ES2259608T3 - Procedimiento para la produccion de material de celulas neuronales. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de material de células neuronales apto para trasplantación, que comprende los siguientes pasos de procedimiento: - obtención de células progenitoras humanas a partir de material de células neuronales fetales o adultas; - expansión de las células progenitoras humanas obtenidas, bajo contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera; - diferenciación parcial in vitro por tratamiento de las células progenitoras con LIF, GDNG y/o una o varias de las interleuquinas IL 1- 11 bajo un contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera: - selección por subclonación bajo un contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera; y - expansión del material de células.

Description

Procedimiento para la producción de material de células neuronales.

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de material de células neuronales.

Para el tratamiento de determinadas enfermedades del sistema nervioso se sigue el concepto de aplicar a estas enfermedades un tratamiento terapéutico mediante la trasplantación de cultivos de células adecuados. Esta terapia se basa en el hecho reconocido que determinadas enfermedades deben asociarse a trastornos funcionales o a la muerte de determinados tipos de células nerviosas. Así, existe la posibilidad de tratar terapéuticamente la Enfermedad de Parkinson mediante la trasplantación de neuronas dopaminérgicas, la Enfermedad de Alzheimer mediante la trasplantación de neuronas colinérgicas, la Corea de Huntington mediante la trasplantación de neuronas estriadas, así como el MSA (Multiple Systemic Atrophy, Atrofia Múltiple Sistémica) mediante la trasplantación de neuronas del cuerpo estriado y dopaminérgicas.

En la actualidad, para este enfoque terapéutico existe el problema de que los materiales trasplantables correspondientes no se encuentran a disposición en amplitud suficiente, ya que por lo general se obtienen a partir de tejidos fetales.

Otro problema consiste en las posibles reacciones de rechazo, ya que en el material trasplantable se encuentran presentes diversos tipos de células que pueden desencadenar un rechazo de los tejidos, como inmunorespuesta. Por ello, por lo general es necesaria una inmunosupresión mediante medicamentos adecuados, que sin embargo pueden tener efectos secundarios indeseados.

Además de ello, existe el problema de que las células preparadas de la manera conocida hasta ahora deben trasplantarse ya al cabo de pocos días, con lo cual se restringen las posibilidades de una investigación infectológica, por ejemplo, en lo que a los virus de SIDA o de hepatitis se refiere.

La invención se basa sobre la misión de poner a disposición material de células neuronales, que sea adecuado para trasplantación o que pueda obtenerse a partir de material trasplantable, y que no presente las desventajas mencionadas arriba. Además, la invención se basa en la misión de poner a disposición un procedimiento para la producción de un material de células de este tipo o de un material trasplantable de este tipo.

La misión se resuelve gracias a las características de las reivindicaciones independientes. Pueden derivarse perfeccionamientos ventajosos a partir de las reivindicaciones subordinadas.

La invención se basa en el concepto de mantener células progenitoras en cultivo y multiplicarlas. Esta multiplicación puede controlarse mediante la acción de determinadas sustancias activas, en especial proteínas, de manera que estas células progenitoras, después de la trasplantación o, en términos generales, después de una puesta en contacto con un substrato adecuado, como por ejemplo, material de células o un material de soporte, se diferencien solamente en un tipo de células determinado (neuronas dopaminérgicas), o lo hacen de manera predominante. Mediante este tratamiento es posible obtener cultivos de células que consisten de manera prácticamente exclusiva en los precursores directos de las células neuronales deseadas, y que en especial contienen aún células gliales inmunocompetentes solamente en proporciones que ya no tienen ningún efecto fisiológico, y que en especial ya no son detectables. Con ello es posible producir en una amplitud prácticamente ilimitada materiales trasplantables adecuados y mejor definidos en cuanto a los tipos de células disponibles.

Así, es posible obtener material de células que contiene de manera prácticamente exclusiva neuronas dopaminérgicas; es decir, la proporción de las neuronas mencionadas en el material de células representa más del 90%, preferiblemente más del 95%, o no contiene ninguna proporción fisiológicamente eficaz de otras células, en especial de células gliales.

Las células progenitoras, mediante cuya multiplicación y selección se obtienen cultivos de células o material de células aptas para trasplantación, pueden obtenerse de material de células neuronales (cerebro o médula espinal), tanto fetales como también adultas. El material celular adulto se prepara hasta ahora ventajosamente a partir de cortes periventriculares o del hipocampo.

El lugar de la toma de las células fetales puede regirse según el tejido diana, es decir, las células progenitoras se toman de las áreas en las que las neuronas deseadas se presentan más tarde, por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas del tejido del mesoencéfalo. Sin embargo, en el caso de una adecuada diferenciación parcial mediante el procedimiento conforme a la invención, es posible obtener también diversas células progenitoras a partir de tejido de un mismo lugar de toma, por ejemplo también a partir de células madre de la sangre de tejido de cordón umbilical.

El aislamiento y cultivo de células progenitoras neuronales a partir de cerebro de roedor se ha descrito muchas veces (Daadi und Weiss, J. Neurosci 1999; Magrassi et al., Development 1998; 54 107 - 110; Ptak et al., Cell Trasplant 1995; 4: 299 - 310; Liepelt et al., Brain Res Dev Brain Res 1990; 51. 267- 270). Los autores pudieron preparar células progenitoras a partir de diversas áreas del cerebro. Además, se prepararon células progenitoras humanas a partir de tejido cortical fetal (o de la totalidad del cerebro) (Buc-Caron, Neurobiol Dis 1995; 2: 37 - 47; Svandsen CN et al., Exp Neurol 1997; 148: 135-146; Sah et al., Nat Biotechnol 1997; 15-574-580; Chalmers-Redman et al., Neuroscience 1997; 76: 1121 - 1128). En cuanto al tipo y modo de preparación de las células progenitoras, se remite a los documentos mencionados arriba, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad, a título de referencia.

Conforme a la invención, la preparación del material de células neuronales aptos para trasplantación tiene lugar mediante un procedimiento que abarca una expansión de las células progenitoras humanas, obtenidas en forma indirecta o directa, una diferenciación parcial in vitro, y una selección, pudiendo en especial los cultivos neuronales obtenidos en última instancia, diferenciarse con un elevado porcentaje en el tipo de célula deseado, eventualmente sin adición de otros factores ni de manipulaciones genéticas permanentes.

Después de la diferenciación parcial o de la selección de las células progenitoras puede eventualmente tener lugar una expansión renovada del material de células.

La diferenciación parcial y la selección pueden repetirse varias veces, pudiendo en cada caso diferenciarse el tipo y modo de la ejecución.

En conjunto, gracias a la invención es posible seleccionar y diferenciar células progenitoras neuronales semi-inmaduras, en un grado tal que después de la adición de medios nutrientes, o después de la trasplantación, se diferencie, de manera exclusiva o predominante, un tipo de célula específico.

La expansión puede tener lugar en especial bajo utilización simultánea de los procesos de la hipoxia, cebado (priming), eventualmente bajo un contenido reducido de oxigeno en la atmósfera, manipulación genética transitoria o no transitoria, y/o tratamiento con factores exógenos, en especial bajo un contenido reducido de oxigeno en la atmósfera. Los pasos de procedimiento se describen en forma detallada más adelante.

La selección tiene lugar por subclonación bajo hipoxia.

En especial, el procedimiento puede llevarse a cabo de manera tal que después de la expansión de las células progenitoras recién obtenidas se lleve a cabo una expansión selectiva del tipo de célula deseado. La expansión selectiva puede tener lugar mediante modificación del contenido de oxigeno, la aplicación de mitógenos adecuados o una diferenciación parcial (cebado) mediante factores exógenos, como se desee, opcionalmente en cada caso bajo un contenido reducido de oxígeno en la atmósfera. La selección de los progenitores "determinados" tiene lugar por subclonación, bajo un contenido reducido de oxígeno en la atmósfera. A la subclonación le sigue una expansión renovada y eventualmente una diferenciación parcial renovada mediante uno de los métodos indicados arriba (hipoxia, cebado, o tratamiento con factores exógenos), en especial mediante tratamiento con factores exógenos o mediante cebado, opcionalmente en cada caso bajo un contenido reducido de oxígeno en la atmósfera. La primera o segunda diferenciación parcial también puede tener lugar mediante un manipuleo genético, transitorio o no, o apoyado mediante dicho manipuleo. Como complemento de una reducción del contenido de oxígeno, es también posible llevar a cabo los pasos de procedimiento bajo condiciones que simulen cambios que son inducidos por este contenido modificado de oxígeno (por ejemplo, con inhibidores de la respiración mitocondrial, tal como rotenon, MPP+ o malonato).

La expansión después de los tratamientos individuales debería preferentemente partir en cada caso desde una célula individual.

El éxito de la selección de estas células progenitoras determinadas, es decir, la caracterización de las poblaciones de neuronas obtenidas, tiene lugar después de una diferenciación completa (in vitro o in vivo), ventajosamente con métodos citométricos, bioquímicos, de biología molecular, inmunohistoquímicos y electrofisiológicos. Para las diversas poblaciones de neuronas, éstos métodos han de derivarse de la bibliografía especializada.

Expansión bajo condiciones hipóxicas

Se ha comprobado que es posible lograr una considerable mejora de la velocidad de división mediante una reducción del oxígeno en el aire y/o mediante un aumento del contenido de nitrógeno, con lo cual aumenta al mismo tiempo la proporción de células progenitoras neuronales especiales, en particular de las neuronas dopaminérgicas, es decir, que tiene lugar una diferenciación. Por ejemplo, en este caso puede mencionarse, por ejemplo, una disminución de la presión de oxígeno de 21% (aire atmosférico) a 10%, preferiblemente 5%, de manera especialmente preferible, 1%, eventualmente en asociación con un aumento simultáneo del contenido de nitrógeno, siendo eventualmente posible emplear a título adicional también otros gases, por ejemplo de 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 5%, de CO_{2}. La disminución del contenido de oxígeno atmosférico tiene lugar bajo condiciones bajo las cuales el material de células se multiplica. Mediante esta técnica de cultivo es posible establecer cepas de células progenitoras de mamíferos, en especial humanas, también a partir de diversas áreas del cerebro (también del tejido de mesoencéfalo).

Los factores exógenos empleados en el caso de la expansión (véase lo que sigue) pueden encontrarse presentes aislados o en combinación, en cada caso en concentraciones de 4.000 a 0,01 ng/ml, preferiblemente de 500 a 1 ng/ml, de manera especialmente preferida, de 100 a 2 ng/ml de la solución de expansión, sin estar limitados a ello.

Diferenciación parcial por cebado

El cebado consiste en que las células progenitoras neuronales (monoclonales) se tratan con LIF, GDNF y/o con una o varias de las interleuquinas IL 1-11, lo que favorece la diferenciación en la población deseada de células nerviosas. Para esta finalidad pueden emplearse también los denominados medios acondicionados, es decir, medios de cultivo, que pueden emplearse para el cultivo, en especial de las neuronas del campo diana de la población deseada de células nerviosas (por ejemplo, del cuerpo estriado en el caso de las neuronas dopaminérgicas) o de células gliales, o que se obtienen a partir de cultivos primarios de estas células. Estos medios contienen las proteínas que son secretadas por las células correspondientes. Estos factores exógenos se retiran nuevamente en un momento (preferiblemente después de algunas horas) en el que las células se desdiferencian en un estado en el que es posible la continuación de la expansión. Las células progenitoras reconvertidas de este tipo se designan como células cebadas. En el caso de una segunda exposición con factores endógenos eficaces (por ejemplo, después de trasplantación en un cerebro adulto), se presenta entonces una diferenciación varias veces más rápida. En el caso de una expansión (renovada) se obtienen entonces cepas de células cebadas (eventualmente también monoclonales), que ya expresan genes que garantizan una especificidad más elevada. Este paso puede repetirse con una frecuencia arbitraria, pudiendo en cada caso exponerse las células a otros factores, o a los mismos factores con otras concentraciones.

Para el cebado se utiliza LIF, GDNF y/o una o varias de las interleuquinas IL 1-11.

Junto con ello, es posible utilizar en cada caso combinaciones, en especial de los mencionados a continuación: citoquinas y factores de crecimiento, citoquinas y factores de transcripción, citoquinas y neurotransmisores, citoquinas y hormonas, citoquinas y gangliósidos, citoquinas y medios acondicionados, factores de crecimiento y factores de transcripción, factores de crecimiento y neurotransmisores, factores de crecimiento y hormonas, factores de crecimiento y gangliósidos, factores de crecimiento y medios acondicionados, factores de transcripción y neurotransmisores, factores de transcripción y hormonas, factores de transcripción y gangliósidos, factores de transcripción y medios acondicionados, neurotransmisores y hormonas, neurotransmisores y gangliósidos, neurotransmisores y medios acondicionados.

En especial, también pueden emplearse combinaciones de citoquinas y factores de crecimiento junto con factores de transcripción o neurotransmisores u hormonas o gangliósidos o medios acondicionados. También pueden emplearse combinaciones de citoquinas y factores de transcripción junto con neurotransmisores u hormonas o gangliósidos o medios acondicionados. También pueden emplearse combinaciones de citoquinas y neurotransmisores junto con hormonas o gangliósidos o medios acondicionados. También es posible emplear combinaciones de factores de crecimiento y factores de transcripción junto con neurotransmisores u hormonas o gangliósidos o medios acondicionados. También es posible emplear combinaciones de factores de crecimiento y neurotransmisores junto con hormonas o gangliósidos o medios acondicionados. También es posible emplear combinaciones de factores de crecimiento y hormonas junto con gangliósidos o medios acondicionados. También pueden utilizarse combinaciones de factores de crecimiento y gangliósidos junto con medios acondicionados.

Como factores de crecimiento se emplean uno o varios del grupo constituido por el factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor), en especial EGF1, EGF2, EGF3 con los subgrupos \alpha y \beta, el factor de crecimiento de transformación (TGF, transforming growth factor) \alpha y \beta, la proteína LIN-3, el factor de crecimiento de los fibrobastos (FGB, fibroblast growth factor), FGF1 y FGF2, el factor de crecimiento de los nervios (NGF, nerve growth factor), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, brain-derived neurotrophic factor), la neurotrofina (NT), en especial NT-3, NT-4, NT-5, NT-6, los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF, insulin-like growth factors), en especial IGF-1 e IGF-2, el factor neurotrófico derivado de la cepa de células gliales (GDNF, glial cell-line derived neurotrophic factor), la neurturina (NTN), la persefina (PSP, persephin), el factor de crecimiento endotelial del endotelio vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor), incluyéndose sus subgrupos o factores de acción similar.

Como citoquinas se emplean una o varias del grupo de las interleuquinas (IL 1- 16), el factor inhibidor de la leucemia (LIF, leukemia inhibitory factor), el factor neurotrófico ciliar (CNTF, ciliary neurotrophic factor), el factor de la necrosis de los tumores (TNF, tumor necrosis factor), en especial TBF-\alpha, los interferones (IFN), en especial el INF-\alpha, los factores inhibidores o estimuladores de los macrófagos, en especial el factor inhibidor de la migración de los macrófagos (MIF, macrophage migration inhibitory factor), el factor de estimulación de la importación mitocondrial (MSF, mitochondrial import stimulation factor), y ácido retínico.

Como neurotransmisores se emplean uno o más del grupo constituido por dopamina, acetilcolina, GABA, glutamato, glicina, taurina, prolina, noradrenalina, serotonina y neuropéptidos, en especial sustancia P y encefalina.

Los neurotransmisores se emplean solos o en presencia de factores de crecimiento y/o de citoquinas.

Solas o en combinación con las sustancias o combinaciones de sustancias, mencionadas arriba, pueden emplearse hormonas, tales como hormonas de crecimiento, hormonas de la glándula tiroidea (en especial para la diferenciación de las células progenitoras en neuronas dopaminérgicas), hormonas esteroides o gangliósidos, incluyéndose en cada caso sus derivados.

Para la formación de neuronas dopaminérgicas se emplean GDNF, LIF y una o más de las IL 1-11, solas o en combinación, en especial la combinación IL-1, GDNF, LIF, IL-11, incluyéndose en cada caso sus subgrupos.

Los factores exógenos pueden emplearse solos o en combinación, en cada caso con concentraciones de 25.000 a 0,005 ng/ml, preferiblemente 1.000 a 0,1 ng/ml, de manera especialmente preferida 100 a 1 ng/ml de solución de expansión, sin estar limitados a estos valores.

En especial, para la diferenciación puede emplearse en cada caso IL-1 en concentraciones de 0,005 a 10 ng/ml, preferiblemente 0,01 a 2 ng/ml, de manera especialmente preferible 0,05 a 0,25 ng/ml. La IL-1 y el LIF pueden emplearse en concentraciones de 0,01 a 100 ng/ml, preferiblemente de 0,1 a 20 ng/ml, de manera especialmente preferible, de 0,5 a 2,5 ng/ml. El GNDF puede emplearse en concentraciones de 1 a 25.000 ng/ml, preferiblemente 1 - 10 a 5.000 ng/ml, de manera especialmente preferida, 1-100 a 2.500 ng/ml.

Los factores también pueden emplearse en combinación en estas concentraciones. Sin embargo, las concentraciones a emplearse no se limitan a los valores mencionados arriba y pueden variar, entre otros, en función de los otros factores empleados en cada caso.

Diferenciación parcial mediante transfección

En especial dentro del marco del cebado descrito arriba, pero también independientemente de ésta, es también posible emplear manipulaciones genéticas. Mediante la transfección de las células progenitoras con genes que son relevantes en el desarrollo de las neuronas específicas, se favorece una diferenciación en el tipo de célula deseado. También una expresión transitoria de estos genes, que no modifique el material hereditario de las células y que no infiltre genes extraños (heterólogos) después de la trasplantación en el cerebro hospedante, determina el destino posterior.

El desarrollo de neuronas dopaminérgicas puede controlarse, en especial mediante transfección de genes, que codifican miembros de la familia de los receptores de esteroides y de hormona tiroidea, tales como los receptores tirosinhidroxilasa, Nurr-1 y/o Nurr-77. En especial, es también posible emplear genes del transportador de monoaminas vesiculares o del transportador de dopamina. En términos generales, pueden emplearse genes que sean específicos con respecto a las neuronas dopaminérgicas.

Los ADNc's correspondientes, junto con los genes mencionados arriba, se conocen de la bibliografía y están disponibles. La transfección se efectúa mediante los procedimientos estándar indicados en la bibliografía. De esta manera es posible una transfección, transitoria o estable, de las células progenitoras.

Selección mediante subclonación

La subclonación es especialmente adecuada para la selección. Mediante la subclonación, a partir de cultivos de células heterogéneas (en este caso, las células progenitoras neuronales obtenidas) es posible generar cepas de células (cepas de células monoclonales o eventualmente policlonales) que se han formado a partir de una única de estas células progenitoras. Con ello es posible minimizar la heterogeneidad de estas células, sin adición de factores exógenos.

La subclonación de las células progenitoras puede tener lugar mediante dilución final de la suspensión de células, por micromanipulación o mediante separación de células activada por fluorescencia (FACS, "fluorescence-activated cell sorting") después de marcación de las células vitales o mediante reconcentración magnética después de marcación de las células con partículas supraparamagnéticas.

La subclonación de las células progenitoras mediante dilución final de la suspensión de células tiene lugar, por ejemplo, diluyendo la suspensión de células en un grado tal que quede solamente una única célula en cada recipiente de cultivo. Las células así extendidas sobre placas, se expanden, con lo cual se obtienen cepas de células monoclonales. En este caso, es preferible mezclar los medios con sustancias mitógenas (véanse los factores de crecimiento mencionados arriba), para lograr una multiplicación a partir de una célula individual. La expansión, diferenciación y caracterización tienen entonces lugar en más como ya descrito arriba para las suspensiones de células progenitoras policlonales.

La subclonación de las células progenitoras por micromanipulación después de marcación de las células vitales mediante fluorescencia puede efectuarse por tinción de las células vivas con un marcador específico para la correspondiente población de células. Las células marcadas son seguidamente objeto de lectura bajo un microscopio de fluorescencia mediante microherramientas (por ejemplo, capilares de vidrio), de modo tal que en el recipiente de cultivo sólo permanezcan células de un tipo, marcadas. Las células así extendidas sobre placas, se expanden, con lo cual se obtienen cepas de células que solamente contienen un tipo de célula.

Para la expansión es preferible mezclar los medios con sustancias mitógenas (véanse los factores de crecimiento mencionados arriba), para lograr una multiplicación a partir de una célula individual. La expansión, diferenciación y caracterización tienen entonces lugar en más como ya descrito arriba para las suspensiones de células progenitoras policlonales. Es eventualmente posible acoplar a ello una subclonación mediante dilución final (véase arriba). Como marcador para células dopaminérgicas se transfectan transitoriamente las células con, por ejemplo, el gen para el EGFP ("enhanced green-fluorescence protein", proteína de fluorescencia verde reforzada), de fluorescencia verde, que se expresa bajo el control de promotores dopaminérgicos específicos (promotor de tirosinhidroxilasa y de transportador de dopamina). Las células, de luminiscencia verde, expresan de manera correspondiente las dos proteínas dopaminérgicas específicas mencionadas, y seguidamente se clonan como descrito arriba. Además, la marcación de las células vivas puede tener lugar mediante anticuerpos fluorescentes. Para las células dopaminérgicas pueden emplearse anticuerpos contra el transportador de dopamina.

La subclonación de las células progenitoras mediante separación de células activada por fluorescencia, puede efectuarse mediante citometría de flujo (FACS, "fluorescence-activated cell sorting", separación de células activada por fluorescencia) después de marcación de las células vitales por fluorescencia, para lo cual se tiñen las células vivas con un marcador específico para la población de células respectiva. A continuación, las células marcadas se separan mediante un aparato FACS, siguiéndose el procedimiento estándar indicado en la bibliografía (para un panorama general: Orfao und Ruiz -Arguelles, Clin. Biochem. 1996: 29: 5- 9), de modo tal que en el cultivo solamente queden células marcadas de un tipo. Las células así extendidas sobre placas se expanden, con lo que se obtienen cepas de células que solamente contienen un tipo de células. Para la expansión es preferible mezclar los medios con sustancias mitógenas (véanse los factores de crecimiento indicados arriba), para lograr una multiplicación a partir de una célula individual. La expansión, diferenciación y caracterización tienen entonces lugar en lo demás como descrito arriba para la suspensión de células progenitoras policlonales. Puede eventualmente acoplarse a continuación una subclonación mediante dilución final (véase arriba). Como marcador para células dopaminérgicas se transfectan transitoriamente las células, por ejemplo con el gen de EGFP que se expresa bajo el control de promotores dopaminérgicos específicos (promotor de tirosinhidroxilasa y transportador de dopamina). Las células, de brillo verde, expresan en forma correspondiente las dos proteínas específicas mencionadas, y seguidamente se clonan como descrito. Además, la marcación de las células vivas puede tener lugar mediante anticuerpos fluorescentes. Para células dopaminérgicas pueden utilizarse por ejemplo anticuerpos contra el transportador de dopamina.

La subclonación de las células progenitoras mediante reconcentración magnética después de marcación de las células con partículas supraparamagnéticas tiene lugar marcando las células vivas magnéticamente con un marcador específico para la respectiva población de células. Se dispone de diversas partículas (basic microbeads - microperlas básicas- recubiertas de dextrano, con aminas libres, 50 nm, Miltenyi Biotech; perlas de amino/carboxi, 110-140 nm, Immunicon Corp.; recubiertas de estreptavidina/biotina, Miltenyi Biotech o Immunicon Corp.). Estas partículas pueden cargarse con ligandos para proteínas superficiales específicas (por ejemplo, receptores D2 de dopamina, transportadores de dopamina u otros transportadores. Seguidamente pueden aislarse células que se ligan a estas partículas, mediante columnas magnéticas.

Las células extendidas sobre placas se expanden, con lo cual se obtienen cepas de células que solamente contienen un tipo de célula. Para la expansión se mezclan preferiblemente los medios con sustancias mitógenas (véanse factores de crecimiento indicados arriba), para lograr una multiplicación a partir de una única célula. La expansión, diferenciación y caracterización tienen entonces lugar en lo demás como ya descrito arriba para las suspensiones de células progenitoras policlonales. Puede eventualmente acoplarse una subclonación mediante dilución final (véase antes). La marcación de las células vivas tiene lugar mediante anticuerpos que han sido acoplados con "microperlas" magnéticas. Para células dopaminérgicas pueden utilizarse anticuerpos contra el transportador de dopamina. Además, es posible la utilización de ligandos de bajo peso molecular de proteínas específicas de tipos de célula. Para neuronas dopaminérgicas se ofrecen ligandos para el receptor D2 de dopamina (derivados de benzamida o de espiperona) o para el transportador de dopamina (derivados de cocaína).

En todos estos procedimientos las células se subclonan en una etapa en la que ha tenido lugar una diferenciación la más amplia posible, sin que se reduzca la capacidad de las células de dividirse, por lo tanto después de un cebado, manipulación genética, modificación de la atmósfera o tratamiento con factores exógenos.

En caso de necesidad, los pasos de la diferenciación parcial, selección (subclonación) y expansión, descritos arriba, pueden combinarse y utilizarse repetidamente.

Realización general del procedimiento

Después de la preparación del tejido cerebral tiene lugar la homogeneización. El tejido se mezcla preferiblemente con una enzima de acción proteolítica, en especial una serina proteasa como tripsina, preferiblemente con una concentración de 50 a 500 mg/ml, para aflojar la unión de los tejidos.

El tejido así preparado se mezcla seguidamente de manera ventajosa con una solución de DNasa, que contiene preferiblemente una concentración de 0,5 a 20 mg, preferiblemente de 2 a 6 mg de DNasa en una solución de 100 ml. Es preferible emplear DNasa I. La solución de DNasa se incuba durante 2 a 30 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 10 minutos, para digerir el ADN extracelular, ya que éste puede influir sobre la supervivencia de las células y sobre la homogeneización.

Seguidamente se homogeneizan las partes de tejido digeridas mediante aspiración reiterada en una pipeta de vidrio de Pasteur.

A continuación se mezcla el tejido con una cantidad eficaz de un medio de expansión para la multiplicación de las células progenitoras, y se lo expande en un frasco de cultivo, como se conoce de la bibliografía indicada.

El medio de expansión puede contener, junto con los factores que fomentan la expansión (mitógenos), 10 a 60%, preferiblemente 30 a 45% de Medio F-12, 30 a 75%, preferiblemente 45 a 70% de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, libre de glucosa, o con una cantidad de glucosa pequeña o grande), cantidades eficaces de un antibiótico adecuado, como por ejemplo penicilina o estreptomicina, con una concentración de 50 a 250 U.I./ml para penicilina y de 50 a 250 \mug/ml para estreptomicina, preferiblemente 150 U.I/ml para penicilina y 150 \mug para estreptomicina.

Los medios de expansión pueden además contener una o varias sustancias del grupo constituido por transferrina, aminas biógenas, en especial diaminas como, por ejemplo, 1,4-diaminabutano (putrescina), agentes de reducción de acción bactericida como selenita de sodio, gestágenos, en especial progestativos como progesterona o sustancias activas de tipo progesterona, así como insulina. Como alternativa, pueden emplearse diversos suplementos que se extraen de suero, como por ejemplo el Suplemento B-27, obtenible en el comercio (Firma Gibco).

La expansión se lleva a cabo en atmósfera cambiada con un contenido reducido de oxígeno. Para ello se almacenan las células en una cámara correspondiente en la que está garantizada una concentración exacta de oxígeno. En función del tipo de célula deseado, se varía el contenido de oxígeno entre 1% y 10%.

Para los cultivos de células a clonarse en este caso, pueden añadirse en especial factores mitógenos en el medio. Para ello se utilizan de manera ventajosa factores mencionados arriba. También la subclonación tiene preferiblemente lugar bajo atmósfera cambiada. Ha demostrado ser ventajoso ajustar la concentración de oxígeno de manera muy individual a las células aisladas, en especial en valores entre 1% y 15%.

Después de suficiente expansión de los clones de las células, tiene lugar la selección y diferenciación parcial de las células en cultivos de células aptos para trasplantación.

La transfección de las células con genes puede tener lugar bajo la adición de cantidades adecuadas, por ejemplo de 0,5 \mug de ADN de plásmido por cada 1 ml de contenido de un recipiente de cultivo, y de 3 \mul de ADN Solución Transfast (Pro mega) por cada 1 ml del medio de expansión, siguiéndose las instrucciones del proveedor. Esta solución puede incubarse a 37ºC y seguidamente adicionarse a la muestra de tejido. Para la identificación de las neuronas diferenciadas, es posible efectuar una incubación con ADN y lipofectina, y seguidamente se los diferencia en Medio I. Las células pueden entonces recolectarse y tratarse ulteriormente, de manera usual.

La medición de la proliferación mediante la incorporación de [^{3}H] timidina y la determinación de proteínas, así como la medición de la proliferación y de la vitalidad por citometría de flujo, tienen lugar mediante procedimientos usuales.

Para la diferenciación de las células progenitoras, es posible aplicar las células in vitro extendiéndolas sobre placas de recubrimiento recubiertas de poli-L-lisina o sobre placas de 48 pocillos en medio neurobasal (Gibco). Los medios pueden mezclarse con FCS, citoquinas y/o medios acondicionados con cuerpo estriado. Pueden emplearse, por ejemplo las citoquinas IL-1B, IL-11, LIF, GDNF u otros factores exógenos como descritos en el Capítulo "Cebado". Las células se diferencian durante 7 a 10 días a 37ºC en una atmósfera humedecida antes de su fijación e investigaciones adicionales.

La integridad funcional de las neuronas, por ejemplo, de las neuronas DA y GABA, puede tener lugar mediante medición de la incorporación de neurotransmisores tritiados. Después de la preincubación durante 10 minutos en un tampón de incubación que contiene pargilina 100 \muM, ascorbato 1 mM y \beta-alanina 2 mM (y para la determinación de la incorporación no específica: GBR12909 3 \muM y ácido 2,4-diamino-n-butírico 1 mM; DABA), pueden adicionarse [^{3}H]DA, [^{3}H]colina o [^{3}H]GABA 50 nM durante 15 minutos a 37ºC. La incorporación puede detenerse mediante lavado de las placas con PBS frío, y la medición de la radioactividad remanente del lisado de células puede tener lugar utilizando conteo de cintilación en líquido. La incorporación especifica puede determinarse como la diferencia entre la incorporación en ausencia (valor total) y la incorporación que tuvo lugar en presencia de GBR12909 y DABA (no específico).

La invención se describe a continuación a modo de ejemplo.

Ejemplo de realización

Para la obtención de células progenitoras para la producción de células neuronales de un tipo determinado, o de un material de células neuronales correspondiente apto para trasplantaciones, se utiliza el cerebro de un feto humano, cuyas meninges fueron removidas. La preparación de la sustancia cerebral tiene lugar bajo enfriamiento, por ejemplo en una cápsula de vidrio de Petri sobre hielo. Las porciones de cerebro, de las cuales han de obtenerse las células progenitoras, se preparan con dos escalpelos, preparándose al mismo tiempo los cortes periventriculares. Las porciones de cerebro preparadas se transfieren a tubitos de material plástico con 12 a 14 ml de una solución de disección sobre hielo.

La solución de disección contiene 98% de HBSS (Hank's buffered salt solution, solución de sal tamponada de Hank), libre de calcio y de magnesio, 150 U.I./ml de penicilina/150 \mug/ml de estreptomicina, así como 4.500 mg/ l de D-glucosa.

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Para la expansión de las células progenitoras neuronales se centrifuga la solución de disección que contiene el material de células neuronales, y se retira el sobrenadante por aspiración. El tejido separado, junto con 1 ml de solución de tripsina (250 mg de tripsina en 100 ml de HBSS, filtrado estérilmente y congelado a -20ºC en muestras de 1 ml, para su conservación o almacenamiento), se mezcla y se agita. La solución se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. La muestra se centrifuga seguidamente, y el sobrenadante se retira del tejido por aspiración.

Seguidamente se mezcla la solución de ADNasa en pellas así obtenida (4 mg de DNasa I, 15 mg de inhibidor de tripsina de granos de soja, 188,2 mg de MgSO_{4}, sobre 100 ml de HBSS, filtrado estérilmente y congelado a -20ºC en muestras de 2 ml para su almacenamiento), y se agita.

La solución se incuba durante 10 minutos a 37ºC, seguidamente se centrifuga y se retira el sobrenadante del tejido por aspiración.

El tejido se mezcla seguidamente con 3 a 5 ml de medio de expansión I o medio de expansión II, para la multiplicación de células.

El medio de expansión I consiste en 32% de Medio F-12, 65% de DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) (4.500 mg/l de D-glucosa), 2% de solución complementaria B-27 (Firma Gibco), 150 U.I./ml de penicilina/150 \mug /ml de estreptomicina, así como el factor de crecimiento EGF (20 ng/ml), opcionalmente también EGF (20 ng/ml) y FGF 2 (20 ng/ml).

El medio de expansión II contiene 45,1% de Medio F-12, 45,1% de DMEM, 1 ml de solución madre de putrescina (100 mg de transferrina sobre 10 ml de HBSS), 1 ml de solución madre de putrescina (consistente en 126 mg de clorhidrato de putrescina sobre 100 ml de HBSS, correspondiente a una concentración de putrescina de 60 \muM), 1 mg de penicilina/estreptomicina, 200 \mul de solución madre de Na-selenita (1 mg de sodio-selenita, 11,6 ml de H_{2}O; 0,3 ml de esta solución sobre 9,7 ml de HBSS resultan en la solución madre), 200 \mul de solución madre de progesterona (1 mg de progesterona sobre 3,2 ml de etanol, 50 \mul de la solución etanólica sobre 4,95 ml de HBSS tiene como resultado la solución madre), 200 \mul de solución madre de insulina (100 mg de insulina sobre 100 ml de HCl, 0,01 N) así como los factores de crecimiento EGF (20 ng/ml) y FGF 2 (20 ng/ml).

El tejido expandido se homogeneiza, por ejemplo con una pipeta de Eppendorf, y se determina el número de células con un hemocitómetro. La suspensión de células se diluye mediante el medio de expansión I ó II, hasta un número de células de aproximadamente 300.000 células/ml. 8 ml de esta suspensión de células (correspondiente a aproximadamente 2,5 millones de células) se colocan encima de un frasco de 25 metros cúbicos, y las células se cultivan con una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}/ 95 de aire a 37ºC durante aproximadamente 1 semana.

Las células se cambian de lugar una a dos veces por semana en medio de expansión I o II, fresco, para lo cual se desprenden las células en el frasco, se las transfiere en tubitos de material plástico y seguidamente se las centrífuga; el sobrenadante se retira por aspiración, se añaden 2 ml de la solución de expansión I ó II, fresca, y seguidamente se homogeneiza. La solución homogeneizada se divide en varias muestras, por ejemplo 3 a 6 muestras, se transfiere a frascos nuevos y se mezcla con 8 ml de la solución de expansión mencionada arriba.

Las células progenitoras expandidas descritos arriba pueden congelarse a muy baja temperatura, de - 80ºC, para su almacenamiento. Para ello se desprenden las células del frasco de cultivo mediante la solución de tripsina descrita arriba, y se centrifuga la suspensión de células a 1.000 x g durante diez minutos. Las pellas obtenidas después del vertido del sobrenadante se incorporan en la solución de expansión I ó II, y la suspensión de células, junto con la correspondiente solución de expansión, se diluye hasta un número de células de 2 a 4 x 10^{6} por ml. La suspensión de células, así obtenida, se almacena a título temporal sobre hielo, y seguidamente se introduce 0,5 ml de la suspensión de células en un tubito de congelación, preenfriado a -80ºC, bajo adición de 0,5 ml de un medio de congelación (consistente en 50% de suero fetal de ternero, 20% de dimetilsulfóxido y 30% de la solución de expansión I ó II. Los tubitos, sellados, se congelan en una caja de poliestireno a -80ºC.

Para el control se descongelan las muestras al día siguiente, o después, y, en caso de tener las células una actividad suficiente, las demás muestras, congeladas a -80ºC, se transfieren, encerradas en láminas (foils) resistentes a la congelación selladas por soldadura, a nitrógeno líquido.

Para el control de las muestras de células congeladas se multiplican las células descongeladas, se las diferencia, y se las caracteriza mediante los métodos indicados arriba, que dependen del tipo de célula. Las células progenitoras congeladas que demuestren características suficientes como células, se almacenan y se utilizan como material de trasplantación.

Las células progenitoras preparadas de esta manera pueden almacenarse durante un periodo de tiempo ilimitado en nitrógeno líquido.

Para la subsiguiente descongelación de las muestras de células se retiran los tubos de congelación directamente del nitrógeno líquido, y se las descongela por completo en un baño de agua a 37ºC. A continuación se desinfecta el tubito con etanol al 70%. La suspensión de células se transfiere a tubitos de material plástico de 15 ml, y se mezcla con 9 ml del medio de expansión I ó II, lentamente y bajo agitación. La suspensión formada se centrifuga a 1.000 x g durante diez minutos, se retira el sobrenadante por vertido y se incorporan las pellas de células en 6 ml de medio de expansión I ó II. La muestra se transfiere seguidamente a un frasco de cultivo de 50 ml, y se incuba en una atmósfera con 5% de CO_{2}/95% de aire a 37ºC durante aproximadamente una semana. A continuación tiene lugar la expansión adicional de las células, como descrito arriba.

Una diferenciación de las células progenitoras puede tener lugar con muestras recién expandidas o con muestras descongeladas.

Para ello las células se retiran por enjuague del frasco de cultivo, se las centrifuga e incorpora en un medio de incorporación adecuado, con lo que resulta un número de células de aproximadamente 20.000 a 100.00 células/ml.

A continuación se agregan las composiciones, por ejemplo, medios de incorporación adecuados de terceros.

El medio de incorporación I consiste en 45,1% de Medio F-12, 45,1% de DMEM, 1 ml de solución madre de transferrina, 1 ml de solución madre de putrescina (resultan 60 \muM), 150 U.I./ml de penicilina/150 \mug /ml de estreptomicina, 200 \mul de solución madre de Na-selenita, 200 \mul de solución madre de progesterona, y 200 \mul de solución madre de insulina.

Las composiciones de las soluciones madre mencionadas corresponden a las soluciones madre de la preparación, descrita arriba, del medio de expansión II.

El medio de incorporación II contiene 44,5% de Medio F-12, 44,5% de DMEM, 150 U.I./ml de penicilina/150 \mug/ml de estreptomicina, así como suero fetal de ternero al 10% (no desactivado por calor).

El medio de incorporación III contiene 98% de un medio neurobasal (Firma Gibco), 1% de Suplemento N-2 (Firma Gibco), así como 150 U.I./ml de penicilina/150 \mug/ml de estreptomicina.

Para la diferenciación, a los medios de incorporación que contienen el material de células, se les añade en cada caso, IL-1 (100 pg/ml), IL-11 (1 ng/ml), GDNF (1 \mug/ml) y LIF (1 ng/ml), juntos, o estas sustancias se añaden en cada caso individualmente con las concentraciones indicadas.

Las muestras se incuban durante 7 a 21 días en una atmósfera con un contenido de oxígeno de 2%.

Seguidamente se seleccionan las células obtenidas mediante subclonación en una atmósfera con 5% de oxígeno, después de lo cual se repiten los pasos descritos de la expansión y diferenciación.

Para las trasplantaciones, las suspensiones de células formadas se incorporan en una solución de sal tamponada con fosfato.

En cada caso se obtienen preparados de neuronas dopaminérgicas que se hallan prácticamente libres de células gliales. Las células pueden seguidamente trasplantarse.

Es también posible preparar en cada caso suspensiones de células progenitoras determinadas, que sin tratamiento adicional después de su implantación en el cerebro humano o al entrar en contacto con otro medio de células o con otro material de soporte, se diferencian parcial o totalmente en un tipo determinado. Es eventualmente también posible acoplar a los pasos de procedimientos mencionados, una diferenciación definitiva de las neuronas.

Claims (4)

1. Procedimiento para la producción de material de células neuronales apto para trasplantación, que comprende los siguientes pasos de procedimiento:

- obtención de células progenitoras humanas a partir de material de células neuronales fetales o adultas;

- expansión de las células progenitoras humanas obtenidas, bajo contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera;

- diferenciación parcial in vitro por tratamiento de las células progenitoras con LIF, GDNG y/o una o varias de las interleuquinas IL 1- 11 bajo un contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera:

- selección por subclonación bajo un contenido disminuido de oxígeno en la atmósfera; y

- expansión del material de células.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque la subclonación tiene lugar mediante uno o varios procedimientos realizados en adecuada sucesión temporal, del grupo siguiente:

- subclonación por dilución final:

- subclonación por micromanipulación de células vitales marcadas;

- subclonación por separación de células, activada por fluorescencia, de células vitales marcadas;

- subclonación por reconcentración magnética de células marcadas magnéticamente.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el contenido de oxígeno en la atmósfera es inferior a 10% en volumen, preferiblemente inferior a 5% en volumen.

4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque para la diferenciación parcial de las células progenitoras se emplean cepas de células progenitoras monoclonales.