ES2273359T3 - Extraccion de proteina basica de mielina. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCION DE UNA PROTEINA BASICA DE MIELINA A PARTIR DE UN TEJIDO QUE CONTIENE MIELINA, COMO UN TEJIDO DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, INCLUYENDO DICHO PROCEDIMIENTO LAS ETAPAS DE: BASICA DE MIELINA A PARTIR DE UN TEJIDO QUE CONTIENE MIELINA CON UN DISOLVENTE ORGANICO SELECCIONADO ENTRE EL GRUPO FORMADO POR EL CLOROFORMO Y LOS COMPUESTOS QUE POSEEN UNA POLARIDAD PARECIDA A LA DEL CLOROFORMO; PRESENCIA DE UN ALCOHOL ALIFATICO INFERIOR O PROPILENGLICOL; ALCOHOL ALIFATICO INFERIOR/DISOLVENTE ORGANICO, HASTA UNA FASE ACUOSA CON LA AYUDA DE IONES HIDROGENO (PROTONES), Y; RACION DE LA PROTEINA BASICA DE MIELINA PURIFICADA. LA INVENCION TAMBIEN TRATA DEL PRODUCTO QUE SE PUEDE OBTENER MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO.
Description
Extracción de proteína básica de mielina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de extracción de proteína básica de mielina partiendo
de un tejido que contiene mielina, tal como tejido de sistema
nervioso central, cuyo procedimiento produce proteína básica de
mielina altamente purificada en un período de tiempo corto. El
producto de proteína recuperado incluye también, además de las
isoformas principales de proteína básica de mielina, varias
isoformas menores que no se obtienen generalmente mediante otros
métodos (Mastronardi, G. G. et al., J. Neurochem. (1993) 60,
153-160).
La mielina es una estructura membranosa
constituida por multitud de laminillas que circunda y aísla
eléctricamente los axones facilitando la conducción de los impulsos
neuronales. Esta estructura elaborada es sintetizada y ensamblada
por los oligodendrocitos del sistema nervioso central (SNC) y por
las células de Schwann del sistema nervioso periférico (SNP) (de
Ferra, F. et al., Cell 43, Parte 2, (1985)
721-727; Nakajima, K. et al., J.
Neurochemistry, 60 (1993) 1554-1563). La
proteína básica de mielina (MBP) es uno de los constituyentes
principales de la mielina del sistema nervioso central, dado que
constituye, aproximadamente, el 30% de sus proteínas de
mielina.
Se sabe que la MBP del ratón posee al menos
cuatro isoformas como proteínas traducidas (Barbarese, E. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
3360-3364). Los pesos moleculares de estas proteínas
son 21,5, 18,5, 17 y 14 kDa. Recientemente han sido indicados mRNAs
separados de 21,5, 20,2, 18,5, 17 (dos isoformas), una isoforma
entre 17 y 14 kDa y otra por debajo de 14 kDa (véase la Figura 3 de
la referencia bibliográfica de Nakajima, K. et al.,
ibid.)
La encefalomielitis alérgica experimental (EAE)
es un modelo en animal ampliamente utilizado para la esclerosis
múltiple (MS), en la que la MBP es considerada como un autoantígeno
putativo. La EAE puede ser inducida en roedores inmunizando los
animales con MBP en el seno de adyuvante fuerte. Por otra parte, se
sabe que la administración oral de MBP pura permite a animales la
inhibición de la inducción de EAE por MPB (Miller, A. et al.,
FASEB, 5 (1991) 2569-2566; Miller, A.. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 (1992)
421-425). En EE.UU. están en curso ensayos en los
que MBP bovina se administra por vía oral a pacientes de MS (Weiner
y Hafler, sin publicar). Además, la MBP puede estar involucrada en
la patogénesis de otras afecciones neurológicas (Carnegie P. R. y
Moore, Proteins of the Nervous System, Raven Press (1980) 2ª ed.
páginas 119-143).
Varios métodos de purificación de MBP han sido
establecidos. La mayor parte de ellos se basan en la extracción
primaria de lípidos desde el tejido cerebral con la separación
subsiguiente de la isoforma principal o las isoformas principales de
proteína básica de mielina desde otros componentes solubles en
tampones acuosos (Deibler G. E. et al., Prep. Biochem., 2
(1971) 139-165; Eylar E. H. et al., Methods
Enzymol., 32 (1974) 323-341; Bellini, T. et
al., J. Neurochemistry, 46 (1986) 1644-1646;
Giegerich, G. et al., J. Chromatogr., 528 (1990)
79-90). También ha sido indicada la extracción
utilizando detergentes (Riccio, P. et al., Mol. Chem.
Neuropathol., 13 (1990) 185-194). Los
detergentes, en general, inhiben los ensayos inmunológicos. Es común
a todos los métodos el que éstos incluyen múltiples etapas de
extracción de lípidos, seguidas de separaciones de las proteínas
restantes empleando diferentes etapas cromatográficas. Estas etapas
tardan tiempo en realizarse y, por tanto, exponen a la MBP a
degradación proteolítica, que se sabe es activa en el tejido de
sistema nervioso central debido a la alta actividad de proteasas
neutras y ácidas.
Los procedimientos más ampliamente utilizados
(Eylar, E. H. et al., ibid.; Deibler, G. E. et al.,
ibid.) comienzan con la extracción del tejido que contiene MBP
con una mezcla de cloroformo-metanol, que origina
MBP soluble en agua. Por tanto, la MBP se encuentra entre una
diversidad de otras proteínas del SNC, desde las que ha de
ser
separada.
separada.
En un procedimiento de purificación conocido, la
MBP fue purificada a partir del material insoluble procedente de
tejido de SNC tratado con cloroformo-metanol y
acetona, o mielina aislada con gradiente de sacarosa desde cerebro o
médula espinal de la rata. Los restos de los tratamientos con
disolventes o mielina purificada, fueron lavados con agua de pH 3,0
y la MBP se extrajo desde el residuo con HCl 0,1 M (Martenson, R.E.,
J. Biol. Chem. 244 (16) (1969) 4268-4272).
Este estudio confirmó las observaciones previas de que la MBP de la
rata consiste en múltiples formas electroforéticas.
En otro procedimiento operatorio de purificación
de MBP conocido, extractos de cerebro canino y porcino fueron
tratados de modo sucesivo con cloroformo-metanol
(2:1 v/v), acetona, y agua desionizada (Pitts, O. M. et al.,
Prep-Biochem. (USA), 06 (04) (1976)
239-164). Este tratamiento fue seguido de
precipitación del extracto a pH 9,0 y filtración sobre gel del
sobrenadante en ácido clorhídrico diluido.
Ninguno de estos procedimientos citados, da por
resultado la purificación simultánea de diferentes isoformas de MBP
del cerebro, como lo hace el procedimiento de la presente invención.
Algunas de estas isoformas están involucradas, como autoantígenos
potenciales, en la esclerosis múltiple (MS) (Voskuhl, R.R. et
al., J. Neuroimmunology, 42 (1993) 187-192;
Voskuhl, R.R. et al., J. Immunology, 153 (1994)
4834-4844).
Según la presente invención, ha sido
desarrollado un procedimiento operatorio de extracción sencillo que
produce MBP altamente purificada en un tiempo corto. La proteína
obtenida como producto según el procedimiento incluye también,
además de las isoformas de MBP principales, varias proteínas básicas
de mielina isofórmicas menores que no se obtienen generalmente
mediante los procedimientos anteriores. Además, isoformas solamente
pronosticadas sobre la base de la presencia de mRNA en el tejido del
sistema nervioso central (Nakajima, K. et al., J.
Neurochemistry, 60 (1993) 1554-1563) pueden ser
detectadas en la proteína básica de mielina preparada según la
presente invención cuando se lleva a cabo el análisis con un
antisuero específico.
El objeto de la presente invención es, por
tanto, un procedimiento de extracción de proteína básica de mielina
partiendo de un tejido que contiene mielina, tal como tejido del
sistema nervioso central, cuyo procedimiento comprende las etapas
siguientes:
- extracción de la proteína básica de mielina
desde el tejido que contiene mielina, con un disolvente orgánico
seleccionado entre el grupo que consiste en cloroformo y compuestos
que poseen una polaridad similar a la del cloroformo;
- incubación de la fase orgánica en presencia de
un alcohol alifático inferior o propilenglicol;
- transferencia de la proteína básica de mielina
desde la fase orgánica a una fase acuosa por medio de iones
hidrógeno (protones); y
- recuperación de las proteínas básicas de
mielina purificadas.
En las figuras que se acompañan, las tinciones
con colorante coomassie fueron efectuadas a minigeles de
SDS-PAGE de 0,75 mm de grosor cuando al usar como
muestra una cantidad de 4 \mug de proteínas, según el análisis de
Bradford. Geles similares fueron empleados para realizar análisis de
inmunotransferencia. Las proteínas fueron electrotransferidas a
filtros de nitrocelulosa. Se usó como anticuerpo primario suero
policlonal de MBP anti-cobaya, producido en el
conejo mediante MBP de cobaya purificada mediante el método de Eylar
et al. (1971, ibid.). Se usó como anticuerpo
secundario conjugado de IgG de cabra anti-conejo,
conjugada a peroxidasa de rábano picante. Las reacciones
inmunitarias fueron visualizadas mediante quimiluminiscencia
intensificada (Amersham).
La Figura 1 muestra en A) la tinción con
colorante coomassie del producto final de proteína básica de mielina
procedente de diversas especies y en B) y C) la inmunotransferencia
de un gel similar (15 segundos y 40 segundos de exposiciones durante
la quimiluminiscencia intensificada, respectivamente).
Calle 1. Marcador promega de peso molecular
bajo; calle 2, MBP bovina; calle 3, MBP humana; calle 4, MBP
porcina; calle 5, MBP de conejo; calle 6, MBP de pollo; calle 7, MBP
de cobaya; calle 8, MBP de rata; calle 9, MBP de ratón; calle 10,
MBP de pez (Lota lota).
Figura 2: Isoformas de MBP visualizadas por
tinción con colorante coomassie (A) o inmunotransferencia detectada
con quimiluminiscencia intensificada (B). Calle st, marcador promega
de peso molecular de gama media; calle 1, homogeneizado de cerebro
de ratón (500 \mug); calle 2, MBP procedente de cerebro de ratón
(8 \mug); calle 3, homogeneizado de médula espinal (500 \mug);
calle 4, MBP procedente de médula espinal de ratón (5 \mug). Los
elementos exónicos en mRNAs que corresponden a las distintas
isoformas, han sido extraídos según Nakajima et al., (1993).
Ha de apreciarse que la movilidad relativa de las MBPs es reducida
en comparación con proteínas estándar de dimensiones similares.
En la Figura 3, se presentan los resultados de
espectrometría de masas con desorción láser asistida con matriz
(LASERMAT) para A) MBP del ratón y B) MBP humana. El análisis se
llevó a cabo en un aparato Finnigan-MAT usando 100
pmol de muestra de proteína mezclada en ácido sinapínico. Para la
MBP humana, es visible también el pico m+2H^{+} (9,3 kDa).
La Figura 4 muestra el análisis por
SDS-PAGE de grado peptídico del producto . El
análisis se llevó a cabo para MBP humana y del ratón mediante un
instrumento Phast System de Pharmacia. A) tinción con colorante
coomassie, B: análisis de inmunotransferencia. Calle 1, MBP humana;
calle 2, MBP del ratón; calle 3, MBP del cobaya digerida
parcialmente mediante trombina. Las dos bandas principales de
producto obtenido por digestión con trombina tienen pesos
moleculares de 10,5 kDa y 8 kDa. Empleando una iluminación de 3 min
en la detección por reacción de quimiluminiscencia (Amersham), no
pudieron observarse productos de degradación de bajo peso molecular
capaces de tinción o inmunorreactivos.
Figura 5. Efecto del lavado de la fase orgánica
con agua neutra. A: tinción con colorante coomassie, B: análisis de
inmunotransferencia. Calle 1, fase de agua de lavado; calle 2,
producto final cuando la fase orgánica se lavó con agua neutra;
calle 3, producto final sin lavar. Las proteínas lavadas
constituyen, aproximadamente, el 2-5% de las
proteínas existentes en la fase orgánica.
Figura 6: Estabilidad del producto. Calle 1,
producto liofilizado congelado; calle 2, producto mantenido una
semana en solución acuosa a temperatura ambiente; calle 3, producto
mantenido una semana a +4ºC. Todas las muestras de MBP fueron
obtenidas de cerebro porcino.
Figura 7. Productos de MBP preparados partiendo
de cerebro de ratón mantenido a +4ºC, post mortem. Calle 1,
cerebro recién obtenido; calle 2, incubación de 4 horas; calle 3,
incubación de 1 día; calle 4, incubación de 4 días; calle 5,
incubación de 8 días.
El procedimiento según la invención está basado
en la extracción de un tejido que contiene mielina tal como tejido
cerebral, con un exceso de disolvente orgánico. Así, las isoformas
de la proteína básica de mielina son transferidas casi
exclusivamente al disolvente orgánico.
Mediante la expresión "tejido que contiene
mielina" se entiende uno tal como el del sistema nervioso central
y el sistema nervioso periférico. El tejido puede ser recién
obtenido o congelado.
La expresión "disolvente orgánico"
significa en este contexto, un disolvente orgánico que posee una
polaridad similar a la del cloroformo (E^{2}: Al_{2}O_{3} =
0,38-0,42), tal como cloroformo, cloruro de metileno
y éter dietílico.
La proporción de disolvente orgánico a tejido no
es crítica, pero un intervalo preferido es el de 3 a 8 ml de
disolvente orgánico por 1 g de tejido que contiene mielina. En una
realización preferida, se utiliza cloroformo en una proporción de un
total de 7,5 ml de disolvente - en tandas de 5 ml y 2,5 ml - por 1 g
de tejido que contiene mielina. Esto significa que por cada mg de
proteína básica de mielina pura se emplea, aproximadamente, 1, 5 ml
(médula espinal) a 5 ml (cerebro congelado) de disolvente orgánico.
Análisis preliminares muestran que el disolvente orgánico puede ser
reciclado, es decir, la fracción de disolvente orgánico que ha sido
utilizado ya para extraer proteínas básicas de mielina, puede ser
empleado para extraer más de ella procedente de otra muestra de
tejido que contiene mielina. Después de la extracción, la fase
orgánica se lava preferiblemente con agua neutra, con objeto de
separar las proteínas solubles a pH neutro. Tales proteínas
constituyen, en general, aproximadamente 2 a 5% de las proteínas
transportadas en la fase orgánica.
En la siguiente etapa del procedimiento, las
isoformas de la proteína básica de mielina extraídas en el
disolvente orgánico son hechas solubles en agua. Esto se efectúa
usando un alcohol alifático inferior o propilenglicol, y iones
hidrógeno. La fase orgánica se incuba a temperatura ambiente en
presencia de un alcohol alifático inferior o propilenglicol. La
proporción preferida de alcohol alifático inferior o de
propilenglicol es 1 ml por 2 ml de disolvente orgánico que contiene
proteína básica de mielina. Esta etapa es esencial para hacer que la
proteína básica de mielina existente en la fase orgánica, pueda ser
transferida a la fase acuosa.
En este contexto, mediante la expresión
"alcohol alifático inferior" se entienden los alcoholes
siguientes:
| Alcohol | Rendimiento |
| Metanol | +++ |
| Etanol | +++ |
| Propanol | +++ |
| 2-Propanol | +++ |
| Butanol | ++ |
| 2-Butanol | ++ |
| Alcohol iso-amílico | + |
| Alcohol terc-amílico | ++ |
Además, el rendimiento obtenido con
propilenglicol es comparable al obtenido con el metanol.
Después de incubar con alcohol alifático
inferior/propilenglicol, las isoformas de proteína básica de mielina
son transferidas cuantitativamente desde la mezcla de disolvente
orgánico y alcohol alifático inferior/propilenglicol, a agua ácida,
que se utiliza preferiblemente en la proporción de 1 ml de agua por
6 ml de mezcla de disolvente orgánico y alcohol alifático
inferior/propilenglicol. Se utilizan iones hidrógeno (protones) para
llevar las proteínas básicas de mielina a la fase acuosa, mediante
acidificación de la fase acuosa con, por ejemplo, ácido
clorhídrico. En tanto en cuanto el disolvente orgánico que contiene
proteína básica de mielina posea capacidad de tamponamiento para que
el pH de la fase acuosa acidificada se eleve al mezclarlo con la
mezcla de disolvente orgánico y alcohol alifático
inferior/propilenglicol, más proteína básica de mielina puede ser
transferida desde la mezcla de disolvente orgánico y alcohol
alifático inferior/propilenglicol a la fase acuosa. El pH se
mantiene, preferiblemente, en 2 aproximadamente. Desde la fase
acuosa obtenida de este modo se recuperan las proteínas básicas de
mielina. Esto puede tener lugar, por ejemplo, liofilizando el
producto dos veces o mediante filtración sobre gel y liofilización.
Según una realización preferida, el producto es sometido a
filtración sobre gel y liofilizado.
Durante el procedimiento de purificación de la
presente invención, la proteína básica de mielina, lo más
probablemente, se coloca por sí misma, inmediatamente, en la fase
orgánica. Esto da como resultado el que el grado de posible
proteólisis de la proteína básica de mielina se reduce al
mínimo.
Aun cuando todavía se desconoce si la proteína
básica de mielina se encuentra presente en el disolvente orgánico en
forma soluble, o en la forma de micelas asociadas a lípidos, los
inventores han indicado por cromatografía en capa fina, que la
proteína básica de mielina está unida a lípidos en el preparado
liofilizado. Se desconoce la naturaleza de este (estos)
lípido(s).
La invención será descrita ahora con más detalle
seguidamente por medio de un ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3,08 g de cerebro de ratón congelado, se
homogeneizaron en 15 ml de cloroformo, a temperatura ambiente (RT)
con un homogeneizador Omni-Mixer 17220 de Sorvall
empleando cuatro series de 30 segundos a velocidad total,
intervenidos pos pausas de 30 segundos para evitar el calentamiento
en exceso. Se separó la fase orgánica de los restos de tejido y
fluido intracelular/citosólico por centrifugación 5 min 4500 rpm, a
temperatura ambiente, con un rotor Sorvall SA-600.
Se desechó el fluido intracelular/citosólico y el residuo se volvió
a extraer con 7,5 ml de cloroformo usando dos series de impulsos en
el homogeneizador, y la fase orgánica se separó como antes. Las
fracciones de cloroformo fueron reunidas y se midió el volumen que
era 18,2 ml.
La fase orgánica se lavó en un tubo cónico de 50
ml añadiendo 4,5 ml de agua neutra y agitando con formación de
vórtice durante 15 segundos. La fase acuosa se separó mediante
centrifugación durante 5 minutos a 2000 rpm con un rotor Sorvall
H5094, a temperatura ambiente. La fase acuosa se separó
cuidadosamente desde la la parte superior de la fase orgánica.
A la fase clorofórmica se añadió 9 ml de metanol
y la mezcla se sometió a agitación con formación de vórtice durante
30 segundos. Luego se añadieron 4,5 ml de agua y 120 \mul de HCl
1M. La mezcla se agitó con formación de vórtice y el pH de la fase
acuosa que se separó se comprobó periódicamente mediante papel de pH
Acilit (Merck). A medida que el pH subía durante la agitación con
formación de vórtice, se añadía más HCl 1M. Después de añadir 140
\mul de HCl 1M, el pH de la fase acuosa permaneció en
1,5-2,0.
La fase acuosa ácida se separó de la fase
orgánica mediante centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm con
un rotor Sorvall H5094, a temperatura ambiente. Se recuperaron en
total 9 ml de fase acuosa ácida, se concentraron hasta 3 ml en un
concentrador en vacío Rotavapor de Büchi, se filtró sobre gel en una
columna PD-10 de Pharmacia y se liofilizó. El
producto final apareció como un polvo blanco y el rendimiento total
de proteína fue 4,3 mg, de conformidad con el análisis de
Bradford.
Utilizando muestras de 4 \mug de proteína
procedente de diversas especies, todas las proteínas visibles en la
electroforesis en SDS-PAGE de 0,75 mm de grosor,
teñidas con colorante coomassie, reaccionan con el antisuero
policlonal específico de proteínas básicas de mielina. El suero fue
producido en conejos por inmunización con proteína básica de mielina
de cobaya purificada mediante el método de Eylar et al.
(1974).
Bandas inmunorreactivas correspondientes a casi
todas las isoformas pronosticadas para el ratón mediante análisis
del mRNA, pero no analizadas para otras especies, pudieron ser
detectadas en todas las muestras de proteína básica de mielina de
mamífero ensayadas (Véase la Figura 1 A, B y C y la Tabla 1).
Además, se detectaron también bandas inmunorreactivas que no son
visibles en la tinción con colorante coomassie pero cuyo tamaño está
de acuerdo con el tamaño de las isoformas de proteína básica de
mielina pronosticado, determinado mediante análisis del mRNA (Véase
la Figura 1 y la Tabla 1).
Todas las isoformas de MBP detectadas en
homogeneizados de cerebro y de médula espinal, estaban presentes
también en el producto final (Figura 2).
La preparación final de proteína básica de
mielina es fácilmente soluble en disolventes acuosos tales como agua
destilada y solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de
dos liofilizaciones o de filtración sobre gel y liofilización, la
proteína aparece en forma de un polvo blanco. No se detectaron
proteínas contaminantes por tinción con colorante coomassie,
cromatografía líquida de alta resolución de fase invertida
(RP-HPLC),o análisis de inmunotransferencia. El
análisis de pesos moleculares mediante espectrometría de masas con
desorción láser, ayudada por matriz, (LASERMAT) de las preparaciones
de proteínas básicas de mielina procedentes del hombre y del ratón,
mostraron que al menos los pesos moleculares de las isoformas
principales (solamente los pesos de las isoformas principales podían
medirse por LASERMAT) correspondían a los pronosticados por los
mRNAs, lo que confirma que al menos esas isoformas no están
degradadas (véase la Figura 3). El análisis por
SDS-PAGE de grado de péptidos mediante el Sistema
Phasy de Pharmacia, no reveló bandas por debajo de 10 kDa
aproximadamente, lo que apoya, además, el que las proteínas
obtenidas como producto están intactas (Véase la Figura 4). Asimismo
una digestión parcial con trombina (Law, M.J., et al., J.
Neurochem., 42 (1984) 559-568) de la preparación
de proteína básica de mielina, da por resultado el esquema típico de
péptidos.
La importancia del lavado de la fase orgánica
con agua neutra, no está claro ya que no pudo demostrarse diferencia
en el contenido de proteína del producto final, tanto si la fase
orgánica se lava como si nó. No obstante, cantidades menores de
proteínas no afines a las proteína básicas de mielina pudieron
apreciarse en la fase acuosa empleada para lavar la fase orgánica
(Véase la Figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Un gramo de cerebro de reciente obtención
proporciona, aproximadamente, 1,5 (cerebro congelado) a 5 miligramos
(médula espinal), de una mezcla de isoformas de proteína básica de
mielina altamente purificada. El rendimiento es del mismo orden que
el obtenido por otros métodos publicados (véase la Tabla 2).
La extracción de proteína básica de mielina
parece actuar igualmente con todas las especies ensayadas (véase la
Fig. 1 y la Tabla 1), y ambos tejidos, el cerebro y la médula
espinal (Figura 2), son materias primas adecuadas para la
purificación de proteína básica de mielina procedente del sistema
nervioso central. El método es adecuado también para la purificación
de proteína básica de mielina procedente del sistema nervioso
periférico.
\vskip1.000000\baselineskip
La especie mejor caracterizada para la expresión
de mRNA de proteína básica de mielina, es el ratón. Los RNAs
mensajeros detectados de la proteína básica de mielina del ratón
codifican polipéptidos de 13,0, 14,2, 16,0, 17 (dos isoformas),
18,5, 20,2 y 21,5 kDa (deFerra, F. et al., 1985,
ibid.; Nakajima, K. et al., 1993, ibid.). Una
proteína que corresponde a las isoformas de proteína básica de
mielina de 21,5 kDa y 16 kDa está presente en preparaciones
procedentes de todas las especies, excepto el pez. Para el ser
humano, la isoforma de 21,5 kDa, detectada ahora en el preparado
purificado por inmunorreacción (Figura 1C, calle 3), solamente ha
sido pronosticada mediante análisis del mRNA procedente de
mielinación y remielinación de tejido cerebral (Kamholz, J. et
al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
4962-4966). La isoforma de 16 kDa presente también
en el preparado de proteína básica de mielina humana no había sido
pronosticada -según la bibliografía- para el ser humano por análisis
del mRNA. Estas isoformas contienen una secuencia de aminoácidos
codificada por el exón-2 del gen de la proteína
básica de mielina. Esta región de la MBP ha mostrado ser reconocida
por líneas de células T específicas de proteína básica de mielina,
procedentes de pacientes con MS (Voskuhl, R. R. et al.,
(1993), ibid.) siendo posiblemente, por tanto, de importancia
fundamental cuando son planificados tratamientos de administración
de proteína básica de mielina a pacientes de MS. Estas isoformas que
contienen exón-2 estaban presente en cantidades
sustanciales en preparados de proteína básica de mielina porcina y
bovina - especies adecuadas como fuente purificación a gran escala
de proteínas básicas de
mielina.
mielina.
La banda de 14,2 kDa, que representa el
polipéptido principal de la MBP del ratón y de la MBP de la rata,
estaba presente también en todas las otras especies. RNA mensajero
que codifica una isoforma de aproximadamente 13 kDa, fue detectada
recientemente para mMBP (Mathisen, P. M., et al., (1993)
Proc. Natl. Aca. Sci. USA 90, 10125-10129).
Una proteína de tamaño correspondiente, fue reconocida por el
antisuero específico para MBP en muestras extraídas del ratón y de
la rata y débilmente, también, en otras especies de mamíferos
después de prolongada exposición
(Fig. 1C).
(Fig. 1C).
Adicionalmente, en rMBP y mMBP un polipéptido de
aproximadamente 10 kDa. se hizo visible en inmunorreacción (Fig. 1C,
calles 8, 9).
\vskip1.000000\baselineskip
El preparado de proteína básica de mielina es
estable como polvo, a -20ºC, durante dos años por lo menos. En
solución acuosa, después de almacenamiento durante una semana al
temperatura ambiente o a +4ºC, no se observó degradación por tinción
con colorante coomassie ni inmunodetección (Figura 6). La
estabilidad puede resultar de selectividad alta en la transferencia
de proteínas básicas de mielina a la fase orgánica y después a la
fase acuosa, y del efecto de desnaturalización de las proteasas por
el cloroformo y el pH ácido.
Los inventores han descubierto que las proteínas
básicas de mielina pueden ser extraídas, todavía, en cantidades
sustanciales a partir de cerebro mantenido durante una semana a +4ºC
(véase la Figura 7). Por consiguiente, no es necesario disponer de
una cadena de congelación profunda, costosa, para la manipulación y
el transporte de la materia prima. Una vez congelado y descongelado
el tejido, los rendimientos de proteína de mielina disminuyen
apreciablemente.
A escala de laboratorio, lo que significa en
este contexto purificación de proteína básica de mielina partiendo
de 100 mg a 100 g de tejido de SNC, el tiempo requerido desde el
comienzo de la purificación desde el tejido hasta la obtención de un
preparado listo para su liofilización, es, aproximadamente, tres
horas. Este tiempo es notablemente más rápido en comparación con el
tiempo de un día cuando se usa el método más corto publicado
(Bellini et al., ibid.) y con el de 5 días por los
métodos comúnmente utilizados de Deibler G. E. et al., (1971)
y Eylar E. H. et al., (1974).
Hasta aquí se ha indicado que el método actúa
para pequeñas muestras de tejido de 100 mg hasta escala de
laboratorio preparativa empleando 100 g de tejido como material de
partida. No hay razón alguna que inhiba la adopción del método para
uso a escala industrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha puesto de manifiesto que el producto de
proteína de mielina actúa como sustrato de proteína quinasas, uno de
los usos potenciales de las proteínas básicas de mielina (Yang, S.D.
et al., J. Biol. Chem., 269 (1994)
29855-29859; Moriyama, T., et al., FEBS
Lett., 353 (1994) 305-308). Además, los
inventores han indicado que este producto de proteína básica de
mielina puede ser utilizado en inmunoensayos de mancha (immunospot)
y en ensayos de proliferación de células T, para la detección de la
presencia de linfocitos T específicos de antígenos. Se ha puesto de
manifiesto que el producto de proteína básica de mielina era
efectivo también en la inducción de EAE en ratones SJL.
De conformidad con lo anteriormente citado, el
producto de proteína básica de mielina de la presente invención,
puede ser usado para estudios inmunológicos que tienen por objeto el
conocimiento de la patogénesis de enfermedades inflamatorias de
desmielinación, tales como la esclerosis múltiple, en el hombre, y
probablemente, el desarrollo de tratamientos de estas enfermedades
mediante administración oral.
\vskip1.000000\baselineskip
| Peso molecular, kDa. | ||||||||
| Especie | 21,5 | 20,2 | 18,5 | 17,2* | 16,0 | 14,2 | 13 | 10 |
| Ratón | ++ | + | +++ | +++ | ++ | ++++ | +++ | + |
| Rata | ++ | + | +++ | +++ | ++ | ++++ | +++ | ++ |
| Cobaya | ++ | + | ++++ | + | + | + | + | - |
| Conejo | + | - | ++++ | + | + | + | + | - |
| Pollo | - | - | ++++ | ++ | ++ | +++ | ^{o} | |
| Humana | + | - | ++++ | +++ | +++ | ++ | + | - |
| Bovina | +++ | + | ++++ | +++ | ++ | + | + | - |
| Porcina | +++ | + | ++++ | +++ | ++ | |||
| Pez^{#} | - | - | - | - | - | ++++ | +++ | - |
| * La forma de 17,2 kDa consiste en dos formas que emigran muy juntas | ||||||||
| ^{#} \begin{minipage}[t]{155mm} La forma de 14,0 kDa apareció como duplicada y una banda de aproximadamente 10 kDa fue visible en la tinción con colorante coomassie pero no en inmunotransferencia (véase la Fig. 1).\end{minipage} | ||||||||
| ^{o} \begin{minipage}[t]{155mm} Banda visible en la tinción con colorante coomassie, pero no reconocida por el suero policlonal de MBP anti-cobaya.\end{minipage} | ||||||||
| \begin{minipage}[t]{155mm} (-) no detectada; (+) visible en inmunotransferencia después de exposición extendida; (++) visible en inmunotransferencia pero no en la tinción con colorante coomassie; (+++) visible tanto en tinción con colorante coomassie como con inmunotinción; (++++) tinción fuerte con colorante coomassie e inmunotinción\end{minipage} |
\newpage
| Método | Rendimiento (mg/g) | Tiempo | Origen |
| Presente invención | 2,8 | 3 h | cerebro porcino recién obtenido |
| 1,4 | 3 h | cerebro porcino congelado | |
| 1,4 | 3 h | cerebro de ratón congelado | |
| 5,5 | 3 h | médula espinal de ratón congelada | |
| Bellini et al., | 6,7 | 1 d | materia blanca bovina recién obtenida |
| Deibler et al., | 1,83 | 5 d | cerebro de cobaya congelado |
| 5,56 | 5 d | médula espinal de cobaya congelada | |
| Giegerich et al., | 1,65 | 2 d | cerebro humano congelado |
Claims (7)
1. Un procedimiento de purificación simultánea
de todas las isoformas de proteína básica de mielina desde un tejido
que contiene mielina, caracterizado por las etapas de:
- extracción de la proteína básica de mielina
desde el tejido que contiene mielina, con exceso de un disolvente
orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en cloroformo y
disolventes orgánicos que poseen una polaridad similar a la del
cloroformo, dentro del intervalo de polaridad de
E^{2}:Al_{2}O_{3} = 0,38-0,42;
- lavado de la fase orgánica con agua
neutra;
- incubación de la fase orgánica en presencia de
un alcohol alifático inferior o propilenglicol;
- adición de agua ácida para transferir
cuantitativamente a una fase acuosa la proteína básica de mielina
desde la mezcla del alcohol alifático inferior o el propilenglicol y
el disolvente orgánico; y
- recuperación de la proteína básica de mielina
purificada.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el tejido que contiene mielina es tejido de sistema
nervioso central.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que el tejido que contiene mielina es recién obtenido o
congelado.
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la extracción desde el tejido que contiene mielina se
lleva a cabo con éter dietílico o un alcano inferior clorado,
preferiblemente con cloroformo o cloruro de metileno.
5. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el alcohol alifático inferior es metanol o
2-propanol.
6. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la extracción, incubación y transferencia de fase tiene
lugar a temperatura ambiente.
7. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la recuperación de la proteína básica purificada se lleva
a cabo por liofilización, preferiblemente doble, o por filtración
sobre gel.
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