ES2261681T3 - Nuevos derivados del hialuronano. - Google Patents

Abstract

Utilización de los derivados de hialuronano en el que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0, 01% y el 100% y en que los grupos carboxilo se encuentran total o parcialmente esterificados con alcoholes o se encuentran en forma salina, encontrándose su viscosidad intrínseca comprendida entre 0, 1 y 22 dl/g, en la preparación de fases estacionarias cromatográficas.

Description

Nuevos derivados del hialuronano.

Campo de la invención

El objetivo de la presente invención se refiere a los derivados de hialuronano. Dichos nuevos compuestos presentan unas características físico-químicas específicas que hacen que sean adecuados para distintos propósitos. Pueden resultar útiles por ejemplo como, selectores quirales en columnas cromatográficas para la separación de enantiómeros.

Estado de la técnica

El hialuronano, al que de ahora en adelante nos referiremos como HA, es un componente importante de un amplio grupo de biopolímeros naturales que se conocen también como glucosaminoglucanos (GAGs). Dichos polímeros en proporciones distintas con colágenos y glucoproteínas determinan la estructura y la función de la matriz extracelular de los tejidos y órganos animales. Su peso molecular medio se encuentra comprendido entre 1 y 10 millones en la mayoría de tejidos. El hialuronano está compuesto de una unidad de repetición formada por un disacárido, el ácido N-acetilhialobiurónico que consiste en unidades de repetición del ácido D-glucurónico y la 2-acetamido-2-desoxi-D-glucosa (N-acetilglucosamina) unidas mediante un enlace glucosídico \beta(1 \rightarrow 3). Cada unidad de repetición se une con la siguiente mediante un enlace glucosídico \beta(1 \rightarrow 4) que forma un polímero lineal. El número de dichas unidades de repetición en un polímero puede alcanzar varios miles y producir una cadena de varios miles de daltonios. El término "hialuronano" se utiliza habitualmente para describir un grupo general de fracciones moleculares de HA con unos pesos moleculares variables o también fracciones hidrolizadas de dicho compuesto. El HA se encuentra presente en los organismos superiores y puede extraerse a partir de fuentes animales, por ejemplo de crestas de gallo, del cordón umbilical, de fuentes microbianas (tales como por ejemplo algunas bacterias tales como Streptococcus y
Pasteurella).

El HA desempeña un papel importante en diversos procesos biológicos en los que la motilidad celular y las interacciones intercelulares, además de su papel estructural que se deriva de sus propiedades lubrificantes e hidratantes. Debido a dichas propiedades biológicas, siempre se ha centrado la atención en las aplicaciones biomédicas de dicho polímero. Como consecuencia de ello, el HA se ha utilizado mucho en viscosuplementación y en viscocirugía, y en particular en el tratamiento de las artropatías y en la cirugía oftalmológica en la que se ha utilizado el HA sin modificar en forma de gel acuoso.

Se ha encontrado un uso distinto para el hialuronano, que consiste en la cromatografía de afinidad para la separación de proteínas del cartílago. Dichas proteínas se separan de los otros componentes mediante un enlace biológico específico con dicho polímero. Dicho uso se basa en la actividad biológica de dicho polímero, que consiste en la interacción fuerte entre el hialuronano y la proteína. Dicho uso constituye el único uso del hialuronano sin modificar que no forme parte de una aplicación biomédica.

Sin embargo, dicho uso también se encuentra relacionado con las propiedades biológicas del HA debido a que aprovecha la interacción específica del HA con la proteína. Contrariamente, no se conoce nada de la interacción del dicho polímero con sustratos distintos de los biológicos, tales como los sustratos lipófilos y apolares.

Los derivados químicos del HA han sido muy estudiados con el objetivo de mantener la biocompatibilidad de la molécula y de obtener polímeros que se puedan procesar en productos o artículos fabricados tales como sondas, endoprótesis, membranas, esponjas, hilos y dispositivos quirúrgicos para implantes. Las publicaciones describen dos propuestas generales de modificación química del HA:

(a) entrecruzamiento del HA mediante reactivos químicos bifuncionales y (b) la modificación del HA con reactivos monofuncionales. Este último enfoque recurre a la presencia de tres grupos reactivos presentes (los grupos acetamido, carboxilo e hidroxilo) en el HA. El esfuerzo principal se dirigió a las modificaciones químicas de las funciones carboxilo e hidroxilo. Las reacciones de esterificación de los grupos carboxilo del HA se describen en el documento EP 216453 que ilustra la esterificación tanto total como parcial de los grupos carboxilo del HA con haluros orgánicos monofuncionales para la producción de materiales con unas propiedades interesantes y para utilizar en cosméticos, cirugía o medicina. Las reacciones de amidación del HA se describen en el documento US 4.937.270 que se refiere a un procedimiento de preparación de un gel biocompatible insoluble en agua.

En lo que se refiere a los grupos hidroxilo del HA, en las publicaciones se describen diversas reacciones de esterificación. El documento US 5.679.657 describe la sal sódica de HA en la que los grupos hidroxilo 2.6-3.6 de cada unidad de repetición disacárida se convirtieron en grupos acetilo.

Dicho producto es soluble en mezclas de agua y etanol al 90% (p/p) y se analizó en relación con sus propiedades suavizantes. Resultan solubles en mezclas de agua y etanol al 90% (p/p). El éster de las sales de hialuronano con el ácido butírico también se ha descrito en las técnicas actuales (documento WO 98/23648) como agente antiproliferativo.

El documento JP-A-54036388 da a conocer unos materiales polisacáridos que contienen por lo menos un grupo ácido que se vuelve insoluble por el entrecruzamiento, la esterificación o la eterificación de los grupos hidroxilo o por la esterificación de los grupos ácido. Los materiales obtenidos son porosos y se utilizan en la preparación de membrana para ultrafiltración, ósmosis inversa, intercambiadores de iones, transportadores o riñones artificiales.

El documento JP-A-6025306 da a conocer unos derivados del ácido hialurónico en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados con ácidos grasos que presentan por lo menos 12 átomos de carbono y los grupos carboxilo se encuentran en forma salificada o en forma ácida. Los derivados ácidos del ácido hialurónico obtenidos de este modo se utilizan en la preparación de fibras usadas en la sutura de heridas o en lámina finas destinadas a la protección de heridas.

En lo que se refiere a la esterificación total de tanto los grupos carboxilo como hidroxilo del HA, únicamente una referencia bibliográfica (Khan et al., Carbohydrate Research (1998) 306, 137-146) describe la preparación de un derivado completamente acetilado del éster bencílico (éster bencílico del hialuronano acetilado) y no se encuentran más detalles sobre sus propiedades y usos posibles.

El propósito de dichos estudios sobre las modificaciones químicas del HA desarrollados hasta la fecha se ha relacionado con la preparación de nuevos derivados del HA que mantienen las propiedades de biocompatibilidad natural y con la preparación de nuevos biomateriales o nuevos sistemas de liberación de fármacos que resulten útiles en la realización de productos comerciales. Hasta el momento, todos los principales esfuerzos para preparar hialuronano modificado químicamente se han centrado únicamente en aplicaciones médicas; dicho polímero no se ha orientado todavía a aplicaciones no biocompatibles.

Descripción de las figuras

Figura 1: lista de racematos analizados

Descripción de la invención

La invención describe nuevos derivados del hialuronano en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran esterificados total o parcialmente con alcoholes o se encuentran en forma salina.

Los grupos hidroxilo se encuentran esterificados con ácidos alifáticos lineales o ramificados, saturados o insaturados y que presentan hasta 24 átomos de carbono; con ácidos cicloalifáticos o alifático cicloalifáticos, tanto monocíclicos como policíclicos, que presentan hasta 34 átomos de carbono; con ácidos arilalifáticos en los que la cadena alifática presenta de 1 a 4 átomos y el residuo arilo puede sustituirse posiblemente con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, halógenos, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo, grupos amino, grupos metoxi; con ácidos de arilo en los que el residuo de arilo puede sustituirse con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, halógenos, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo, grupos metoxi; con ácidos inorgánicos; con ácidos heterocíclicos aromáticos o no aromáticos, posiblemente condensados con anillos aromáticos o no aromáticos, en los que el grupo heterocíclico presenta de 3 a 20 átomos de carbono y puede sustituirse posiblemente con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, halógenos, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo, grupos amino y grupos metoxi; y con ácidos inorgánicos. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con ácidos alifáticos comprenden: el acetato, el butirato, el propionato, el retinoato y el acetato de n-propilo. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con los ácidos cicloalifáticos o alifáticos cicloalifáticos comprenden: el carboxilato de ciclohexano, el acetilato de ciclohexano y el carboxilato de ciclopropano. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con los ácidos arilalifáticos comprenden: el acetato de fenilo, el acetato de naftilo, el 2-(4-isobutilfenil)propionato, el 2-(6-metoxi-2-naftil)propionato y el cinamato. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con los ácidos arílicos comprenden: el benzoato, el benzoato sustituido tal como: el halobenzoato, el alquilbenzoato, el nitrobenzoato y el 2-acetoxibenzoato. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con los ácidos inorgánicos comprenden: el nitrato. Los ejemplos de ésteres obtenidos mediante la esterificación de los grupos hidroxilo con los ácidos heterocíclicos comprenden: el ácido cincónico, el ácido quínico, la prolina, el ácido nicotínico y el ácido mecónico.

Como alternativa a la esterificación, los grupos hidroxilo pueden presentarse carbamoilados con isocianatos de alquilo, de alquilarilo, de arilo posiblemente sustituidos en los que tanto el residuo alquilo lineal como ramificado, saturado o insaturado, presenta de 2 a 6 átomos de carbono y el residuo arilo consiste en un residuo mononuclear o polinuclear, posiblemente sustituidos con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, grupos halo, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo y grupos metoxi. Los ejemplos de carbamoilatos comprenden: los halofenilcarbamoilatos, los alquifenilcarbamoilatos, los dialquilfenilcarbamoilatos, los dihalofenilcarbamoilatos, los haloalquilfenilcarbamoilatos, los trialquilfenilcarbamoilatos, los metilfenilcarbamoilatos, los ciclohexilcarbamoilatos, los terc-butilcarbamoilatos, los 1-feniletilcarbamoilatos y los bencilcarbamoilatos. En dichos derivados de la invención, todos los grupos hidroxilo, tanto los primarios como los secundarios, se pueden esterificar o carbamoilar del mismo modo, o se pueden esterificar o carbamoilar también los grupos primarios de un modo distinto al de los grupos hidroxilo secundarios.

En los derivados de la invención, los grupos carboxilo del hialuronano se encuentran total o parcialmente esterificados con alcoholes o se encuentran en forma salina. Los alcoholes aptos para la esterificación son los alcoholes alifáticos, arílicos, cicloalifáticos o heterocíclicos. Los alcoholes alifáticos consisten en alcoholes lineales o ramificados que presentan hasta 34 átomos de carbono, pueden encontrarse saturados o insaturados, posiblemente sustituidos con halógenos, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo, grupos amino y grupos metoxi. Los ejemplos comprenden el alcohol metílico, el alcohol etílico y el alcohol propílico.

Los alcoholes que contienen residuos de benceno posiblemente sustituidos con cadenas alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, con halógenos, con grupos hidroxilo y con grupos amino pertenecen a los alcoholes arilalifáticos. Los ejemplos comprenden el alcohol bencílico y el alcohol feniletílico. Los alcoholes cicloalifáticos comprenden también los alcoholes alifáticos-cicloalifáticos, pueden ser tanto monocíclicos como policíclicos y pueden presentar hasta 34 átomos de carbono. Los alcoholes heterocíclicos pueden contener heteroátomos seleccionados de entre el grupo que consiste en O, S y N; pueden ser tanto aromáticos como no aromáticos, encontrarse posiblemente condensados con anillos tanto aromáticos como no aromáticos y posiblemente sustituidos con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, grupos halo, grupos nitro, grupos ciano, grupos hidroxilo, grupos amino y grupos metoxi. Los ejemplos comprenden: el tocoferol y la quercetina.

El grado de sustitución de los grupos hidroxilo se expresa como porcentaje (%) de los grupos hidroxilo esterificados o de los grupos carbamoilados. El grado de sustitución de los derivados de la invención está comprendido entre el 0,01 y el 100%. Los dos intervalos de sustitución preferidos de los grupos hidroxilo son 0,01-0,2% y 7-100%.

Los grupos carboxilo de los derivados de la invención se encuentran esterificados tanto totalmente como parcialmente con alcoholes o se encuentran en forma de sal. El grado de esterificación de los grupos carboxilo se expresa como porcentaje (%) de los grupos carboxilo modificados con alcohol. El grado de esterificación es del 100% cuando todos los grupos carboxilo se encuentran esterificados. Cuando se encuentran parcialmente esterificados, los grupos no esterificados se encuentran salificados con cationes metálicos alcalinos, cationes metálicos alcalinotérreos y cationes que contienen nitrógeno. Los cationes que contienen nitrógeno comprenden aquéllos que contienen nitrógeno orgánico, tales como las sales de tetraalquilamonio, en las que el grupo alquilo presenta de 1 a 5 átomos de carbono. Otros ejemplos comprenden las sales de lutidina, colidina e imidazol.

Cuando los derivados se encuentran parcialmente esterificados, el grado preferido de esterificación es superior al 50%.

Los derivados preferidos del hialuronano de la invención pertenecen a los grupos siguientes:

- primer grupo: derivados del hialuronano en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 0,2% y los grupos carboxilo se encuentran completamente esterificados (100% de grado de esterificación);

- segundo grupo: derivados del hialuronano en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en cantidades comprendidas entre el 70% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran completamente esterificados (100% de grado de esterificación);

- tercer grupo: derivados del hialuronano en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en cantidades comprendidas entre el 70% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran en forma salina.

Los compuestos preferidos que pertenecen, en lo que se refiere a la sustitución y la esterificación, a uno de los grupos anteriores presentan los grupos hidroxilo esterificados con ácidos alifáticos lineales o ramificados, saturados o insaturados; con ácidos arialifáticos; con ácidos arílicos, o presentan los grupos hidroxilo carbamoilados con alquilarilo o arilisocianatos posiblemente sustituidos; dichos compuestos presentan los grupos carboxilo esterificados parcial o totalmente con alcoholes alifáticos, arilalifáticos o arílicos o los grupos carboxilo se encuentran en forma de cationes que contienen nitrógeno. Los derivados preferidos comprenden hialuronano fenilcarbamoilado de tetrabutilamonio, el éster bencílico del hialuronano fenilcarbamoilado, el éster bencílico de benzoato de hialuronano, el éster metílico del hialuronano butirado, el éster metílico del hialuronano fenilcarbamoilado, el éster metílico del fenilacetato de hialuronano, el éster metílico del benzoato de hialuronano, el éster alílico del hialuronano fenilcarbamoilado, el éster bencílico del hialuronano butirado, el éster bencílico del fenilacetato de hialuronano, el éster bencílico del hialuronano 3,5-dimetilfenilcarbamoilado, el éster metílico del 3,5-dimetilfenilacetato de hialuronano.

Otro objetivo adicional de la invención consiste en el procedimiento de preparación de los derivados. Dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) la posible esterificación total o parcial de los grupos carboxilo presentes en el hialuronano;

b) la esterificación o carbamoilación de los grupos hidroxilo presentes en el hialuronano; pudiéndose aplicar las etapas a) y b) en un orden cualquiera.

La etapa a) se realiza mezclando el hialuronano en su forma ácida o salina con un haluro adecuado en presencia de un disolvente orgánico según los procedimientos químicos convencionales. Dicha reacción se realiza preferentemente en N,N-dimetilformamida, a una temperatura comprendida entre 2 y 40ºC durante un período comprendido entre 10 y 60 horas. El material inicial preferido es el hialuronano en forma de sal amónica cuaternaria. Con las variaciones en las condiciones de reacción descritas en la técnica actual, resulta posible obtener compuestos con un grado distinto de esterificación.

La etapa b) puede comprender diversas etapas que permiten la esterificación o la carbamoilación de los grupos hidroxilo. La etapa b) se realiza en un único paso cuando los grupos hidroxilo esterificados o carbamoilados son tanto los grupos hidroxilo primarios como los secundarios. La reacción se realiza añadiendo el reactivo adecuado tanto al producto obtenido de la etapa a) como al hialuronano, tanto en forma ácida como salina, en disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos preferidos comprenden los disolventes apróticos tales como los dialquilsulfóxidos, las dialquilcarboxiamidas, en particular los dialquilsulfóxidos C_{1}-C_{6}, tales como el dimetilsulfóxido, y las dialquilamidas C_{1}-C_{6} de ácidos alifáticos C_{1}-C_{6}, tales como la N,N-dimetilformamida, la dietilformamida, la dimetilacetamida y la dietilacetamida. La carbamoilación se realiza según los procedimientos de reacción convencionales entre un alcohol y un isocianato. Por lo tanto, los grupos hidroxilo del hialuronano, en su forma ácida o salina, o en su forma esterificada, se hacen reaccionar en el disolvente adecuado con el isocianato correspondiente en presencia de una base de Lewis, tal como una amina terciaria, o de un ácido de Lewis como catalizador. La esterificación se realiza haciendo reaccionar el hialuronano en su forma ácida, salina o esterificada en el grupo carboxilo con un disolvente esterificador adecuado según los procedimientos conocidos en la técnica actual. Dichos productos son formas activadas de los ácidos carboxílicos correspondientes, tales como anhídridos y haluros. Resulta preferible utilizar bases tales como aminas terciarias o ácidos de Lewis como catalizadores. También pueden utilizarse diversos disolventes orgánicos.

En algunos casos, pueden utilizarse catalizadores específicos para acelerar la reacción. Con dicha reacción, los grupos hidroxilo que se encuentran carbamoilados o esterificados se encuentran tanto en los grupos hidroxilo primarios como en los secundarios.

La etapa b) se realiza en diversos pasos cuando los grupos hidroxilo primarios se encuentran esterificados de un modo distinto a los secundarios. Un paso implica la modificación selectiva de los grupos hidroxilo primarios tanto de los productos obtenidos en a) como del hialuronano en su forma ácida o salina según el procedimiento descrito en el documento WO 99/18133; mientras que el otro paso implica la esterificación o la carbamoilación de los grupos hidroxilo secundarios según los procedimientos descritos anteriormente.

En los derivados obtenidos con el procedimiento de preparación, los grupos carboxilo libres del polímero sustituido parcialmente posiblemente se pueden salificar según procedimientos conocidos.

Como material inicial, es posible utilizar hialuronano extraído a partir de fuentes diversas, tanto animales como biotecnológicas. El grado de pureza no resulta ser una característica esencial en la preparación de los derivados. En algunas aplicaciones específicas, resulta necesario obtener fracciones de hialuronano con unos pesos moleculares bien definidos.

Cuando ello tiene lugar, puede someterse el hialuronano con un peso molecular elevado a procedimientos químicos, enzimáticos, quimioenzimáticos o físicos para obtener las fracciones con el peso molecular que se pretende.

El polímero que se ha de obtener puede conseguirse directamente de desperdicios de HA (fracciones de peso molecular) producidos para usos biomédicos. Dichos subproductos pueden utilizarse ventajosamente como material inicial para la preparación de los derivados de la presente invención.

Cuando el hialuronano inicial se encuentra en la forma de sal cuaternaria, resulta preferible utilizar la sal de tetraalquilamonio, con grupos alquilo con un número de átomos de carbono entre 1 y 6. En la mayoría de los casos se utiliza el tetrabutilamonio de hialuronano. Resulta posible prepara dichas sales haciendo reaccionar la disolución acuosa de la sal sódica de HA o su forma ácida con una resina sulfónica salificada con una sal amónica cuaternaria. En este caso la sal que se utiliza presenta la salinidad adecuada en los disolventes orgánicos utilizados en la obtención.

La modificación química de los grupos carboxilo y de los grupos hidroxilo del hialuronano para obtener los derivados sustituidos de la invención conduce a una disminución drástica de la hidrofilia de dichos derivados y por lo tanto de su utilización en aplicaciones biocompatibles. Al mismo tiempo, dicha modificación química permite obtener derivados solubles en un gran número de disolventes orgánicos en los que los derivados del HA conocidos en la técnica actual resultan insolubles. De hecho, se ha descubierto que los derivados de la invención presentan propiedades de solubilidad específica en disolventes orgánicos. Dicha solubilidad depende de la naturaleza química de los sustituyentes, del grado de sustitución y del peso molecular. En función del grado de sustitución de los grupos hidroxilo, de los grupos carboxilo y del tipo de sustituyente, puede utilizarse una amplia variedad de disolventes orgánicos para solubilizar los derivados de la invención. De hecho, se pueden solubilizar en disolventes tales como los alcoholes, las cetonas, los ésteres, los éteres, los dialquilsulfóxidos, las dialquilcarboxamidas, los alcoholes, las cetonas alifáticas o heterocíclicas con un punto de ebullición bajo, los hidrocarburos clorados y las mezclas de los mismos. Los compuestos son insolubles en agua, en hidrocarburos alifáticos y en éteres dialquílicos. Las propiedades de solubilidad, la compatibilidad con disolventes específicos o las mezclas de disolventes y la estabilidad en presencia de disolventes específicos o mezclas representan una peculiaridad de los compuestos de la invención que los diferencian de los derivados del HA conocidos en las técnicas actuales y que por consiguiente permite unos usos nuevos y peculiares.

Los derivados del hialuronano de la invención pueden utilizarse ventajosamente en la preparación de fases estacionarias cromatográficas, comprendiendo también fases estacionarias quirales. De hecho, el solicitante ha descubierto sorprendentemente que los derivados de la invención reconocen enantiómeros específicos y que permiten su separación a partir de las mezclas racémicas mediante el procedimiento cromatográfico.

Con el objetivo de preparar fases estacionarias cromatográficas, dichos derivados del hialuronano se utilizan como tales. O pueden utilizarse también tras haberse pulverizado o moldeado en perlas y tras haber sido posible seleccionarlos basándose en sus dimensiones de partículas. Alternativamente pueden empaquetarse en una columna tras haberse depositado en un soporte sólido. Como soporte sólido resultan aptos todos los soportes utilizados en la separación cromatográfica. Pueden estar constituidos de un material orgánico o preferentemente de un material inorgánico. Los ejemplos de soportes inorgánicos aptos comprenden el gel de sílice, alúmina, caolín, óxido de titanio, óxido de magnesio, silicatos y polímeros sintéticos.

En una configuración preferida se utiliza sílice funcionalizada, por ejemplo, se utiliza la \gamma-aminopropil-sílice. Los ejemplos de gel de sílice comprenden el Daisogel SP-1000-7 y el Nucleosil 1000-7.

Para dicho uso, los derivados aptos presentan una viscosidad intrínseca de 0,1 a 22 dl/g. Para los derivados de hialuronano esterificados en el grupo funcional carboxilo, se prefiere un intervalo de viscosidad comprendido entre 0,2 y 4 dl/g.

Los derivados con una viscosidad intrínseca inferior no resultan útiles en la preparación de fases estacionarias quirales ya que no separan eficazmente las mezclas racémicas y debido también a que no presentan unas características de reproducibilidad aptas. Además, algunos de los derivados con una viscosidad muy reducida se hinchan notablemente tras unos pocos ciclos de separación.

Un grupo de derivados interesantes a utilizar en la preparación de fases estacionarias cromatográficas se encuentra compuesto de derivados con un grado de sustitución de los grupos hidroxilo bajo o muy bajo (0,01% a 0,2%) y en los que los grupos carboxilo se encuentran completamente esterificados (100%).

Una ventaja de dichos derivados con un grado de sustitución bajo o muy bajo radica en las propiedades de solubilidad de los disolventes altamente polares. Dichos compuestos, cuando se depositan en un soporte sólido, presentan una eficacia inesperada en la separación de enantiómeros que contienen grupos funcionales polares tales como los grupos amino, hidroxilo o carboxilo. La ventaja sorprendente de dichos derivados consiste en la posibilidad de preparar fases estacionarias que presenten la capacidad de funcionar bajo condiciones de fase inversa, como, por ejemplo, al utilizar mezclas de agua y disolventes orgánicos en cualquier proporción o mezclas de disoluciones amortiguadoras del pH y disolventes orgánicos con unos valores de pH definidos. Otra ventaja más consiste en su utilización versátil. De hecho, pueden utilizarse no únicamente bajo unas condiciones de fase inversa sino también en fase normal con un único disolvente orgánico o con mezclas de disolventes orgánicos, lo que permite que el operario pueda cambiar de un modo de
funcionamiento a otro en función de las necesidades sin disminuir con ello la eficacia de la separación cromatográfica.

Las fases estacionarias cromatográficas que comprenden los derivados del hialuronano de la invención constituyen otro objetivo de la presente invención. Dichas fases se preparan según el procedimiento siguiente. Los derivados de la invención se solubilizan en un disolvente apto y la disolución obtenida se añade a un soporte cromatográfico. Se añade un producto que no sea disolvente a la mezcla con la intención de depositar el derivado sobre un soporte sólido. De este modo se aísla, se lava y se seca el material. El soporte modificado obtenido de este modo se utiliza como fase estacionaria quiral. A partir de esta etapa, resulta claro que la solubilidad en un disolvente adecuado junto con las propiedades quirópticas y enantioselectivas de los derivados del hialuronano resultan ser una condición previa fundamental en la producción de fases estacionarias quirales. Pueden aplicarse otros métodos conocidos por los expertos a los derivados de la invención para obtener fases estacionarias quirales.

Dichas fases estacionarias pueden utilizarse en cromatografía de capa fina, cromatografía líquida, por ejemplo HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), cromatografía de lotes, cromatografía de "lecho móvil simulado" (SMB), cromatografía de fluido supercrítico (SFC). Además, la invención comprende un procedimiento de separación de mezclas enantiómeras mediante dichas fases estacionarias quirales.

La invención comprende además la utilización de dichas fases estacionarias para la separación de diversas mezclas racémicas de interés comercial e industrial. Permiten la separación analítica y preparatoria de los enantiómeros de compuestos estructuralmente distintos que pueden contener también grupos polares así como de aquéllos completamente polares. Además, a partir de una mezcla racémica de isómeros ópticos, resulta posible, mediante la utilización de una de dichas fases estacionarias, obtener la preparación de isómeros ópticamente puros o mezclas de isómeros que presentan un contenido en enantiómeros superior al de la mezcla inicial. Además, las fases permiten la determinación de la composición en enantiómeros de las mezclas obtenidas por ejemplo por síntesis asimétrica.

Los ejemplos específicos de la separación de enantiómeros mediante las fases estacionarias de la invención se describen en la parte experimental. La Figura 1 ilustra las estructuras de los racematos analizados.

Otras utilizaciones de los compuestos de la invención se identifican basándose en sus propiedades de solubilidad específica, su compatibilidad relativa con los disolventes orgánicos y sus propiedades térmicas que los distinguen de los derivados del HA conocidos en la técnica actual. Como consecuencia de ellos, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse además en la preparación de dispositivos, tales como por ejemplo, esponjas, películas y fibras para utilizarse en envoltorios, en materiales compuestos, en materiales de alta tecnología, o pueden utilizarse también como aditivos para materiales plásticos, adhesivos y barnices. Otras aplicaciones interesantes se refieren al campo de la cosmética. Un ejemplo adecuado lo constituye la preparación de laca para el cabello.

Los siguientes ejemplos ilustran el alcance de la invención y no tienen un carácter limitativo.

Ejemplo 1 Preparación del éster bencílico de hialuronano

Se disolvieron 3,5 g de tetrabutilamonio de hialuronano preparados mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 55000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 350 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 30ºC, sometidos a un flujo de nitrógeno y a agitación mecánica. Se añadieron 8,9 mg de yoduro de tetrabutilamonio, 0,8 ml de trietilamina y 3,35 ml de bromuro de bencilo, realizándose la reacción durante 18 horas. Se concentró el producto a baja presión, se precipitó en 50 ml de acetato de etilo; se realizó la redisolución y la reprecipitación del precipitado varias veces, a continuación se secó y se recuperó. El rendimiento resultó del 90%. El grado de esterificación, determinado mediante ^{1}H-NMR (resonancia magnética nuclear protónica) en DMSO (sulfóxido de dimetilo) a 40ºC al comparar las zonas debidas a los protones metilénicos del bencilo (5,0-5,4 ppm) con las zonas debidas a las protones metílicos del residuo N-acetilamida (1,6-1,2 ppm), resultó del 100%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en acetato de etilo y en éter dietílico. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 2 Preparación del éster bencílico de hialuronano

El procedimiento difiere del descrito en el Ejemplo 1 en el hecho de que el hialuronano sódico inicial presenta un peso molecular viscosimétrico de 120000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485). El producto presentó un grado de esterificación del 100% y se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Preparación del éster bencílico de hialuronano

Se disolvió 1 g de tetrabutilamonio de hialuronano preparado mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 50000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 100 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 30ºC, sometidos a un flujo de nitrógeno y a agitación mecánica. Se añadieron 30 mg de yoduro de tetrabutilamonio, 0,22 ml de trietilamina y 0,96 ml de bromuro de bencilo, realizándose la reacción durante 18 horas. Se concentró el producto a una presión reducida, a continuación se precipitó en 50 ml de acetato de etilo y después se realizó la redisolución y la reprecipitación del precipitado varias veces, a continuación se desecó. Se obtuvieron 720 mg del producto. El derivado presentó un grado de esterificación del 100% que se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se analizó la solubilidad en disolventes del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en acetato de etilo y en éter dietílico. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 4 Preparación del éster bencílico de hialuronano.

El procedimiento difiere del descrito en el Ejemplo 3 en el hecho de que el hialuronato sódico inicial presenta un peso molecular viscosimétrico de 18000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485). El producto presentó un grado de esterificación del 100% y se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo 5 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se dispersaron 1,06 g de éster bencílico de hialuronano del Ejemplo 2 en 60 ml en 100 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 100 ml, a una temperatura de 25ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación magnética. Tras 1 hora, se añadieron 2,5 ml de isocianato de fenilo y 15 \mul de dilaurato de dibutilestaño, realizándose la reacción durante 25 horas. A continuación se añadieron ostros 2,0 ml de isocianato de fenilo y 10 \mul de dilaurato de dibutilestaño y se hizo reaccionar la mezcla durante otras 14 horas. Se calentó la mezcla hasta 60ºC y se hizo reaccionar durante otras 4 horas. A continuación se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/5 de su volumen y se precipitó en 200 ml de éter dietílico. Después se filtró el sólido, se lavó y se secó. Se obtuvieron 660 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, tal como se determinó mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (6,2-7,6 ppm) con las zonas debidas a los protones de los polisacáridos y los protones del bencilmetileno (3,0-5,2 ppm), resultó del 100%. La viscosidad intrínseca de producto resultó de 2,06 dl/g en acetona a 20ºC. Se determinó la solubilidad de los derivados en N,N-dimetilformamida, en acetona, en éter dietílico y en hexano. Los derivados son solubles en N,N-dimetilformamida y en acetona.

Ejemplo 6 Preparación del tetrabutilamonio de hialuronano fenilcarbamoilado

Se disolvió 1 g de tetrabutilamonio de hialuronano preparado mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 120000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 50 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Con una jeringuilla se añadieron 480 \mul de 1,8-diazabiciclo[4.5.0]undec-7-eno(1.5-5) (DBU) y 10 minutos más tarde, se añadieron 520 \mul de isocianato de fenilo diluidos en 3 ml de N,N-dimetilformamida mediante un embudo de goteo con un índice de flujo de 1 ml cada 10 minutos. Se repitió la adición dos veces cada 0,5 horas y se realizó la reacción durante 0,75 horas tras la última adición. Se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/3 del volumen y se precipitó en 100 ml de éter. El producto se disolvió en 50 ml de acetona y se precipitó dos veces en 300 ml de éter.

Se filtró el precipitado y a continuación se secó. Se obtuvieron 1,2 g del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, tal como se determinó mediante ^{1}H-NMR en DMSO a 40ºC al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (7,4-6,8 ppm) con los protones aromáticos del grupo metilo del residuo N-acetilamido (1,8-1,6 ppm), resultó del 50%.

Ejemplo 7 Preparación del tetrabutilamonio de hialuronano fenilcarbamoilado

Se disolvieron 4 g de tetrabutilamonio de hialuronano preparados mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 120000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 200 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Con una jeringuilla se añadieron 4,8 ml de DBU, diez minutos más tarde, se añadieron gota a gota 3,5 ml de isocianato de fenilo diluidos en 5 ml de N,N-dimetilformamida, mediante un embudo de goteo, con un índice de flujo de 1 ml cada 10 minutos. Se repitió la adición cada 1,5 horas y a continuación se realizó la reacción durante 1,5 horas. Se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/3 del volumen y se precipitó en 200 ml de éter. El producto se disolvió en 200 ml de acetona y se precipitó dos veces en 1 l de éter. Se filtró el precipitado y a continuación se secó. Se obtuvieron 5 g del producto. El grado de sustitución del producto resultó del 100% y se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 6.

La viscosidad intrínseca del producto fue de 11,5 dl/g en acetona a 20ºC.

Ejemplo 8 Preparación del tetrabutilamonio de hialuronano fenilcarbamoilado

Se disolvieron 2 g de tetrabutilamonio de hialuronano preparados mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 50000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 200 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Con una jeringuilla se añadieron 2,4 ml de DBU, diez minutos más tarde, se añadieron gota a gota 1,64 ml de isocianato de fenilo diluidos en 5 ml de N,N-dimetilformamida, mediante un embudo de goteo, con un índice de flujo de 1 ml cada 10 minutos. Se repitió la adición dos veces cada 1,75 horas y a continuación se realizó la reacción durante 19 horas tras la última adición. Se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/3 del volumen y se precipitó en 100 ml de éter. El producto se disolvió en 50 ml de acetona y se precipitó dos veces en 300 ml de éter. Se filtró el precipitado y a continuación se secó. Se obtuvieron 2,94 g del producto. El producto presentó un grado de sustitución de los grupos hidroxilo del 100% y se determinó tal como se ha descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 9 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se disolvieron 0,750 g de éster bencílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 en 75 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 250 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Con una jeringuilla se añadieron 50 \mul de dilaurato de dibutilestaño y 3,0 de isocianato de feniletílico y se hicieron reaccionar durante 22 horas. Se concentró el producto a una presión reducida de aproximadamente 1/5 del volumen y se precipitó en 200 ml de éter, a continuación se disolvió en 30 ml de acetona y finalmente se precipitó en 200 ml de éter. A continuación se disolvió el precipitado en 30 ml de diclorometano y se precipitó en 200 ml de metanol. Se filtró el precipitado y a continuación se secó. Se obtuvieron 870 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR en DMSO a 40ºC al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (6,2-7,6 ppm) con las zonas de los protones de los polisacáridos y del metileno del grupo bencilo (3,0-5,2 ppm), resultó del 100%. La viscosidad intrínseca del producto fue de 0,59 dl/g en acetona a 20ºC.

Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano, en acetona, en metanol y en éter dietílico. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano y en acetona.

Ejemplo 10 Preparación del éster bencílico de hialuronano butirado

Se disolvieron 0,75 g de éster bencílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 en 75 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 250 ml con un condensador, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, y sometidos a agitación mecánica. Con una jeringuilla se añadieron 0,74 g de dimetilaminopiridina y 1,67 ml de anhídrido butírico, manteniendo la reacción de la mezcla durante 22 horas.

Se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/5 del volumen y se precipitó en 150 ml de éter. Se disolvió en 30 ml de acetona y se precipitó dos veces en 150 ml de éter. A continuación se filtró el precipitado y se secó. Se obtuvieron 960 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR en DMSO a 40ºC al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos del bencilo (7-7,6 ppm) con las zonas debidas al metilo del residuo bencilo (0,8-1 ppm), resultó del 100%. La viscosidad intrínseca del producto fue de 0,65 dl/g en acetona a 20ºC. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano, en acetona, en cloroformo y en tetrahidrofurano. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano, en acetona, en cloroformo y en tetrahidrofurano. Se obtuvieron unas películas mediante la evaporación lenta de las disoluciones (20 mg/0,5 ml) del derivado en diclorometano y las del derivado en cloroformo.

Ejemplo 11 Preparación del éster bencílico de hialuronano acetilado

Se dispersaron 0,5 g de éster bencílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 en 40 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 100 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Dos horas más tarde, se enfrió la mezcla a temperatura ambiente. Con una jeringuilla se añadieron 50 mg de dimetilaminopiridina disueltos en 2 ml de N,N-dimetilformamida y 1,33 ml de anhídrido acético y se hizo reaccionar la mezcla durante 48 horas. Se concentró la disolución a una presión reducida de 1/5 del volumen y se precipitó en 150 ml de éter. Se disolvió en 20 ml de acetona y se precipitó 150 ml de éter; dicho procedimiento se repitió dos veces. A continuación se filtró el precipitado y se secó. Se obtuvieron 520 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR en DMSO a 40ºC al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos del residuo bencilo (7,6-7 ppm) con las zonas debidas a los protones del metilo de los residuos acetilados y de los residuos del N-acetilamido (2,2-1,8 ppm), resultó del 100%.

La viscosidad intrínseca del producto fue de 0,83 dl/g en acetona a 20ºC.

Ejemplo 12 Preparación del éster bencílico de hialuronano acetilado

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 11 pero el éster bencílico del Ejemplo 2 se dispersa en N,N-dimetilformamida a una temperatura de 25ºC. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR tal como se ha descrito en el Ejemplo 11 resulto del 100%. La viscosidad intrínseca del producto fue de 1,70 dl/g en acetona a 20ºC. Tras una evaporación lenta del disolvente, resulta posible preparar películas del derivado solubilizadas en acetona (100 mg/5 ml).

Ejemplo 13 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se dispersaron 0,5 g de éster bencílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 4 en 100 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 80ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Dos horas más tarde, se enfrió la mezcla a una temperatura de 50ºC, con una jeringuilla se añadieron 15 \mul de dilaurato de dibutilestaño disueltos en 2 ml de N,N-dimetilformamida y 1,75 ml de isocianato de fenilo, y se hizo reaccionar la mezcla durante 22 horas. Se concentró la disolución a una presión reducida de aproximadamente 1/5 del volumen y se precipitó en 200 ml de éter. A continuación se disolvió en 20 ml de acetona y se precipitó 200 ml de éter; a continuación se filtró el sólido bajo una presión reducida, se disolvió en 20 ml de diclorometano y se precipitó en 200 ml de metanol. Se volvió a disolver en 20 ml de acetona y se precipitó en 200 ml de éter. El precipitado se filtró y se secó. Se obtuvieron 530 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos del residuo bencilo (7,6-7 ppm) con las zonas debidas a los protones del metilo de los residuos del N-acetilamido (2,2-1,8 ppm), resultó del 100%. La viscosidad intrínseca del producto fue de 0,30 dl/g en acetona a 20ºC. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano, en acetona, en metanol y en éter dietílico. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano y en
acetona.

Ejemplo 14 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilacetilado

Se dispersaron 1,0662 g de éster bencílico de hialuronano tal como se ha descrito en el Ejemplo 2 en 100 ml de N,N-dimetilformamida y 20 ml de piridina en un matraz de tres bocas sometidos a agitación mecánica. La disolución obtenida de este modo se dispuso en un baño de hielo picado y se añadieron gota a gota 5 ml de cloruro de fenilacetilo al mismo. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se sometió a agitación constante durante 15 horas. Se volvió a disponer la disolución en un baño de hielo picado y se añadieron gota a gota otros 5 ml de cloruro de fenilacetilo al mismo. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se sometió a agitación constante durante tres horas.

Se añadieron 350 ml de éter bajo agitación, se recuperó el precipitado por filtración, a continuación se solubilizó en acetona y se precipitó con metanol. Se repitió dos veces la reprecipitación.

El producto se solubilizó con 50 ml de cloruro de metileno, se precipitó en 150 ml de metanol y se solubilizó en 200 ml de acetato, se precipitó en 400 ml de agua, se lavó y finalmente se secó. Se obtuvieron 0,7 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, tal como se determinó mediante ^{1}H-NMR en CDC13 resultó del 100%. La viscosidad intrínseca del producto en acetona a 20ºC fue de 2,28 dl/g.

Ejemplo 15 Preparación del éster bencílico de hialuronano 3,5-dimetilfenilcarbamoilado

Se dispersó 1 g de éster bencílico de hialuronano preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 en 200 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 500 ml, a una temperatura de 50ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación mecánica. Una hora más tarde, con una jeringuilla se añadieron 15 \mul de dilaurato de dibutilestaño disueltos en 2 ml de N,N-dimetilformamida y 4,5 ml de isocianato de fenilo, y se hizo reaccionar la mezcla durante 22 horas. Se concentró la disolución a una presión reducida y se precipitó en 200 ml de éter. Se disolvió en 20 ml de acetona y se precipitó 200 ml de metanol. A continuación se filtró el precipitado y se secó. Se obtuvieron 0,9 g del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, determinado mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (6,2-7,6 ppm) con las zonas debidas a los protones del polisacárido y del bencilmetileno (3,0-5,2 ppm), resultó del 100%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en diclorometano, en acetona y en éter dietílico. El derivado es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo. La viscosidad intrínseca del producto fue de 0,6 dl/g en acetona: DMF (9:1) a 20ºC.

Ejemplo 16 Preparación del éster bencílico de hialuronano acetilado

Se dispersó 1 g de éster bencílico de hialuronano preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 2 en 100 ml de N-metilpirrolidona en un matraz de tres bocas de 250 ml, a una temperatura de 80ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación magnética. Cuando se completó la solubilización, se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se añadieron 4 ml de anhídrido acético y 100 mg de dimetilaminopiridina, haciéndose reaccionar la mezcla durante 48 horas a temperatura ambiente. A continuación se concentró la disolución a una presión reducida de 1/3 de su volumen y se precipitó en agua ácida. Después se recuperó el producto por filtración y se disolvió en acetona; a continuación, se reprecipitó en agua ácida, se filtró y se secó al horno de vacío a 50ºC. Se obtuvieron 980 mg del producto. El producto presentó un grado de sustitución del 100% de los grupos hidroxilo, determinado tal como se ha descrito en el ejemplo 11. La viscosidad intrínseca del producto en acetona a 20ºC fue de 0,64 dl/g.

Ejemplo 17 Preparación del éster metílico de hialuronano

Se disolvieron 500 mg de tetrabutilamonio de hialuronano preparados mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 52000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 100 ml de N,N-dimetilformamida anhidra a una temperatura de 50ºC, sometidos a agitación magnética en un matraz de 250 ml con un condensador. Se enfrió a la temperatura ambiente y a continuación se vertió en un reactor de 1 litro. Se descendió la temperatura a 4ºC y se añadieron 1,5 ml de yoduro de metilo; a continuación se hizo reaccionar la mezcla durante 48 horas bajo agitación mecánica. Se concentró la disolución a baja presión de aproximadamente 1/3 de su volumen y se precipitó en 200 ml de éter dietílico. Se lavó el producto dos veces en acetona, se filtró y se secó. Se obtuvieron 310 g del producto. Se caracterizó el derivado mediante ^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR. Se observó un desplazamiento significativo con respecto al polímero inicial, principalmente de la señal debida al carboxilo del ácido glucurónico (de 167 a 171 ppm) y las dos señales interglucosídicas (de 81 a 83 ppm), produciendo el metilo una nueva señal a 53 ppm. Se determinó la solubilidad del derivado en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico y en acetona. El derivado es soluble en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 18 Preparación del éster metílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se dispersaron 250 mg de éster metílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 17 en 100 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 250 ml, a una temperatura de 80ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación magnética. Dos horas más tarde, se descendió la temperatura a 50ºC y se añadió 1 ml de isocianato de fenilo y 15 \mul de dilaurato de dibutilestaño; se hizo reaccionar la mezcla durante 22 horas. A continuación se concentró la disolución a una presión reducida de 1/5 de su volumen y se precipitó en 200 ml de éter dietílico. Se filtró el sólido, se lavó y se secó. Se obtuvieron 220 mg del producto. El grado de sustitución se determinó mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (6,8-7,8 ppm), las debidas al grupo N-acetilamido (1,6-2,0 ppm) y las señales debidas al del polisacárido y al grupo metilo (2,8-5,0 ppm), resultó del 35%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico y en acetona. El producto es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 19 Preparación del éster bencílico de hialuronano benzoilado

Se vertieron 964 mg de anhídrido benzoico en un matraz de tres bocas de 50 ml con un condensador a una temperatura de 50ºC y bajo un flujo de nitrógeno. Se prepararon 100 mg de éster bencílico de hialuronano preparados tal como se ha descrito en el Ejemplo 4 en 15 ml de N,N-dimetilformamida y 32 \mul de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno(1.5-5) (DBU) y se hizo reaccionar durante 22 horas. A continuación se concentró la disolución a una presión reducida de 1/3 de su volumen y se precipitó en éter. Se filtró el sólido y se dispersó en 100 ml de acetona que se eliminó a continuación bajo presión reducida. Se lavó de nuevo el producto en cloroformo, se filtró y se secó. Se obtuvieron 52 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo se determinó mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debidas a los protones aromáticos (7,0-7,6 ppm), con los debidos al metileno del bencilo (5,0-5,2 ppm) y con la señal del grupo N-acetilamido (1,6-2,0 ppm), resultó del 100%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico, en acetona y en cloroformo. El producto es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 20 Preparación del éster bencílico de hialuronano

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 3 pero el peso molecular viscosimétrico del hialuronato sódico inicial es de 9000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485). El producto presenta un grado de esterificación del 100% y se determinó tal como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 21 Preparación del éster alílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se disolvieron 150 mg de tetrabutilamonio de hialuronano preparados mediante intercambio catiónico a partir de hialuronato sódico con un peso molecular viscosimétrico de 52000 (determinación según el Biochimica et Biophysica Acta, 1960, 42, 476-485) en 15 ml de N,N-dimetilformamida anhidra en un matraz de tres bocas de 50 ml a una temperatura de 30ºC, bajo un flujo de nitrógeno y sometidos a agitación magnética. Cuando se hubo completado la solubilización del polímero, se añadieron 200 \mul bromuro de alilo, 40 \mul de trietilamina y una cantidad catalítica de yoduro de tetrabutilamonio. Se hizo reaccionar la mezcla durante 26 horas. A continuación se calentó hasta 50ºC, se añadieron 170 \mul de isocianato de fenilo y 10 \mul de dilaurato de dibutilestaño, haciéndose reaccionar la mezcla durante 21 horas. A continuación se concentró la disolución a baja presión de aproximadamente 1/3 de su volumen y se precipitó en éter dietílico. Después se filtró el sólido, se lavó dos veces en acetona y se secó. Se obtuvieron 50 mg del producto. Se caracterizó el derivado mediante NMR (^{1}H , 2D COSY, ^{1}H DOSY, ^{13}C). A partir de la comparación de las áreas debidas a las señales del grupo alílico conjugado con el hialuronano (CH-O a 3,90 ppm - CH= a 5,90 ppm, =CH_{2} de 5,22 a 5,35 ppm) con los debidos a los protones aromáticos de los grupos fenilcarbamato (de 6,8 a 7,6 ppm) y con la señal del grupo N-acetilamido (1,6-2,0 ppm), el grado de esterificación resultó del 50% y el grado de sustitución de los grupos hidroxilo del 100%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico y en acetona. El producto es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 22 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se dispersaron 200 mg de éster bencílico de hialuronano preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 en 50 ml de N,N-dimetilformamida en un matraz de tres bocas de 100 ml, a una temperatura de 80ºC, bajo un flujo de nitrógeno, con un condensador y sometidos a agitación magnética. Una hora más tarde, se enfrió a 50ºC, se añadieron 15 \mul de isocianato de fenilo y 50 \mul de dilaurato de dibutilestaño, haciéndose reaccionar la mezcla durante 22 horas. A continuación se concentró la disolución a una presión reducida de 1/5 de su volumen y se precipitó en 200 ml de éter dietílico. Después se filtró el sólido, se lavó y se secó. Se obtuvieron 130 mg del producto. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo, tal como se determinó mediante ^{1}H-NMR al comparar las zonas debido a los protones aromáticos (6,8-7,6 ppm) con la zona debida al bencilmetileno (5,0-5,2 ppm) y con la señal del grupo N-acetilamido (1,6-2,0 ppm) resultó del 2%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico y en acetona. El producto es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 23 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 22 pero utilizando 5 \mul de isocianato de fenilo. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo determinado tal como se ha descrito en el ejemplo 22 resultó del 0,2%. Se determinó la solubilidad del derivado en N,N-dimetilformamida, en sulfóxido de dimetilo, en éter dietílico y en acetona. El producto es soluble en N,N-dimetilformamida y en sulfóxido de dimetilo.

Ejemplo 24 Preparación del éster bencílico de hialuronano fenilcarbamoilado

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 9 pero utilizando éster bencílico de hialuronano preparado tal como se describe en el Ejemplo 20. El grado de sustitución de los grupos hidroxilo determinado tal como se ha descrito en el ejemplo 9 resultó del 100%. La viscosidad intrínseca del producto en acetona al 20ºC es de 0,09 dl/g.

Ejemplo 25 Determinación de la temperatura de transición vítrea

Se utilizó un calorímetro de exploración diferencial (DSC) de Perkin Elmer mod. Pyris 1 calibrado previamente según el estándar. Se colocaron apropiadamente de 5 a 10 mg del producto de la invención en una célula de aluminio y se mantuvieron a 55ºC durante 30 minutos directamente en el calorímetro antes de cada determinación. Para los productos descritos en el Ejemplo 10 y el Ejemplo 11 se han seguido los siguientes ciclos térmicos: primero se calentó de 55ºC a 200ºC con un índice de exploración de 10ºC/min, posteriormente se enfrió a 200ºC/min y se realizó un segundo calentamiento de 55ºC a 200ºC a 10ºC/min. Ambos productos presentaron una transición vítrea que se produce a la temperatura (punto de inflexión) de 130 a 132ºC para el producto del Ejemplo 10 y a la temperatura de 163 a 166ºC para el producto del Ejemplo 11. Para el producto del Ejemplo 15 se siguieron los siguientes ciclos térmicos: primero se calentó de 55ºC a 185ºC a un índice de exploración de 10ºC/min, se enfrió a 10ºC/min, en segundo lugar se calentó de 55ºC a 185ºC a 10ºC/min, se enfrió a 200ºC/min, y en tercer lugar se realizó un nuevo calentamiento de 55ºC a 185ºC a 10ºC/min. El producto presentó una transición vítrea a la temperatura (punto de inflexión) de 177 a 179ºC.

Ejemplo 26 Procedimiento general de preparación de fases estacionarias quirales HY con derivados de la invención

Se solubilizó el derivado de la invención en un disolvente adecuado agitando enérgicamente la disolución. A continuación se filtró la disolución y se añadió a una suspensión de gel de sílice previamente aminopropilsilanizado. Después se mantuvo el sistema sometido a agitación durante dos horas y pudo someterse a tratamiento con ultrasonidos durante 30 minutos. Se añadió un producto no disolvente y se dispuso la muestra en el sílice. Se recuperó el precipitado y a continuación se secó. Tras eliminar las partículas no deseadas y el disolvente, se secó el residuo y se obtuvo la fase estacionaria quiral.

Ejemplo 27 Procedimiento general aplicado en la separación de mezclas racémicas utilizando columnas de HPLC que contienen la fases estacionarias quirales de la invención

Se utilizó una bomba Knauer WellChrom Maxi-Star K-1000 (Knauer GmbH, Berlín, Alemania) con un inyector de HPLC Knauer con una válvula de 6 puertos y un bucle de 20 \mul. Se realizó la determinación a 254 nm con un detector Knauer WellChrom K-2500. La integración de los picos de los cromatograma se realizó con el paquete de software BDS (Barspec Ltd., Rehovot, Israel). El empaquetamiento de la columna de HPLC, adquirida en Max Stevenson (Berlín, Alemania, 150 x 4.6 mm) se realizó mediante la técnica "sluny" utilizando una bomba Knauer para HPLC. Los disolventes analíticos puros de J. T. Baker utilizados para HPLC, se redestilaron antes de usarlos. El volumen muerto de la columna se determinó con 1,3,5-tri-terc-butilbenceno. Las estructuras de los racematos analizados se ilustran en la Figura 1.

Ejemplo 28 Separación de las mezclas racémicas con HY-7, HY-8, HY-11

Se llenaron las columnas cromatográficas con las fases estacionarias HY-7, HY-8 y HY-11 obtenidas respectivamente a partir de los derivados descritos en los Ejemplos 5, 9 y 13. La fase móvil utilizada para la separación de los racematos analizados es n-hexano : 2-propanol (proporción de 9:1) con un índice de flujo de 1,0 ml/min. Los cromatogramas obtenidos permiten la determinación del factor de separación (\alpha) y el factor de resolución (Rs) ilustrados en la Tabla 1.

TABLA 1

Racemato	HY-7	HY-8	HY-11
	\alpha	Rs	\alpha	Rs	\alpha	Rs
2	1	0	1,53	2,87	1,15	0,62
9	1,53	0,26	2,40	7,43	1	0
10	1	0	1,09	0,37	1	0
11	1	0	1,17	0,77	1	0
12	1	0	2,21	8,25	1	0
16	1,44	0,67	1,98	1,36	1,28	0,89

La Tabla ilustra la capacidad del reconocimiento enantiómero de los derivados analizados y la mayor capacidad del derivado HY-8.

Los mismos racematos se analizaron utilizando una columna cromatográfica llena con HY-14 obtenido a partir del derivado del Ejemplo 24 y bajo las mismas condiciones experimentales. En el presente caso no se separó racemato alguno y la presión en la columna, que es baja en el inicio, tiende a incrementarse lentamente pero con un ritmo constante durante los análisis, indicando claramente de este modo que, bajo dichas condiciones, el derivado se hincha.

Ejemplo 29 Separación de mezclas racémicas con HY-10

Se analizó el racemato 12 mediante HPLC con una columna de 150 mm x 4,6 mm de diámetro interior que contenía la fase estacionaria quiral del derivado de hialuronano preparados tal como se describió en el Ejemplo 11 bajo las condiciones siguientes: fase móvil de hexano : isopropanol en una proporción de 9:1, índice de flujo de 1 ml/min. La separación cromatográfica de los dos enantiómeros se caracterizó mediante los siguientes parámetros: k'1 = 4,80, \alpha = 1,32, Rs = 1,36 que demuestran la resolución "de referencia" del racemato. Tras dicha separación, se utilizó de nuevo la columna bajo las condiciones siguientes: fase móvil de hexano: diclorometano: metanol en una proporción de 68:30:2, índice de flujo 1 ml/min durante 5 horas; fase móvil de hexano: acetato de etilo en una proporción de 70:30, índice de flujo 1 ml/min durante 5 horas; fase móvil de diclorometano: acetato de etilo en una proporción de 1:1, índice de flujo 1 ml/min durante dos horas. Tras dicho tratamiento, se analizó de nuevo el racemato 12 bajo las condiciones iniciales y se obtuvo la resolución de referencia. Queda claro por lo tanto que el selector quiral no fue eliminado debido a los cambios y al tipo de fase móvil utilizada.

Ejemplo 30 Comparación de la separación de mezclas racémicas con columnas comerciales

Se analizó el racemato metil-3-hidroxi-5-oxo-1-ciclopenteno-1-heptanoato mediante HPLC con una columna de 250 mm x 4,6 mm de diámetro interior que contenía la fase estacionaria quiral del derivado de hialuronano preparados tal como se describió en el Ejemplo 16 bajo las condiciones siguientes: fase móvil de hexano: isopropanol en una proporción de 9:1, índice de flujo de 1 ml/min. El mismo racemato se analizó mediante HPLC con dos distintas columnas comerciales denominadas Chiralcel OD y Chiralcel OJ, ambas de 250 mm x 4,6 mm de diámetro interior, bajo las mismas condiciones. Los resultados se describen en la Tabla 2.

TABLA 2

Fase estacionaria	\alpha	Rs
HY-12	1,21	1,2
Chiralcel OD	1,07	0,7
Chiralcel OJ	1,16	1,1

La tabla demuestra que la fase estacionaria que contiene el derivado de la invención permite una mejor separación del racemato.

Ejemplo 31 Separación de mezclas racémicas con HY-5 utilizando un disolvente puro como fase móvil

Se empaquetó la columna cromatográfica de HPLC con HY-5 obtenido con el derivado del Ejemplo 8 y se separaron varias mezclas racémicas. La fase móvil utilizada fue el n-hexano, con un índice de flujo de 1,0 ml/min. Los cromatogramas obtenidos permiten la determinación del factor de separación (\alpha) y del factor de resolución (Rs) ilustrados en la tabla 3.

TABLA 3

Racemato	HY-5	HY-5
	\alpha	Rs
1	2,11	0,27
2	1,06	0,12
3	1,16	0,10
5	1,56	0,31

A partir de la tabla anterior resulta posible comprender la capacidad de reconocimiento de enantiómeros al utiliza un disolvente puro como fase móvil.

Ejemplo 32 Separación de mezclas racémicas (clenbuterol, prometazina) con HY-13 bajo fase inversa

Se llenó la columna cromatográfica de HPLC con la fase estacionaria obtenida a partir del derivado del Ejemplo 23 y se separaron dos mezclas racémicas. La fase móvil utilizada fue el metanol : agua (proporción de 1:1), con un índice de flujo de 1 ml/min. Se resolvieron los dos enantiómeros de cada mezcla y los cromatogramas presentaron dos picos simétricos separados con el factor de separación (\alpha) y el factor de resolución (Rs) que se ilustran en la tabla 4.

TABLA 4

Racemato HY-13
	\alpha	Rs
Clenbuterol	1,47	3,22
Prometazina	1,35	1,87

A partir de la tabla anterior resulta posible comprender la capacidad de reconocimiento de enantiómeros al utiliza un disolvente puro como fase móvil.

Claims (24)

1. Utilización de los derivados de hialuronano en el que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 100% y en que los grupos carboxilo se encuentran total o parcialmente esterificados con alcoholes o se encuentran en forma salina, encontrándose su viscosidad intrínseca comprendida entre 0,1 y 22 dl/g, en la preparación de fases estacionarias cromatográficas.

2. Utilización de los derivados según la reivindicación 1, en la preparación de fases estacionarias quirales.

3. Fases estacionarias quirales que comprenden derivados del hialuronano, en las que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 100%, los grupos carboxilo se encuentran total o parcialmente esterificados con alcoholes o se encuentran en forma salina; y la viscosidad intrínseca de dichos derivados está comprendida entre 0,1 y 22 dl/g.

4. Fases estacionarias quirales según la reivindicación 3, en las que los grupos hidroxilo de los derivados de hialuronano se encuentran esterificados con ácidos inorgánicos; con ácidos alifáticos lineales o ramificados, saturados o insaturados; con ácidos cicloalifáticos o alifático cicloalifáticos que pueden ser policíclicos; con ácidos arilalifáticos; con ácidos de arilo; con ácidos heterocíclicos pudiéndose encontrar dichos ácidos sustituidos por alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, por halógenos, por grupos hidroxilo, por grupos amino, por grupos nitro, por grupos metoxi o por grupos ciano.

5. Fases estacionarias quirales según la reivindicación 4, en las que los grupos hidroxilo de los derivados de hialuronano se encuentran carbamoilados con isocianatos de alquilo,; con isocianatos de alquil arilo, con isocianatos de arilo; en las que dichos isocianatos son posiblemente sustituidos con alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, halógenos, grupos nitro, grupos ciano o grupos metoxi, en las que el residuo alquilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, presenta de 2 a 6 átomos de carbono y en las que el residuo arilo consiste en un residuo mononuclear o polinuclear, posiblemente sustituido.

6. Fases estacionarias quirales según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en las que los grupos carboxílicos de los derivados del hialuronano se encuentran esterificados con alcoholes alifáticos, arilalifáticos, arílicos, cicloalifáticos o heterocíclicos.

7. Fases estacionarias quirales según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en las que los grupos hidroxilo de los derivados del hialuronano se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 0,2% o en unas cantidades comprendidas entre el 70% y el 100%.

8. Fases estacionarias quirales según la reivindicación 7, en las que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 0,2% y los grupos carboxilo se encuentran totalmente esterificados (un grado de esterificación del 100%).

9. Fases estacionarias quirales según la reivindicación 7, en las que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 70% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran totalmente esterificados (un grado de esterificación del 100%) o se encuentran en forma salina.

10. Utilización de las fases estacionarias según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en la preparación de isómeros ópticamente puros o de mezclas de isómeros que presentan un contenido enantiomérico superior al de la mezcla racémica inicial.

11. Utilización de las fases estacionarias según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en la separación preparatoria o analítica de enantiómeros o mezclas de racematos.

12. Utilización de las fases estacionarias según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11 en cromatografía líquida, en HPLC, en SMB, o en SCFC.

13. Derivados de hialuronano, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran total o parcialmente esterificados con alcoholes o se encuentran en forma salina, con la excepción del éster bencílico de hialuronano acetilado, siempre que los grupos carboxilo se encuentren total o parcialmente esterificados con alcoholes.

14. Derivados de hialuronano según la reivindicación 13, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados con ácidos inorgánicos; con ácidos alifáticos lineales o ramificados, saturados o insaturados; con ácidos cicloalifáticos monocíclicos o policíclicos o alifático cicloalifáticos; con ácidos arilalifáticos; con ácidos de arilo; con ácidos heterocíclicos; pudiéndose encontrar dichos ácidos sustituidos por alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, por halógenos, por grupos hidroxilo, por grupos amino, por grupos nitro, por grupos metoxi y por grupos ciano.

15. Derivados según la reivindicación 14, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados con ácido acético, ácido butírico, ácido retinoico, ácido benzoico, ácido fenilacético.

16. Derivados según la reivindicación 13, en los que los grupos hidroxilo se encuentran carbamoilados con isocianatos de alquilo; con isocianatos de alquilarilo; con isocianatos de arilo; encontrándose dichos isocianatos posiblemente sustituidos; en los que el residuo alquilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, presenta de 2 a 6 átomos de carbono y en los que el residuo arilo consiste en un residuo mononuclear o polinuclear, posiblemente sustituido por alquilos C_{1}-C_{5} lineales o ramificados, por halógenos, por grupos nitro, por grupos ciano o por grupos metoxi.

17. Derivados según la reivindicación 16, en los que los grupos hidroxilo se encuentran carbamoilados con isocianato de fenilo, isocianato de dialquilfenilo, isocianato de trialquilfenilo, o isocianato de 1-feniletilo.

18. Derivados según cualquiera las reivindicaciones 13 a 18, en los que los grupos carboxilo se encuentran esterificados con alcoholes alifáticos, arilalifáticos, arílicos, cicloalifáticos o heterocíclicos.

19. Derivados según la reivindicación 18, en los que los grupos carboxilo se encuentran esterificados con alcohol metílico, alcohol bencílico, alcohol alílico o alcohol propílico.

20. Derivados según cualquiera las reivindicaciones 17 a 19, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 0,2% o en unas cantidades comprendidas entre el 70% y el 100%.

21. Derivados según la reivindicación 20, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 0,01% y el 0,2% y los grupos carboxilo se encuentran totalmente esterificados (un grado de esterificación del 100%).

22. Derivados según la reivindicación 20, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 70% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran totalmente esterificados (un grado de esterificación del 100%).

23. Derivados según la reivindicación 20, en los que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados o carbamoilados en unas cantidades comprendidas entre el 70% y el 100% y los grupos carboxilo se encuentran en forma salina.

24. Procedimiento de preparación de los derivados de hialuronano según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, que comprenden las siguientes etapas de reacción:

a) la posible esterificación total o parcial de los grupos carboxilo presentes en el hialuronano;

b) la esterificación o carbamoilación de los grupos hidroxilo presentes en el hialuronano;

pudiéndose aplicar las etapas a) y b) en un orden cualquiera.