ES2275712T3 - Portadores de oxigeno artificiales de hemoglobina humana o porcina reticulada modificada, procedimientos para su preparacion a partir de material modificado y su uso. - Google Patents
Portadores de oxigeno artificiales de hemoglobina humana o porcina reticulada modificada, procedimientos para su preparacion a partir de material modificado y su uso. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la preparación de portadores de oxígeno artificiales de hemoglobina reticulada con propiedades funcionales mejoradas, caracterizado porque la hemoglobina i) en primer lugar se desoxigena ii) a continuación se hace reaccionar covalentemente con un efector de la unión de oxígeno químicamente reactivo; iii) después la solución se mezcla con un efector no reactivo químicamente; y después iv) la hemoglobina se reticula entre sí covalentemente de forma estable con glutardialdehído, bajo muy intensa dilución de la mezcla de reacción con adición simultánea del reticulante, a continuación la solución se diluye de nuevo con agua, incrementándose el volumen total de la mezcla de reacción en un factor de 2 a 10 y después de ello, v) se acopla covalentemente un poli(óxido de etileno), vi) el producto obtenido se procesa de forma conocida.
Description
Portadores de oxígeno artificiales de
hemoglobina humana o porcina reticulada modificada, procedimientos
para su preparación a partir de material modificado y su uso.
La presente invención comprende según las
reivindicaciones la preparación de hemoglobinas químicamente
modificadas reticuladas con propiedades funcionales mejoradas, las
hemoglobinas reticuladas preparadas según este procedimiento así
como su uso como portadores de oxígeno artificiales. El
procedimiento de preparación se caracteriza tanto por simplicidad
técnica como también por altos rendimientos.
Se conjuga hemoglobina altamente pura
desoxigenada bajo la protección de un agente antioxidante con un
efector de la unión de oxígeno, en especial
pirixodal-5-fosfato, después se
lleva a cabo la polimerización de la hemoglobina con
glutardialdehído con un gran aumento del volumen de la mezcla de
reacción y con ello una gran dilución de los reactantes durante la
adición del reticulante. A continuación, tras la dilución con agua,
se acopla químicamente un derivado de poli(óxido de etileno) a la
hemoglobina reticulada. Se obtienen polímeros compatibles con
plasma sanguíneo con características de unión a oxígeno optimizadas,
que se pueden usar como portadores de oxígeno artificiales, en
especial divididos en una proporción de bajo peso molecular y una de
alto peso molecular como sustitutos sanguíneos o como aditivos
sanguíneos, por ejemplo en el tratamiento de estados de falta de
oxígeno.
En la medicina resulta deseable por diferentes
indicaciones médicas disponer de un sistema artificial de apoyo
para el transporte de oxígeno. En caso de una grave pérdida de
sangre parece no sólo razonable sustituir el volumen de forma
isotónica e isooncótica, sino también restituir una función
adicional de la sangre, concretamente, el transporte de oxígeno.
Con la cada vez menor disposición a la donación de sangre, en casos
catastróficos graves (entre otros en caso de guerra) hay cada vez
menos sangre conservada adecuada disponible, en especial para poder
cubrir una necesidad imprevisible. La disponibilidad momentánea de
sangre conservada apropiada conlleva además considerables problemas
logísticos. Además, la sangre conservada sólo se puede almacenar
normalmente aproximadamente 35 días y por ello tiene que renovarse
continuamente - lo que ocasiona costes considerables - mientras que
soluciones artificiales se pueden conservar durante un tiempo
esencialmente más prolongado, ya que dado el caso se pueden
congelar. En función del tiempo de almacenamiento, la sangre
conservada se adicifica intracelularmente, y por ello sus
características de unión a oxígeno no son de ninguna manera óptimas,
sino que más bien se deben regenerar en primer lugar en el
organismo. Por el contrario, un portador de oxígeno artificial
funciona de forma óptima desde el primer momento. La cada vez menor
disposición a la donación de sangre se enfrenta por otro lado al
creciente envejecimiento de la población que aumenta la demanda. De
forma simultánea, a causa del envejecimiento también se reduce el
número de los donantes de sangre potenciales. De la misma forma, a
causa de los riesgos de infección ineludibles (debilidades inmunes,
hepatitis), la población de los suburbios ("slums") queda
excluida como donante de sangre. Un sustituto sanguíneo artificial
transportador de oxígeno también sería universal,
independientemente del grupo sanguíneo. Es posible además que con un
sustituto sanguíneo de este tipo se pueda atravesar un choque por
hipovolemia antes que con una sangre conservada, ya que los
eritrocitos de la conserva están rígidos y por ello presentan una
transitabilidad capilar reducida. En cualquier caso, los
experimentos con animales han demostrado que se puede combatir el
choque por hipovolemia con un sustituto sanguíneo transportador de
oxígeno de forma más eficaz que con expansores plasmáticos simples
(Pabst, R. (1977): "Sauerstofftransport mit stromafreien
Hämoglobinlösungen und Fluorocarbonen", Med. Klin.
72: 1555-1562, Keipert P.E., Chang T. M.S.
(1985) "Pyridoxylated Polyhemoglobin as a Red Cell Substitute for
Resucitation of Letal Hemorrhagic Shock in Conscious Rats2",
Biomater., Med. Dev. Artif. Organs 13:
1-15). A esto se añaden otras aplicaciones de un
portador de oxígeno artificial: cada vez se pueden realizar menos
intervenciones quirúrgicas complicadas que cursan obligatoriamente
con graves pérdidas de sangre porque faltan las reservas de sangre
necesarias. En cambio se desarrollan intervenciones quirúrgicas cada
vez mayores y más invasivas - entre las que se cuentan
especialmente también transplantes - cuya realización en cada caso
concreto depende decisivamente de la disponibilidad de muchas
reservas de sangre apropiadas. Adicionalmente, se pueden conservar
mucho mejor órganos previstos para un transplante si se prefunden
con portadores de oxígeno (artificiales). Sólo un transplante de
hígado requiere hasta 100 unidades de transfusión de 450 ml cada
una. En casos de daños por politraumatismo (por ejemplo a causa de
un accidente de automóvil) se requieren grandes cantidades
similares.
Pero no sólo en caso de una grave pérdida de
sangre, sino también en caso de trastornos circulatorios crónicos
(en especial cerebrales, coronarios, renales y periféricos - por
ejemplo en caso de sordera sensitiva súbita - o de una crisis
anémica por ejemplo en caso de osteomielitis crónica o después de
quimioterapia tumoral) existe una necesidad de una sustancia
sanguínea transportadora de oxígeno artificial. También en caso de
una falta de oxígeno fetal a causa de una insuficiencia placentaria
para evitar una amenaza de aborto o para evitar los daños por la
falta de oxígeno en el parto se ofrece la aplicación del aditivo o
para la deshabituación de la respiración asistida. Una necesidad de
este tipo es incluso considerablemente superior a la del caso
mencionado anteriormente de una grave pérdida de sangre: tales
trastornos circulatorios crónicos son la causa de la muerte de
aproximadamente 750.000 personas al año en Alemania. A esto se
añaden los casos de enfermedad por esta causa. Sólo aproximadamente
la mitad de personas mueren de cáncer anualmente. La falta crónica
de oxígeno en los tejidos se intenta tratar de forma conocida
mediante suministro de oxígeno hiperbárico. Independientemente de
que esta terapia sólo surte efecto mientras impera la sobrepresión
de oxígeno e independientemente de que el procedimiento no está
exento de peligro, A este respecto existe el peligro de daños
tisulares oxidativos por reacciones radicálicas de oxígeno que se
pueden comprobar mediante los correspondientes productos de
reacción. Un portador de oxígeno artificial actúa mientras está
presente y ofrece a los tejidos el llamado oxígeno de baja presión,
de forma que no aparecen los daños mencionados. La aplicación de un
aditivo sanguíneo transportador de oxígeno como apoyo provisional
del sistema de transporte de oxígeno endógeno representa otra
posibilidad y alternativa para la lucha contra la falta de oxígeno
tisular crónica que hasta ahora se ha intentado tratar con agentes
potenciadores de la circulación (por ejemplo, vasodilatadores).
Para el tipo de aplicación, resulta muy adecuado
el concepto de que se trate de una terapia de oxígeno funcional: no
se aplica el sustrato (el oxígeno), sino que se mejora la función
del sistema portador que lleva el oxígeno a los tejidos. Esto hace
multiplicativo el efecto de la terapia, así como muy efectivo, y le
proporciona simultáneamente un carácter catalítico. A esto se
añaden también indicios claros de que un portador de oxígeno
disuelto en plasma es mucho más eficaz que uno "empaquetado"
en eritrocitos. Adicionalmente, un sustituto sanguíneo artificial
de este tipo puede prepararse exento de los patógenos conocidos; de
esta forma se pueden evitar problemas infecciosos como hepatitis y
el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Un grupo receptor potencial adicional para
soluciones transportadoras de oxígeno artificiales son pacientes
para los que se prevé una reacción alérgica por ejemplo frente a los
antígenos HLA. Hasta ahora se ha intentado eliminar los leucocitos
de la sangre conservada mediante una filtración sobre algodón. Las
soluciones de sustitutos sanguíneos artificiales estarían por el
contrario completamente exentas de leucocitos. Muy recientemente se
ha observado en cerdos que tras la mejora del suministro de oxígeno
(disminución de la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno), se
reduce el volumen de latido del corazón y la frecuencia cardiaca
permanece inalterada (Villereal M.C. y col. (1987): "Engineered
Red Blood Cells with Modified Oxygen Transport Properties: A New
Oxygen Carrier", Biomater., Med. Dev., Artif. Organs
15: 397). En otro trabajo (Bosman R.J. y col., (1992):
"Free Polymerized Hemoglobin Versus Hydroxyetyl Starch in
Resucitation of hypopovolemic dogs", Anesth. Analg.
75: 811-817) se mostró que la administración
de soluciones transportadoras de oxígeno tras un choque de
hipovolemia en perros evita el aumento de volumen del corazón y por
lo tanto protege al corazón. Aquí se abre la posibilidad de
alcanzar una protección miocárdica funcional mediante la mejora del
suministro de oxígeno, lo que resulta de ayuda por ejemplo en el
caso de un infarto. Esto sería un aspecto completamente nuevo para
aplicación de soluciones transportadoras de oxígeno.
Otra aplicación de tales portadores de oxígeno
artificiales sería el aumento de la sensibilidad a la irradiación
de tumores, ya que cada vez se insinúa más que portadores de oxígeno
moleculares disueltos en el plasma ceden oxígeno a los tejidos de
forma mucho más efectiva que sangre completa: tales portadores
artificiales ocasionan una sinergia con los portadores nativos
(intraeritrocitarios). Es decir, el portador artificial
molecularmente disperso en el plasma sanguíneo no sólo cede oxígeno
a los capilares de la mejor manera de por sí, sino que además
refuerza la cesión de oxígeno del sistema nativo existente, y
concretamente mediante el mecanismos de la difusión facilitada.
Esto significa que para este propósito sólo se requiere una pequeña
concentración del portador artificial en el plasma. A pesar de
ello, esta terapia funcional se mantiene excepcionalmente efectiva
(véase anteriormente).
Todo lo dicho pone de manifiesto la necesidad de
un transportador de oxígeno artificial. Resulta imprescindible para
la utilización de un portador de oxígeno artificial que su material
de partida esté disponible en cantidad suficiente. Las reservas de
sangre caducadas no resuelven por tanto el problema. Por ello es
necesario utilizar hemoglobinas animales, preferentemente de los
animales de matadero más importantes; vacas y/o cerdos.
A partir de la representación de la necesidad de
portadores de oxígeno artificiales resultan a grandes rasgos dos
tipos de aplicación: por una parte en caso de una gran pérdida de
sangre y por otra parte en caso de una falta de oxígeno crónica. En
el primer caso, para la compensación se necesita un sustituto
volumétrico isooncótico transportador de oxígeno (portadores de
oxígeno artificiales de primera generación), en el segundo caso por
el contrario, un aditivo sanguíneo transportador de oxígeno
(portadores de oxígeno artificiales de segunda y nueva generación).
Como se ha mencionado, el segundo caso es con mucho el más común.
Por lo habitual, un aditivo sanguíneo correspondiente permite, en
combinación con un llamado expansor de plasma, también la terapia
de una perdida de sangre grave con la gran ventaja de que el médico
tiene la posibilidad de adaptar tanto el aporte de portadores de
oxígeno como también del volumen de líquido a las necesidades del
paciente concreto.
También el organismo puede modificar ambos
(cantidad del portador de oxígeno y volumen sanguíneo)
independientemente entre sí, concretamente la formación de
eritrocitos a través de eritropoyetina y el volumen plasmático
mediante un sistema de regulación propio. Ambas magnitudes se
desacoplan por el hecho de que el portador tiene en la sangre una
presión osmótica coloidal mucho menor que el plasma.
Hasta ahora otros han seguido fundamentalmente
tres estrategias para el desarrollo de un portador de oxígeno para
la sangre (estado de la técnica; Rudolph A.S. y col. (eds.): Red
Blood Cell Substitutes: Basic principles and Clinical
Applications, Marcel Dekker, Nueva York, u.a. 1998; Tsuchida E.
(ed.): Blood Substitutes: Present and Future Perspectives,
Elsevier Sciences, Ámsterdam 1998; Chang, T.M.S. (autor o ed.):
Blood Substitutes: Principles, Methods, Products and Clinical
Trials, Volumen 1 y Volumen 2, Karger Landes, Basilea u.a. 1997
y 1998).
Uso de emulsiones con hidrocarburos fluorados -
últimamente también se utilizan otros halógenos como bromo - en las
que el oxígeno puede disolverse especialmente bien (Hirlingen W.K. y
col. (1982): "Auswirkunden eines teilweisen Blutaustausches mit
Fluosol DA 20% auf den intakten Organismus des Schweines",
Annästhesist 31 660-666). Dado que
los fluorocarburos son lipófilos, es de esperar sin embargo que se
produzcan interacciones y trastornos en las capas lipídicas de las
membranas celulares. Estas últimas son componentes funcionales
integrantes de las células. Además los fluorocarburos se deben
dispersar con emulgentes tales como fosfolípidos, los cuales pueden
interferir adicionalmente con las membranas de las células (los
llamados portadores de oxígeno artificiales sobre la base de
fluorocarburos de primera generación).
La microencapsulación de soluciones altamente
concentradas de hemoglobina natural y también químicamente
modificada en vesículas fosfolipídicas con la adición de efectores
apropiados de la unión de hemoglobina ("eritrocitos artificiales
o hemosomas") representa una estrategia adicional (Ogata Y.
(1994): "Characteristics of Neo Red Cells, Their Function and
Safety: In-Vivo Studies", Artificial
Cells, Blood Substiutes, and Immobilization Biotechnologies
22 875-881). En este campo se han realizado
también los primeros experimentos animales (Hunt, A.C, y col.,
(1995): "Synthesis and Evaluation of a Protypal Artificial Red
Cell", Science 230: 1165-1168).
Las vesículas tenían un diámetro de menos de 0,05 \mum y eran por
lo tanto en cuestión de volumen dos potencias decimales menores que
los glóbulos rojos naturales.
La tercera estrategia consiste en la preparación
de soluciones de hemoglobina que se pueden infundir. El portador de
oxígeno artificial está presente por lo tanto de forma extracelular
en la sangre. Mientras que las dos primeras soluciones del problema
se pueden ver como la preparación de una sangre artificial, de forma
que no puede aparecer la dificultad de una interferencia osmótica
coloidal, en el caso de esta solución del problema se encontraba
inicialmente un expansor plasmático cuyas macromoléculas también
podían transportar oxígeno (los llamados portadores de oxígeno
artificiales sobre la base de hemoglobina de primera
generación).
La hemoglobina nativa no se puede usar para
esto, ya que por ejemplo es excretada muy rápidamente por los
riñones. Es ineludible por lo tanto una modificación química. En el
marco de esta estrategia por ejemplo se ha unido la hemoglobina por
sus grupos amino de forma covalente a dextranos o se ha polimerizado
entre sí hasta un peso molecular de aproximadamente 700.000 g/mol.
Lo primero fue perseguido por ejemplo por la empresa Fresenius
(Fresenius E. (1976): "Blood and Plasma Substitute Comprising a
Colloidal Solution of Hydroxyethyl Starch Coupled To Haemoglobin
Free Stroma", publicación de patente DE-P
2616-086)I y lo último por la empresa
Biotest (Bonhard K. y col. (1983): "Verfahren zur Gewinnung von
hepatitissicheren, sterilen, pyrogenfreien und stromafreien
Hämoglobinlösungen", documento de patente
DE-O-3130770) y la empresa Alza
(Bonsen P. (1976): "Water-soluble Polymerized
Hemoglobin", documento de patente
DE-O-2607706). Otra estrategia
referente a soluciones extracelulares es estabilizar la
hemoglobina, reticulándola en tetrámeros o enganchando grupos
laterales (oligoetilenglicol), sin aumentar esencialmente el peso
molecular (tetramérico) (estabilisierte Hämoglobine (Matsushita M.,
y col. (1987): "In vivo Evaluation of Pyridoxylated
Hemoglobin-Polyoxyethylene Conjugate", Biomat.
Artif. Cells., artif. Org. 15: 377). Como se ha
mencionado anteriormente, las soluciones de sustitutos sanguíneos
extracelulares han demostrado en experimentos animales resultados
prometedores en lo referente a un tratamiento de
choque.
choque.
Es una ventaja del uso de hemoglobinas como
portadores de oxígeno artificiales - frente a los fluorocarburos -
que se puedan aprovechar las adecuadas propiedades de la unión
natural a oxígeno. A ellas pertenecen la afinidad por el oxígeno
media óptimamente adaptada, la cooperatividad homotrópica, es decir,
la forma de S de la curva de unión a oxígeno, así como el efecto de
Bohr (alcalino), que forma la base de un mecanismo de
autorregulación natural para la cesión dirigida de oxígeno a tejidos
con carencia de suministro.
De la bibliografía relacionada se desprende
claramente que un acoplamiento covalente intratetramérico de las
unidades de hemoglobina (Keipert P.E. y col. (1989): "Metabolism,
Distribution and Excretion of HbXL: A Nondissociation
Interdimerically Crosslinked Hemoglobin with excepcional Oxygen
Offloading Capability", - en Chang T.M.S., Geyer R.P. (Eds.):
Blood Substitutes, Marcel Dekker, Nueva York 1989) y/o una
polimerización de la hemoglobina conducen a un fuerte aumento del
tiempo de permanencia en sangre (Chang T.M.S. (1987): "Modified
Hemoglobin as Red Cell Blood Substitutes", Biomater., Med.
Devices Artif. Organs 14: 323-328;
Friedman H.J. y col. (1984): "In vivo Evaluation of
Pyridoxylated-Polymerized Hemoglobin Solution",
Surg., Gynecol., Obstet. 159:
429-435). Esto es una condición esencial para la
utilidad clínica de tales soluciones.
En el caso de los portadores de oxígeno
artificiales extracelulares molecularmente dispersos, se han
desarrollado hasta ahora sin embargo ignorando un gran campo de
demanda - la falta de oxígeno crónica -, intentando soluciones
isooncóticas. Las consecuencias de trastornos circulatorios crónicos
que aparecen considerablemente más a menudo, como se ha mencionado
anteriormente, sólo se pueden mejorar mediante soluciones
transportadoras de oxígeno cuya presión osmótica coloidal se
despreciable frente a la normal (3,5 kPa), es decir, sólo con ayuda
de un aditivo sanguíneo transportador de oxígeno, en cierto modo un
concentrado eritrocítico molecular''. Estos son portadores de
oxígeno artificiales basados en hemoglobina de segunda
generación.
En los distintos intentos de desarrollar un
transportador de oxígeno artificial surgieron los problemas que se
mencionan a continuación:
- \bullet
- Aumento de la afinidad oxígeno-hemoglobina: la presión de semisaturación (P50) se reduce a causa de la modificación química en la molécula de hemoglobina. Por ello se dificulta la cesión del oxígeno al tejido. Esto aparece marcadamente en el caso de la unión de hemoglobina a dextrano. Para evitar el aumento de la afinidad de oxígeno, se han unido efectores apropiados (por ejemplo, piridoxalfosfato) a los grupos prostéticos de la hemoglobina.
- \bullet
- A menudo disminuyen simultáneamente el llamado valor n50 (índice de HILL) como una expresión de la cooperatividad homotrópica disminuida (forma de S atenuada de la curva de unión oxígeno-hemoglobina), lo que de igual modo dificulta el suministro de oxígeno al tejido. Esta forma de S de la curva de unión oxígeno-hemoglobina facilita asimismo la captación de oxígeno en los pulmones y su cesión a las células. Los fluorocarburos poseen por el contrario una "curva de unión a oxígeno" lineal y no tienen por lo tanto la misma ventaja funcional.
- \bullet
- El portador de oxígeno artificial tiene a menudo un tiempo de permanencia en el organismo demasiado escaso, la excreción de las hemoglobinas disueltas se lleva a cabo a través de los riñones. En caso de soluciones de hemoglobina extracelulares como portadores de oxígeno artificiales se ha intentado impedir la excreción mediante reticulación intermolecular, no obstante el tiempo de permanencia de las hemoglobinas extracelulares sigue siendo inferior al deseado. Por el contrario, los hemosomas son retirados del plasma por el sistema retículoendotelial del organismo. Por ejemplo, el tiempo medio de los eritrocitos artificiales ascendió a sólo 5,8 horas (véase anteriormente).
- \bullet
- Respecto a la alta presión osmótica coloidal: A causa de ello se puede producir una pérdida de volumen (choque hipovolémico). Este efecto aparece cuando el peso molecular del portador de oxígeno artificial es comparable con el de las proteínas plasmáticas. Tampoco se tiene libertad a este respecto con la dosificación del portador de oxígeno artificial, sino que se tienen que tomar en consideración las proporciones oncóticas.
- \bullet
- El ambiente oncótico del plasma se determina además de forma decisiva por el llamado segundo coeficiente del virial (valor A_{2}): éste caracteriza la interacción del portador de oxígeno (siempre macromolecular) con el disolvente (agua). La síntesis ha de ajustarse de tal manera que este valor se aproxime a cero.
- \bullet
- Respecto a la alta viscosidad de la solución de portador: esta va acompañada normalmente por un valor A_{2} demasiado elevado, y aparece preferiblemente cuando un portador está compuesto de moléculas en cadena. Una viscosidad demasiado elevada no aparece según la ley de la viscosidad de Einstein cuando las moléculas portadoras poliméricas son redondeadas y compactas.
- \bullet
- Estabilidad in vitro de las moléculas portadoras: esta se refiere por un lado a la desintegración de las moléculas y por otro a la unión oxidativa de metahemoglobina, la cual ya no puede unir oxígeno y finalmente a la viscosidad a través de interacciones que se modifican lentamente entre el portador y la albúmina del plasma.
- \bullet
- Reacción desproporcionada del sistema reticuloendotelial (SRE): Un factor de influencia principal es el tamaño molecular del portador artificial. Existe para ello un límite crítico en aproximadamente 0,3 \mum: partículas mayores activan el SRE.
- \bullet
- Daño renal y hepático: Un choque renal apareció sobre todo cuando se usó solución de hemoglobina con contenido en estroma. Desde que se ultrafiltran las soluciones, ya no se ha observado ningún daño renal. Los daños hepáticos se indicaron con ayuda del perfil de transaminasas plasmáticas, estas se basan presumiblemente en interacciones de la membrana celular: el hígado posee una circulación abierta (capilares fenestrados).
- \bullet
- También debe comprobarse la hemostasia; son posibles trastornos en el sentido de una potenciación o de un impedimento, se debe prestar especial atención a la agregación de los trombocitos.
- \bullet
- Efecto antigénico: respecto a esto se ha demostrado recientemente en estudios homólogos con ratas que la hemoglobina nativa no tiene un efecto antigénico y que la polimerización con glutardialdehído no aumenta la antigenicidad (Hertzman C.M. y col. (1986): "FERUM Antibody Titers in Rats Receiving Repeated Small Subcutaneous Injection of Hemoglobin or Polyhemoglobin. A Preliminary Report". Int. J. Artif. Organs 9: 179-192). En el mismo trabajo se muestra que la hemoglobina humana nativa y polimerizada actúa de forma poco antigénica en ratas y que el efecto mediante la polimerización se refuerza como mucho en un grado mínimo.
- \bullet
- Los efectos tóxicos se pueden diferenciar en pirogénicos, vasoconstrictores - por ejemplo en los vasos coronarios - y endotóxicos. El efecto vasoconstrictor se basa presumiblemente en la captura de los radicales de monóxido de nitrógeno, los cuales son sustancias de control vasodilatadoras endógenas conocidas; el efecto vasoconstrictor se puede aclarar no obstante también mediante la alta eficacia de los portadores artificiales, ya que se suministra "demasiado bien" oxígeno a la musculatura lisa.
- \bullet
- Estabilidad in vivo: Se puede pensar en una catálisis enzimática endógena, por ejemplo mediante proteasas.
- \bullet
- Sobrecarga del organismo con lipoides (emulgentes): esta complicación aparece con la aplicación de soluciones de hemoglobina y fluorocarburos microencapsuladas, a este respecto se determinaron en ratas una activación del complemento a través de la ruta alternativa así como una formación de anticuerpos.
- \bullet
- La tolerabilidad de los portadores artificiales con plasma sanguíneo humano reciente, en función del valor de pH puede producir precipitaciones.
Presumiblemente a causa de los problemas
mencionados hasta ahora no está disponible un portador de oxígeno
artificial para la aplicación clínica rutinaria.
A partir de la mención de los diversos problemas
se deduce que aún sigue habiendo un gran catálogo de requerimientos
para un portador de oxígeno artificial útil.
En la naturaleza el oxígeno siempre se
transporta en enormes agregados microscópicos. Aquí se han
desarrollado básicamente dos "soluciones al problema"
diferentes. En animales superiores (y también en los seres humanos),
el portador de oxígeno molecular está empaquetado en células (en
los eritrocitos). En segundo lugar se desarrollaron enormes
moléculas de unión a oxígeno que no se encuentran intracelularmente,
sino extracelularmente disueltas en la hemolinfa, esta variante se
encuentra predominantemente en animales inferiores con diferentes
características. Los anélidos poseen por ejemplo hemoglobinas de
alto peso molecular con un peso molecular medio alrededor de
3000000 g/mol como portadores de oxígeno. Además existen las
llamadas hemoeritrinas, en las que el hierro como agente de unión a
oxígeno está directamente acoplado molecularmente a la proteína.
Finalmente se encuentran las hemocianinas con un peso molecular
alrededor de 8000000 g/mol, en las que el ión de metal pesado de
unión a oxígeno es cobre, véase también Barnikol W.K.R., y col.
(1996): "Hyperpolymere Hämoglobine als küstliche
Sauerstoffträger. Ein innovativer Ansatz der medizinischen
Entwicklung", Therapiewoche 46:
811-815.
La transición en la historia del desarrollo
desde los portadores de oxígeno extracelulares hasta los eritrocitos
ha llevado a que el contenido en oxígeno del fluido sanguíneo se
incremente tres veces: mientras que 1 ml de "sangre" de la
lombriz de tierra sólo puede unir como máximo 3,6 \mumoles de
oxígeno, en el mismo volumen de sangre humana se unen hasta 9,0
\mumoles de oxígeno.
La lombriz de tierra posee en su sangre enormes
moléculas (eritrocruorina) como portadores de oxígeno con un peso
molecular de aproximadamente 3400000 g/mol con alrededor de 200
sitios de unión para oxígeno. Además la molécula es muy compacta y
su estructura cuaternaria es altamente ordenada. La molécula es tan
grande que se puede ver directamente con ayuda del microscopio
electrónico. Su concentración en la hemolinfa asciende a al menos 6
g/dl. La medición de la curva de unión a oxígeno en condiciones
in vivo simuladas da como resultado una presión de
semisaturación (P50) de 9,1 Torr (1,2 kPa) (Barnikol W.K.R.,
Burkhard O. (1987): "Highly Polymeryzed Human Hemoglobin as an
Oxygen Carrying Blood Substitute", Advances in Experimental
Medicine and Biology Volumen 215: 129-134;
Barnikol W.K.R. (1986): "The Influence of Glutardialdehyde on the
Oxygen Cooperativity of Human Hemoglobin", Pflügers
Archiv 406: R61). Este sistema suministra por lo tanto
suficiente oxígeno a las células de la lombriz de tierra. Por el
peso molecular extremadamente alto, la hemoglobina de la lombriz de
tierra prácticamente ya no tiene ningún efecto osmótico coloidal
(sólo aproximadamente 4 kPa). Con ello, como en la sangre de los
mamíferos - la presión oncótica de los eritrocitos asciende sólo a
1,3 10^{-6} Pa - tanto la función de coloidoosmolaridad y de
unión a oxígeno están desacopladas, y ambas pueden variarse
libremente por el organismo como variable de control.
Si se quiere transmitir el principio del sistema
de la lombriz de tierra a portadores de oxígeno artificiales que se
basen en hemoglobina humana o animal, se debe modificar la molécula
de hemoglobina de tal forma que pueda apoyar como enorme molécula
extracelular con presión oncótica despreciable al transporte de
oxígeno normal de los eritrocitos al menos temporalmente. Tales
portadores de oxígeno artificiales son por lo tanto hemoglobina
altamente polimerizada que debe tener en cuenta toda la problemática
anteriormente mencionada. La "hemoglobina" de lombriz de
tierra, que cumple con los requisitos de presión oncótica, no se
puede usar para este propósito en humanos porque presumiblemente
posee una alta antigenicidad, además la presión de semisaturación
es con 1,2 kPa demasiado baja (Barnikol W.K.R., Burkhard O. (1987):
"Highly Polymeryzed Human Hemoglobin as an Oxygen Carrying Blood
Substitute", Advances in Experimental Medicine and Biology
Volumen 215: 129-134; Barnikol W.K.R. (1986):
"The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of
Human Hemoglobin", Pflügers Archiv 406: R61).
Además, presumiblemente no se puede obtener en las cantidades
necesarias.
Hasta ahora, en el desarrollo de portadores de
oxígeno artificiales se ha intentado ajustar su presión de
semisaturación exactamente al valor normal para el ser humano de
aproximadamente 3,47 kPa. Experimentos con animales muestran en
realidad que un portador de oxígeno artificial molecularmente
disperso con una presión de semisaturación de aproximadamente 2 kPa
oxigena los órganos de la mejor forma (Conover y col. (1999),
Art. Cells, Blood Subst., and Immobil. Biotech. 27
93-107). Por otra parte, experimentos con animales
muestran también no obstante que para un suministro suficiente de
oxígeno resulta igualmente importante una capacidad de oxígeno de
la sangre suficientemente grande (Moss G.S., y col. (1984):
"Hemoglobin Solution - From Tetramer to Polymer", en: The
Red Cells; Sixth Aven Arbor Conference, Alan Riss, Nueva York,
1984: 191-210). Esta depende a su vez de la
concentración posible del portador de oxígeno en el plasma. Además
se demuestra a este respecto que una presión de semisaturación de
3,47 kPa no se debe mantener indispensablemente. Esencialmente
consiste más bien en que no se puede quedar por debajo de un valor
crítico determinado.
A los requerimientos en el desarrollo de un
portador de oxígeno artificial se suman el hecho de que un
procedimiento de preparación debe ser lo más simple posible y con
ello rentable, sobre todo ya que se debe trabajar de forma estéril
desde el principio. El producto se debe poder obtener con el mayor
rendimiento posible. Durante la reacción de reticulación se debe
producir simultáneamente material para su uso como aditivo sanguíneo
así como aquel para su uso como sustituto del volumen sanguíneo
transportador de oxígeno.
En especial, en la preparación de los polímeros
artificiales de hemoglobina mediante la reticulación de las
moléculas de hemoglobina a través de sus grupos amino por medio de
reticulantes difuncionales se debe prestar atención además a que no
se formen redes moleculares que son insolubles y por lo tanto
disminuyen el rendimiento del producto. Por ello debe evitarse la
aparición de la llamada distribución de percolación de los pesos
moleculares:
La presente invención tenía como objetivo poder
preparar en un procedimiento técnicamente sencillo con grandes
rendimientos portadores de oxígeno artificiales hipooncóticos de
hemoglobina reticulada que poseyesen buenas características
funcionales optimizadas, en especial la característica de la unión a
oxígeno y que fuesen adecuados para aplicarse como productos
farmacéuticos a seres humanos.
El objetivo se consigue según la invención como
se describe a continuación. El problema fundamental de la aparición
de una distribución de percolación de los grados de multimerización
y de los pesos moleculares a través de la reticulación de las
hemoglobinas polifuncionales con el reticulante difuncional
glutardialdehído se pudo resolver sorprendentemente gracias al
hecho de que durante la reticulación el volumen de la mezcla de
reacción se aumenta en gran medida (en total de 2 a 10 veces), y
concretamente, añadiendo en primer lugar simultáneamente el
reticulante en solución diluida y a continuación diluyéndolo
adicionalmente con agua. Con ello se producen hemoglobinas
reticuladas con alto grado de reticulación con altos rendimientos,
sin que se produzca una distribución de percolación de los pesos
moleculares con formación de redes moleculares insolubles. El
producto en bruto de la reticulación destaca más bien por un límite
superior deseado (aproximado) determinado del intervalo de pesos
moleculares. Se obtiene en el cromatograma en gel una llamada
distribución en cuadrilátero del peso molecular (véanse la figura
1, figura 2 y figura 3).
La preparación según la invención comprende por
lo tanto las siguientes etapas:
En una reacción en un recipiente, la
hemoglobina
i) en primer lugar se desoxigena, en especial
mediante flujo de nitrógeno;
ii) a continuación se hace reaccionar
covalentemente con un efector químicamente reactivo de la unión a
oxígeno:
iii) luego se mezcla la solución con un efector
no reactivo químicamente y entonces
iv) la hemoglobina se reticula entre sí
covalentemente de modo estable con glutardialdehído, bajo una gran
dilución (de 2 a 5 veces) del volumen de la mezcla de reacción, con
adición simultánea del reticulante (en solución), y a continuación
el volumen de reacción se aumenta adicionalmente (dilución total del
volumen de la solución hasta 2-10, en especial
2-7, especialmente 5-6 veces el
volumen) y después
v) se acopla covalentemente un óxido de
polietileno.
El producto obtenido se puede procesar de forma
conocida.
Preferiblemente, la hemoglobina de partida es de
origen porcino o proviene de seres humanos, con muy especial
preferencia, de origen porcino, en especial del cerdo doméstico.
En especial, según la invención, en la etapa
iii) se añade glutardialdehído en una solución altamente diluida de
forma cronometrada. Preferiblemente, se lleva a cabo a continuación
una dilución adicional y un aumento del volumen de reacción con
agua, de forma que se alcance la dilución total anteriormente
mencionada.
A este respecto se prefiere que en la etapa iv)
se añada glutardialdehído en una cantidad en moles de
6-10, preferiblemente 7-9 mol/mol
en relación con la hemoglobina monomérica, disuelto en
1-4, preferiblemente 1-2, en
especial 1,5-2, con muy especial preferencia
1,7-1,9 litros de agua por litro de solución de
reacción original.
Esta adición se lleva a cabo de forma
cronometrada entre aproximadamente 3 y 15, preferiblemente
3-10, en especial 4-6 minutos. A
continuación la solución reacciona entre 1 y 6 horas.
Adicionalmente se prefiere que a la solución que
contiene hemoglobina antes de la reacción según la etapa ii) se le
añadan 2-8, en especial 3-6, con muy
especial preferencia 3-4 moles de ascorbato de sodio
por mol de hemoglobina no reticulada. Esta reacción se lleva a cabo
a lo largo de 0,5-6 horas, en especial
70-120 minutos.
Además se une covalentemente, en la etapa ii)
preferentemente, como efector
piridoxal-5'-fosfato en una
proporción molar, en relación con la hemoglobina monomérica de 0,5
a 3, preferiblemente de 1 a 2,5 mol/mol a lo largo de un periodo de
0,5-20, en especial de 1-7
horas.
Según la invención resulta además ventajoso y se
prefiere que en la etapa iii) así como en la etapa iv) tras la
unión covalente de
piridoxal-5'-fosfato así como
glutardialdehído se añada respectivamente borohidruro sódico
reductor.
Este se añade en especial en la etapa ii) en una
cantidad de 1-9, preferiblemente de
1-5, en especial de 1-2,5 mol/mol,
por ejemplo de 30 a 90 minutos, y en la etapa iv) en una cantidad de
5-20, en especial de 6-12 mol/mol,
respectivamente en relación con la hemoglobina monomérica durante 15
a 100 minutos.
Con especial preferencia, en la etapa iii) se
añade como efector químicamente no reactivo
2,3-difosfoglicerato en una cantidad de
0,5-6, en especial de 1-4 mol/mol,
en relación con la hemoglobina monomérica y aproximadamente
5-50 minutos, en especial 10-20 y
con muy especial 15 minutos después se añade glutardialdehído.
Como poli(óxido de etileno) se acopla
preferiblemente un éter polieteilenglicólico por ejemplo con un
resto alquilo C1-C5 como metilo, etilo, butilo con
un peso molecular de 500 a 3000 g/mol, en especial un derivado de
metoxi-polietilenglicol con un peso molecular de
1500-2500 g/mol, en especial de 2000 g/mol, como
especialmente succinimidil-propionato de
metoxi-polietilenglicol, en cantidades de
2-12, en especial de 3-8 mol/mol de
hemoglobina. Otros productos de derivatización son
metoxi-polietilenglicol-succinimidill-succinamida
y succinimidil-oxiacetato de
metoxipolietilenglicol.
El acoplamiento de poli(óxido de alquileno) a
hemoglobinas no reticuladas se describe en los documentos
US-A 4179337, US 5478805, US 5386014,
EP-A 0206448, EP-A 0067029,
DE-OS 3026398.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a lo
largo de 1-4, en especial 2-3
horas.
Adicionalmente resulta ventajoso que todas las
reacciones de preparación se lleven a cabo especialmente en
soluciones que se han liberado de oxígeno mediante tonometría con
gases libres de oxígeno. El procedimiento usado se describe en:
Pötzschke H.: Hyperpolymere des menschliches Hämoglobins:
Entwicklung präparativer Verfahren zu ihrer Synthese, Validierung
analitischer Methoden und Geräte zu ihrer Charakterisierung, Tesis
doctoral, Facultad de Medicina, Universidad de Viena, 1997.
El producto obtenido puede procesarse de forma
conocida, como se indica a continuación. Presenta especialmente una
distribución de pesos moleculares de 50000 hasta 5000000, dado el
caso hasta 10000000 g/mol o más.
El producto obtenido se puede separar en una
fracción de peso molecular medio superior y una fracción de peso
molecular medio inferior, estando el límite de separación
preferiblemente en torno a los 700000 g/mol, mediante un
procedimiento de separación de sustancias preparativo, como por
ejemplo una cromatografía de exclusión volumétrica, una
ultrafiltración, una precipitación fraccionada, por ejemplo con
poli(óxido de alquileno) o sales como sulfato amónico como agente
de precipitación o un procedimiento de fraccionamiento de
campo-flujo (véase Curling J.M. (ed) Methods of
Plasma Protein Fractionation, Academic Press, Londres entre otros
1980, así como los documentos de patente EP-A
0854151 y EP-A 95107280).
A partir del producto de masa molecular superior
y a partir del producto de masa molecular inferior se puede
preparar respectivamente una preparación farmacéutica, obteniéndose
a partir de la porción de bajo peso molecular de los polímeros un
sustituto sanguíneo parenteral y a partir de la porción de alto peso
molecular de los polímeros un aditivo sanguíneo parenteral.
El ajuste del valor de pH antes (y después) de
las etapas de reacción individuales se lleva a cabo preferiblemente
con ácido láctico o sosa cáustica hasta valores entre 6 y 10,
dependiendo de la etapa de reacción, por ejemplo
6,5-7,5 antes de la etapa ii), a continuación a
7,5-8,5 y después de nuevo a 6,5-7,5
antes de la etapa iii), después a 7,5 a 9 así como antes de la
etapa v) a 7,5-10.
La concentración de hemoglobina asciende
preferiblemente a 200-380 g/l, en especial
240-360 g/l, la solución contiene adicionalmente 10
a 150 mmol/l de NaHCO_{3} así como 10 a 150 mmol/l de NaCl.
La temperatura durante la "reacción de un
recipiente" asciende a 2-42ºC, en especial a
3-25ºC, preferiblemente a
4-22ºC.
El portador de oxígeno artificial preparado
según la invención presenta preferiblemente un valor n50
(cooperatividad) de 1,6 a 2,5 y un valor de p50 (presión de
semisaturación) de 2,1 a 3,2 kPa.
El producto obtenido según la invención con las
características mencionadas se puede usar para la preparación de un
agente para la aplicación intravascular o biomédica como portador de
oxígeno artificial o en forma de una preparación farmacéutica como
reemplazo sanguíneo (sustituto sanguíneo) o como un añadido a la
sangre para aumentar la capacidad de transporte de oxígeno (aditivo
sanguíneo) o a una solución alimenticia en el organismo humano o
animal, en órganos individuales o en aplicaciones biotecnológicas,
en especial para el tratamiento de una falta de oxígeno crónica en
el ser humano.
Para la preparación de los productos que se van
a administrar, los derivados de hemoglobina según la invención se
disuelven en medios apropiados, como soluciones para infusión, por
ejemplo en solución acuosa salina o de glucosa, preferiblemente a
concentraciones isotónicas con el plasma sanguíneo.
El procedimiento según la invención se basa por
lo tanto en etapas de reacción individuales coordinadas entre sí,
cuyo significado y repercusión se explican a continuación.
Como material de partida sirve hemoglobina
altamente pura. Esta se puede obtener según procedimientos conocidos
a partir de sangre fresca de animales de matadero o por ejemplo a
partir de sangre conservada caducada. Se describen procedimientos
para la obtención de hemoglobina purificada en: Antonini E. y col.
(eds.): Hämoglobins (Colowick S.P., Kaplan N.O. (eds.): Methods in
Enzymology, Volume 76), Academic Press, Nueva York, entre otros
1981.
Como se ha mencionado, según la invención la
hemoglobina está desoxigenada (es decir, libre de su ligando
fisiológico) durante la reticulación con glutardialdehído, la cual
es conocida en sí misma, véanse los documentos DE 2499885, US
4857636, US-A 4001200, US-A 4001401,
DE 449885, US 5439882, EP-A 0201618, ya que sólo los
polímeros preparados a partir de hemoglobina desoxigenada durante
la reticulación poseen propiedades de unión de oxígeno que
posibilitan un empleo como portador de oxígeno artificial en las
indicaciones deseadas.
Preferiblemente, para una segunda protección
contra la oxidación de la hemoglobina por trazas de oxígeno
restante, éste se puede eliminar mediante reacción química con
iones ascorbato.
Como efector de la unión de oxígeno se une en
especial piridoxal-5'-fosfato, en
una cantidad optimizada según las propiedades del producto final,
de forma covalente a la hemoglobina porcina o humana. Esta unión de
piridoxal-5'-fosfato a hemoglobina
es en principio conocida, por ejemplo, el documento de patente
EP-P0528841 describe un procedimiento para la
preparación de hemoglobina piridoxilada. La piridoxilación conduce a
los valores de presión de semisaturación deseados, cuando se
procede como se describe según la invención.
Los lugares de acoplamiento (aldiminas = bases
de Schiff) del acoplamiento covalente no estable de
piridoxal-5'-fosfato se pueden
estabilizar de forma conocida (v.a.) mediante reducción con
borohidruro de sodio (se producen aminas), manteniéndose según la
invención las condiciones especiales mencionadas. Para proteger la
capacidad de las moléculas de hemoglobina de una cooperatividad
homotrópica de los sitios de unión de oxígeno entre sí, que en la
mayoría de los casos se pierde claramente con la reticulación de la
hemoglobina con el reticulante glutardialdehído, según la invención
se añade antes de la reticulación
2,3-difosfoglicerato, un efector químico
(heterotrópico) no reactivo de la unión de oxígeno de la
hemoglobina. Este puede estar almacenado con ello durante la
reticulación de forma reversible en su sitio de unión en la
molécula de hemoglobina. Tras la síntesis, se eliminan completamente
2,3-difosfoglicerato junto con los reactantes no
consumidos así como productos de reacción sobrantes (véase más
adelante).
Como reticulante bifuncional se emplea
glutardialdehído en las condiciones según la invención especificadas
anteriormente.
Los sitios de acoplamiento (aldiminas = bases de
Schiff) de los puentes de glutardialdehído moleculares de
reticulación se estabilizan como se ha descrito mediante la reacción
con borohidruro de sodio (se producen aminas), debiéndose mantener
las condiciones según la invención.
Mediante la reticulación se producen
hemoglobinas reticuladas con una distribución de los pesos
moleculares entre aproximadamente 50000 y 5000000 g/mol (y mayores,
por ejemplo 10-15000000 g/mol).
Para mejorar la compatibilidad con las proteínas
del plasma, se acopla a la hemoglobina reticulada un derivado-(MVV)
de poli(óxido de etileno), en especial el recientemente mencionado
(metoxi)polietilenglicol monofuncionalmente activado con un
peso molecular de 1500-2500 g/mol. El acoplamiento
de polietilenglicol (PEG), la llamada pegelación así como también
la reticulación de hemoglobina son en sí conocidas (véase también E.
Tsucheda (ed.): Blood Substituts: Present and Future Perspectives,
Elsevier Science, Ámsterdam 1998).
No obstante son nuevas tanto la pegelación como
también la reticulación de hemoglobina conjuntamente, así como la
aplicación del efector químicamente ineficaz antes de la
reticulación, lo que contribuye en especial al mantenimiento de la
cooperatividad, como también en especial las condiciones de
reticulación detalladas. Mediante la pegelación que se propone en
este documento, se impide ahora la en cualquier caso débil reacción
del SER y también la degradación enzimática mediante proteasas.
El ajuste del valor de pH se lleva a cabo como
se ha detallado anteriormente.
Mediante el desarrollo y las condiciones de
reacción conseguidos para ello se puede por una parte impedir la
aparición de una distribución de percolación (mediante la dilución
según la invención), por otra parte se pueden evitar las
alteraciones indeseables de la afinidad por el oxígeno y la
cooperatividad condicionadas por la reticulación y las uniones
covalentes a la hemoglobina por ejemplo de glutardialdehído,
piridoxalfosfato y poli(óxido de etileno), y en especial también se
puede conseguir una alta compatibilidad plasmática.
Todas las etapas de reacción contribuyen a estas
propiedades especiales del producto preparado según la
invención.
El procesamiento posterior se encentra en el
marco del conocimiento del experto en la materia: los componentes
insolubles se pueden separar por centrifugación (por ejemplo durante
20 minutos con una aceleración centrifuga relativa de 20000 g).
Las hemoglobinas reticuladas se separan mediante
una etapa de procedimiento (conocida) preparativa, por ejemplo
mediante una cromatografía de exclusión volumétrica o una
ultrafiltración, una precipitación fraccionada o un fraccionamiento
de campo-flujo, en una porción de bajo peso
molecular y otra de alto peso molecular. Eligiendo procedimientos
adecuados (son especialmente importantes el límite de separación
nominal de peso molecular de la membrana de ultrafiltración o la
zona de separación de peso molecular del gel empleado), se eliminan
a este respecto al mismo tiempo todos los reactantes no consumidos
así como los productos de reacción no deseados.
Una configuración especialmente preferida de la
invención se aclara con más detalle por medio del siguiente ejemplo
de preparación:
Se disuelve hemoglobina porcina o humana
purificada con una concentración entre 200 y 380 g/l,
preferiblemente entre 240 y 360 g/l en una solución acuosa
electrolítica. Esta contiene hidrogenocarbonato de sodio con una
concentración entre 10 y 150 mmol/l, preferiblemente entre 40 y 60
mmol/l, así como cloruro de sodio con una concentración entre 10 y
150 mmol/l, preferiblemente entre 50 y 100 mmol/l.
La temperatura asciende a 2 a 42ºC,
preferiblemente entre 3 y 25ºC.
Esta solución de hemoglobina se agita, se lleva
a cabo una desoxigenación de la hemoglobina mediante flujo de
nitrógeno puro.
A esta solución se añaden de 2 a 8,
preferiblemente de 3 a 4 mol de ascorbato de sodio (como solución 1
molar en agua) por mol de hemoglobina y se deja reaccionar entre
0,5 y 6 horas, preferiblemente entre 70 y 120 minutos.
El valor de pH de la solución se titula ahora
con ácido láctico o sosa cáustica (de una concentración entre 0,1 y
1, preferiblemente entre 0,4 y 0,6 mol/l) hasta un valor entre 6,5 y
7,5, preferiblemente entre 6,9 y 7,3.
En este momento se añaden 0,5 a 3,0,
preferiblemente de 1,0 a 2,5 moles de
piridoxal-5'-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejan reaccionar entre 0,5 y 20, preferiblemente
entre 1 y 7 horas.
El valor de pH se ajusta con sosa cáustica o
ácido láctico (de una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente
entre 0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 7,5 y 8,5, preferiblemente
entre 7,7 y 8,2.
Ahora se añaden de 1,0 a 9,0, preferiblemente
aproximadamente de 1,0 a 2,5 moles de borohidruro de sodio (como
solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) y se dejan reaccionar
entre 30 y 90, preferiblemente entre 50 y 70 minutos. El valor de
pH de la solución se titula con ácido láctico o sosa cáustica (de
una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente entre 0,4 y 0,6
mol/l) a un valor entre 6,5 y 7,5, preferiblemente entre 6,9 y 7,5.
En este momento se añaden de 0,5 a 6,0, preferiblemente de 1,0 a 4,0
moles de 2,3-difosofoglicerato por mol de
hemoglobina y se dejan reaccionar entre 5 y 50, preferiblemente
entre 10 y 20 minutos.
A continuación se lleva a cabo la adición
controlada cronometrada del reticulante bifuncional, se añaden entre
6 y 10, preferiblemente entre 7 y 9 moles de glutardialdehído por
mol de hemoglobina, disuelto en 1-4, preferiblemente
en 1,5 a 2 litros de agua por litro de solución de hemoglobina,
durante 3 a 10, preferiblemente durante 4 a 6 minutos y se dejan
reaccionar entre 1 y 6, preferiblemente entre 2 y 3 horas.
El valor de pH se ajusta con sosa cáustica o
ácido láctico (de una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente
entre 0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 7,5 y 9,0, preferiblemente
entre 7,6 y 8,8.
Se añaden de 5 a 20, preferiblemente de 6 a 12
moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en sosa
cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina y se dejan reaccionar
entre 15 y 100, preferiblemente entre 30 y 80 minutos.
Entonces se lleva a cabo una adición de 0 a 4,
preferiblemente entre 0,5 y 3 litros de agua por litro de la
solución de hemoglobina origina. El valor de pH se ajusta, en caso
de que fuese necesario, con sosa cáustica o ácido láctico (de una
concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente entre 0,4 y 0,6 mol/l)
a un valor entre 7,5 y 10, preferiblemente entre 8 y 9.
En este momento se añaden por mol de hemoglobina
monomérica entre 2 y 12, preferiblemente entre 3 y 8 moles de un
derivado de poli(óxido de alquileno) activado, preferiblemente
succinimidil-propionato de
metoxi-polietilenglicol, con un peso molecular
entre 500 y 3000, preferiblemente 1000 y 2500 g/mol, en especial
2000 g/mol.
A continuación se sustituye con agitación
constante de la solución de hemoglobina la atmósfera de nitrógeno
durante 1 a 3 horas por oxígeno puro y se oxigena completamente la
hemoglobina.
El procesamiento se lleva a cabo como se ha
detallado anteriormente.
Las ventajas del procedimiento según la
invención se pueden resumir como sigue:
Mediante el desarrollo de la reacción según la
invención, en especial mediante el aumento de volumen de reacción
en la etapa iv) del procedimiento, se obtiene un producto que se
puede utilizar íntegramente para la preparación de portadores de
oxígeno artificiales y concretamente, aproximadamente por igual
respectivamente como aditivo sanguíneo (la fracción con la
hemoglobina reticulada de mayor grado de polimerización: fracción I)
y como sustituto de volumen sanguíneo (fracción II, con las
porciones de bajo peso molecular). La separación se puede llevar a
cabo fácilmente con procedimientos conocidos, algunos procedimientos
posibles se especifican por ejemplo en los documentos de patente
EP-A95107280 y EP-A 97100790. Los
polímeros de la fracción I, preferiblemente hasta un peso
molecular mayor de 700000 g/mol son tan suficientemente uniformes
molecularmente, que en la concentración plasmática terapéutica
deseable poseen una presión osmótica coloidal suficientemente baja.
Gracias a esta uniformidad molecular se alcaza simultáneamente una
coeficiente virial bajo, así como una escasa viscosidad. La
compatibilidad con las proteínas del plasma sanguíneo, una
compatibilidad inmune y tiempo de permanencia intravasal
suficientes así como unos efectos secundarios vasoconstrictores
suficientemente escasos, es decir, una escasa extravasación de los
polímeros de la fracción molecular I se consigue mediante un
acoplamiento covalente de poli(óxidos de alquileno).
Adicionalmente, el requisito de simplicidad y rentabilidad se tiene
en cuenta de forma decisiva en este nuevo procedimiento ya que toda
la preparación tiene lugar en un único recipiente (la llamada
preparación en un recipiente) y se consiguen altos rendimientos de
más del 70%, ascendiendo los rendimientos de polímeros con un peso
molecular mayor de 700000 g/mol a más del 15%. El procedimiento de
preparación posibilita la preparación de hemoglobinas modificadas y
reticuladas en pocas etapas de procedimiento. Los parámetros de
procedimiento elegidos conducen a este respecto a una distribución
definida de los polímeros de hemoglobina modificados, que son
adecuados como portadores de oxígeno artificiales y tienen en cuenta
las circunstancias fisiológicas en el suero sanguíneo.
Además, la cooperatividad de la hemoglobina no
reticulada se mantiene considerablemente en el producto reticulado
y la presión de semisaturación se puede ajustar de forma
adecuada.
Los portadores de oxígeno artificiales
preparados según la invención de hemoglobina reticulada son
compatibles con el plasma en administración parenteral y se pueden
aplicar clínicamente como se ha detallado.
La invención se explicará más detalladamente por
medio de los siguientes ejemplos.
A este respecto, las figuras 1-3
muestras lo siguiente:
Figura 1: una distribución ponderada en
masa de los tamaños moleculares y de los pesos moleculares (M) del
polímero de hemoglobina porcina del ejemplo 1, representada como
cromatograma de exclusión volumétrica (obtenido con gel Sephacryl
S-400 HR, Pharmacia, Friburgo, Alemania).
E_{425nm} es la extinción en el eluido de cromatografía a 425 nm.
Se incluyen los valores de abscisas de 700000 y 5000000 g/mol.
Figura 2: cromatograma para el ejemplo
de aplicación 2, para las aclaraciones véase la figura 1.
Figura 2: cromatograma para el ejemplo
de aplicación 3, para las aclaraciones véase la figura 1.
Además se aplicaron los siguientes
procedimientos de determinación:
1. Contenidos en hemoglobina: se midieron
fotométricamente con el procedimiento de cianohemiglobina modificado
según Drabkin ("Hämoglobin-Farbtest MRP 3",
Boehrimger Manheim, Alemania).
2. Valores de pH: se midieron
potenciométricamente (electrodo de vidrio de pH) con un analizador
de gases sanguíneos ("ABL 5", Radiómetro, Willich,
Alemania).
3. Se llevaron a cabo determinaciones de la
distribución de pesos moleculares de las hemoglobinas
reticuladas mediante cromatografía de exclusión volumétrica
(según: Pötzschke H. y col. (1996): "Vernetzte globuläre Proteine
- eine neue Klasse halbsynthetischer polymerer Moleküle:
Characterisierung ihrer Struktur in Lösung am Beispiel
hyperpolymeren Hämoglobins und Myoglobins mittels
Volumenausschluss-Chromatografie, Viskometrie,
Osmometrie und Lichtstreuung", Macromolecular Chemistry and
Physics 197, 1419 - 1437, así como Pötzschke H. y col.
(1996): "Ein neuartiges Verfahren zur bestimmung Molarer Massen
breit verteilter Polymerer mit Hilfe der
Gel-Chromatographie und der Viskometrie am Beispiel
Hämoglobin-Hyperpolymerer", Macromolecular
Chemistry and Physics 197, 3229 - 3250) en el gel
"Sephacryl S-400HR" (Pharmacia Bioitech,
Friburgo, Alemania).
4. Se llevaron a cabo determinaciones de las
características de unión a oxígeno de las hemoglobinas por
medio de un procedimiento y aparato propio (como se describe en:
Barnikol W.K.R. y col. (1978); "Eine verbesserte Modifikation der
Mikromethode nach Niesel und Thews zur Messung von
O_{2}-Hb-Bindungskurven in
Vollblut und konzentrierten Hb-Lösungen",
Respiration 36, 86 - 95.
5. La investigación de la compatibilidad
plasmática de hemoglobinas reticuladas se llevó a cabo por
medio de una prueba de precipitación estandarizada in vitro.
(Domack U. (1997), "Entwicklung und in vivo Evaluation
eines künstliches Sauerstoffsträgers auf Basis von
Rinderhämoglobin", Tesis doctoral, Departamento de Química,
Universidad Johannes Gutenberg, Maguncia, 1997): se mezclaron
soluciones de hemoglobina (contenidos en hemoglobina
aproximadamente 30 g/l, en una solución acuosa electrolítica (StLg)
de la composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaN_{3} 3 mM) con las
mismas cantidades de plasma humano esterilizado por filtración
recién obtenido y a continuación se añadieron respectivamente a 500
\mul de la mezcla hasta 20 \mul de ácido láctico 0,5 molar y se
mezcló, de forma que para cada derivado de hemoglobina que se iba a
investigar se dieron respectivamente valores de pH de un intervalo
entre aproximadamente 7,4 hasta 6,8. Tras una incubación de 30
minutos a temperatura ambiente y centrifugación de las muestras, se
llevó a cabo la determinación del contenido en hemoglobina como
medida de la hemoglobina no precipitada, así como el pH
correspondiente en el sobrenadante, así como el control óptico
subjetivo de precipitaciones no coloreadas de proteínas
plasmáticas.
\newpage
Ejemplo de realización
1
Hemoglobina porcina altamente pura, en una
concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica
acuosa de la composición NaHCO_{3} 50 mM y NaCl 100 mM se
desoxigenó a 4ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno puro
continuamente renovado sobre la solución. A continuación se
añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como solución 1 molar en
agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 6
horas. La solución se tituló con ácido láctico 0,5 molar hasta un
valor de pH de 7,1, se añadieron 1,1 moles de
piridoxal-5'-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 16 horas. En este momento
se ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica 0,5 molar, se
añadieron 1,1 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar
en sosa cáustica 0,01 molar) y se dejó reaccionar durante una hora.
Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar,
a continuación se añadieron 1,1 moles de
2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras
15 minutos de reacción, 8 moles de glutardialdehído por mol de
hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de
solución de hemoglobina para la reticulación de la hemoglobina
durante 5 minutos y se dejó reaccionar 2,5 horas. Tras la
titulación con sosa cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,8
siguió una adición de 15 moles de borohidruro de sodio (como
solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de
hemoglobina durante 1 hora. Siguió una adición de 2 litros de agua
por litro de solución de hemoglobina original. El valor de pH
ascendió entonces a 9,3, y siguió directamente una adición de 4
moles de succinimidil-propionato de
metoxi-polietilenglicol de 2000 g/mol de peso
molecular durante 2 horas. La atmósfera de nitrógeno sobre la
solución se sustituyó por una atmósfera de oxígeno puro.
Después de 1 hora se separaron componentes
insolubles mediante centrifugación (20000 g durante 15 minutos). A
continuación se llevó a cabo una cambio de la solución electrolítica
mediante una cromatografía de exclusión volumétrica (gel Sephadex
G-25, Pharmacia, Alemania) a una solución
electrolítica acuosa de la composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y
NaCOH_{3} 20 mM.
El rendimiento ascendió a 77%; el rendimiento
para peso molecular mayor de 700000 g/mol es de 28%.
La figura 1 muestra una representación de la
distribución de las masas moleculares de los polímeros de
hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión
volumétrica.
Las mediciones de las características de unión a
oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC, una
presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de
7,4) dieron para el producto un valor de p50 de 2,9 kPa y un valor
de n50 de 1,95.
En la "prueba de precipitación", la
hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH de
7,4 a 6,8 ninguna interacción con el plasma humano, en especial
ninguna precipitación perceptible, ni de la hemoglobina ni de las
proteínas plasmáticas.
Ejemplo de realización
2
Hemoglobina porcina altamente pura, en una
concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica
acuosa de la composición NaHCO_{3} 50 mM y NaCl 100 mM se
desoxigenó a 22ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno puro
continuamente renovado sobre la solución. A continuación se
añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como solución 1 molar en
agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 90
minutos. La solución se tituló con ácido láctico 0,5 molar hasta un
valor de pH de 7,1, se añadió 1,1 moles de
piridoxal-5'-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 2 horas. En este momento se
ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica 0,5 molar, se
añadieron1,5 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en
sosa cáustica 0,01 molar) y se dejó reaccionar durante una hora.
Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar,
a continuación se añadieron 1,1 moles de
2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras
15 minutos de reacción, 9 moles de glutardialdehído por mol de
hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de
solución de hemoglobina para la reticulación de la hemoglobina
durante 5 minutos y se dejó reaccionar 1 hora. Tras la titulación
con sosa cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,8 siguió una
adición de 10 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar
en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 0,5
horas. El valor de pH ascendió entonces a 8,7, y siguió directamente
una adición de 8 moles de succinimidil-propionato
de metoxi-polietilenglicol de 1000 g/mol de peso
molecular durante 1 hora. La atmósfera de nitrógeno sobre la
solución se sustituyó por una atmósfera de oxígeno puro.
Después de 1 hora se separaron componentes
insolubles mediante centrifugación (10 minutos a 20000 g). A
continuación se llevó a cabo una cambio de la solución
electrolítica mediante una cromatografía de exclusión volumétrica
(gel Sephadex G-25, Pharmacia, Alemania) a una
solución electrolítica acuosa de la composición NaCl 125 mM, KCl
4,5 mM y NaCOH_{3} 20 mM.
El rendimiento ascendió a 79%; el rendimiento
para peso molecular mayor de 700000 g/mol ascendió a 28%.
La figura 2 muestra una representación de la
distribución de las masas moleculares de los polímeros de
hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión
volumétrica.
Las mediciones de las características de unión a
oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC, una
presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de
7,4) dieron para el producto un valor de p50 de 2,9 kPa y un valor
de n50 de 1,96.
En la "prueba de precipitación", la
hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH de
7,4 a 6,8 ninguna interacción con el plasma humano, en especial
ninguna precipitación perceptible, ni de la hemoglobina ni de las
proteínas plasmáticas.
Ejemplo de realización
3
Hemoglobina humana altamente pura, en una
concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica
acuosa de la composición NaHCO_{3} 50 mM y NaCl 100 mM se
desoxigenó a 4ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno puro
continuamente renovado sobre la solución. A continuación se
añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como solución 1 molar en
agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 3
horas. La solución se tituló con ácido láctico 0,5 molar hasta un
valor de pH de 7,1, se añadió 1,1 moles de
piridoxal-5'-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 16 horas. En este momento
se ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica 0,5 molar, se
añadieron 1,5 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar
en sosa cáustica 0,01 molar) y se dejó reaccionar durante una hora.
Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar,
a continuación se añadieron 1,5 moles de
2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras
15 minutos de reacción, 9 moles de glutardialdehído por mol de
hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de
solución de hemoglobina para la reticulación de la hemoglobina
durante 5 minutos y se dejó reaccionar 2,5 horas. Tras la
titulación con sosa cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 8,0
siguió una adición de 10 moles de borohidruro de sodio (como
solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de
hemoglobina durante 1 hora. Siguió una adición de 2 litros de agua
por litro de solución de hemoglobina original. El valor de pH
ascendió entonces a 8,6, y siguió directamente una adición de 4
moles de succinimidil-propionato de
metoxi-polietilenglicol de 2000 g/mol de peso
molecular durante 2 horas. La atmósfera de nitrógeno sobre la
solución se sustituyó por una atmósfera de oxígeno puro. Después de
1 hora se separaron componentes insolubles mediante centrifugación
(10 minutos a 20000 g). A continuación se llevó a cabo una cambio
de la solución electrolítica mediante una cromatografía de
exclusión volumétrica (gel Sephadex G-25, Pharmacia,
Alemania) a una solución electrolítica acuosa de la composición
NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaCOH_{3} 20 mM.
La figura 3 muestra una representación de la
distribución de las masas moleculares de los polímeros de
hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión
volumétrica. El rendimiento total ascendió a 75%; el rendimiento
para peso molecular mayor de 700000 g/mol ascendió a 17%.
Las mediciones de las características de unión a
oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC, una
presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de
7,4) dieron para el producto un valor de p50 (como medida de una
afinidad media por el oxígeno) de 2,8 kPa y un valor de n50 (una
cooperatividad media aparente de los sitios de unión de oxígeno) de
1,74.
En la "prueba de precipitación", la
hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH
fisiológica y fisiopatológicamente interesante de 7,4 a 6,8 ninguna
interacción con el plasma humano, en especial ninguna precipitación
perceptible, ni de la hemoglobina ni de las proteínas
plasmáticas.
Claims (18)
1. Procedimiento para la preparación de
portadores de oxígeno artificiales de hemoglobina reticulada con
propiedades funcionales mejoradas, caracterizado porque la
hemoglobina
i) en primer lugar se desoxigena
ii) a continuación se hace reaccionar
covalentemente con un efector de la unión de oxígeno químicamente
reactivo;
iii) después la solución se mezcla con un
efector no reactivo químicamente; y después
iv) la hemoglobina se reticula entre sí
covalentemente de forma estable con glutardialdehído, bajo muy
intensa dilución de la mezcla de reacción con adición simultánea
del reticulante, a continuación la solución se diluye de nuevo con
agua, incrementándose el volumen total de la mezcla de reacción en
un factor de 2 a 10 y después de ello,
v) se acopla covalentemente un poli(óxido de
etileno),
vi) el producto obtenido se procesa de forma
conocida.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, caracterizado porque la hemoglobina es de origen porcino
o humano.
3. Procedimiento según la reivindicación
2, caracterizado porque como material de partida sirve
hemoglobina porcina.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en la etapa iv)
se añade glutardialdehído en una solución muy intensamente diluida
cronometradamente y de esa forma el volumen de la mezcla de
reacción y la concentración de hemoglobina durante la reacción de
polimerización varían simultáneamente de forma inversa y a
continuación se diluye la solución.
5. Procedimiento según la reivindicación
4, caracterizado porque en la etapa iv) se añade
glutardialdehído en una cantidad de 6 a 10 moles, en relación con
la hemoglobina monomérica, disuelto en 1 a 2 litros de agua por
litro de solución de reacción original durante 3 a 15 minutos y
reacciona 1 a 6 horas adicionales.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque a la solución
que contiene hemoglobina antes de la reacción según la etapa ii) se
le añaden 2 a 8 moles de ascorbato de sodio por mol de hemoglobina
no reticulada durante 0,5 a 6 horas.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en la etapa ii)
se une covalentemente como efector
piridoxal-5'-fosfato en una
proporción molar, en relación con la hemoglobina monomérica de 0,5
a 3, preferiblemente de 1 a 2,5 mol/mol durante 0,5 a 20 horas.
8. Procedimiento según la reivindicación
7, caracterizado porque en la etapa ii), así como en la etapa
iv) tras la unión covalente de
piridoxal-5'-fosfato a la
hemoglobina así como tras el acoplamiento covalente de la
hemoglobina con glutardialdehído se añade respectivamente
borohidruro de sodio reductor.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa
iii) se añade 2,3-difosfoglicerato en una cantidad
relativa de 0,5 a 6 moles en relación con la hemoglobina monomérica,
y se comienza de 5 a 50 minutos después la etapa iv).
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque en la etapa v)
se acopla un éster de polietilenglicol con un peso molecular de 500
a 3000 g/mol.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el producto
obtenido se separa mediante un procedimiento de separación en una
fracción de mayor peso molecular medio y un fracción de menor peso
molecular medio.
12. Procedimiento según la reivindicación
11, caracterizado porque a partir de la porción de bajo peso
molecular de los polímeros se prepara un sustituto sanguíneo
parenteral y a partir de la porción de mayor peso molecular de los
polímeros se prepara un aditivo sanguíneo parenteral.
13. Portador de oxígeno artificial,
caracterizado porque se trata de una hemoglobina conjugada
covalentemente con un efector de la unión a oxígeno así como
polimerizada con glutardialdehído y acoplada químicamente con un
derivado de poli(óxido de alquileno).
14. Portador de oxígeno artificial según
la reivindicación 13, caracterizado porque el portador
presenta un valor de n50 de 1,6 a 2,5 y un valor de p50 de 2,1 a
3,2 kPa.
15. Uso de hemoglobina reticulada según la
reivindicación 13 ó 14 para la preparación de un agente para la
aplicación por vía intravascular o biomédica como portador de
oxígeno artificial en el organismo humano o animal para el
tratamiento de estados de falta de oxígeno.
16. Uso según la reivindicación 15 para el
tratamiento de una falta de oxígeno crónica en el ser humano.
17. Uso según la reivindicación 16,
caracterizado porque el agente se usa en forma de una
preparación farmacéutica como un reemplazo de la sangre (sustituto
sanguíneo) o como un añadido a la sangre para aumentar la capacidad
de transporte de oxígeno (aditivo sanguíneo) o en órganos
individuales.
18. Uso ex vivo de hemoglobina
reticulada según la reivindicación 13 ó 14 como añadido a una
solución de alimentación o en aplicaciones biotecnológicas.
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