ES2285561T3 - Procedimiento de purificacion de coral y coral obtenido mediante este procedimiento. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de extracción de sustancias orgánicas presentes en el coral, que consiste en tratar el coral con un fluido o una mezcla de fluidos en estado supercrítico sin modificar la estructura cristalina de dicho coral a una temperatura inferior a 270ºC, preferiblemente inferior o igual a 260ºC y más preferiblemente inferior o igual a 250ºC y a una presión muy superior a la presión crítica de dicho fluido o mezcla de fluidos, por ejemplo del orden de al menos 3 veces y preferiblemente de al menos 5 veces dicha presión crítica.
Description
Procedimiento de purificación de coral y coral
obtenido mediante este procedimiento.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de purificación de coral y al coral obtenido mediante
este procedimiento.
La invención se aplica particularmente en el
campo médico.
El coral, que presenta una estructura porosa,
está compuesto esencialmente (aproximadamente el 97%) de materia
mineral, mayoritariamente carbonato cálcico, estando el resto
(aproximadamente el 3%) constituido por óxidos de magnesio y de
hierro y por sustancias orgánicas responsables de su coloración. Su
dureza varía de 2,5 a 3,5 en la escala de Mohs.
El carbonato cálcico que constituye el coral
presenta una estructura cristalográfica metastable de tipo aragonita
que puede transformarse fácilmente en calcita, particularmente bajo
los efectos de una temperatura alrededor de
260ºC.
260ºC.
La materia orgánica del coral contiene materia
proteica pero está sensiblemente libre de materia lipídica.
Actualmente existen varios sustitutivos óseos a
base de coral autorizados por la Agence Française de Sécurité
Sanitaire des Produits de Santé (AFSSAPS). Uno de estos productos,
comercializado por la compañía INOTEB con la denominación
BIOCORAL®, se obtiene mediante tratamiento del coral en la
superficie de sus poros, lo que permite eliminar una parte de las
sustancias orgánicas mencionadas anteriormente.
Un análisis morfológico más profundo del coral
(microscopía electrónica de barrido y térmica acoplada a
espectroscopía de masas) muestra sin embargo que dichas sustancias
orgánicas no solamente están presentes en los poros del coral, sino
también en las uniones de los granos de las partículas de carbonato
cálcico. El tratamiento establecido para el producto BIOCORAL®, no
permite extraer las sustancias orgánicas situadas en las uniones de
los granos, lo que representa aproximadamente el 90% del total de
las sustancias orgánicas.
Un problema que pretende resolver la presente
invención, es por lo tanto disponer de coral sensiblemente libre de
materia orgánica y en particular de proteínas, que pueda utilizarse
para fabricar sustitutos óseos de calidad comparable a la de los
implantes sintéticos existentes.
En la presente invención se entiende por
"coral sensiblemente libre de materia orgánica" coral que
contiene al menos dos veces menos sustancias orgánicas que el coral
no tratado.
Otro problema que pretende resolver la presente
invención es disponer de un procedimiento que permita eliminar las
sustancias orgánicas presentes en el coral sin modificar la
estructura cristalina de este último.
Ahora se ha descubierto, y éste es el fundamente
de la invención, que el tratamiento de coral con un fluido en
condiciones supercríticas, en un campo de temperatura y de presión
optimizado, permite proporcionar una solución a los problemas
presentados anteriormente, que no se resolvieron mediante los
procedimientos conocidos del estado de la técnica.
De este modo, de acuerdo con un primer aspecto,
la invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de
extracción de las sustancias orgánicas presentes en el coral, que
consiste en tratar el coral con un fluido o una mezcla de fluidos
en estado supercrítico sin modificar la estructura cristalina de
dicho coral, a una temperatura inferior a 270ºC, preferiblemente
inferior o igual a 260ºC y más preferiblemente inferior o igual a
250ºC y a una presión muy superior a la presión crítica de dicho
fluido o mezcla de fluidos por ejemplo del orden de al menos 3
veces y preferiblemente al menos 5 veces dicha presión crítica.
La utilización de un fluido en estado
supercrítico para extraer sustancias orgánicas se ha descrito en el
documento EP 0 603 920. Sin embargo, este documento se refiere
solamente al tratamiento de un tejido óseo y utiliza dióxido de
carbono para extraer lípidos, es decir sustancias que no se
encuentran en el coral. Para extraer proteínas, se hace referencia
de acuerdo con el documento anterior a un tratamiento complementario
de naturaleza química o enzimática con ayuda de compuestos
adicionales tales como detergentes u oxidantes, que podrían alterar
la estructura del coral. Además, de acuerdo con este documento, el
tratamiento se realiza a una presión cercana a la presión crítica
del dióxido de carbono.
De acuerdo con el procedimiento de la invención,
se utiliza por lo tanto un fluido en condiciones llamadas
"supercríticas", es decir que el fluido posee las propiedades
invasivas de un gas aunque se comporta como un líquido. Debido a
esto, el fluido es capaz de difundirse en la estructura porosa del
coral sin ningún problema de tensión superficial, lo que permite
optimizar la extracción de las sustancias orgánicas y en particular
de las proteínas (que se denominarán también en lo sucesivo
"matriz orgánica") presentes en el coral.
\newpage
El fluido o la mezcla de fluidos que puede
utilizarse en el procedimiento de la invención debe tener una
temperatura crítica inferior a 270ºC, preferiblemente inferior o
igual a 260ºC y más preferiblemente inferior o igual a 250ºC y debe
permitir la disolución de la materia orgánica.
Como ejemplo, pueden mencionarse etanol, acetona
o una mezcla de uno de estos dos fluidos con dióxido de carbono que
posee una temperatura crítica inferior a 270ºC. Ventajosamente, se
utiliza etanol debido a la disponibilidad de este producto y a su
carácter poco costoso y no tóxico. La temperatura crítica del etanol
es de 240ºC y su presión crítica de 6,12 MPa.
En el caso en el que el fluido es etanol o
acetona, la temperatura de tratamiento del coral está comprendida
ventajosamente entre 240 y 260ºC.
En el caso en el que se utiliza una mezcla de
fluidos tal como una mezcla de etanol-dióxido de
carbono, la temperatura de tratamiento del coral está comprendida
ventajosamente entre 80 y 100ºC.
El procedimiento de la invención se pone en
práctica a una presión suficiente, muy superior a la presión crítica
del fluido o de la mezcla de fluidos utilizada para evitar la
transformación de la estructura cristalina del coral. Desde este
punto de vista, la presión crítica de los fluidos mencionados
anteriormente puede conseguirse fácilmente.
En el caso de etanol o de acetona, la presión de
tratamiento del coral está comprendida ventajosamente entre 300 y
450 MPa, preferiblemente entre 350 y 450 MPa.
En el caso de una mezcla de fluidos tal como una
mezcla de etanol-dióxido de carbono, la presión de
tratamiento del coral está comprendida ventajosamente entre 30 y 50
MPa, preferiblemente del orden de 40 MPa.
La duración del tratamiento no es crítica en si
misma y generalmente varía entre varios minutos y varias horas, en
función del fluido utilizado. En el caso de etanol o de acetona,
esta duración está comprendida ventajosamente entre 15 y 240
minutos, preferiblemente de aproximadamente una hora.
Estando determinada la composición química
mineral del coral, el fluido o la mezcla de fluidos de acuerdo con
la invención se utiliza ventajosamente sin ningún compuesto
adicional tal como un detergente o un oxidante que pueda alterar la
estructura del coral.
De acuerdo con un segundo aspecto, la invención
se refiere al coral sensiblemente libre de sustancias orgánicas,
tal como se obtiene mediante el procedimiento descrito
anteriormente.
De acuerdo con un tercer aspecto, la invención
se refiere a los sustitutos óseos realizados a partir de coral
sensiblemente libre de sustancias orgánicas. Estos sustitutos óseos
pueden obtenerse mediante métodos bien conocidos por el
especialista en la técnica.
A continuación se ilustrará la invención con
ayuda de los siguientes ejemplos.
Ejemplo
1
El coral en bruto se trata en un dispositivo de
generación de alta presión de agua en un recinto que tiene un
volumen fijo. Este último, realizado en una aleación de altas
características mecánicas, tiene una profundidad de 229 mm, un
diámetro interno de 55 mm. Se cierra mediante un obturador en forma
de seta que soporta la junta metálica que asegura la estanquidad
con su deformación. La estanquidad en el arranque (sin presión en el
autoclave) se consigue mediante la subida del obturador con ayuda
de 8 tornillos en la parte superior. La presión aplicada en el
recinto por la bomba o la temperatura comprimirá la junta que por sí
misma hará estanco al sistema.
La temperatura se mide en el interior del
recinto mediante un termopar situado en la parte superior del
reactor. El termopar está en contacto directo con el fluido a
presión.
El coral se coloca en frascos flexibles de 20 ml
de Teflón PFA (Ref. M77400, Fisher Bioblock Scientific) que
resisten temperaturas cercanas a 300ºC y que soportan la deformación
debida a la presión. La presión que se ejerce sobre las paredes
internas y externas del frasco es la misma. En efecto, en el frasco
que no contiene o contiene muy poco aire, el líquido presente en el
interior del frasco y el líquido transmisor (agua) están a la misma
presión, por lo tanto la pared es como "invisible" y solamente
experimenta una ligera deformación debida a la compresibilidad del
agua. El tratamiento se realiza en presencia de etanol como fluido
"supercrítico", a una temperatura de 240 a 260ºC,
preferiblemente del orden de 250ºC a una presión de 300 a 400 MPa,
preferiblemente del orden de 350 MPa, durante 15 a 240 minutos,
preferiblemente aproximadamente 1 hora.
\newpage
Ejemplo
2
La muestra obtenida en el ejemplo 1 se tritura
en un mortero y se pesa (masa MB materia bruta- aproximadamente 3
g). Se prelavan 3 g del polvo obtenido, que se disuelven en 135 ml
de HCl 0,1 N, en agitación durante 1 h. La solución obtenida de
este modo se dializa en una membrana de peso molecular 12.000 a
16.000 (referencia MCWO) y después se congela a -80ºC y se
liofiliza. El liofilizado se pesa a su vez (masa MO -materia
orgánica- aproximadamente 3 g).
Como comparación, se realiza el mismo
experimento sobre una muestra de coral bruto (aragonita) y sobre una
muestra del producto BIOCORAL®.
La figura 1 representa la relación MO/MB para
cada una de las tres muestras. Se puede constatar que el tratamiento
"supercrítico" de acuerdo con la invención permite obtener un
coral que contiene aproximadamente dos veces menos sustancias
orgánicas que el producto BIOCORAL®.
Ejemplo
3
- -
- Se mezclan 50 volúmenes de la solución A con 1 volumen de la solución B. La solución de trabajo es ligeramente turbia al comienzo y después se aclara rápidamente con agitación suave en vórtice. Su color es verde opalescente.
- -
- Se trituran las muestras en un mortero y se pesa el polvo obtenido.
- -
- Se disuelve 1 g de polvo en 45 ml de HCl 0,6 N durante 1 hora en agitación.
- -
- Se dosifica la fracción soluble en agua: se disuelven 1,2 mg de materia orgánica en 75 \mul de agua.
- -
- Se disuelve el residuo restante después del centrifugado en 75 \mul de NaOH 0,3 N.
- -
- Se prelavan 25 \mul de cada patrón (0 \mul/mg, 5 \mul/mg, 25 \mul/mg, 50 \mul/mg y 250 \mul/mg) de cada muestra (preparados de la misma manera que las muestras a dosificar) y se reparten en los pocillos de una placa de 96 pocillos.
- -
- Se cubre la placa y se incuba durante 30 minutos a 37ºC.
- -
- Se lee la densidad óptica a 562 nm una vez que la placa se ha enfriado a temperatura ambiente.
Como comparación, se realiza el mismo
experimento sobre una muestra de coral bruto (aragonita) y sobre una
muestra del producto BIOCORAL®.
La figura 2 representa la relación de
proteínas/MB para cada una de las tres muestras. Se puede constatar
que el tratamiento "supercrítico" de acuerdo con la invención
permite obtener un coral del que se han extraído dos veces más
proteínas, en comparación con el producto BIOCORAL®.
Ejemplo
4
Se recortan los cilindros (\diameter = 12 mm)
en discos de un mm de grosor con ayuda de una sierra de diamante y
después se esterilizan con calor seco a 100ºC durante 1 h 30 (3
ciclos). Los discos se depositan sobre un lecho de agarosa al 0,1%
en las placas de cultivo (NUNC; 24 pocillos, 2 cm^{2}). La
suspensión celular se deposita sobre cada disco a razón de 20.000
células MG63/cm^{2} (1,13 cm^{2} x 2 debido a la porosidad -
22.600 células o sea aproximadamente 50.000 células por muestra), en
un volumen de 100 \mul de medio de cultivo completo (IMDM:
Iscowe's Modified Dubelco's Medium, SVF al 10% - suero fetal de
ternero). Después de 30 minutos para dejar que las células se
adhieran, se completa con 1 ml de medio. El medio se cambia cada
dos días.
Se retira el medio de cultivo completo y se
aclara con medio en solitario. Se priva a las células durante 17
horas (medio en solitario + 10% de SVF, timidina tritiada, 10
\muCi/ml (Ref: TRK 758 AMERSHAM), o 10 \mul de ^{3}HT/Volumen
de medio completo). Se elimina el sobrenadante (se conserva para
eliminación posterior) y después se retira el material de la
agarosa y se transfiere a un pocillo de plástico. Se aclara dos
veces con PBS 1x (o con medio de Hank 1x) después se fijan las
células con metanol frío al 100% durante 10 minutos a 4ºC. Se
aclara dos veces con PBS 1x (o con medio de Hank 1x) y se precipita
con TCA frío al 5% durante 20 minutos a 4ºC. Se elimina el
sobrenadante y se aclara cuatro veces con PBS 1x (o con medio de
Hank 1x).
Se incuba en NaOH 0,3 N durante 2 horas a
temperatura ambiente (disolución de la capa celular) sin sobrepasar
300 a 500 \mul de NaOH. Se recoge la solución en un tubo de
centelleo al que se le añaden 5 ml de líquido de centelleo y se
determinan la radiactividad de la solución y del material con ayuda
de un contador \beta (radiactividad despreciable).
Como comparación, se realiza el mismo
experimento sobre una muestra de coral bruto (aragonita) y sobre una
muestra del producto BIOCORAL®.
Los resultados se presentan en la Figura 3. Se
puede constatar que la proliferación celular de las células MG63
sobre el coral tratado de acuerdo con la invención es idéntica a la
observada sobre el producto BIOCORAL®.
El conjunto de estos resultados sugiere que el
coral tratado de acuerdo con la invención puede utilizarse en la
fabricación de sustitutos óseos.
Claims (9)
1. Procedimiento de extracción de sustancias
orgánicas presentes en el coral, que consiste en tratar el coral
con un fluido o una mezcla de fluidos en estado supercrítico sin
modificar la estructura cristalina de dicho coral a una temperatura
inferior a 270ºC, preferiblemente inferior o igual a 260ºC y más
preferiblemente inferior o igual a 250ºC y a una presión muy
superior a la presión crítica de dicho fluido o mezcla de fluidos,
por ejemplo del orden de al menos 3 veces y preferiblemente de al
menos 5 veces dicha presión crítica.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho fluido se selecciona entre etanol
y acetona y la mezcla de fluidos se selecciona entre las mezclas de
etanol-dióxido de carbono y
acetona-dióxido de carbono cuya temperatura es
inferior a 270ºC, preferiblemente inferior a o igual a 260ºC y más
preferiblemente inferior o igual a 250ºC.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho fluido es etanol.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la presión de tratamiento del coral está
comprendida entre 300 y 450 MPa, preferiblemente entre 350 y 400
MPa.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la temperatura de tratamiento del coral
está comprendida entre 240 y 260ºC, preferiblemente del orden de
250ºC y el tiempo de tratamiento del coral está comprendido entre
15 y 240 minutos, preferiblemente del orden de 1 h.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la mezcla de fluidos es una mezcla de
etanol-dióxido de carbono y la presión de
tratamiento del coral está comprendida entre 30 y 50 MPa,
preferiblemente del orden de 40 MPa.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la temperatura de tratamiento del coral
es del orden de 80 a 100ºC.
8. Coral obtenido mediante el procedimiento de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Sustituto óseo fabricado a partir de coral de
acuerdo con la reivindicación 8.
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