ES2273339T3

ES2273339T3 - Aparato y metodo de deteccion electroquimioluminiscente basada en particulas magneticas.

Info

Publication number: ES2273339T3
Application number: ES95943578T
Authority: ES
Inventors: David B. Talley; Jonathan K. Leland
Original assignee: Bioveris Corp
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: EP0871864B1; DE69535223T2; DE69535223D1; US6133043A; WO1996015440A1; JP2006184294A; US5744367A; ATE339682T1; EP0871864A1; JPH10509798A; AU4501596A; EP0871864A4

Abstract

UN METODO Y APARATO PARA MEDIR LA ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA DE UNA COMPOSICION MUESTRA SE DESCRIBEN, EN DONDE ESPECIES ELECTROQUIMIOLUMINISCENTES ACTIVAS SENSIBLES SE CAPTURAN POR EL ELECTRODO (5) CON LA AYUDA DE UN IMAN (15) DE CAPTURA QUE TIENE UNA CONFIGURACION TAL QUE LAS LINEAS DE FLUJO MAGNETICO (O EL GRADIENTE DEL CAMPO MAGNETICO) DE AL MENOS UNA FUENTE DE CAMPO MAGNETICO EN SU INTERIOR SE COMPRIMEN Y/O DISPERSAN. DICHO IMAN (15) DE CAPTURA MEJORA LA DISTRIBUCION DE LAS ESPECIES ELECTROQUIMIOLUMINISCENTEMENTE ACTIVAS SENSIBLES MAGNETICAMENTE SOBRE LA SUPERFICIE (5) DEL ELECTRODO Y REDUCE LA INTERFERENCIA CON EL TUBO (20) FOTOMULTIPLICADOR, POTENCIANDO DE DICHA FORMA LA SEÑAL (ECL) Y MEJORANDO LA SENSIBILIDAD. LA DISTRIBUCION Y CAPTURA MEJORADAS TAMBIEN PERMITEN TIEMPOS DE ANALISIS MENORES.

Description

Aparato y método de detección electroquimioluminiscente basada en partículas magnéticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un aparato y método de detección electroquimioluminiscente para realizar ensayos con los mismos, en los que las composiciones de muestra analizadas contienen especies activas ECL (electroquimioluminiscentes, "electrochemiluminescent") unidas a micropartículas que responden magnéticamente capturadas sobre la superficie del electrodo, con la ayuda de fuentes de campos magnéticos, para iniciar una reacción quimioluminiscente.

Antecedentes de la invención

La electroquimioluminiscencia es la base de procesos de detección y cuantificación altamente sensibles en los que se generan electroquímicamente especies reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo. Las especies reactivas generadas electroquímicamente se someten a una reacción quimioluminiscente. La luminiscencia procedente de la reacción quimioluminiscente se usa para detectar o cuantificar la especie activa ECL. Se han desarrollado sistemas y métodos de detección por electroquimioluminiscencia altamente sensible que pueden medir cantidades traza de materiales. La detección de luminiscencia de marcadores activos ECL se ha usado para desarrollar ensayos en materiales tales como sustancias bioquímicas y biológicas y para proporcionar inmunoensayos sensibles y ensayos con sondas de ADN.

Estos sistema de detección electroquimioluminiscente tienen muchas ventajas sobre otros sistemas de detección porque la medición es simple y rápida, no se usan radioisótopos, los límites de detección para las especies activas ECL son extremadamente bajos (200 fmol/L); el intervalo dinámico de la cuantificación específica activa ECL se extiende en seis órdenes de magnitud; y los marcadores activos ECL son extremadamente estables y pequeños (\sim 1000 Da)
(Da \equiv Daltons) de modo que pueden marcarse haptenos o moléculas grandes y pueden acoplarse múltiples marcadores a proteínas y oligonucleótidos sin afectar a su inmunorreactividad, solubilidad y su capacidad para hibridar.

Además, puesto que la quimioluminiscencia requiere una tensión aplicada, pueden controlarse la iniciación y duración de la respuesta controlando la tensión aplicada a un electrodo. El aparato y los métodos de detección por ECL se describen con más detalle en las siguientes solicitudes publicadas PCT: WO86/02734, WO87/00987, WO88/03947.

Se ha desarrollado una variedad de formatos para ensayos basados en la detección y cuantificación de electroquimioluminiscencia. Por ejemplo, se han desarrollado formatos heterogéneos (una o más separaciones) y homogéneos (sin separación) para ensayos competitivos en los que haptenos marcados con un resto activo ECL compiten por un anticuerpo con un analito de interés. En formatos heterogéneos, se separan las fracciones libre y unida del componente marcado, tal como el hapteno, antes del análisis en el sistema de detección por ECL. Si la eficacia de la excitación de ECL difiere considerablemente para las fracciones libre y unida de los componentes marcados, puede cuantificarse la intensidad de ECL de una fracción en presencia de la otra fracción en un formato homogéneo.

La solicitud publicada PCT WO89/04919 describe métodos para realizar ensayos basados en fenómenos luminiscentes en un formato homogéneo, en los que la intensidad de la señal luminiscente generada por el resto activo ECL proporciona un medio para monitorizar la unión específica de un sistema de ensayo. En estos métodos, se unen micropartículas a especies activas ECL de los componentes de ensayo para modular la intensidad de la señal luminiscente.

La solicitud publicada PCT WO92/14138 describe métodos para realizar ensayos en los que las micropartículas unidas a la especie activa ECL responden magnéticamente y se acercan al electrodo en el que la especies activa ECL se somete a excitación mediante una pluralidad de imanes orientados norte-sur. Esto aumenta significativamente la señal de ECL procedente de la composición de muestra.

En ausencia de un imán, el transporte de las micropartículas que responden magnéticamente hasta la superficie del electrodo para la excitación está dictado en gran medida por el movimiento browniano. Con la incorporación de imanes para capturar las micropartículas que responden magnéticamente sobre la superficie del electrodo, la excitación de la fracción unida de la especie activa ECL es más eficaz; de hecho, la señal procedente de la fracción unida aumenta enormemente por encima de la de la fracción libre, de modo que pueden realizarse ensayos en un formato homogéneo.

La inclusión de micropartículas que responden magnéticamente ha encontrado una ventaja particular en métodos para realizar ensayos tales como los ensayos con sondas de ADN en los que se emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN presente. En tales ensayos, la reacción de PCR se realiza en primer lugar para amplificar el gen específico con dos cebadores, uno de los cuales es un cebador biotinilado. El ADN bicatenario formado con el cebador biotinilado se une a micropartículas recubiertas con estreptovidina y se separan las cadenas de ADN. La cadena unida a partículas se hibrida con una sonda de ADN que tiene un marcador activo ECL que puede detectarse y cuantificarse en un aparato de detección por ECL, normalmente uno que emplea un imán.

Aunque el aparato y los métodos enseñados en la técnica anterior, tal como los documentos WO89/04914 y WO92/14138 y aparatos comerciales tales como el analizador Origin® 1.5 de IGEN Inc. permiten la detección y cuantificación de cantidades extremadamente pequeñas de analitos en una variedad de ensayos, existe un esfuerzo continuado para disminuir los límites de detección y aumentar la sensibilidad de los ensayos realizados y también para aumentar la velocidad a la que se realizan los ensayos.

Un medio para disminuir los límites de detección y aumentar la sensibilidad de los ensayos consiste en aumentar la señal de ECL procedente de la composición de muestra. Esto puede lograrse mejorando la captura de partículas desde la composición de muestra tal como empleando un largo tiempo de residencia de la composición de muestra dentro de la celda de medición para permitir que se capturen más partículas sobre la superficie del electrodo. Otro medio para mejorar la sensibilidad es mejorar la distribución de las partículas sobre el electrodo. Se cree que las partículas que se han apilado sobre la parte superior de otras partículas sitúan la especie activa ECL demasiado alejada de la superficie del electrodo para producir luminiscencia con la aplicación de una tensión al electrodo. Una distribución de partículas más uniforme sobre la superficie del electrodo permitirá que más especies activas ECL se iluminen, aumentando la señal de ECL. Los dispositivos de detección por ECL convencionales que emplean uno o más imanes habituales proporcionan una captura de partículas eficaz y una distribución de partículas en un corto periodo de tiempo, pero se desean mejoras.

La captura de partículas depende de la fuerza magnética que impulsa las partículas que responden magnéticamente hacia la superficie del electrodo a través de la solución. La fuerza magnética es normalmente el producto de la saturación magnética de las partículas y el gradiente de campo magnético. La fuerza de impulso magnético puede aumentar con la selección de partículas magnéticas con una alta saturación magnética pero una vez seleccionadas, debe aumentarse el gradiente de campo magnético para aumentar esta fuerza magnética.

El aumento de la intensidad del campo magnético del imán empleado aumentará el gradiente de campo magnético y mejorará la captura de partículas. Sin embargo, el aumento de la intensidad del campo magnético puede dar como resultado otros problemas tales como un aumento de la interferencia con el tubo fotomultiplicador. Según aumenta la intensidad del campo magnético, así lo hace su tamaño, normalmente extendiéndose adicionalmente desde la superficie del electrodo y más cerca del tubo fotomultiplicador. Esto puede dar como resultado una reducción de la señal de ECL y pérdida de sensibilidad. Además, el aumento de la intensidad del campo magnético puede conducir a un apilamiento de materiales particulados sobre el electrodo, dando como resultado una reducción de la señal de ECL.

Objetos de la invención

Es un objeto general de esta invención proporcionar un aparato de detección electroquimioluminiscente con sensibilidad mejorada y tiempos de ensayo más rápidos.

Es otro objeto general de la presente invención proporcionar un método de medición de la electroquimioluminiscencia en una composición de muestra con un aumento de la sensibilidad y la velocidad.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato y método de detección por ECL que emplean un imán de captura de una configuración que proporciona una captura mejorada de micropartículas que responden magnéticamente en composiciones de muestra sin aumentar la interferencia con el tubo fotomultiplicador.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un aparato y método de detección por ECL que emplean un imán de captura de una configuración que proporciona una distribución de partículas más uniforme sobre la superficie del electrodo.

Breve descripción de los dibujos

Otros varios objetos, características y ventajas que conlleva la presente invención se apreciarán con más detalle a medida que se vaya entendiendo mejor la misma cuando se considere junto con los dibujos adjuntos, en los que caracteres de referencia similares designan partes iguales o similares en todas las diversas vistas, y en los que:

La figura 1 es una representación esquemática de la configuración básica de un sistema de detección por ECL de la presente invención;

la figura 2 es una representación esquemática de una celda de flujo de un aparato de detección por ECL de la presente invención y los componentes del aparato de detección por ECL que interaccionan con la celda de flujo;

la figura 3 es una representación esquemática de una celda de flujo de un aparato de detección por ECL de esta invención con un imán de captura que tiene una configuración de intercalación ("sandwich");

la figura 4 es una representación en perspectiva del imán habitual empleado en dispositivos de detección por ECL convencionales como imán de captura;

la figura 5 es una disposición de imán comparativa, que sin ser parte de la presente invención, es una representación en perspectiva de un imán con canal ("channel magnet") usado en los dispositivos de detección por ECL de la presente invención como imán de captura;

la figura 6 es una representación en perspectiva de un imán de intercalación ("sandwich magnet") usado en los dispositivos de detección por ECL de la presente invención como imán de captura;

la figura 7 es una representación de las líneas de campo magnético de un imán de intercalación como en la figura 6;

la figura 8 es una disposición de imán comparativa, que sin ser parte de la presente invención, es una representación en perspectiva de las líneas de campo magnético de un imán con canal como en la figura 5;

la figura 9 es una representación de las líneas de campo magnético de un imán habitual como en la figura 4;

la figura 10 es una representación gráfica del potencial de pico (promedios) medido por un aparato de detección por ECL como una función de la velocidad de bombeo (tiempo de toma de muestras) con imanes de varias configuraciones;

la figura 11 es una representación gráfica del cambio en la señal de ECL medida por un aparato de detección por ECL como una función de la velocidad de bombeo y la configuración del imán; y

la figura 12 es una representación gráfica de la señal de ECL medida por un aparato de detección por ECL como una función de la tensión aplicada.

Descripción de términos

Los términos "resto ECL", "resto activo ECL" y "marcador" se usan de manera intercambiable y se refieren a sustituyentes tales como Ru(bpy)_{3}^{2+} que se unen a moléculas tales como un analito, un análogo de un analito, una pareja de unión de un analito o un análogo del mismo u otros componentes de un ensayo que generan electroquimioluminiscencia con la exposición a una tensión aplicada.

Los términos "electroquimioluminiscencia", "electroquimioluminiscente", "luminiscencia", "luminiscente" y "producir luminiscencia" incluyen la emisión de luz y otras formas de radiación electromagnética. Los términos "detección" y "cuantificación" se denominan como "medición", entendiéndose que una cuantificación puede requerir la preparación de composiciones de referencia y calibraciones. Los términos "líneas de flujo magnético", "líneas de inducción", "flujo magnético", "líneas de flujo" y "líneas de campo magnético" se usan de manera intercambiable y se refieren a aquellas líneas que definen un campo magnético por la fuerza que se aplicaría sobre un objeto que responde magnéticamente en esa ubicación. La compresión y/o dispersión de las líneas de flujo magnético dará como resultado la compresión y/o dispersión del gradiente de campo magnético y también puede dar como resultado la compresión y/o cierta expansión en tamaño y forma del campo magnético.

El término "fuente del campo magnético" incluye imanes permanentes y electroimanes, que son entidades separadas, individuales con polos magnéticos N-S definidos. El término "fuente del campo magnético" también incluye regiones dentro de un material compuesto o estructura que genera un campo magnético. Tales regiones pueden producirse dentro de un material compuesto a partir de partículas magnéticas de óxido de hierro.

Sumario de la invención

Se han conseguido los objetivos anteriores y otros según la reivindicación 1, empleando un imán de intercalación en un aparato de detección por ECL que tiene una configuración en la que las líneas de flujo magnético de la(s)
fuente(s) de campo magnético empleadas en ella se redirigen por compresión.

Cuando se comprimen las líneas de flujo magnético, la densidad de flujo magnético (intensidad del campo magnético) del campo magnético aumenta sin que se extienda significativamente el campo magnético desde la superficie del electrodo. Tales configuraciones sirven para potenciar la eficacia de captura de perlas sobre el electrodo extendiendo el gradiente de campo magnético sobre la superficie y disminuyendo la interferencia con el tubo fotomultiplicador.

Una realización de esta invención es un aparato para la medición de electroquimioluminiscencia procedente de una composición de muestra que comprende:

a): una celda que tiene un volumen que contiene la composición de muestra, un electrodo adaptado para aplicar una tensión a la composición de muestra y un imán adaptado para atraer magnéticamente componentes que responden dentro de la composición de muestra hacia la superficie del electrodo;

b): medios para imprimir una tensión sobre dicho electrodo suficiente para generar luminiscencia a partir de especies activas electroquimioluminiscentes (ECL) dentro de la composición de muestra; y

c): medios para medir la luminiscencia generada por la especie activa ECL dentro de la composición de muestra.

en el que el imán se sitúa por debajo de dicho electrodo y tiene una configuración tal que se comprimen las líneas de flujo magnético de al menos una fuente de campo magnético dentro del imán.

La invención también proporciona un método según se define en la reivindicación 9, para medir la electroquimioluminiscencia procedente de una composición de muestra, en el que dicha composición de muestra contiene una especie activa electroquimioluminiscente (ECL) que comprende un resto activo ECL y una partícula que responde magnéticamente, comprendiendo dicho método:

a): introducir un volumen conocido de dicha composición de muestra en una celda de medición que contiene un electrodo;

b): recoger la especie activa ECL que comprende un resto activo ECL y una partícula que responde magnéticamente sobre una superficie de dicho electrodo mediante la imposición de un campo magnético sobre dichas partículas que responden magnéticamente;

c): imponer una tensión sobre dicho electrodo de magnitud suficiente para inducir luminiscencia a partir de la especie activa ECL dentro de la composición de muestra; y

d): medir la luminiscencia emitida desde la composición de muestra.

en el que el campo magnético impuesto sobre dichas partículas que responden magnéticamente se proporciona mediante un imán de captura situado por debajo de la superficie del electrodo que comprende una o más fuentes de campo magnético, teniendo dicho imán de captura una configuración de manera que se comprimen las líneas de flujo magnético de al menos una fuente de campo magnético dentro del imán de captura.

Pueden emplearse varios formatos homogéneos y heterogéneos diferentes para recoger y concentrar el complejo sobre la superficie de un electrodo en la realización del método descrito anteriormente. En un ensayo heterogéneo, se concentra la fracción unida sobre la superficie del electrodo de trabajo y se mide la señal de ECL en presencia de la fracción no unida en la celda de medición. En un formato heterogéneo modificado, se realiza una etapa de separación in situ tras haberse bombeado la composición de muestra a la celda de medición y se captura la fracción unida sobre el electrodo de trabajo. En esta etapa de separación in situ, se bombea un segundo fluido a través de la celda para separar la fracción no unida de la fracción unida de la especie activa ECL. La capacidad para realizar la separación de las fracciones unida y no unida en el interior de la celda de medición es ventajosa porque no requiere un aparato de separación adicional y el procedimiento es generalmente mucho más rápido que los métodos de separación externos. La medición de la señal de ECL procedente de la fracción unida después de una separación de este tipo proporciona una mayor exactitud y límites de detección inferiores que lo que es posible sin la separación.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La figura 1 ilustra los componentes principales de un sistema de detección por ECL dentro del alcance de esta invención. El núcleo del instrumento es la celda 2, una celda de flujo electroquímico tal como la mostrada, que contiene un electrodo 5 de trabajo, un contraelectrodo 10 y un imán 15.

La figura 2 proporciona una ilustración más detallada de una celda de flujo electroquímico que puede usarse en el aparato de la presente invención. El electrodo 5 de trabajo y el contraelectrodo 10 inician la reacción ECL cuando se aplica una tensión a los mismos mediante una fuente 25 de tensión a través de los conductores 26 y 27. Preferiblemente, estos electrodos se fabrican de oro pero pueden haberse usado otros materiales con varios grados de éxito. Un medio 20 de detección luminosa detecta la luz emitida durante la reacción ECL y puede ser ventajosamente un tubo fotomultiplicador (TFM), fotodiodo, dispositivo de carga acoplada, película o emulsión fotográfica o similares. Se sitúa un electrodo 35 de referencia en una trayectoria 50 de fluido aguas abajo de la celda 2 de flujo. Una bomba 55 extrae varios fluidos a través de la celda 2 de flujo mediante la trayectoria 50 de fluido. La trayectoria 50 de fluido puede ser un simple conducto que conduce desde una salida 3 de la celda 2 de flujo. Se introducen composiciones de muestra en la celda de flujo mediante una trayectoria 40 de flujo a través de una entrada 4. La trayectoria 40 de fluido puede ser un simple conducto que alimenta fluido desde un medio 100 de control de fluido. El medio 100 de control de fluido controla el fluido que entra en la celda 2 de flujo desde diversas fuentes. En la figura 1, se muestran fuentes 6 y 7 a granel, que pueden ser fuentes a granel de una solución de limpieza y/o solución de acondicionamiento para la celda 2 de flujo, y también una fuente 120 de muestra para las composiciones de muestra, que puede ser una serie de tubos de ensayo. La fuente 25 de tensión es normalmente un potenciostato que puede aplicar diversas formas de onda de tensión a través de los electrodos mediante los conductores 26 y 27.

Esta invención puede emplear componentes de manejo de fluidos, luminómetros y potenciostatos que se encuentran en los sistemas de detección por ECL disponibles comercialmente, tales como los componentes empleados en el analizador Origen® 1.5 de IGEN, Inc., Rockville, Maryland.

En una secuencia típica, se extrae una composición de muestra de la fuente 120 de muestra, normalmente dentro de un tubo de ensayo, y se lleva al interior de la celda 2 de flujo mediante un vacío proporcionado por la bomba 55. Se capturan las partículas que responden magnéticamente dentro de la composición de muestra sobre el electrodo 5 mediante un campo magnético procedente del imán 5. Opcionalmente, las partículas se lavan para eliminar los compuestos activos ECL que no se unen a las partículas que responden magnéticamente. Éstos incluyen compuestos activos ECL libres o no unidos y componentes activos ECL que se acoplan en una unión no específica, es decir, las partículas no se unen al resto activo ECL en el sitio específico de interés.

Se aplica una tensión de rampa al electrodo 5 de trabajo y el contraelectrodo 10 mediante el potenciostato 25 y se mide la luz emitida con un tubo 20 fotomultiplicador. Tras la medición, puede introducirse una solución de limpieza y/o solución de acondicionamiento desde la fuente 6 y/o 7 mediante el controlador 100, si se desea. Normalmente, se aplica una forma de onda de tensión cuando la solución de acondicionamiento está dentro de la celda para "acondicionar" o normalizar la superficie del electrodo para proporcionar mediciones reproducibles. En realizaciones preferidas, se automatiza la manipulación de componentes de manejo de fluidos para las muestras, la solución de limpieza y/o solución de acondicionamiento.

La figura 2 muestra una ilustración más detallada de la celda 2 y el electrodo 35 de referencia. El aparato mostrado en las figuras 1 y 2 incorpora una celda de flujo continuo. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que puede incorporarse fácilmente una celda estática en estos sistemas de detección y que la presente invención engloba tal aparato, aunque no se prefieren. El medio 20 de detección luminosa puede ser cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente para el aparato en la figura 1, pero es preferiblemente un tubo fotomultiplicador (TFM). El aparato incluye una bomba 55, que es también ventajosamente una bomba peristáltica que proporciona medios para el transporte de fluidos hasta, a través y desde la celda 2. También puede usarse una bomba de desplazamiento positivo. Se proporciona un mecanismo 18 de obturador entre la celda 2 y el TFM 20 y es opcional. Preferiblemente, el obturador 18 se hace funcionar de manera que puede controlarse para abrir solamente lo suficiente para exponer el TFM 20 a la celda 2 durante la medición de la ECL. El mecanismo de obturador puede cerrarse, por ejemplo, durante el mantenimiento. La celda 2 comprende bloques 120 y 125 de montaje, un espaciador 140 anular y una ventana 148. Está definido un volumen 130 de contención de muestra por el bloque 120 y 125 de montaje, el espaciador 140 y la ventana 148. Los bloques 120 y 125 de montaje se construyen ventajosamente de acero inoxidable, el anillo 140 anular se construye ventajosamente de Teflon® y la ventana 148 se forma ventajosamente con un material que es sustancialmente transparente a la longitud de onda de la luz luminiscente electroquímica emitida por la especie activa ECL en la celda, tal como vidrio, plástico, cuarzo, o un material similar. El bloque 125 de montaje tiene una abertura 126 central en cada ventana 148 que se ajusta de manera sellada. El bloque 120 de montaje está conectado a un tubo 40 de entrada en una entrada 4 y un tubo 50 de salida a una salida 3 que se construyen ambos preferiblemente de acero inoxidable. El tubo 40 de entrada alimenta un canal 41 de entrada y el tubo 50 de salida lo recibe desde el canal 51 de salida dentro del bloque 120 de montaje. El canal 41 de entrada y el canal 51 de salida se abren hacia el volumen 130 de contención de muestra. El canal 41 de entrada cruza el volumen 130 de contención de muestra en un primer extremo 150 del mismo adyacente al espaciador 140 y el canal 51 de salida cruza el volumen 130 de contención de muestra en un segundo extremo 151 del mismo, adyacente al espaciador 140. La combinación del tubo 40 de entrada, el canal 41 de entrada, el volumen 130 de contención de muestra, el canal 51 de salida y el tubo 50 de salida, proporciona así una trayectoria de flujo continuo para el flujo estrecho, sustancialmente laminar de la composición de muestra hasta, a través y desde la celda 2. Las flechas A y B representan el flujo hacia dentro y hacia fuera del tubo 40 de entrada y el tubo 50 de salida, respectivamente.

La bomba 55 se sitúa ventajosamente en el tubo 50 de salida para impulsar la solución desde un volumen de muestra en la dirección de la flecha A hacia el tubo 40 de entrada. La solución fluirá a través del tubo 40 de entrada, el volumen 130 de contención de muestra y el tubo 50 de salida pasado el electrodo 35 de referencia y hacia fuera en la dirección de la flecha B. Alternativamente, la bomba 55 puede situarse en el tubo 40 de entrada para impulsar la solución a través del tubo 40 de entrada, el volumen 130 de muestra y el tubo 50 de salida. La bomba 55 puede controlarse para suspender su funcionamiento para contener una solución particular en la celda 2 durante un periodo de tiempo. Ventajosamente, se usa la misma trayectoria de flujo a través del tubo de entrada, el volumen de contención de muestra y el tubo de salida para todas las soluciones y fluidos que pasan a través de la celda 2, por lo que un fluido realiza una acción de limpieza hidrodinámica, forzando el fluido anterior fuera de la celda 2. La construcción de flujo continuo permite la rápida alternancia entre las etapas de iniciación y permite que se les imprima a los electrodos de trabajo una tensión variable o se mantengan de manera continua en un potencial preoperativo mientras se expone de manera continua a una o más soluciones sin exponer estos electrodos al aire, lo que puede producir fluctuaciones de tensión aleatorias.

Montado dentro del volumen 130 de contención de muestra hay un electrodo 5 de trabajo y un contraelectrodo 10. En otras realizaciones, pueden utilizarse múltiples electrodos de trabajo. Estos electrodos pueden construirse ventajosamente de platino, oro, carbono u otros materiales que sean eficaces para este fin.

El electrodo 5 de trabajo y el contraelectrodo 10 proporcionan la superficie de contacto para imprimir el potencial sobre la solución dentro del volumen 130 de contención de muestra que activa las reacciones químicas y desencadena la electroquimioluminiscencia en esta muestra y/o proporciona energía para la limpieza y acondicionamiento de las superficies de la celda 2. El electrodo 5 de trabajo está donde tienen lugar las reacciones electroquímicas y de ECL de interés.

El electrodo 35 de referencia proporciona una tensión de referencia a la que se refiere la tensión aplicada por el electrodo 5 de trabajo, por ejemplo, + 1,2 voltios frente a la referencia, y se sitúa ventajosamente en el tubo 50 de entrada en una posición alejada de la celda 2. Hilos 60, 62 y 82 conductores conectan el electrodo 5 de trabajo, el contraelectrodo 10 y el electrodo 35 de referencia, respectivamente, a una fuente de control de la tensión, que no se muestra. Las fuentes de control de la tensión adecuadas incluyen los potenciostatos y circuitos de trabajo convencionales descritos en la solicitud PCT publicada WO 82/14138.

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La figura 3 es otra ilustración de la celda 2 electroquímica empleada en el aparato de la presente invención. Se muestra el posicionamiento relativo con respecto al electrodo 5 de trabajo, el contraelectrodo 10, el imán 15, el volumen 130 de muestra y la lente 148. Los conectores 101 proporcionan medios para conectar el tubo 40 de entrada al canal 41 de entrada, y el tubo 50 de salida al canal 51 de salida de la base 120. El imán 15 ilustrado en la figura 3 tiene una configuración de intercalación que concuerda con la presente invención, tratado de manera más particular a continuación.

Los imanes empleados en el aparato y métodos de esta invención tienen una configuración en la que se comprimen las líneas de flujo magnético de la(s) fuente(s) de campo magnético, es decir, se comprime el gradiente de campo magnético. Manipulando las líneas de flujo magnético de esta manera, puede controlarse la forma y densidad del campo magnético sin expandirlo significativamente en tamaño. La forma y distribución del campo magnético pueden controlarse para proporcionar una distribución más regular sobre la superficie del electrodo sin una extensión significativa de la superficie del electrodo, que se traduce en una distribución más regular de las partículas capturadas sobre el electrodo (menos apilamiento) sin un aumento significativo en la interferencia del TFM.

La figura 4 ilustra un imán habitual conocido en la técnica que comprende una única fuente 99 de campo magnético, es decir, un par de polos N-S, y la figura 9 es una representación de su campo magnético. La figura 5 (un ejemplo comparativo, sin ser parte de la presente invención) ilustra un imán con canal en el que una única fuente 99 de campo magnético se une a un material 98 altamente imantable en la forma de un canal en forma de U. En tal configuración, el material 98 imantable se convierte en una extensión del polo magnético al que está unido. Con la extensión del polo magnético (S) en ambos lados del polo opuesto (N) del par, las líneas de flujo magnético procedentes de la fuente 99 de campo magnético se dispersan o extienden sobre un área superficial mayor porque un polo de la fuente de campo magnético se divide esencialmente. Las configuraciones de imán en las que se extiende un polo del imán para dispersar el campo magnético pueden variar ampliamente y tales configuraciones serán evidentes para un experto en la técnica, basándose en la descripción del presente documento. Una característica importante de esta configuración de imán y otras que proporcionan dispersión solamente es que las líneas magnéticas del flujo se redirigen sin aumentar la intensidad del campo magnético mediante la aplicación de una segunda fuente de campo magnético.

La figura 8 (un ejemplo comparativo, sin ser parte de la presente invención) muestra las líneas de flujo magnético que definen el campo magnético para el imán con canal de la figura 5. Podría conseguirse un patrón similar de líneas de flujo con tres fuentes de campo magnético separadas. El campo magnético se distribuirá sobre la misma área superficial pero las líneas de flujo magnético se extenderán normalmente de manera adicional desde la superficie del electrodo, produciendo interferencia con el tubo fotomultiplicador debido al efecto aditivo de tres fuentes de campo magnético separadas. Emplear un material sensible magnéticamente para extender el polo magnético permite la dispersión de los campos magnéticos sin aumentar el campo magnético en su totalidad.

Los materiales sensibles magnéticamente que pueden extender un polo magnético pueden variar ampliamente en forma, tamaño y composición. Esencialmente, puede usarse cualquier aleación o material ferromagnético con una alta saturación magnética. Un material usado con particular ventaja es el que se denomina vanadio-Permandur, que comprende normalmente un 50% de hierro, un 40% de cobalto y un 2% de vanadio y está disponible de muchas fuentes incluyendo Applied Magnetics, Baltimore, MD. El uso de un material sensible magnéticamente diferente para extender un polo magnético permite que se obtengan imanes con configuraciones complejas. Pueden obtenerse imanes de fuente de campo única, de un componente con una configuración similar, pero se requieren métodos de fabricación complejos.

En una realización de la presente invención, el imán utilizado para capturar las partículas magnéticas dentro de la composición de muestra tiene una configuración en la que se comprimen las líneas de flujo magnético, es decir, se comprime el gradiente de campo magnético. En tales realizaciones, se emplean dos o más fuentes de campo magnético y se configuran de tal manera que sus campos magnéticos que se oponen solapan o se fuerzan. Esto se consigue situando polos que se oponen (N-N o S-S) a mayor proximidad entre sí que los polos que se atraen (N-S) de las fuentes de campo magnético, es decir, una configuración "coercitiva". Esto incluye polos que se oponen contiguos. La figura 6 ilustra un ejemplo de una configuración coercitiva, denominada en el presente documento como un "imán de intercalación" en el que se ponen contiguos polos que se oponen. La figura 7 es una representación de las líneas de flujo magnético para tal imán. Al configurar dos o más fuentes de campo magnético de tal manera, el campo magnético en su totalidad es más ancho con relación al de una única fuente de campo magnético y dado que se comprime el gradiente de campo magnético, aumenta la densidad de flujo sin extender significativamente el campo magnético por encima de la superficie del electrodo como es el caso en el que se configuran dos o más fuentes de campo magnético con una configuración aditiva.

Aunque la figura 6 ilustra un imán de intercalación que tiene dos o más fuentes de campo magnético, la presente invención incluye configuraciones que tienen más de dos fuentes de campo magnético, incluyendo cuatro, cinco, seis, siete, ocho, etc. Sin embargo, emplear sólo dos fuentes de campo magnético en el imán de intercalación simplifica la construcción y puede preferirse en algunos dispositivos de detección por ECL por este motivo. Las fuentes de campo magnético empleadas pueden ser imanes permanentes o electroimanes pero preferiblemente son imanes permanentes para la simplicidad de la construcción de la celda. Para formar un imán de intercalación, simplemente pueden unirse juntos imanes permanentes habituales mediante un medio convencional tal como con una resina epoxídica o un adhesivo anaerobio de alta fuerza de unión.

Los imanes de intercalación, como en la figura 6, proporcionan un aumento del 30 o el 40% en la señal de captura con respecto a los imanes habituales como en la figura 4, para las siguientes partículas que responden magnéticamente: perlas Dynal 280, perlas Dynal 450 y perlas Rhone-Poulenc. Con la reducción de la interferencia del TFM, el aumento en la señal de ECL es incluso mayor y normalmente es aproximadamente 2,5 veces mayor con las perlas Dynal 280, aproximadamente 3,5 veces más grande con las perlas Dynal 450 y 3,0 veces mayor con las perlas Rhone-Poulenc en condiciones de funcionamiento convencionales. Las señales de capturas mejoradas se correlacionan con una sensibilidad mejorada. Además de mejorar la señal de captura mediante la captura más eficaz de partículas, los imanes de intercalación retienen las partículas de manera más eficaz comparado con imanes habituales. Cuando el aparato de detección por ECL tiene una celda de flujo continuo con composiciones de muestra y soluciones de lavado que pasan a su través, puede aumentarse la velocidad de bombeo sin una pérdida de señal, permitiendo que se acorte el tiempo del ciclo de modo que puedan analizarse más muestras por unidad de tiempo. Pueden obtenerse mejoras similares en la señal de captura y la retención con respecto a los imanes habituales con otras configuraciones de imán en las que se comprimen las líneas de campo magnético.

El imán empleado puede variar significativamente en forma y, en cierto grado, en tamaño. El tamaño del imán está limitado normalmente por el espacio disponible dentro de la celda del aparato de detección por ECL. Han resultado ventajosos los imanes de forma rectangular que tienen polos norte-sur que se extienden a lo largo de su dimensión más larga, en configuraciones coercitivas, permitiendo que se configuren múltiples imanes que se oponen dentro de un pequeño volumen. En realizaciones preferidas, se sitúa una sustancia que responde magnéticamente entre las fuentes de campo magnético. Esta sustancia que responde magnéticamente redirige las líneas de flujo magnético en cierto grado además de espaciar las fuentes de campo magnético y sirve para dar forma al campo magnético. En realizaciones preferidas, la sustancia que responde magnéticamente es una aleación de hierro u óxido de hierro tal como vanadio-Permandur.

Es deseable proporcionar líneas magnéticas de fuerza en la región por encima del electrodo de trabajo que son casi horizontales con respecto al plano del electrodo. Esto induce una orientación de las partículas que responden magnéticamente en la que las partículas se encuentran sobre la superficie del electrodo y los restos activos ECL pueden evaluarse fácilmente con respecto a la energía electroquímica suministrada por el electrodo. El aparato mostrado en la figura 3 muestra el imán situado justo por debajo del electrodo. Sin embargo, en realizaciones seleccionadas, un imán puede ser móvil con relación a la superficie del electrodo de modo que permita una sencilla liberación o eliminación de las partículas que responden magnéticamente en la superficie del electrodo. Para algunas realizaciones, se ha encontrado ventajoso que el imán esté anclado sobre pivote bajo el electrodo de modo que permita la extensión en la trayectoria de flujo para capturar partículas y retirarlas de la trayectoria de flujo para la medición de ECL. Es habitual un arco de aproximadamente 60º para la posición superior con respecto a la posición inferior. Tal configuración aumenta la eficacia de captura sin aumentar la interferencia con el TFM.

Aunque puede usarse cualquier tipo de imán permanente, se han usado aleaciones de neodimio-hierro-boro con ventaja en el diseño de imán de intercalación y el diseño de imán con canal con vanadio-Permandur como el material sensible magnéticamente que ayuda a definir la forma y densidad del campo magnético. Los imanes empleados normalmente tienen un fino recubrimiento de níquel para evitar la corrosión. Se ha encontrado que espesores de imán de 0,508 - 0,762 mm (20 - 30 mil) son ventajosos en imanes de intercalación con espaciadores de vanadio-Permandur de un espesor similar. Los espaciadores pueden oscilar en espesor desde esencialmente cero, es decir, menos de 0,01 veces el espesor del imán hasta 2,0 veces el espesor de los imanes empleados.

Las líneas de flujo magnético de imanes de captura que se extienden desde la superficie del electrodo pueden producir presumiblemente interferencia con TFM desviando electrones de su trayectoria normal cuando se desplazan desde el fotocátodo hasta la primera fase de diodo. Los electrones desviados pueden dar como resultado una disminución de la ganancia. Cuando se usa el imán de intercalación, disminuye este efecto considerablemente puesto que sus líneas de flujo magnético no se extienden alejándose de la superficie del electrodo.

El uso de imanes con las configuraciones especiales requeridas de esta invención muestra una ventaja particular en el aparato de detección por ECL con celdas de flujo continuo que tienen una separación de celda (la distancia entre la superficie superior del imán y la superficie del electrodo de trabajo) inferior a 0,381 mm (15 mil). La separación de celda influye en el rendimiento del imán en la captura de partículas. Las separaciones de celda habituales oscilan desde 0,254 - 0,635 mm (10 - 25 mil).

Los métodos de la presente invención emplean un imán que tiene una configuración que proporciona líneas de flujo magnético comprimidas. El método supone introducir una composición de muestra en una celda para muestra, en el que dicha composición de muestra contiene partículas suspendidas que responden magnéticamente con un resto activo ECL unido a las mismas; imponer un campo magnético sobre la composición de muestra de suficiente intensidad para recoger las partículas que responden magnéticamente en la superficie de un electrodo; imponer una tensión sobre dicho electrodo suficiente para inducir que el compuesto activo ECL produzca luminiscencia y medir la luminiscencia emitida. Este método puede realizarse ventajosamente con el aparato de la presente invención tal como el que se muestra en la figura 1, en el que se extrae una muestra del carrusel 120 mediante el medio 100 de control de muestras y se introduce en la celda 2. Se recogen las partículas que responden magnéticamente sobre la superficie del electrodo 5 de trabajo con el imán 15. Si se ancla sobre pivote, el imán 15 está preferiblemente en la posición superior y tras la recogida de las partículas que responden magnéticamente, se retira el imán 15 de la posición superior. Opcionalmente, se apaga la bomba una vez que se recogen las partículas sobre la superficie del electrodo y la composición de muestra está en el estado estático mientras se aplica una tensión al electrodo 5 y el contraelectrodo 10 suficiente para inducir luminiscencia. Entonces, un tubo fotomultiplicador mide la luminiscencia emitida desde la composición de muestra. Tras la medición, la celda para muestra puede purgarse de composición de muestra con una solución de limpieza. Cuando se ancla sobre pivote, el imán puede retirarse de la superficie del electrodo para liberar las partículas que responden magnéticamente. Tras la liberación, puede introducirse una solución de acondicionamiento en la celda para muestra y aplicarse una tensión para acondicionar la superficie del electrodo para la siguiente medición.

El aparato y método de la presente invención no se limitan a composiciones de muestra particulares. Las muestras pueden ser sólidos, emulsiones, suspensiones, líquidos o gases y pueden derivarse de varias fuentes tales como células, agua, disolventes orgánicos, aire y similares, tales como las descritas en el documento PCT 92/00982. La composición de muestra puede contener un analito de interés que puede variar ampliamente desde células, partículas subcelulares, virus, haptenos, antígenos, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas y similares, tales como los descritos más particularmente en el documento PCT 92/00982. Normalmente, el analito de interés está presente a bajas concentraciones inferiores a aproximadamente 10^{-3} molar y pueden ser de tan sólo 10^{-12} molar o inferior. En algunas realizaciones, los analitos de interés pueden entrar en una reacción de unión tal como interacción con ADN o ARN, una reacción antígeno-anticuerpo, una reacción ligando-receptor y similares. Esta reacción de unión puede permitir la incorporación de un marcador, tal como un marcador activo ECL. Los marcadores pueden incorporarse en el analito directamente, en una pareja de unión, o a través de otro componente reactivo. Una alternativa a marcar el analito de interés directa o indirectamente es marcar un análogo del mismo que compite con el analito. El uso de parejas de unión y análogos del analito de interés se describe más particularmente en el documento WO92/14138 en el que se denominan como "sustancias para la realización de ensayos".

Ventajosamente, los restos activos ECL usados como marcadores son quelatos metálicos. Esencialmente, puede usarse cualquier quelato metálico que producirá luminiscencia en condiciones electroquímicas. El metal puede ser, por ejemplo, un metal de transición, tal como un metal de transición del bloque d, o un metal de las tierras raras. Los metales de transición adecuados incluyen los seleccionados de los grupos que consisten en lutecio, osmio, rutenio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnecio, cobre, cromo o tungsteno. Los metales de transición preferidos son rutenio y osmio. Los ligandos que se unen al metal de tales quelatos metálicos son normalmente de naturaleza heterocíclica u orgánica y desempeñan un papel en la determinación de la solubilidad. Ejemplos de ligandos adecuados son los ligandos polidentados y ligandos monodentados descritos en el documento WO92/14138. Ejemplos de quelatos metálicos adecuados son los siguientes: bis[(4,4’-carbometoxi)-2,2’-bipiridina]-2-[3-(4-metil-2,2’-bipiridina-4-il)propil]-1,3-dioxolano-rutenio (II); bis(2,2’-bipiridina)[4-(butan-1-al)-4’-metil-2,2’-bipiridina]rutenio (II); bis(2,2’-bipiridina)[ácido 4-(4’-metil-2,2’-bipiridina-4’-il)-butírico]rutenio (II); tris(2,2’bipiridina)rutenio (II); (2,2’-bipiridina)[bis-bis(1,2-difenilfosfino)etilen]-2-[3-(4-metil-2,2’-bipiridina-4’-il)propil]-1,3-dioxolano-osmio (II); bis(2,2’-bipiridina)[4-(4’-metil-2,2’-bipiridina)-butilamina]rutenio (II); bis(2,2’-bipiridina)[1-bromo-4(4’-metil-2,2’-bipiridina-4-il)butano]rutenio (II); ácido bis(2,2’-bipiridina)maleimidohexanoico, 4-metil-2,2’-
bipiridina-4’-butilamida-rutenio (II). Otros restos activos ECL se describen en los documentos WO92/14138, WO88/
0394 y US87/00987.

Los restos activos ECL preferidos son aquellos con tris(2,2’-bipiridina)rutenio (II) que pueden experimentar una reacción electroquimioluminiscente con tripropilamina (TPA). Las sales de tris(bipiridil)rutenio (II) son compuestos solubles en agua, muy estables que pueden modificarse químicamente con grupos reactivos para formar restos activos tales como el éster de NHS de Ru(bpy)_{3}^{2+} de fórmula I siguiente.

1

Estos restos pueden unirse a proteínas, haptenos, ácidos nucleicos, etc.

La reacción de ECL de la especie activa ECL dentro de la composición de muestra se inicia mediante una tensión aplicada. Pueden aplicarse muchas formas de onda de tensión diferentes para iniciar la reacción de ECL. La figura 12 ilustra mediciones de la corriente del electrodo de trabajo y la intensidad de ECL inducida por la aplicación de una onda triangular a los electrodos de un analizador Origen® 1.5 con éster de NHS de Ru(bpy)_{3}^{2+} de la fórmula I anterior con TPA. La tensión aplicada tal como se muestra es realmente la tensión medida en el electrodo de referencia e incluye los efectos de una resistencia significativamente descompensada; en consecuencia, la tensión real aplicada en el electrodo de trabajo es sustancialmente menor que la representada. La corriente que fluye en la celda antes de aplicar una tensión a los electrodos es principalmente el resultado de la oxidación de la TPA y de la hidrólisis del agua. La reacción electroquimioluminiscente se vuelve evidente cuando la tensión aplicada alcanza aproximadamente 1100 mA. Se muestra que la intensidad de la luminiscencia aumenta con la tensión aplicada hasta que se agota la TPA en la superficie del electrodo. La luminiscencia observada, ilustrada en la figura 12, puede medirse fácilmente con los tubos fotomultiplicadores convencionales.

Tal como puede apreciar un experto habitual en la técnica, la cantidad de quelato metálico u otro resto ECL que contiene metal incorporado en la composición de muestra puede variar ampliamente de sistema a sistema. Generalmente, la cantidad de resto utilizado es la que es eficaz para dar como resultado una emisión detectable y, si se desea, cuantificable de energía electromagnética procedente de la composición de muestra. La detección y/o cuantificación de un analito de interés se realiza normalmente y se compara con la luminiscencia procedente de la muestra que contiene una cantidad conocida de analito de interés como un patrón de calibración.

Las partículas a las que se une el resto ECL comprenden ventajosamente material microparticulada que tiene un diámetro de 0,0001 a 200 \mum. Estas micropartículas deben responder magnéticamente y normalmente comprenden dióxido de hierro, u otros óxidos de hierro. La superficie de las micropartículas debe contener un componente que pueda unirse al analito de interés, un análogo del mismo o una pareja de unión. Se describen ejemplos adecuados en el documento WO92/14138. Éstos incluyen almidón reticulado, dextranos, proteínas, y similares. La densidad de las partículas puede variar ampliamente y normalmente pueden tener una densidad de desde 1,0 hasta 5,0 g/ml y preferiblemente tienen una densidad de desde 1,1 hasta 2 g/ml. La concentración de las partículas usadas en la preparación de la composición de muestra también varía ampliamente, tal como por ejemplo, 1 - 10.000 mg/ml, preferiblemente 5 - 1000 mg/ml. Se describen partículas magnéticas adecuadas en las patentes de los EE.UU. números 4.628.037; 4.695.392; 4.695.393; 4.698.302; 4.554.088; y el documento EP 0 180 384. Las partículas pueden ser paramagnéticas o ferromagnéticas. Es deseable que las partículas magnéticas tengan una baja resonancia magnética de modo que cuando se retira el campo magnético de la superficie del electrodo, las partículas se desimantan y se eliminan de la celda.

Con el fin de introducir energía electroquímica en la especie activa ECL en la composición de muestra, debe sumergirse el electrodo en un electrolito que normalmente es una solución de una o más sales u otras especies en agua, un líquido orgánico o una mezcla de los mismos. Se facilitan ejemplos adecuados en el documento WO92/14138.

Puede realizarse una variedad de ensayos usando los métodos de esta invención. Los métodos de esta invención y el aparato de esta invención pueden medir cantidades traza de microorganismos, productos farmacéuticos, hormonas, virus, anticuerpos, ácidos nucleicos y otras proteínas.

Sin una elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior, utilizar la presente invención en su mayor extensión. Por tanto, las realizaciones específicas preferidas siguientes deben considerarse como meramente ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción de ningún modo.

En lo anterior y en los ejemplos siguientes, todas las temperaturas se presentan en grados Celsius y a menos que se indique lo contrario, todas las partes y porcentajes son en peso.

Ejemplos Instrumentación

Se emplea un aparato de detección por ECL tal como se muestra en las figuras 1 - 3, que tiene un imán de captura de una configuración de intercalación de la figura 6, en los ejemplos que ilustran la invención. El imán de intercalación se sustituye por un imán habitual de la figura 4 en los ejemplos comparativos. Los componentes de manejo de fluidos, el luminómetro, el potenciostato y la celda de flujo electroquímico de cada aparato son los de un analizador Origen 1.5 con las siguientes características, a menos que se indique lo contrario:

Electrodo de trabajo - disco de Au, diámetro de 3 mm

Contraelectrodo - disco de oro, diámetro de 3 mm

Electrodo de referencia - Ag/AgCl separación de celda - 0,305 mm (12 mil)

Componentes de la composición de muestra

Resto ECL - éster de NHS de Ru(bpy)_{3}^{2+} = Ru(2,2’-bipiridil)_{2}(4-[3-(1,3-dioxilan-2-il)propil]-4’-metil-2,2’-bipiri-
dina)^{2+} obtenido de Igen, Inc.

Tampón de ECL - KH_{2}PO_{4} 112 mM, K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 88 mM, NaCl 50 \mum, NaN_{3} 6,5 mM, Triton X-100 0,8 \mum, Tween 20 0,4 mM, tripropilamina H_{2}O 100 mM.

Diluente de ECL - KH_{2}PO_{4} 37,5 mM, K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 109,2 mM, NaCl 151,7 mM, NaN_{3} 0,65 mM, albúmina sérica bovina 0,43 mM en H_{2}O.

Micropartículas

a) Dynal M-450 Dynabeads, partículas superparamagnéticas de diámetro de 4,5 \muM, 30 mg/mL obtenidas de Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021.

b) Dynal M-280 Dynabeads, partículas superparamagnéticas de diámetro de 2,8 \muM, 10 mg/mL obtenidas de Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021.

Micropartículas recubiertas

Las micropartículas (perlas Dynal M-280) se recubren con proteína mezclando 1 mL (30 mg) de partículas en 150 micromoles/litro de tampón bicarbonato-carbonato de sodio (pH 9,6) con un volumen igual de 0,5 a 1,0 g/l de solución de proteína. Esta solución de proteína se incuba durante 15 minutos a 37ºC. Entonces, se separan las partículas y se incuban durante 15 minutos en el diluyente de ECL descrito anteriormente.

Anticuerpos marcados

Para marcar anticuerpos con Ru(bpy)_{3}^{2+}, se mezclan 1 mg de anticuerpo y 0,5 mL de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,8) con 3 mL de éster de NHS de Ru(bpy)_{3}^{2+} en dimetilsulfóxido anhidro. Se permita que proceda el marcaje durante 30 minutos y luego se termina mediante la adición de 25 \mul de reactivo de glicina 1,0 m/l y se incuba adicionalmente durante 10 minutos. Entonces, se purifica la proteína marcada mediante su paso a través de una columna Sephadex G25, se eluye con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) que contiene una azida de sodio, 0,5 g/L. Se recogen y reúnen las fracciones de proteína marcada con Ru(bpy)_{3}^{2+}.

Los inmunoensayos pueden realizarse mezclando 100 mL de muestra, 75 mL de micropartículas recubiertas y 75 mL de anticuerpo marcado e incubando la mezcla con agitación durante 15 minutos.

Ciclo de medición de ECL

El ciclo de medición de ECL consiste en tres etapas: 1) preacondicionamiento; 2) medición; y 3) limpieza. La etapa de preacondicionamiento supone la aplicación de una forma de onda triangular de tensión de 0,0 - 2,2 voltios a -1,0 a + 0,6 voltios a 2,0 v/seg. La etapa de medición supone la aplicación de una forma de onda triangular de + 0,6 voltios a + 2,8 voltios a + 2,0 voltios a 1,0 voltios por segundo. La etapa de limpieza supone la aplicación de una forma de onda cuadrada de tensión de desde 0,0 a 3,0 voltios hasta de -0,5 voltios a 0,0 voltios. Todas las tensiones son con relación al electrodo de referencia de Ag/AgCl.

Ejemplo 1 Ensayo de HBsAG de BMG 280 usando tampón Flash

Se llevaron a cabo ensayos de HBsAg de BMG 280 manuales (incubación de 15 min. a 37ºC) y se hicieron funcionar dispositivos de detección por ECL según se describió anteriormente, teniendo uno una configuración de imán de intercalación de la presente invención y teniendo el otro un imán de captura habitual. Se analizan las composiciones de muestra con ambos dispositivos a varias velocidades de captura para determinar la velocidad de captura óptima. Todos los ensayos se ejecutan usando tampones BMG, la secuencia RACEF (velocidad de barrido de 4800 mV/seg y límite de barrido de 2600 mV) y con los elementos de calefacción fijos en 35ºC. A continuación, en la tabla 1, se muestran resultados a modo de ejemplo

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

Los datos en la tabla 1 muestran que, para el imán habitual a una separación de celda de 0,305 mm (12 mil), la velocidad de captura óptima es de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 50 rpm (revoluciones por minuto). El imán intercalado, a una separación de celda de 0,305 mm (12 mil), tiene una velocidad de captura óptima de aproximadamente 60 rpm. Las razones de ensayo muestran un aumento de aproximadamente el 14% cuando se usa el imán intercalado. Usando el imán intercalado para el ensayo de HBsAg, ha de reducirse la tensión del TFM desde 850 V (usada con el imán habitual) hasta 800 V debido al aumento de las cuentas del ensayo por encima del límite de 9,5 millones.
Se cree que el cambio de 50 V desde 800 V hasta 850 V hace que aumenten las cuentas de ECL en un factor de 1,79.

Los resultados del ensayo muestran un aumento de 2,08 veces en las cuentas del imán habitual al intercalado. Aproximadamente el 50% del aumento se debe a la mejora en la ganancia del TFM (reducción de los efectos de interferencia en el TFM). Se cree que el aumento restante se debe a la captura más eficaz de las perlas y/o a que las perlas se encuentran en una configuración más óptima que permite una ECL más eficaz. El potencial de pico aumenta en más de 100 mV con el cambio de imanes de la configuración habitual a la intercalada. Esto muestra cómo cambia la orientación de las perlas sobre la superficie del electrodo con el diseño de imán.

Ejemplo 2 Ensayo de TSH sin separación de BMG usando tampón Igen

Para evaluar adicionalmente el rendimiento del diseño de imán intercalado, se realizan ensayos de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) sin separación de BMG, con la velocidad de la bomba de captura en 40 rpm y 80 rpm. Se usan una celda Lexn 280 (separación de celda = 0,254 mm (10 mil) y la secuencia RACE280 NEW en un analizador Origen 1.5, según se describió anteriormente, con un imán habitual y un imán intercalado de cuatro imanes. Se mide la ECL para calibradores de TSH. El tiempo de captura para la captura a 40 rpm es igual a 16,8 segundos y para la captura a 80 rpm es de 8,4 segundos.

Los resultados indican que las razones de imán intercalado son mejores que las razones de imán habitual tanto a 40 rpm como a 80 rpm. Véase la figura 10. Se muestran de nuevo las diferencias entre los imanes en la manera en que influyen en la distribución de perlas sobre la superficie del electrodo. Los potenciales de pico se desplazan a valores más positivos usando el imán intercalado, lo que indica una distribución de perlas diferente.

Ejemplo 3 Ensayo de sonda de ADN usando tampón IGEN

Los ensayos de ADN se ejecutaron usando los dispositivos de detección por ECL descritos anteriormente con el imán habitual y las dos configuraciones de imán intercalado a velocidades de captura de 40 rpm y 80 rpm. Las razones no mejoran drásticamente cuando se usa el imán intercalado; sin embargo, el aumento en las magnitudes de la señal oscilaron desde el 40% hasta el 100% (véase la figura 11). Los resultados también muestran que usando el diseño de imán intercalado, pueden aumentarse las rpm de captura hasta 80 rpm, permitiendo una reducción en el tiempo de ensayo.

Otra observación de estos ensayos de ADN es que con el aumento en la señal procedente del diseño intercalado, el mantenimiento de la misma magnitud de la señal que con el imán habitual permite una velocidad de captura incluso más rápida (el tiempo de captura disminuye en un factor de cuatro). El uso de una velocidad de captura de 40 - 60 rpm con el imán intercalado proporcionará beneficios a partir de ambas de un aumento del 40 - 50% en la señal y un tiempo del ciclo más rápido.

Incluidos dentro de los métodos proporcionados por esta invención, se encuentran métodos para realizar ensayos tales como inmunoensayos y ensayos con sondas de ADN en una variedad de formatos. En la realización de un ensayo, el complejo marcado unido a la micropartícula que se detecta y cuantifica, se forma normalmente mediante una reacción dentro de la solución o participa en una reacción dentro de la solución. El compuesto marcado puede ser el analito de interés, un análogo o un componente que compite con el analito de interés. Tales compuestos se denominan a menudo como "compuestos que producen ensayo". Las reacciones que proporcionan un complejo marcado ECL unido a micropartículas se conocen bien y algunas se describen en el documento WO92/14138, incluyendo:

Ejemplo 5 - IgB de ratón marcada con Ru(bpy)_{3}^{2+};

Ejemplos 9 y 10 - anti-TSH de ratón marcado con Ru(bpy)_{3}^{2+}; y

Ejemplos 16 - 18 - Preparación de partículas magnéticas de ácidos nucleicos

Preparación de partículas magnéticas de estreptavidina

Los ensayos de sondas de ADN de esta invención pueden incluir métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación para aumentar la sensibilidad. Se describen preparaciones de muestra y métodos de prueba adecuados en Clinical Chemistry, volumen 37, nº 8 (1991) y Clinical Chemistry, volumen 38, nº 6 (1992).

Los métodos de ensayo de la presente invención incluyen inmunoensayos de intercalación en fase sólida competitivos en los que pueden usarse dos anticuerpos específicos para diferentes epítopos del analito. Se describen técnicas de ensayo específicas más particularmente en los siguientes ejemplos del documento WO/92/14138.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior, utilizar la presente invención en su mayor extensión. Por tanto, las realizaciones específicas preferidas siguientes deben considerarse como meramente ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción de ningún modo.

Claims

1. Aparato para analizar una composición de muestra que comprende:

a): una celda (2) para contener dicha composición de muestra y que comprende un electrodo (5) adaptado para aplicar una tensión a la composición de muestra;

b): un imán (15) de captura situado por debajo de una superficie de dicho electrodo y adaptado para atraer magnéticamente componentes que responden dentro de la composición de muestra hacia la superficie del electrodo;

c): medios para imprimir una tensión (25) sobre dicho electrodo suficiente para generar luminiscencia a partir de especies activas electroquimioluminiscentes dentro de la composición de muestra; y

d): medios para medir la luminiscencia generada dentro de dicha composición (20);

en el que dicho imán (15) de captura consiste en un imán de intercalación que comprende al menos dos fuentes de campo magnético dispuestas a lo largo de un eje común paralelo a dicha superficie del electrodo de manera que los polos que se oponen de las fuentes de campo magnético adyacentes estén a mayor proximidad que los polos que se atraen de las mismas fuentes de campo magnético adyacentes.

2. Aparato según la reivindicación 1, en el que dicho medio para imprimir una tensión comprende una fuente (25) de tensión.

3. Aparato según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho imán de captura comprende de dos a ocho fuentes de campo magnético, y dicho aparato comprende una sustancia que responde magnéticamente situada entre las fuentes de campo magnético.

4. Aparato según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho imán de captura comprende dos o más fuentes de campo magnético adaptadas para atraer y distribuir sobre la superficie del electrodo, micropartículas que responden magnéticamente dentro de la composición de muestra que tienen un resto activo electroquimioluminiscente unido a ellas.

5. Aparato según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho medio para medir la luminiscencia generada dentro de cada composición de muestra comprende un detector (20) luminoso.

6. Aparato según la reivindicación 1, en el que los polos que se oponen de las fuentes de campo magnético dentro del imán de captura son contiguos entre sí.

7. Aparato según cualquier reivindicación anterior, en el que las fuentes de campo magnético comprenden imanes permanentes.

8. Aparato según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho imán de captura puede ser móvil con relación a la superficie del electrodo.

9. Método para medir la electroquimioluminiscencia procedente de una composición de muestra utilizando el aparato según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha composición de muestra contiene una especie activa electroquimioluminiscente (ECL) que comprende un resto activo ECL y una partícula que responde magnéticamente, comprendiendo dicho método:

a): introducir un volumen conocido de dicha composición de muestra en dicha celda;

b): recoger la especie activa ECL que comprende un resto activo ECL unido a una partícula que responde magnéticamente sobre una superficie de dicho electrodo mediante la imposición de un campo magnético sobre dicha partícula que responde magnéticamente;

d): medir la luminiscencia emitida desde la composición de muestra.

en el que el campo magnético impuesto sobre dichas partículas que responden magnéticamente se proporciona mediante dicho imán de captura.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende la etapa adicional de separar las especies activas ECL que comprenden dicho recto activo ECL unido a dicha partícula que responde magnéticamente de los otros componentes de la composición de muestra.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la etapa de separación adicional se realiza antes de la etapa de medir la luminiscencia de la composición de muestra.

12. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que la etapa adicional de separar las especies activas ECL capturadas sobre la superficie del electrodo de los otros componentes se realiza después de la etapa de recoger las especies activas ECL sobre una superficie de dicho electrodo.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que las micropartículas que responden magnéticamente tienen un diámetro dentro del intervalo de 0,0001 a 200 micras y una densidad de desde 1,0 hasta 5,0 g/ml.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la etapa de recoger las especies activas ECL comprende extender el imán al interior de la celda y retirar el imán de la celda antes de la etapa de imponer una tensión sobre dicho electrodo.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que la composición de muestra es un fluido en movimiento.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que las especies activas ECL comprenden un resto activo ECL a base de rutenio u osmio.

17. Método según la reivindicación 16, en el que las especies activas ECL están unidas a una célula, partícula subcelular, microbio, virus, hapteno, antígeno, anticuerpo, ácido nucleico o proteína.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en el que las especies activas ECL compuestas por un resto activo ECL unido a una partícula que responde magnéticamente están presentes en una concentración inferior a 10^{-3} molar.

19. Método según la reivindicación 9, en el que las especies activas ECL compuestas por un resto activo ECL unido a una partícula que responde magnéticamente están presente en una concentración inferior a aproximadamente 10^{-12} molar.

20. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que la luminiscencia medida a partir de la composición de muestra es al menos el doble de la medida a partir de la composición de muestra en la que el imán de captura no tiene una fuente de campo magnético con líneas de flujo magnético que se dispersan o se comprimen.