ES2261054B1

ES2261054B1 - Procedimiento para obtener un extracto de pulpo, el producto obtenido y su aplicacion como suplemento para el cultivo y criopreservacion de tejido y de celulas en suspension de invertebrados marinos.

Info

Publication number: ES2261054B1
Application number: ES200403171A
Authority: ES
Inventors: Francisco Garcia Camacho; El Hassan Belarbi; Tarik Chileh; Emilio Molina Grima; Asterio Sanchez Miron; M. Del Carmen Ceron Garcia; Antonio Contreras Gomez
Original assignee: Universidad de Almeria
Current assignee: Universidad de Almeria
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2004-12-31
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2024-12-31
Also published as: ES2261054A1

Abstract

Extracto de pulpo como suplemento para el cultivo y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos. La presente invención se refiere a un procedimiento para obtención de un suplemento para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos a base de extracto acuoso de pulpo homogeneizado y la utilización de dicho suplemento preparación de medios para la criopreservación de células en suspensión y de tejidos de organismos invertebrados marinos.

Description

Procedimiento para obtener un extracto de pulpo, el producto obtenido y su aplicación como suplemento para el cultivo y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para obtención de un extracto acuoso de pulpo homogeneizado y la utilización de dicho extracto acuoso de pulpo homogeneizado como suplemento del medio para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos, preferentemente esponjas marinas.

Estado de la técnica

En los últimos 20 años, la Química de Productos Naturales ha experimentado un notable crecimiento. Entre los invertebrados marinos, las esponjas son el filo más prolífico de nuevos compuestos bioactivos con interés farmacológico, especialmente anticancerígenos y antivirales [Belarbi, E. H., Contreras Gómez, A., Chisti, Y, García Camacho, F. Y Molina Grima, E. (2003). Producing drugs from marine sponges. Biotechnology Advances 21: 585-598; Donia, M y Hamman, M (2003) Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents. Lancet Infect Dis 3: 338-48.; Mayer, A. M. S. Y Gustafson, K R. (2003). Marine Pharmacology in 2000: antitumor and cytotoxic compounds. Int. J. Cancer. :291-299.; Jha, R. K Y Zi-rong, Xu (2004) Biochemical compounds from marine organisms. Mar. DrugsK 2: 123-146.; Thakur, N.L. y Müller, W.E.G. (2004) Biotechnological potential of marine sponges. Current Science. 86(11): 1506-1512].

Desafortunadamente, el desarrollo de nuevos fármacos a partir de estas moléculas está ralentizado, e incluso estancado, debido a la escasez de biomasa o a las lógicas restricciones medioambientales en relación con la explotación de sus hábitats naturales [Osinga R, Tramper J, Wijiffels RH. Cultivation of marine sponges. Marine Biotechnology 1999;1:509-32].

Actualmente se están haciendo numerosos intentos dentro del campo de la síntesis química, sin embargo, debido a la complejidad de las moléculas, resultan inviables económicamente. Por esta razón, es evidente que se necesitan rutas alternativas para producir masivamente estos compuestos. Una de ellas, objetivamente factible, es el cultivo in vitro de células y tejido de esponja (fragmentos o explantes).

Sin embargo, el conocimiento de los requerimientos nutricionales de las esponjas marinas para llevar a cabo el cultivo in vitro es escaso y muy poco preciso. Los alimentos comerciales (bacterias o fitoplancton, suplementos nutricionales desconocidos, etc.) solo consiguen, en el mejor de los casos, mantener viables a los especímenes en acuarios durante cortos periodos de tiempo.

También, se han realizado múltiples intentos utilizando medios de cultivo comerciales dedicados al cultivo de células animales, especialmente células de insecto y de mamífero. Entre ellos se encuentran medios tan conocidos como el de Eagle, DMEM, RPMI, M199, L-15, etc., utilizados ampliamente en el cultivo in vitro de tejido y células de invertebrados marinos [Mothersill, C. y Austin, B. (2000). Aquatic Invertebrate cell culture. Ed. Springer-Praxis Books in Aquatic and Fisheries, Chichester, UK].

En general, es muy difícil definir todos los requerimientos nutricionales de las células y/o tejido animal, especialmente el de los invertebrados marinos. Por esta razón, se utilizan adicionalmente sueros y promotores del crecimiento de origen animal, procedentes de mamíferos terrestres, en conjunción con los medios comerciales para soportar y promover el crecimiento celular.

Sin embargo, la extrapolación de experimentos realizados con células y tejido de organismos terrestres a células y tejido de invertebrado marino no han tenido éxito alguno. Entre las causas del fracaso está la utilización de promotores del crecimiento provenientes de sueros de animales terrestres. Por ejemplo, la utilización de factores de crecimiento epitelial, ácido retinoico, extracto de embrión de pollo, entre otros, en el cultivo de células de los invertebrados del subfilo Urochordata [Rinkevich, B., Frank, U, Gateño, D., and Rabinowitz, C. (1994) The establishment of various cell Zines from colonial marine invertebrates. In: Müller, W. E. G. (eds), Use of Aquatic Invertebrates as Tools for Monitoring of Enviromental Hazards, pp. 253-263. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany; Rinkevich, B., Shlemberg, Z. and L. Fishelson (1995) Whole body protochordate regeneration from totipotent blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7695-7699; Rinkevich, B. (1999) Cell cultures from marine invertebrates: obstacles, new approaches and recent improvements. Journal of Biotechnology 90:133-153], que lógicamente no guardan paralelismo alguno con los animales de origen marino. Una alternativa a estos suplementos de origen terrestre es la utilización de extractos y/o sueros isoalogénicos o alogénicos provenientes de animales marinos, ya que podrían contener nutrientes necesarios para el crecimiento de invertebrados marinos. Sin embargo, tales extractos son difíciles de estandarizar y tienen composiciones aún desconocidas. Se han hecho algunos intentos en el cultivo de explantes y células de crustáceos. Por ejemplo, (i) extracto de músculo y plasma sanguíneo del bogavante (Homarus gammarus) para el cultivo de tejido de ovario de Penaeus monodom; extracto de gamba para el cultivo de tejido y células procedentes de Paneus stylirostris. El tiempo máximo de cultivo fue de 4 semanas [Mothersill y Austin, 2000].

Con esta filosofía, se ha patentado recientemente la utilización de sueros procedentes de gastrópodos marinos [US6054317. System for the cell culture and cryopreservation of marine invertebrates], en los que se piensa existen lípidos adicionales, metales traza, factores de crecimiento y nutrientes específicos para la promover la proliferación celular de invertebrados marinos, entre lo que se encuentran las esponjas marinas. Los resultados aportados parecen ser interesantes pero la producción a gran escala de estos sueros a partir de gastrópodos sería totalmente hipotética dadas las dificultades de la extracción y preparación de los sueros, así como, la producción a gran escala de estos gastrópodos.

La preservación de células y tejidos de invertebrados marinos para su posterior utilización en procedimientos de cultivo in vitro manteniendo niveles aceptables de viabilidad podría tener importantes repercusiones económicas y medioambientales ya que se reducirían, e incluso se eliminarían, las recolecciones de especies en su hábitat natural. La utilización de dimetil sulfóxido (DMSO) en conjunción con sueros parece mejorar ostensiblemente la preservación de células y tejido de invertebrados marinos.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para el crecimiento in vitro y criopreservación de tejido y suspensiones celulares precedentes de invertebrados marinos.

Por un lado, el procedimiento de cultivo comprende la utilización de un extracto acuoso procedente del pulpo (especie Octopus vulgaris, filo arthopoda, subfilo crustacea), suministrado al medio de cultivo base en un amplio rango de concentraciones. Al tratarse de un filo próximo al de otros invertebrados marinos como al de las esponjas marinas (porifera), el extracto puede proporcionar nutrientes, promotores del crecimiento y factores de adhesión específicos muy similares a los existentes en la biomasa de esponjas y otros fila próximos. Como mínimo, el extracto puede proporcionar algunos de los siguientes grupos de metabolitos:

(i): Aminoácidos: Recientemente, Rosa et al. [Rosa, R., Costa, P.R. y Numes, M.L. (2004) Effect of sexual maduration on the tissue biochemical composition of Octopus vulgaris and O. defilippi (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology 145: 563-574] publicaron un exhaustivo análisis sobre la composición aminoacídica del Octopus vulgaris. También, la prestigiosa base de datos americana "USDA Nacional Nutrient Database for standard Reference, Realase 17" (2004) publica en su página WEB un análisis nutricional detallado del Octopus vulgaris, en el que detectaron y cuantificaron la presencia en cantidades variables de los siguientes aminoácidos: treonina, metionina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, glicina, alanina, cistina, prolina, serina y triptofano. Los mayoritarios son leucina, lisina y arginina, ácido glutámico, ácido aspártico y alanina.

(ii): Lípidos y ácidos grasos: El perfil de ácidos grasos de la biomasa de Octopus vulgaris también está cuantificado con precisión en la literatura científica [Rosa, R., Costa, P.R. y Numes, M.L. (2004) Effect of sexual maduration on the tissue biochemical composition of Octopus vulgaris and O. defilippi (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology 145: 563-574. Navarro, J. C. Y Villanueva, R. (2003) The fatty acid composition of Octopus vulgaris paralarvae reared with live and inert food: deviation from their natural fatty acid profile. Aquaculture 219: 613-631; USDA Nacional Nutrient Database for Standard Reference, Realase 17, 2004]. Los ácidos grasos mayoritarios de la biomasa son el C16:00, C18:00, C18:1, C20:1, araquidónico (20:4n6; ARA), eicosapentaenoico (C20:5n3) y docosahexaenoico (C20:5n3). El colesterol también se encuentra en cantidades significativas.

(iii): Vitaminas: Dentro de este grupo se han detectado en la biomasa de Octopus vulgaris Vitamina C (ácido ascórbico total), tiamina, riboflavina, niacina, ácido pantoténico, vitamina B6, ácido fólico, vitamina B 12, vitamina A, retinol, vitamina E y vitamina K [USDA Nacional Nutrient Database for Standard Reference, Realase 17, 2004].

(iv): Oligoelementos: Entre otros destacan el hierro, zinc, cobre y selenio [USDA Nacional Nutrient Database for standard Reference, Realase 17, 2004].

(v): Hormonas y factores de crecimiento: D'Aniello et al (1996) [D 'Aniello A., Cosmo, A.D., Cristo, C. D., Assini, L., Botte, V. Y Fiore, M.D. (1996) Ocurrence of sex steroid hormones and their binding proteins in Octopus vulgaris Lam. Biochemical and Biophysical Research communications 227: 782-788] detectaron y cuantificaron la existencia en Octopus vulgaris de hormonas tales como progesterona, tetosterona y 17\beta-estradiol (y sus correspondientes proteínas de enlace).

(vi): Moléculas de adhesión celular: Las diferentes familias de moléculas de adhesión encontradas en invertebrados (Ej. colágenos y lamininas), responsables de la formación de la matriz extracelular, tienen un elevado índice de especificidad. De hecho, la ausencia de esta especificidad en otros suplementos justifica el elevado índice de fracaso en experimentos de adhesión celular (superficie-célula, célula-célula) [Fernández-Busquets, X Y Burger, MM (1999) Cell adhesión and histocompatibility in sponges. Microsc. Res. Techa 44: 204-218]. Esto es más notorio cuando los invertebrados marinos utilizados son esponjas marina Dado que el pulpo (filo artrópodo) y las esponjas marinas (porifera) pertenecen a filos muy próximos, es de prever que moléculas de adhesión del Octopus vulgaris puedan ser reconocidas por las células de esponjas marinas. Recientemente, en una publicación [Mizuta, S., Tanaka, T. Y Yoshinka, R. (2003) Comparison of collagen types of arm and mantle muscles of the common octopus (Octopus vulgaris). Food Chemistry 81: 527-532] extrajeron del pulpo diferentes tipos de colágeno.

La cantidad en el extracto de pulpo de cada uno de los metabolitos citados anteriormente dependerá de la solubilidad en agua de éstos en las diferentes formas químicas que se puedan presentar.

La presente invención comprende un extracto acuoso preparado a partir de pulpo homogeneizado como suplemento en el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos, preferentemente de esponjas marinas que presenta las siguientes ventajas:

-: Es un extracto fácil de obtener, ya que se trata de un extracto acuoso sencillo, a diferencia de los extractos procedentes de sueros sanguíneos de invertebrados marinos, que pueden considerarse más complejos de obtener.

-: Este extracto presenta la posibilidad de ser utilizado a gran escala sin dañar el medio ambiente, ya que procede de la especie Octopus cultivable en cautividad en piscifactorías.

La diferencia fundamental que presenta la presente invención respecto de la solicitud de patente US6054317 es que en ésta última, se suplementa el medio de cultivo base con un suero (o plasma) procedente de arterias de gastrópodos mediante un costoso procedimiento, en la presente invención, la suplementación del cultivo base se realiza con extracto acuoso de pulpo, mucho más fácil de obtener.

El medio de cultivo base sobre el que se adiciona el extracto puede ser cualquier medio base para el cultivo de células animales, en general, suplementado con sales marinas comerciales o sales inorgánicas para confeccionar agua de mar artificial, hasta alcanzar osmolalidades próximas a 1000 mosmol.

Otro aspecto importante de la invención consiste en utilizar medio base de cultivo en conjunción con DMSO (dimetil sulfóxido) y extracto acuoso de pulpo homogeneizado en diferentes proporciones para criopreservar células y tejido de esponja marina. La capacidad para almacenar muestras biológicas de campo y muestras procedentes de cultivo es otra aportación de esta invención, ya que la recolección masiva de esponjas marinas es totalmente prohibitiva por el irreversible impacto ambiental que ocasionaría. Las esponjas no tienen sistema circulatorio, pero sí un extraordinario sistema acuífero. Esta característica estructural del tejido facilita la llegada de DSMO a las células más internas del tejido, manteniendo su estructura.

En este sentido, muestras de tejido y suspensiones celulares de esponja marina se sumergieron en el medio base enriquecido según Tabla 1 y 2, y suplementado con hasta un 20% v/v de extracto acuoso de pulpo y un 10% v/v de DSMO. Seguidamente se congelaron a -20ºC y -150ºC. El DSMO protege a las células de la formación de cristales de hielo durante la etapa de congelación, y el medio base enriquecido con el extracto acuoso de pulpo protege a las membranas celulares durante la descongelación.

Al igual que con los sueros comerciales, las subfracciones del extracto acuoso, y los componentes que las constituyen, podrían obtenerse por métodos bien establecidos, tales como cromatografia, filtración, diálisis o extracción con solventes, entre otros. En el caso de los sueros comerciales, tales subfracciones y sus componentes han resultado ser beneficiosas en el crecimiento de multitud de líneas celulares y tejido animal.

TABLA 1

Compuesto	Concentración (g/L)
NaCl	19.430
KCl	0.340
MgSO_{4}.7H_{2}O	6.981
MgCl_{2}.6H_{2}O	5.070
CaCl_{2}	1.100
NaH_{2}PO_{4}.7H_{2}O	0.712
NaBr	0.016
Na_{2}F_{6}Si	2.28 10^{-3}

TABLA 2

Aminoácido	Concentración (g/L)
L-asparagina	1.322
Ácido L-aspártico	1.330
Ácido L-glutámico	1.470
Glucina	0.750
L-prolina	1.150
L-serina	1.050
Taurina	0.122
Ácido ascórbico	0.500

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Ensayos de realización

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan aquí sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica.

Ensayo 1

Preparación del extracto acuoso de pulpo homogeneizado

La preparación del extracto acuoso de pulpo homogeneizado consiste en trocear pulpo y homogeneizar a Tª ambiente (22 \pm 6ºC), utilizando una cortadora convencional, con una relación en peso equivalente de pulpo y agua de mar.

La mezcla obtenida posteriormente se centrífuga y el sobrenadante se somete a un proceso de filtración en gradiente hasta 0.22 \mum.

Finalmente el producto obtenido tras la filtración se conserva congelado a -150ºC hasta su utilización como suplemento del medio basal.

El porcentaje de pulpo homogeneizado está definido en un intervalo entre el 15% y el 20% del total de la mezcla.

Ensayo 2

Crecimiento in vitro de tejido

En los siguientes ensayos se ha utilizado como suplemento del medio basal, enriquecido según Tablas 1 y 2, un extracto acuoso preparado a partir de pulpo homogeneizado.

Estos ensayos se han centrado en el crecimiento in vitro de explantes de dos especies de esponjas marinas Axinella damicornis y Crambe crambe. Las esponjas del género Axinella contienen una familia de compuestos llamada halicondrinas altamente citotóxicos [Pettit G. R., Schimitdt J. M, Cerny R. L., Hooper J. N A. y Rützler K (1991) Isolation and structure of the cell growth inhibitory constituents from the Western Pacific marine sponge Axinella sp. Journal of Medical Chemistry 34: 3339-3340]. La esponja Crambe crambe es importante porque sintetiza biomoléculas pertenecientes a una familia de compuestos llamados crambescidinas con elevada citotoxicidad y exhiben propiedades antivíricas, entres otras [Rinehart, K. L. y Jares-Erijman, E. A. (1999) Antiviral and cytotoxic compounds from the the sponge Crambe crambe. Patente USA 5,952,332].

Especímenes de las esponjas marinas Crambe crambe y Axinella damicornis fueron cortados en trozos pequeños con volúmenes comprendidos aproximadamente entre 0.025 cm^{3} y 0.075 cm^{3}. Seguidamente fueron mantenidos en agua de mar con hipoclorito sódico al 1% durante un tiempo no superior a 5 minutos. A continuación, se mantuvieron durante un periodo no superior a 5 días en agua de mar con un cóctel de antibióticos: gentamicina (\approx0.5 mg/ml), nistatina (\approx1.25 \mug/ml) y penicilina (\approx0.5 mg/ml). La temperatura en todo momento no superó los 20ºC.

Finalmente los trozos de tejido de esponjas eran situados en diferentes formulaciones del medio de cultivo. Se han hecho experimentos utilizando los siguientes elementos:

a): Agua de mar suplementada con extracto de pulpo homogeneizado en el rango desde 5% a 20% v/v.

b): Agua de mar sin extracto de pulpo.

c): Medio basal RPMI 1640 enriquecido con sales inorgánicas constitutivas del agua de mar, aminoácidos y suplementado con extracto de pulpo en el rango desde 5% a 20% v/v. En la Tabla 1 se detallan las concentraciones finales de las sales inorgánicas adicionadas al medio base de cultivo (RPMI 1640 comercial); los valores pueden oscilar en un \pm 10%. En la Tabla 2 se detallan las concentraciones finales de los aminoácidos suplementados al medio base comercial RPMI 1640.

d): Medio base RPMI 1640 enriquecido con sales inorgánicas constitutivas del agua de mar y aminoácidos según Tablas 1 y 2.

e): Medio base RPMI 1640 enriquecido con sales inorgánicas constitutivas del agua de mar.

Los ensayos se han realizado a la temperatura media del hábitat donde fueron recolectadas, 17 \pm 3ºC. Los experimentos se realizaron en incubador bajo atmósfera de CO_{2} del 4 \pm 0.5% y pH 7.0 \pm 0.2.

En las figuras 1 y 2 se han representado algunos de los resultados más ilustrativos de la evolución del crecimiento en volumen de diferentes trozos de tejido de la esponja Crambe crambe en diferentes formulaciones del medio de cultivo. Como se puede apreciar en las figuras el símbolo \medcirc representa el blanco o solo agua de mar, el símbolo \blacksquare representa el medio base RPMI 1640 enriquecido sin extracto, el símbolo \boxempty representa el medio base RPMI 1640 enriquecido con un 20% de extracto de pulpo y el símbolo \blacktriangle representa medio RPMI 1640 enriquecido con un 10% de extracto de pulpo.

Los resultados obtenidos revelan que la utilización del extracto de pulpo homogeneizado en el medio base enriquecido favorece notablemente el crecimiento de los explantes de esponjas marinas en relación con los experimentos llevados a cabo sin extracto acuoso de pulpo. Además la viabilidad de los explantes fue claramente más longeva utilizando extracto acuoso de pulpo.

Las Figuras 1 y 2 muestran la evolución del crecimiento de trozos de tejido de la esponja Crambe crambe cultivada en diferentes formulaciones del medio base RPMI 1640 según la descripción de la invención y en agua de mar. En la Figura 1 se observa la evolución del volumen absoluto y en la Figura 2 se observa la evolución del volumen relativo (referido al volumen inicial del explante).

Ensayo 3

Criopreservación de tejido y de células en suspensión

Especímenes de la esponja marina Axinella damicornis fueron cortados en trozos pequeños con volúmenes comprendidos aproximadamente entre 0.025 cm^{3} y 0.100 cm^{3}. Seguidamente fueron mantenidos en agua de mar con hipoclorito sódico al 1% durante un tiempo no superior a 5 minutos. A continuación, se mantuvieron durante un periodo no superior a 1 hora en agua de mar con un cóctel de antibióticos: gentamicina (\approx0.5 mg/ml), nistatina (\approx1.25 \mug/ml) y penicilina (\approx0.5 mg/ml). La temperatura en todo momento no superó los 20ºC. A continuación, los trozos de tejido de esponja fueron sumergidos en diferentes disoluciones: (i) agua de mar, (ii) medio basal suplementado con sales y aminoácidos según tablas 1 y 2, (iii) medio basal suplementado con sales y aminoácidos según tablas 1 y 2 y con extracto acuoso de pulpo en el rango del 5 al 20% y (iv) medio basal suplementado con sales y aminoácidos según tablas 1 y 2 con extracto acuoso de pulpo en el rango del 5 al 20% v/v y DSMO al 10% v/v aproximadamente. Los explantes fueron congelados a -20ºC y -150ºC con una velocidad de congelación comprendida entre 1ºC/min y 3ºC/min. Antes de la criopreservación, trozos de tejido fueron disgregados en agua de mar artificial libre de Ca^{++} y Mg^{++}. Las células en suspensión fueron recuperadas por centrifugación y su viabilidad fue cuantificada mediante citometría de flujo según protocolo publicado recientemente [García Camacho, F., Belarbi, E.H., Cerón García, M C., Sánchez Mirón, A., Chile, T., Chisti, Y, Molina Grima, E. (2004). Shear effects on suspended marine sponge cells. Biochem. Eng. J. (Aceptado)]. Transcurridas varias semanas, los tejidos preservados con extracto acuoso de pulpo y DSMO presentaban claramente el mayor índice de viabilidad. Y la temperatura de -150ºC preservó durante más tiempo los explantes.

Por otro lado, especímenes de la esponja marina Axinella damicornis fueron cortados en trozos pequeños con volúmenes comprendidos aproximadamente entre 0.025 cm^{3} y 0.100 cm^{3}. Seguidamente fueron mantenidos en agua de mar con hipoclorito sódico en el rango del 1% al 10% v/v durante un tiempo no superior a 10 minutos. A continuación, se mantuvieron durante un periodo no superior a 1 hora en agua de mar con un cóctel de antibióticos: gentamicina (\approx0.5 mg/ml), anfotericina B (\approx1.25 \mug/ml) y penicilina (\approx0.5 mg/ml). Los trozos de tejido fueron colocados en tubos cónicos de centrífuga de 50 cm^{3} junto con agua de mar artificial libre de Ca^{++} y Mg^{++} y con agente protector Pluronic F68 en una proporción dentro del rango 0.01% a 0.5% en peso. La mezcla se mantuvo en agitación en un agitador orbital operado a una velocidad inferior a 100 rpm durante un periodo no superior a 7 horas y a la temperatura de 18 \pm 2ºC. Las células fueron recuperadas por centrigugación y resuspendidas en las mismas disoluciones que las utilizadas en los ensayos de criopreservación de tejido. Del mismo modo, fueron congeladas y criopreservadas. Igualmente, transcurridas varias semanas, las células preservadas con extracto acuoso de pulpo y DSMO presentaban claramente el mayor índice de viabilidad. Y la temperatura de -150ºC consiguió preservar mejor las suspensiones celulares.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, ésta se refiere procedimiento para obtención de un extracto para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos que comprende las siguientes etapas:

a): Troceado de pulpo;

b): homogeneización del pulpo con agua de mar a Tª ambiente;

c): centrifugación de la mezcla;

d): esterilización del sobrenadante o extracto acuoso por filtración en gradiente hasta un tamaño de poro de 0.22 \mum;

e): congelación del extracto acuoso filtrado.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, ésta se refiere a un extracto para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos que contiene una cantidad de pulpo homogeneizado entre 15-20% en volumen.

De acuerdo con otro aspecto importante de la invención, ésta se refiere a un extracto para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos que tiene un valor de carbón orgánico disuelto comprendido entre 0.3 y 0.5% en peso.

De acuerdo con otro aspecto importante de la invención, ésta se refiere al uso del extracto como suplemento para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos donde los invertebrados marinos son de forma preferida esponjas marinas y se utiliza preferentemente en una cantidad entre 5-20% en volumen.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del un extracto en la preparación de medios para la criopreservación de células en suspensión y de tejidos de organismos invertebrados marinos.

Según un último aspecto, la presente invención se refiere al uso del un extracto en la preparación de medios de cultivo de células en suspensión y de tejidos de organismos invertebrados marinos.

Claims

1. Procedimiento para obtención de un extracto de pulpo para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): troceado de pulpo;

b): homogeneización del pulpo con agua de mar a Tª ambiente;

c): centrifugación de la mezcla;

e): congelación del extracto acuoso filtrado.

2. Extracto de pulpo para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos obtenido por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado porque comprende una cantidad de pulpo entre 15-20% en volumen.

3. Extracto de pulpo para el cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos obtenido por el procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor de carbón orgánico disuelto comprendido entre 0.3 y 0.5% en peso.

4. Uso del extracto de pulpo de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, como suplemento para cultivo in vitro y criopreservación de tejido y de células en suspensión de invertebrados marinos preferentemente esponjas marinas.

5. Uso del extracto de pulpo según reivindicación 4 en una cantidad entre 5-20% en volumen.

6. Uso del extracto de pulpo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 para la preparación de medios para la criopreservación de células en suspensión y de tejidos de organismos invertebrados marinos.

7. Uso del extracto de pulpo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 para la preparación de medios de cultivo de células en suspensión y de tejidos de organismos invertebrados marinos.