ES2266235T3 - Metodo y aparato para mediciones por "patch-clamp" en celulas. - Google Patents
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Abstract
Método para realizar mediciones en células o estructuras similares con la técnica de patch-clamp, caracterizado por el hecho de que - al menos una célula es introducida en el lumen interior de un capilar que a lo largo de la longitud del capilar al menos en un punto tiene un diámetro interior más pequeño que el diámetro exterior de dicha célula, donde el capilar presenta una superficie interna muy limpia al menos en la parte con el diámetro interior más pequeño y donde dicho diámetro interior más pequeño mide menos de 10 µm, - dicha célula está situada en el interior de dicho capilar en el lugar mencionado, formando un gigasello entre la membrana celular y la superficie interna de dicho capilar con una resistencia eléctrica de al menos 10 gigaohmios, y - a continuación se realiza un experimento de patch-clamp en dicha célula.
Description
Método y aparato para mediciones por
"patch-clamp" en células.
La invención se refiere a un método para
mediciones en células o estructuras similares con la técnica de
"patch-clamp" (fijación de parches) y a un
dispositivo para dichas mediciones.
Las células vivas crean un micromedioambiente
interno envolviéndose ellas mismas con una membrana lípida,
asegurando de ese modo la función de los mecanismos celulares.
Estas membranas lipídas son prácticamente impermeables a las
partículas cargadas. Por ello, proteínas transportadoras
especializadas incrustadas transportan iones a través de la
membrana, los cuales representan la base para una variedad de
funciones fisiológicas, incluidas la excitabilidad eléctrica de las
células, el transporte de sustancias a través de las membranas o
las capas celulares y diferentes señales eléctricas y químicas en
las células.
El método de patch-clamp,
desarrollado por Sakmann y Neher en 1981, supuso una revolución
para la investigación en el campo de la biología celular. La
técnica de patch-clamp permite la medición directa
de corrientes a través de transportadores iónicos con una alta
resolución de tiempo. De hecho, este método es la única técnica que
puede medir cambios conformacionales de moléculas proteínicas
especializadas separadas en tiempo real con una resolución de
tiempo de varios milisegundos. Esto permite por ejemplo evaluar la
acción de moléculas señal o agentes farmacológicos directamente en
la proteína meta. Asimismo, esta técnica permite controlar con
exactitud el entorno eléctrico y químico de una membrana y la
aplicación de moléculas de señalización, fármacos, etc., a ambos
lados de la membrana.
Esta técnica puede examinar una variedad de
proteínas transportadoras, incluyendo los transportadores iónicos
electrogénicos de iones orgánicos e inorgánicos, canales iónicos
selectivos y no selectivos y otras proteínas de membrana inductoras
de poros. Entre los canales iónicos se encuentran los canales
regulados por ligandos y por voltaje, operados por reservorios, que
son selectivos o no selectivos para Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+} y
Cl^{-}. Incluso los movimientos de carga dentro de una proteína
asociada a una membrana pueden ser medidos (cargas de apertura).
Esto hace que todas las proteínas asociadas a la membrana sean
accesibles para la técnica, incluidos los receptores, las enzimas,
y su interacción con otras proteínas o moléculas cargadas. Los
canales iónicos se encuentran distribuidos en los tejidos de una
manera específica y se caracterizan por una gran diversidad de
funciones. Es por ello que son objetivos ideales para compuestos
farmacológicos para manipular funciones tisulares específicas.
Ejemplos de tales compuestos son los diuréticos, los
antidiabéticos, los antiepilépticos, las anestesias locales, los
antiarrítmicos, ciertos antibióticos, etc. La técnica de
patch-clamp representa un método muy sensible para
probar la acción biológica de tales compuestos. La mayor desventaja
de la técnica es el complicado método experimental, la necesaria
manipulación manual y el bajo rendimiento resultante de los
compuestos de prueba y las proteínas transportadoras.
Existen diversas modalidades de la técnica de
patch-clamp, las cuales todas requieren
micromanipulación. Se hace una aproximación a la célula
mecánicamente con una micropipeta de vidrio, bajo control visual
microscópico, y es fijada a la pipeta mediante succión. Esto tiene
como consecuencia una unión hermética eléctricamente entre la
membrana celular y la punta de la pipeta, que es un prerrequisito
para conseguir un registro de corrientes ínfimas de alta resolución
y con bajo nivel de ruidos. Las corrientes son registradas con
diferentes modalidades de la técnica, bien a través del parche de la
membrana en la punta de la pipeta, o bien a través de la capa de la
membrana opuesta.
La unión hermética entre la membrana celular y
el capilar de vidrio se suele denominar "sello". Las distintas
características del sello posibilitan el estudio experimental de
diferentes tipos de células y de magnitudes de corrientes iónicas.
En 1980 Neher y Sakmann describieron un método para la obtención de
sellos con una característica novedosa, es decir, los conocidos
como gigasellos. A este descubrimiento le fue otorgado el premio
Nobel en 1991, y los gigasellos hicieron posible por primera vez la
medición precisa de corrientes iónicas en picoamperios en células
de pequeños mamíferos, humanos,
\hbox{insectos y otras
células. En su publicación de 1981, el grupo de Neher y Sakmann
escribió:}
``La técnica de patch clamp extracelular ha
posibilitado por primera vez la observación de las corrientes en
canales iónicos simples (Neher y Sakmann, 1976). Según esta
técnica, una pequeña pipeta de vidrio pulido térmicamente es
presionada contra la membrana celular, formando un sello eléctrico
con una resistencia del orden de 50 megaohmios (Neher et al.,
1978). La alta resistencia de este sello asegura que la mayor parte
de las corrientes que se originan en un parche pequeño de la
membrana fluyan al interior de la pipeta, y desde allí a un
conjunto de circuitos de medición de la corriente. La resistencia
del sello es también importante puesto que determina el nivel de
ruido de fondo en los registros.
Se puede separar el parche de la membrana
manteniendo la pipeta fijada a la célula. Esto proporciona un
acceso directo de baja resistencia al interior de la célula, lo que
permite el registro del potencial y la fijación de voltaje de las
células pequeñas'' (Hamill, Marty, Neher, Sakmann, Sigworth,
Pflügers Arch. 391:85-100;1981).
Un "gigasello" es obtenido cuando la
resistencia eléctrica alcanza el orden de gigaohmios tras la
aproximación a la célula con la punta de la pipeta y la succión. La
resistencia habitual de varias decenas de gigaohmios indica que
incluso iones pequeños como los protones no pueden pasar entre la
membrana y la superficie de vidrio. Previamente se pensó que dicho
gigasello tenía que formarse entre la membrana y el borde de la
punta de la pipeta, que se aproxima a la membrana por fuerza
mecánica y succión hidráulica. Con este gigasello los
amplificadores operacionales modernos permiten la medición de
corrientes dirigidas que descienden hasta 100 fA (10^{-13}A). En
cualquier caso, las corrientes medidas representan el total del
transporte iónico a través de la membrana más las corrientes de
fuga a través del aparato y la preparación.
La técnica de patch-clamp es
extremadamente lenta y requiere personal altamente cualificado,
debido especialmente a las necesarias micromanipulaciones. La
aproximación a células simples en una fase microscópica con el
micromanipulador y la aplicación de succión para sellar la pipeta
requieren un alto grado de destreza y experiencia con las
propiedades mecánicas de una célula dada y su micromanipulación.
Por ejemplo, la fuerza mecánica aplicada antes de la succión es
crítica para la unión de la membrana y la punta de la pipeta.
Asimismo, el sello es inestable mecánicamente y puede perderse por
perturbación mecánica y turbulencia hidráulica (por ejemplo,
intercambio de soluciones). Se necesitan un microscopio y un
micromanipulador. Esto prohíbe la miniaturización y la disposición
más deseada de conjuntos con pipetas múltiples.
La descripción anterior explica que para
conseguir una variedad de aplicaciones potenciales de la técnica de
patch-clamp sería deseable que se examinaran
diferentes células simultáneamente y se obtuvieran gigasellos
automáticamente. Esto se ve dificultado por el hecho de que la punta
de una micropipeta debe entrar en contacto cercano con la membrana
celular mecánicamente. El documento
DE-A1-197 44 649 describe un
dispositivo y un método para examinar células múltiples con un
conjunto de pipetas múltiples. No obstante, en este documento de
patente se usa el mismo principio (como se ha mencionado
anteriormente) relativo al movimiento mecánico del conjunto de
pipetas hacia la membrana celular. El documento WO 99/66329 describe
un conjunto de poros en un sustrato plano fino para aplicar células
y examinar células múltiples simultáneamente. La fabricación de
tales sustratos porosos es complicada y de coste elevado, y es
difícil conseguir y controlar la adherencia de las células a los
poros múltiples, y es arbitraria. Los sellos de células con la
superficie de un sustrato plano son mecánicamente inestables y se
pierden más fácilmente por los intercambios de soluciones. Además,
en todas las disposiciones planas de poros como la expuesta en el
documento WO 99/66329 o en otros dispositivos de medición
transepitelial conocidos por un experto en la materia (por ejemplo,
mediante el uso de cámaras), se entorpece el curso normal del
experimento si algunos de los poros no están sellados con células
herméticamente. Los poros permeables conducen grandes corrientes de
fuga con varios órdenes de magnitud mayores que las corrientes a
través de los transportadores iónicos que han de ser medidas. En
tales disposiciones aparecen serios problemas con la interferencia
eléctrica entre poros, especialmente desde los poros permeables. La
alta capacitancia eléctrica puede causar ruido eléctrico y
alteraciones, reduciendo de ese modo la resolución de tiempo de la
medición. Es decir, es especialmente crítico a la hora de medir
canales iónicos con regulación de voltaje.
La patente estadounidense 6.048.722
(correspondiente al documento WO 97/17426) describe una estación de
trabajo de fisiología celular para la adquisición de datos
automatizados y el control de la perfusión. El aparato soporta un
ovocito de Xenopus en el interior de una punta de pipeta Pasteur
para formar un sello entre la membrana y el cristal del ovocito. La
resistencia de dicho sello debe oscilar entre los 100 y los 200
megaohmios. Los ovocitos de Xenopus suelen ser grandes (a
diferencia de las células mamíferas). Su diámetro exterior mide más
de 1 mm. En consecuencia, presentan una gran área de membrana y
contienen varios órdenes de magnitud más canales iónicos que otras
células dando como resultado corrientes iónicas del orden de entre
varios cientos hasta 1.000 nanoamperios. Por ello, un sello
denominado de alta resistencia (del orden de entre 10 y 200
megaohmios) es suficiente para medir grandes corrientes en ovocitos
de Xenopus. No obstante, estas células son de origen anfibio y, en
consecuencia, de uso limitado para el estudio de la función del
canal iónico en las células mamíferas y humanas. En las células
mamíferas, las cuales suelen tener un diámetro de entre 5 y 50
micrómetros, las corrientes iónicas sólo suelen alcanzar entre uno
y varios cientos de picoamperios. Para medir tales corrientes
ínfimas, la resistencia del sello debe ser de órdenes de magnitud
mayores que para los ovocitos de Xenopus, es decir, entre 10 y
1.000 gigaohmios. Como se ha mencionado anteriormente, un experto
en la materia asumió que el canto o borde de una pipeta de vidrio
debe ser presionado contra la membrana celular para obtener un
gigasello de tales características. Esto es también evidente en la
patente estadounidense 6.048.722 que describe el habitual uso
adicional de biosensores, incluidas las pipetas de
patch-clamp y las agujas de inyección en el interior
de la cámara de registro. Esto también requiere micromanipulación
adicional con sondas como electrodos, agujas y pipetas de
patch-clamp dentro de la cámara de registro para el
soporte del ovocito de Xenopus. Estos requisitos conllevan las
mismas desventajas que se han mencionado anteriormente.
En resumen, un experto en la materia asumió
previamente que un gigasello tenía que formarse entre la membrana
celular y el borde de una punta de la pipeta que se aproxima a la
membrana por fuerza mecánica y succión hidráulica.
Como consecuencia, es un objetivo de la presente
invención evitar las desventajas del estado de la técnica. La
consecución de gigasellos entre la membrana y la cámara de registro
o el sustrato de soporte requeridos para la técnica de
patch-clamp representarán un enfoque novedoso. Esto
aumentará la estabilidad mecánica de tales sellos. La necesidad de
control microscópico visual será eliminada. Con la invención se
consigue una capacitancia eléctrica pequeña de la preparación de
registro, dando como resultado pequeñas fluctuaciones dieléctricas
(ruido) y una alta resolución de tiempo de la señal medida. Esto
permite que se lleven a cabo mediciones en células múltiples
simultáneamente y/o en orden rápido con la técnica de
patch-clamp. El aparato será fácilmente
automatizado y ensamblado empleando piezas sencillas o ya
existentes. El aparato será miniaturizado para disponer
preparaciones de registro múltiples en paralelo, y para integrar el
aparato en sistemas robot de laboratorio ya existentes. El
dispositivo dispondrá preparaciones de registro múltiples
independientemente, de manera que las cámaras de registro estén
posicionadas en un conjunto flexible y que las cámaras que contienen
las células preparadas para el registro puedan ser sustituidas
fácilmente y movidas en dicho conjunto. Las preparaciones de
registro múltiple han de ser protegidas eléctricamente una respecto
de la
otra.
otra.
La presente invención resuelve al menos
parcialmente los problemas descritos anteriormente con el método
reivindicado en la reivindicación 1 y el aparato reivindicado en la
reivindicación 11. Las formas de realización preferidas del método
o del aparato están descritas en las reivindicaciones 2 a 10 y 12 a
22. Las reivindicaciones 23 y 24 se refieren a un capilar y a un
kit.
La presente invención proporciona un método
según el cual una célula es posicionada en el lumen de un capilar y
un sello suficientemente hermético con una resistencia que excede
los 10 gigaohmios es obtenido entre la membrana celular y la pared
interna del capilar. Tras la consecución del gigasello se puede
realizar un experimento de patch-clamp. El capilar
se estrecha de manera que tiene a lo largo de su longitud al menos
en un punto un diámetro interior más pequeño que el diámetro
exterior de la célula que ha de ser medida. Dicho diámetro interior
más pequeño mide menos de 10 \mum. El capilar presenta una
superficie interna muy limpia al menos en la parte con el diámetro
interior más pequeño.
Estrechamiento significa una forma del capilar
que permite el soporte de una célula que es movida a lo largo de la
longitud del capilar, y evita el paso de la misma. Estrechamiento
puede significar también una forma cónica de la pared interna del
capilar que rodea la célula circunferencialmente y que permite un
contacto cercano entre la superficie interna del capilar y la
superficie de la célula. Por ello, los capilares han de ser
construidos con una sección transversal interna preferiblemente
redonda que se estrecha a lo largo de su longitud dando lugar a un
estrechamiento o boquilla para soportar y posicionar la célula y
conseguir un sello hermético entre la superficie de la célula y la
superficie interna de la pipeta estrechada. Evidentemente, el
diámetro interior, la forma y la inclinación del estrechamiento
pueden variar para posibilitar diferentes diámetros de la célula.
Mediante el uso de diámetros interiores muy pequeños en el
estrechamiento, se pueden posicionar y soportar células muy
pequeñas o estructuras de membrana subcelular, por ejemplo,
mitocondrias, lisosomas o bacterias. Hasta ahora estas estructuras
no han sido accesibles directamente con el método de
patch-clamp, puesto que éstas suelen ser demasiado
pequeñas para una leve microscopia y manipulaciones micromecánicas.
Por ello, el término "célula" en la presente invención incluye
cualquier estructura biológica o artificial rodeada por una membrana
lipída.
En la presente invención el término
"posicionamiento" describe cualquier fijación de la célula en
el estrechamiento o en el capilar suficiente para experimentos de
patch-clamp, donde se consigue una unión o sello
suficientemente hermético con una resistencia que excede los 10
gigaohmios entre la membrana celular y la superficie interna de la
pared capilar.
Resultó sorprendente que un gigasello (como se
requiere para mediciones de corrientes iónicas en células pequeñas,
por ejemplo, células mamíferas, humanas, vegetales y de insectos)
pueda ser obtenido entre la superficie interna del lumen de un
capilar, y una membrana celular y que se pueda realizar un
experimento de patch-clamp en tales células tras la
permeabilización de un lado de la membrana celular, y que resultaran
innecesarias sondas adicionales tales como pipetas de
patch-clamp o agujas de inyección para llevar a
cabo tales experimentos. Con la invención, el mero posicionamiento
de la célula en la parte estrecha del capilar resulta suficiente, y
no es necesario el empleo de aparatos adicionales tales como agujas,
pipetas de patch-clamp o micromanipuladores para la
obtención de un gigasello. Asimismo, los gigasellos obtenidos según
la invención son mecánicamente estables y pueden resistir
perturbaciones mecánicas e hidráulicas. Normalmente, es posible
retirar los capilares que contienen células selladas del soporte
del capilar, y moverlo a otro soporte sin perder el gigasello. Los
gigasellos también son resistentes a las vibraciones mecánicas, por
ejemplo, golpeo contra el capilar. Se puede descargar líquido al
interior del capilar usando un tubo estrecho sin romper el
sello.
La longitud del capilar no es de vital
importancia para la presente invención. Se pueden usar capilares de
longitudes completamente diferentes. En una forma de realización
preferida, el capilar es al menos tan largo que la totalidad de la
célula está posicionada en el interior del capilar.
La anterior descripción muestra que la parte
estrecha o estrechamiento del capilar puede ser realizado de
distintos modos. Según una sencilla forma de realización preferida,
el capilar entero se estrecha de modo que el diámetro interior se
reduce gradualmente o poco a poco a lo largo de la longitud del
capilar. En esta forma de realización, la célula ha de ser
posicionada donde el diámetro de la sección transversal interna del
estrechamiento del capilar se aproxima al diámetro exterior de la
célula. En otra forma de realización preferida, la sección
transversal más estrecha ha de estar situada en un extremo del
capilar, y la célula ha de ser introducida en el capilar por el otro
extremo, de modo que la célula ha de ser posicionada y sellada en
el interior del capilar cerca de la abertura estrecha.
Según otra forma de realización preferida, el
estrechamiento ha de estar situado en un extremo, y la célula ha de
ser introducida en el capilar desde el otro extremo, de modo que la
célula sea posicionada y sellada en la abertura estrecha, y que
parte de la célula sobresalga de dicha abertura. Esto permite un
intercambio rápido de soluciones en la parte de la membrana
sobresaliente.
Según una forma de realización preferida, los
capilares estrechados pueden ser las denominadas micropipetas,
similares a las diversas formas de micropipetas usadas para los
experimentos de patch-clamp convencionales. Un
experto en la materia sabe cómo fabricar y conformar dichas
micropipetas. Normalmente, las micropipetas son extraídas de los
capilares de vidrio tras el calentamiento (al menos local) por la
separación de ambos extremos del capilar en la sección central
fundida. La fusión garantiza la superficie limpia requerida del
material de la pipeta para obtener gigasellos.
Según una forma de realización preferida, los
capilares o micropipetas pueden estar hechos de diferentes
materiales dieléctricos, tales como plásticos (por ejemplo,
poliestireno). En otra forma de realización preferida de la
invención, los capilares o micropipetas están hechos de vidrio. Se
ha mostrado que el vidrio queda sellado herméticamente a las
membranas biológicas, y que presenta propiedades dieléctricas
ventajosas. El vidrio es inerte a una amplia gama de productos
químicos y puede ser limpiado fácilmente. Asimismo, se pueden
fabricar capilares de vidrio y micropipetas con una gran diversidad
de diámetros del estrechamiento con costes bajos y con tecnología
de formación de vidrio estándar. De manera independiente del
material, se usan los diámetros interiores del
estrechamiento/abertura de la parte más estrecha de menos de 10
micrómetros (\mum), dependiendo del diámetro de la estructura
biológica o de la célula examinada. Un límite inferior preferido
para este tipo de diámetros es de 50 nanómetros (nm).
Según otra realización preferida de la
invención, las células son introducidas y posicionadas en el
interior del capilar llenando o descargando el capilar con una
suspensión de células en solución. Por ejemplo, la suspensión de
células ha de ser introducida en la abertura grande de la
micropipeta, y ha de aplicarse succión hacia la abertura estrecha,
provocando el posicionamiento de una célula en el estrechamiento de
la pipeta. El posicionamiento se consigue simplemente a través del
movimiento de fluido y/o la célula. Tan pronto como la primera
célula se mueve hacia el estrechamiento, el contacto entre la
superficie de la célula y la pared interna del capilar la célula
queda sellada al capilar y bloquea el flujo de líquido. Por lo
tanto, no hay células adicionales que se muevan hacia el
estrechamiento. Así, se consigue en un único paso la introducción
de células en el capilar y el posicionamiento de una célula en el
estrechamiento. De acuerdo con la invención, se prefiere la
aplicación de gradientes de presión de entre 5 mbar a 1 bar,
preferiblemente entre 5 mbar y 500 mbar.
De forma alternativa o adicional, en otra forma
de realización de la invención, se puede conseguir la introducción
y posicionamiento de células en el capilar por sedimentación. En
este caso, el capilar es fijado en una dirección vertical y la
célula es posicionada por la gravedad, preferiblemente además del
flujo hidráulico anteriormente descrito.
De forma alternativa o adicional, en otra forma
de realización de la invención, se puede conseguir la introducción
y el posicionamiento de las células en el capilar por
centrifugación. En este caso, una suspensión de células es
centrifugada en el capilar y la célula es posicionada por fuerza
centrífuga, preferiblemente además del flujo líquido anteriormente
descrito. Para obtener un gigasello con las células, es preferible
llevar a cabo la centrifugación a entre 2 y 20 g. Para las
bacterias y otras estructuras de membrana pequeñas con un diámetro
inferior a 1 micrómetro, es preferible que la centrifugación sea
realizada a entre 10 y 500 g.
De forma alternativa o adicional, en otra forma
de realización de la invención, se puede conseguir o facilitar la
introducción y el posicionamiento de células en el capilar por
vibración mecánica o mediante el uso de un campo eléctrico aplicado
longitudinalmente a lo largo del capilar. Otra forma de realización
usa perlas magnéticas acopladas a o rodeadas por las células, y se
lleva a cabo el posicionamiento de dicha célula empleando un campo
magnético. Otra forma de realización usa luz láser (pinzas ópticas)
para posicionar la célula.
En una forma de realización preferida de la
invención, al menos la parte estrechada del capilar es llenada en
primer lugar con una solución fisiológica (preferiblemente limpia
tras haberla pasado a través de un filtro estéril o por
centrifugación). Entonces la suspensión de células es posicionada
sobre la superficie de la solución. Seguidamente, las células pasan
a través de la capa de la solución limpia hacia el estrechamiento
por medio de la gravedad, centrifugación, etc., como ha sido
descrito anteriormente. Puesto que las células son, en la mayoría
de los casos, más pesadas que los fragmentos de la membrana y otras
partículas contaminantes típicas en una suspensión de células, este
método permite que las células sean "enjuagadas" mientras que
penetran en la parte estrechada del capilar. Además, aumenta la
probabilidad de que una célula intacta penetre en la parte
estrechada antes que cualquier otra partícula. Esto reduce de
manera efectiva el riesgo de contaminación de la superficie interna
del estrechamiento de la pipeta con partículas que, de lo
contrario, evitarían la formación posterior de un gigasello.
En general, es esencial para la invención que la
superficie interna del capilar esté muy limpia para proporcionar
gigasellos, sobre todo gigasellos con resistencias muy altas. Como
consecuencia, se prefiere producir el capilar, pero al menos la
parte estrecha/estrechada de tal capilar, con una superficie
interna muy limpia. Asimismo, se prefiere mantener tal superficie
interna muy limpia hasta que el capilar sea usado para un
experimento de patch-clamp, e incluso durante tal
experimento de patch-clamp.
Para producir gigasellos con células en el
interior de capilares según la invención, es preferible que se
cumpla al menos uno de los siguientes 4 requisitos técnicos.
Evidentemente, es más preferible cumplir con los 4 requisitos
técnicos.
- 1.
- Fusión, preferiblemente fusión completa del capilar durante la producción del estrechamiento para garantizar la sumersión de cualquier partícula de polvo o contaminantes más allá de la superficie interna.
- 2.
- Evitación de la contaminación de la superficie interna manteniendo el capilar en un medio muy limpio después de la producción, por ejemplo, sellándolo en un recipiente estéril bajo un flujo o aire filtrado (preferiblemente, un tamaño de poro de 0'2 micrómetros).
- 3.
- Evitación de la contaminación de la superficie interna durante el experimento, por ejemplo, llenando al menos el estrechamiento con una solución filtrada y estéril, por ejemplo, una solución salina fisiológica.
- 4.
- Evitación de la contaminación de la superficie interna durante el experimento proveniente de partículas contaminantes en la suspensión de células mediante sedimentación y/o centrifugación de células a través de dicha capa de una solución filtrada y estéril.
En algunas formas de realización preferidas los
siguientes parámetros son medidos en dicha célula o estructura de
membrana posicionada: la corriente en
"voltage-clamp" (fijación de voltaje), el
voltaje en "current clamp" (fijación de corriente),
resistencia eléctrica, impedancia, capacidad eléctrica,
fluorescencia óptica, resonancia de plasmón, resonancia mecánica,
fluidez y/o rigidez.
Según ciertas formas de realización preferidas,
el posicionamiento de la célula puede ser verificado y/o controlado
antes de que se lleve a cabo un experimento de
patch-clamp. Esto puede conseguirse por medios
ópticos, por ejemplo, por análisis de luz láser que ilumina el
estrechamiento del capilar. En este contexto, se puede colorear
dicha célula con colorantes, anticuerpos acoplados por colorante,
ligandos, lipídos, etc. El colorante puede ser elegido para indicar
variaciones químicas en el interior de la célula o en la superficie
de la célula y, así, dar como resultado información biológica
aparte de la posición de la célula en el capilar, por ejemplo,
cambios químicos en el citosol. De forma preferible, el
posicionamiento de la célula es controlado y verificado midiendo la
presión y/o el flujo a través del capilar. Los cambios de presión
y/o flujo indican el posicionamiento de una célula en el
estrechamiento del capilar. La presión y el flujo pueden ser
regulados, preferiblemente de forma automática, para conseguir el
posicionamiento deseado de una célula y el sello hermético entre la
membrana y la superficie capilar interna. De manera más preferible,
la resistencia eléctrica a lo largo del capilar es medida para
evaluar la posición de la célula con respecto al estrechamiento y
para medir la calidad del sello. Las fuerzas de posicionamiento
pueden después ser reguladas para mejorar la resistencia del sello.
De este modo, las fuerzas hidráulicas o de centrifugación pueden
ser controladas para conseguir un sello óptimo entre la membrana de
diferentes tipos de células y la superficie capilar interna.
Según la invención, se pueden usar un capilar o
una micropipeta nuevos para cada experimento de
patch-clamp. Esto garantiza una superficie nueva y
muy limpia para el posicionamiento y el sellado de una célula nueva.
En otra forma de realización preferida, el capilar es reutilizado
tras un experimento de patch-clamp. Para este
propósito, la célula es retirada del capilar por succión/descarga.
Seguidamente, el capilar es limpiado y preparado para otro
experimento de patch-clamp. La limpieza del capilar
se lleva a cabo preferiblemente mediante descarga de disolventes o
productos químicos. De forma adicional o alternativa, se pueden
usar calor y ultrasonido para limpiar la superficie interna
capilar.
Para un experto en la materia resulta obvio que
el método reivindicado puede ser modificado de diferentes maneras.
Por ejemplo, el intercambio de la solución se puede realizar en
ambos lados de la célula después del sellado de dicha célula a la
pared interna del capilar. El intercambio de la solución puede ser
realizado mediante el empleo de tubos o salidas para succión y/o
descarga, etc. Asimismo, la membrana puede ser permeabilizada de
manera selectiva en un lado del sello. Para conseguir esto, se
pueden usar cambios de presión, ultrasonido, saltos de voltaje
eléctrico o productos químicos permeabilizantes (por ejemplo,
ionóforos, tensioactivos, enzimas, solventes), los cuales pueden
ser aplicados a través de dichos dispositivos de intercambio de
soluciones. La permeabilización selectiva de una superficie de la
membrana puede hacer el lado interno de la otra superficie de la
membrana accesible para sustancias aplicadas al capilar, y puede
reducir la resistencia eléctrica accediendo a la otra superficie de
la membrana. Según la invención, para la rotura de la membrana no
son necesarias sondas adicionales tales como agujas ni el movimiento
mecánico de tales sondas.
Obviamente, con el presente método se puede
examinar una variedad de distintos tipos de células. Según la
invención, se prefiere el empleo de células o estructuras
subcelulares (como se ha mencionado anteriormente) con diámetros de
menos de 100 \mum, preferiblemente menos de 50 \mum. Más
preferible es el uso de células o estructuras con diámetros de entre
30 \mum y 3 \mum.
Por mencionar algunas, entre las células que
pueden ser examinadas se encuentran las células de linfoma Jurkat,
las células HEK293, células de ovario de hámster chino (CHO),
células primarias de tejido neuronal como el hipocampo, ganglio,
células neuroendocrinas, etc.; músculo esquelético, músculo de
contracción involuntaria, músculo cardíaco, células inmunes;
epitelio y endotelio, etc. Además, las células pueden ser creadas
mediante ingeniería genética. Por ejemplo, las proteínas de
transporte iónico pueden ser expresadas en líneas celulares, por
ejemplo, células CHO. En una forma de realización preferida, se
puede recoger material genético como el ADN o el ARN del capilar
tras el experimento de patch-clamp.
Según otra forma de realización, el método
presentado puede utilizarse para examinar vesículas lipídicas
artificiales o naturales. De manera preferible, pueden introducirse
en dichas vesículas proteínas de transporte iónico, posiblemente
proteínas modificadas genéticamente. Asimismo, se pueden examinar
estructuras de membrana subcelular (por ejemplo, mitocondrias,
lisosomas, retícula endoplásmica, núcleos), células vegetales y
células procarióticas (por ejemplo, bacterias), puesto que, a
diferencia del estado de la técnica, las estructuras de la técnica
de patch-clamp con diámetros que bien pueden medir
más de un micrómetro pueden ser posicionadas y selladas.
En una forma de realización preferida, el
material es tomado/recogido de la célula posicionada, que pueden
ser proteínas, lípidos, ARN, ADN, enzimas y otras moléculas.
La invención comprende además un nuevo aparato
para experimentos de patch-clamp en células u otras
estructuras de membrana, preferiblemente para la aplicación del
método descrito anteriormente. Este dispositivo comprende al menos
un capilar, al menos un aparato para la entrega de una célula en
dicho lumen del capilar y el posicionamiento de dicha célula en el
interior del capilar y otros aparatos habituales necesarios para
llevar a cabo una medición de patch-clamp. Dicho
capilar se estrecha de manera que a lo largo de la longitud del
capilar al menos un punto tenga un diámetro interior más pequeño
que el diámetro exterior de la célula que ha de ser medida. Dicho
diámetro interior más pequeño mide menos de 10 \mum. El capilar
presenta una superficie interna muy limpia al menos en la parte con
el diámetro interior más pequeño. Además, el capilar está diseñado
de manera que una célula pueda ser introducida en dicho lumen del
capilar y posicionada para obtener un gigasello de al menos 10
gigaohmios entre la membrana celular y la superficie interna del
capilar. El diseño del aparato y sus ventajas están relacionados
directamente con el método anteriormente descrito y la descripción
del método es parte explícita de la descripción de dicho
dispositivo.
En una forma de realización preferida de la
invención, el aparato contiene dispositivos que permiten la
descarga y el drenaje del lumen del capilar con al menos una
solución o suspensión de células. Para este fin, se pueden emplear
recipientes para líquidos tales como receptáculos, tubos para la
alimentación y el drenaje del capilar, bombas para suspensiones y
soluciones, pipetas, válvulas e indicadores de flujo/presión.
En una forma de realización preferida de la
invención, los dispositivos de descarga/drenaje son complementados
o sustituidos por un dispositivo diseñado para centrifugar las
células al interior del capilar.
El aparato puede contener dispositivos para
medir la resistencia eléctrica (por ejemplo, electrodos
preferiblemente hechos de cloruro de plata o fibras y cableado de
carbono) o aparatos para analizar las propiedades ópticas del
sistema capilar/celular, preferiblemente fuentes de luz láser,
fibras ópticas, y detectores de luz. Dichos aparatos pueden ser
usados para controlar y ajustar el posicionamiento de la célula
dentro del capilar.
Las ventajas de la invención son más evidentes
en una forma de realización preferida de la invención donde se usan
capilares estrechados múltiples, preferiblemente micropipetas. Los
capilares pueden ser dispuestos preferiblemente en una fila
distanciados regularmente. De esta manera, el método de
patch-clamp puede ser automatizado, puesto que las
células selladas en los capilares pueden ser examinadas bien
simultáneamente, bien en un orden secuencial rápido.
En las formas de realización con capilares
múltiples las células pueden ser posicionadas en el interior de
dichos capilares en un primer paso. Puesto que las células
posicionadas están protegidas mecánicamente y firmemente selladas,
los capilares que contienen las células pueden ser transferidos en
un segundo paso a un aparato de medición. Además, los capilares que
contienen las células pueden ser sustituidos si falla el intento de
sellado o el intento de apertura de la membrana. En esta forma de
realización se puede ensamblar un conjunto de células abiertas,
selladas y posicionadas.
En las formas de realización con capilares
múltiples, tales capilares pueden ser protegidos eléctricamente uno
respecto del otro y del medio ambiente con facilidad. En este
contexto se pueden usar preferiblemente protecciones de puesta a
tierra de metal o cualquier otro material conductor al cerrar los
capilares. Tales protecciones pueden ser, por ejemplo, en forma de
tubos cilíndricos que rodean parcial o completamente los
capilares.
En las formas de realización con capilares
múltiples, se emplean preferiblemente recipientes para líquidos
múltiples, preferiblemente microondas, que mantienen suspensiones o
soluciones con células y compuestos. Estos recipientes pueden ser
pocillos en una placa de microvaloración. De forma preferible, el
número y la disposición de recipientes están relacionados con el
conjunto de capilares. Esto permite transferir el líquido de un
pocillo definido a un capilar correspondiente, por ejemplo, usando
pipetas de pistón.
En las formas de realización descritas, los
capilares y los recipientes para líquidos son dispuestos o movidos
preferiblemente de forma que las suspensiones o las soluciones,
incluidas las suspensiones celulares, puedan ser fácilmente
transferidas al lumen del capilar. Las ilustraciones y las
descripciones de las mismas proporcionan ejemplos para tales
disposiciones.
En una forma de realización preferida al menos
un capilar en el aparato se estrecha de manera que a lo largo de la
longitud del capilar al menos un punto tenga un diámetro interior
más pequeño que el diámetro exterior de la célula que ha de ser
medida, con el fin de aplicar el método descrito en la presente
invención. El capilar está hecho preferiblemente de vidrio y es
preferiblemente una micropipeta.
Las características y las explicaciones
descritas, al igual que otras características y explicaciones se
extraen del siguiente protocolo experimental y las descripciones de
las ilustraciones. Otras características se pueden aplicar en dicho
protocolo experimental o ilustraciones, por separado o
combinadas.
Figura
1
Es un dibujo donde se compara el posicionamiento
de una célula mediante la técnica de patch-clamp
habitual (A) y el método inventado (B).
Figura
2
Dibujo de una forma de realización del capilar
según la invención.
Figura
3
Representación de la permeabilización selectiva
de un lado de la membrana, respectivamente.
Figura
4
Dibujos de otras dos formas de realización de
capilares que contienen células en la posición sellada.
Figura
5
Dibujo de un aparato para
patch-clamp automatizado, el cual comprende un
capilar con célula y dispositivos adicionales.
Figura
6
Dibujo de un conjunto de capilares múltiples
para llevar a cabo el posicionamiento automatizado por succión y
patch-clamp automatizado.
Figura
7
Dibujo de un conjunto de capilares múltiples
para llevar a cabo el posicionamiento automatizado por
centrifugación y patch-clamp automatizado.
Figura
8
Trazos de la corriente en respuesta a los pasos
de voltaje que demuestran el aumento de la resistencia debido a la
formación del gigasello durante el posicionamiento de una célula en
el interior de un capilar.
La figura ilustra las diferencias entre el
método inventado y la técnica de patch-clamp
habitual del estado de la técnica. La figura 1A muestra la conexión
(sello) de una célula a la punta de una micropipeta con el método de
patch-clamp convencional. El sello se forma entre
el borde de la abertura de la pipeta y la membrana celular. La
flecha indica la dirección de succión/flujo, después de que se haya
presionado la punta de la pipeta contra la célula y aplicado vacío
al interior de la pipeta. La figura 1B muestra el posicionamiento y
el sellado de una célula mediante el método inventado. Las flechas
indican la dirección de flujo y/o el movimiento de las células
cuando las células suspendidas, por ejemplo, en la figura 1B son
tres células, son movidas hacia la punta de la micropipeta. La
figura 1B también muestra una célula sellada a la pared interna de
la pipeta estrechada. Se puede realizar un experimento de
patch-clamp en esta célula. A diferencia del estado
de la técnica, el método inventado no requiere que se mueva la
micropipeta hacia la célula. Las células son descargadas en el
lumen de la pipeta y posicionadas en el estrechamiento. Este método
no sólo es sencillo, sino que además acaba con la necesidad de un
microscopio para controlar el posicionamiento y de un
micromanipulador para posicionar la micropipeta. Esto permite en
cualquier caso miniaturizar y automatizar el dispositivo.
La figura 2 muestra un capilar y una célula
posicionada y sellada según el método inventado. El capilar es
construido como un tubo fino (diámetro exterior de 1'5 mm.,
diámetro interior de 1'2 mm.) y en el ejemplo mostrado se estrecha
hasta una pequeña abertura (0'5 - 1 \mum). En este estrechamiento
se posiciona una célula (diámetro \approx 10 \mum) y su
membrana es sellada a la superficie interna del estrechamiento
preferiblemente compuesta de vidrio. Las dos líneas pequeñas en la
abertura del estrechamiento simbolizan la permeabilización de la
membrana celular en la parte derecha. En ambos lados del capilar se
introducen unos tubos finos para la descarga/drenaje de soluciones
y suspensiones (diámetro exterior de 0'2 mm., diámetro interior de
0'1 mm.). Las flechas indican la dirección del flujo del líquido.
Estos dispositivos de descarga/drenaje pueden ser usados bien para
introducir la suspensión celular en el capilar (entrada y salida
izquierdas), bien para drenar la suspensión celular, por ejemplo,
después de un experimento (entrada y salida izquierdas). Asimismo,
los tubos pueden ser usados para limpiar el capilar (entradas y
salidas izquierdas y derechas) o para la aplicación de sustancias
farmacológicas, productos químicos de permeabilización de membranas
y otros compuestos (entradas y salidas izquierdas y derechas).
Además, se introducen electrodos en el lumen del capilar (por
ejemplo, cable de plata clorurada, diámetro exterior 0'2 mm.) para
mediciones eléctricas de corriente y/o voltaje e inyección de
corriente. Las dimensiones del capilar, el estrechamiento y las
entradas y salidas pueden ser ajustados a los requisitos
respectivos, por ejemplo, al diámetro de los tipos de células con
diferente tamaño.
La figura 3 muestra cómo la membrana celular
puede ser permeabilizada en ambos lados del sello circunferencial.
Es decir, la membrana celular puede hacerse permeable, bien en el
lado de la entrada que se reduce del estrechamiento, bien en el
lado de la salida. La permeabilización aparece simbolizada por
líneas dobles. La información correspondiente se encuentra en la
descripción anterior.
La figura 4 muestra dos modelos alternativos
adicionales de capilares estrechados con una célula sellada en la
parte estrecha, respectivamente. El panel izquierdo de la figura 4
muestra un estrechamiento, que se pliega hacia atrás formando un
borde o canto en la parte más estrecha del capilar. El panel
derecho muestra un capilar con forma de reloj de arena, mostrado en
la figura 4 de modo que ambos lados del estrechamiento son
simétricos en el punto más estrecho. Las características descritas
en la figura 4 son aquí reivindicadas explícitamente como parte de
la descripción de la invención.
La figura 5 muestra un dibujo de un dispositivo
según la invención. Se muestra un capilar de vidrio 1 formado como
una micropipeta similar al modelo mostrado en la figura 2. En la
parte similar a una boquilla del capilar estrechado 1 se posiciona
una célula para experimentos. Se introducen entradas y salidas 2 en
ambos extremos del lumen del capilar a ambos lados de la célula.
Estas entradas y salidas están conectadas a bombas e indicadores de
flujo/presión 3 que sirven para transferir líquidos entre los
receptáculos 5 y el capilar 1 y medir presiones y/o índices de
flujo. Se introducen los electrodos 8 en ambos lados del capilar 1.
Estos electrodos aparecen representados por líneas debajo de las
entradas y salidas también en la figura 2.
Una fuente de luz láser 6 y un detector de luz 7
son mostrados en la figura 5, los cuales sirven para controlar el
posicionamiento y la fijación de la célula en el capilar 1. Todos
los elementos respectivos están conectados electrónicamente a un
aparato de control 4 que contiene un ordenador y registra datos,
realiza la fijación de corriente y/o de voltaje (ver abajo), analiza
datos, y controla y regula el aparato.
Las figuras 6 y 7 muestran un aparato, donde son
ensamblados capilares múltiples. Los capilares están dispuestos en
conjunto regular plano y pueden ser posicionados por el dispositivo
sobre un conjunto respectivo de receptáculos múltiples. Estos
receptáculos pueden ser microrrecipientes en una placa de
microvaloración como se muestra en las figuras 6 y 7. Las aberturas
más grandes de las pipetas apuntan hacia los microrrecipientes y
pueden ser movidas a dichos recipientes. Los recipientes pueden ser
llenados con suspensiones celulares. En la parte inferior de la
figura 6 las suspensiones son aspiradas al interior de las pipetas.
En la figura 7 las células suspendidas son movidas hacia las puntas
de las pipetas por centrifugación. Con este fin, el soporte del
conjunto de pipetas se monta en un rotor. La fuerza centrífuga
mueve por rotación las células hacia la parte estrecha de las
pipetas. La parte inferior de la figura 7 muestra otra placa de
microvaloración. Los recipientes en esta placa pueden ser llenados
con soluciones de sustancias farmacológicas. El conjunto de pipetas
que soporta las células puede sumergirse en los recipientes para
probar compuestos farmacológicos. De forma alternativa o adicional,
se pueden transferir sustancias o soluciones de las mismas de los
recipientes a las micropipetas que soportan las células mediante
dispositivos de manipulación de líquidos, por ejemplo, robots de
pipeteado.
Se explica la figura 8 en la siguiente
descripción de un experimento.
Las micropipetas de patch-clamp
con dimensiones como las descritas en la figura 2 fueron extraídas
de vidrio de borosilicato (Clark Electromedical Instruments,
Reading, Reino Unido) mediante un extractor controlado por un
microprocesador (Zeitz Instrumente, Augsburg, FRG). Las puntas de la
pipeta fueron pulidas a fuego en el extractor bajando hasta una
resistencia de la punta de entre 2 y 3 megaohmios en una solución
acuosa conteniendo 150 mM de NaCl. Para reducir la capacitancia
eléctrica, la superficie externa de algunas puntas de pipetas
fueron revestidas con caucho de silicio o parafina.
Se realizaron mediciones usando un amplificador
de patch-clamp EPC9 (HEKA, Lambrecht, FRG) para la
fijación del voltaje y adquisición de datos. Los datos fueron
digitalizados a 10 kHz y filtrados a 2 kHz. Los análisis fueron
realizados usando un software de HEKA.
"Voltage-clamp" significa una técnica habitual
para el control de parámetros eléctricos durante una medición de
patch-clamp. Un grupo de circuitos de
retroalimentación de alta resistencia inyecta de manera exacta la
cantidad de corriente en la preparación biológica, de forma que el
voltaje permanece en el valor deseado. El grupo de circuitos
análogo presenta una alta resolución de tiempo y permite la
compensación de corrientes capacitativas, resistencia de series y
corrientes de fugas, que habrán de ser distinguidas de las
corrientes iónicas que fluyen a través de las estructuras de
membrana examinadas.
La pipeta ha sido llenada con una solución
Ringer modificada filtrada y estéril que contiene 145 mM de NaCl, 5
mM de KCl, 2 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2}, 10 mM de glucosa
y 10 mM de HEPES (pH 7'4). La pipeta ha sido conectada
eléctricamente al preamplificador por medio de un cable de plata
revestido con AgCl. Se introdujeron entre 100 y 500 células T Jurkat
(ATCC, VA, EEUU) con un diámetro de aproximadamente 5 \mum
suspendidas en un medio RPMI de aproximadamente 10 \mum en la
micropipeta mediante un tubo de vidrio fino. Después, se ha
sumergido la punta de la pipeta en un baño que contiene el
electrodo de tierra. Se midió la resistencia con un salto de tensión
de 5 mV (ver figura 8a). Se aplicó una presión de 0'5 bar a la
pipeta, siendo descargadas las células hacia la punta de la pipeta.
El gradiente de presión fue eliminado en cuanto aumentó la
resistencia eléctrica de la pipeta, indicando la posición de una
célula en el estrechamiento de la pipeta (figura 8 b).
Este tipo de experimento podría reproducir
gigasellos entre el interior de la pipeta y la membrana celular. Al
igual que con el método de patch-clamp
convencional, la resistencia eléctrica era de más de 10 gigaohmios
(ver figura 8 C).
Asimismo, este experimento demuestra que la
célula está situada en la sección de la pipeta que se estrecha. Un
lado de la membrana celular fue perforado por la aplicación de un
impulso de presión corto (1 bar, 200 ms.) o de un salto de tensión
(500 mV, 0'1 ms.). Esto resulta evidente a partir del aumento de
los movimientos de carga capacitativa (transientes de corriente). El
gigasello se ha mostrado normalmente estable a lo largo de períodos
de tiempo extensos (entre 10 y más de 60 min.), incluso resistente
a las vibraciones mecánicas aplicadas con este propósito a la
micropipeta.
El experimento aquí descrito muestra de manera
inequívoca que, mediante la introducción de una célula en un
capilar de vidrio que presenta un estrechamiento, se puede obtener
un gigasello estable entre la membrana celular y la superficie
interna de la pared de la pipeta. La resistencia y la estabilidad
del sello son lo suficientemente altas para la consecución de las
ventajas descritas.
Claims (24)
1. Método para realizar mediciones en células o
estructuras similares con la técnica de
patch-clamp, caracterizado por el hecho de
que
- -
- al menos una célula es introducida en el lumen interior de un capilar que a lo largo de la longitud del capilar al menos en un punto tiene un diámetro interior más pequeño que el diámetro exterior de dicha célula, donde el capilar presenta una superficie interna muy limpia al menos en la parte con el diámetro interior más pequeño y donde dicho diámetro interior más pequeño mide menos de 10 \mum,
- -
- dicha célula está situada en el interior de dicho capilar en el lugar mencionado, formando un gigasello entre la membrana celular y la superficie interna de dicho capilar con una resistencia eléctrica de al menos 10 gigaohmios, y
- -
- a continuación se realiza un experimento de patch-clamp en dicha célula.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que dicha célula es
introducida y posicionada en el capilar mediante la descarga o la
succión de una suspensión o solución que contiene la célula en el
interior del capilar.
3. Método según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado por el hecho de que dicha célula es
introducida y posicionada en el capilar por centrifugación y/o
sedimentación aplicada a la suspensión o solución que contiene
dicha célula.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicho capilar es un capilar de vidrio.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicho capilar es una micropipeta.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicha célula presenta un diámetro de menos de 100 \mum,
preferiblemente de menos de 50 \mum, siendo preferidos diámetros
de entre 30 \mum y 3 \mum.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicha célula o dicha suspensión o solución que contiene la
célula es introducida en dicho capilar haciéndola pasar a través de
un líquido o solución preferiblemente filtrada y estéril, en
especial una solución salina fisiológica.
8. Método según la reivindicación 7,
caracterizado por el hecho de que antes de la fase relativa
al paso, se introduce dicho líquido o solución preferiblemente
filtrada y estéril en el capilar, de manera que se cubre al menos
el lugar donde se situará el gigasello.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que la posición de dicha célula en el interior del capilar es
controlada antes o durante un experimento de
patch-clamp, de manera preferible mediante la
medición de las presiones o flujos o resistencia eléctrica o el
empleo de señales ópticas, preferiblemente luz láser, después de
posicionar una célula en el interior del lumen del capilar.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que dicha célula es retirada del capilar después del experimento de
patch-clamp, y el capilar es limpiado,
preferiblemente rociándolo con un solvente o sustancia química
apropiada.
11. Aparato para la realización de experimentos
en células o estructuras similares con el método de
patch-clamp, en especial para la aplicación del
método descrito en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el
cual comprende
- al menos un capilar (1) que a lo largo de su
longitud presenta al menos en un punto un diámetro interior menor
que el diámetro exterior de una célula,
caracterizado por el hecho de que el
capilar (1) presenta una superficie interna muy limpia al menos en
la parte con el diámetro interior más pequeño, y donde dicho
diámetro interior más pequeño mide menos de 10 \mum, y que está
diseñado para soportar y posicionar al menos una célula en su lumen
y permitir la formación de un gigasello entre la membrana celular y
la superficie interna de dicho capilar con una resistencia
eléctrica de al menos 10 gigaohmios,
comprendiendo además
- al menos un dispositivo diseñado para
introducir dicha célula en el lumen del capilar y posicionarla
y
- otros dispositivos necesarios para llevar a
cabo un experimento de patch-clamp.
12. Aparato según la reivindicación 11,
caracterizado por el hecho de que dicho aparato para la
introducción y posicionamiento está diseñado para descargar y/o
drenar al menos una suspensión o solución que contiene dicha célula
en el interior o en el exterior del lumen del capilar.
13. Aparato según la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que incluye los siguientes
aparatos:
- -
- Recipientes como receptáculos (5) para líquidos, suspensiones y soluciones,
- -
- Entradas (2) y/o salidas (2) que conectan los receptáculos (5) y el capilar (1),
- -
- Bombas (3), válvulas (3) y/o tubos para líquidos, suspensiones y soluciones, y de manera opcional
- -
- Aparatos para medir presiones y flujos.
14. Aparato según una de las reivindicaciones
11 a 13, caracterizado por el hecho de que dicho aparato
para la introducción y posicionamiento es diseñado para la
centrifugación de al menos una suspensión o solución que contiene
dicha célula en el interior del lumen del capilar.
15. Aparato según una de reivindicaciones 11 a
14, caracterizado por el hecho de que dicho capilar es un
capilar de vidrio.
16. Aparato según una de las reivindicaciones
11 a 15, caracterizado por el hecho de que dicho capilar (1)
es una micropipeta.
17. Aparato según una de las reivindicaciones
11 a 16, caracterizado por el hecho de que se incluyen
dispositivos (6 y 7) para la medición de la resistencia eléctrica
y/o para iluminar, preferiblemente con luz láser, y para el
análisis de las señales ópticas después de o durante la
introducción de células en el capilar.
18. Aparato según una de las reivindicaciones
11 a 17, diseñado para realizar experimentos de
patch-clamp en células automáticamente,
caracterizado por el hecho de que están dispuestos capilares
múltiples, preferiblemente en un conjunto plano espaciado
regularmente.
19. Aparato según la reivindicación 18,
caracterizado por el hecho de que son diseñados recipientes
múltiples, preferiblemente pocillos en una placa de
microvaloración, para contener soluciones y suspensiones con
células o compuestos, y porque preferiblemente se dispone un número
de recipientes correspondiente al número de capilares.
20. Aparato según la reivindicación 19,
caracterizado por el hecho de que los capilares y los
recipientes son dispuestos o pueden ser posicionados de manera que
las suspensiones o soluciones y sus respectivos contenidos pueden
ser traspasados de los recipientes a los capilares o viceversa.
21. Aparato según una de las reivindicaciones
18 a 20, caracterizado por el hecho de que los capilares
pueden ser sustituidos después de un intento fallido de sellado, y
que preferiblemente abre una célula de una forma que genera un
conjunto de capilares, conteniendo cada capilar una célula sellada
y abierta preparada para realizar mediciones de
patch-clamp.
22. Uso de un capilar, preferiblemente un
capilar de vidrio, preferiblemente una micropipeta,
caracterizado por el hecho de que a lo largo de la longitud
del capilar al menos en un punto presenta un diámetro interior
menor que el diámetro exterior de una célula, según el cual el
capilar presenta una superficie interna muy limpia al menos en la
parte con el diámetro interior más pequeño, para la realización del
método reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a
10.
23. Capilar, preferiblemente capilar de vidrio,
preferiblemente micropipeta, caracterizado por el hecho de
que presenta al menos en un punto un diámetro inferior a 10 \mum,
con una superficie interna lo suficientemente limpia para
proporcionar un gigasello en un experimento de
patch-clamp, siendo el capilar sellado en un
recipiente o envoltorio estéril.
24. Kit para poner en práctica el método
reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el cual
comprende al menos un capilar reivindicado en la reivindicación
23.
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