desnaturalización de 5 minutos a 94ºC, seguida por 30 ciclos (30
segundos a 94ºC, seguido de 30 ciclos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC)
y finalmente 10 minutos a 72ºC. La secuencia de los cebadores es la
siguiente:
Se purificaron los productos de amplificación
con el kit QUIACQUICK PCR purification (Quiagen) y se secuenciaron
directamente con ayuda de los cebadores 3' RTD y 5' Prot 2.1 con
ayuda del kit ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied
Biosystem). Se analizaron con el secuenciador automático Applied
Biosystem 377 y se alinearon las secuencias con las secuencias
consenso de VIH-2 (subtipos A y B).
Antes del tratamiento, no se detectó ninguna
mutación con respecto a las secuencias consenso
VIH-2 A y B.
Tras el tratamiento, se observaron las
mutaciones siguientes:
- -
- posición 45: en los pacientes 1 y 2, se observó la coexistencia de una población no mutada (lisina; codón AAA) y de una población mutada (arginina; codón AGA), es decir, la mutación K45K/R;
- -
- posición 54: se observó en los pacientes 1 y 2, la sustitución de la isoleucina (codón ATA) par la metionina (codón ATG): es decir, la mutación I54M;
- -
- posición 64: se observó una población no mutada y una población en la que la isoleucina (codón ATA) está sustituido por una valina (codón GTA): es decir, la mutación 164I/V;
- -
- posición 84: en el paciente 3 se observó una población no mutada (isoleucina; codón ATC) y una población mutada con sustitución de la isoleucina por una leucina (codón CTC): es decir, la mutación I84I/L;
- -
- posición 90: en los 3 pacientes, se observó la sustitución de la leucina (codón CTG) par una metionina (codón ATG): es decir, la mutación L90M.
De manera análoga, se observaron las mutaciones
siguientes:
- -
- posición 10: la sustitución de la valina (codón: GTA) por una isoleucina (codón: ATA): es decir, la mutación V 10 I, durante el tratamiento de un paciente mediante Ritonavir;
- -
- posición 46: la sustitución de la isoleucina (codón: ATA) por una valina (codón: GTA): es decir, la mutación I 46 V, durante el tratamiento de un paciente mediante Ritonavir; y
- -
- posición 82: la sustitución de la isoleucina (codón: ATA) por una metionina (codón: ATG): es decir, la mutación I 82 M, durante el tratamiento de un paciente mediante Indinavir.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas utilizables para buscar la eventual
existencia de mutaciones, de acuerdo con la invención, según las
técnicas de hibridación, pueden definirse a partir de las
alineaciones publicadas por Myers G et al., 1997, Human
Retroviruses and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid
and aminoacid sequences, Los Alamos National Laboratory, Los
Alamos; Nuevo México.
Por supuesto, además de las sondas definidas de
manera expresa a continuación, la invención comprende igualmente
las sondas nucleotídicas equivalentes, es decir, sondas que permiten
detectar las mismas mutaciones, en la secuencia proteica de la
proteasa que las detectadas por las sondas definidas a continuación,
teniendo en cuenta la degeneración del código genético, dicho de
otra manera, teniendo en cuenta el hecho de que un mismo ácido
aminado puede codificarse por diferentes codones.
Por tanto, por la expresión "secuencias
nucleotídicas equivalentes", se entienden todas las secuencias
nucleotídicas que difieren entre sí por al menos un nucleótido pero
cuya traducción conduce a la misma secuencia proteica, en otros
términos todas las secuencias nucleotídicas que codifican para la
misma secuencia proteica.
Evidentemente, esta observación es válida para
cada uno de los codones de cada una de las sondas. Así, por
ejemplo, el ácido aminado en la posición 53 de la proteasa de
VIH-2 es una fenilalanina que puede codificarse o
bien por el codón TTT o bien por el codón TTC. Por supuesto, las
sondas correspondientes a cada una de estas posibilidades forman
parte de la invención.
En función de las condiciones particulares de la
hibridación, y especialmente de la temperatura y de la composición
de los tampones de hibridación y de lavado, pueden definirse sondas
que deberán comprender por lo menos una de las secuencias mínimas a
continuación, o sus complementarias. Las sondas que contienen estas
secuencias permiten distinguir las mutaciones en un procedimiento
de hibridación. Por supuesto, las sondas análogas, obtenidas
especialmente introduciendo análogos de bases, tales como inosina o
nebularina, en posiciones en las que está presente un polimorfismo
debido a una variabilidad intrínseca del virus, permiten obtener un
resultado similar y también forman parte de la invención.
\newpage
Estas secuencias se facilitan en el sentido 5'
hacia 3':
- \quad
- CCA AAA ATA para una forma de tipo natural de la posición 45.
- \quad
- CCA AAA GTA para una forma de tipo natural de la posición 45.
- \quad
- CCT AAA ATA para una forma de tipo natural de la posición 45.
- \quad
- CCA AGA ATA para una forma mutada de la posición 45.
- \quad
- CCA AGA GTA para una forma mutada de la posición 45.
- \quad
- CCT AGA ATA para una forma mutada de la posición 45.
- \quad
- TTT ATA AAC para una forma de tipo natural de la posición 54.
- \quad
- TTT ATA AAT para una forma de tipo natural de la posición 54.
- \quad
- TTT ATG AAC para una forma mutada de la posición 54.
- \quad
- TTT ATG AAT para una forma mutada de la posición 54.
- \quad
- GAA ATA AAA para una forma de tipo natural de la posición 64.
- \quad
- GAA ATA GAA para una forma de tipo natural de la posición 64.
- \quad
- GAA GTA AAA para una forma mutada de la posición 64.
- \quad
- GAA GTA GAA para una forma mutada de la posición 64.
- \quad
- AAC ATC TTT para una forma de tipo natural de la posición 84.
- \quad
- AAC ATT TTT para una forma de tipo natural de la posición 84.
- \quad
- AAC CTC TTT para una forma mutada de la posición 84.
- \quad
- ATT CTG ACA para una forma de tipo natural de la posición 90.
- \quad
- ATC CTG ACA para una forma de tipo natural de la posición 90.
- \quad
- ATT CTA ACA para una forma de tipo natural de la posición 90.
- \quad
- ATC CTA ACA para una forma de tipo natural de la posición 90.
- \quad
- ATT ATG ACA para una forma mutada de la posición 90.
- \quad
- ATC ATG ACA para una forma mutada de la posición 90.
\vskip1.000000\baselineskip
o incluso:
- \quad
- CCA GTA GTC para una forma de tipo natural de la posición 10.
- \quad
- CCA ATA GTC para una forma mutada de la posición 10.
- \quad
- AAA ATA GTA para una forma de tipo natural de la posición 46.
- \quad
- AAA GTA GTA para una forma mutada de la posición 46.
- \quad
- CCA ATC AAC para una forma de tipo natural de la posición 82.
- \quad
- CCA ATA AAC para una forma de tipo natural de la posición 82.
- \quad
- CCA ATG AAC para una forma mutada de la posición 82.
\vskip1.000000\baselineskip
Por supuesto, para obtener sondas más largas que
las que tienen las secuencias mínimas de 9 nucleótidos representadas
anteriormente, deben seleccionarse los nucleótidos complementarios
de manera que se respete la secuencia de las regiones adyacentes
por ambas partes de la secuencia mínima en el gen de la proteasa de
una cepa de VIH-2. Estas secuencias pueden
obtenerse en los bancos de datos.
Por ejemplo, pueden utilizarse las sondas que se
indican a continuación, o sus complementarias.
(a) posición 45:
Puede utilizarse una sonda que comprende por
ejemplo de 9 a 25 nucleótidos (preferentemente repartidos
simétricamente alrededor del codón mutado AGA), cuya secuencia está
incluida en una de las secuencias siguientes:
(b) posición 54:
Puede utilizarse una sonda que comprende por
ejemplo de 9 a 25 nucleótidos (preferentemente repartidos
simétricamente alrededor del codón mutado ATG), cuya secuencia está
incluida en una de las secuencias siguientes:
(c) posición 64:
Puede utilizarse una sonda que comprende por
ejemplo de 9 a 25 nucleótidos (preferentemente repartidos
simétricamente alrededor del codón mutado GTA), cuya secuencia está
incluida en una de las secuencias siguientes:
(d) posición 84:
Puede utilizarse una sonda que comprende por
ejemplo de 9 a 25 nucleótidos (preferentemente repartidos
simétricamente alrededor del codón mutado CTC), cuya secuencia está
incluida en la secuencia siguiente:
- \quad
- CCCCAATCAACCTCTTTGGCAGAAA
(e) posición 90:
Puede utilizarse una sonda que comprende por
ejemplo de 9 a 25 nucleótidos (preferentemente repartidos
simétricamente alrededor del codón mutado ATG), cuya secuencia está
incluida en una de las secuencias siguientes:
<110> BIO MERIEUX
\hskip1cm ASSISTANCE PUBLIQUE, HOPITAUX DE
PARIS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de búsqueda de una
resistencia frente a las antiproteasas de una cepa del virus
VIH-2 procedente de una muestra biológica tomada de
un paciente
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BR34443/CR/HG/klp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00 949555.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
21-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 99 07855
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-06-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaaaata
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaaagta
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctaaaata
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagaata
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagagta
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctagaata
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttataaac
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttataaat
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttatgaac
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttatgaat
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaataaaa
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaatagaa
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtaaaa
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtagaa
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacatcttt
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacattttt
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacctcttt
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattctgaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcctgaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattctaaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcctaaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatgaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcatgaca
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtagtc
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatagtc
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatagta
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatagta
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatcaac
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaataaac
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatgaac
\hfill9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattacactcc aagaatagta ggggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatagccc aagaatagta ggggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatagtcc aagaatagta ggggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatacccc aagaatagta ggggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatagtcc aagaatagta ggagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatacccc aagaatagta ggagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagggggatt tatgaacacc aaaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagggggatt catgaacacc aaaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggaggatt catgaacacc aaaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggagggtt catgaacacc aaaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatgtaga agtaaaagta ctaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatataga agtaaaagta ctaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagatgtaga agtaaaggta ctaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatgtaga agtagaagtt ctaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatgtaga agtagaagtc ctgga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagtgtaga agtaagagtg ctaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccaatcaa cctctttggc agaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaatat tatgacagcc ttagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaatat tatggcaacc ttagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaatgt tatgacagct ttagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaatat catgacagcc ttggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaacat tatgacagcc tta
\hfill23
Claims (17)
1. Procedimiento de búsqueda, en una muestra
biológica tomada de un paciente contaminado por
VIH-2 que contiene por lo menos una cepa viral de
VIH-2, de una eventual resistencia de dicha cepa
viral de VIH-2 frente a un tratamiento mediante un
agente antiproteasa, en el que se busca, según los procedimientos
conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de las
posiciones 45, 54, 64, 84 y 90 de la secuencia proteica de la
proteasa de dicha cepa viral, habiéndose reconocido previamente
dicha mutación como que induce dicha resistencia, y en el que se
concluye, en el caso en el que se encuentra una mutación de este
tipo, la existencia de una cepa viral resistente frente a dicho
agente antiproteasa en el paciente considerado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que:
- a)
- se busca, según los procedimientos conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de dichas posiciones de la secuencia proteica de la proteasa de dicha cepa viral procedente de una muestra biológica tomada de un paciente contaminado por VIH-2,
- b)
- se selecciona, entre las mutaciones encontradas en a), las que, tras la clonación en un virus VIH-2, no impiden que el clon viral obtenido se multiplique en cultivo en presencia de dicho agente antiproteasa, y
- c)
- en el caso en el que se selecciona por lo menos una mutación en la etapa b), se concluye la existencia de una resistencia frente a dicho agente antiproteasa mencionado en b).
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se busca la presencia de por lo menos una mutación
seleccionada de entre las mutaciones siguientes:
K 45 R, I 54 M, I 64 V, I 84 L, L 90 M,
en la secuencia proteica de la proteasa de dicha
cepa viral, y en el que se concluye la presencia de dicha
resistencia en caso de presencia de dicha mutación o de dichas
mutaciones.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que, para buscar una mutación de
la secuencia proteica de la proteasa, se realiza la búsqueda de una
mutación correspondiente en la secuencia nucleotídica del gen de
dicha proteasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que se realiza dicha búsqueda con ayuda de técnicas de
hibridación, según los procedimientos conocidos.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que se realiza dicha búsqueda con ayuda de técnicas de
secuenciación, según los procedimientos conocidos.
7. Sonda nucleotídica utilizable en el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
presentando dicha sonda como máximo 40 nucleótidos y que comprende
como secuencia mínima una secuencia seleccionada de entre el grupo
constituido por:
- (a)
- CCA AGA ATA para una forma mutada de la posición 45,
- CCA AGA GTA para una forma mutada de la posición 45,
- CCT AGA ATA para una forma mutada de la posición 45,
- TTT ATG AAC para una forma mutada de la posición 54,
- TTT ATG AAT para una forma mutada de la posición 54,
- GAA GTA AAA para una forma mutada de la posición 64,
- GAA GTA GAA para una forma mutada de la posición 64,
- AAC CTC TTT para una forma mutada de la posición 84,
- ATT ATG ACA para una forma mutada de la posición 90,
- ATC ATG ACA para una forma mutada de la posición 90,
eventualmente completada por la secuencia
nucleotídica de una región adyacente del gen de dicha proteasa, por
ambas partes de la secuencia mínima,
- (b)
- una secuencia nucleotídica diferente de una secuencia definida en (a) por al menos un nucleótido pero cuya traducción conduce a una misma secuencia proteica, y
- (c)
- una secuencia complementaria de una secuencia definida en (a) o en (b).
8. Sonda nucleotídica según la reivindicación 7,
caracterizada porque se selecciona de entre las
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
o una secuencia complementaria.
9. Procedimiento de búsqueda, en una muestra
biológica tomada de un paciente contaminado por
VIH-2 que contiene por lo menos una cepa viral de
VIH-2, de una eventual resistencia de dicha cepa
viral de VIH-2 frente a un tratamiento mediante un
agente antiproteasa, en el que se busca, según los procedimientos
conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de las
posiciones 10, 46 u 82 de la secuencia proteica de la proteasa de
dicha cepa viral, habiéndose reconocido previamente dicha mutación
como inductora de dicha resistencia, y en el que se concluye, en el
caso en el que se encuentra una mutación de este tipo, la presencia
de una cepa viral resistente frente a dicho agente antiproteasa en
el paciente considerado.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que:
- a)
- se busca, según los procedimientos conocidos, la presencia de por lo menos una mutación en una de dichas posiciones de la secuencia proteica de la proteasa de dicha cepa viral procedente de una muestra biológica tomada de un paciente contaminado por VIH-2,
- b)
- se selecciona, de entre las mutaciones halladas en a), las que, tras la clonación en un virus VIH-2, no impiden que el clon viral obtenido se multiplique en cultivo en presencia de dicho agente antiproteasa, y
- c)
- en el caso en el que se selecciona por lo menos una mutación en la etapa b), se concluye la existencia de una resistencia frente a dicho agente antiproteasa mencionado en b).
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que se busca la presencia de por lo menos una mutación
seleccionada de entre las mutaciones siguientes:
V 10 I, I 46 V e I 82 M,
en la secuencia proteica de la proteasa de dicha
cepa viral, y en el que se concluye la presencia de dicha
resistencia en caso de presencia de dicha mutación o de dichas
mutaciones.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que, para buscar una mutación de la
secuencia proteica de la proteasa, se realiza la búsqueda de una
mutación correspondiente en la secuencia nucleotídica del gen de la
proteasa.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que se realiza dicha búsqueda con ayuda de las técnicas de
secuenciación, según los procedimientos conocidos.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que se realiza dicha búsqueda con ayuda de las técnicas de
hibridación, según los procedimientos conocidos.
15. Sonda nucleotídica utilizable en el
procedimiento según la reivindicación 14, presentando dicha sonda
como máximo 40 nucleótidos y que comprende como secuencia mínima una
secuencia de entre el grupo constituido
por:
por:
- (a)
- CCA ATA GTC para una forma mutada de la posición 10,
- AAA GTA GTA para una forma mutada de la posición 46,
- CCA ATG AAC para una forma mutada de la posición 82,
eventualmente completada por la secuencia
nucleotídica de una región adyacente del gen de dicha proteasa, por
ambas partes de la secuencia mínima,
- (b)
- una secuencia nucleotídica diferente de la definida en (a), por al menos un nucleótido pero cuya traducción conduce a una misma secuencia proteica, y
- (c)
- una secuencia complementaria de una secuencia definida en (a) o en (b).
16. Utilización de una sonda nucleotídica para
buscar en una muestra biológica tomada de un paciente contaminado
por VIH-2 que contiene por lo menos una cepa viral
de VIH-2, la presencia de por lo menos una mutación
en una de las posiciones 45, 54, 64, 84 y 90 de la secuencia
proteica de la proteasa de dicha cepa viral, habiéndose reconocido
previamente dicha mutación como inductora de una resistencia de
dicha cepa viral VIH-2 frente a un tratamiento
mediante un agente antiproteasa, presentando dicha sonda como máximo
40 nucleótidos y que comprende como secuencia mínima una secuencia
seleccionada de entre el grupo constituido por:
- (a)
- CCA AGA ATA para una forma mutada de la posición 45,
- CCA AGA GTA para una forma mutada de la posición 45,
- CCT AGA ATA para una forma mutada de la posición 45,
- TTT ATG AAC para una forma mutada de la posición 54,
- TTT ATG AAT para una forma mutada de la posición 54,
- GAA GTA AAA para una forma mutada de la posición 64,
- GAA GTA GAA para una forma mutada de la posición 64,
- AAC CTC TTT para una forma mutada de la posición 84,
- ATT ATG ACA para una forma mutada de la posición 90,
- ATC ATG ACA para una forma mutada de la posición 90,
eventualmente completada por la secuencia
nucleotídica de una región adyacente del gen de dicha proteasa, por
ambas partes de la secuencia mínima, y
- (b)
- una secuencia complementaria de una secuencia definida en (a).
\newpage
17. Utilización de una sonda nucleotídica para
buscar en una muestra biológica tomada de un paciente contaminado
por VIH-2 que contiene por lo menos una cepa viral
de VIH-2, la presencia de por lo menos una mutación
seleccionada de entre las mutaciones siguientes:
V 10 I, I 46 V e I 82 M
en la secuencia proteica de la proteasa de dicha
cepa viral, habiéndose reconocido previamente dicha mutación como
inductora de una resistencia de dicha cepa viral
VIH-2 frente a un tratamiento mediante un agente
antiproteasa, presentando dicha sonda como máximo 40 nucleótidos y
que comprende como secuencia mínima una secuencia seleccionada de
entre el grupo constituido por:
- (a)
- CCA ATA GTC para una forma mutada de la posición 10,
- AAA GTA GTA para una forma mutada de la posición 46,
- CCA ATG AAC para una forma mutada de la posición 82,
eventualmente completada por la secuencia
nucleotídica de una región adyacente del gen de dicha proteasa, por
ambas partes de la secuencia mínima, y
- (b)
- una secuencia complementaria de una secuencia en (a).
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