ES2267095T3 - Procedimiento in vitro para inducir la hinchazon nuclear. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PRODUCTOS Y METODOS PARTICULARMENTE UTILES PARA ACTIVAR Y ANALIZAR NUCLEOS DE CELULAS SIN DIVISION. LOS PRODUCTOS CARACTERIZADOS INCLUYEN ACTIVACION DE EXTRACTOS DE HUEVOS, EXTRACTOS DE FACTOR CITOESTATICO (CSF), CONJUNTOS QUE CONTIENEN ESTOS EXTRACTOS, Y UNA PLATINA DE MICROSCOPIO DE MICROCAMARA UTIL EN EL ANALISIS DE ACTIVACION DEL NUCLEO.

Description

Procedimiento in vitro para inducir la hinchazón nuclear.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a productos y procedimientos para el análisis de núcleos celulares de mamífero quiescentes, tales como los núcleos de células fetales humanas y núcleos de células espermáticas de mamífero.

Antecedentes de la invención

Jackson, Seminars in Perinatology 15:49, (1991), describe diversos procedimientos para el diagnóstico prenatal, incluyendo procedimientos para diagnosticar enfermedades. Estos procedimientos implican el análisis del ADN presente en las etapas embrionarias tempranas. Específicamente, Jackson menciona la utilización de una reacción en cadena de polimerasa para amplificar genes, y la posibilidad de someter a ensayo oocitos mediante el ensayo de cuerpos polares. Según Jackson:

"Existen otros enfoques concebibles de biopsia embrionaria para el diagnóstico prenatal. El trofectodermo puede obtenerse en etapas embrionarias multicelulares posteriores, cuando resulta posible obtener más células e inducir su replicación en cultivo de tejido... Otro enfoque del diagnóstico prenatal temprano es la recuperación de células fetales en la circulación materna. Esta tentadora posibilidad de procedimiento no invasivo ha sido investigada durante varios años por parte de varios grupos tanto en los Estados Unidos como en el Reino Unido. Ambos grupos originalmente han buscado marcadores inmunológicos placentarios para la identificación y recuperación de estas células. Se han desarrollado varios anticuerpos trofoblásticos, algunos de los cuales aparentemente presentan una especificidad relativa para la célula fetal. Tras esporádicas noticias de éxito, algunos artículos recientes aparentemente indican que estos marcadores son insuficientemente específicos y que de hecho se encuentran unidos a células maternas con suficiente frecuencia para que este enfoque no resulte viable por el momento".

Bianchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3279, (1990), describen el aislamiento de eritrocitos nucleados fetales en sangre materna utilizando un anticuerpo monoclonal contra el receptor de transferrina. Estos autores afirman que "se tuvo éxito en la detección de la secuencia del cromosoma Y en el 75% de los embarazos portadores de varón, demostrando que resulta posible aislar secuencias génicas fetales de células en la sangre materna".

Según Roberts, Science 18:378, (1991), dos procedimientos disponibles para el cribado prenatal son el muestreo de tejido coriónico (CVS) y la amniocentesis. Ambos procedimientos presentan problemas que implican tiempos de espera y riesgo de aborto, "estimado en 1% a 2% para el CVS y en 0,5% para la amniocentesis." Supra. Roberts también señala un procedimiento para analizar directamente el ADN nuclear cuando las células se encuentran en interfase.

Lohka y Masui, Science 220:719, (1983), describen la inducción de la formación de una cubierta nuclear en esperma desmembranado de Xenopus laevis utilizando una preparación libre de células procedente del citoplasma de óvulos activados de Rana pipiens.

Leno y Laskey, J. Cell Biology 112:557, (1991), llevaron a cabo experimentos con eritrocitos de pollos adultos. Según Leno:

"Coppock et al. (1989) [Supra], han informado de que resulta necesario un pretratamiento con tripsina para la descondensación nuclear y la replicación del ADN de los núcleos de eritrocitos en extracto de huevo de Xenopus. El pretratamiento de tripsina no resultó necesario para la descondensación nuclear ni la replicación del ADN en nuestros extractos".

Gordon et al., Experimental Cell Research 157:409, (1985), describen "un sistema para la activación del esperma humano utilizando extractos libres de células procedentes de óvulos de Xenopus laevis". De manera similar, un resumen de Brown et al., J. Cell Biology 99:396a, (1984), indica que los cambios nucleares que se producen durante las etapas tempranas de la fertilización pueden estimularse mediante la inyección de núcleos aislados de esperma en óvulos receptores heterólogos, o mediante la incubación de núcleos de esperma de rana en presencia de extractos libres de células procedentes de óvulos de rana. Afirman que han descubierto que el esperma humano puede activarse in vitro utilizando extracto de huevo de rana Xenopus laevis para estimular los sucesos tempranos de la activación nuclear, entre ellos la descondensación de la cromatina, el hinchamiento nuclear y la síntesis del ADN.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a productos y procedimientos útiles para hacer que núcleos quiescentes se activen (es decir, que pasen por una o más etapas de la activación nuclear). Los productos y procedimientos descritos resultan particularmente útiles para activar los núcleos de células fetales humanas y los núcleos de células espermáticas de mamífero. La "activación" de un núcleo de una célula quiescente en la presente invención se refiere al hinchamiento nuclear.

Los ácidos nucleicos pueden analizarse en la etapa de activación, inducida por la presente invención, con el fin de obtener información útil, tal como información sobre la estructura y secuencias de un ácido nucleico, el número de copias de una secuencia de ácidos nucleicos, y la localización nuclear de un ácido nucleico. El análisis de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas en la técnica, tales como la hibridación in situ.

Una ventaja particular de la presente invención es su utilización en el diagnóstico prenatal. La activación de los núcleos de las células fetales puede utilizarse para facilitar el diagnóstico prenatal de diversas condiciones humanas. Los núcleos de todos los tipos de células fetales humanas, incluyendo las células sanguíneas (tales como los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y otras células circulantes del feto), así como otros tipos de célula fetal, tales como las células presentes en el líquido amniótico, o las células derivadas de la placenta (tales como los trofoblastos o los trofoblastos sincitiales), pueden activarse utilizando los productos y procedimientos descritos. Preferentemente, las células fetales que deben activarse se recuperan de la sangre o del tejido de una mujer embarazada, y no directamente del feto o de la placenta, reduciendo de esta manera la probabilidad de que se produzcan incomodidades o daños en el feto y/o en la madre debidos al procedimiento diagnóstico.

La expresión "actividad de activación" se refiere a la capacidad de un agente de producir la activación nuclear. Entre los ejemplos de agentes que producen la activación nuclear se incluye un extracto de factor citostático no activado (CSF). La potenciación de la actividad de activación se refiere a un incremento de la actividad de activación producida por un agente que causa la activación nuclear. Entre los ejemplos de agentes que potencian la activación nuclear ocasionada por un agente activador se incluyen el extracto CSF.

La actividad de activación puede medirse utilizando técnicas conocidas en la práctica. Entre estas técnicas se incluyen la visualización microscópica de núcleos hinchados, la incorporación de precursores de ácidos nucleicos marcados en ácidos nucleicos nuevamente sintetizados, la visualización microscópica de cromosomas en metafase, y la hibridación in situ.

Entre los procedimientos descritos se incluye el pretratamiento de un núcleo humano en reposo para potenciar su capacidad de activarse, produciendo la activación nuclear completa o parcial, y producir y analizar esta activación nuclear en un portaobjetos de microscopio con microcámara. Entre otros procedimientos útiles dados a conocer se incluyen la preparación de productos, tales como un extracto de huevo activador, un extracto CSF, y un extracto CSF modificado; la utilización de una etapa de pretratamiento con proteasa en la activación del esperma; un ensayo de activación; un ensayo de integración retrovírica; y un procedimiento para clonar animales completos utilizando núcleos activados.

El núcleo de una célula fetal en reposo o de una célula espermática normalmente es pequeño, presenta la cromatina condensada y no se replica ni se divide. Las secuencias específicas de ácidos nucleicos en el núcleo de estas células pueden teñirse mediante procedimientos de hibridación in situ fluorescente si la secuencia diana de ácidos nucleicos resulta accesible para la sonda. Sin embargo, el tamaño reducido del núcleo puede afectar a la accesibilidad de las secuencias particulares de ácidos nucleicos y a la cantidad de información obtenida de la hibridación con éxito. Además, las señales de hibridación obtenidas con éxito presentan una resolución espacial limitada por el tamaño del núcleo. Como resultado, la obtención de una señal fluorescente fiable puede resultar difícil y la información obtenida mediante tinción fluorescente generalmente indica sólo la presencia o la ausencia de secuencias específicas accesibles, y posiblemente el número de estas secuencias por núcleo.

En los procedimientos descritos, la presente invención produce el hinchamiento nuclear. Puede obtenerse información genética de este suceso, que se caracteriza por cambios de la estructura y función nucleares. La información útil obtenida en esta etapa de activación incluye que se facilita la visualización de una región cromosómica particular utilizando una sonda mediante el incremento de la resolución espacial durante el hinchamiento, incrementando de esta manera la accesibilidad de la región cromosómica para la sonda.

De esta manera, en un primer aspecto, la invención incluye un procedimiento para causar el hinchamiento del núcleo de una célula fetal humana.

La presente invención puede utilizarse para estudiar los ácidos nucleicos de células fetales aislados por diferentes procedimientos. Por ejemplo, pueden obtenerse células fetales de sangre materna circulante, o mediante técnicas tales como la amniocentesis o la biopsia coriónica. Preferentemente, la célula fetal se obtiene de una manera no invasiva (es decir, sin perturbar el útero). Las células fetales, tales como eritrocitos y leucocitos, cruzan la placenta y circulan transitoriamente en la sangre materna. Además, los trofoblastos que forman la capa más externa de la placenta pueden desprenderse y circular por la sangre materna. Los trofoblastos típicamente acaban atrapados en la red de capilares pulmonares de la madre.

El aislamiento nuclear y el pretratamiento preferentemente se llevan a cabo utilizando condiciones moderadas. Las condiciones moderadas son aquéllas que permiten llevar a cabo el aislamiento nuclear y el pretratamiento causando una cantidad mínima de daños a las proteínas y a los ácidos nucleicos. La utilización de condiciones moderadas ayuda a mantener la integridad de los ácidos nucleicos, reduciendo de esta manera los artefactos durante la tinción posterior, y evitando la activación prematura de las proteasas, permitiendo de esta manera que se produzca el tratamiento con proteasas posterior bajo condiciones controladas seleccionadas para optimizar el tratamiento.

Preferentemente, se lleva a cabo el aislamiento nuclear y el pretratamiento para liberar el núcleo del citoesqueleto circundante, formando de esta manera un núcleo pretratado, en dos etapas: (1) permeabilización de la membrana, y (2) separación o alteración (es decir, desnaturalización o degradación) de las proteínas citoesqueléticas y las proteínas de la matriz nuclear. Estas etapas pueden llevarse a cabo simultáneamente o separadamente. La formación de un núcleo pretratado preferentemente se lleva a cabo bajo condiciones que minimizan el daño producido en los ácidos nucleicos y en las histonas.

La permeabilización de la membrana la abre, facilitando de esta manera el posterior tratamiento nuclear. Pueden utilizarse diferentes técnicas para la permeabilización de la membrana, incluyendo el choque hipotónico, rotura y detergente. Preferentemente se utiliza un detergente no iónico para permeabilizar las membranas plasmática y nuclear. Más preferentemente, se utiliza lisolecitina como el detergente no iónico.

Pueden utilizarse diferentes procedimientos para separar, desnaturalizar y degradar las proteínas citoesqueléticas que circundan al núcleo y las proteínas de la matriz nuclear dentro del núcleo. Entre estos procedimientos se incluyen la utilización de un agente reductor tiol para desnaturalizar las proteínas nucleares, utilizando la extracción salina controlada para eliminar selectivamente las proteínas del citoesqueleto y de la matriz nuclear, y utilizando un tratamiento polianiónico controlado para facilitar la separación de los ácidos nucleicos cargados negativamente de las proteínas nucleares cargadas positivamente. Las condiciones de separación pueden seleccionarse para garantizar que se produzcan daños mínimos en los ácidos nucleicos, histonas y proteínas no citoesqueléticas. Preferentemente se utiliza una proteasa bajo condiciones moderadas para eliminar las proteínas citoesqueléticas que circundan al núcleo. Más preferentemente, se utiliza tripsina como la proteasa. En la realización más preferente, el pretratamiento se lleva a cabo con tripsina y lisolecitina.

Los núcleos se activan bajo condiciones no sintéticas que inhiben la síntesis de los ácidos nucleicos. Como resultado, el núcleo se hincha con o sin formación de una cubierta nuclear, pero el ADN no se replica ni entra en mitosis. La resolución espacial incrementada resultante producida por el hinchamiento nuclear facilita la utilización de sondas de ácidos nucleicos al incrementar la accesibilidad de regiones de los ácidos nucleicos. Las condiciones no sintéticas, que sin embargo permiten alcanzar el hinchamiento nuclear, pueden conseguirse mediante la adición de reactivos tales como 6-dimetilaminopurina (por ejemplo 5 mM), al extracto CSF.

En otro aspecto, se describe un procedimiento para inducir el hinchamiento en núcleos quiescentes. El procedimiento puede utilizarse para inducir el hinchamiento en ausencia de un extracto activador y en ausencia de síntesis del ADN. En particular, se suplementa el extracto CSF con un inhibidor de proteína quinasa y una solución acuosa.

En otro aspecto, se describe un procedimiento para activar un núcleo de célula espermática de mamífero. El procedimiento implica las etapas de: (a) pretratar una célula espermática utilizando un permeabilizador de membranas, una proteína y un agente reductor tiol para formar una célula espermática pretratada, y (b) activar la célula espermática pretratada. El procedimiento puede utilizarse para estudiar el esperma de diferentes mamíferos. Estos estudios pueden llevarse a cabo, por ejemplo, para determinar si el esperma contiene un gen o una secuencia particular de ácidos nucleicos que pueden transferirse durante la fertilización.

En otro aspecto, se describe un producto para causar el hinchamiento nuclear. El producto contiene extracto CSF suplementado con un inhibidor de proteína quinasa y una solución acuosa.

Entre las ventajas de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, facilitar el cribado prenatal mediante la optimización de condiciones para la activación nuclear, que causan el hinchamiento del núcleo de una célula fetal. En esta etapa de activación puede obtenerse con facilidad información importante sobre las secuencias de ácidos nucleicos o sobre la morfología cromosómica, por ejemplo mediante la utilización de sondas de ADN. Debido a que algunas células fetales, tales como trofoblastos, eritrocitos y leucocitos pueden obtenerse de una fuente materna, una ventaja de la invención es que es un procedimiento no invasivo para detectar la presencia de defectos genéticos en dichas células.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente de las realizaciones preferentes de la misma, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las realizaciones preferidas

En primer lugar se describirá brevemente el dibujo.

Dibujo

La Fig. 1 muestra el efecto sobre la replicación del ADN de los núcleos activados, de utilizar extracto CSF suplementado con 6-dimetilamino-purina (DMAP).

Procedimientos y productos

Entre los procedimientos para activar los núcleos se incluyen aquellos descritos por Coppock et al., Developmental Biology 131:102, 1989; Wangh, J. Cell Science 93:1, (1989); Wood y Earnshaw, J. Cell Biology 111:2839, (1990); Leno y Laskey, J. Cell Biology 112:557, (1991); Young, Biology of Reproduction 20:1001, (1979); Philpott et al., Cell 65:569, (1991); Shamuy Murray, J. Cell Biology 117:921, (1991); Adachi et al., Cell 64:137, (1991); Newport y Spann, Cell 48:219, (1987); y Henry Harris, en CELL FUSION 40-50 (Harvard University Press, 1970).

DiBernardino et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 83:8231, (1986), y Orr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1369, (1986), describen experimentos de trasplante nuclear para activar los núcleos de Rana pipiens. DiBernardino pudo obtener renacuajos con una tasa de supervivencia de hasta un mes, mediante el trasplante de células somáticas diferenciadas en óvulos enucleados.

La presente invención da a conocer procedimientos y productos que resultan útiles para activar un núcleo quiescente, y para estudiar dicha activación. Estos procedimientos y productos resultan especialmente útiles para analizar núcleos de células fetales humanas quiescentes, tales como aminocitos, queratinocitos, trofoblastos, eritrocitos y leucocitos. Sin embargo, los procedimientos y productos también resultan útiles para activar los núcleos de otros tipos de células humanas quiescentes, tales como otros tipos de células fetales quiescentes y de esperma, y células en reposo aisladas de otros mamíferos.

La preparación de un núcleo para la activación nuclear y la producción de la activación nuclear se describen en detalle posteriormente. Entre las etapas se incluyen: (1) la preparación de núcleos humanos quiescentes, (2) la preparación de extractos CSF no activados de una fuente tal como óvulos no activados de Xenopus.

También se describen en detalle posteriormente extractos CSF modificados que pueden producir el hinchamiento nuclear en ausencia de un extracto de huevo activador.

Los procedimientos y productos proporcionados pueden utilizarse para causar la activación de un núcleo humano quiescente, induciendo de esta manera el hinchamiento. Los procedimientos proporcionados en la presente invención referentes a la activación de los núcleos generalmente se basan en procedimientos existentes utilizados en otros sistemas. Sin embargo, se dan a conocer mejoras sobre los sistemas existentes. Además, los procedimientos existentes no se han utilizado anteriormente en células fetales humanas, ni es conocido si producirían resultados útiles en estas células.

Se proporcionan Ejemplos para ilustrar diferentes aspectos y realizaciones de la presente invención. Debe entenderse que resultan posibles diversas modificaciones diferentes y se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

I. Activación nuclear (1) Preparación de núcleos

La presente invención proporciona un procedimiento para la activación de núcleos celulares de mamífero quiescentes, preferentemente núcleos celulares humanos quiescentes. Antes de activarlos, se aíslan y se pretratan los núcleos humanos quiescentes. Una fuente preferida de células humanas quiescentes son las células fetales recuperadas de la sangre de mujeres embarazadas, tales como trofoblastos, eritrocitos y leucocitos (tales como granulocitos, neutrófilos, basófilos y eosinófilos). El aislamiento de estas células no requiere la penetración en el útero. La presente invención también resulta útil para analizar otros tipos de núcleos celulares humanos quiescentes, incluyendo queratinocitos quiescentes (es decir, aquellos aislados del líquido amniótico), aminocitos, y células espermáticas, o células similares obtenidas de mamíferos aparte del ser humano.

Las células fetales quiescentes pueden recuperarse del suministro sanguíneo materno utilizando técnicas tales como la tinción de anticuerpos seguido de la separación celular (por ejemplo ver Bianchi, Non-Invasive Method For Isolation and Detection of Fetal DNA, patente PCT/US/90/06623, incorporada como referencia en la presente memoria). Las técnicas de separación celular con anticuerpos separan las células fetales de las células maternas basándose en la presencia de diferentes antígenos sobre las células fetales y maternas. El antígeno puede diferenciarse con anticuerpos adecuados. Entre estos anticuerpos, que puede obtener un experto en la materia, se incluyen HLe-1, que reconoce un antígeno presente sobre los leucocitos humanos maduros, tales como los granulocitos, y sobre precursores muy inmaduros de los eritrocitos, pero no sobre las células nucleadas, y los anticuerpos contra el receptor de transferrina (ver, por ejemplo, Bianchi, supra, patente PCT/US90/06623). Pueden llevarse a cabo procedimientos con anticuerpos poniendo en contacto una muestra que contiene sangre fetal y materna con un anticuerpo marcado que reconoce las células fetales y las células maternas. La célula marcada con anticuerpo puede separarse utilizando técnicas estándar, incluyendo la citometría de flujo, las perlas inmunomagnéticas y el panning
celular.

Las células humanas quiescentes deben aislarse bajo condiciones moderadas diseñadas para evitar la activación de las proteasas extracelulares (por ejemplo aquéllas del plasma), de las proteasas intracelulares, o de las nucleasas, así como para evitar el daño mecánico a las estructuras celulares. La activación involuntaria de proteasas o nucleasas durante el aislamiento nuclear podría ocasionar daños tanto en el material genético de la célula como en las estructuras proteicas dentro o circundando los ácidos nucleicos. Entre los posibles daños a los ácidos nucleicos se incluyen la degradación de los ácidos nucleicos, y los daños al estado estructural (por ejemplo el superenrollamiento). Una ventaja de mantener intacta la estructura proteica, es mantener la proteína citoesquelética de manera que posteriormente pueda separarse de los ácidos nucleicos bajo condiciones moderadas, minimizando los daños a las histonas y a las proteínas no esqueléticas.

Preferiblemente, las soluciones utilizadas para aislar células contienen inhibidor de proteasa. Las soluciones utilizadas para aislar células como las soluciones HBSS y NIB pueden suplementarse con inhibidores de proteasa de la manera siguiente: heparina 0,1 mg/ml, TPCK 0,1 mM (N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona), TLC 0,1 mM (N\alpha-p-tosil-L-lisina clorometil cetona), PMSF 0,05 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), leupeptina 5 \mug/ml, o Na_{2}S_{2}O_{5} 31,25 mM.

Tras la purificación celular, el núcleo celular preferentemente se aísla y se pretrata bajo condiciones moderadas. El pretratamiento nuclear preferentemente comprende dos etapas, que pueden llevarse a cabo simultánea o separadamente: (1) permeabilización de la membrana, y (2) separación o alteración (por ejemplo desnaturalización o degradación) de proteínas citoesqueléticas y proteínas de matriz nuclear. El tratamiento debe llevarse a cabo para minimizar los daños a los ácidos nucleicos dentro del núcleo.

La separación o alteración de determinadas proteínas aparentemente resulta una etapa necesaria para la activación. Por ejemplo, en los eritrocitos de Xenopus, la digestión proteolítica de las proteínas citoesqueléticas, tales como la vimentina, aparentemente resulta una etapa necesaria para la posterior activación nuclear (Coppock et al., Developmental Biology 131:102, (1989). El pretratamiento debe preparar al núcleo para la posterior activación, y no causar la activación.

Entre las condiciones deseadas para la permeabilización de la membrana plasmática se incluyen el tratamiento suave con detergentes, el tratamiento suave con proteasas, la rotura moderada, y el choque hipotónico suave. Las condiciones moderadas son aquellas condiciones capaces de permeabilizar la membrana plasmática, creando daños mínimos en el ADN y proteínas nucleares. La permeabilización puede detectarse utilizando azul tripán. El azul tripán es un pigmento que no puede entrar en células intactas. La entrada del azul tripán en una célula indica permeabilización. La degradación de las proteínas debido a la activación involuntaria de las proteasas puede determinarse utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida para buscar productos de degradación de las proteínas. El grado en que los ácidos nucleicos nucleares se encuentran intactos puede establecerse mediante la utilización de electroforesis de gel de agarosa para determinar la presencia de productos de degradación de los ácidos nucleicos.

Entre los posibles pretratamientos para la separación o alteración de las proteínas citoesqueléticas y las proteínas de matriz nuclear se incluyen los siguientes:

(a)

Tratamiento con uno o más agentes reductores tiol, tales como ditiotreitol 10 mM durante un tiempo limitado, a una temperatura y pH controlados, para desnaturalizar la proteína citoesquelética;

(b)

Extracción salina controlada, tal como mediante lavado en tampones suplementados con cantidades crecientes de NaCl o de KCl comprendidas en el intervalo entre 0,025 y 1,0 M, para eliminar selectivamente las proteínas citoesqueléticas y las proteínas unidas a ADN;

(c)

Tratamiento controlado con polianiones, tales como heparina a una concentración comprendida entre 0,01 y 1,0 mg/ml o tripolifosfato pentasódico a 70 nM, en tampón borato 10 mM (TPP) a pH 9,0, para eliminar selectivamente la proteína citoesquelética cargada positivamente;

(d)

Degradación de las proteínas citoesqueléticas utilizando una proteasa.

El grado de daño a las proteínas y al ADN puede medirse tal como se ha descrito anteriormente. Preferentemente el aislamiento nuclear y el pretratamiento pueden realizarse simultáneamente utilizando concentraciones moderadas de lisolecitina (por ejemplo 40 \mug/ml) y proteasa (por ejemplo 0,3 \mug/ml de tripsina), de manera que se producen daños mínimos en las proteínas no citoesqueléticas, histonas y ácidos nucleicos. Deben utilizarse los tiempos y temperaturas mínimos requeridos para el tratamiento con detergentes y proteasas. En el caso de los glóbulos rojos, estos son aproximadamente 10 minutos a 25ºC utilizando 0,3 \mug/ml de tripsina y 40 \mug/ml de lisolecitina. Tal como apreciará un experto en la materia, el tiempo y la temperatura preferentes cambian con la concentración de los reactivos.

También puede llevarse a cabo un tratamiento controlado con agentes quelantes selectivos de iones como pretratamiento adicional. Entre los agentes quelantes selectivos de iones adecuados se incluyen EGTA, que puede quelar Ca^{2+}, EDTA, que puede quelar Ca^{2+} y Mg^{2+}, y mimosina, que puede quelar Cu^{2+}, Al^{3+} y Fe^{3+}. Estos iones estabilizan la estructura de cromatina de orden más alto, de esta manera su quelación puede ayudar en la descondensación de la cromatina.

Entre los procedimientos para terminar el pretratamiento con detergente y con proteasa se incluye añadir proteínas para adsorber los detergentes (tal como albúmina de suero bovino al 0,4%; la albúmina de suero bovina utilizada en esta etapa debe prepararse mediante diálisis de fracción V de BSA disponible comercialmente frente a agua destilada para eliminar las sales solubles, seguido de liofilización) y añadir los inhibidores de proteasa (tales como el inhibidor de tripsina de soja) a la reacción. Los núcleos pretratados seguidamente deben lavarse utilizando una solución helada diseñada para mantener intacto el ADN genómico. Puede utilizarse tampón NIB para este fin. El NIB está constituido por
sacarosa 250 mM, NaCl 25 mM, Pipes 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, espermidina 0,5 mM y espermina 0,15 mM, pH 7,0.

La eficacia global de las condiciones moderadas en la obtención de un núcleo pretratado puede determinarse mediante: a) el examen microscópico de núcleos para evaluar si los núcleos se encuentran libres de su citoesqueleto circundante y si se encuentran separados o agrupados; el agrupamiento de núcleos es una indicación fuerte de daño nuclear, debido a que muchos núcleos resultan atrapados en ADN liberado; y b) la capacidad de los núcleos de responder a extracto de óvulos activador; la utilización de condiciones moderadas incrementa la posterior activación de los núcleos individuales y mejora la sincronía y la homogeneidad con la que se activa la población entera de núcleos.

(2) Tratamiento con extracto de CSF de los núcleos

Puede utilizarse extracto de CSF no activado para ayudar en la posterior activación nuclear de núcleos celulares de mamífero quiescentes, incluyendo núcleos celulares humanos para causar directamente el hinchamiento nuclear, tal como se comenta en la sección II, infra.

La capacidad del extracto CSF de potenciar la activación puede incrementarse con diversos suplementos.

El extracto CSF preferentemente se prepara a partir de óvulos no inducidos detenidos en la metafase meiótica. El extracto CSF preparado a partir de óvulos no inducidos detenidos en la metafase meiótica contiene niveles elevados de actividad de factor promotor de mitosis (MPF) y actividad de factor citostático (CSF). CSF y MPF son factores presentes en extracto CSF que se cree que ayudan en la posterior activación de los núcleos quiescentes mediante la alteración de las proteínas citoesqueléticas, las proteínas de la matriz nuclear y las histonas nucleares, particularmente mediante la fosforilación de estas proteínas.

MPF es una actividad que controla la entrada nuclear en la mitosis y el inicio de la formación del huso. MPF está compuesta de dos subunidades catalíticas, p34^{cdc2} y ciclina B. Al iniciarse la anafase, la ciclina B es destruida, dando como resultado la inactivación de MPF. Durante la anafase, el cromosoma se desplaza hacia los dos polos opuestos del huso y seguidamente se descondensa.

CSF es una actividad responsable de la detención de la metafase en los óvulos de vertebrado no fertilizados. La actividad de CSF se debe a por lo menos dos quinasas: la quinasa activada por mitógeno (MAP) y cdk2/ciclina (cdk2 es una quinasa relacionada con cdc2, pero la subunidad reguladora de cdk2 es la ciclina E (o A) y no la ciclina B). Las actividades de MAP aparentemente se encuentran controladas por quinasas adicionales, tales como la quinasa C-Mos.

Un motivo para obtener extracto CSF de óvulos detenidos en la metafase meiótica es que tanto MPF como CSF resultan inactivados al iniciarse el ciclo celular.

Los extractos CSF procedentes de óvulos no inducidos de Xenopus pueden prepararse mediante un procedimiento basado en el trabajo de Lohka y Masui, Developmental Biology 103:434, (1984), así como en el de Murray et al., Nature 339:280, (1989). Un procedimiento para obtener extracto CSF es el siguiente. Los óvulos se obtienen de una o más ranas en ovulación, tal como se ha descrito anteriormente. Cada lote de óvulos recién ovulados, aproximadamente 500 a 1.000 óvulos, se endurece tal como se ha descrito anteriormente. Se descartan los óvulos dañados y los activados. Los óvulos restantes se agrupan en un vaso grande de vidrio siliconado o de teflón y se lavan 4 ó 5 veces a temperatura ambiente (aproximadamente 21ºC) en aproximadamente 500 ml de tampón EB que contiene EGTA potásico 5 mM, pH 7,5 (EB = gluconato potásico 50 mM, sacarosa 250 mM, HEPES potásico 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, pH ajustado a 7,5 con hidróxido potásico). A continuación, los óvulos se transfieren a un tubo de centrifugación volumétrico de polialómero, se mezclan con aceite F-50 Versilube (General Electric) en una proporción de 0,2 ml/ml óvulos, y se agrupan fuertemente mediante centrifugación a 40X g durante 1 minuto, a temperatura ambiente. Las capas superiores de aceite y acuosas se separan y los óvulos se trituran mediante centrifugación durante 15 minutos a 9.000X g, a 2-4ºC. La capa citoplasmática entre el pellet de yema y la capa lipídica encima se recogen desde el fondo pinchando el tubo de centrifugación con una aguja de jeringa. Se añade citocalasina B hasta una concentración final de 10 a 50 \mug/ml y se añade EGTA potásico hasta una concentración final de 1 mM. El material citoplasmático se mezcla pipeteando u oscilando suavemente, después el material citoplasmático se centrifuga durante 15 minutos a 9.000X, a 2-4ºC. Un procedimiento alternativo de centrifugación implica la preparación de un sobrenadante de alta velocidad mediante centrifugación a >100.000X g durante 2 horas a 2-4ºC. En cualquier caso, el segundo sobrenadante citoplasmático que resulta (en adelante denominado "extracto CSF preparado") se recupera y se utiliza fresco o se diluye hasta el 7,5-10% en glicerol y se congela para su posterior utilización de la misma manera que el extracto de óvulos activador. Preferentemente el extracto CSF se incuba a 25ºC durante 2 horas previamente a la congelación. El nivel de actividad de histona H1 quinasa se incrementa en varias veces durante el periodo de incubación.

Los extractos congelados pueden utilizarse mediante descongelación rápida a temperatura ambiente y después colocarlos sobre hielo. Los extractos descongelados preferentemente se suplementan con un sistema regenerador de ATP que consiste en fosfato de creatina 10 mM y creatina fosfoquinasa 10 \mug/ml.

La actividad histona H1 quinasa, el estado estructural del ADN de plásmido añadido al extracto CSF, y la incapacidad del extracto CSF de causar la activación nuclear, demuestran que el "extracto CSF preparado" se había detenido en la metafase meiótica. La actividad de histona H1 quinasa del extracto CSF antes o después de la congelación era elevada. Tras activar el extracto con Ca^{2+} 1,2 a 4 mM, se redujo la actividad de histona. Preferentemente se utilizó Ca^{2+} 1,2 mM al suplementar el extracto CSF con EGTA 1 mM para conseguir el reciclado. No se produce ningún reciclado al utilizar Ca^{2+} 3 a 4 mM en extracto CSF suplementado en presencia de EGTA 1 mM. El ADN de plásmido circular negativamente superenrollado añadido al extracto se relajó. Los núcleos de eritrocitos de Xenopus pretratados con lisolecitina-tripsina añadidos al extracto CSF no consiguieron hincharse ni sintetizar ADN.

Varios suplementos del extracto CSF, en la concentración apropiada, incrementaron la capacidad del extracto CSF de potenciar la actividad de activación sin resultar en actividad prematura de síntesis de ADN. Entre los suplementos útiles se incluyen los inhibidores de proteína quina.

II. Utilización de un extracto CSF para causar el hinchamiento nuclear

El hinchamiento nuclear puede producirse en núcleos quiescentes mediante la utilización de un extracto CSF modificado, preparado mediante centrifugación a alta o baja velocidad, o mediante la utilización de un extracto CSF o extracto CSF modificado preparado mediante centrifugación a alta velocidad (un "extracto CSF parcialmente purificado"). La utilización de un extracto CSF para inducir el hinchamiento nuclear preferentemente se lleva a cabo en núcleos aislados pretratados para separar los núcleos de su citoesqueleto circundante, preferentemente con detergente y una proteasa, tal como se describe en la presente memoria. Preferentemente el extracto CSF modificado es un extracto CSF parcialmente purificado y en cualquier caso se modifica mediante dilución con una solución acuosa y suplementando con un inhibidor de proteína quinasa. Puede modificarse el extracto CSF fresco o el extracto descongelado congelado.

La dilución del extracto CSF para potenciar su capacidad de causar el hinchamiento nuclear puede llevarse a cabo utilizando diversas soluciones acuosas, tales como agua y tampones de pH fisiológico. La solución acuosa preferentemente se encuentra tamponada a un pH comprendido entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. Un ejemplo de un tampón apropiado es el tampón EB (EB = gluconato potásico 50 mM, sacarosa 250 mM, HEPES potásico 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, pH ajustado a 7,5 con hidróxido potásico). Preferentemente la solución acuosa se añade en una cantidad para conseguir una dilución de entre el 25% y el 75%.

La capacidad del extracto CSF de causar el hinchamiento nuclear también puede potenciarse mediante la utilización de un inhibidor de proteína quinasa, tal como DMAP o estaurosporina. DMAP y estaurosporina son inhibidores de quinasa de amplio rango capaces de inhibir las acciones de tanto CSF como MPF. El experto en la materia podrá obtener otros inhibidores de proteína quinasa capaces de inhibir CSF y/o MPF. El inhibidor de quinasa seleccionado preferentemente podrá inhibir tanto CSF como MPF.

Preferentemente se utiliza DMPA 2,5 a 5 mM. La utilización de inhibidores de proteína quinasa debe bloquear las actividades quinasa en el extracto, incluyendo la histona H1 quinasa, y resultar en que los núcleos tratados formen cubiertas pero no consigan iniciar la replicación del ADN. El experto en la materia podrá determinar empíricamente la concentración apropiada de inhibidor de proteína quinasa mediante la medición del grado de hinchamiento y de replicación del ADN en presencia de diferentes cantidades de inhibidores de proteína quinasa.

Se utilizan tanto una solución acuosa como un inhibidor de proteína quinasa para modificar el extracto CSF. Los núcleos tratados con extracto CSF diluido suplementado con DMAP (CSF-DMAP) se hinchan hasta un volumen mayor que los núcleos tratados con CSF-DMAP no diluido. Preferentemente se diluye un inhibidor de proteína quinasa que contiene CSF (CSF-PKH) entre el 25% y el 75% utilizando un tampón apropiado, y los núcleos se incuban durante más de 60 minutos a 25ºC, y más preferentemente durante aproximadamente 90 minutos a 25ºC para medir el hinchamiento nuclear.

El extracto CSF-PKH diluido puede modificarse adicionalmente mediante la alteración de las concentraciones de los iones Ca^{2+} y Mg^{2+} para incrementar adicionalmente el hinchamiento, y afectar a la condensación y descondensación de la cromatina. Las concentraciones de los iones Ca^{2+} y Mg^{2+} puede alterarse mediante la adición de estos iones o mediante la eliminación de estos iones utilizando agentes quelantes, tales como ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA) (por ejemplo 5 mM), o ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) (por ejemplo 5 mM). La alteración de las concentraciones de iones Ca^{2+} y Mg^{2+} libres en CSF-PKH diluido presenta el efecto de modificar el grado de hinchamiento nuclear y la apariencia de la cromatina dentro del núcleo. Los niveles de los iones Ca^{2+} y Mg^{2+} muy bajos o nulos potencian el hinchamiento nuclear y la descompactación de la cromatina. El incremento de Ca^{2+} hasta 1,2 mM evita los niveles significativos de hinchamiento nuclear y de descompactación de la cromatina. La cantidad óptima de Ca^{2+} y Mg^{2+} y de quelante puede determinarse empíricamente variando la cantidad de quelante y la concentración de cationes y midiendo el hinchamiento de los núcleos.

Los agentes quelantes u otros agentes que provocan la descondensación de la cromatina, tales como los polianiones como la heparina y TPP o los agentes reductores tiol como el DTT, no resulta necesario que se añadan directamente al extracto CSF-PKH diluido. Estos agentes adicionales pueden utilizarse para hinchar o descondensar adicionalmente los núcleos tras el tratamiento en extracto CSF-PKH diluido.

III. Activación del esperma de mamífero

La presente invención también proporciona un procedimiento para activar el esperma de mamífero, que resulta particularmente adecuado para la activación del esperma humano. El procedimiento implica el pretratamiento del esperma humano con una proteasa (tripsina). El esperma pretratado puede activarse utilizando los diversos procedimientos descritos en la presente memoria, es decir, mediante la utilización de un extracto CSF suplementado con una solución acuosa y un inhibidor de proteína quinasa para conseguir el hinchamiento nuclear.

El procedimiento preferente para activar un esperma implica: (1) pretratamiento con una proteasa, un detergente, un agente reductor tiol, y preferentemente un bloqueante tiol para evitar la reasociación de los grupos sulfhidrilo, (2) un pretratamiento adicional con el extracto CSF. El esperma puede obtenerse utilizando técnicas conocidas en la técnica. El pretratamiento puede llevarse a cabo utilizando una proteasa y un detergente, secuencialmente o simultáneamente, seguido de un agente reductor tiol, seguido de un agente bloqueante tiol.

Un ejemplo de un protocolo preferente es el siguiente:

1.

Lisar esperma en lisolecitina 100 \mug/ml durante 5 minutos a 25ºC.

2.

Tratar con tripsina 100 \mug/ml durante 5 a 15 minutos (10 minutos es el óptimo) a 25ºC.

3.

Detener el tratamiento de lisolecitina y de tripsina mediante la utilización de inhibidor de tripsina de soja 30 \mug/ml y albúmina de suero bovino al 0,4%.

4.

Incubar los núcleos del esperma en ditiotreitol 5 mM durante 60 minutos a 4ºC.

5.

Detener la reacción 4 mediante la incubación de los núcleos en N-etilmaleimida 1 mM durante 10 minutos a 25ºC.

6.

Incubar los núcleos en extracto CSF durante 90 minutos a 25ºC, seguido de 60 minutos a 4ºC.

El procedimiento anterior tiene como resultado el hinchamiento nuclear sin formación de cubierta nuclear durante la etapa de pretratamiento con CSF (etapa 6). Las etapas 1-3, o su equivalente, resultan todas necesarias para conseguir el hinchamiento, formación de cubierta nuclear y replicación de ADN completos.

La activación de las células espermáticas presenta diversos usos, incluyendo su utilización para determinar si el esperma contiene un gen o secuencia de ácidos nucleicos particular que pueda transferirse durante la fertilización. Estos estudios resultan útiles, por ejemplo, para investigar el efecto del envejecimiento sobre el esperma; para detectar defectos cromosómicos, y para determinar la presencia en el esperma de genes foráneos (tales como aquellos que se encuentran presentes en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)).

Un ejemplo de la utilidad de dicho aspecto de la invención se encuentra en el campo de la cría animal, particularmente de la cría de animales transgénicamente modificados. Los animales no humanos modificados transgénicamente habitualmente se crean inyectando secuencias de ADN en embriones no humanos tempranos. Si el ADN inyectado se integra en el genoma de la célula huésped, puede acabar en la línea germinal del animal adulto tras la maduración del animal. Los animales transgénicos macho resultan particularmente deseables debido a que pueden cruzarse con muchas hembras. Sin embargo, previamente a la cría, se desconoce el porcentaje de células germinales modificadas, así como el número de copias y la distribución de los genes insertados en cada célula.

Los procedimientos y reactivos proporcionados en la presente invención para activar los núcleos de las células espermáticas y para examinar su composición genética, por ejemplo mediante hibridación in situ, hacen posible determinar el porcentaje de esperma que porta una o más copias del gen insertado. Esta información puede utilizarse para conocer la probabilidad de que un gen particular se transmita a una generación futura, previamente a la cría del animal. Esta información resulta deseable debido al tiempo y costes necesarios para la cría de un animal.

IV. Ensayo de activación nuclear

Los procedimientos dados a conocer en la presente invención, para activar núcleos, también pueden utilizarse como procedimiento general de ensayo para medir la activación nuclear y la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos en los núcleos activados. El ensayo resultaría particularmente útil para identificar y purificar los factores presentes en extracto CSF y para estudiar la fertilidad masculina.

Otro uso de un ensayo de activación nuclear es el estudio de la fertilidad masculina mediante la medición del grado de activación del esperma humano bajo diferentes condiciones. Estos estudios pueden utilizarse, por ejemplo, para examinar técnicas para la conservación del esperma de manera que el esperma pueda utilizarse posteriormente en la fertilización in vitro, para someter a ensayo el esperma de hombres no fértiles para identificar causas de la infertilidad masculina (ver Brown et al., Yale Journal of Biology And Medicine 65:29, 1992) (no reconocida como antecedentes de la técnica), y para someter a ensayo posibles anticonceptivos masculinos.

En prácticamente la totalidad de las especies de animales, las células espermáticas experimentan dos reacciones, la capacitación y la respuesta del acrosoma, antes de alcanzar la superficie del huevo y fusionarse con él. Tras la entrada del núcleo espermático en un huevo, experimenta varios cambios. El núcleo se hincha, adquiere una cubierta y una lámina nucleares, replica su ADN, y finalmente se fusiona con el pronúcleo femenino. Durante este proceso, las proteínas básicas espermáticas (histonas y protamina) se intercambian por histonas embrionarias.

Aparentemente para que un núcleo espermático responda a un citoplasma de huevo, en primer lugar debe experimentar alguna forma de digestión proteolítica. Un sitio probable de necesaria digestión proteolítica son las proteínas citoesqueléticas no histonas. Posibles anticonceptivos podrían dirigirse a enzimas proteolíticas necesarias. El efecto del anticonceptivo puede determinarse sometiendo a ensayo el grado con el que se inhibe la activación. Algunos posibles anticonceptivos también podrían reconocer otros enzimas que pueden resultar necesarios para la activa-
ción.

Alternativamente, el ensayo podría utilizarse para determinar las condiciones que resultan en niveles más altos de activación, encontrando de esta manera condiciones que potencian la fertilización.

Entre los usos específicos del ensayo de activación nuclear se incluyen los siguientes:

1)

Someter a ensayo la célula espermática tratada bajo diferentes condiciones de preparación, crioconservación, capacitación y manipulación.

2)

Someter a ensayo el efecto de los enzimas de la célula espermática (por ejemplo las proteasas, las nucleasas, las fosfatasas y las quinasas), incluyendo la inhibición de los enzimas de la célula espermática, sobre la activación.

3)

Un ensayo para purificar los enzimas que afectan a la activación.

4)

Someter a ensayo el esperma procedente de individuos no fértiles para determinar si la infertilidad se debe a problemas con la activación nuclear del esperma.

5)

Someter a ensayo la capacidad de fármacos o reactivos específicos de potenciar o de inhibir la activación.

6)

Someter a ensayo el efecto de inhibidores o de activadores de los enzimas de la célula espermática sobre la activación.

7)

Someter a ensayo la presencia de un gen utilizado para crear un animal transgénico, y

8)

Someter a ensayo la presencia de genoma vírico, tal como VIH, en el esperma.

El ensayo específico de activación nuclear utilizado para estudiar la fertilidad se ajustará al estudio del aspecto particular de la activación. Por ejemplo, para someter a ensayo el efecto de reactivos sobre la activación, el esperma debe manipularse y prepararse bajo condiciones moderadas. Tal como se ha comentado anteriormente, las condiciones moderadas resultan útiles para minimizar la activación involuntaria de las proteasas o de las nucleasas. Para obtener esperma para el ensayo de activación, en primer lugar deben lavarse muestras frescas de esperma en solución salina isotónica bajo condiciones moderadas. A continuación, el esperma puede almacenarse mediante congelación en nitrógeno líquido bajo condiciones controladas en presencia de crioprotector (Martin et al., en: Preimplantation Genetics, Plenum Press, New York, (editores Verinsky y Kuliev, 1991).

El esperma fresco o congelado/descongelado puede tratarse bajo condiciones que resulten en la capacitación, tal como describen Martin et al., supra. A continuación, se permeabiliza la membrana espermática bajo condiciones moderadas, tal como se ha descrito anteriormente (por ejemplo se utiliza lisolecitina para permeabilizar la membrana). Después, los núcleos se recuperan del esperma lisado mediante centrifugación moderada en tampón isosmótico. Los núcleos preferentemente se pretratan tal como se ha descrito anteriormente en la Sección II (por ejemplo utilizando un permeabilizador de membranas, una proteasa, y un agente reductor tiol).

A continuación, los núcleos puede pretratarse adicionalmente (por ejemplo utilizando extracto CSF que contiene Ca^{2+} 100 \muM).

La hibridación in situ puede llevarse a cabo para determinar la presencia, el número y la localización de secuencias particulares de ADN. El efecto de diversos reactivos sobre la activación nuclear puede determinarse mediante la adición de reactivos al esperma antes o después de diversas etapas individuales de aislamiento, pretratamiento, pretratamiento adicional o contracto con extracto de huevo.

V. Ensayo de integración retrovírica

Los ensayos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para examinar la integración del ácido nucleico provírico, tal como de VIH, en el ADN huésped. Los ensayos pueden llevarse a cabo utilizando un núcleo completo o un pseudonúcleo. Estos ensayos pueden utilizarse para identificar sitios diana para inhibir la integración provírica, y para derivar agentes antivíricos que se dirijan a estos sitios diana.

Un provirus es la forma de doble cadena del ADN de un retrovirus. Se sintetiza en el citoplasma de una célula infectada por un retrovirus mediante transcripción inversa del ARN vírico. La integración del ADN provírico en el genoma de la célula huésped es una etapa crítica en el ciclo de vida de todos los retrovirus, incluyendo VIH-1, y conduce a la expresión vírica y a la producción de nuevos virus. De esta manera, mediante el bloqueo de la integración vírica, puede inhibirse la propagación vírica (es decir, la multiplicación vírica y/o la infección vírica).

Puede llevarse a cabo un ensayo de integración de la manera siguiente:

1.

Se pre-trata un núcleo celular para separar el núcleo de su citoesqueleto circundante para formar un núcleo pretratado. La elección de núcleo celular puede variarse dependiendo del virus estudiado. Preferentemente, el núcleo celular se obtiene de una célula que es un huésped natural para el virus. Entre los ejemplos de células susceptibles a la infección retrovírica se incluyen las células de mamífero y las células vegetales. Preferentemente se utiliza un núcleo de célula humana.

2.

El núcleo pretratado se activa y se incuba con un complejo de integración vírico. Un complejo de integración vírica contiene el ADN de doble cadena provírico del ARN vírico y material necesario para la integración vírica. De esta manera, el complejo de integración contiene una integrasa y puede contener otros enzimas y proteínas víricos. Un experto en la materia puede obtener un complejo de integración utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, puede utilizarse un sobrenadante de alta velocidad de células infectadas por un virus como complejo de integración (Brown et al., Cell 49:347, 1987). Alternativamente, puede obtenerse un complejo de integración a partir de integrasa vírica purificada y oligonucleótidos específicos con las secuencias víricas necesarias para la integración (Engelman et al., Cell 67:1211, 1991). El complejo de integración puede añadirse a los núcleos, cromatina o pseudonúcleos, en diferentes puntos del ciclo celular. Por ejemplo, la incubación puede tener lugar antes (por ejemplo previamente a la activación), durante el periodo en el que se produce el hinchamiento nuclear y se están formando las cubiertas nucleares en el extracto CSF y en el extracto activador, o durante la formación de la cromatina, la formación de la cubierta nuclear o la replicación de los pseudonúcleos.

3.

Medición de la integración de los ácidos nucleicos víricos en los ácidos nucleicos del huésped. La medición puede llevarse a cabo utilizando técnicas estándar, tales como mediante la utilización de sondas de hibridación dirigidas a secuencias víricas de ácidos nucleicos. La utilización de sondas de hibridación puede facilitarse mediante técnicas de amplificación, tales como la amplificación por PCR. Preferentemente, se separan los ácidos nucleicos víricos no integrados de los ácidos nucleicos del huésped previamente a la utilización de la sonda de ensayo de hibridación. Una etapa de separación resulta útil para reducir la hibridación de las sondas a los ácidos nucleicos víricos no incorporados en el genoma del huésped. La separación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante centrifugación de los núcleos en glicerol o mediante electroforesis de los ácidos nucleicos aislados.

Alternativamente, puede llevarse a cabo un ensayo de integración utilizando un pseudonúcleo. Puede construirse un pseudonúcleo a partir de un molde de ADN de plásmido que seguidamente se utiliza como diana para la integración retrovírica, y no el núcleo activado intacto. Este enfoque presenta la ventaja de que el tamaño del oligonucleótido del genoma del plásmido es mucho menor que el núcleo eucariótico completo y la secuencia del genoma del plásmido es conocida o puede establecerse con facilidad.

Puede construirse un pseudonúcleo mediante la adición de ADN de plásmido a un extracto CSF fresco o congelado/descongelado (por ejemplo a una concentración comprendida entre 0,1 y 20 ng/\mul). Este material puede utilizarse inmediatamente o congelarse para su utilización posterior. El ADN de plásmido puede formar cromatina en el extracto CSF (por ejemplo, ver Sánchez et al., Journal of Cell Science 103:907, 1992, y Wangh, Journal of Cell Science 93:1, 1989, que describe dicha formación de la cromatina utilizando plásmido FV1 derivado del BPV de tipo 1 en óvulos intactos de Xenopus).

El ensayo se lleva a cabo mediante la activación de la cromatina y midiendo la integración del ácido nucleico vírico. Por ejemplo, la cromatina se diluye en una muestra adicional de extracto CSF que se activa (por ejemplo mediante la adición de Ca^{2+} 1,2 mM). La activación desencadena la formación de la cubierta nuclear alrededor de la cromatina y hace que ésta se replique.

De esta manera, puede llevarse a cabo un ensayo de activación utilizando un pseudonúcleo en lugar de un núcleo pretratado, de la manera siguiente: 1) formar un pseudonúcleo, 2) activar el pseudonúcleo, e incubar con un complejo de integración que contiene ácido nucleico vírico antes de la activación o en diferentes tiempos tras la activación, y 3) medir la integración del ácido nucleico vírico en el ácido nucleico del pseudonúcleo.

Utilizando un ensayo de integración, se puede determinar cuando se produce la integración vírica durante el ciclo celular, y si un agente resulta eficaz para inhibir la integración vírica. Por ejemplo, la importancia de diferentes etapas del ciclo celular en la integración vírica puede evaluarse utilizando CSF o extractos activadores suplementado con DMAP, afidicolina, e inhibidores de la topoisomerasa de tipo II. DMAP y la afidicolina bloquean la replicación del ADN pero permiten que se produzcan el hinchamiento nuclear y la descondensación de la cromatina. Los inhibidores de la topoisomerasa de tipo II bloquean la descondensación de la cromatina, que requiere actividad de topoisomerasa de tipo II. Entre los ejemplos de la utilización de estos fármacos se incluyen los siguientes:

1)

si fármacos tales como DMAP y la afidicolina inhiben la descondensación de la cromatina pero no consiguen inhibir la integración vírica, probablemente sólo resulta necesaria la descondensación de la cromatina tras la mitosis para la integración. En este caso, podrían diseñarse fármacos para prevenir la integración durante o previamente a la descondensación de la cromatina.

2)

si se bloquean tanto la integración (es decir, la inserción del ADN provírico en el genoma diana) como la circularización (es decir, la inserción del ADN provírico en sí mismo) mediante DMAP y afidicolina, entonces probablemente resultarán necesarios la síntesis continuada de ADN para la integración vírica. De acuerdo con ello, una diana podría ser la integración vírica durante la síntesis del ADN. Si se requiere la síntesis del ADN para la integración provírica, podría determinarse si la integración se produce antes o después de la replicación de la diana en el genoma del huésped. Por ejemplo, puede añadirse bromodesoxiuridina trifosfato (BrdUTP) a reacciones para incrementar la densidad de las cadenas de ADN nuevamente sintetizadas. A continuación, pueden recogerse muestras al final de la fase S, cuando se ha completado la replicación del genoma. Tras eliminar electroforéticamente todas las moléculas víricas no integradas, el ADN genómico puede partirse con una enzima de restricción que reconoce dos o más sitios dentro del genoma vírico. A continuación, la preparación puede fraccionarse, por ejemplo mediante centrifugación en gradiente de densidades de CsCl y sondearse para los segmentos liberados del virus. Si el provirus se inserta en el genoma huésped antes de la replicación, el ADN vírico se recuperará en el pico de densidad pesada/ligera, junto con prácticamente la totalidad del ADN genómico. Por otra parte, si el provirus se inserta tras la replicación de su secuencia diana, el ADN vírico se encontrará en el pico ligero/ligero. Tras determinar el momento de la integración, pueden diseñarse fármacos para inhibir la integración y someterse a ensayo.

3)

En caso de que la integración tenga lugar en presencia de DMAP o de afidicolina, pero no de ambos, ello indica que la síntesis de ADN, per se, no resulta necesaria para la integración, pero que algunas propiedades dependientes del ciclo celular del citoplasma influyen sobre la integración.

De esta manera, un experto en la materia puede identificar en qué momento durante el ciclo de vida de una célula, se produce la integración vírica, centrarse en los fármacos para la inhibición de dicha integración vírica, y someter a ensayo si un agente inhibe la integración vírica. Los agentes que inhiben la integración retrovírica pueden utilizarse como agentes terapéuticos para tratar una persona infectada por un retrovirus (tal como VIH) o evitar que una persona no infectada resulte infectada por un retrovirus. Un "agente terapéutico" retrovírico se refiere a un agente que reduce, en algún grado, la propagación in vivo de un retrovirus y preferentemente reduce, en algún grado, uno o más de los síntomas asociados con una infección retrovírica.

VI. Kits de activación

La tecnología dada a conocer en la presente invención puede utilizarse para producir kits de activación que resulten útiles para la activación clínica de núcleos y para la investigación científica. Estos kits resultan particularmente útiles para el cribado prenatal. Entre los usos de los kits de activación para la investigación científica se incluyen facilitar el estudio de complejas actividades bioquímicas, incluyendo el ensamblaje de nucleosomas y cromatina en el ADN de plásmido o vírico, la formación de cubiertas nucleares eucarióticas que rodean las cadenas molde en el núcleo, la replicación semiconservativa del ADN de doble cadena en los núcleos eucarióticos, la replicación conservativa de reparación de ADN de cadena única independiente del ensamblaje de la cubierta nuclear, la activación de núcleos celulares quiescentes, la degradación de la envoltura nuclear, la condensación de la cromatina para formar cromosomas, la formación de husos meióticos y mitóticos, la transcripción regulada de genes eucarióticos y la síntesis de proteína.

Un kit de activación básico de acuerdo con la presente invención comprende el producto según la reivindicación 1 de la presente invención. Los extractos se preparan basándose en los procedimientos descritos en la presente invención. Los kits contienen suplementos que ayudan en la activación. Los suplementos se encuentran en recipientes separados o en el extracto de óvulos.

Preferentemente, estos suplementos se encuentran en recipientes separados. Los suplementos son inhibidores de proteína quinasa (por ejemplo DMAP).

Los kits de activación también pueden suplementarse con reactivos utilizados para estudiar la activación en general o determinar el grado de replicación del genoma. Entre los suplementos útiles para estas actividades se incluyen los nucleótidos radioactivos, los nucleótidos biotinilados y diferentes pigmentos (por ejemplo biotina-rojo de Texas-estreptavidina y Hoechst).

VII. Clonación de animales no human completos a partir de núcleos celulares somáticos

Los procedimientos dados a conocer por la presente invención, para activar núcleos, pueden resultar útiles para preparar un núcleo no humano para su trasplante posterior en un huevo no humano para el propósito de dirigir el desarrollo de un nuevo organismo. Previamente al trasplante nuclear, el núcleo no humano que debe trasplantarse se activa in vitro. El núcleo no humano activado seguidamente se trasplanta en un huevo no humano cuyo propio núcleo ha sido eliminado o inactivado funcionalmente. El huevo seguidamente se desarrolla en un nuevo organismo bajo la dirección de la información genética contenida en el núcleo trasplantado. Entre los usos de la clonación de núcleos de células somáticas se incluyen la creación de un clon de animales genéticamente idénticos, la clonación de animales con atributos favorables, y la producción de más animales que se encuentran en peligro de extinción.

Una dificultad en la clonación de los núcleos de las células somáticas de las especies de mamífero es que estos núcleos presentan patrones de estructura y función génicas (por ejemplo patrones de metilación del ADN) que difieren de los patrones en los núcleos de esperma y óvulos. De esta manera, resulta necesario reprogramar los núcleos de células somáticas antes de la clonación para eliminar los diferentes patrones. La activación previa de los núcleos de células somáticas en un extracto apropiado de óvulos antes del trasplante debe permitir la necesaria reprogramación que permita que un núcleo trasplantado dé lugar a un nuevo organismo completo o sustancialmente completo.

La clonación utilizando un núcleo de célula somática comprende tres etapas: (1) activar el núcleo de la célula somática, (2) preparar un óvulo receptor, y (3) trasplantar el núcleo de célula somática en el óvulo. La primera etapa se lleva a cabo incluyendo utilizar los procedimientos mejorados, dados a conocer anteriormente, para activar un núcleo.

La preparación de un óvulo receptor variará dependiendo del origen del óvulo. La fuente del óvulo debe tratarse de manera que se evite la activación antes del trasplante nuclear. Los procedimientos para preparar óvulos de mamífero, tales como aquellos descritos por Martin et al., supra, son conocidos en la técnica.

La preparación de un óvulo receptor incluye destruir el pronúcleo de óvulo. La destrucción o eliminación del propio núcleo del óvulo garantiza que el material genético del óvulo (ADN) no contribuya al crecimiento y desarrollo del individuo nuevamente clonado. Un procedimiento de destrucción del pronúcleo implica la utilización de luz ultravioleta, tal como describe Gurdon, en: METHODS IN CELL BIOLOGY, XENOPUS LAEVIS: PRACTICAL USES IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY 36:299-309, Academic Press, California (editores Kay y Peng, 1991). Alternativamente, el pronúcleo del óvulo puede extraerse quirúrgicamente mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por King, en: METHODS IN CELL PHYSIOLOGY 2:1-36, Academic Press, New York (editor D.M. Prescott, 1966) y McGrath y Solter, Science 220:1300-1319, (1983).

El trasplante nuclear puede llevarse a cabo mediante técnicas estándar. Estas técnicas varían dependiendo de la especie, y son conocidas en la técnica.

Debe resultar posible clonar Xenopus de la manera siguiente: se aíslan núcleos de glóbulos rojos de Xenopus, se pretratan, y se pretratan adicionalmente. A continuación, los núcleos se activan mediante contacto con un extracto de óvulos activador. Seguidamente los núcleos se activan a diferentes etapas del ciclo celular (por ejemplo la fase G, G2, etc.) y se transfieren a óvulos de Xenopus preparados del receptor.

Los óvulos de Xenopus receptores se preparan para el trasplante nuclear mediante endurecimiento utilizando Ca^{2+} (tal como se ha descrito anteriormente), y después se irradian con luz ultravioleta para destruir el genoma del óvulo. A continuación, uno a dos núcleos somáticos activados en 20 a 50 nanolitros se microinyectan en el óvulo de Xenopus, en la región citoplasmática clara que se encuentra aproximadamente a 400 micrómetros por debajo del polo animal del óvulo. Seguidamente el óvulo se incuba bajo condiciones que permiten la rotación del citoplasma. Estas condiciones pueden obtenerse convenientemente mediante flotación del óvulo en metrizamida. La rotación del citoplasma del óvulo respecto al córtex del mismo resulta importante para establecer el eje dorsal/ventral apropiado del embrión vertebrado no humano en desarrollo.

VIII. Ejemplos Ejemplo 1 Optimización de la inducción

El presente ejemplo describe experimentos llevados a cabo para determinar el tiempo de inducción óptimo para un extracto de óvulos activador. La síntesis de proteínas durante la parte temprana del primer ciclo celular en óvulos activados o en extractos de óvulos resulta necesaria para la preparación de un extracto activador capaz de la replicación eficaz y completa del genoma. Las proteínas requeridas pueden sintetizarse tanto en óvulos intactos antes de preparar los extractos, como en los extractos, incluyendo extractos congelados/descongelados. Tal como se ha indicado anteriormente, los extractos de óvulos activadores deben prepararse a partir de extractos inducidos durante más de 10 minutos para potenciar la actividad de activación de la síntesis del ADN.

Se encontró que las proteínas sintetizadas durante los primeros 28 a 30 minutos en óvulos intactos (incubados a 20ºC) o durante los primeros 60 a 80 minutos en un extracto recién preparado y activado (incubado a 25ºC), promovían la replicación posterior del ADN. Por el contrario, las proteínas sintetizadas después en el primer ciclo celular, es decir, tras iniciarse la replicación, inhiben la síntesis del ADN. Los cambios en la síntesis del ADN pueden detectarse como alteraciones en el momento de inicio de la síntesis del ADN, de la tasa inicial de replicación y en la cantidad total de replicación.

La cantidad de CaCl_{2} utilizada para inducir un extracto CSF recién preparado regula si el extracto sale de la detención de la metafase meiótica, atraviesa la primera interfase, y reentra la primera fase M. Según las mediciones de actividad de histona H1 quinasa, el extracto CSF fresca inducido mediante la adición de CaCl_{2} 3 mM sale de la metafase meiótica, entra en la interfase pero no consigue entrar en la mitosis I. Por el contrario, el extracto CSF inducido con CaCl_{2} 1,2 mM sale de la metafase meiótica, entra en la interfase y después entra en la mitosis I, tal como indica un segundo pico en la actividad de H1 quinasa.

Para el propósito de la comparación, se prepararon extractos de óvulos inducidos e incubados a 20ºC durante periodos variables de tiempo antes de triturarlos. En todos los casos, los óvulos se agruparon, indujeron, lavaron, trituraron, y se prepararon extractos tal como se ha descrito para los extractos activadores preparados con las modificaciones siguientes: (1) todos los tubos y puntas de pipeta utilizados para preparar los extractos de óvulos en primer lugar se trataron con dietilpirocarbonato al 1% para destruir la actividad de ribonucleasa, y (2) todas las etapas en la preparación de extracto se llevaron a cabo utilizando guantes de plástico para evitar la contaminación con ribonucleasas. Los extractos se congelaron en un bloque de aluminio, se congelaron con nitrógeno líquido y después se descongelaron en un tiempo posterior previamente a su utilización. Tras la síntesis de ADN, se incorporaron los P^{32}dCTP, se realizó una electroforesis y un análisis fosfoimager.

Los resultados demuestran que los extractos activadores óptimos de la síntesis del ADN se obtienen mediante la inducción síncrona de lotes de óvulos e incubándolos durante 28 a 30 minutos a 20ºC. De los periodos de tiempo ensayados, los extractos de 28 a 30 minutos iniciaron los primeros la replicación nuclear, sintetizaron el ADN más rápido, y replicaron más ADN, seguido de los extractos de óvulos de 10 minutos, 22 minutos, 34 minutos y 40 minutos. El orden global para una replicación nuclear más temprana, una síntesis de ADN más rápida, y el grado de replicación del ADN era el siguiente: 10 minutos < 22 minutos < 25 minutos < 28 minutos > 34 minutos > 40 minutos. Debido a que el ciclo celular del óvulo es tan rápido, incluso diferencias pequeñas en la duración del periodo de incubación o de la temperatura de incubación tienen como resultado extractos subóptimos.

También se determinó que la replicación máxima, incluso en el extracto congelado/descongelado de 28 a 30 minutos, depende de la continuación de la síntesis de proteínas durante los primeros 30 minutos de la incubación in vitro. Se preparó un extracto de óvulos activador tal como se ha descrito anteriormente, y se indujo durante 28 minutos. Se añadió cicloheximida inmediatamente antes de la inducción, o 30 minutos después de la misma. Se observó replicación máxima del ADN en el control (sin cicloheximida) y se añadió cicloheximida 30 minutos después de la inducción, mientras que la adición de cicloheximida a los cero minutos resultó en una replicación del ADN significativamente menor. Ello sugiere que las proteínas requeridas para una replicación eficaz son relativamente inestables pero se sintetizan abundantemente a partir de ARNm reclutados sobre polisomas durante los primeros 28 a 30 minutos tras la inducción de los óvulos.

Ejemplo 2 Extracto CSF suplementado con DMAP y tratado con extracto activador

La adición de 6-dimetilaminopurina (DMAP) a los extractos CSF se utilizó para pretratar adicionalmente núcleos de eritrocitos de Xenopus y para estimular la posterior replicación del ADN en extracto de óvulos activador. La DMAP puede utilizarse para inhibir la síntesis de ácidos nucleicos y la actividad de proteína quinasa. Se aislaron y se pretrataron núcleos de eritrocitos de Xenopus tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente, y se incubaron en "extracto CSF preparado" descongelado suplementado con \beta-glicerol-PO_{4} 80 mM y nocodazol 5 \mug/ml a una concentración de 2.000 núcleos/\mul. Se llevó a cabo un pretratamiento adicional mediante incubación durante 30 minutos a 4ºC, después 30 minutos a 25ºC, después 60 minutos a 4ºC. La mitad de las muestras se suplementaron con DMAP 5 mM antes de la adición de los núcleos. Tras las dos horas de incubación, cada muestra se diluyó con 9 volúmenes de extracto de óvulos activador, suplementado con 5 \mug/ml de nocodazol (esta dosis de nocodazol enlentece la tasa de replicación) y aproximadadamente 160 \muCi/ml de P^{32}-dCTP. Se extrajeron alícuotas a lo largo del tiempo para medir la replicación del ADN.

Tal como se ilustra en la fig. 1, la adición de DMAP a los extractos CSF potenció la capacidad del extracto CSF de estimular la posterior replicación del ADN en extracto de óvulos activador. La DMAP redujo el tiempo de retardo antes del inicio de la replicación e incrementó la tasa inicial y la cantidad total de síntesis del ADN.

Ejemplo 3 Utilización de extracto CSF diluido suplementado con DMAP

El presente ejemplo ilustra la utilización de extracto CSF diluido suplementado con DMAP para conseguir la formación de cubierta nuclear y estructura nuclear en ausencia de síntesis de ADN. Se aislaron núcleos de eritrocitos de Xenopus y se pretrataron utilizando lisolecitina y tripsina. Se preparó "extracto CSF preparado" mediante centrifugación de alta velocidad y se congeló mediante transferencia del extracto, diluido hasta el 7,5% a 10% (v/v) en glicerol, en forma de gota de 20 \mul sobre un bloque de aluminio sumergido en nitrógeno líquido. Se descongelaron alícuotas del extracto sobre hielo y se suplementaron con creatina fosfato 10 mM, creatina fosfoquinasa 10 \mug/ml, \beta-glicerol-PO_{4} 80 mM y CaCl_{2} 0,1 mM. Todavía sobre hielo, el extracto CSF recibió un volumen reducido (1/33avo) de DMAP hasta una concentración final de 5 mM, y después se diluyó con cantidades diferentes de tampón EB de la manera siguiente: mezcla 1, 100% = sólo extracto, sin EB; mezcla 2, 75% = 3 volúmenes de extracto + 1 volumen de EB; mezcla 3, 50% = 1 volumen de extracto + 1 volumen de EB; y mezcla 4, 25% = 1 volumen de extracto + 3 volúmenes de EB.

Cada una de dichas mezclas se calentó hasta 25ºC y se incubó durante 15 minutos. Los núcleos pretratados seguidamente se añadieron en 1/10 del volumen hasta una concentración final de 2.000 núcleos/\mul. Las muestras de cada incubación se extrajeron inmediatamente (0), 60, 90 y 120 minutos después, y se fijaron, se examinaron, y se fotografiaron. El tratamiento de los núcleos con CSF-DMAP diluida resultó en un mayor hinchamiento que el tratamiento con CSF-DMAP no diluida. Los núcleos tratados con la mezcla 3 presentaron un mayor grado de hinchamiento nuclear, de formación de cubierta nuclear y de descondensación de la cromatina que los núcleos tratados con las otras mezclas. Algunos experimentos adicionales con P^{32}-dCTP y dUTP biotinilado demostraron que no tiene lugar síntesis de ADN durante el proceso de hinchamiento nuclear descrito anteriormente.

Ejemplo 4 Utilización de extracto CSF diluido suplementado con DMAP, MgCl_{2} y EGTA

El presente ejemplo ilustra el efecto de extracto CSF diluido suplementado con DMAP, MgCl_{2} y EGTA sobre la formación de la cubierta nuclear, el hinchamiento nuclear y la estructura de la cromatina. Los núcleos se trataron tal como se describe en el Ejemplo 7 previamente a la adición de extracto CSF. El extracto CSF (preparado tal como en el Ejemplo 7), todavía sobre hielo, se suplementó de la manera siguiente: DMAP 5 mM, dUTP biotinilado 16 \muM y MgCl_{2} 16 \muM. El extracto suplementado se diluyó con un volumen igual de tampón EB que contenía EGTA potásica 5 mM, pH 7. Esta mezcla se calentó hasta 25ºC y se incubó durante 15 minutos. A continuación, los núcleos pretratados se añadieron en 1/10 del volumen hasta una concentración final de 2.000 núcleos/\mul. Las muestras de cada incubación se extrajeron inmediatamente (0), 15, 45, 60 y 90 minutos después y se fjaron, se examinaron y se fotografiaron.

El CSF-DMAP al 50%, suplementado con EGTA y MgCl_{2}, hizo que los núcleos de eritrocitos pretratados se hinchasen rápidamente y adquiriesen una cubierta nuclear. No se observó incorporación de biotina en el ADN. De esta manera, al contrario que en el Ejemplo 7, tuvo lugar el hinchamiento en ausencia de síntesis de ADN. Además, el ADN observado en el presente ejemplo se encontraba más compactado que el ADN observado en el Ejemplo 8. La diferencia entre el presente ejemplo y el Ejemplo 8 es probable que se deba a la alteración de la concentración y composición de cationes del extracto CSF. Por ejemplo, el EGTA puede quelar el Ca^{2+}, reduciendo de esta manera el Ca^{2+}, mientras se añade Mg^{2+} adicional para incrementar la concentración de Mg^{2+}.

A pesar de las dificultades encontradas, la presente invención puede utilizarse para activar núcleos humanos quiescentes. Los núcleos humanos quiescentes se activaron análogamente a los núcleos de eritrocitos de Xenopus. Por lo tanto, las mejoras descritas en la presente invención, que resultan en el incremento de la activación de los eritrocitos de Xenopus quiescentes resultan aplicables a núcleos humanos activados quiescentes.

Otras realizaciones se encuentran comprendidas en las reivindicaciones siguientes.

Claims (12)

1. Producto capaz de hinchar un núcleo de una célula quiescente, que comprende:

a)

un citoplasma que contiene un factor citostático que se extrae de por lo menos una célula en metafase II meiótica,

b)

una solución acuosa, y

c)

un inhibidor de proteína quinasa.

2. Producto según la reivindicación 1, en el que la solución acuosa es un tampón acuoso que contiene gluconato de potasio.

3. Producto según la reivindicación 2, en el que el tampón acuoso presenta un pH comprendido entre 6,5 y 7,5.

4. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de proteína quinasa es un inhibidor de la histona H1 quinasa.

5. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inhibidor de proteína quinasa es 6-dimetilaminopurina.

6. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye además por lo menos un ingrediente adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en sales de Ca^{2+}, sales de Mg^{2+} y agentes que quelan cationes Ca^{2+}.

7. Producto según la reivindicación 6, en el que el ingrediente adicional es el ácido etilenglicol-bis (\beta aminoetil éter) N,N,N'N'-tetraacético.

8. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el citoplasma que contiene factor citostático ha sido congelado.

9. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el citoplasma que contiene factor citostático se extrae de óvulos de rana Xenopus.

10. Procedimiento de hinchamiento in vitro de un núcleo de una célula animal excepto para células obtenidas de un embrión humano, que comprende las etapas de:

a)

separar o alterar el citoesqueleto circundante al núcleo, y

b)

incubar dicho núcleo con el producto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el citoesqueleto es separado del núcleo previamente a dicha incubación.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la separación del citoesqueleto del núcleo incluye permeabilizar dicha célula con un detergente y tratar dicha célula con por lo menos un reactivo seleccionado de entre el grupo de proteasas, polianiones y agentes reductores de tiol.