IT202000010888A1 - Nanovescicole di mielina e loro impieghi - Google Patents
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Description
NANOVESCICOLE DI MIELINA E LORO IMPIEGHI
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
L?invenzione concerne nanovescicole di mielina e loro impieghi nel trattamento di patologie demielinizzanti e neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC) e periferico (SNP). Sotto un altro aspetto vengono descritti procedimenti per la preparazione di nanovescicole di mielina aventi particolari caratteristiche che le rendono adatte: al recupero della guaina di mielina laddove ? compromessa, come sistema di rilascio di farmaci al SNC o SNP e all?immunotolleranza.
STATO DELLA TECNICA
Le malattie demielinizzanti formano un ampio gruppo di patologie caratterizzate da una compromissione della mielina che avvolge le cellule nervose. Gli assoni demielinizzati sono sensibili a danni, degenerazione e morte con disabilit? devastanti. La genetica, gli agenti infettivi, le reazioni autoimmuni e altri fattori sconosciuti possono causare le malattie demielinizzanti.
La sclerosi multipla (SM) ? una malattia demielinizzante e neurodegenerativa che colpisce il sistema nervoso centrale, caratterizzata da una reazione anomala delle difese immunitarie.
Il processo infiammatorio, scatenato dal sistema immunitario, pu? danneggiare la mielina (guaina che circonda e isola le fibre nervose). Questo processo, detto demielinizzazione, pu? provocare aree di perdita o lesione della mielina, che vengono definite placche. Le placche possono evolvere da una fase infiammatoria iniziale a una fase cronica, in cui assumono caratteristiche simili a cicatrici (dette sclerosi).
Altre malattie demielinizzanti sono l?encefalomielite acuta disseminata, l?adrenoleucodistrofia e l?adrenomieloneuropatia, la neuropatia ottica ereditaria di Leber. Il processo di rimielinizzazione comporta la ricostruzione dello strato di mielina attorno agli assoni danneggiati. Non sono ancora noti trattamenti volti a promuovere la riparazione della mielina di neuroni e fibre nervose e la sua ricostituzione, prevenendo cos? la conseguente neurodegenerazione. Recenti ricerche nel campo della rimielinizzazione si sono concentrate principalmente sul reinserimento di farmaci gi? approvati per altre patologie dalla Food and Drug Administration e dall'Agenzia europea della medicina. D'altra parte, agenti emergenti come i mAbs opicinumab e GNbAC1 si rivolgono a percorsi completamente nuovi e non convenzionali. Alcuni di essi sono gi? stati testati in studi clinici in cui sono stati trovati esercitare effetti benefici sulla rimielinizzazione e sulla neuroregenerazione/neuroprotezione. [Kremer et al., 2019, Cadavid et al., 2019].
Inoltre la risposta autoimmunitaria che porta alla distruzione della mielina, responsabile della sclerosi multipla, potrebbe essere fortemente contenuta grazie a una terapia che insegna al sistema immunitario a riconoscere come "amici" gli antigeni che scatenano la risposta. Il primo passo per arrivare a questo tipo di cura consiste nell'individuare gli antigeni bersaglio, cio? le proteine che scatenano l'immunit? autoreattiva. Questi antigeni non sono ancora tutti noti con certezza. Studi di tolleranza con peptidi mielinici nella SM hanno dimostrato essere sicuri e in grado di indurre risposte immunomodulanti [Lutterotti A, et al. 2013]. (Vedi anche: https://bit.ly/2W3u6H0 e https://bit.ly/2W2kufS). Recentemente, vescicole o nanoparticelle sono state proposte come uno strumento prezioso per il rilascio (delivery) di farmaci per patologie che coinvolgono il sistema nervoso centrale a causa della loro capacit? di superare la barriera ematoencefalica [Picone et al., 2016 e 2018] e i problemi relativi alle terapie comuni [Croese et al., 2018; Casella et al., 2018]. Rispetto ai metodi tradizionali, i sistemi di somministrazione di farmaci presentano numerosi vantaggi; infatti, sono in grado di consegnare selettivamente il farmaco in un sito specifico, proteggerlo dalla degradazione, controllarne il rilascio, evitare gli effetti collaterali sistemici avversi e se opportunamente progettati attraversare le barriere biologiche [Picone et al., 2016]. Tutti questi vantaggi consentono una riduzione delle dosi e della frequenza della somministrazione della terapia con una maggiore compliance dei pazienti. Tuttavia, l'uso di nano-carrier/ vescicole caricati o no con farmaci, adatti alla riparazione della mielina non sono ancora presenti nel panorama della medicina.
Scopo della presente invenzione ? pertanto quello di fornire un trattamento efficace per promuovere da un lato la riparazione dei neuroni e delle fibre nervose, mediante la ricostituzione della guaina mielinica, portando ad un recupero delle funzioni perse e la riduzione della disabilit? risultante. Dall?altro lato ? quello di fornire un trattamento efficace per il rilascio di farmaci al CNS e per lo sviluppo dell?immunotolleranza.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
L?invenzione concerne nanovescicole di mielina aventi un diametro medio nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV, in cui dette nanovescicole di mielina presentano proteine tipiche della guaina mielinica. La mielina estratta possiede dal 15% a 25% in peso di proteine rispetto al peso della mielina stessa. Le nanovescicole sono state denominate MyVes.
Sotto un altro aspetto l?invenzione concerne l?impiego delle nanovescicole di mielina per l?uso come medicamento.
Sotto ancora un altro aspetto l?invenzione concerne l?impiego delle nanovescicole di mielina per il trattamento delle patologie demielinizzanti.
Sotto un aspetto ulteriore viene descritto un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di:
a. preparare una dispersione di mielina in acqua ad una concentrazione tra 0,1mg/ml-10 mg/ml;
b. omogenizzare la dispersione di mielina della fase a. con Ultraturrax (Ika) ad un?intensit? nell'intervallo che va da 8000 a 22000 rpm per un tempo nell?intervallo da 5 a 15 min, per ottenere una soluzione omogenizzata;
c. sonicare la soluzione omogenizzata della fase b. con un sonicatore (Bandelin) ad una intensit? di 35-45 kHz per un tempo nell?intervallo da 1 a 15 minuti, per ottenere nanovescivole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica.
L?invenzione descrive ancora l?impiego come effetto di immunotolleranza e l?uso delle nanovescicole a base di mielina per il trattamento delle patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale e periferico, in cui dette patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale o periferico sono Alzheimer, Parkinson, Sclerosi Laterale Amiotrofica.
In un?ulteriore forma di realizzazione si descrive un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di:
a. preparare una soluzione di mielina in un solvente polare ad una concentrazione nell?intervallo da 0,1 a 1 mg/ml;
b. far fluire la soluzione di mielina della fase a (come fase interna). attraverso un chip per microfluidica (chip di micromiscelazione del tipo split-and-ricombine) (Dolomite, UK), utilizzando come fase esterna acqua. La procedura ? stata condotta utilizzando come unit? di controllo del flusso e del pompaggio una macchina microfluidica Elveflow dotata di regolatore di pressione OB1 che funziona a pressioni di 2-8 bar e sensori di flusso che funzionano nell'intervallo 0?5000 ?l/min con una precisione di 10 ?l/min, per ottenere nanovescicole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica
Le pressioni applicate hanno spinto la soluzione di mielina nel canale interno e la fase acquosa nel canale esterno, con un intervallo di flusso compreso tra 10 e 200 ?l/min.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate in cui:
la Figura 1 mostra uno schema della procedura per la preparazione delle vescicole di mielina MyVes, e un?immagine rappresentativa delle MyVes: ovvero la mielina con proteine. Tali proteine potrebbero potenzialmente essere responsabili sia dell?ancoraggio delle MyVes all?assone demielinizzato sia dell?effetto di immunotolleranza, inoltre viene rappresentata la possibilit? di caricare le MyVes con un farmaco;
la Figura 2 mostra uno schema del processo di riparazione della mielina mediante la possibile interazione delle proteine presenti nelle MyVes con le proteine esposte dal neurone demielinizzato;
la Figura 3A mostra una provetta con mielina cerebrale di ratto isolata e ottenuta mediante centrifugazione dell'omogenato cerebrale usando un gradiente di saccarosio; la Figura 3B mostra una provetta con mielina estratta e lavata con acqua al fine di eliminare il saccarosio e poi centrifugata (5000 rpm per 15 minuti) per eliminare l?acqua di lavaggio, liofilizzata e congelata;
la Figura 4 riporta il grafico delle dimensioni delle nanovescicole secondo la presente invenzione, misurata mediante light scattering;
la Figura 5 riporta una fotografia ottenuta mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) delle MyVes;
la Figura 6A riporta l?istogramma relativo alla percentuale di vitalit? in seguito al trattamento a neuroni in coltura, di nanovescicole di mielina secondo la presente invenzione, somministrate a diverse dosi e tempi al fine di determinarne la citocompatibilit?,
la Figura 6B mostra la morfologia cellulare delle cellule controllo (non Trattate) e trattate con le MyVes alla dose pi? alta;
la Figura 7 mostra l?istogramma dell?intensit? di fluorescenza emessa dalle MyVes dopo interazione con la sonda fluorescente Di-8-ANEPPS (MyVes-Fluo) rispetto alle MyVes senza sonda (MyVes) e al solvente utilizzato.
la Figura 8A mostra l?istogramma dell?intensit? di fluorescenza emessa dalle cellule neuronali dopo trattamento con le MyVes marcate con la sonda fluorescente Di-8-ANEPPS
Figura 8B mostra la presenza e la localizzazione della fluorescenza emessa dalle cellule neuronali, mediante microscopia a fluorescenza, dopo trattamento delle cellule con le MyVes marcate con la sonda fluorescente Di-8-ANEPPS, dopo 4 e 24 ore di trattamento. Le figure circolari si riferiscono agli ingrandimenti
la Figura 9A riporta l?istogramma relativo alla percentuale di vitalit? in seguito al trattamento a cellule microgliali in coltura, di nanovescicole di mielina secondo la presente invenzione, somministrate a diverse dosi al fine di determinarne la citocompatibilit?,
la Figura 9B mostra la morfologia cellulare delle cellule microgliali controllo (non Trattate) e trattate con le MyVes alla dose pi? alta;
la Figura 9C mostra l?istogramma relativo alla concentrazione dell?interleuchina 1? presente nel terreno di crescita delle cellule microgliali controllo (non Trattate) e trattate con le MyVes alla dose pi? alta;
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
L?invenzione pertanto concerne nanovescicole di mielina aventi un diametro medio nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica. Le nanovescicole sono state denominate MyVes.
Le nanovescicole possono essere unilamellari, multilamellari o piene (cio? senza cavit? acquosa interna, come ad esempio con le nanoparticelle solide lipidiche).
Le vescicole mieliniche secondo la presente invenzione sono state caratterizzate, come descritto negli Esempi, passaggio cruciale necessario per comprendere appieno l'origine del loro comportamento e successivamente tradurre i loro benefici in termini di prestazioni di laboratorio in specifiche applicazioni biomediche. A tal fine, il potenziale zeta ? un importante parametro per misurare la carica superficiale delle particelle, tale valore ottenuto per le nanovescicole mieliniche qui descritte va da -10 a -50mV. Questo parametro ? fortemente correlato alla procedura di preparazione di MyVes.
Nella presente invenzione quando si impiega la definizione: ?nanovescicole di mielina? o ?MyVes? o ?nanoparticelle a base di mielina? si intende comprendere le nanovescicole mieliniche qui descritte aventi un potenziale zeta che va da -10 a -50mV, preferibilmente da -20 a -40mV, pi? preferibilmente da -30 a -40mV.
La carica superficiale, oltre a controllare la stabilit? di una sospensione colloidale e la sua tendenza all'aggregazione, svolge anche un importante ruolo nel modellare le interazioni tra nanoparticelle e ambiente. Inoltre, per la caratterizzazione delle MyVes saranno necessari altri parametri come: indice di polidispersit? (PDI), stabilit?, capacit? di carico di un farmaco, relazioni struttura-funzione (capacit? di attraversare membrane biologiche come la barriera ematoencefalica, capacit? d?interagire con proteine presenti nel sito target, capacit? di rilasciare il farmaco trasportato).
Le strutture demielinizzate sono suscettibili ad essere danneggiate, un processo che porta alla neurodegenerazione a causa della morte dei neuroni, le cellule responsabili della propagazione degli stimoli nervosi. Non sono ancora disponibili trattamenti efficaci per promuovere le riparazioni dei neuroni e delle fibre nervose, la ricostituzione della guaina mielinica, il recupero delle funzioni perse e la riduzione della disabilit? risultante. La nanotecnologia ? un nuovo approccio promettente, che ha esercitato un enorme contributo nella diagnosi e nel trattamento dei disturbi correlati al SNC. Tuttavia, l'uso di vescicole, o, in generale, di nano-carrier, fabbricati con mielina e caricate con farmaci, non ? ancora presente nel panorama della medicina. Le nanovescicole di mielina secondo la presente invenzione sono uno strumento prezioso ed efficace per sostituire la mielina danneggiata, come sistema di rilascio di farmaci contro le malattie demielinizzanti del sistema nervoso e come sistema di immunotolleranza.
In una forma preferita, la nanovescicola di mielina secondo la presente invenzione ha un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200 nm, preferibilmente da 90 a 110nm. In una forma pi? preferita, la nanovescicola di mielina secondo la presente invenzione ha un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV., e le proteine sono le proteine basiche della mielina (myelin basic proteins o BMPs), le proteine proteolipidiche della mielina (Myelin proteolipid proteins o PLPs) e le glicoproteine oligodendrocitiche della mielina (Myelin oligodendrocyte glycoproteins o MOG).
Le nanovescicole di mielina secondo la presente invenzione possono essere caricate di un composto, preferibilmente detto composto ? un farmaco, un agente di contrasto, una sonda fluorescente, citochine, fattori di crescita, antiossidanti, antiinfiammatori, immunomodulatori, o qualsiasi altra molecola attiva nel favorire o coadiuvare il trattamento: della sclerosi, della rigenerazione della mielina e delle malattie neurodegenerative del SNC e SNP.
Sotto un altro aspetto l?invenzione concerne l?impiego delle nanovescicole di mielina per l?uso come medicamento.
Sotto ancora un altro aspetto la l?invenzione concerne l?impiego delle nanovescicole di mielina per il trattamento delle patologie demielinizzanti. In una forma preferita dette patologie demielinizzanti sono la sclerosi multipla (SM), l?encefalomielite acuta disseminata, l?adrenoleucodistrofia, l?adrenomieloneuropatia e la neuropatia ottica ereditaria di Leber.
L?invenzione dunque descrive l?impiego delle nanovescicole a base di mielina per il trattamento delle malattie neurodegenerative.
Le MyVes potrebbero essere uno strumento prezioso ed efficace per sostituire la mielina danneggiata e come sistema di rilascio di farmaci contro malattie demielinizzanti e/o patologie del sistema nervoso centrale. MyVes, potrebbero migliorare il profilo di rilascio del farmaco al sito target, la stabilit?, l'assorbimento e la biodistribuzione, migliorando l'efficacia e la sicurezza del trattamento rispetto alla somministrazione tradizionale dei farmaci.
Sotto ancora un altro aspetto viene descritto l?impiego delle nanoparticelle di mielina per la riparazione della mielina danneggiata a livello degli assoni del sistema nervoso centrale e periferico.
Pertanto, le nanovesicole di mielina possono essere rilevanti per diversi aspetti tra cui la riparazione della mielina e il rilascio (delivery) di farmaci nel sito target del SNC e SNP.
Inoltre, essendo la SM una malattia autoimmune, strategie per la tolleranza di specifici antigeni sono utilizzati a scopo terapeutico. I peptidi mielinici presenti nelle MyVes potrebbero essere in grado di indurre risposte immunotolleranti, e viene descritto il loro impiego come effetto di immunotolleranza. In particolare, se le MyVes portassero l?antigene responsabile della risposta immunitaria potrebbero istruire il sistema immunitario e ridurre la risposta immunitaria oltre che trasportare un farmaco e ricostruire la mielina.
L?invenzione descrive ancora l?impiego delle nanovescicole a base di mielina per il trattamento delle patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale e periferico, in cui dette patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale o periferico sono Alzheimer, Parkinson, Sclerosi Laterale Amiotrofica.
Un aspetto ulteriore viene descritto un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di:
a. preparare una dispersione di mielina in acqua ad una concentrazione che va da 0,1 mg/ml -10 mg/ml;
b. omogeneizzare la dispersione di mielina della fase a. con Ultraturrax (Ika) ad un?intensit? nell'intervallo che va da 8000 a 22000 rpm per un tempo nell?intervallo da 1 a 15 min, per ottenere una soluzione omogenizzata;
c. sonicare la soluzione omogenizzata della fase b. con un sonicatore (Bandelin) ad una intensit? nell?intervallo da 35 a 45 kHz per un tempo da 1 a 15 minuti, per ottenere nanovescivole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica.
In una forma di preparazione, la dispersione della fase a. ? preparata iniettando la mielina, precedentemente sciolta in un solvente organico volatile miscibile con acqua, nel mezzo acquoso, durante la fase di miscelazione della fase b..
Un esempio di realizzazione di questo procedimento viene descritto nell?Esempio 2 come ?Procedura 1?.
In una forma di realizzazione, viene descritto un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di:
a. preparare di una soluzione di mielina in un solvente organico volatile, preferibilmente Tert Butanolo ad una concentrazione da 0,1 a 1 mg/ml.
b. iniettare la soluzione di mielina della fase a., in acqua distillata ed omogenizzare la dispersione di mielina ottenuta con Ultraturrax (Ika) ad un?intensit? nell'intervallo che va da 8000 a 22000 rpm per un tempo nell?intervallo da 5 a 15 minuti, per ottenere una soluzione omogenizzata;
c. sonicare la soluzione omogenizzata della fase b. con un sonicatore (Bandelin) ad una intensit? nell?intervallo da 35 a 45 kHz per un tempo da 1 a 15 minuti, per ottenere nanovescivole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica.
Un esempio di realizzazione di questo procedimento viene descritto nell?Esempio 2 come ?Procedura 2?.
Questo procedimento ha lo scopo di istituire una procedura di fabbricazione adatta per ottenere un carico passivo di agenti terapeutici (cio? l'inclusione diretta dell'agente terapeutico durante l'autoassemblaggio dei fosfolipidi mielinici), l'estratto di mielina ? stato sciolto nel solvente organico volatile appropriato miscibile con acqua (ad esempio pu? essere utilizzato Terz- butanolo, etanolo, isopropanolo, tetraidrofurano e altri solventi volatili polari miscibili con l?acqua.
In un?ulteriore forma di realizzazione si descrive un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di:
a. preparare una soluzione di mielina in tert-Butanolo (o opportuno solvente polare volatile) ad una concentrazione nell?intervallo da 0,1 a 1 mg/ml;
b. far fluire la soluzione di mielina della fase a. come fase interna, e acqua distillata come fase esterna, attraverso un chip di microfluidica per micromiscelazione del tipo ?split-and-ricombine? di Dolomite, UK, utilizzando come unit? di controllo del flusso e del pompaggio una macchina microfluidica ?Elveflow? dotata di regolatore di pressione OB1 che funziona a pressioni di 2-8 bar e sensori di flusso che funzionano nell'intervallo 0? 5000 ?l/min con una precisione di 10 ?l/min. Le pressioni applicate hanno spinto la soluzione di mielina nel canale interno e la fase acquosa nel canale esterno, con un intervallo di flusso compreso tra 10 e 200 ?l/min, per ottenere nanovescicole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presentano proteine tipiche della guaina mielinica Un esempio di realizzazione di questo procedimento viene descritto nell?Esempio 2 come ?Procedura 3?.
In una forma preferita, il procedimento dell?invenzione (Procedimento 1, 2 o 3) ha la fase aggiuntiva di liofilizzare le nanovescivole di mielina ottenuta, mediante la liofilizzazione, in modo da ottenere nanoparticelle di mielina liofilizzate.
Sono stati effettuati test di stabilit? per valutare la ?shelf-life? delle MyVes, in seguito a incubazione del campione a temperatura ambiente per un periodo di un mese, e i risultati indicano un?ottima stabilit? delle MyVes.
Mediante l'uso di modelli cellulari o animali si analizza la capacit? delle MyVes di interagire con le cellule neuronali e la loro localizzazione subcellulare.
La Figura 1 mostra uno schema semplificato della procedura per la preparazione delle vescicole di mielina MyVes, e un?immagine rappresentativa delle MyVes: ovvero la mielina con le proteine, inoltre viene rappresentata la possibilit? di caricare le MyVes con un farmaco. Senza essere legati ad una particolare teoria, le proteine presenti in MyVes, identificate da saggi immunologici, potrebbero essere coinvolte sia in siti di riconoscimento presenti sulle superficie dei neuroni demielinizzati permettendo cos? l'ancoraggio del nuovo strato di mielina e la sua successiva ricostruzione (figura 2) sia dell?effetto di immunotolleranza. La capacit? di MyVes di caricare e rilasciare i farmaci, di riparare la mielina danneggiata e l?attivit? di immunotolleranza saranno valutati utilizzando saggi specifici in vitro e in vivo.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: isolamento della mielina
Isolamento da cervello di ratto:
Il cervello di ratto, una volta espiantato, ? stato posto in ghiaccio e tramite un mortaio e l?utilizzo dell?azoto ? stato polverizzato. Successivamente, ne sono stati prelevati circa 60 mg che sono stati omogenati in un omogeneizzatore con 180 ?l di soluzione di Saccarosio 0,32 M, 10% di inibitori di proteasi (Amersham Biosciences, Milan, Italy) e 10% di inibitori delle fosfatasi (cocktail II and III; Sigma-Aldrich, Milan, Italy). L?omogenato ? stato posto in un tubo per ultracentrifuga dove sono stati aggiunti 720 ?l di soluzione di saccarosio 2M e 300 ?l di una soluzione 0,1mM CaCl. Successivamente, a tale soluzione sono stati accuratamente sovrapposti 1,8 ml di soluzione di saccarosio 1 M e il tutto ? stato centrifugato a 127.000 RCF per 3 h a 4?C. [Franklin et al., 2016]. Terminata l?ultracentrifugazione, ? stata prelevata la mielina che si trovava sulla superficie della provetta (Figura 3A). La mielina prelevata e stata posta in un tubo da 15ml e sono stati effettuati 3 lavaggi in acqua distillate (10ml) mediante centrifugazione a 5000 rpm per 15 minuti. Al termine di tale procedimento la mielina ? stata liofilizzata in modo da ottenerla sotto forma di polvere (figura 3B).
L?isolamento di mielina pu? essere effettuato anche da tessuto cerebrale umano.
Infatti, essendo la guaina mielinica una struttura che avvolge gli assoni dei neuroni dei vertebrati e che presenta una composizione e struttura altamente conservata tale protocollo potrebbe essere applicato anche a tessuto umano.
I cervelli dei ratti provengono dall'ATeN Center - Stabulario con sale operatorie per piccoli animali - di Palermo e sono stati donati in conformit? del permesso numero 69636.N.JCO approvato dal Ministero della Salute Italiano. Si dichiara il rispetto delle normative sulla sperimentazione animale.
Esempio 2: Preparazione delle vescicole di mielina
Procedura 1. Dispersione diretta dell'estratto di mielina sotto miscelazione ad alta energia
L?estratto di mielina essiccata ? stato sospeso in mezzo acquoso alla concentrazione di 0,1 mg/ml e omogeneizzata per 30 minuti con Ultraturrax (Ika) a 18000 rpm e quindi sonicata per 10 min a 35 kHz. Dopo la produzione, la dispersione acquosa ? stata liofilizzata e conservata. La dimensione delle nanovescicole dopo dispersione in acqua ? risultata essere pari a 130 ? 60 nm; potenziale z ? 37 mV
Procedura 2. Procedura di nanoprecipitazione ad alta energia
Allo scopo di istituire una procedura di fabbricazione adatta per ottenere un carico passivo di agenti terapeutici (cio? l'inclusione diretta dell'agente terapeutico durante l'autoassemblaggio dei fosfolipidi mielinici), l'estratto di mielina ? stato sciolto nel solvente organico appropriato miscibile con acqua (Terz- butanolo) alla concentrazione di 0,1 mg/ml. La soluzione ? stata aggiunta lentamente a un mezzo acquoso miscelando con una procedura ad alta energia con Ultraturrax (Ika) a 18000 rpm e successivamente sonicando per 10 min a 35 KHz. La dimensione delle nanovescicole dopo dispersione in acqua ? risultata essere pari a 100?25 nm, con un potenziale z pari a -42 mV.
Procedura 3. Nanoprecipitazione controllata tramite miscelazione di microfluidica (procedura a bassa energia)
? stata impiegata una procedura a bassa energia con l'obiettivo di evitare la possibile inattivazione dei componenti proteici dell'estratto di mielina e di consentire l'incapsulamento di agenti terapeutici instabili rispetto alle procedure di fabbricazione ad alta energia. La procedura di microfluidica consente di ottenere un controllo sulla distribuzione delle dimensioni finali delle nanoparticelle. In particolare, l'estratto di mielina ? stato sciolto nel solvente organico volatile appropriato miscibile con acqua (Terz-butanolo) alla concentrazione di 0,1 mg/ml. La soluzione ? stata fatta fluire attraverso un chip microfluidico per micromiscelazione del tipo split-and-recombine (Dolomite, UK) utilizzando come fase esterna acqua. La procedura ? stata condotta utilizzando come unit? di controllo del flusso e del pompaggio una macchina microfluidica Elveflow dotata di regolatore di pressione OB1 che funziona a pressioni di 2-8 bar e sensori di flusso che funzionano nell'intervallo 0?5000 ?l/min con una precisione di 10 ?l/min. Le pressioni applicate hanno spinto la soluzione di mielina nel canale interno e della fase acquosa nel canale esterno, rispettivamente a 100 ?l/min e 200 ?l/min. Dopo la produzione la sospensione acquosa ? stata liofilizzata e conservata. Il liofilizzato disperso in acqua ha prodotto nanovescicole di 60 ? 10 nm con potenziale z pari a -38 mv).
Le tre procedure di preparazione delle nanovescicole mediante: estrazione della mielina, formazione e caratterizzazione delle vescicole sono state ripetute pi? volte con successo, indicando un?ottima riproducibilit? dei risultati ottenuti.
Inoltre test di stabilit? delle MyVes, in seguito a incubazione del campione a temperatura ambiente per un periodo di un mese, indicando un?ottima stabilit? delle MyVes.
Esempio 3: caratterizzazione delle nanovescicole di mielina
Le nanovescicole secondo la presente invenzione sono state caratterizzate come di seguito riportato. I nostri esperimenti preliminari indicano che l'estrazione della mielina trasporta anche proteine legate alla guaina mielinica, circa il 15-25% in peso di mielina Le nanovescicole MyVes prodotte sono state caratterizzate in termini di propriet? fisiche con una dimensione media di circa 100nm (Figura 4), morfologia sferoidale mediante analisi SEM (Figura 5) e potenziale tra -10 e -50mV.
Caratterizzazione biologica
Le MyVes prodotte sono state somministrate a diverse dosi a neuroni in coltura al fine di determinarne la cito-compatibilit?. A tal fine, le cellule neuronali sono state piastrate in una multiwell da 96 alla concentrazione di 600.000/mL e poste in incubatore al 5% di CO2 a 37?C. Per la crescita cellulare e i trattamenti ? stato utilizzato il terreno RPMI (Roswell Park Memorial Institute) arricchito con 10% Siero Fetale Bovino (FBS), 1% glutammina, 1% antibiotici (penicillina e streptomicina). Dopo 24h dalla semina, le vescicole di mielina sono state somministrate a diverse dosi alle cellule per 24 e 48 ore. Al termine del trattamento ? stato eseguito il test di vitalit? cellulare MTS (Promega). I risultati preliminari ottenuti indicano che le MyVes sono cito-compatibili alle dosi e ai tempi utilizzati (Figura 6). In figura 6A ? riportato l?istogramma relativo alla percentuale di vitalit? in seguito al trattamento, in figura 6B la morfologia cellulare.
Successivamente, al fine di capire se le vescicole isolate siano in grado di interagire con le cellule neuronali esse sono state marcate con molecole fluorescenti e dopo somministrazione ? stata studiata la loro eventuale localizzazione subcellulare. Per la marcatura le MyVes sono state incubate per 30 minuti con la sonda fluorescente Di-8-ANEPPS, questa sonda ? debolmente fluorescente in soluzioni acquose e diventa fortemente fluorescente dopo il legame ad ambienti lipofili come le membrane biologiche. L'analisi della fluorescenza mediante fluorimetro (Glomax), ha mostrato che le MyVes possono essere marcate con la sonda fluorescente Di-8-ANEPPS. (Figura 7). Le cellule neuronali, piastrate in una multiwell da 96 alla concentrazione di 600.000/mL, sono state, quindi, incubate con diverse quantit? delle MyVes marcate con la molecola fluorescente Di-8-ANEPPS per 4 e 24ore. Dall'analisi fluorimetrica, mediante fluorimetro (Glomax), ? stato rilevato, dopo 24 ore, nelle cellule trattate, un incremento della fluorescenza in modo dose-dipendente rispetto al controllo (cellule non trattate) (Figura 8A). Inoltre, mediante analisi al microscopio a fluorescenza (Zeiss) ? stata verificata l?interazione delle MyVes con le cellule neuronali in coltura dopo 4 e 24 ore dal trattamento (Figura 8B).
Il passo successivo ? stato quello di somministrate le MyVes a diverse dosi a cellule microgliali in coltura (cellule principalmente legate alla risposta immunitaria nel sistema nervoso centrale) al fine di determinarne sia la citocompatibilit? che l?eventuale attivazione immunitaria. A tal fine, le cellule microgliali sono state piastrate in una multiwell da 96 alla concentrazione di 200.000/mL e poste in incubatore al 5% di CO2 a 37?C. Per la crescita cellulare e i trattamenti ? stato utilizzato il terreno RPMI (Roswell Park Memorial Institute) arricchito con 10% Siero Fetale Bovino (FBS), 1% glutamina, 1% antibiotici (penicillina e streptomicina)
Il test di vitalit? cellulare MTS (Promega) e l?analisi morfologica ha indicano che le MyVes non presentano un effetto tossico su cellule microgliali (Figura 9A, B) in coltura. Inoltre mediante test ELISA dei supernatanti ottenuti dopo il trattamento ? stato riscontrato che le MyVes non attivano l?espressione dell?interleuchina 1 ?, marker di attivazione della risposta immunitaria (Figura 9C).
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante le nano-vescicole di mielina ed i procedimenti per prepararle, secondo la presente invenzione. Tali procedimenti possono essere convenientemente realizzati in un qualsiasi tipo di laboratorio.
Claims (17)
1. Una nanovescicola di mielina avente un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV e che presenta proteine tipiche della guaina mielinica.
2. La nanovescicola di mielina secondo la rivendicazione 1, avente un diametro medio nell?intervallo che va da 90 a 110 nm.
3. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, avente un potenziale zeta nell?intervallo che va da -35 a -45mV.
4. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui le proteine sono le proteine basiche della mielina (myelin basic proteins o BMPs), le proteine proteolipidiche della mielina (Myelin proteolipid proteins o PLPs) e le glicoproteine oligodendrocitiche della mielina (Myelin oligodendrocyte glycoproteins o MOG).
5. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caricate con una sostanza.
6. La nanovescicola di mielina secondo la rivendicazione 5, in cui detta sostanza ? un farmaco, un agente di contrasto, una sonda fluorescente, citochina, fattori di crescita, antiossidanti, antiinfiammatori, immunomodulatori.
7. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per l?uso come medicamento.
8. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per l?uso come veicolo per la veicolazione di farmaci e biomolecole ad effetto terapeutico (drug delivery) al sistema nervoso centrale e periferico.
9. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 per l?uso nel trattamento delle patologie demielinizzanti.
10. La nanovescicola di mielina per l?uso secondo la rivendicazione 9, in cui dette patologie demielinizzanti sono la sclerosi multipla, l?encefalomielite acuta disseminata, l?adrenoleucodistrofia e l?adrenomieloneuropatia e la neuropatia ottica ereditaria di Leber.
11. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per l?uso come effetto di immunotolleranza.
12. La nanovescicola di mielina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per l?uso nel trattamento delle patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale e periferico.
13. La nanovescicola di mielina per l?uso secondo la rivendicazione 12, in cui dette patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale o periferico sono Alzheimer, Parkinson, Sclerosi Laterale Amiotrofica.
14. Un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di: a. preparare una dispersione di mielina in solvente acquoso ad una concentrazione nell?intervallo da 0,1 mg/ml a 10 mg/ml);
b. omogeneizzare la dispersione di mielina della fase a. con Ultraturrax ad un?intensit? nell'intervallo che va da 8000 a 22000 rpm per un tempo nell?intervallo da 5 a 15 min, per ottenere una dispersione omogenizzata;
c. sonicare la dispersione omogenizzata della fase b. con un sonicatore ad una intensit? di 35-45 kHz per un tempo di 1-15 minuti, per ottenere nanovescivole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV.
15. Il procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui la dispersione della fase a. ? preparata iniettando la mielina, precedentemente sciolta in un solvente organico miscibile con acqua, nel mezzo acquoso, durante la fase di miscelazione della fase b.
16. Un procedimento per la preparazione di nanovescicole di mielina avente le fasi di: a. preparare una soluzione di mielina in un solvente polare ad una concentrazione nell?intervallo da 0,1 a 1 mg/ml);
b. far fluire la soluzione di mielina della fase a. attraverso un chip microfluidico per micromiscelazione, con flusso compreso tra 0 e5000 ?l/min per ottenere nanovescicole di mielina aventi un diametro nell?intervallo che va da 30 a 200nm, un potenziale zeta nell?intervallo che va da -10 a -50mV.
17. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16, avente la fase aggiuntiva di liofilizzare le nanovescivole di mielina ottenute dalla fase c., per ottenere nanoparticelle di mielina liofilizzate.
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