ES2283460T3 - Composiciones que comprenden una beta-galactosidasa, una n-acetil-glucosaminidasa y una n-acetil-galactosaminidasa, no comprendiendo dichas composiciones proteasa. - Google Patents
Composiciones que comprenden una beta-galactosidasa, una n-acetil-glucosaminidasa y una n-acetil-galactosaminidasa, no comprendiendo dichas composiciones proteasa. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización para favorecer la descamación de una composición cosmética que comprende, como principio activo, al menos una asociación de a-galactosidasa, N-acetil-glucosaminidasa y N-acetil-galactosaminidasa que favorece la descamación, de forma que dicha composición no comprende proteasas.
Description
Composiciones que comprenden una
\beta-galactosidasa, una
N-acetil-glucosaminidasa y una
N-acetil-galactosaminidasa, no
comprendiendo dichas composiciones proteasa.
La presente invención se refiere a composiciones
que favorecen la descamación. En particular, trata sobre
composiciones exentas de proteasas y que comprenden al menos una
asociación de \beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa, y,
llegado el caso, un activador de glicosidasas, y sus utilizaciones
para luchar contra el envejecimiento cutáneo o contra las pieles
secas.
La descamación es un fenómeno natural, ligado al
hecho de que la epidermis, que constituye la capa superior de la
piel, está en constante regeneración. La epidermis está constituida
por varias capas de células, de las cuales la más profunda es la
capa basal, constituida por células indiferenciadas. A lo largo del
tiempo, estas células van a diferenciarse y migrar hacia la
superficie de la epidermis, constituyendo las diferentes capas de
esta, hasta formar en la superficie de la epidermis los corneocitos,
células muertas que constituyen la última capa de la epidermis, es
decir, la capa más externa, llamada también stratum corneum,
que se eliminan por descamación. Esta pérdida en la superficie se
compensa por la migración de células de la capa basal hacia la
superficie de la epidermis. Se trata de una renovación perpetua de
la piel.
Una piel joven renueva sus capas superficiales
cada dos a tres semanas, mientras que una piel madura puede
necesitar el doble de ese tiempo. Una de las consecuencias de esta
disminución de la velocidad de renovación epidérmica es la
impresión de piel seca. En efecto, cuanto más largo es el proceso
de renovación, más disminuye la hidratación natural en la
superficie de la piel.
Además, cuanto más disminuye la velocidad de
descamación, la piel más toma un aspecto mate y pierde su brillo y
su frescor.
Una eliminación forzada de la capa córnea
acelera la renovación epidérmica, permite luchar contra el
envejecimiento cutáneo y entonces la piel vuelve a presentar un
aspecto joven y fresco, así como una hidratación mejor. La piel
pierde de este modo su aspecto mate y el tono se encuentra
mejorado.
El envejecimiento cutáneo, resultante de los
efectos sobre la piel de factores intrínsecos o extrínsecos, se
traduce en la aparición de arrugas, pliegues y arruguitas; en el
amarilleamiento de la piel, que desarrolla en particular un aspecto
apergaminado, acompañado, llegado el caso, de la aparición de
manchas pigmentarias; en la desorganización de las fibras de
elastina y de colágeno, lo que acarrea una pérdida de elasticidad,
de flexibilidad y de firmeza y en la aparición de
telangiectasias.
Algunos de estos signos del envejecimiento están
más especialmente ligados al envejecimiento intrínseco o biológico,
es decir, al envejecimiento "normal" relacionado con la edad, o
cronobiológico, mientras que otros son más específicos del
envejecimiento extrínseco, es decir, del envejecimiento provocado de
una manera general por el medio ambiente; más concretamente, se
trata del fotoenvejecimiento debido a la exposición al sol, a la
luz o a cualquier otra radiación.
La invención se interesa por el envejecimiento
intrínseco o fisiológico así como por el envejecimiento
extrínseco.
Los cambios de la piel debidos al envejecimiento
intrínseco son la consecuencia de una senescencia genéticamente
programada en la cual intervienen factores endógenos. Este
envejecimiento intrínseco provoca especialmente una disminución de
la velocidad de renovación de las células de la piel, lo cual se
traduce esencialmente por la aparición de alteraciones clínicas
tales como la reducción del tejido adiposo subcutáneo y la aparición
de finas arrugas y por cambios histopatológicos tales como un
aumento del número y del espesor de las fibras elásticas, una
pérdida de fibras verticales de la membrana del tejido elástico y la
presencia de grandes fibroblastos irregulares en las células de
este tejido elástico.
Por el contrario, el envejecimiento extrínseco
ocasiona alteraciones clínicas tales como arrugas gruesas y la
formación de una piel blanda y/o curtida y cambios histopatológicos
tales como una excesiva acumulación de materia elástica en la
dermis superior y una degeneración de las fibras de colágeno.
Las degradaciones proteolíticas observadas en el
proceso de descamación estarían inducidas por proteasas sintetizadas
por el stratum corneum, en particular la enzima emparentada
con la quimotripsina del stratum corneum (SCCE, por sus
siglas en inglés). Se ha demostrado, además, que en el curso de la
diferenciación terminal de la epidermis se externalizan
glicosidasas de origen lisosomial (Nemanic et al., J. of
Invest. Dermat., 1983, 81: 28-33). Sin embargo, la
caracterización de los sustratos de estas glicosidasas a nivel del
stratum corneum apenas ha progresado y el papel biológico de
las mismas no ha sido claramente elucidado.
Se ha observado que la presencia de restos
sacarídicos en las proteínas protege las estructuras desmosomales y
las proteínas de los corneosomas de una degradación proteolítica
inducida artificialmente por la adición de proteasas (Walsh y
Chapman (1990), Arch Dermatol Res 282:304-310).
De esta observación, resulta la hipótesis de que
las glicosidasas endógenas podrían favorecer la acción de las
proteasas a nivel del stratum corneum y acelerar, de este
modo, el fenómeno de la descamación.
También es posible que los azúcares generados
por la actividad glicosidásica endógena impliquen directamente una
respuesta celular que conduzca a la liberación de los
corneocitos.
En consecuencia, la puesta a punto de cosméticos
que favorezcan el fenómeno de la descamación mediante su aplicación
sobre la piel permite luchar contra las pieles secas y el
envejecimiento cutáneo en particular. En la técnica conocida, se
describen numerosos ejemplos de composiciones cosméticas que
favorecen la descamación. En particular, se pueden citar
composiciones que contienen ácido retinoico, tales como las
descritas en el documento de la patente de Estados Unidos
US-A-4.603.146, composiciones que
contienen \alpha- o \beta-hidroxiácidos
(véanse, por ejemplo, las solicitudes
EP-A-413 528 o
WO-A-93/10756). No obstante, estos
compuestos presentan efectos secundarios que consisten en picores,
tiranteces, calentamientos y rojeces desagradables para el usuario.
En la técnica actual se describen ejemplos de composiciones que
comprenden esencialmente proteasas o una combinación de proteasas y
glicosidasas (FR-A-2 732 593,
Bieurope SA; PCT WO 93/19732, Unilever PLC; PCT WO 95/07687,
Unilever PLC). Sin embargo, el empleo de proteasas en composiciones
tópicas implica riesgos toxicológicos y puede ocasionar,
especialmente, reacciones alérgicas y fenómenos de irritación.
La invención se deriva de estudios del efecto de
glicosidasas exógenas sobre el fenómeno de la descamación. Estos
estudios se han realizado con ayuda de la puesta a punto de un test
in vitro de descamación adaptado al cribado de moléculas.
De este modo, estos estudios han permitido demostrar que, de manera
sorprendente, una aumento de la actividad glicosidásica a nivel del
stratum corneum por la adición de glicosidasas exógenas
específicas, si es necesario en asociación con un producto capaz de
estimular la actividad glicosidásica endógena, es suficiente en
ausencia de adición de proteasas exógenas para favorecer el fenómeno
de la descamación.
En consecuencia, la invención trata de
composiciones que comprenden, como principio activo, al menos una
asociación de \beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa, que
favorece la descamación, sin que dicha composición comprenda
proteasas.
Las otras glicosidasas comprendidas en las
composiciones según la invención son todas las enzimas susceptibles
de tener como sustrato proteoglicanos, glicolípidos y en general los
glicoconjugados del stratum corneum. Tales enzimas son las
sialidasas como por ejemplo: neuraminidasas, manosidasas,
galactosidasas, glucosidasas, condroitinasas, glucuronidasas o
incluso hialuronidasas.
Pueden también ser todas las glicosidasas que
favorecen la descamación, seleccionadas mediante cualquier ensayo
de eficacia de glicosidasas en la descamación (Lundström A. y
Egelrud T., Arch. Dermatol. Res. (1990), 282:
234-237), o incluso por el ensayo que comprende las
etapas siguientes:
- a)
- la recuperación de muestras del stratum corneum a partir de un individuo;
- b)
- la fijación de la muestra sobre un soporte;
- c)
- la puesta en contacto de la muestra fijada sobre un soporte con una disolución tamponada que contiene la glicosidasa a ensayar;
- d)
- la recuperación del material insoluble liberado en la disolución tamponada;
- e)
- la dosificación de las queratinas presentes en el material insoluble y su cuantificación relativa respecto a un ensayo de control sin glicosidasa.
Mediante el presente ensayo, las queratinas
dosificadas en la etapa e) en el material insoluble reflejan la
cantidad de corneocitos liberados. Asimismo, permite ensayar el
efecto "prodescamante" de un producto y más particularmente de
las glicosidasas.
Estas otras glicosidasas comprenden también las
celulasas para las cuales no se conoce ningún sustrato endógeno a
nivel del stratum corneum.
Las glicosidasas para las cuales se ha
evidenciado un efecto prodescamante con ayuda de estudios in
vitro son: N-glicanasa, celulasas,
\beta-glucosidasa. En la invención está
comprendida en la composición una asociación de tres glicosidasas:
\beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa.
Las glicosidasas utilizadas en las composiciones
según la invención se pueden purificar a partir de extractos de
proteínas sintetizadas por la células del stratum corneum o
pueden ser glicosidasas sintetizadas naturalmente por
microorganismos. Asimismo, pueden ser glicosidasas recombinantes
producidas en sistema heterólogo.
De manera general, una composición según la
invención comprende de 0,001 a 15% en peso de glicosidasa, de
manera preferida de 0,01 a 10% y mejor de 0,05 a 5% en peso respecto
del peso total de la composición.
La invención resulta de la observación de que el
aumento de la actividad glicosidásica a nivel del stratum
corneum es suficiente para favorecer la descamación. En
consecuencia, la invención se refiere también a composiciones
cosméticas que comprenden un producto capaz de estimular la
actividad de las glicosidasas. Un producto capaz de estimular la
actividad de las glicosidasas es un producto que permite aumentar la
velocidad de la reacción enzimática, medida, por ejemplo, por el
aumento de la cantidad de sustratos digeridos por unidad de tiempo
cuando se añade dicho producto en el medio de reacción. Un ejemplo
de producto capaz de estimular la actividad de la
\beta-glucosidasa es el
1-O-metil-\beta-D-glucopiranósido.
Estos activadores representan entre 0,01% y 10% del peso total de
la composición, de manera preferida entre 0,1 y 1% del peso total de
la composición.
En las composiciones utilizables según la
invención y definidas precedentemente, las glicosidasas pueden estar
asociadas a otros activos que tienen propiedades descamantes
conocidas, como los hidroxiácidos, los \alpha- o
\beta-cetoácidos, los retinoides, ciertos ácidos
sulfónicos o ciertos carbohidratos tales como los definidos en la
solicitud de patente (L'Oreal, "utilización de carbohidratos para
favorecer la descamación de la piel"
WO-A-97 12597). Una asociación tal
permite disminuir la concentración activa de esos activos debido a
los efectos aditivos. De este modo se puede obtener una
composición menos irritante y menos tóxica, así como una
composición más eficaz que las de la técnica anterior que no utiliza
estos activos.
Los hidroxiácidos pueden ser por ejemplo
\alpha-hidroxiácidos o
\beta-hidroxiácidos, que pueden ser lineales,
ramificados o cíclicos, saturados o insaturados. Además, los átomos
de hidrógeno de la cadena carbonada pueden estar sustituidos por
halógenos, radicales halogenados, alquilados, acilados,
aciloxilados, alcoxicarbonilados o alcoxilados que tienen de 2 a 18
átomos de carbono.
Estos hidroxiácidos son, especialmente, los
ácidos glicólico, láctico, málico, tartárico, cítrico y de manera
general los ácidos de frutas, los ácidos
2-hidroxialcanoico, mandélico, salicílico, así como
sus derivados alquilados o acilados como los ácidos
n-octanoil-5-salicílico,
n-dodecanoil-5-salicílico,
n-decanoil-5-salicílico,
n-octil-5-salicílico,
el ácido n-heptiloxi-5- o
-4-salicílico, el ácido
2-hidroxi-3-metilbenzoico
o incluso sus derivados alcoxilados como el ácido
2-hidroxi-3-metoxibenzoico.
Los retinoides pueden ser especialmente ácido
retinoico (todo-trans o 13-cis) y
sus derivados, retinol (vitamina A) y sus ésteres tales como
palmitato de retinol, acetato de retinol y propionato de retinol así
como sus sales, o incluso retinal.
Como ejemplo, los hidroxiácidos, los cetoácidos
y los retinoides se pueden introducir en las composiciones
utilizadas según la invención en una cantidad que representa de 0,01
a 5% en peso total de la composición y mejor de 0,1 a 3%.
La composición utilizada según la invención
contiene un medio cosmética o dermatológicamente aceptable, es
decir, un medio compatible con la piel, las uñas, las mucosas, los
tejidos y los cabellos. Según un modo preferido de realización de
la invención, la composición tiene un pH que permite una actividad
óptima de las glicosidasas utilizadas y, preferentemente, próximo
al de la piel, comprendido entre 4 y 7. La composición que
comprende las glicosidasas se aplica preferentemente por vía tópica
sobre la cara, el cuello, los cabellos, las mucosas y las uñas o
sobre cualquier otra zona cutánea del cuerpo.
Una composición cosmética según la invención se
presenta preferentemente en una forma apropiada para una
administración por vía tópica y para contener activos de tipo
enzima que presentan una inestabilidad en medio acuoso y para una
aplicación tópica. Especialmente se presenta en forma de
disoluciones hidroalcohólicas o aceitosas, de dispersiones de tipo
loción o sérum, de geles anhidros o aceitosos, de emulsiones de
consistencia líquida o semilíquida de tipo leche, obtenidas por
dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (O/W) o a la inversa
(W/O), de suspensiones o de emulsiones de consistencia blanda,
semisólida o sólida de tipo crema, gel, de microemulsiones, o
incluso de microcápsulas, micropartículas o de dispersiones
vesiculares de tipo iónico y/o no iónico. Estas composiciones se
preparan según los métodos usuales. Una forma preferida y
especialmente adaptada para composiciones que comprenden activos
enzimáticos es una forma del tipo W/O/W tal como la descrita en el
documento de solicitud EP 0 779 071 (L'Oréal).
Asimismo, las composiciones según la invención
se pueden usar para los cabellos en forma de disoluciones
alcohólicas o hidroalcohólicas, o en forma de cremas, geles,
emulsiones y espumas.
Las cantidades de los diferentes constituyentes
de las composiciones usadas según la invención son las utilizadas
de manera clásica en los campos considerados.
Estas composiciones constituyen especialmente
cremas de protección, de tratamiento o de cuidado para el rostro,
para las manos o para el cuerpo, leches corporales de protección o
de cuidado, lociones, geles o espumas para el cuidado de la piel y
de las mucosas o para la limpieza de la piel.
Asimismo, las composiciones pueden consistir en
preparaciones sólidas que constituyen jabones o pastillas de
limpieza.
\newpage
De forma conocida, la composición utilizada
según la invención puede contener también coadyuvantes habituales
en los campos cosmético y dermatológico, tales como gelificantes
hidrófilos o lipófilos, activos hidrófilos o lipófilos,
conservantes, antioxidantes, disolventes, perfumes, cargas y
materias colorantes. Las cantidades de estos distintos
coadyuvantes son las utilizadas de manera clásica en los campos
considerados y, por ejemplo, de 0,01% a 20% del peso total de la
composición. Naturalmente, la persona conocedora de la técnica
velará para escoger el o los eventuales aditivos y/o sus cantidades
de tal forma que las propiedades ventajosas ligadas de forma
intrínseca a la composición según la invención, en especial las
actividades enzimáticas de las glicosidasas, no sean alteradas en
absoluto o de manera sustancial por los añadidos previstos.
Como aceites utilizables en la invención, se
pueden citar aceites minerales (aceite de vaselina), aceites
vegetales (aceite de karité, aceite de almendras dulces), aceites
animales, aceites de síntesis, aceites siliconados (ciclometicona)
y aceites fluorados (perfluoropoliéteres). También se pueden
utilizar como materias grasas alcoholes grasos, ácidos grasos
(ácido esteárico), ceras (parafina, carnauba, cera de abejas).
Como emulsionantes utilizables en la invención
se puede citar el Polysorbate 60 y el estearato de sorbitano,
vendidos respectivamente con las denominaciones comerciales Tween 60
y Span 60 por la empresa ICI. Se pueden añadir coemulsionantes
tales como el PPG-3 miristiléter vendido con la
denominación comercial Emcol 249-3K por la empresa
Witco.
Como disolventes utilizables en la invención se
pueden citar los alcoholes inferiores, especialmente el etanol y el
isopropanol y el propilenglicol.
Como gelificantes hidrófilos se pueden citar
polímeros carboxivinílicos (carbomer), copolímeros acrílicos tales
como los copolímeros de acrilatos/alquilacrilatos, poliacrilamidas,
polisacáridos tales como la hidroxipropilcelulosa, gomas naturales
(xantana) y arcillas y, como gelificantes lipófilos, se pueden citar
arcillas modificadas tales como bentonas, soles metálicos de ácidos
grasos como los estearatos de aluminio, sílice hidrófoba,
polietilenos y etilcelulosa.
Como activos hidrófilos, se pueden utilizar
proteínas o hidrolizados de proteínas, aminoácidos, polioles, urea,
alantoína, azúcares y derivados de azúcar, vitaminas hidrosolubles,
almidón, extractos bacterianos o vegetales, especialmente de Aloe
Vera.
Como activos lipófilos, se pueden utilizar el
tocoferol (vitamina E) y sus derivados, ácidos grasos esenciales,
ceramidas, aceites esenciales.
Con el fin de luchar de manera eficaz contra el
fotoenvejecimiento, es posible, además, añadir a la composición
utilizada según la invención uno o varios filtros solares
complementarios, activos en el UV A y/o en el UV B, hidrófilos o
lipófilos, que contengan opcionalmente una función sulfónica.
El filtro solar se escoge preferentemente entre
filtros orgánicos y/o filtros minerales.
Como filtros orgánicos se pueden citar,
especialmente, derivados cinámicos, derivados salicílicos, derivados
de alcanfor, derivados de triazina, derivados de la benzofenona,
derivados de dibenzoilmetano, derivados de
\beta,\beta-difenilacrilato, derivados del ácido
p-aminobenzoico, polímeros filtro y siliconas filtro
descritos en el documento de la solicitud
WO-93/04665 o también los filtros orgánicos
descritos en el documento de la solicitud de patente
EP-A 0 487 404.
Como filtros minerales, se pueden citar
especialmente pigmentos o bien incluso nanopigmentos (tamaño medio
de las partículas primarias: generalmente entre 5nm y 10 nm,
preferentemente entre 10 y 50 nm) de óxidos metálicos recubiertos o
no, como por ejemplo nanopigmentos de óxido de titanio (amorfo o
cristalizado en forma rutilo y/o anatasa), de hierro, de zinc, de
zirconio o de cerio, que son todos agentes fotoprotectores bien
conocidos por sí mismos que actúan por bloqueo físico de la
radiación UV (reflexión y/o difusión). Por otro lado, agentes de
recubrimiento clásicos son la alúmina y/o el estearato de aluminio.
Se describen en concreto tales nanopigmentos de óxidos metálicos,
recubiertos o no, en los documentos de las solicitudes de patentes
EP-A-0 518 772 y
EP-A-0 518 773.
Como ejemplos de filtros solares complementarios
activos en el UV-A y/o en el UV-B,
se pueden citar:
- ácido
p-aminobenzoico;
- p-aminobenzoato
oxietilenado (25 mol);
-
p-dimetilaminobenzoato de
2-etilhexilo;
- p-aminobenzoato de
etilo N-oxipropilenado;
- p-aminobenzoato de
glicerol;
- salicilato de homomentilo;
- salicilato de
2-etilhexilo;
- salicilato de trietanolamina;
- salicilato de
4-isopropilbencilo;
-
4-terbutil-4'-metoxi-dibenzoilmetano
(PARSOL 1789 de GIVAUDAN ROURE);
- p-metoxicinamato de
2-etilhexilo (PARSOL MCX de GIVAUDAN ROURE);
-
4-isopropil-dibenzoilmetano (EUSOLEX
8020 de MERCK);
- antranilato de mentilo;
-
2-etilhexil-2-ciano-3,3'-difenilacrilato,
(UVINUL N539 de BASF);
-
etil-2-ciano-3,3'-difenilacrilato;
- ácido
2-fenil-benzimidazol-5-sulfónico
y sus sales;
-
3-(4'-trimetilamonio)-benciliden-bornan-2-on-metilsulfato;
-
2-hidroxi-4-metoxibenzofenona
(UVINUL MS 40 de BASF);
-
2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfonato
(UVINUL MS 40 de BASF);
-
2,4-dihidroxibenzofenona (UVINUL 400 de BASF);
-
2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona (UVINUL D 50 de
BASF);
-
2,2'-dihidroxi-4,4'-dimetoxibenzofenona
(HELISORB II de NORQUAY);
-
2-hidroxi-4-n-octoxibenzofenona;
-
2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona;
- ácido
\alpha-(2-oxoborn-3-iliden)-tolil-4-sulfónico
y sus sales;
-
3-(4'-sulfo)benciliden-bornan-2-ona
y sus sales;
-
3-(4'-metilbencilidén)-d,l-alcanfor;
-
3-bencilidén-d,l-alcanfor;
- ácido
benceno-1,4-di(3-metiliden-10-canfosulfónico)
y sus sales (MEXORYL SX de CHIMEX);
- ácido urocánico;
-
2,4-6-tris-[p-(2'-etilhexil-1'-oxicarbonil)anilino]-1,3,5-triazina;
-
2-[p-(terbutilamido)anilino]-4,6-bis
[p-(2'-etilhexil-1'-oxicarbonil)anilino]-1,3,5-triazina;
-
2,4-bis{[4-2-etil-hexiloxil]-2-hidroxil-fenil}-6-(4-metoxi-fenil)-1,3,5-triazina;
- polímero de N-(2 y
4)-[2-oxoborn-3-iliden)metil)bencil]-acrilamida;
- ácido
4,4-bis-bencimidazolil-fenilen-3,3',5,5'-tetrasulfónico
y sus sales;
-
2,2'-metilen-bis-[6-(2H-benzotriazol-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol];
- poliorganosiloxanos de función
malonato.
La invención trata también de un procedimiento
de tratamiento cosmético, mediante la aplicación de composiciones
como las definidas previamente en el texto, según la técnica de
utilización habitual de estas composiciones. Por ejemplo:
aplicaciones de cremas, de geles, de sérums, de pomadas, de
lociones, de leches sobre la piel, el cuero cabelludo, las uñas y/o
las mucosas.
\newpage
Las composiciones que favorecen la descamación
son adaptadas para el tratamiento de las pieles secas o para luchar
contra el envejecimiento cutáneo.
En consecuencia, la invención se refiere también
al uso de composiciones tales como las descritas precedentemente
para el tratamiento de las pieles secas o el tratamiento y/o la
prevención del envejecimiento cutáneo.
La parte que sigue a continuación presenta los
resultados del estudio in vitro del efecto de diferentes
glicosidasas sobre la descamación. Además presenta ejemplos de
formulación de composiciones según la invención sin restringir el
alcance de las reivindicaciones.
La figura 1 es un histograma que ilustra el
efecto de la urea al 5% sobre la separación de los corneocitos. Los
valores se representan en porcentaje del nivel de detección de
queratinas respecto del control negativo que contiene el tampón de
base PBS (100%).
La figura 2 ilustra el efecto
dosis-respuesta de la N-glicanasa
sobre la separación de los corneocitos en comparación con la urea
(por immunoblot).
La figura 3 es un gráfico que ilustra el efecto
de la N-glicanasa a tres concentraciones diferentes
sobre la liberación de los corneocitos. Los valores son las medias
de 5 experiencias independientes expresados en porcentaje del nivel
de detección de queratinas respecto del control negativo que
contiene el tampón de base (100%).
La figura 4 ilustra el efecto sobre la
descamación de ciertas glicosidasas y de ciertas celulasas
comercializadas por Clonezyme por immunoblot.
La figura 5 es un gráfico que muestra el efecto
de la celulasas sobre la liberación de los corneocitos en
comparación con el tampón de base. Los valores se representan en
porcentaje del nivel de detección de queratinas respecto del
control negativo que contiene el tampón de base (100%).
La figura 6 es un gráfico que ilustra el efecto
de una mezcla de glicosidasas sobre la liberación de los
corneocitos. Los valores se representan en porcentaje del nivel de
detección de queratinas respecto del control negativo que contiene
el tampón de base (100%).
Para la toma de muestras de las capas
superficiales del stratum corneum, el ensayo utiliza el
método del barniz-blenderm realizado sobre las
pantorrillas. Se aplica barniz directamente sobre la piel y luego,
tras 10 minutos, se levantan las capas superiores del stratum
corneum con adhesivo de tipo blenderm (3M). A continuación se
ajusta el filtro que contiene la muestra sobre una placa de
microvaloración de 96 pozos en teflón y se fija sobre una base que
permite la estanqueidad entre los pozos.
A los pozos se añaden 90 \mul de tampon de
base (PBS, pH 6,5, 0,1% fosfato ácido de sodio, 0,05% tween 20) que
contienen las enzimas o productos ensayados. Cada determinación se
realiza sobre 3 o 4 pozos repartidos de forma diferente sobre la
placa, tras un tiempo de incubación comprendido entre 1 hora y 48
horas a temperatura comprendida entre 20 y 37ºC. 40 \mul de cada
pozo tratado en las mismas condiciones se mezclan y se filtran
sobre tamices de porosidad de 0,22 \mum, a fin de eliminar las
proteínas solubles y retener así los corneocitos liberados. Los
corneocitos se retoman en 30 \mul de tampon de base en presencia
de DTT y se calientan durante 15 minutos a 80ºC. A continuación se
centrifugan las muestras para eliminar el material insoluble y se
analizan por SDS-PAGE y/o Western Blot con la ayuda
de anticuerpos monoclonales antiqueratina K10 (queratinas
suprabasales). Las queratinas se detectan tras la coloración de las
proteínas con nitrato de plata (a un peso molecular aparente de
aproximadamente 55-65 kDa). La utilización de un
anticuerpo monoclonal anti-K10 permite confirmar la
presencia de queratinas suprabasales solubilizadas.
El análisis de las fracciones pasadas por el
tamiz de porosidad 0,22 \mum (que contienen las proteínas
solubles) no contiene proteínas mayoritariamente representadas a
55-65 kDa que corresponden a la zona de migración de
las queratinas. En cambio, el análisis de la fracción retenida
`por el filtro permite la identificación de las queratinas. Esto
confirma que el análisis de queratinas por inmunoblot refleja bien
la presencia de corneocitos, ya que las queratinas de los
corneocitos están relacionadas con el material insoluble. En
consecuencia, la cuantificación de las queratinas detectadas
permite obtener una estimación de la cantidad de corneocitos
liberados en el curso de la incubación y, en consecuencia, una
evaluación del efecto prodescamante de un producto.
La urea es un componente conocido por su acción
positiva sobre la descamación. A fin de validar el ensayo, se ha
utilizado esta molécula como control positivo a concentraciones de
1% y 5% (en comparación con el testigo negativo constituido
únicamente por el tampón de base). Los resultados se presentan en
las figuras 1 y 2. Los datos promedio de los ensayos realizados en
4 experimentos independientes muestran claramente un efecto de la
urea al 5% (200% +/- 100% de queratina medida respecto al 100%
medido sin urea).
Estos resultados permiten validar el uso de este
ensayo para el cribado de moléculas susceptibles de favorecer la
descamación.
La N-glicanasa (endo. F)
permite eliminar todas las cadenas N-unidas que
llevan las glicoproteínas. La N-glicanasa
utilizada es la comercializada por Boehringer. Los resultados
presentados en las figuras 2 y 3 muestran claramente un efecto de
la N-glicanasa sobre la liberación de los
corneocitos.
Se ensayó la capacidad de favorecer la
descamación de diferentes glicosidasas comercializadas por
CloneZyme™. La tabla 1 que sigue a continuación presenta las
especificidades de los sustratos de las diferentes glicosidasas
ensayadas.
| (-: ninguna actividad; \varepsilon, +, ++: actividad específica). |
Uno de los intereses de estas glicosidasas es su
disponibilidad relativamente sencilla y su estabilidad frente a las
variaciones de temperatura. En consecuencia, son más especialmente
aptas para entrar en la preparación de composiciones adecuadas para
la administración tópica. Mediante la identificación de las
queratinas tras coloración con nitrato de plata de los geles
SDS-PAGE e inmunodetección, los resultados
presentados en la figura 4 muestran que estas glicosidasas
favorecen la descamación. La especificidad de estas glicosidasas
frente a sus sustratos es más o menos estrecha. Los resultados
muestran un óptimo de eficacia con la glicosidasa Gli10, con, por
orden de eficacia, Gli10 > Gli07 > Gli02.
Las celulasas cortan los enlaces
\beta1-4 situados entre dos glucosas internas
(endoglicosidasas). La presencia de celulosa o de estructuras
similares no se ha descrito en la epidermis humana. Sin embargo,
resulta posible que determinadas estructuras sacarídicas del
stratum corneum constituyan el blanco de celulasas. Se ha
ensayado el efecto de la celulasa comercializada por Boehringer a
través de su capacidad para favorecer la descamación. Los
resultados presentados en la figura 5 muestran de manera
sorprendente un efecto importante (similar al de la urea) de la
celulasa sobre la descamación. Se obtienen resultados similares con
varias celulasas recombinantes comercializadas por CloneZyme™, con,
por orden de eficacia, cel03 > cel04, cel01 (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La tabla 2 presenta la especificidad de
sustratos de diferentes celulasas ensayadas frente a glicósidos.
| (+ : 1-10% actividad relativa; 10-100% actividad relativa). |
Se ha probado el efecto sobre la descamación de
ciertas exo-glicosidasas. En particular, se han
ensayado in vitro 40 U de
\beta-galactosidasa, de
\alpha-fucosidasa, 1 U de
N-acetil-glucosaminidasa, 0,5 U de
\alpha-galactosidasa, 0,3 U de
\alpha-manosidasa 0,2 U de
\beta-manosidasa 50 U de glucuronidasa 5 U de
\beta-glucosidasa y U de
\alpha-glucosidasa. Tomadas de manera separada,
las exoglicosidasas no afectan más que muy débilmente a la
descamación. La combinación que muestra un efecto significativo
sobre la descamación es la mezcla de
\beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa. La
figura 6 muestra el efecto de esta combinación de enzimas sobre la
liberación de los corneocitos.
La O-glicanasa permite separar
específicamente las cadenas O-unidas. Se ha
ensayado la capacidad de favorecer la descamación de la
O-glicanasa. Los resultados obtenidos en los
ensayos in vitro muestran que la O-glicanasa
no parece afectar a la descamación o lo hace muy débilmente (10% de
aumento observado). Además, el empleo simultáneo de
O-glicanasa y de sialidasa de amplio espectro
(Arthrobacter ureafaciens) o de O-glicanasa +
N-glicanasa y sialidasa no muestra un efecto
superior al observado con la N-glicanasa sola.
Composición
1
- Aceite de vaselina
\dotl7,0 g
- N-glicanasa
(Endo-F de Flavobacterium
meningosepticum)
\dotl0,1 g
- Monoestearato de glicerilo, estearato de
polietilenglicol(100 OE)
\dotl3,0 g
- Polímero carboxivinílico
\dotl0,4 g
- Alcohol estearílico
\dotl0,7 g
- Proteínas de soja
\dotl3,0 g
- NaOH
\dotl0,4 g
- Conservante
\dotlcs
- Agua
\dotlcsp 100 g
Esta composición se presenta en forma de leche
para el rostro, que tiene buenas propiedades cosméticas y es suave
y cómoda de utilizar.
El pH de la composición es de aproximadamente
5,5.
Composición
2
-
\beta-glucosidasa
\dotl0,5 g
- Palmitato de
etil-2-hexilo
\dotl10,0 g
- Ciclopentadimetilsiloxano
\dotl20,0 g
- Butilenglicol
\dotl5,0 g
- Conservante
\dotlcs
- Agua
\dotlcsp 100 g
Esta loción, que no contiene tensioactivo,
favorece la descamación de la piel.
Composición
3
- Palmitato de octilo
\dotl35,0 g
- Glicerina
\dotl2,0 g
-
N-acetil-glucosaminidasa
\dotl0,8 g
- Polímero reticulado acrilatos
C10-C30/alquilacrilatos
\dotl0,1 g
- Trietanolamina
\dotl0,1 g
- Aminoácidos de trigo
\dotl1,0 g
- Conservante
\dotlcs
- Agua
\dotlcsp 100 g
La leche obtenida, que no contiene tensioactivo,
posee buenas propiedades cosméticas.
Composición
4
- Glicerina
\dotl10,0 g
-
N-acetil-galactosidasa
\dotl1,0 g
- Cocoanfodiacetato de
disodio
\dotl10,0 g
- Conservante
\dotlcs
- Agua
\dotlcsp 100 g
El gel obtenido posee buenas propiedades
cosméticas.
Composición
5
- Butilenglicol
\dotl7,0 g
- Sarcosinato de lauroilsodio
\dotl4,0 g
-
\beta-glucosidasa
\dotl1,0 g
- Trietanolamina
\dotl0,8 g
- Carbomer
\dotl0,5 g
- Conservante
\dotlcs
- Agua
\dotlcsp 100 g
El gel obtenido posee buenas propiedades
cosméticas.
Claims (19)
1. Utilización para favorecer la
descamación de una composición cosmética que comprende, como
principio activo, al menos una asociación de
\beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa que
favorece la descamación, de forma que dicha composición no comprende
proteasas.
2. Utilización según la reivindicación
1, caracterizada porque la composición contiene además una
glicosidasa escogida entre las enzimas siguientes:
N-glicanasa, celulasas y/o
\beta-glucosidasa.
3. Utilización según las
reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la composición
comprende además un producto capaz de estimular la actividad
glicosidásica.
4. Utilización según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque las
glicosidasas que favorecen la descamación representan entre 0,001 y
15% del peso total de la composición, de manera preferida de 0,01 a
10% y mejor aún de 0,05% a 5%.
5. Utilización según la reivindicación
4, caracterizada porque un producto capaz de estimular la
actividad glicosidásica representa de 0,01 a 10% del peso total de
la composición, de manera preferida de 0,1 a 1%.
6. Utilización según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque al menos una
glicosidasa que favorece la descamación es una glicosidasa
recombinante.
7. Utilización según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque al menos
una glicosidasa es una glicosidasa aislada del stratum
corneum.
8. Utilización según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la
composición comprende además al menos otro activo que tiene
propiedades que favorecen la descamación.
9. Utilización según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la
composición es adecuada para la administración tópica.
10. Utilización de una composición según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de
las pieles secas o el tratamiento y/o la prevención del
envejecimiento cutáneo.
11. Composición susceptible de ser
utilizada para favorecer la descamación, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende una
asociación de \beta-galactosidasa,
N-acetil-glucosaminidasa y
N-acetil-galactosaminidasa, de forma
que dicha composición no comprende proteasas.
12. Composición según la reivindicación
11, caracterizada porque comprende además un producto capaz
de estimular la actividad glicosidásica.
13. Composición según las
reivindicaciones 11 o 12, caracterizada porque las
glicosidasas que favorecen la descamación representan entre 0,001 y
15% del peso total de la composición, de manera preferida de 0,01 a
10% y mejor aún de 0,05% a 5%.
14. Composición según la reivindicación
12, caracterizada porque un producto capaz de estimular la
actividad glicosidásica representa de 0,01 a 10% del peso total de
la composición, de manera preferida de 0,1 a 1%.
15. Composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque al menos
una glicosidasa que favorece la descamación es una glicosidasa
recombinante.
16. Composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 15, caracterizada porque comprende
además al menos otro activo que tiene propiedades que favorecen la
descamación.
17. Composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 16, caracterizada porque es
adecuada para la administración tópica.
18. Procedimiento de tratamiento cosmético
de la piel para favorecer la descamación de la misma que consiste
en aplicar sobre la piel, el cuero cabelludo, las uñas y/o las
mucosas, una composición tal como la definida en las
reivindicaciones 11 a 17.
19. Procedimiento cosmético de
tratamiento de las pieles secas, de prevención y /o de tratamiento
del envejecimiento cutáneo, que consiste en aplicar sobre la piel
una composición tal como la definida en las reivindicaciones 11 a
17.
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