ES2282397T3 - Anticuerpos que modulan la interaccion upa/upar y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo contra un fragmento uPAR, en donde el fragmento uPAR se selecciona del grupo constituido por los péptidos 84-279, 85-279, 86-279 y 87-279, al que se hace referencia como secuencia de aminoácidos uPAR, caracterizado porque los anticuerpos - son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total y - no reconocen los fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenidos por escisión con quimotripsina.

Description

Anticuerpos que modulan la interacción uPA/uPAR y usos de los mismos.

La presente invención proporciona métodos y agentes útiles para la modulación de la función uPA/uPAR, que pueden emplearse en el diagnóstico o la terapia de diversas patologías, que incluyen infección de HIV, inflamación y cáncer.

Introducción Migración celular y enfermedad

El cuerpo humano responde a los estímulos patógenos por producción local de moléculas inflamatorias específicas y reclutamiento de células especializadas de la sangre y los tejidos próximos. Esto ocurre en casi todas las enfermedades, y contribuye en la mayoría de los casos a las defensas generales del organismo. Sin embargo, algunas veces la reacción inflamatoria, o la carencia de la misma, contribuyen también a la enfermedad propiamente dicha. Neutrófilos, monocitos-macrófagos, linfocitos, células endoteliales y fibroblastos son atraídos por estímulos migratorios específicos y acumulan una respuesta de defensa que causa la destrucción y eliminación del agente u organismo de la enfermedad. Una serie de entidades patológicas severas pueden adscribirse a exceso o deficiencia de la respuesta de las células migratorias. Por ejemplo, las inmunodeficiencias pueden estar causadas por un fallo de las células inflamatorias en acudir con prontitud al sitio lesionado o infectado. El reclutamiento de células en sí mismo, por otra parte, puede causar patologías destructivas en las cuales las células autólogas atacan y destruyen células y tejidos, como en algunas enfermedades auto-inmunes. Sería particularmente ventajoso poder conocer previamente tales situaciones a fin de tomar precauciones especiales.

Un ejemplo especial entre las enfermedades es el cáncer. En esta enfermedad, una deficiencia de las células linfáticas del hospedador puede estar en la base de la carencia de respuesta humoral o celular contra las células de cáncer propiamente dichas, como sería de esperarse, dado que las células de cáncer expresan antígenos muy peculiares. Por otra parte, las células de cáncer tienen la capacidad particular de invadir los tejidos próximos y producir metástasis a distancia; este proceso, sin embargo, es debido no sólo a una propiedad de las células de cáncer. De hecho, las células hospedadoras estromáticas no malignas participan de hecho activamente en el establecimiento del fenotipo maligno y por tanto el fenotipo destructor e invasivo. Si bien los mecanismos implicados se desconocen todavía en gran parte, está claro que una cooperación de las células estromáticas y las células de cáncer es necesaria para el fenotipo maligno, y que las células estromáticas responden a la vez a estímulos que proceden de las células de cáncer y que señalan a las células de cáncer. El bloque farmacológico del fenotipo invasivo del cáncer, debe basarse por tanto en acciones sobre las células de cáncer y las células estromáticas. Una vez más, sería particularmente ventajoso poder conocer previamente las contribuciones específicas de cada tipo de célula.

Otro ejemplo específico es el SIDA, una enfermedad causada por HIV-1 y caracterizada por una inmuno-deficiencia progresiva y grave y por una serie de infecciones fatales, tumores, etc. resultantes, causados por la inmuno-deficiencia propiamente dicha.

Finalmente, deben considerarse las enfermedades infecciosas, dado que las bacterias extrañas reclutan neutrófilos y monocitos/macrófagos al sitio de infección.

Activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) y su receptor (uPAR)

El activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) es una serina-proteasa que activa el plasminógeno a plasmina, una serina-proteasa de amplio espectro propiamente dicha. La plasmina es una proteasa importante en la fibrinólisis, y su actividad parece ser necesaria también en la curación de las heridas.

UPA se sintetiza como un precursor inactivo (pro-uPA) que sufre activación proteolítica para dar uPA. Pro-uPA (y uPA) se fijan con afinidad alta (Kd de 0,1 nM) (Stoppelli, 1984; Vassalli, 1985) a un receptor específico de la membrana plasmática (uPAR, CD87) que localiza su actividad en la superficie celular, restringiendo así el área de activación del plasminógeno (Stephens et al., 1989). La molécula de uPA puede dividirse en dos fragmentos, dotado cada uno de una actividad específica: el fragmento amino-terminal (ATF) tiene la actividad de fijación de receptores, y el fragmento carboxi-terminal (denominado también uroquinasa de peso molecular bajo) tiene la actividad proteolítica plena.

UPAR (Dano, 1990) es una molécula presente en la superficie celular y formada por tres repeticiones, caracterizadas por un patrón específico de disulfuros (véase Figura 1 para un esquema). Las tres repeticiones, de aproximadamente 90 residuos cada una, están conectadas por dos regiones enlazadoras y definen dominios de proteína específicos. Se ha demostrado que el dominio amino-terminal, D1, fija uPA directamente, aunque otras áreas del receptor (como el dominio D3) son también relevantes en el contacto con uPA. uPAR se fija a la superficie celular con un ancla específica de glicosilfosfatidilinositol (gpI), y por tanto carece de un resto trans-membranal y un resto intracelular que sería típico de otros receptores. Es importante (véase más adelante), que la región enlazadora entre los dominios D1 y D2, contiene una secuencia, AVTYSRSRYLEC, a la cual se ha mapeado un epítope quimiotáctico (Blasi, 1997; Fazioli, 1997; Nguyen, 2000).

Ligandos de uPAR

Además de fijar específicamente uPA, uPAR es capaz de fijar también vitronectina, siendo capaz por tanto de proporcionar un anclaje a las células cuando se extiende sobre vitronectina (Deng et al., 1996; Hoyer-Hansen, 1997; Sidenius, 2000; Waltz, 1994). Adicionalmente, se ha comunicado que uPAR interacciona con otras moléculas, como trombospondina (Higazi et al., 1996), quininógeno (Coleman, et al., 1997), aunque con afinidad menor. Entre éstas parecen ser importantes las interacciones con integrinas (Simon, 2000; Tarui, 2000; Waltz, et al., 1997; Wei et al., 1996; Xue et al., 1994; Xue et al., 1997; Yebra et al., 1996). La interacción con integrinas parece tener propiedades de señalización, dado que puede afectar a la adhesión celular (Wei et al., 1996) y la migración celular (Degryse, 1999; Degryse, 2001; Yebra et al., 1996). Finalmente, se han consignado interacciones con otras proteínas de la superficie celular como el receptor de manosa-6-fosfato (Nykjaer, 1998) y uPARAP (Behrendt, 2000).

UPAR y señalización

En los últimos años se ha demostrado convincentemente que uPAR es un receptor de señalización cuando está activado por uPA. A este respecto, la actividad catalítica de uPA en algunos casos no parece ser necesaria. La fijación de uPA a uPAR induce migración celular, adhesión celular y proliferación (Blasi, 1997; Chapman, 1997; Ossowski, 2000). A. La migración celular parece inducirse a niveles de expresión fisiológicos de uPAR, mientras que la adhesión y la proliferación celulares parecen requerir niveles altos de receptores, como los presentes en el cáncer o en células transfectadas (Ossowski, 2000). En línea con esta posibilidad, ratones que carecen de uPA o uPAR tienen un fenotipo inmunodeficiente acusado debido a la carencia de migración de varias células inflamatorias, y son incapaces de combatir la infección por C. neoformans y P. aeruginosa (Gyetko, 1996; Gyetko, 2000). La actividad promotora de la migración de uPAR requiere fijación de uPA y está mediada por un receptor sensible a la toxina de la tos ferina y requiere la activación de una tirosina-quinasa de la familia Src, y de ERKs (Fazioli, 1997; Nguyen, 2000; Ossowski, 2000; Resnati, 1996). Las propiedades de adhesión celular de uPAR están mediadas por una interacción lateral con al menos algunas de las integrinas acopladas con el citoesqueleto y están mediadas por caveolina (Wei et al., 1996; Wei et al., 1999). Las propiedades de proliferación, por otra parte, dependen de una incorporación constitutiva de una \alpha4-integrina por uPAR, dando como resultado la activación constitutiva de la ERK promotora de la proliferación e inhibición de la MAP-quinasa p38 inhibidora del crecimiento (Aguirre Ghiso et al., 1999; Ossowski, 2000).

uPAR y migración celular

La uPA exógena induce quimiotaxis en una diversidad de células (Boyle, 1987; Degryse, 1999; Fibbi, 1988; Gudewicz, 1987; Gyetko, 1994; Nguyen, 2000; Resnati, 1996; Webb et al., 2000). Estudios en profundidad han demostrado que la fijación de uPA transforma uPAR en un ligando para una proteína de la superficie celular que puede transducir su señal (Blasi, 1997). Después de la fijación de u-PA, un epítope peptídico de u-PAR, que está oculto por lo demás en el contexto de la molécula, llega a la superficie de la molécula o se hace disponible debido a la escisión de uPAR. El péptido tiene la secuencia AVTYSRSRYLEC (Figura 1), y está localizado en la región que enlaza el dominio D1 a D2 y que está dotada de actividad quimiotáctica (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). Los fragmentos recombinantes de u-PAR que contienen al menos la secuencia SRSRY (uPAR "activada") inducen migración en las células que carecen de uPAR (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). El epítope quimiotáctico de uPAR se mantiene activo tanto si está situado en el extremo terminal N como en el extremo terminal C de un fragmento recombinante. De hecho, tanto el dominio D1-SRSRY como el dominio SRSY D2-D3 son ambos quimiotácticamente activos (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). Péptidos sintéticos que contienen al menos la secuencia SRSRY pueden sustituir eficazmente las interacciones uPA-uPAR o la adición de fragmentos de uPAR exógenos activados (B. Degryse, 1999; Blasi, 1997; Fazioli, 1997).

El adaptador de uPAR

Dado que uPAR carece de un dominio intracelular, se ha sugerido un adaptador trans-membranal para mediar los efectos de señalización de uPA/uPAR (Resnati, 1996). La mejor evidencia de la existencia de un adaptador es el descubrimiento de que las células que carecen de uPAR, una forma soluble modificada de uPAR puede actuar directamente como quimioatrayente. Se ha demostrado que una secuencia entre los dominios D1 y D2 de uPAR es responsable de esta actividad. De hecho, un péptido sintético correspondiente a esta región o el fragmento de uPAR que transporta este péptido en el término amino (denominado en lo sucesivo "D2D3_{88-278}") tiene una actividad quimiotáctica muy fuerte y reproduce los sucesos de señalización evocados por uPA (Blasi, 1997; Fazioli, 1997; Nguyen, 2000). La quimiotaxis inducida por uPA y D2D3_{88-279} en monocitos de sangre periférica, en células leucémicas precursores de mieloides THP-1, células de cáncer y células de la musculatura lisa es sensible a la toxina de la tos ferina e induce fosforilación de Hck y
MEK. Los últimos son necesarios para actividad (Degryse, 2001; Nguyen, 2000; Resnati, 1996; Webb et al., 2000).

uPA/uPAR y cáncer

Hace largo tiempo que se sabe que pro-uPA, uPA y uPAR están involucradas en la patogénesis y malignidad del cáncer, y este conocimiento está basado en: 1. uPA y uPAR se sobreexpresan casi constantemente en los cánceres humanos y cánceres modelo (revisado en Ossowski, 2000). 2. Varios enfoques han demostrado que la inhibición de la actividad de uPA o de la fijación de uPAR reduce la invasividad de las células tumorales en modelos murinos de cáncer in vivo, mientras que su sobreexpresión aumenta la misma considerablemente (Crowley, 1993; Min, 1996; Ossowski, 1991; Ossowski, 1988, Ossowski, 2000). 3. Niveles altos de pro-uPA o uPAR en tejidos, suero u orina son un marcador de pronóstico negativo importante en el cáncer humano (Sier, 1998; Sier, 1999; Stephens, 1999).

uPA/uPAR y enfermedades inflamatorias

Después de la estimulación celular, u-PAR es expresado por los monocitos circulantes, neutrófilos y linfocitos D, pero no por eritrocitos ni linfocitos B (Bianchi et al., 1996; Todd, 1985). Adicionalmente, u-PAR (CD87) es un gen diana en la activación de linfocitos y macrófagos (Cao et al., 1995; Nykjaer, 1994). De hecho, los monocitos y células semejantes a monocitos (como HL60, U937) expresan u-PAR, o son inducidos a sobreexpresar u-PAR por una diversidad de citoquinas y otros agentes, como el éster de forbol PMA, fitohemaglutinina, liposacárido bacteriano, TGF\beta1/vitamina D3, GM-CSF, IFN \alpha, TNF \alpha, etc. En los linfocitos T humanos, la estimulación del complejo TCR/CD3, el tratamiento con linfoquinas IL2, IL4, IL7 o la activación concomitante del receptor de las células T y la incorporación de integrinas, inducen todos ellos la expresión de u-PAR (Bianchi et al., 1996; Nykjaer, 1994). Es también digno de mención que u-PAR es expresado por linfocitos T infiltrantes de tumores y que la migración de linfocitos T activados a través de las membranas basales reconstituidas es dependiente, al menos en parte, de u-PA y uPAR (Bianchi et al., 1996). Teniendo en cuenta la importante contribución de las células estromáticas a la invasividad del cáncer, es también importante subrayar que en los tumores humanos una de las células que contribuye más que las otras a la producción global de u-PAR es el macrófago tumoral (Dano, 1994). Es muy importante que la expresión de uPAR está regulada en sentido ascendente por la infección de células con la espiroqueta Borrelia burgdorferi, el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, un patógeno que adquiere uPA en su superficie adquiriendo por tanto propiedades invasivas. Análogamente, la exposición de las células a Salmonella typhimurium y Streptococcus pyogenes da como resultado la regulación ascendente de uPAR (Coleman JL, 2001). La enfermedad de Lyme se caracteriza por manifestaciones inflamatorias en la piel, el corazón, el CNS y las articulaciones, dando como resultado el deterioro tisular debido a la infiltración de células inflamatorias, fundamentalmente monocitos/macrófagos. Es interesante que el hexapéptido lipidado OspA de B. burgdorferi, así como el liposacárido de S. typhimurium, y el ácido lipotecoico de S. pyogenes eran capaces de inducir la liberación de suPAR por las células humanas U937 (Coleman JL, 2001).

Hace largo tiempo que se sabe que uPA y uPAR están implicadas en la inflamación. En primer lugar, ambas moléculas están reguladas en sentido creciente por agentes inflamatorios, tales como el lipopolisacárido de endotoxina o IL1-\beta (Hasegawa, 1997). Además, uPA y uPAR activan reacciones inflamatorias típicas tales como la migración (Sitrin, 2000; Sitrin et al., 1999) y la liberación del anión superóxido (Cao et al., 1995) en los neutrófilos. Se ha demostrado aumento de uPA y uPAR en enfermedades con componentes inflamatorios importantes tales como la enfermedad de Crohn (Desreumaux, 1999), enfermedades inflamatorias de las articulaciones (Cerinic, 1998; Del Rosso, 1999), artritis reumatoide (Braat, y D.C., 2000; Slot, 2000; Slot, 1999) y la enfermedad de Lyme, Coleman JL, 2001). Además, se ha demostrado en modelos murinos que uPA y uPAR son componentes esenciales en la respuesta a Pneumocistis carinii (Beck, 1999), en modelos de artritis (Busso N, 1998), en varios aspectos vasculares de inflamación (Carmeliet P, 1997) y en la inflamación peritoneal (May et al., 1998). Finalmente, uPA/uPAR se expresan en la diferenciación de células dendríticas y están reguladas en sentido decreciente en las etapas finales de la diferenciación (Ferrero, 2000).

También en las células de cáncer, a pesar de que u-PAR se expresa a menudo en las células estromáticas, u-PA y u-PAR pueden influir en la migración de las células cancerosas. La "activación" de u-PAR en las células estromáticas puede atraer células de cáncer por una acción semejante a las quimioquinas. En este caso, u-PAR se comportaría como una quimioquina de la superficie celular. De hecho, las quimioquinas ancladas a una molécula de presentación presente en la matriz extracelular pueden atraer otras células que tengan receptores específicos (Premack, 1996). Dado que uPAR es en sí misma una proteína de membrana, puede no requerir una molécula de presentación.

Liberación de uPAR soluble en la circulación en enfermedades humanas

En la sangre se encuentran muchos receptores. U-PAR no es una excepción. Ha sido encontrada primeramente en la sangre y el fluido ascítico de pacientes con cáncer de ovario (Pedersen, 1993) y subsiguientemente en tejidos, sangre o incluso orina de muchos otros tipos de cáncer, incluso leucemias. En la mayoría de los casos, niveles elevados de su-PAR liberada pueden estar relacionados con mal pronóstico (Stephen, 1999). Asimismo, en otras enfermedades, el nivel de su-PAR está incrementado en los tejidos o la sangre: a saber, en la artritis reumatoide (Slot, 2000; Slot, 1999) y particularmente en el SIDA (véase más adelante). La liberación de uPAR soluble se observó también después de la infección de células con Borrelia burgdorferi, Salmonella typhimurium y Streptococcus pyogenes (Coleman JL, 2001).

uPA/uPAR y SIDA

Pruebas múltiples ligan tanto uPA como uPAR con el HIV y el SIDA. En primer lugar, la expresión de uPA y uPAR en los linfocitos T y monocitos es modulada por la infección de HIV (Speth, 1998) y uPAR es un antígeno de activación en las células T y está incrementado en los pacientes de SIDA (Nykjær, 1994). Finalmente, se ha demostrado que uPA puede escindir directamente el gp120 viral en el bucle V, importante para la infección viral (Handley, 1996).

Los autores de la presente invención han medido recientemente el nivel de uPAR soluble (suPAR) en la sangre de una cohorte extensa bien definida de individuos HIV-positivos seleccionados antes de la introducción de los regímenes terapéuticos anti-retrovirales altamente activos. En esta cohorte, se encontró que el nivel de suPAR es proporcional a la gravedad del estado de enfermedad (es decir, individuos sero-positivos, frente a inmuno-deficientes, frente a diagnosticados de SIDA) y era un indicador extremadamente significativo de pronóstico negativo (Sidenius, 2000). La significación de los niveles de suPAR respecto al pronóstico era independiente de, y tan indicativa como la disminución de los linfocitos T CD4^{+} o una viremia muy alta. Se encontró que un nivel bajo de suPAR era un marcador de pronóstico favorable incluso en pacientes con alta viremia y número bajo de células CD4^{+}. Inversamente, un nivel elevado de suPAR era un indicador negativo incluso en pacientes con células CD4^{+} relativamente altas y viremia baja. La significación estadística de estas correlaciones (Sidenius, 2000) sugiere que el sistema uPA/uPAR puede intervenir de algún modo en la patogénesis del SIDA.

Fragmentos de u-PAR y enfermedades humanas

Además de suPAR intacta (Sier, 1998), fragmentos de su-PAR se encuentran a menudo en tejidos y líneas de células de cáncer. Por su tamaño y por su reactividad con anticuerpos, estos fragmentos corresponden a grandes rasgos a un dominio D1 liberado o a un dominio D2-más-D3 liberado o fijado a las células (Hoyer-Hansen, 1997, Hoyer-Hansen, 1992; Mustjoki, 2000; Solberg, 1994). Además, estos fragmentos se encuentran también en el medio acondicionado de, por ejemplo, células U937 y su abundancia relativa respecto a su-PAR intacta parece estar controlada (Sidenius, 2000).

El descubrimiento de que dichos fragmentos de u-PAR que contienen en su término N o C el epítope mínimo SRSRY tienen actividad quimiotáctica fuerte (Blasi, 1997; Fazioli, 1997), demuestra que algunos de los fragmentos que se producen in vivo pueden de hecho ser moléculas u-PAR "activadas". Su producción en un tejido dado puede cambiar profundamente el potencial migratorio de las células presentes en dicho tejido. Por tanto, es muy importante identificar si tales fragmentos de u-PAR in vivo representan de hecho u-PAR "activada". Tales fragmentos se han encontrado en suero o en tejidos a niveles bajos en la orina de individuos normales (Sidenius, 2000) y a niveles elevados en enfermedades tales como leucemia (sangre) (Mustjoki, 2000) y cáncer (orina y tejidos, pero no en sangre) (Sidenius, 2001), y pueden encontrarse posiblemente en muchos otros. En individuos sanos, tales fragmentos no han sido encontrados nunca en la sangre, y están presentes en cantidades muy bajas en sus tejidos y orina. Sin embargo, la presencia del epítope quimiotáctico en estos fragmentos no puede ser evaluada excepto por métodos complejos que implican purificación y secuenciación de proteínas.

u-PAR es muy resistente a las proteasas con la excepción de la región enlazadora entre los dominios D1 y D2
(Behrendt, 1991). Esta región puede ser escindida in vitro por varias proteasas. La escisión en esta región da como resultado la producción de dos fragmentos desiguales de u-PAR, uno que contiene el dominio D1, y el otro el dominio D2-más-D3. La naturaleza de la proteasa de escisión determinará si el epítope quimiotáctico se conserva en los fragmentos de u-PAR y en qué proporción del mismo (Figura 1). Por ejemplo, la quimotripsina escinde entre los residuos 87 y 88, dejando un fragmento D2-más-D3 con el término amino SRSRYLEC. Esta u-PAR "activada", cuando se prepara de forma soluble, tiene una actividad quimiotáctica muy fuerte sobre varias células y líneas de células (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). Asimismo uPA propiamente dicha escinde uPAR, en el residuo 84, produciendo un fragmento D2-más-D3 con una secuencia amino-terminal AVTYSRSRYLEC (Hoyer-Hansen, 1997; Hoyer-Hansen, 1992). De nuevo, este fragmento está dotado de una actividad quimiotáctica muy fuerte. El péptido sintético AVTYSRSRYLEC tiene también una actividad quimioatrayente extremadamente fuerte, tal como péptidos más cortos que contienen todavía la secuencia SRSRY (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). Alternativamente, enzimas semejantes a plasmina pueden destruir probablemente el epítope dado que las mismas escinden en ambos residuos 90 y 92, dentro de la región SRSRY (Resnati et al., 1996).

El hecho de que se producen fragmentos de u-PAR in vivo, y que su nivel está incrementado en varias enfermedades, sugiere que los mismos pueden ser parte de la enfermedad propiamente dicha. Por tanto, será importante medir su nivel y su naturaleza molecular.

Objeto de la invención

En un primer aspecto, la presente invención concierne a un anticuerpo contra un fragmento de uPAR, en donde el fragmento de u-PAR se selecciona del grupo constituido por los péptidos 84-279, 85-279, 86-279 y 87-279, a los que se hace referencia como secuencia de aminoácidos de uPAR, caracterizado porque los anticuerpos

-

son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total y

-

no reconocen fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenidos por escisión con quimotripsina.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo contra un fragmento de uPAR, en donde el
fragmento de uPAR se selecciona del grupo constituido por los péptidos AVTYSRSRYLEC, VTYSRSRYLEC,
TYSRSRYLEC, YSRSRYLEC, caracterizado porque los anticuerpos

-

son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total y

-

no reconocen fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenidos por escisión con quimotripsina.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

\newpage

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica como agente de diagnóstico para pronosticar el curso de afecciones inflamatorias, enfermedades infecciosas y/o cáncer.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica como agente de diagnóstico para pronosticar el curso del cáncer.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a anticuerpos contra el receptor FPRL1/LXA4 para la fabricación de un medicamento para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos contra el receptor FPRL1/LXA4 para la fabricación de un medicamento para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la determinación de uPAR activada a partir de extractos de tejidos, fluidos biológicos, que comprende:

a)

preparar una muestra de tejido, extracto de tejido, fluidos biológicos;

b)

poner en contacto la muestra con uno de los anticuerpos de las reivindicaciones 1-3;

c)

determinar la fijación específica del anticuerpo.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de pro-uPA, un derivado o fragmento del mismo que retiene la fijación completa de uPAR, sin el dominio carboxil-terminal de uPA que lleva la actividad enzimática, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección de HIV.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para el escrutinio de compuestos útiles para el tratamiento de la infección por HIV, que comprende:

a)

seleccionar un compuesto capaz de modular la interacción pro-uPA/uPAR,

b)

poner en contacto dicho compuesto con un cultivo de células promonocíticas U1 en las cuales la producción de HIV se ha activado convenientemente,

c)

determinar cualesquiera variaciones de replicación del virus.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la determinación de uPAR activada a partir de tejidos, extractos de tejidos, fluidos biológicos, para el diagnóstico de la infección por HIV, que comprende:

a)

preparar una muestra de tejido, extractos de tejido, fluidos biológicos;

b)

poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo contra el péptido AVTYSRSRYLEC;

c)

determinar la fijación específica del anticuerpo.

Descripción de la invención 1. Pro-uPA y sus análogos/derivados inhiben la infección por HIV y la reactivación de HIV latente

La presente invención se refiere al efecto de pro-uPA sobre la reactivación de HIV-1 latente o sobre la infección y replicación de HIV-1 en células humanas. Las células U1 albergan un HIV-1 latente que puede ser reactivado por diversas citoquinas. En estas células, la forma de proenzima (pro-uPA) del activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) impide la reactivación de la replicación de HIV inducida por PMA o TNF-alfa, y actúa sinérgicamente con anticuerpos anti-TNF-alfa y con TGF-beta en el bloqueo total de esta reactivación. Adicionalmente, pro-uPA bloquea también la entrada/infección de HIV en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sin afectar a la proliferación celular. De acuerdo con estos resultados, se ha encontrado que los clones de células U937 que sustentan una proliferación rápida y eficiente de HIV después de la infección (clones "más") exhiben niveles altos de uPAR. Por el contrario, otros clones que exhiben una producción muy retardada e ineficiente de virus (clones "menos") exhiben un nivel muy bajo de uPAR. Pro-uPA puede utilizarse junto con otros fármacos para bloquear la infección por HIV o su propagación.

2. El receptor de siete dominios trans-membranales FPRL1/LXA4R media la actividad quimiotáctica de uPAR

Dado que uPAR carece de dominios trans-membranales, no puede transmitir directamente a la célula la señal emitida por la fijación de uPA. La sensibilidad a la toxina de la tos ferina indica que está implicado un receptor de siete dominios trans-membranales acoplado a la proteína G. Para identificar este adaptador, los autores de la invención han buscado una línea de células en la cual introducir cDNAs de adaptadores candidato y ensayar su respuesta a D2D3_{88-278} en la quimiotaxis. Una información útil estaba disponible en la bibliografía, que ha enfocado la atención de los inventores hacia los receptores para el péptido quimiotáctico bacteriano fMLP. De hecho, se ha informado que la quimiotaxis por fMLP requiere uPAR (Gyetko, 1994). La quimiotaxis por fMLP es inducida por dos receptores de siete dominios trans-membranales, uno de afinidad alta, FRP, y uno de afinidad baja, FPRL1 (Prosnitz, 1997) (Murphy, 1996). El receptor de afinidad baja FPRL1 se fija también específicamente a otros ligandos como la lipoxina A4 (y por ello es denominado también LXAR) (Gronert, 1998), amiloide A del suero (Su, 1999), la catelicidina LL-37 (Yang et al., 1999), y varios péptidos que incluyen algunos derivados de gp120 y gp41 de HIV (Chiang, 2000; Deng, 1999; Le, 1999). Es interesante que al parecer pueden ser activados múltiples caminos de señalización por FRPL1/LXA4R, dependiendo del ligando (Chiang, 2000).

Los inventores identifican aquí un receptor de siete dominios transmembranales acoplado a la proteína G, FPRL1/
LXA4R, como el mediador de la actividad quimiotáctica de uPAR. La inhibición de FPRL1/LXA4R reduce los efectos inflamatorios de uPA/uPAR. Por ello, FPRL1/LXA4R constituye una nueva diana para la terapia anti-inflamatoria. Dado de uPA/uPAR están implicados también en la migración de las células de cáncer, y por consiguiente en su invasividad y metástasis, FPRL1/LXA4R se convierte en una nueva diana para la terapia anti-metastásica. En todos estos casos, los inhibidores actuarían en un paso subsiguiente a la fijación de uPA a uPAR.

3. Los anticuerpos para el receptor FPRL1/LXA4R de siete dominios transmembranales acoplado a la proteína G inhiben la actividad quimiotáctica y promotora de la migración de uPA/uPAR

La presente invención contempla también la identificación de un primer inhibidor del mediador de membrana de la actividad promotora de la migración de uPA/uPAR, es decir de FPRL1/LXA4R. FPRL1/LXA4R puede fijar ligandos múltiples. Éstos incluyen los péptidos de formilo (a concentraciones altas), la lipoxina A4 y sus análogos, diversos péptidos de las proteínas gp120 y gp41 de HIV, y proteínas que funcionan sin embargo por regla general a concentraciones altas. Adicionalmente, este receptor fija también un anticuerpo específico generado contra el péptido ASWGGTPEERLK en el tercer dominio extracelular de FPRL1/LXA4R (Fiore, 1995).

Los anticuerpos para el receptor FPRL1/LXA4R bloquean específicamente la migración de los monocitos humanos recién aislados o de las células leucémicas THP-1 inducida por ATF/uPA-pro-uPA y mediada por la fijación de uPAR. Aquéllos inhiben también la actividad quimiotáctica del fragmento "activado" de uPAR, D2D3_{88-278}. Tales anticuerpos, en composiciones farmacéuticas adecuadas, pueden utilizarse específicamente para detener la migración celular en enfermedades hiper-inflamatorias como enfermedad de Crohn, choque séptico, artritis reumatoide, cáncer y SIDA.

4. Anticuerpos y ELISA para reconocer específicamente las formas escindidas, "activadas" de uPAR y para inhibir la migración inducida por uPA/uPAR

Los anticuerpos policlonales generados contra la secuencia quimiotácticamente activa AVTYSRSRYLEC reconocen específicamente las formas escindidas ("activadas") de u-PAR que contienen los residuos 84 y/o, 85 y/o 86, y/o 87 en el término amino. Se encontró que los anticuerpos generados por inyección del péptido AVTYSRSRYLEC en conejos son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total. Sin embargo, dichos anticuerpos identificaban formas escindidas de D2-más-D3 que contienen en sus términos N el AVTYSRSRYLEC, o VTYSRSRYLEC o
TYSRSRYLEC o YSRSRYLEC en el término amino. El antisuero no reconocía fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenido por escisión con quimotripsina. Se presenta también un ensayo ELISA capaz de cuantificar específicamente la concentración de D2-más-D3. Por esta razón, otros anticuerpos (tales como anticuerpos monoclonales) pueden generarse para identificar específicamente todos los fragmentos posibles de D2 más D3 relevantes para enfermedades humanas.

La presente invención proporciona un método para identificar y cuantificar la presencia de formas activadas de u-PAR, el receptor de u-PA, el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa. El método comprende la producción de anticuerpos que identifican específicamente la presencia en tejidos, en extractos, en fluidos biológicos de formas naturales o recombinantes de u-PAR que contienen en sus términos el péptido quimiotáctico de u-PAR. El método comprende también el establecimiento de un ELISA (Ensayo de Inmuno-Sorbente Unido a Enzima) para evaluar cuantitativamente en términos absolutos o de porcentaje la presencia de dichas formas de u-PAR. El uso de este método y estos reactivos es importante en una diversidad de enfermedades causadas por migración celular deficiente o excesiva, en las cuales se requiere la producción de formas activadas de u-PAR.

Descripcion de las figuras

Figura 1.- Un esquema de la estructura de uPAR. Ésta se compone de tres dominios, D1, D2 y D3. La región enlazadora entre el dominio D1 y D2 comienza en Gly83. UPA puede escindir entre los residuos Arg84 y Ala85, MMP-12 entre Thr86 y Tyr87, quimotripsina entre Tyr87 y Ser88 y plasmina entre Arg89 y Ser90. El dominio D3 está conectado a la superficie celular por un ancla gpI.

Figura 2.- Pro-uPA y ATF, pero no LMW uPA, inhiben la reactivación de HIV-1 inducida por PMA (10 nM) en células U1. SuPAR bloquea el efecto de Pro-uPA. Pro-uPA y otros efectores se añadieron en el tiempo cero.

Figura 3.- El efecto anti-HIV de pro-uPA es invertido por los anticuerpos R3, R4 y R5 en células U1. Los datos se presentan como valor medio y STD de muestras duplicadas recogidos para el pico de expresión de HIV (día 4), medido como actividad RT (cpm/\mul). a-TNP es un control de isotipo coincidente.

Figura 4.- Pro-uPA inhibe la reactivación de HIV-1 inducida por TNF-alfa (1 ng/ml) en células U1 (A). Pro-uPA y los anticuerpos anti-TNF-alfa (1 \mug/ml) (B), o pro-uPA (10 nM) y TGF-beta (5 ng/ml) (C) actúan sinérgicamente en la inhibición de la reactivación de HIV-1 inducida por PMA en células U1. Pro-uPA y todos los restantes efectores se añadieron en el tiempo cero.

Figura 5.- uPA no inhibe la reactivación de HIV-1 inducida por IL-6 en células U1. IL-6 se utilizó a 10 ng/ml.

Figura 6.- Pro-uPA tiene efectos diferentes sobre la replicación de HIV-1 de ... (A), ... (B) o ... (C) humanos. La actividad de transcriptasa inversa (RT, cpm/\mul) se midió cada 3-4 días durante un total de 20-25 días.

Figura 7.- Pro-uPA no tiene efecto alguno sobre la incorporación celular de timidina (expresada en % del control, es decir células que no recibieron pro-uPA). Los datos están separados para ... (A), ... (B) o ... (C).

Figura 8A.- La capacidad de HIV-1 para replicarse en clones diferentes de células U937 está correlacionada con el nivel de expresión de uPAR, como se mide por ELISA. Los clones "más" (+) son aquéllos que se replican muy eficiente y rápidamente (2-3 semanas). Los clones "menos" (-) se replican muy ineficiente y lentamente (6 a siete semanas). PMA, cuando se utilizó, fue a 10 nM.

Figura 8B.- Análisis por inmuno-transferencia de extractos de clones de células U937 sin tratar o tratadas con PMA (10 nM). cSB y c10 son clones "más" (replicación alta de HIV-1). c12 y c34 son clones "menos" (baja eficiencia de replicación).

Figura 9.- Identificación del adaptador de uPAR. A. Efecto del anticuerpo vs. péptido 3 (dilución 1 a 100) sobre la migración promovida por D2D3_{88-278} en células THP-1 humanas. B. Experimentos de desensibilización con fMLP. Los quimio-atrayentes se utilizaron a las concentraciones indicadas.

Figura 10.- D2D3 estimula la quimiotaxis de HEK223 únicamente cuando los mismos son transfectados con el cDNA de FPRL1/LXA4R. D2D3_{88-278} se obtuvo por escisión de suPAR de longitud total con quimotripsina, y purificación del fragmento.

Figura 11.- Análisis por inmuno-transferencia de uPAR murino. En macrófagos peritoneales de ratones de tipo salvaje (pista 1), uPAR está presente en la forma de longitud total (36 kD) y en la forma D2D3 escindida (26 kD). En ratones deficientes en uPA, pistas 2 y 3), la forma de 26 kD está ausente. La ausencia de bandas en los macrófagos de los ratones deficientes en uPAR (pistas 4 y 5) demuestra la especificidad de los anticuerpos.

Figura 12.- Esquema de activación de la migración a lo largo de uPA/uPAR. uPA se fija a uPAR y escinde la misma en la región del enlazador D1-D2. La uPAR "activada" fija luego el FPLR1/LXA4R que transduce intracelularmente su señal migratoria.

Figura 13.- La quimiotaxis inducida por D2D3 en los monocitos es bloqueada específicamente por anticuerpos que reconocen específicamente FPRL1/LXA4R. Los monocitos de sangre periférica humana no se estimularon, o se estimularon con D2D3_{88-278} a dos concentraciones o MCP-1 a 2 nM (véase esquema). no = sin anticuerpos. N.I. = suero no inmune. \alpha-FPRL1 = anticuerpos anti-FPRL1.

Figura 14.- Los anticuerpos anti-FPRL1/LXA4R inhiben específicamente la quimiotaxis inducida por ATF. El anticuerpo se diluyó en relación 1:20, pero actúa del mismo modo también a 1:100.

Figura 15.- Uso del anticuerpo anti-péptido 3 para identificar fragmentos de uPAR activados específicamente. Los fragmentos de suPAR humano de longitud total y D2D3 con términos amino diferentes se corrieron en SDS-PAGE, se sometieron a transferencia y se ensayaron con dos antisueros diferentes. D2D3(88) es el fragmento generado por escisión de suPAR con quimotripsina. D2D3(84)FLAG y D2D3(92)FLAG se han generado por tecnología de DNA recombinante y contienen también un epítope FLAG carboxi-terminal.

Figura 16.- Ensayo de Inmuno-Sorbente Unido a Enzima (ELISA) de fragmentos suPAR y D2D3 con términos amino diferentes. SuPARcutCT es una preparación de D2D3 obtenida por escisión de suPAR con quimotripsina y purificación (es decir el término en el residuo 89). SuPARcutMMP12 es un fragmento D2D3 obtenido por escisión con MMP-12 y purificación.

Ejemplo 1 Pro-uroquinasa (pro-uPA) y sus derivados uPA y ATF inhiben la replicación de HIV-1 en líneas de células monocitoides infectadas latentemente y en células de sangre humana infectadas recientemente

Las células infectadas con HIV latente proporcionan una población celular resistente a la terapia con anti-retrovirales y representan el mecanismo para la persistencia de HIV durante toda la vida (Finzi et al., 1989). La línea de células promonocíticas U937 es uno de los modelos más utilizados para estudios acerca de la infección por HIV in vitro. Dicha línea exhibe a la vez CD4 y CXCR4 y, por tanto, puede ser infectada por virus X4. A partir de esta línea de células se ha derivado la línea de células infectadas crónicamente designada "U1", que contienen dos copias de provirus integrados, y que se utiliza extensamente como modelo de latencia y reactivación virales (Folks et al., 1988). La línea de células promocíticas U1 es uno de los modelos más concienzudamente caracterizados de latencia post-integración. La misma se obtuvo de una población de células U937 que sobrevivieron al efecto citopático de infección aguda por HIV-1_{LAI/IIIB} (X4), y contiene dos copias de provirus integrados (Folks et al., 1987; Folks et al., 1988). En ausencia de estimulación, las células U1 expresan niveles bajos del transcrito de HIV-1 de 2 kb cortado y empalmado múltiples veces (Butera et al., 1994) que codifica las proteínas reguladoras Tat, Rev y Nef (Pomerantz et al., 1990). Varios estudios han demostrado posteriormente que el estado de latencia relativa en las células U1 es una consecuencia de la función deficiente de Tat (Cannon et al., 1994; Emiliani et al., 1996). Niveles altos de producción de virus pueden ser inducidos rápidamente por estimulación de las células U1 con citoquinas pro-inflamatorias, tales como el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha), IL-6, IL-1\beta (Vicenzi et al., 1997), por la activación de MAPK y estimulación consiguiente de AP-1 y NF-kB (Yang et al., 1999). Alternativamente, la reactivación de la replicación del virus puede conseguirse también por producción de factores solubles derivados del endotelio que incluyen MCP-1, TNF-\alpha e IL-6 (Borghi et al., 2000) y por agentes químicos tales como el acetato-miristato de forbol (PMA) (Folks et al., 1988). Además de los agentes inductores de HIV-1, se han consignado también agentes inhibidores. Éstos incluyen la proteína-quinasa p68 inducible por interferón y dependiente de RNA bicatenario, que inhibe la replicación de HIV inducida por TNF-\alpha (Muto et al., 1999), y TGF-\beta que inhibe la expresión de HIV inducida por PMA (Poli et al., 1991).

Se ha consignado anteriormente que diferentes clones de células U937, originados por dilución limitante, podrían dividirse en dos categorías distintas denominadas "Más" y "Menos", para describir su capacidad diferencial de sostener la infección productiva por HIV. La infección de los clones más muestra típicamente un pico de replicación del virus entre las semanas segunda y tercera, mientras que los clones menos están retardados sustancialmente (típicamente, el pico de replicación del virus se observa después de 6-9 semanas de infección) y a veces con niveles muy bajos de producción de virus (Franzoso et al., 1994). Los autores de la invención han medido los niveles de uPAR en los clones "más" y "menos" y han correlacionado estos valores con la capacidad para sostener la replicación viral. Los inventores han encontrado que los niveles bajos de uPAR están correlacionados con niveles altos de replicación viral.

Materiales y Métodos Reactivos

Los anticuerpos uPA, uPAR, suPAR, LMW-uPA, ATF, R2, R3, R4 y R5 han sido descritos detalladamente en la bibliografía (Blasi, 1994; Rønne, 1991). El miristato-acetato de forbol (PMA) (Sigma, Milán, Italia) se utilizó a 10^{-8}M, IL-6 recombinante, TGF-\beta, TNF-\alpha y el anticuerpo policlonal anti-TNF-\alpha e isotipo se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN) y se utilizaron a las concentraciones finales de 10, 5 y 1 ng/ml, y 1 \mug/ml respectivamente, como se ha consignado con anterioridad (Poli, 1990; Poli et al., 1990).

Proliferación celular

La proliferación celular se evaluó utilizando el ensayo de absorción de ^{3}H-timidina. Se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a 2 x 10^{4} células en 100 \mul de medio y se incubó durante 16 h a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Se cosecharon las células y se contaron en un contador \beta (TopCount, Packard, Downers Grove, IL).

Líneas de células

Se estimularon células U1 a la densidad de 2 x 10^{5} células por ml en RPMI 1640 (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkerville, MD) que contenía 10% de FCS. Se preincubaron las células con anticuerpos uPA, uPAR, suPA, R2, R3, R4 y R5 durante 20 min a 37ºC antes de la adición de estímulos. Se utilizó la línea de células U1 parental U937 como control en los experimentos de transfección. Las células U937 se adquirieron de ATCC y se mantuvieron en medio RPMI 1640 en presencia de FCS antes y después de la infección con el X4 HIV-1_{LAI/IIIB}. Para la infección, se sembraron las células a razón de 2 x 10^{5} células/ml en placas de 96 pocillos con fondo plano (Falcon, Becton-Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) y se infectaron con 1-2 x 10^{7} partículas de virus diluidas a partir de un stock de virus en forma de pelet (Advanced Biotecnology, Inc., Columbia, MD). Después de la infección, 2 h a 37ºC, las células se lavaron y resuspendieron en medio RPMI 1640.

La expresión viral se monitorizó por determinación de la actividad de transcriptasa inversa (RT) dependiente de Mg^{2+} en sobrenadantes de cultivo (Poli, 1990). En particular, se añadieron 5 microlitros de sobrenadantes a 25 microlitros de una mixtura que contenía poli(A), oligo(dT) (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), MgCl_{2}, y desoxitimidina-5'-trifosfato (dTTP) marcado con 32P (Amersham Corp., Arlington Heights, IL), y se incubaron durante 2 h a 37ºC. Se aplicaron por puntos 6 microlitros de la mezcla sobre papel DE81, se secaron al aire, se lavaron 5 veces en tampón 2x SSC, y dos veces más en etanol de 95%. El papel se secó luego y se sometió a recuento en un contador de centelleo (LS 5000, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA).

Virus

Se utilizaron dos cepas de HIV-1 R5 en este estudio, ADA y Bal. Ambos stocks de HIV-1 se prepararon en PBMC primarios, se filtraron los sobrenadantes, se dividieron en partes alícuotas de 0,2 \mum, y se guardaron a -80ºC.

Preparación de células primarias y condiciones de infección

Se obtuvieron de Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) PBMC de sangre extraída de donantes seronegativos, se resuspendieron en RPMI 1640 que contenía 10% de FCS y se dejaron activar por PHA (5 microgramos por ml) (Sigma, Milán, Italia) o IL-2 (20 unidades por ml) (Chiron, Emeryville, CA). Después de 3 días, las células se lavaron y resuspendieron en medio que contenía IL-2.

Células MDM: Se separaron PBMC en un gradiente isoosmótico Percoll (Amersham, Pharmacia). La pureza era consistentemente mayor que 90%, como se determinó por análisis FACS de la expresión de CD14. Los monocitos se sembraron en placas de plástico de 48 pocillos (Falcon, Becton Dickinson Labware) a un millón por ml en DMEM (BioWhittaker) complementado con 10% FCS (Hyclone) y 5% de suero humano agrupado, y se dejaron diferenciar durante 5-7 días. Los medios y los sueros se monitorizaron respecto a contenido bajo de endotoxina por el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (BioWhittaker).

Antes de la infección, se pretrataron las células con proUPA (a 37ºC y con 5% de CO_{2}) durante 10 minutos, a la concentración indicada. Las células primarias se infectaron con 0,1 MOI de una cepa R5 de HIV. Después de 2 horas de adsorción, a 37ºC y con 5% de CO_{2}, el virus se eliminó por lavado concienzudo y se añadió medio que contenía una nueva parte alícuota de proUPA. Se cambió el 50% del medio de cultivo cada 3 días y volvió a añadirse medio nuevo que contenía proUPA.

Medida del antígeno uPAR

Las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron 2 veces con PBS, y se lisaron en PBS que contenía 1% de Triton X-100. La concentración total de proteínas se determinó utilizando un kit (Dc Protein Assay, BIO-RAD) con BSA como estándar, y la concentración del antígeno uPAR por un kit comercial ELISA de uPAR (UR-1, Monozyme, Dinamarca).

Análisis Estadístico

Para todos los experimentos, se recogieron los sobrenadantes de cultivo cada día durante 5 días, en el caso de la línea de células, o cada 3 días para la infección de U937 y células primarias. Los reactivos se repusieron cada vez que se cambió el medio de cultivo. Se muestran los datos representativos de uno de tres experimentos independientes. Los resultados se presentan como valores medios de cultivos triplicados y la barra de error muestra la desviación estándar del valor medio.

Resultados a. pro-uPA y ATF inhiben la expresión de HIV-1 en células U1 estimuladas con PMA y TNF-alfa, pero no IL-6

Los autores han ensayado si pro-uPA interfiere con la inducción de HIV-1 por diversas citoquinas. Como se muestra en la Figura 2A, el tratamiento con pro-uPA causa una disminución de la replicación de HIV-1 inducida por PMA dependiente de la concentración como se mide por la actividad de RT. La inhibición no es completa, alcanzando aproximadamente 60% para 1-10 nM de pro-uPA. El efecto de pro-uPA es específico dado que puede ser bloqueado por un suPAR (uPAR soluble) recombinante que fija específicamente pro-uPA impidiendo su asociación al uPAR de la superficie celular (Figura 2D). El efecto de pro-uPA podría ser debido a su conversión en uPA y formación subsiguiente de plasmina por el plasminógeno del suero. Alternativamente, el mismo podría actuar por fijación a uPAR induciendo un camino de transducción de señales en competición con PMA. La inhibición del efecto de pro-uPA por suPAR sugiere la última posibilidad, actuando suPAR como un agente de barrido de pro-uPA, dado que el complejo pro-uPA-suPAR es todavía enzimáticamente activo aunque incapaz de fijar uPAR de la superficie celular. Para confirmar esta posibilidad, se ensayaron tanto LMW-uPA como ATF. LMW-uPA es el dominio carboxil-terminal de uPA con actividad enzimática total y sin afinidad alguna de fijación de receptores. ATF es el fragmento amino-terminal de uPA con actividad plena de fijación de receptores y sin actividad enzimática alguna (Stoppelli, 1985). Como se muestra en la Figura 2B, LMW-uPA no inhibe la expresión de HIV-1 inducida por PMA. Por otra parte, ATF reproduce totalmente el efecto de pro-uPA (Figura 2C). Globalmente estos datos sugieren que la inhibición por pro-uPA de la expresión de HIV-1 inducida por PMA requiere una interacción entre pro-uPA y su receptor de la superficie celular, uPAR. De acuerdo con esta posibilidad, los anticuerpos anti-uPAR (R3, R5) que impiden la interacción pro-uPA/uPAR, inhiben también el efecto de pro-uPA (Figura 3). Por el contrario, el anticuerpo R4, que no interfiere con la fijación de pro-uPA, no tiene efecto alguno. Por esta razón, se llegó a la conclusión de que la inhibición de la replicación de HIV-1 por pro-uPA requiere una interacción con uPAR.

Niveles altos de producción de virus pueden obtenerse también en células U1 por estimulación con las citoquinas pro-inflamatorias TNF-alfa e IL-6. Estos agentes activan la expresión de HIV-1 por activación de la transcripción por mecanismos dependientes de NF-kB (TNF-alfa) o posteriores a la transcripción (IL-6) (Duh et al., 1989; Osborn et al., 1989; Poli et al., 1990). UPA (y pro-uPA) es capaz también de inhibir la replicación de HIV inducida por TNF-alfa (Figura 4A). Dado que el efecto de PMA sobre la replicación de HIV-1 depende en parte de la inducción de la secreción de TNF-alfa, y por consiguiente es parcialmente inhibido por un anticuerpo anti-TNF-alfa (Poli et al., 1990), podría esperarse que la combinación del anticuerpo anti-TNF-alfa con pro-uPA sea un inhibidor más potente de la replicación/expresión de HIV-1 inducida por PMA. Como se muestra en la Figura 4B, mientras que anti-TNF-alfa y pro-uPA inhiben individualmente la replicación de HIV-1 aproximadamente en un 70%, alcanzan juntos un efecto mayor inhibiendo más del 90%. Este resultado sugiere que pro-uPA y TNF-alfa actúan por un camino de señalización paralelo.

TGF-beta inhibe también la replicación/expresión de HIV-1 inducida por PMA (Poli et al., 1991) de una manera independiente de NF-kB. Como se muestra en la Figura 4C, la adición de la combinación de TGF-\beta y pro-uPA da como resultado un efecto inhibidor aditivo, aproximadamente 90% de inhibición con respecto al 60% obtenido con un solo reactivo. Estos resultados indican por tanto fuertemente que pro-uPA interfiere con un paso de señalización diferente de los activados por TGF-\beta o TNF-\alpha e indican que estos pasos están activados.

Al contrario de lo que ocurre en el caso de PMA y TNF-\alpha, pro-uPA no tiene efecto alguno sobre la replicación de HIV dependiente de IL-6 en células U1 (Figura 5). Globalmente, los resultados obtenidos con diferentes citoquinas sugieren que pro-uPA actúa por interferir con un camino de señalización específico que puede conducir a la inhibición de la expresión del virus.

b. Las células U1 expresan uPAR de la superficie celular y difunden el mismo al medio acondicionado

Dado que la inhibición por pro-uPa de la replicación de HIV-1 requiere una interacción con uPAR, se ha ensayado si las células U1 expresan uPAR. El ensayo se realizó por un análisis de inmuno-transferencia de lisados de células U1, demostrando la presencia de una banda específica que reacciona con los anticuerpos monoclonales anti-uPAR. Un análisis similar del medio acondicionado muestra la presencia de uPAR en células U1 tanto sin tratar como tratadas con PMA, en las cuales está incrementado uPAR. La medida de la cantidad de uPAR por ELISA dio esencialmente los mismos resultados (datos no presentados). Estos datos están de acuerdo con informes anteriores que demuestran que PMA puede inducir uPAR en células U937 (Picone, 1989).

c. Pro-uPA afecta a la replicación de HIV-1 en células primarias

Cuando se ensayó en células monocíticas de sangre periférica humana (PBMC), se encontró que pro-uPA afecta también a la replicación de HIV. Sin embargo, se demostró cualitativamente que el efecto de pro-uPA es dependiente de su concentración y de la naturaleza de las células. De hecho, en los PBMC estimulados por PHA y PBMC estimulados por IL-2 se encontró un efecto nulo de pro-uPA a 1 nM y una fuerte inhibición del crecimiento de virus a 10 nM (Figura 6A y B). Con macrófagos derivados de monocitos, por otra parte, concentraciones bajas de pro-uPA (10 nM) estimulaban la expresión del virus mientras que concentraciones mayores la inhibían (Figura 6C). Pro-uPA no era tóxico para las células: a 10 nM, pro-uPA no mostraba esencialmente efecto alguno sobre la proliferación celular tal como se mide por la absorción de ^{3}H-timidina en PBMC estimulados por PHA no infectados, PBMC estimulados por PHA infectados con virus ni en PBMC en reposo no infectados (Figura 7A, B, C).

d. Correlación entre la replicación viral y el nivel de expresión de uPAR

Se compararon los niveles de uPAR en diversos clones de células U937 que se distinguían por su eficiencia alta (clones "más") o baja (clones "menos") en cuanto a soportar la replicación de HIV. La Figura 8A muestra una correlación entre la capacidad de HIV para replicarse y los niveles de uPAR medidos por un ELISA. Los clones de células U937 no estimulados capaces de sostener la infección productiva de HIV (clones "más": cSB y c10) expresaban alrededor de 10 veces menos uPAR que lo hacían los clones de U937 que exhibían infección productiva retardada y/o reducida de HIV (clones "menos": c12 y c34). Esta diferencia era aún mayor (aproximadamente 30 veces) cuando las células se estimularon durante 24 horas con PMA, dado que los clones "más" eran incapaces de regular uPAR en sentido creciente. La figura 8B muestra en enfoque adicional para comparar los niveles de uPAR en los clones menos y más, realizado por inmunotransferencia de cantidades iguales de proteínas procedentes de lisados de dos clones cada una. Ese ejemplo demuestra claramente que la infección productiva de HIV por las células U937 está en correlación inversa con el nivel de expresión de uPAR. De hecho, los clones de células capaces de sostener una eficiencia elevada de replicación viral tienen un nivel muy bajo de uPAR, e incluso no aumentan la expresión de uPAR en condiciones (tratamiento
con PMA) en las cuales uPAR es inducido normalmente varias veces en la misma línea de células (Picone, 1989).

Ejemplo 2 La quimiotaxis inducida por uPA y fragmentos de uPAR "activados" es mediada por el receptor de quimioquinas FPRL1/LXA4R

uPA y uPAR inducen y son necesarios para la quimiotaxis de los monocitos, células leucémicas THP-1 y varias otras células. El derivado de uPA, ATF (fragmento amino-terminal), o la pro-enzima pro-uPA tienen el mismo efecto. Adicionalmente, las formas activadas de uPAR (escindida después del residuo 84) activan también la quimiotaxis. Para todos estos estimulantes, y en todas las células ensayadas, el mecanismo sigue siendo el mismo (Degryse, 1999; Degryse, 2001; Fazioli, 1994; Resnati, 1996). En particular, estos agentes se basan eventualmente en la activación de un mediador trans-membranal. Después de fijación a uPAR, uPA escinde uPAR o modifica su conformación ("activación") haciendo que el mismo se escinda entre los dominios D1 y D2. Los datos muestran que la uPAR así-"activada" tiene que interaccionar con un mediador trans-membranal que transduce a su vez las señales migratorias de pro-uPA/uPAR (Fazioli, 1994) (Blasi, 1997). Esto es debido al hecho de que uPAR está presente en la superficie exterior de la célula y carece de una porción intracelular.

La quimiotaxis por uPA y derivados o por moléculas uPAR activadas (y el camino de señalización activado por ellos) es inhibida por la toxina de la tos ferina (Degryse, 1999; Degryse, 2001; Fazioli, 1994; Resnati, 1996). Ésta es una propiedad de los receptores acoplados a proteínas G, una familia de proteínas que incluyen receptores quimiotácticos como receptores de quimioquinas. La sensibilidad a la toxina de la tos ferina sugiere por tanto que el mediador trans-membranal (adaptador) de la quimiotaxis uPA/uPAR podría ser un receptor acoplado a proteínas G.

Materiales y Métodos Materiales

Los anticuerpos policlonales de conejo específicos para uPAR de ratón eran un obsequio generoso del Dr. Gunilla Hoyer-Hansen y Prof. Keld Dano. La fuente de agentes quimioatrayentes ha sido descrita anteriormente (Blasi, 1997; Fazioli, 1997; Resnati, 1996).

El antisuero del péptido 3 (AVTYSRSRYLEC) (Blasi, 1997) se preparó por síntesis química, acoplamiento a hemocianina de lapa bocallave (KLH), e inyección en conejos utilizando métodos estándar. Las inmunoglobulinas específicas del péptido 3 se purificaron por cromatografía de afinidad en columnas de péptido 3-Sepharose, por métodos estándar.

Células

Las células THP-1 utilizadas en el presente ejemplo han sido descritas previamente (Resnati, 1996). Las células HEK293 humanas fueron donadas amablemente por el Dr. Hal Chapman y el HEK293/FPRL1 humano por el Dr. J.M. Wang. Las células HEK293 no expresan uPA, pro-uPA o uPAR. Las mismas no expresan tampoco receptores fMLP, en particular FPRL1. Las células HEK293/FPRL1 han sido generadas por transfección de cDNA de FPRL1 en células HEK293 (Murphy, 1996).

Quimiotaxis

Los ensayos de quimiotaxis se realizaron como se ha descrito (Degryse, 1999), con cámaras Boyden modificadas utilizando filtros (tamaño de poro 5 \mum), Corning) tratados con colágeno I (100 \mug/ml) y fibronectina (10 \mug/ml, Boehringer-Mannheim). Se añadieron al pocillo superior 20.000-40.000 células en DMEM exento de suero, mientras que se añadieron los quimioatrayentes al pocillo inferior. En caso de estar presentes, los anticuerpos o moléculas desensibilizadoras se pre-incubaron con las células durante 1 hora y se añadieron luego a ambos pocillos de las cámaras Boyden durante el ensayo de quimiotaxis. La migración se mantuvo durante 60-120 en el caso de las células THP-1 y 4-6 horas para las células HEK293 o HEK293/FPRL1. Después de migración a 37ºC, las células que quedaban en la superficie superior de los filtros se separaron por rascado, se fijaron los filtros en metanol y se tiñeron en una solución de 10% (p/v) de violeta cristal en metanol al 20% (v/v). Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados presentados representan el valor medio \pm SD del número de células contado en 10 campos de alta potencia por filtro y son representativos de al menos 3 experimentos. La migración aleatoria de las células, es decir la migración en ausencia de quimioatrayente, recibió el valor arbitrario de 100%.

Citofluorimetría

Para ensayar la presencia de diversos marcadores de superficie en diferentes células, se ha empleado citofluorimetría. Los anticuerpos que reconocían específicamente los monocitos estaban dirigidos contra CD14 (Pharmigen, CA, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal R2 se utilizó para uPAR (Rønne, 1991) y el anticuerpo anti-FPRL1 (Fiore, 1995) se obtuvo del Dr. Mario Romano.

Aislamiento de macrófagos peritoneales de ratón

Se aislaron macrófagos murinos por lavados repetidos de la cavidad peritoneal de ratones sacrificados por eutanasia, con medio esencial mínimo Dulbecco (DMEM) complementado con 5% de FBS. Para aumentar la eficiencia de la recuperación, los ratones se inyectaron con 1 ml de Tioglicolato al 3%, y se recogieron los macrófagos 3-5 días después. La pureza de la preparación se determinó por análisis mediante citometría de flujo con anticuerpos monoclonales anti-MAC-1.

Análisis por inmunotransferencia

Los extractos de células totales en PBS 1%-Triton X-100 se incubaron a 95ºC durante 3 min en SDS al 0,5% y DTT 2 mM en un volumen final de 10 \mul. Las proteínas se desglicosilaron (Behrendt, 1991; Sidenius, 2001) por adición de tampón de desglicosilación (PBS que contenía 0,5% de Triton X-100 y EDTA 15 mM), 1 unidad de péptido-N-glicosidasa F (PMGasa-F) e incubación a 37ºC durante una noche. Para la transferencia Western, las muestras se corrieron sobre geles SDS-PAGE al 12% en condiciones reductoras, se transfirieron a una membrana de PVDF y se hicieron reaccionar con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante. La tinción positiva se reveló con Super Signal West Dura Extended Duration Substrate, de Pierce Chem. Co. El anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la uPAR murina se utilizó a 1 \mug/ml para el análisis de transferencia Western.

Resultados 4. El epítope quimiotáctico de uPAR es esencial para promover la quimiotaxis de THP-1

Con objeto de ensayar si la quimiotaxis por uPA/ATF/pro-uPA y por uPAR "activada" depende realmente del epítope quimiotáctico identificado en la región enlazadora entre los dominios D1 y D2 (Blasi, 1997; Fazioli, 1994), se ha generado un anticuerpo para el péptido sintético AVTYSRSRYLEC, y se ha ensayado la IgG específica del péptido en experimentos de quimiotaxis con células THP-1. Como se muestra en la Figura 9A, ATF inducía quimiotaxis en las células THP-1 en presencia de anticuerpos irrelevantes. Sin embargo, el efecto se reducía acusadamente en presencia de 10 \mug/ml de IgG anti-péptido 3. este experimento demuestra que un reactivo que interfiere específicamente con el epítope quimiotáctico de uPAR puede inhibir la migración de las células dependiente de uPA-uPAR, aun cuando el mismo no impide la fijación de uPA a uPAR.

5. Experimentos de desensibilización

Los quimioatrayentes pueden desensibilizarse unos a otros por ocupación del sitio de fijación de un receptor acoplado a proteínas G. Alternativamente, aquéllos actúan también indirectamente por inducir la fosforilación de otros receptores. Para identificar el adaptador transmembranal que media en la quimiotaxis uPA/uPAR, los autores de la invención han aprovechado la propiedad de desensibilización y han buscado un quimioatrayente capaz de desensibilizar los monocitos celulares o las células THP-1 de uPA.

Para inducir la quimiotaxis de una manera dependiente de uPA/uPAR, se ha empleado en este ejemplo D2D3_{88-279}, una forma de uPAR purificada, soluble y escindida por quimotripsina, dotada de potente actividad quimiotáctica (Resnati, 1996). Como quimioquina desensibilizadora, se ha utilizado el péptido fMLP bacteriano formilado (formil-metionil-leucil-fenilalanina). Como se muestra en la Figura 9B, fMLP desensibiliza las células THP-1 de D2D3_{888-279} inhibiendo la quimiotaxis en un 50% a alrededor de 10-20 \muM. Sin embargo, la desensibilización es específica para D2D3_{88-279}, dado que fMLP no afectaba a la quimiotaxis de MCP-1 excepto marginalmente a concentraciones muy altas (200 \muM).

La quimioquina fMLP activa la quimiotaxis por dos receptores diferentes: un receptor de baja afinidad, FPRL1 (denominado también LXA4R), y un receptor de afinidad alta, FPR. Dado que fMLP desensibilizaba contra D2D3_{88-279} y ATF a 20 \muM, el receptor implicado en la desensibilización de la quimiotaxis por D2D3_{88-279} debe ser FPRL1/LXAR4R y no FPR.

6. La transfección del cDNA de FPRL1 en células que no responden a D2D3_{88-279} confiere sensibilidad a D2D3_{88-279}

Con objeto de demostrar positivamente que cualquier molécula dada media la señalización por uPA/uPAR, sería ventajoso disponer de una línea de células que no exprese uPA, uPAR ni el mediador propiamente dicho, y que por consiguiente no responda a los estímulos quimiotácticos de cualquiera de uPA/pro-uPA/ATF o de uPAR activada. Se encontró que las células HEK293 no expresan uPA ni uPAR, y no responden a uPA/ATF ni a D2D3_{88-279} (Figura 10). Por esta razón, se ha comparado el efecto de D2D3_{88-279} sobre las células HEK293 vs. células HEK293 transfectadas con FPRL1/LXA4R. Como se muestra en la Figura 10, HEK293 no responden a D2D3_{88-279} en la quimiotaxis. Sin embargo, las células HEK293 transfectadas con FPRL1/LXA4R responden bien, con un máximo a aproximadamente 0,1 nM de D2D3_{88-279}. Este resultado indica que la transfección de las células HEK293 con el cDNA de FPRL1 es suficiente para conferir la sensibilidad a uPAR.

7. Los macrófagos de ratón que carecen del gen uPA no escinden uPAR

Los ratones que son genéticamente deficientes en uPA son también inmuno-deficientes debido a que sus macrófagos y linfocitos T son incapaces de migrar a los sitios de infección (Gyetko, 1996). El mismo efecto se observa en los ratones deficientes en uPAR (Gyetko, 2000). La deficiencia en migración de los ratones carentes de uPA podía ser debida a la incapacidad de las células de estos ratones para escindir (activar) la uPAR de la superficie, debido a la falta de uPA. Si fuera éste el caso, podría esperarse que se encontrara uPAR intacta en las células de un ratón con uPA fuera de combate (k.o.). La figura 11 muestra un análisis por SDS-PAGE y por inmuno-transferencia con anticuerpos policlonales específicos de conejo dirigidos hacia uPAR murino, en el cual se comparan lisados (por duplicado) de macrófagos peritoneales suscitados por tioglicolato de tipo salvaje (wt), uPA^{-/-} y uPAR^{-/-}. Los extractos se desglicosilaron primeramente y se corrieron subsiguientemente sobre SDS-PAGE, se transfirieron a filtros de PVDF y se enfrentaron a los anticuerpos uPAR anti-ratón. Como se muestra en la Figura 11, el extracto de macrófagos peritoneales de ratones de tipo salvaje (wt) (pista 1) muestra dos bandas específicas, de 35 y 25 kD respectivamente, cuando se transfieren con el anticuerpo uPAR anti-ratón. Éstas corresponden a los pesos moleculares esperados para uPAR humano de longitud total y D2D3 (Behrendt, 1991; Sidenius, 2000), y por consiguiente es probable que correspondan a la misma especie en ratón (pistas 2,3). Por el contrario, los extractos de macrófagos uPA^{-/-} exhiben únicamente la banda superior, es decir uPAR de longitud total. La ausencia de las bandas en extractos de macrófagos uPAR^{-/-} (pistas 4,5) demuestra la especificidad de los anticuerpos. Los datos muestran por tanto que un fragmento correspondiente al tamaño de un D2D3_{84-278} no se acumula en los ratones uPA^{-/-}, y por tanto que la distinción entre los dominios D1 y D2 no puede ocurrir en los ratones uPA^{-/-}. La movilidad de este fragmento es idéntica a la observada en las células humanas, y que ha sido identificada como D2D3_{84-278} por secuenciación de aminoácidos (Hoyer-Hansen, 1992; Solberg, 1994). Este resultado está en correlación con la migración celular deficiente en ratones uPA^{-/-} (Gyetko, 1996) y por consiguiente está de acuerdo con la hipótesis de que se requiere la escisión de uPAR in vivo para la migración celular. Los datos indican también que uPA escinde directamente uPAR. Sin embargo, es todavía posible que la escisión sea debida a una proteasa diferente que requiere no obstante uPA para activación. De hecho, la activación de MMP-2 y MMP-9 es deficiente en los ratones uPA^{-/-} (Carmeliet, 1997). Por esta razón, los autores de la invención sugieren la hipótesis de que la migración de los linfocitos T y monocitos/macrófagos a los sitios de infección requiere la escisión de uPAR por uPA, y que la uPAR activada se fija a su vez y estimula el receptor quimiotáctico FPRL1-LXA4R. Un esquema que recapitula el mecanismo se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 3 Inhibición de la quimiotaxis uPA/ATF/uPAR por reactivos anti-FPRL1/LXA4R

La respuesta específica de células que contienen FPRL1/LXA4R a D2D3_{84-278} (Figura 10) sugiere claramente que el receptor FPRL1/LXA4R acoplado a proteína G es el mediador de la quimiotaxis inducida por uPA y uPAR "activada". Para sustanciar esta hipótesis, se han utilizado células que contienen varios receptores de quimioquinas, con inclusión de FPRL1/LXA4R, y han ensayado si anticuerpos específicos para FPRL1/LXA4R inhiben la quimiotaxis inducida por ATF o D2D3_{84-278}.

Materiales y Métodos Materiales

Los anticuerpos anti-LXA4R/FPRL1 (Fiore, 1995) fueron una donación generosa del Dr. Mario Romano (Chieti, Italia) y Clarles Serhan (Boston, Mass., EE.UU.).

Células

Las células THP-1 han sido descritas anteriormente (Resnati, 1996). Se obtuvieron monocitos por dos tandas de centrifugación sobre gradientes de Ficoll (1,077 g/l) y Percoll (Pharmacia Biotech.) de sangre periférica de individuos voluntarios sanos. Resumidamente, se diluyó sangre heparinizada en relación 1:1 con PBS y se estratificaron 3 ml de Ficoll-Hipaque bajo 10 ml de mezcla sangre/PBS. Después de centrifugación, se recuperó la capa de células mononucleares, se lavaron las células para eliminar cualquier cantidad de Ficoll contaminante, y se purificaron los monocitos por gradientes Percoll. La pureza de las poblaciones separadas se determinó por análisis mediante citometría de flujo con anticuerpos monoclonales anti-CD14.

Resultados

Los monocitos de sangre periférica humana (PBM) y la línea de células leucémicas monocíticas THP-1 expresan varios receptores de quimioquinas que incluyen los receptores de fMLP FPR y FPRL1, pero responden también a D2D3_{88-279} en la quimiotaxis. Las células PBM y THP-1 expresan también varios otros receptores de quimioquinas, que incluyen receptores que responden a la proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1), un receptor distinto del de otras quimioquinas, como FMLP (resultados no presentados dado que reproducen datos existentes en la bibliografía). La citofluorimetría muestra que las células empleadas expresan de hecho uPAR y FPRL1 (no representado).

Como se muestra en la Figura 13, tanto MCP-1 como D2D3_{88-279} inducen la quimiotaxis de los monocitos humanos recientes. La actividad de D2D3_{88-279} es bloqueada específicamente por el anticuerpo anti-SPRLL1/LXA4R; sin embargo, el anticuerpo no tiene efecto alguno sobre MCP-1. Así pues, el receptor FPRL1 es necesario para mediar la quimiotaxis dependiente de uPAR.

Como se muestra en la Figura 14, el resto amino-terminal de uPA, ATF, así como MMCP-1 inducen la quimiotaxis en las células THP-1, como ha sido consignado previamente (Resnati, 1996). También en este caso, el anticuerpo FPRL1/LXA4R bloqueaba específicamente la quimiotaxis de ATF, mientras que no tenía efecto alguno sobre la quimiotaxis de MCP-1.

Ejemplo 4 Anticuerpos específicos para detectar y cuantificar fragmentos de uPAR "activadas"

El fragmento quimiotáctico D2D3_{88-279} de uPAR es generado in vitro por escisión con quimotripsina de una forma soluble de uPAR (Fazioli, 1997) (véase Figura 1). Una forma de uPAR que contiene los dominios D2 y D3 y que comienza en el residuo 84 ha sido identificada in vivo: in vitro, uPA propiamente dicho a concentraciones fisiológicas escinde suPAR y uPAR de la superficie celular en el residuo 84 (Hoyer-Hansen, 1997; Hoyer-Hansen, 1992; Sidenius, 2000). Adicionalmente, el péptido sintético uPAR con la actividad quimiotáctica máxima abarca los residuos 84-97 (Fazioli, 1997). Es posible por tanto que la activación de uPAR en los tejidos sea debida a la escisión por uPA. Finalmente, el fallo de los ratones deficientes en uPA para escindir uPAR (véase la Figura 11) sugiere que el fenotipo deficiente en migración es debido a la falta de escisión.

\newpage

Dado que la escisión de uPAR puede "activar" uPAR confiriendo un fenotipo promotor de la migración, la escisión de uPAR debe conferir por tanto un fenotipo "inflamatorio" a las células. Sin embargo, la escisión en la región enlazadora entre los dominios D1 y D2 tendría efectos muy diferentes dependiendo del punto en que ocurra la escisión. Por ejemplo, la escisión entre los residuos 84 y 89 generaría una uPAR "activada", mientras que la escisión entre el residuo 89 y el 93 destruiría la actividad. Esto está basado en el descubrimiento de que si bien los péptidos AVTYSRSRYLEC y SRSRY son activos en la promoción de la quimiotaxis, la escisión del péptido AVTYSRSRYLEC con plasmina (que escinde inmediatamente después de los dos residuos arginina) destruía la actividad (datos no presentados). Evidentemente, la detección de la presencia de uPAR "activada" y su medida cuantitativa (en sangre, orina, células o fragmentos de tejido) con un ensayo simple podría ser útil en la evaluación del estado inflamatorio de un individuo. Sin embargo, los métodos actuales no permiten una evaluación fácil del punto en que se escinde uPAR, dado que requieren purificación y secuenciación de proteínas.

Los anticuerpos, sin embargo, pueden discriminar entre secuencias de aminoácidos muy similares o incluso secuencias que difieren en un solo residuo. Por esta razón, los autores de la invención han investigado en busca de anticuerpos específicos para fragmentos de uPAR "activadas".

Materiales y métodos Preparación de antisuero del péptido 3

Se sintetizó el péptido 3 (AVTYSRSRYLEC) (Blasi, 1997), se acopló a hemocianina de lapa bocallave (KLH), y se generó un antisuero de conejo por métodos estándar. Las inmunoglobulinas específicas del péptido 3 se purificaron por cromatografía de afinidad en columnas de péptido 3-Sepharose, por métodos estándar.

Expresión y purificación de uPAR y fragmentos uPAR recombinantes

Se expresó uPAR soluble de longitud total (suPAR) en células CHO transfectadas establemente con un cDNA que codificaba los aminoácidos 1-278 de uPAR humana madura y se purificó por cromatografía de afinidad en una columna con anticuerpo monoclonal R2 inmovilizado sobre Sepharose activada con CNBr (Pharmacia) como ha sido descrito (Blasi, 1997; Fazioli, 1997). Los autores de la invención han empleado también fragmentos recombinantes similares que contienen en su término carboxi el epítope FLAG (Prickett, 1989). Se prepararon D2D3_{88-278} y D2D3_{87-278} por hidrólisis de suPAR de longitud total con quimotripsina y MMP-12, respectivamente, seguido por purificación del resto D2D3 en la misma columna que se ha descrito arriba. Las proteínas recombinantes D2D3_{84-278/FLAG} y D2D3_{92-278/FLAG} se purificaron del medio acondicionado de células COS7 transfectadas transitoriamente y se purificaron en una columna de afinidad M2 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Ensayos de transferencia Western

10 ng de proteínas suPAR, D2D3_{88-278}, D2D3_{84-278/FLAG} y D2D3_{92-278/FLAG} purificadas se desnaturalizaron en condiciones ligeramente reductoras y se desglicosilaron enzimáticamente utilizando PNGasa F (Boehringer) como se ha descrito en otro lugar (Dano, 1990). Las proteínas desglicosiladas se separaron por SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a membranas de PVDF utilizando electro-transferencia semi-seca. Después de bloqueo en leche seca desnatada al 5%, se incubaron las transferencias con 0,5 \mug/ml de un anticuerpo policlonal anti-uPAR que reconocía todas las formas conocidas de uPAR o con una dilución 1:2000 del suero anti-Pep3. Las transferencias se lavaron, se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000, Amersham) se lavaron, y se revelaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (SuperSignal Dura, Pierce).

Ensayo ELISA

Se recubrieron ON placas NUNC maxisorb de 96 pocillos ON con 1 \mug/ml de anticuerpo R2 diluido en tampón de recubrimiento (NaHPO_{4} 0,1M, pH 9,6). Se lavaron las placas tres veces con PBS-T (PBS que contenía 0,1% de Tween 20) y se bloquearon durante 1 hora a 37ºC con 2% de BSA en PBS. Los pocillos separados se incubaron con el suPAR recombinante purificado y fragmentos D2D3 generados por escisión con quimotripsina o MMP-12, y se diluyeron a 10 ng/ml en tampón de dilución (PBS que contenía 1% de BSA). Después de incubación a 37ºC durante 1 hora, se lavaron las placas y se incubaron durante 1 hora a 37ºC con un anticuerpo policlonal anti-uPAR que reconocía todas las formas de uPAR o el anticuerpo anti-péptido 3 purificado por afinidad, diluidos ambos a 1 \mug/ml en tampón de dilución. Después de lavado adicional, se sondaron las placas durante 1 hora a 37ºC con anticuerpo anti-conejo de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (1:1000, Sigma), se lavaron y se revelaron con un sustrato cromógeno de fosfatasa alcalina (pNPP, Sigma) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se determinó la fijación específica por sustracción de la absorbancia observada en los pocillos que no recibieron suPAR o fragmentos de suPAR. Los datos se presentan como el valor medio (\pm SD) de una determinación duplicada.

Resultados

Para determinar la especificidad del anticuerpo Péptido 3, se realizaron experimentos de transferencia Western sobre fragmentos suPAR y D2D3 que llevaban partes diferentes bien definidas de la región enlazadora de uPAR. Cuando las transferencias se sondaron con el anticuerpo anti-Péptido 3, se reconocía eficientemente la proteína D2D3_{84-278/FLAG}, pero no las proteínas suPAR, D2D3_{88/278}, o D2D3_{92/278/FLAG} (Figura 15, panel izquierdo). Esto no estaba causado por carga diferente de las proteínas en el gel, dado que todas las proteínas recombinantes eran igualmente bien reconocidas por un anticuerpo policlonal dirigido contra suPAR intacta (Figura 15, panel derecho). Sorprendentemente, el anticuerpo anti-Péptido 3 no reconocía suPAR intacta (que lleva evidentemente la región enlazadora entera). Este experimento demuestra que el anticuerpo anti-péptido 3 reconoce preferentemente uPAR escindida y que el o los epítopes reconocidos incluye(n) uno o más de los aminoácidos Ala84-Tyr87. El experimento sugiere también que la secuencia 85-87 está oculta en la uPAR intacta y queda expuesta cuando se escinde uPAR.

Estas observaciones se confirmaron utilizando un experimento independiente de fijación in vitro (ELISA). En este ensayo, suPAR y las diferentes proteínas D2D3 se capturan primeramente utilizando un anticuerpo monoclonal (R2, que reconoce los términos carboxi de todas las formas de suPAR, escindidas por una proteasa in vitro), adsorbido previamente en plástico. En un segundo paso, las proteínas fijadas se sondaron con el antisuero policlonal (de conejo) dirigido contra el Péptido 3 o contra uPAR intacta. Los anticuerpos de conejo fijados se cuantificaron utilizando un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a enzima y una detección colorimétrica. Si bien el antisuero anti-uPAR reconocía igualmente suPAR, suPAR escindida con quimotripsina y suPAR escindida con MMP-12 (Figura 6, panel B), la IgG anti-péptido 3 reconocía solamente una suPAR escindida por MMP-12 (Figura 16, panel A). La quimotripsina escinde uPAR en el residuo 87-88 (Behrentz, 1991), mientras que MMP-12 escinde en el residuo 86/87 (datos no presentados). Por esta razón, la IgG anti-péptido 3 reconoce específicamente fragmentos D2D3 cuyo término amino lleva al menos el residuo 84, o los residuos 84-85 o residuos 84-87 de uPAR, demostrando por tanto alta capacidad de discriminación entre fragmentos D2D3. Cuando los datos obtenidos con los anticuerpos anti-péptido 3 y anti-uPAR se dividieron uno por otro, la relación anti-péptido 3/anti-uPAR entero era 0,024 con suPAR y 0,005 con suPAR escindida por quimotripsina. Sin embargo, la relación era 0,27 con suPAR escindida con MMP-12 (Figura 16, panel C).

Considerados globalmente, los datos demuestran que el borde aminoterminal del epítope reconocido por el anticuerpo anti-Péptido 3 es Tyr87, dado que los fragmentos D2D3 generados por MMP12 (que tienen Tyr87 como aminoácido N-terminal) son reconocidos plenamente, mientras que el fragmento D2D3 generado por quimotripsina (que tiene Ser88 como aminoácido N-terminal) no lo son. Este experimento demuestra también que puede utilizarse un ensayo ELISA simple para detectar selectivamente formas específicas de uPAR escindida.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas

Aguirre Ghiso, J. A., Kovalski, K., and Ossowski, L. (1999). Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol 147, 89-104.

B. Degryse, M. R., S. Rabbani, A. Villa, F. Fazioli and Blasi, F. (1999). Src-dependence and pertussis-toxin sensitivity of urokinase receptor-dependent chemotaxis, and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells vía the urokinase receptor. Blood 94, 649-662.

Beck, J. M., Preston, A.M., Gyetko, M.R. (1999). Urokinase-type plasminogen activator in inflammatory cell recruitment and host defense against Pneumocystis carinii in mice. Infect. Immun. 67, 879-884.

Behrendt, N., Ploug, M., Patthy, L., Houen, G., Blasi, F. & Danø, K. (1991). The ligand-binding domain of the cell surface receptor for urokinase-type plasminogen activator. J. Biol. Chem. 266, 7842-7847.

Behrendt, N., Jensen, O.N., Engelholm, L.H., Moertz, E., Mann, M. and Dan, K. (2000). A urokinase receptor-associated protein with specific collagen binding properties. J. Biol. Chem. 275, 1993-2002.

Bianchi, E., Ferrero, E., Fazioli, F., Mangili, F., Wang, J., Bender, J. R., Blasi, F., and Pardi, R. (1996). Integrin-dependent induction of functional urokinase receptors in primary T lymphocytes. J Clin Invest 98, 1133-41.

Blasi, F., Fazioli, F., Resnati, M., Sidenius, N. (1997). UPAR mimicking peptide. In WO 98/42733, priority 20-March-97.

Blasi, F. (1997). uPAR-uPA-PAI-1: a key intersection in proteolysis, adhesion and chemotaxis. Immunol. Today 18, 415-417.

Blasi, F., Conese, M., Møller, L.B., Pedersen, N., Cavallaro, U., Cubellis, M.V., Fazioli; F., Hernández-Marrero, L., Limongi, P., Muñoz-Canoves, P., Resnati, M., Riittinen, L., Sidenius, N., Soravia, E., Soria, M.R.,
Stoppelli, M.P., Talarico, D., Teesalu, T., Val (1994). The urokinase receptor: structure, regulation and inhibitor-mediated internalization. Fibrinolysis 8 (Suppl. 1), 182-188.

Borghi, M. O., Panzeri, P., Shattock, R., Sozzani, S., Dobrina, A., and Meroni, P. L. (2000). Interaction between chronically HIV-infected promonocytic cells and human umbilical vein endothelial cells: role of proinflammatory cytokines and chemokines in viral expression modulation. Clin Exp Immunol 120, 93-100.

Boyle, M. D. P., Chiodo, V.A., Lawman, M.J.P., Gee, A.P. and Young, M. (1987). Urokinase: a chemotactic factor for polymorphonuclear leukocytes in vivo. J. Immunol. 139, 169-174.

Braat, E. A., Jie, A.F., Ronday, H.K., Beekman, B., Rijken,, and D.C. (2000). Urokinase-mediated fibrinolysis in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients may be affected by the inactivation of singla chain urokinase type plasminogen activator by thrombin. Ann. Rheum. Dis. 59, 315-318.

Busso N, P. V., Van Ness K, Kolodziesczyk E, Degen J, Bugge T, So A (1998). Exacerbation of antigen-induced arthritis in urokinase-deficient mice. J. Clin. Invest. 102, 41-50.

Butera, S. T., Roberts, B. D., Lam, L., Hodge, T., and Folks, T. M. (1994). Human immunodeficiency virus type 1 RNA expression by four chronically infected cell lines indicates multiple mechanisms of latency. J Virol 68, 2726-30.

Cannon, P., Kim, S. H., Ulich, C., and Kim, S. (1994). Analysis of Tat function in human immunodeficiency virus type 1-infected low-level-expression cell lines U1 and ACH-2. J Virol 68, 1993-7.

Cao, D., Mizukami, I.F., Garni-Wagner, B. A., Kindzelskii, A. L., Todd, R. F., 3rd, Boxer, L. A., and Petty, H. R. (1995). Human urokinase-type plasminogen activator primos neutrophils for superoxide anion release. Possible roles of complement receptor type 3 and calcium. J Immunol 154, 1817-29.

Carmeliet, P., Moons, L., Lijnen, R., Baes, M., Lemaître, V., ipping, P., Drew, A., Eeckhout, Y., Shapiro, S., Lupu, P. and Collen, D. (1997). Urokinase-generated plasmin activates matrix metalloproteinases during aneurysm formation. Nature Genetics 17, 439-444.

Carmeliet P, M. L., Dewerchin M, Mackman N, Luther T, Breier G, Ploplis V, Muller M, Nagy A, Plow E, Gerard R, Edgington T, Risau W, Collen D (1997). Insights in vessel development and vascular disorders using targeted inactivation and transfer of vascular endothelial growth factor, the tissue factor receptor, and the plasminogen system. Ann. N.Y. Acad. Sci. 811, 191-206.

Cerinic, M. M., Generini, S., Partsch, G., Pignone, A., Dini, G., Konttinen, Y.T. and Del Rosso, M. (1998). Synoviocytes frorn osteoarthritis and rheumatoid arthritis produce plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 and display u-PA receptors on their surface. Life Sci. 63, 441-453.

Chapman, H. A. (1997). Plasminogen activators, integrins, and the coordinated regulation of cell adhesion and migration. Curr. Opin. Cell Biol. 9, 714-724.

Chiang, N., Fierro, I.M., Gronert, K. and Serhan, C.N. (2000). Activation of lipoxin A4 receptors by aspitin-triggered lipoxins and select peptides evokes ligand-specific responses in inflammation. J. Exp. Med. 191, 1197-1207.

Coleman JL, G. J., Benach JL (2001). Borrelia burgdorferi and other bacterial products induce expression and release of the urokinase receptor. J. Immunol. 166, 473-480.

Colman, R. W., Pixley, R. A., Najamunnisa, S., Yan, W., Wang, J., Mazar, A., and McCrae, K. R. (1997). Binding of high molecular weightkininogen to human endothelial cells is mediated via a site within domains 2 and 3 of the urokinase receptor. J Clin Invest 100, 1481-7.

Crowley, C. W., Cohen, R.L., Lucas, B.K., Liu, G., Shuman, M.A., and Levinson, A.D. (1993). Prevention of metastasis by inhibition of the urokinase receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5021-5025.

Dano, K., Behrendt, N., Brunner, N., Ellis, V., Plough, M. and Pyke, C. (1994). The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion. Fibrinolysis 8 (suppl. 1), 189-203.

Dano, K., Blasi, F. et al. (1990). Urokinase-type plasminogen activator receptor. In WO 90/12091.

Degryse, B., Resnati, M., Rabbani, S. A., Villa, A., Fazioli, F., & Blasi, F. (1999). Src-dependence and pertussis-toxin sensitivity of urokinase receptor-dependent chemotaxis, abd cytoskeleton reorganization in rat srnooth muscle cells via the urokinase receptor. Blood 94, 649-662.

Degryse, B., Orlando, S., Resnati, M., Rabbani, S.A. and Blasi, F. (2001). Urokinase/urokinase receptor and vitronectin/avb3 integrin induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization through different signaling pathways. Oncogene in press.

Del Rosso, M.; Fibbi, G., Matucci Cerinic, M. (1999). The urokinase-type plasminogen activator system and inflammatory joint diseases. Clin. Exper. Rheumatol. 17, 485-498.

Deng, G., Curriden, S. A., Wang, S., Rosenberg, S., and Loskutoff, D. J. (1996). Is plasminogen activator inhibitor-1 the molecular. switch that governs urokinase receptor-mediated cell adhesion and release? J Cell Biol 134, 1563-71.

\newpage

Deng, X., Ueda, H., Su, S.B., Gong, W., Dunlop, N.M., Gao, J.-L;, Murphy, P.M. and Wang, J.M. (1999). A synthetic peptide derived from human immunodeficiency virus type 1 gp120 downregulates the expression and function of chemokine receptors CCR5 and CXCR4 in monocytes by activating the 7-transmembrane G-protein-coupled receptor FPRL1/LXA4R. Blood 94, 1165-1173.

Desreumaux, P., Huet, G., Zerimech, F., Gambiez, L., Balduyck, M. (1999). Acute inflammatory intestinal vascular lesions and in situ abnormalities of the plasminogen activation system in Crohn's disease. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 11, 1113-1119.

Duh, E. J., Maury, W. J., Folks, T. M., Fauci, A. S., and Rabson, A. B. (1989). Tumor necrosis factor alpha activates human immunodeficiency virus type 1 through induction of nuclear factor binding to the NF-kappa B sites in the long terminal repeat. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5974-8.

Emiliani, S., Van Lint, C., Fischle, W., Paras, P., Jr., Ott, M., Brady, J., and Verdin, E. (1996). A point mutation in the HIV-1 Tat responsive element is associated with postintegration latency. Proc Natl Acad Sci USA 93, 6377-81.

Fazioli, F., Resnati, M, Sidenius, N, Higashimoto, Y, Appella, E and Blasi, F. (1997). The urokinase-sensitive region of the urokinase receptor is responsible for its potent chemotactic activity. EMBO J. 16, 7279-7286.

Fazioli, F. a. B., F. (1994). Urokinase-type plasminogen activator and its receptor: new target for anti-metastatic therapy? TiPS 15, 25-29.

Ferrero, E., vettoretto, K., Bondanza, A., Villa, A., Resnati, M., Poggi, A., Zocchi, M.R. (2000). uPA/uPAR system is active in immature dendritic cells derived from CD14+ CD34+ precursors and is down regulated upon matruration. J. Immunol. 164, 712-718.

Fibbi, G., Ziche, M., Morbidelli, L., Magnelli, L. and Del Rosso, M. (1988). Interaction of urokinase with specific receptors stimulates mobilization of bovine adrenal capillary endothelial cells. Exp. Cell Res. 179, 385-395.

Finzi, D., Blankson, J., Siliciano, J. D., Margolick, J. B., Chadwick, K., Pierson, T., Smith, K., Lisziewicz, J., Lori, F., Flexner, C., Quinn, T. C., Chaisson, R. E., Rosenberg, E., Walker, B., Gange, S., Gallant, J., and Siliciano, R. F. (1999). Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanísm for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy [see comments]. Nat Med 5, 512-7.

Fiore, S. a. S., C.N. (1995). Lipoxin A4 receptor activation is distinct from that of the formyl peptide receptor in myeloid cells: inhibition of CDI1/18 expression by lipoxin A4-lipoxin A4 receptor interaction. Biochemistry 34, 16678-16686.

Folks, T. M., Justement, J., Kinter, A., Dinarello, C. A., and Fauci, A. S. (1987). Cytokine-induced expression of HIV-1 in a chronically infected promonocyte cell fine. Science 238, 800-2.

Folks, T. M., Justement, J., Kinter, A., Schnittman, S., Orenstein, J., Poli, G., and Fauci, A. S. (1988). Characterization of a promonocyte clone chronically infected with HIV and inducible by 13-phorbol-12-myristate acetate. J Immunol 140, 1117-22.

Franzoso, G., Biswas, P., Poli, G., Carlson, L. M., Brown, K. D., Tomita-Yamaguchi, M., Fauci, A. S., and Siebenlist, U. K. (1994). A family of serine proteases expressed exclusively in myelo-monocytic cells specifically processes the nuclear factor-kappa B subunit p65 in vitro and may impair human immunodeficiency virus replication in these cells. J Exp Med 180, 1445-56.

Gronert, K., Gewirtz, A., Madara, J.L., and Serhan, C.N. (1998). Identification of a human enterocyte Lipoxin A (receptor that is regulated by interleukin (IL)-13 and interferon g and inhibits tumor necrosis factor a-induced IL-8 release. J. Exp. med. 187, 1285-1294.

Gudewicz, P. W. a. B., N. (1987). Human urokinase-type plasminogen activator stimulates chemotaxis of human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Comm., 147, 1176-1181.

Gyetko, M. R., Chen, G.-H., McDonald, R.A., Goodman, R., Huffnagle, G.B., Wilkinson, C.C., Fuller, J.A. and Toews, G.B. (1996¿). Urokinase is required for the pulmonary inflammatory response to Cryptococcus neoformans. A murine transgeníc model. J. Clin. Invest. 97, 1818-1826.

Gyetko, M. R., Todd, R. F. 3rd, Wilkinson, C. C., and Sitrin, R. G. (1994). The urokinase receptor is required for human monocyte chemotaxis in vitro. J. Clin. Invest. 93, 1380-1387.

Gyetko, M. R., Sud, S., Kendall, T., Fuller, J.A., Newstead, M.W., Standiford, T.J. (2000). Urokinase receptor-deficient mice have impaired neutrophil recruitment in response to pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. J. Immunol. 165, 1513-1519.

Handley, M. A., Steigbigel, R.T. and Morrison, S.A. (1996). A role for urokinase-type plasminogen activator in human immunodeficiency virus type 1 infection of macrophages. J. Virol. 70, 4451-4456.

Hasegawa, T., Sorensen, L., Dohi, M., Rao, N.V., Hoidal, J.R. and Marshall, B.C. (1997). Induction of urokinase-type plasminogen activator receptor by IL-1 beta. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16, 683-692.

Higazi, A. A., Upson, R. H., Cohen, R. L., Manuppello, J., Bognacki, J., Henkin, J., McCrae, K. R., Kounnas, M. Z., Strickland, D. K., Preissner, K. T., Lawler, J., and Cines, D. B. (1996). Interaction of single-chain urokinase with its receptor induces the appearance and disappearance of binding epitopes within the resultant complex for other cell surface proteins. Blood 88, 542-51.

Hoyer-Hansen, G., Ploug, M., Behrendt, N., Ronne, E. and Dano, K. (1997). Cell surface acceleration of urokinase-catalyzed receptor cleavage. Eur J Biochem 243, 21-26.

Hoyer-Hansen, G., Behrendt, N., Ploug, M., Dano, K. and Preissner, K. T. (1997). The intact urokinase receptor is required for efficient vitronectin binding: receptor cleavage prevents ligand interaction. FEBS Lett 420, 79-85.

Hoyer-Hansen, G., Ronne, E., Solberg, H., Behrendt, N., Ploug, M., Lund, L.R., Bilis, V. and Dano, K. (1992). Urokinase plasminogen activator cleaves its cell surface receptor releasing the lígand-binding domain. J Biol Chem 267, 18224-18229.

Le, Y., Shen, W., Li, B., Gong, W., Dunlopm, N.M. and Wang, J.M. (1999). A new insight in the role of "old" chemotactic peptide receptor FPR and FPRL 1: down-regulation opf chemokine receptors CCR5 and CXCR4. Forum 94, 299-311.

May, A. E., Kanse, S. M., Lund, L. R., Gisler, R. H., Imhof, B. A., and Preissner, K. T. (1998). Urokihase receptor (CD87) regulates leukocyte recruitment via beta 2 integrins in vivo. J Exp Med 188, 1029-37.

Min, H. Y., Doyle, L.V., Vitt, C.R., Zandonella, C.L., Stratton-Thomas, J.R., Shuman, M.A. and Rosenberg, A. (1996). Urokinase receptor antagonists inhibit angiogenesis and primary tumor growth in syngcneic mice. Cancer Res. 56, 2428-2433.

Murphy, P. M. (1996). The N-formyl peptide chemotactic receptors. (Boca Raton, FL.: CRC Press).

Mustjoki, S., Sidenius, N. Sier, C.F.M. Blasi, F. Elonen, E., Alitalo, R. and Vaheri, A. (2000). Levels of soluble urokinase receptor correlate with number of circulating tumor celas in acute leukemia and decrease rapidly during chemotherapy. Cancer Res. 60, 7126-7132.

Muto, N. F., Martinand-Mari, C., Adelson, M. E., and Suhadolnik, R. J. 1999). Inhibition of replication of reactivated human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in latently infected U1 cells transduced with an HIV-1 long terminal repeat-driven PKR cDNA construct. J Virol 73, 9021-8.

Nguyen D. H., Webb, D.J., Catling, A.D., Song, Q., Dhakephalkar, A., Weber, M.J., Ravichandran, K.S. and Gonias, S.L. (2000). Urokinase-type plasminogen activator stimulates the Ras/Extracellular signal-regulated trinase (ERK) signaling pathway andMCF-7 cell migration by a mechanism that requires focal adhesion kinase, Src, and Shc. Rapid dissociation of GRB2/Sps-Shc complex is associated with the transient phosphorylation of ERK in urókinase-treated cells. J. Biol. Chem. 275, 19382-19388.

Nykjaer, A., Christensen, E.I., Vorum, H., Hager, H., Petersen, C.M., Roigaard, H., Min, H.Y., Vilhardt, F., Moller, L.B., Kornfeld, S. and Gliemann, J. (1998). Mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor-II receptor targets the urokinase receptor to lysosomes via a novel binding interaction. J. Cell Biol. 141, 815-828.

Nykjaer, A., Møller, B., Todd III, R.F., Christensen, T., Andreasen, P.A., Gliemann, J. and Petersen, C.M. (1994). Urokinase receptor. An activation antigen in human T lymphocytes. J. Immunol. 152, 505-516.

Osborn, L., Kunkel, S., and Nabel, G. J. (1989). Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 stimulate the human immunodeficiency virus enhancer by activation of the nuclear factor kappa B. Proc Natl Acad Sci USA 86, 2336-40.

Ossowski, L., Clunie, G., Masucci, M.T. and Blasi, F. (1991). In vivo interaction between urokinase and its receptor: effect on tumor cela invasion. J. Cell Biol. 115, 1107-1112.

Ossowski, L.,. (1988). In vivo invasion of modified chorioallantoic membrana by tumor cells: the role of cell surface bound urokinase. J. Cell Biol. 107, 2437-2445.

Ossowski, L., Aguirre Ghiso, J. A. (2000). Urokinase receptor and integrin partnership: coordination of signaling for cell adhesion, migration and growth. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 613-620.

Pedersen, N., Schmitt, M., Rønne, E., Nicoletti, M.I. Høyer-Hansen, G., Conese, M., Giavazzi, R., Danø, K., Kuhn, W. Jänicke, F. and Blasi, F. (1993). An unoccupied, water soluble urokinase receptor is present in the ascitic fluid and plasma from patients with ovarian cancer. J. Clin. Invest. 92, 2160-2167.

Picone, R., Kajtaniak, E.L., Nielsen, L. S., Behrendt, N., Mastronicola, M. R., Cubellis, M.V., Stoppelli, M.P., Pedersen, S., Danø, K. and Blasi, F. (1989). Regulation of urokinase receptors in monocyte-like U937 cells by phorbol esters phorbol myristate acetate. J. Cell Biol. 108, 693-702.

Poli, G., Bressler, P., Kinter, A., Duh, E., Timmer, W. C., Rabson, A., Justement, J. S., Stanley, S. and Fauci, A. S. (1990). Interleukin 6 induces human immunodeficiency virus expression in infected monocytic celas alone and in synergy with tumor necrosis factor alpha by transcriptional and post-transcriptional mechanisms. J Exp Med 172, 151-8.

Poli, G., Kinter, A., Justement, J. S., Kehrl, J. H., Bressler, P., Stanley, S., and Fauci, A. S. (1990). Tumor necrosis factor alpha functions in an autocrine manner in the induction of human immunodeficiency virus expression. Proc Natl Acad Sci USA 87, 782-5.

Poli, G., Kinter, A. L., Justement, J. S., Bressler, P., Kehrl, J. H., and Fauci, A. S. (1991). Transforming growth factor beta suppresses human immunodeficiency virus expression and replication in infected cells of the monocyte/macrophage lineage. J Exp Med 173, 589-97.

Pomerantz, R. J., Trono, D., Feinberg, M. B., and Baltimore, D. (1990). Cells nonproductively infected with HIV-1 exhibit an aberrant pattern of viral RNA expression: a molecular model for latency. Cell 61, 1271-6.

Premack, B. A. a. S., T.J. (1996). Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nature Med. 2, 1174-1178.

Prickett, K. S., Amberg, D.C. and Hopp, T.P. (1989). A calcium-dependent antibody for identification and purification of recombinant proteins. Bio Techniques 7, 580-588.

Prosnitz, E. R., Ye, R.D. (1997). The N-formyl peptide receptor: a model for the study of chemoattractant receptor structure and function. Pharmacol. Ther. 74, 73-102.

Resnati, M., Guttinger, M., Valcamonica, S., Sidenius, N., Blasi, F. and Fazioli, F. (1996). Proteolytic cleavage of the urokinase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect. EMBO J. 15, 1572-1582.

Rønne, E., Behrendt, N., Ellis, V., Ploug, M., Danø, K. and Høyer-Hansen, G. (1991). Cell induced potentiation of the plasminogen activation system is abolished by a monoclonal antibody that recognizes the N-terminal domain of the urokinase receptor. FEBS Lett. 288, 233-236.

Sidenius, N., Olsen, J.E., Sier, C.F.M. Blasi, F., Ullum, H. (2000). Increased plasma levels of soluble urokinase receptor in HIV infected patients are highly correlated with survival. Blood 96, 4091-4095.

Sidenius, N., Nicoletti, I., Mariani, A., Aletti, G., Frigerio, L., Ferrari, A., Agape, V., Stephens, R. W., Frandsen, T.L., Brünner, N., Giavazzi, R., Blasi, F. and Sier, C.F.M. (2001). Presence of domain 1 fragment of urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) in human body fluids. Submitted.

Sidenius, N., Sier, C F.M. and Blasi, F. (2000). Sheddíng and cleavage of the urokinase receptor (uPAR): Identification and characterisation of uPAR fragments in vitro and in vivo. FEBS L. 475, 52-56.

Sidenius, N. and Blasi, F. (2000). Domain 1 of the urokinase receptor (uPAR) is required for uPAR-mediated cell binding to vitronectin. FEBS L. 470, 40-46.

Sier, C., Stephens, R, Bizik, J, Mariani, A, Bassan, M, Pedersen, N, Frigerio, L, Ferrari, A, Danza, K, Brünner, N and Blasi, F. (1998). Full-size, GPI-anchor free urokinase receptor is increased in serum of ovarian cancer patients. Cancer Res. 58, 1843-1849.

Sier, C. F. M., Sidenius, N., Mariani, A., Aletti, G., Agape, V., Ferrari, A., Stephens, R., Brunner, N., Blasi, F. (1999). Presence of soluble urokinase-type plasminogen activator receptor in urine and possible clínica] relevance. Lab, Invest. 79, 717-722.

Simon, D. I., Wei, Y., Zhang, L., Rao, N.K., Xu, H., Chen, Z., Liu, Q., Rosenberg, S., Chapinan, H.A. (2000). Identification of a urokinase receptor-integrin interaction site. Promiscuous regulator of integrin function. J. Biol. Chem. 275, 10228-10234.

Sitrin, R. G., Pan, P.M., Harper, H.A., Todd, R.F. 3rd, Harsh, D.M., Blackwood, R.A. (2000). Clustering of urokinase receptora (uPAR; CD87) induces proinflammatory signalirlg in human polymorphonuclear neutrophils. J. Immunol. 165, 3341-3349.

Sitrin, R. G., Pan, P. M., Harper, H. A., Blackwood, R. A., and Todd, R. F., 3rd (1999). Urokinase receptor (CD87) aggregation triggers phosphoinositide hydrolysis and intracellular calcium mobilization in mononuclear phagocytes. J Immunol 163, 6193-200.

Slot, O., Brunnner, N. and Stephens, R.W. (2000). Marker of erosive progression in RA. Ann. Rheum. Dis. 59, 656.

Slot, O., Brunner, N., Locht, I-L, Oxholm, P. and Stephens, R.W. (1999). Soluble urokinase plasminogen activator receptor in plasma of patients with inflammatory rheumatic disorders: increased concentrations in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 58, 488-492.

Solberg, H., Rømer, J., Brünner, N., Holm, A., Sidenius, N., Danø, K. and Høyer-Hansen, G. (1994). A cleaved form of the receptor for urokinase-type plasminogen activator in invasive transplanted human and murine tumors. Int J Cancer 58, 877-881.

Speth, C., Pichler, I, Stockl, G., Mair, M., Dierich, M.P. (1998). Urokinase plasminogen activator receptor (UPAR; CD87) expression on monocytic cells and T cells is modulated by HIV-1 infection. Immunobiology 199, 152-162.

Stephens, R. W., Nielsen, H.J., Christensen, I.J., Thorlacius-Ussing, O., Sorensen, S., Dano, K., Brunner, N. (1999). Plasma urokinase receptor levels in patients with colorectal cancer: relationship to prognosis. J. Natl Cancer Inst 91, 869-874.

Stoppelli, M. P., Corti, A., Soffientini, A., Cassani, G., Blasi, F. and Assoian, R.K. (1985). Differentiation-enhanced binding of the amino-terminal fragment of human urokinase plasminogen activator to a specific receptor on U937 monocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4939-4943.

Su, S. B., Gong, W., Gao, J.-L., Shen, W., Murphy, P.M., Oppenheim, J.J. and Wang, J.M. (1999). A seven-transmembrane, G protein coupled receptor, FPRLI, mediates the chemotactic activity of serum ámyloid A for human phagocytic cells. J. Exp. Med. 189, 395-402.

Tarui, T., Mazar, A.P., Cines, D.B., akada, Y. (2000). Urokinase receptor (uPARICD87) is a ligand for integrin and mediates cell-cell interaction. J. Biol. Chem. In press, MS. M0082202000, October 26.

Todd, R. F. r., Alvarez, P.A., Brott, D.A. and Liu, D.Y. (1985). Bacterial liposaccharide, phorbol myristate acetate and muramyl dipeptide stimulate the expression of a human monocyte surface antigen Mo3e. J. Immunol. 135, 3869.

Vassalli, J.-D., Baccino, D. and Belin, D. (1985). A celIular binding site for the Mr 55,000 form of the human plasminogen activator urokinase. J. Cell Biol. 100, 86-92.

Vicenzi, E., Biswas, P., Mengozzi, M., and Poli, G. (1997). Role of pro-inflammatory cytokines and beta-chemokines in controlling HIV replication. J Leukoc Biol 62, 34-40.

Waltz, D. A., and Chapman, H. A. (1994). Reversible cellular adhesion to vitronectin linked to urokinase receptor occupancy. J. Biol. Chem. 269, 14746-14750.

Waltz, D. A., Natkin, L. R., Fujita, R. M., Wei, Y., and Chapman, H. A. (1997). Plasmin and plasminogen activator inhibitor type 1 promote cellular motility by regulating the interaction between the urokinase receptor and vitronectin. J Clin Invest 100, 58-67.

Webb, D. J., Nguyen, D. H., and Gonias, S. L. (2000) Extracellular signal-regulated kinase functions in the urokinase receptor-dependent pathway by which neutralization of low density lipoprotein receptor-related protein promotes fibrosarcoma cell núgration and Matrigel invasion. J Cell Sci 113, 123-134.

Wei, Y., Lukashev, M., Simon, D. I., Bodary, S. C., Rosenberg, S., Doyle, M. V., and Chapman, H. A. (1996). Regulation of integrin function by the urokinase receptor. Science 273, 1551-5.

Wei, Y., Yang, X., Liu, Q., Wilkins, J. A., and Chapman, H. A. (1999). A role for caveolin and the urokinase receptor in integrin-mediated adhesion and signaling. J Cell Biol 144, 1285-94.

Xue, W., Kindzelskii, A. L., Todd, R. F., 3rd, and Petty, H. R. (1994). Physical association of complement receptor type 3 and urokinase-type plasminogen activator receptor in neutrophil membranes. J Immunol 152, 4630-40.

Xue, W., Mizukami, I., Todd, R. F., 3rd, and Petty, H. R. (1997). Urokinase-type plasminogen activator receptors associate with beta] and beta3 integrins of fibrosarcoma cells: dependence on extracellular matriz components. Cancer Res 57, 1682-9.

\newpage

Yang, X., Chen, Y., and Gabuzda, D. (1999). ERK MAP kinase links cytokine signals to activation of latent HIV-1 infection by stimulating a cooperative interaction of AP-1 and NF-kappaB. J Biol Chem 274, 27981-8.

Yebra, M., Parry, G. C. N., Stromblad, S., Mackman, N., Rosenberg, S., Mueller, B. M., and Cheresh, D. A. (1996). Requirement of receptor-bound urokinase-type plasminogen activator for integrin alphavbeta5-directed cell migration. J Biol Chem 271, 29393-9.

Claims (22)

1. Anticuerpo contra un fragmento uPAR, en donde el fragmento uPAR se selecciona del grupo constituido por los péptidos 84-279, 85-279, 86-279 y 87-279, al que se hace referencia como secuencia de aminoácidos uPAR, caracterizado porque los anticuerpos

-

son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total y

-

no reconocen los fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenidos por escisión con quimotripsina.

2. Anticuerpo contra un fragmento uPAR, en donde el fragmento uPAR se selecciona del grupo constituido por los péptidos AVTYSRSRYLEC, VTYSRSRYLEC, TYSRSRYLEC, YSRSRYLEC, caracterizado porque los anticuerpos

-

son incapaces de reconocer su-PAR intacta de longitud total y

-

no reconocen los fragmentos con SRSRYLEC amino-terminal obtenidos por escisión con quimotripsina.

3. Anticuerpo contra un fragmento uPAR de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el fragmento uPAR es el péptido AVTYSRSRYLEC.

4. El uso de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la fabricación de una composición farmacéutica para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

5. El uso de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la fabricación de una composición farmacéutica como agente de diagnóstico para pronosticar el curso de afecciones inflamatorias, enfermedades infecciosas y/o cáncer.

6. El uso de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la fabricación de una composición farmacéutica como agente de diagnóstico para pronosticar el curso del cáncer.

7. Anticuerpos contra el receptor FPRL1/LXA4 para la fabricación de un medicamento para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

8. El uso de anticuerpos contra el receptor FPRL1/LXA4 para la fabricación de un medicamento para diagnóstico y/o tratamiento de afecciones inflamatorias y/o cáncer.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo está generado contra el péptido ASWGGT
PEERLK en el tercer dominio extracelular de FPRL1/LXA4R.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6 ó 8-9, para el tratamiento de choque séptico, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, artritis crónica, cáncer y/o invasión de cáncer.

11. Un método para la determinación de uPAR activada a partir de tejidos, extractos de tejido, fluidos biológicos, que comprende:

a)

preparar una muestra de tejido, extracto de tejido, fluidos biológicos;

b)

poner en contacto la muestra con uno de los anticuerpos de las reivindicaciones 1-3;

c)

determinar la fijación específica del anticuerpo.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 que se encuentra en la forma de ELISA.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, para el diagnóstico y/o pronóstico ex-vivo de patologías que implican la activación de uPAR.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer y/o enfermedades inflamatorias.

15. El uso de pro-uPA, un derivado o fragmento de la misma que retiene la fijación de uPAR total, sin el dominio carboxi-terminal de uPA que soporta la actividad enzimática, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección de HIV.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho derivado o fragmento de pro-uPA se selecciona del grupo constituido por:

a)

un mutante de pro-uPA en el sitio activo;

b)

el fragmento amino-terminal pro-uPA, y

c)

un fragmento que contiene el dominio de factores de crecimiento.

17. El uso de pro-uPA, un derivado o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, en combinación con un anticuerpo anti-TNF-alfa y/o TGF-beta.

18. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, para el tratamiento de infecciones agudas o latentes de HIV en individuos infectados por HIV o en pacientes de SIDA.

19. Un método para el escrutinio de compuestos útiles para el tratamiento de la infección de HIV, que comprende:

a)

seleccionar un compuesto capaz de modular la interacción pro-uPA/uPAR,

b)

poner en contacto dicho compuesto con un cultivo de células promonocíticas U1 en las cuales la producción de HIV se ha activad convenientemente,

c)

determinar cualesquiera variaciones de la replicación del virus.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la producción de HIV por las células U1 se activa por su estimulación con TNF-alfa, IL-6 o IL-beta.

21. Un método para la determinación de uPAR activada a partir de tejido, extractos de tejido, fluidos biológicos, para el diagnóstico de la infección de HIV, que comprende:

a)

preparación de una muestra de tejido, extractos de tejido, fluidos biológicos;

b)

poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo contra el péptido AVTYSRSRYLEC;

c)

determinar la fijación específica del anticuerpo.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, que se encuentra en forma de ELISA.