ES2264481T3 - Polipeptidos de cacao y su empleo en la produccion de sabor de cacao y chocolate. - Google Patents
Polipeptidos de cacao y su empleo en la produccion de sabor de cacao y chocolate.Info
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Abstract
Un polipéptido de cacao identificado mediante SEQ. ID. No. 1.
Description
Polipéptidos de cacao y su empleo en la
producción de sabor de cacao y chocolate.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos de cacao que tienen un peso molecular de
aproximadamente 10 y 14 kDa, y que derivan de un precursor de 69
kDa. En particular, la presente invención se refiere a la producción
de dichos polipéptidos por medios recombinantes y el empleo de
dichos polipéptidos para la producción de sabor de
cacao/chocolate.
Durante el procesado de las habas de cacao, la
generación del sabor típico del mismo requiere dos pasos, un paso de
fermentación, el cual incluye el secado al aire del material
fermentado y un paso de tostación del mismo.
Durante la fermentación, la pulpa que rodea las
habas se degrada mediante microorganismos y los azúcares contenidos
en la pulpa se transforman en su mayor parte, en ácidos. En el curso
del proceso de fermentación estos ácidos se difunden lentamente en
las habas causando una acidificación del material celular. Durante
la fermentación, se generan también péptidos con diferentes tamaños
y un alto nivel de aminoácidos libres hidrofóbicos, cuya acción se
debe principalmente a la actividad de proteinasas específicas. Esta
mezcla específica de péptidos y aminoácidos hidrofóbicos se
considera que representa los precursores del sabor específico del
cacao.
La investigación se ha centrado en las
diferentes enzimas proteolíticas implicadas en estas reacciones. De
hecho, se ha descubierto que un número de diferentes tipos de
enzimas tal como una endoproteinasa aspártica, una cisteína
endoproteinasa o una carboxipeptidasa participan en estas reacciones
de degradación que conducen a la formación del conjunto
péptidos/aminoácidos precursor del sabor del cacao.
En el segundo paso de la producción del sabor de
cacao, a saber, el paso de tostación, los oligopéptidos y
aminoácidos generados en la etapa de fermentación se someten a una
reacción Maillard con azúcares reductores presentes en la mezcla,
obteniéndose substancias responsables del sabor de cacao como
tal.
En la técnica han habido intentos de producir
artificialmente el sabor de cacao, como p. ej., sometiendo el polvo
de acetona seco preparado a partir de habas maduras de cacao sin
fermentar, a una autolisis a un pH de 5,2, seguido de la tostación
en presencia de azúcares reductores. Se pensó que en estas
condiciones debían generarse de preferencia los aminoácidos
hidrofóbicos libres y péptidos hidrofílicos y el modelo de péptido
así obtenido se vio que era similar al de los extractos de las habas
de cacao fermentadas. Un análisis de los aminoácidos libres reveló
que los Leu, Ala, Phe y Val eran los aminoácidos predominantes
liberados en las habas fermentadas o autolisis (Voigt et al.,
Food Chem. 49 (1994), 173-180). En contraste con
estos descubrimientos no pudo ser detectado ningún sabor específico
a cacao cuando el polvo mencionado se sometió a autolisis a pH 3,5.
Solamente se descubrieron unos pocos aminoácidos que habían sido
liberados pero se formó un gran número de péptidos hidrofóbicos.
También, con una mezcla sintética de aminoácidos
libres solos cuya composición era similar a la del espectro
descubierto en las habas fermentadas, el sabor a cacao no pudo ser
detectado después del tostado, indicando con ello que tanto los
péptidos como los aminoácidos eran importantes para este propósito
(Voigt et al., Food Chem. 49 (1994),
173-180).
Adicionalmente, Voigt et al., (Food
Chemistry 50 (1993), 177-184), describe estudios
in vitro dirigidos a la formación proteolítica de precursores
específicos de cacao empleando substratos de proteínas (entre ellas,
la albúmina y fracciones de la proteína globulina) mediante
proteasas purificadas a partir de semillas de cacao sin germinar. Se
han realizado estudios comparativos con respecto a una proteolisis
entre ambos substratos de proteína, y se obtuvieron precursores de
aroma de cacao mediante digestión proteolítica. La fracción de
proteína resultante indicó la presencia de moléculas que tenían un
tamaño del orden de 7 a 16 kDa.
Hasta la fecha se ha prestado poca atención al
conjunto proteínico a partir del cual se genera el conjunto
péptidos/aminoácidos precursor del sabor, puesto que las proteínas
de cacao son difíciles de aislar y/o de investigar. Una de las
razones importantes para esto reside en que las semillas de cacao
contienen una alta cantidad de polifenoles y grasa, cuya separación
hace necesario el empleo de líquidos orgánicos lipofílicos, tales
como la acetona. El empleo de estos líquidos contribuye además a la
eliminación de substancias activas del sabor o precursores del
mismo, las cuales son de naturaleza lipofílica. Otro inconveniente,
cuando se intenta determinar el conjunto proteínico de las habas de
cacao, reside en la pobre solubilización de las proteínas
purificadas con la acetona, lo cual da como resultado una pobre
recuperación de las proteínas totales.
Hasta la fecha cuatro importantes proteínas con
un peso molecular aparente de 14,5, 21, 31 y 47 kDa, han podido ser
identificadas en las habas de cacao antes de la fermentación, las
cuales se piensa que son la principal fuente del conjunto
péptidos/aminoácidos que justifica eventualmente el sabor a
cacao.
Dado que actualmente no se dispone de ninguna
otra información más substancial acerca del conjunto
proteínas/péptidos de cacao, constituye un objeto de la presente
invención el separar dicho conjunto con más detalle y eventualmente
proporcionar los medios para perfeccionar la preparación del sabor
de cacao.
\newpage
El objetivo anterior ha sido solucionado
mediante dos péptidos que tienen un peso molecular de alrededor de
10 y 14 kDa respectivamente, los cuales se derivan de la proteína
precursora de 69 kDa previamente descrita por Spencer et al.,
(1998) US5770433; Spencer y Hodge, (1991) WO/19801, y Spencer y
Hodge, Planta 186 (1992), 567-576. La secuencia de
dichos péptidos está identificada mediante SEQ. ID. No. 1 y 2
respectivamente.
En las figuras,
La figura 1, muestra la fotografía de proteínas
SDS-PAGE de dos dimensiones, aisladas de habas de
cacao sin fermentar;
La figura 2a muestra el resultado de un análisis
LC_ESI-MS, de un extracto GndHCl de habas de cacao
sin fermentar.
Durante los estudios que han conducido a la
invención de los presentes inventores, se han diseñado nuevos
métodos para perfeccionar el aislamiento de las proteínas de cacao
empleando agentes desnaturalizantes tales como p. ej., SDS (1%),
urea ó GndHCl, lo cual ha dado como resultado un aumento de 3 veces
la solubilidad de las proteínas comparado con los métodos
convencionales. En particular, el empleo de GndHCl 6M proporcionó
buenos resultados. El GndHCl destacó por ser fácilmente eliminable
mediante RP-HPLC sin que tuviera lugar ninguna
reacción con las proteínas. Además, pudo mostrarse también que
incluso el polvo de habas crudo después de ser sometido a un
tratamiento con un tampón de solubilización que incluía un agente
desnaturalizante, podía ser analizado con éxito, sin que fuera
necesario ningún cuidado especial para eliminar los polifenoles.
Durante los estudios más arriba descritos,
dirigidos para proporcionar una mejor recuperación total de las
proteínas de cacao, los inventores sometieron un polvo de habas de
cacao crudas a un gel SDS-PAGE de dos dimensiones,
con el cual pudo detectarse un grupo de varios polipéptidos que
tenían un peso molecular alrededor de 9-16 kDa. Los
polipéptidos contenidos en dicho grupo de carácter ácido han sido
aislados más tarde empleando una RP-HPLC.
Finalmente han podido aislarse dos polipéptidos
que han mostrado un peso molecular alrededor de 10 y alrededor de 14
kDa, los cuales polipéptidos han sido secuenciados hasta el terminal
N. Las secuencias obtenidas están mostradas en SEQ ID. No. 3
(proteína de 10 kDa) y SEQ ID. No 4 (proteína de 14 kDa),
respectivamente.
Después de una comparación con secuencias de
proteína conocidas, pudo demostrarse que estos polipéptidos se
derivan obviamente de una proteína precursora de 69 kDa, la cual es
conocida por dar origen a una proteína de 31 y 47 kDa. En
consecuencia, dicha proteína de 69 kDa después de procesar las habas
de cacao no solamente da origen a las proteínas más arriba
mencionadas de 47 y 31 kDa sino también a las presentes proteínas de
10 y 14 kDa, las cuales por lo tanto representan también parte del
conjunto proteínas/péptidos de las habas de cacao.
En consecuencia, en una versión de la presente
invención, se proporcionan dos polipéptidos identificados mediante
SEQ. ID. No 1 y SEQ. ID. No. 2, los cuales forman parte de un
conjunto proteínas/péptidos de habas de cacao sin fermentar.
De acuerdo todavía con otra versión, la presente
invención proporciona un nucleótido recombinante que codifica dichos
polipéptidos. Una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera
de los dos polipéptidos, puede derivarse fácilmente a partir de la
secuencia de polipéptidos dada, traduciendo el aminoácido de acuerdo
con el código genético en los correspondientes tripletes. Dicha
secuencia de nucleótidos puede muy bien expresarse en una célula
adecuada mediante medios bien conocidos en la técnica, como p. ej.,
en una célula bacteriana, p. ej., en E. coli, ó en una
levadura, en una células de insecto, mamífero o de un vegetal.
Para finalizar, se inserta una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención en
un vehículo adecuado, como p. ej., un vector de expresión, y se
incorpora en una célula seleccionada. Con respecto a las células
vegetales, los nucleótidos que codifican los polipéptidos de la
presente invención pueden ser también incorporados en cualquier
cromosoma de la célula vegetal empleando p. ej., el fenómeno de la
recombinación homóloga. A este respecto, por lo menos una copia de
preferencia más de 40 copias de una secuencia de nucleótidos que
codifican una cualquiera de los presentes polipéptidos puede estar
presente en la secuencia de ADN para ser insertada en un cromosoma
de la célula vegetal.
Cuando es insertada en el cromosoma de una
célula vegetal, dicha célula puede ser estimulada para crecer en una
planta. En consecuencia, de acuerdo con otra versión, la presente
invención se refiere también a una planta que contiene un nucleótido
recombinante que codifica un polipéptido de la presente
invención.
Además, la invención se refiere también al
empleo de dichos polipéptidos para la preparación del sabor de
cacao. Para finalizar, se ha pensado que los presentes polipéptidos
podrían añadirse a la mezcla de fermentación de habas de cacao con
el fin de proporcionar una mayor cantidad de dichos polipéptidos
para la degradación. Los polipéptidos aislados pueden añadirse
durante el procesado del cacao y chocolate para potenciar estos
sabores. Los polipéptidos aislados pueden emplearse en una reacción
del proceso con azúcares reductores, especialmente monosacáridos, p.
ej., glucosa, fructosa, etc. para generar sabor de cacao o chocolate
artificial. Cuando se emplean plantas de cacao, que han sido
modificadas por medios recombinantes y contienen un alto número de
copias de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos
de la presente invención, dichas plantas tendrán inherentemente una
más alta concentración de dichos polipéptidos y eventualmente se
obtendrá como resultado la producción de un sabor de cacao más
fuerte después del procesado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención de
manera más detallada. Sin embargo, se comprende que la presente
invención no está limitada por los ejemplos sino que más bien queda
abarcada por el ámbito de las reivindicaciones del apéndice.
Se obtuvieron las habas de cacao sin fermentar
de Costa de Marfil y, a no ser que se mencione otra cosa, todos los
estudios se efectuaron empleando habas de cacao West African
Amelonado. Se pasaron las habas de cacao secas por un triturador de
habas, seguido de una aventadora para eliminar las cáscaras. Las
habas sin cáscara se guardaron en una botella de color topacio a
–20ºC. Las habas de cacao sin cáscara se molieron durante unos pocos
segundos en un molino universal. El polvo de las habas sin cáscara
se pasó a través de un tamiz de 0,8 mm y se guardó a 4ºC.
Se disolvió el polvo de las habas de cacao crudo
(sin fermentar) (100 mg) en 1 ml de tampón de solubilización [8 M de
urea, 3% (p/v) de CHAPS, 2,8% (v/v) de anfolitos soporte (anfolina
con pH en el margen 4-6,5, 5-8, y
3-10 (2:4:1)), y 10 mM de DTT (ditiotreitol)]. El
sobrenadante transparente se sometió a una primera dimensión de
separación con un gradiente de pH inmovilizado (IPG) de
4-7, y a una segunda dimensión con un 10% de gel T
SDS-PAGE. Las proteínas fueron visualizadas mediante
tinción con plata.
El perfil electroforético de proteínas
resultante en una típica haba de cacao sin fermentar sobre un
SDS-PAGE de dos dimensiones se muestra en la figura
1. Las proteínas de 47, 31 y 21 kDa se representaron mediante varias
subformas y además se identificaron claramente dos distintos grupos
(de carácter ácido y carácter básico) en un margen de pesos
moleculares alrededor de 9-16 kDa. Pudieron
mostrarse todas las manchas de proteína, para desaparecer
gradualmente después de la fermentación de las habas.
La
tricina-SDS-PAGE de genotipos de
haba de cacao sin fermentar mostró que dichos grupos en la región de
peso molecular 9-16 kDa estuvieron presentes en
todos los 21 diferentes genotipos representando tres grupos de
cacao, a saber, Criollo, Forastero y Trinitario.
El grupo de carácter ácido ha sido seleccionado
para una posterior investigación.
Se suspendió polvo de habas de cacao sin cáscara
(10 g) en 200 ml de acetona acuosa al 80% (v/v) y se agitó durante 1
hora a 4ºC. La suspensión resultante se centrifugó a 15.000 rpm
durante 15 minutos a 4ºC. El residuo se extrajo 5 veces con 200 ml
de acetona acuosa al 80% (v/v) seguido por 3 lavados con 100% de
acetona. El polvo de acetona resultante se secó a presión
reducida.
A continuación, se preparó un extracto de GndHCl
y un extracto GndHCl piridin-etilado de CAP a partir
de habas de cacao sin fermentar. Se suspendió 1 g de CAP con 10 ml
de tampón de GndHCl (100 mM de fosfato de amonio, 66,7 mM de
hidróxido de potasio, 3 mM de EDTA y 6 M de GndHCl y se trató en un
baño de ultrasonidos durante 1 minuto. La suspensión se enfrió en
hielo durante 15-30 minutos y se centrifugó a 15000
rpm a 4ºC durante 15 minutos. El supernatante transparente se
eliminó cuidadosamente. Con el fin de obtener un extracto GndHCl
piridin-etilado, dicho extracto de CAP (2 ml) se
trató con argón (burbujeo) y se mezcló con 50 \mul de solución
reductora (0,8 M de DTT en 3 M de fosfato de tripotasio/3 mM de
EDTA). La solución se guardó a temperatura ambiente en la oscuridad
durante 60 minutos. La piridin-etilación a los
residuos de cisteína del CAP reducido se efectuó mezclando
vigorosamente 40 \mul de
4-vinil-piridina y subsiguiente
incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente (Lundell y
Schreitmüller, Anal. Biochem. 266 (1999) 31-47). La
mezcla de reacción se dializó frente a 500 ml de tampón de
extracción durante la noche a temperatura ambiente. La muestra
dializada se centrifugó y el sobrenadante transparente se pasó a
través de un disco de filtro de 0,22 \mum y se guardó a 4ºC hasta
ser analizado.
Se efectuó un análisis
LC-ESI-MS del extracto reducido y
piridiletilado, como puede verse en la figura 2. Para finalizar, los
extractos GndHCl reducidos y piridiletilados de CAP fueron
inyectados en columnas de HPLC de fase invertida [serie
Bio-Rad HRLC sistema 800; columnas C4 y C8 de
Aquapore RP butil (7 \mum, 4,6 x 220 mm), Aquapore RP 300 (7
\mum, 4,6 x 220 mm), Perkin Elmer, Spherisorb
80-5C8 (220 x 4 mm); Marchery Nagel y proteína Vydac
C4 (4,6 x 220 mm)], preequilibradas con disolvente A (0,1% v/v de
TFA en agua) y se eluyó con un gradiente lineal de una concentración
creciente de disolvente B (80% v/v de acetonitrilo y 0,1% v/v de
TFA): 0-15% de B en 5 minutos,
15-27% de B en 40 minutos, 27-35% de
B en 2 minutos, isocrático a 35% de B durante 3 minutos,
35-43% de B en 25 minutos, 43-56% de
B en 50 minutos, 56-70% de B en 5 minutos,
70-100% de B en 10 minutos e isocrático a 100% de B
durante 5 minutos].
Se encontró que hay fracciones que contienen
proteínas que eluyen con un tiempo de retención de aproximadamente
41, 52, 68, 78 y 87 minutos. Estas fracciones, fueron
aproximadamente de un M_{r} de 10.425 (marcado como CSP10), 9.010
(marcado como CSP9) 20.540 (marcado como CSP22) y 12.500 (marcado
como CSP12), respectivamente, como puede verse en la tabla 1. En el
caso de proteínas que eluyeron a 41 minutos y 97 minutos, no pudo
identificarse ninguna masa molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de retención, minutos | Código de retención | M_{r} medio | Comentarios |
| 41,4 | CSP14 | No detectado | |
| 52,5 | CSP10 | 10,425 | |
| 67,7 | CSP9 | 9,010 | |
| 78,5 | CSP22 | 20,540 | Albúmina CSP |
| 86,9 | CSP12 | 12,245 | |
| 97,3 | CSP67 | No detectado | Vicilin tipo CSP |
| 132,2 | CSP Agg | No detectado |
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que el Mw medio de la proteína designada
CSP14 no pudo ser asignado con el método de más arriba, la fracción
del pico se disolvió en 500 \mul de disolvente B al 25% (0,05% v/v
de TFA/80% v/v ACN). Para SDS-PAGE, un alícuota de
10 \mul se secó en el speedvac y se disolvió en 20 \mul de
tampón de muestra SDS y se analizó con un gradiente de
10-20% T y geles de Tris-Tricina
acrilamida preparados, empleando el sistema miniprotean 3 de
Bio-Rad. Las bandas de proteína fueron visualizadas
tiñendo los geles en solución de tinción [0,5% (w/v) azul brillante
de Commassie R250 en 30% (v/v) de metanol y 10% (v/v) de ácido
acético] durante 1 hora seguido por el desteñido [30% (v/v) de
metanol más 10% (v/v) de ácido acético] hasta que las bandas se
hicieron visibles contra el fondo claro (Graffin, Methods Enzymol.
182 (1990) 425-477). De acuerdo con ello, pudo
observarse que la CSP 14 correspondía a una proteína que tenía un
peso molecular de aproximadamente 14 kDa.
A continuación, las proteínas de cacao,
reducidas y piridin-etiladas se aislaron/recogieron
mediante inyecciones repetitivas y se juntaron automáticamente las
fracciones y se recogieron los extractos GndHCl de la CAP sin
fermentar, como se ha descrito más arriba. Las fracciones reunidas
de cada proteína se secaron a presión reducida y se disolvieron en
400 \mul de disolvente A y se recromatografiaron [columna Aquapore
RP 300 (7 \mum, 4,6 x 220 mm), sistema disolvente TFA/ACN; volumen
de inyección 400 \mul; detección a 215 nm; gradientes: 1. (CSP14)
y (CSP9): 0-15% de B en 5 minutos, isocrático al 15%
de B durante 5 minutos, 15-35% de B en 60 minutos,
35-50% de B en 10 minutos, 50-100%
de B en 5 minutos e isocrático a 100% de B durante 5 minutos; 2.
Figura 7c (CSP12): 0-35% de B en 5 minutos,
isocrático a 15% de B durante 5 minutos, 35-60% de B
en 60 minutos, 60-75% de B en 10 minutos,
75-100% de B en 10 minutos e isocrático al 100% de B
durante 10 minutos;]. Fracciones de 1 ml cada una fueron recogidas
automáticamente y las que contenían las fracciones del pico de cada
una de las CSP14 y CSP10 se reunieron, se secaron y se guardaron a
–20ºC hasta que fueron usadas.
Las proteínas purificadas de las semillas de
cacao CSP10 y CSP14 se sometieron al secuenciado de los aminoácidos
hasta el N-terminal mediante el secuenciador de
proteínas por degradación Edman. El rendimiento inicial y repetitivo
del ciclo Edman fue entre el 80 y el 90%. Los resultados obtenidos
están mostrados en la tabla 2 a conti-
nuación:
nuación:
| Proteína | Cantidad inicial, | Rendimiento inicial, | Secuencia |
| p moles | p moles | ||
| CSP10 | 400 | 120 | Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Ser Glu Glu Glu Thr Pha |
| Gly Glu Phe Xaa Gln Val Xaa Ala Pro Leu Xaa Pro Gly | |||
| CSP14 | 200 | 100 | Gly Arg Lys Gln Tyr Glu Arg Asp Pro Arg |
Se ha descubierto que las secuencias
N-terminal de CSP 10 y 14 listadas más arriba, son
una parte de la proteína de almacenamiento de 67 kDa de cacao tipo
vicilin (WO 91/19801, ver más arriba). De esta forma, tanto la CSP
10 como la CSP 14 no son hasta la actualidad fragmentos de la
proteína de almacenamiento de 67 kDa de cacao tipo vicilin,
producidos durante el proceso normal de dicha proteína en las habas
de cacao. Alineando las proteínas de 47 y de 31 kda, conocidas por
derivarse de la proteína vicilin de 67 kDa, pudo derivarse a esta
proteína la secuencia restante para la CSP 10 y la CSP 14, lo cual
dio como resultado las secuencias identificadas por SEQ.ID. No. 1 y
SEQ.ID. No. 2.
Un cálculo de los pesos moleculares de los
aminoácidos contenidos en los polipéptidos de acuerdo con la SEQ.
ID. No. 1 y 2 confirmó los pesos moleculares aproximados de los
polipéptidos resultantes de aproximadamente 10 y 14 kDa.
En consecuencia, dichos péptidos parecen también
haber sido escindidos durante el procesado normal de la proteína de
67 KDa y representan una parte del conjunto
proteínas/poli-péptidos de las habas de cacao.
Se preparó un sabor de reacción de cacao para
emplear como referencia haciendo reaccionar 0,8% de Leu, 1,45% de
Phe, 0,8% de Val, 1,5% de fructosa, 1,5% de agua (4 gotas de NaoH en
20 ml de agua) y 94% de propilenglicol a 125ºC durante 60 minutos a
reflujo. Los sabores de reacción preparados con el polipéptido
aislado de cacao antes y después de la hidrólisis con enzimas
comerciales o enzimas de cacao fueron generados reemplazando los
aminoácidos con una fracción del 1% de polipéptido liofilizado. La
degustación se efectuó sobre una solución al 0,1% en 1% de sacarosa.
El sabor de la reacción producido con los hidrolizados de cacao se
analizó y se comparó respecto a la referencia preparada.
<110> Société des Produits Nestlé S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Polipéptidos de cacao y su empleo en
la producción de sabor de cacao y chocolate
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<141>
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<170> PatentIn Ver: 2.1
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<210> 1
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<211> 89
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<212> PRT
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<213> Theobroma cacao
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 101
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<212> PRT
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<213> Theobroma cacao
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 26
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<212> PRT
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<213> Theobroma cacao
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<400> 3
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\sa{Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Ser Glu Glu Glu
Thr Phe Gly Glu Phe}
\sac{Xaa Gln Val Xaa Ala Pro Leu Xaa Pro
Gly}
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Theobroma cacao
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<400> 4
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\sa{Gly Arg Lys Gln Tyr Glu Arg Asp Pro
Arg}
Claims (9)
1. Un polipéptido de cacao identificado
mediante SEQ. ID. No. 1.
2. Un polipéptido de cacao identificado
mediante SEQ. ID. No. 2.
3. Un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que posteriormente
se hace reaccionar con azúcares reductores.
4. Una secuencia de nucleótidos que
codifica un poli-péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
5. Un vector que contiene una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Una célula que contiene una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4 y/o un
vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula de acuerdo con la
reivindicación 6, la cual es una célula bacteriana, una levadura,
una célula de insecto, una célula de mamífero o una célula
vegetal.
8. Una planta que contiene una célula vegetal
de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Empleo de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la producción
de sabor de cacao y/o chocolate.
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