ES2263186T3 - Soporte para cultivos celulares. - Google Patents
Soporte para cultivos celulares.Info
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Abstract
SE PROPONE UN SOPORTE PARA CULTIVOS CELULARES, ESPECIALMENTE UN MICROSOPORTE PARA BIORREACTORES U ORGANOS ARTIFICIALES, SOBRE CUYA SUPERFICIE ESTAN ASENTADAS CELULAS UNIDAS AL SOPORTE, ESTANDO COMPUESTO EL SOPORTE DE UN ALGINATO (1) Y LA SUPERFICIE (3) DEL MISMO ESTA RECUBIERTA DE UNA CAPA DE UNA PROTEINA DE ADHESION (2), ENCONTRANDOSE LAS CELULAS (4) SOBRE LA PROTEINA DE ADHESION (2).
Description
Soporte para cultivos celulares.
La invención consiste en un soporte para
cultivos celulares, en particular un microsoporte para
biorreactores u órganos artificiales sobre la superficie de los
cuales se implantan células unidas a soportes.
Con el fin de permitir una manipulación
ventajosa de cultivos celulares en reactores biotecnológicos y de
fabricar órganos artificiales con células vivas, el hecho de
implantar cultivos celulares sobre la superficie de un soporte es
conocido. De esta manera, podemos fijar por ejemplo células humanas
u otras células de mamíferos en un lugar fijo con el fin de que
puedan ser colocadas en una solución nutritiva y puedan, si es el
caso, ser retiradas con el soporte sin que exista el problema de
una separación para su recuperación desde la solución. Mientras
que los cultivos para la fabricación de órganos artificiales son
implantados preferentemente sobre una construcción de plástico
biodegradable formada en función del implante que debe ser
instalado, empleamos generalmente en el caso de reactores
biotecnológicos dispersiones sueltas de bolas en suspensión en
soluciones nutritivas. El diámetro de los soportes se sitúa
generalmente en la zona de los milímetros o inferior, aunque se
han de designar con microsoportes. Un gran número de materiales
son usuales en tanto que materiales como el dextran, el
poliestireno, la poliacrilamida, la celulosa, la gelatina o el
chitosan Los materiales precitados tienen el defecto de presentar
una biocompatibilidad insuficiente y no son en consecuencia
utilizables como reimplantación de un órgano en tejidos vivos.
Este procedimiento está propuesto por ejemplo
para el tratamiento de la diabetes, en el cual se aplican
microsoportes con células produciendo insulina en el hígado o en el
páncreas. Además, una limitación importante de las medidas y de las
geometrías de soporte posibles se da para los materiales usuales.
Finalmente, los biorreactores no sirven únicamente para la
producción de ciertas sustancias químicas, sino también muchas
veces para la multiplicación de células. En este caso, es necesario
separar las células de los soportes para la multiplicación y el
cruce. Las enzimas usuales a tal efecto provocan muchas veces
daños a las células antes de ser obtenidas, aunque su uso es
problemático (ver para ello McKéehan, W. L.; The effect of
temperature during tryopsin treatment on viability and
multiplication potencial of single normal human and chicken
fibroblasts. 1977. Cell Biol. Int. Rep. 1;
p.335-343 y Freshney, R. I.; Culture of animal cells
(4th ed.) 2000. John Wiley & Sons, Inc., Publication. P.
160-161).
Es además conocida en el estado de la técnica la
utilización de alginatos para la fijación espacial de células.
Podemos fabricar fácilmente partículas de medidas y formas
diferentes a partir de alginatos. La variación de los parámetros de
proceso, por ejemplo la concentración de alginatos, peso molecular
o proporción de los ácidos de manurón y de gulurón en el producto
de salida, permite en esta ocasión producir materiales teniendo
propiedades diversas, por ejemplo en términos de medida de
partículas o de poros. Una ventaja suplementaria de los alginatos
puros reside en su remarcable biocompatibilidad. Sin embargo los
alginatos no se adaptan a la implantación de células relacionadas a
soportes, por que las células no se fijan a ellos. Ello es por que
la fijación de las células se efectúa a través de encapsulación en
el interior de partículas de alginato, preferentemente en
cavidades bastante grandes.
Ante este antecedente, la invención se da como
tarea el hecho de utilizar un alginato como material de soporte
para los cultivos celulares, sabiendo que alginatos con una
proporción de ácido de manurón de alrededor del 70 por ciento se
revela ventajosa. Con el fin de permitir la implantación de
células sobre la superficie del soporte, esta última está
recubierta de una proteína de adhesión que adhiere por su parte el
alginato.
Nace de esta manera un soporte para los cultivos
celulares caracterizado por una biocompatibilidad elevada conforme
a las propiedades del alginato. Debido a ello se adapta,
principalmente para la reconstrucción de tejido in vivo, pero
mostrando también una buena estabilidad química in vitro.
Se evitan las reacciones de rechazo del implante gracias a la
utilización de células corporales propias. Al contrario de los
materiales pudiendo ser bioabsorbidos, tampoco aparece, después de
la implantación, proceso de rechazo por el cuerpo de productos de
degradación yendo por regla general emparejado con inflamaciones
en el caso del soporte propuesto. Además, el soporte presenta una
estabilidad mecánica elevada debido a que la estructura
tridimensional del alginato está reforzada y sostenida por la
proteína de adhesión. La proteína provoca una adherencia segura de
las células que se implantan en ella, que también están fijadas en
un lugar bien localizado en la superficie del soporte. Finalmente,
células sensibles se retiran, incluso sin enzimas, del material de
soporte, fluidificando la parte de alginato del soporte- como se
explica más precisamente después.
En un desarrollo ulterior de la invención, es
colágeno lo que se utiliza como proteína de adhesión, que forma
una estructura de fibras esencialmente bidimensional. De igual
forma, se asegura una buena adherencia segura de células sobre el
soporte y su estabilidad mecánica elevada está asegurada.
Para una protección mejorada de las proteínas de
adhesión sobre la superficie del alginato contra procesos de
degradación biológica, el soporte puede ser tratado con ayuda de
una solución conteniendo un estabilizador químico. Se utilizan a
tal efecto sustancias que conducen a la puesta en red de las
proteínas de adhesión, especialmente tanino, glutardialdehido o
carbodiimida.
Para la parte de alginato del soporte, se ha
probado alginato de bario. Los iones de bario, que conectan entre
sí las moléculas de alginato, provocan una estabilidad química
elevada del gel de alginato, tanto en condiciones in vivo
como in vitro. La resistencia de los alginatos de calcio
está preferentemente netamente sobrepasada.
Las partículas de alginato muestran variaciones
de medida considerables en la concentración de los iones que lo
rodean, preferentemente del pH. Tales variaciones pueden estar
provocadas por ejemplo por el crecimiento de las células sobre la
superficie del soporte. Con el fin de evitar eventuales variaciones
de tamaño que pueden provocar una separación de la proteína de
adhesión de la superficie del soporte, se propone añadir una
sustancia química tampón al alginato. El agente activo RPMI 1640
está entre otros adaptado para dicho uso.
El alginato rodea preferentemente una o varias
cavidades realizadas de forma análoga a las cápsulas de alginato
conocidas en el estado de la técnica (Dulieu, C., Poncelet D.,
Neufeld R. J.; encapsulación e inmovilización, en : Cell
Encapsulation Technology and therapeutics (Kuhltreiber, W. M.,
Lanza, R. P., Chick W. L.; Eds), pp 3-17. Boston:
Birkhuser). Agentes activos con las cuales el crecimiento de las
células puede estar inflenciado pueden ser introducidos en el
alginato o en las cavidades que se encuentren su interior. Puede
referirse en esta ocasión por ejemplo a sustancias nutritivas, de
factor de crecimiento, hormonas o antibióticos, que favorecen
notablemente el crecimiento de cultivos de células jóvenes, en
especial la concurrencia a capas de cultivo no deseadas. Debido a
la disposición de los agentes activos en la proximidad inmediata de
las células, podemos asegurar, incluso para una pequeña cantidad,
una concentración suficiente, y por consiguiente aparecen ventajas
considerables de coste.
Ciertas células no se abren más que en presencia
de otros tipos de células con las cuales existe relación de
interacción. Por tipos de células diferentes, se ha de entender
tanto de tipos de células diferentes como de células del mismo tipo
en diferentes estados de crecimiento. En general, se tiene
necesidad de productos de metabolismo de un tipo de célula para el
crecimiento o de metabolismo de cada uno de los otros tipos de
célula. A menudo, el producto de tejido de una célula puede ser
considerablemente aumentado por la presencia de otro tipo de
célula. Se propone por esta razón implantar sobre el soporte
diferentes tipos de células completándose unas a las otras. Es
igualmente posible, en lugar de introducir agentes activos,
implantar sobre o en el soporte de las células que producen el
agente activo deseado.
Incluso si múltiples tipos de células son
implantadas sobre un soporte, es deseable normalmente no utilizar
más que una de ellas, mientras que los otros tipos de células no
sirven más que para favorecer o influenciar el metabolismo. Con el
fin de favorecer la obtención del tipo de célula previsto o de su
producto de metabolismo, se propone que diferentes tipos de
células estén presentes sobre la superficie exterior del soporte en
el interior. Preferentemente se encuentra en esta ocasión sobre la
superficie exterior del soporte un monocultivo de las células
primariamente utilizadas. El cambio de tejido entre los tipos de
células puede ser efectuado igualmente a través del alginato debido
a la permeabilidad de este último.
Soportes teniendo una forma esférica pudiendo
ser fácilmente fabricados y presentando una buena estabilidad
mecánica han sido probados particularmente para ser empleados en
birreactores.
Para la fabricación de implantes, el soporte se
fabrica preferentemente al contrario fundiendo una huella del
tejido. Se pueden producir de esta manera implantes
tridimensionales con medidas determinadas previamente, en las que la
superficie exterior corresponde en su estructura a los materiales
naturales. En el interior se encuentran dado el caso diferentes
tipos de células ordenadas en diferentes espacios. Es además
posible integrar el soporte en estructuras espaciales bastante
grandes, como por ejemplo una red espacial. Igualmente, incluso
defectos o pérdidas importantes de órgano de superficie pueden ser
compensadas.
Para la fabricación del soporte propuesto, se
adopta en primer lugar su forma geométrica a partir del alginato.
Se endurece en esta ocasión una solución de alginato añadiendo una
sustancia gelificante, por ejemplo una mezcla de clorato de bario,
ácido sulfónico de propano morfolino y sal de cocina. Para
fabricar soportes en forma esférica, se hace gotear a tal afecto
la solución de alginato en un baño de precipitación con el producto
gelificante disuelto, sabiendo que inyectores vaporizadores
inyectados de aire se prestan a la fabricación de microsoportes de
pequeño diámetro. Alternativamente, es posible proceder a una
gelificación en formas de fundición con el fin de obtener huellas
de tejido. Durante el proceso de fabricación, podemos introducir
también cavidades, células o agentes activos en el interior de la
partícula de alginato de la manera conocida en el estado de la
técnica (así por ej.: Kühtreibr, W. M., Lanza R. P., Chick, W. L.
(1999), Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Boston.
Birkhauser). La separación de las partículas del baño de
precipitación se efectúa de forma ventajosa con ayuda de una
centrifugadora. Luego, las partículas de alginato formadas son
aportadas a una solución diluida de una proteína de adhesión,
preferentemente colágeno. La gelificación de la proteína o del
colágeno se obtiene modificando el pH de la solución. Una gran
parte se separa en esta ocasión sobre la superficie del soporte
mientras que las partes superfluas de proteína helada quedan en el
disolvente y pueden sufrir una fusión. La separación de los
soportes de la solución se efectúa preferentemente empleando una
centrifugadora.
Para mejorar la protección de las proteínas de
adhesión sobre la superficie de alginato contra los procesos de
degradación biológica, los soportes pueden ser luego aportados en
una solución conteniendo un estabilizador químico de proteína,
preferentemente tanino en una concentración de alrededor del 1%.
Después de un tiempo de reacción, que se eleva en el caso de la
solución de tanino a alrededor de 10 minutos, se efectúa la
separación de los soportes con ayuda de una centrifugadora para
este uso.
Finalmente, los soportes se aportan en una
suspensión de diferentes células que tiene que ser aportadas, que
se depositan ellas mismas sobre su superficie. La individualización
de las células puede efectuarse por ejemplo de la manera usual
desde un grupo de células o desde otra superficie de soporte
empleando la enzima tripsina.
Con el fin de evitar modificaciones de medida
durante variaciones de la concentración de iones con el peligro
consiguiente de una separación de la proteína de adhesión, el
soporte contiene a tal afecto una sustancia química tampón, por
ejemplo RPMI 1640. Con el fin de ser inyectado con ayuda de la
sustancia tampón, el nudo compuesto por alginato se deposita
preferentemente en una solución de la sustancia tampón, sabiendo que
los espacios de tiempo útiles van de algunas horas a varios días.
Finalmente se efectúa de la manera prescrita el aporte de la capa
de proteína y de las células sobre el soporte.
Con el fin de obtener las células de la
superficie, podemos introducir el soporte según la invención como
el conocido de Lindi, T., Cultivo de células y de tejido (4º
edición,), 2000; Spktrum Akademischer Verlag, p. 99, en una
solución de enzimas líticas, como la tripsina. De esta manera se
provoca la separación de las células de la superficie. Existe de
forma alternativa la posibilidad de introducirla en una solución
conteniendo agentes de complexación, preferentemente EDTA (ácido
tetracético etilenodiamina). La concentración de EDTA se sitúa
preferentemente a 5 milimol, sabiendo que una solución de sal
exenta de iones de calcio y de magnesio con tampón de fosfato
representa un disolvente adaptado. La solución de EDTA provoca una
disolución del alginato, sabiendo que la temperatura de proceso
útil es de 35 a 40 grados Celsius. La duración adaptada de la
acción va de una a varias decenas de minutos en función de los
parámetros geométricos del soporte. Se obtienen de esta manera
capas de células libres sobre el substrato de proteína de adhesión
que se dejan separar de la solución. Es posible dejar primero la
esfera en crecimiento restante después de la extracción de alginato
de la proteína de adhesión con las células en una solución
nutritiva, sabiendo que el crecimiento de células en el interior
de la envoltura de proteína se acelera debido a la mejora de la
difusión.
Con el fin de separar igualmente la capa de
proteína de adhesión del soporte, se introduce esta última o las
células que están separadas con la capa de proteína que está
separada en una solución de una enzima actuando de forma lítica
sobre la proteína, por ejemplo colagenasa en el caso de colágeno.
En función del fin perseguido, el empleo de la enzima puede ser
efectuado en diversas etapas. Si no se debe producir más que una
completa disolución del soporte, la enzima puede verse añadida a la
solución de EDTA o estar sometida a la acción de la solución
después de que las células hayan sido separadas. Para proteger,
por el contrario, células en el interior del alginato contra
influencias nefastas de la enzima, la disolución de la capa de
proteína se efectúa antes de la colocación del soporte en la
solución de EDTA. Así se evita un contacto inmediato de las células
con el interior del alginato.
Se obtendrán detalles, características y
ventajas suplementarias de la invención en la parte descriptiva
siguiente, en la cual un ejemplo de ejecución se describe con más
detalle. Muestra la sección de un soporte según la invención para
cultivos celulares en una representación conforme a los
principios.
El nudo del soporte está compuesto por alginato
(1) al cual se adjuntan preferentemente un tampón de iones si se
da el caso, agentes activos para apoyar el crecimiento de las
células. Su superficie está recubierta por una capa continua de una
proteína de adhesión (2), por ejemplo colágeno. Sobre la superficie
(3) de la proteína de adhesión (2) adhieren las células (4) que
deben ser multiplicadas o producir los agentes activos deseados.
Por el contrario, las investigaciones han demostrado que ninguna
implantación de células (4) o de grupos de células no se efectúa
sobre una superficie de alginatos libre de proteínas.
Es necesario muchas veces elevar células
diferentes (4, 5) en cocultivo, a sabiendas de que los diferentes
tipos de células están en relación metabólica las unas con las
otras. Si se busca la obtención de un solo tipo de células (4, 5),
se impone una separación espacial. El soporte está previsto en el
interior de cavidades (6), en las cuales son insertadas las
células (5). Podemos así obtener células (4) de tipo puro a partir
de la superficie (3) disolviendo la proteína de adhesión (2) con
ayuda de una proteasa que no actúa sobre el alginato. Después de
que la proteína de adhesión (2) ha sido aplicada de nuevo sobre el
nudo de alginato así como algunas células sobre la superficie (3),
un nuevo ciclo de crecimiento puede tener lugar. El alginato (1)
con las células (3) queda en esta ocasión conservado, aunque la
complejidad y los costes del proceso se reducen
considerablemente.
El resultado es que obtenemos así un soporte
estable y biocompatible para células ligadas a un soporte, que se
presta tanto a la producción de órganos artificiales como al empleo
en reactores biotécnicos y del cual células pueden ser separadas
con ayuda de una proteinasa destinada a disolver la proteína de
adhesión o sin las enzimas por disolución del alginato.
Claims (20)
1. Soporte para cultivos celulares,
preferentemente microsoporte para biorreactores u órganos
artificiales sobre la superficie de los cuales son implantadas
células ligadas a soportes, caracterizados por el hecho de
que
- -
- el soporte está compuesto por un alginato (1),
- -
- La superficie (3) del soporte está recubierta por una capa de proteína de adhesión (2)
- -
- Y las células (4) se encuentran sobre la proteína de adhesión (2).
2. Soporte según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la proteína de adhesión
(2) es colágeno.
3. Soporte según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado por el hecho de que la proteína de adhesión
(2) está estabilizada químicamente.
4. Soporte según la reivindicación 3,
caracterizado por el hecho de que el estabilizador es el
tanino, glutardialdehído o un carbodiimida.
5. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que el alginato
(1) es un alginato de bario.
6. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que el alginato
(1) rodea una substancia química tampón.
7. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que el alginato
(1) contiene una o varias cavidades (6).
8. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que el alginato
(1) o las cavidades (6) contienen células o agentes activos
destinados a apoyar el crecimiento de las células.
9. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que diferentes
tipos de células (4, 5) están implantadas sobre el soporte.
10. Soporte según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que los tipos de células (4,
5) que se encuentran sobre la superficie (3) y en las cavidades (6)
son diferentes.
11. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por una forma esférica.
12. Soporte según una de las reivindicaciones 1
a 10 caracterizado por el hecho de que el soporte presenta
la forma de un tejido biológico.
13. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por el hecho de que el soporte
está integrado en una estructura espacial.
14. Soporte según una de las reivindicaciones
precedentes caracterizado por las etapas de procedimiento
siguientes:
- -
- formación de soportes de alginato (1),
- -
- aporte de los soportes en una solución de proteína de adhesión (2),
- -
- gelificación de la proteína de adhesión (2),
- -
- separación de los soportes de la solución,
- -
- aporte de los soportes en una suspensión de las células que deben ser producidas (4).
15. Soporte según la reivindicación 14,
caracterizado por el hecho de que la proteína de adhesión
(2) es el colágeno.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15 caracterizado por el hecho de que el soporte está
almacenado antes de su aportación en la solución de colágeno en una
substancia química tampón.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 14 a 16 caracterizado por el hecho de que
los soportes se colocan, después de su separación de la solución de
la proteína de adhesión (2) en una solución con una substancia que
estabiliza las proteínas y seguidamente las separa.
18. Procedimiento para la separación de las
células (14) de la superficie (3) de un soporte respecto a una de
las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por las etapas de
procedimiento siguientes:
- -
- aportación del soporte en una solución con un agente de complexación,
- -
- abandono del soporte en la solución del agente de complexación hasta la disolución del alginato (1),
- -
- separación de las células (4, 5) de las células
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado por el hecho de que el agente de complexación
es de EDTA.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19 caracterizado por el hecho de que el soporte o las
células separadas (4, 5) se introducen en una solución de una
enzima disolviendo la proteína de adhesión (2).
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|---|
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