ES2259079T3 - Inhibidores de la actividad cinasa del receptor tie2 para tratar enfermedades angiogenicas. - Google Patents
Inhibidores de la actividad cinasa del receptor tie2 para tratar enfermedades angiogenicas.Info
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Abstract
Un compuesto de **fórmula** y las sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables del mismo, en el que: R1 se selecciona del grupo que consiste en arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico, heterociclicalquilo, aroílo y alcanoílo; R2 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo(C1-C10), cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico, heterociclicalquilo, alquenilo, cicloalquenilo y alquinilo; y en el que R1 y R2 pueden estar de forma independiente opcionalmente sustituidos con uno o más grupos seleccionados de la lista: ¿ halógeno; ¿ hidroxi; ¿ alquilo(C1-C10) sustituido con hidroxi; ¿ alcoxi(C1-C10); ¿ alquilo S(O)m, en el que m es 0, 1 ó 2; ¿ amino; ¿ amino monosustituido; ¿ amino disustituido; ¿ alquilo(C1-C10); ¿ cicloalquilo; ¿ cicloalquil-alquilo; ¿ alquilo C1-C10) halosustituido; ¿ arilo, o aralquilo, en el que los restos de arilo también pueden estar sustituidos de una a dos veces con halógeno, hidroxi, alquilosustituido con hidroxi, alcoxi(C1-C10), alquilo S(O)m, amino, amino monosustituido, amino disustituido, alquilo(C1-C10) o alquilo(C1-C10) halosustituido.
Description
Inhibidores de la actividad cinasa del receptor
Tie2 para tratar enfermedades angiogénicas.
La presente invención se refiere al tratamiento
de enfermedades, en un mamífero, en el que se ha producido una
angiogénesis inapropiada, excesiva o indeseable y/o en el que se ha
producido una actividad excesiva del receptor Tie2.
Las enfermedades proliferativas crónicas a
menudo están acompañadas de una angiogénesis profunda, que puede
contribuir a, o mantener, un estado inflamatorio y/o proliferativo,
o que conduce a la destrucción de tejidos mediante la proliferación
invasiva de los vasos sanguíneos. (Folkman, EXS 79:
1-8, 1997; Folkman, Nature Medicine 1:
27-31, 1995; Folkman y Shing, J. Biol. Chem.
267: 10931, 1992).
Por lo general, la angiogénesis se utiliza para
describir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos o los vasos
sanguíneos de reemplazo o la neovascularización. Es un proceso
necesario y fisiológico normal en el que la vasculatura se
establece en el embrión. Generalmente, la angiogénesis no se produce
en la mayoría de los tejidos adultos normales, exceptuando los
sitios de ovulación, las menstruaciones y la cicatrización de
heridas. Sin embargo, muchas enfermedades se caracterizan por una
angiogénesis persistente y sin regular. Por ejemplo, en la
artritis, nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación
y destruyen el cartílago (Colville-Nash y Scott,
Ann. Rheum. Dis., 51, 919, 1992). En la diabetes (y en muy
diversas enfermedades del ojo), los vasos nuevos invaden la mácula
o la retina u otras estructuras oculares y pueden causar ceguera
(Brooks et al., Cell, 79, 1157, 1994). El proceso de
la ateroesclerosis se ha unido a la angiogénesis (Kahlon et
al., Can. J. Cardiol. 8, 60, 1992). Se ha encontrado que
el crecimiento tumoral y la metástasis son dependientes de la
angiogénesis (Folkman, Cancer Biol, 3, 65, 1992;
Denekamp, Br. J. Rad. 66, 181, 1993; Fidler y Ellis,
Cell, 79, 185, 1994).
El reconocimiento de la implicación de la
angiogénesis en enfermedades importantes ha estado acompañado de la
investigación para identificar y desarrollar inhibidores de la
angiogénesis. Por lo general, estos inhibidores se clasifican en
respuesta a dianas concretas en la cascada de la angiogénesis, como
la activación de las células endoteliales mediante una señal
angiogénica; la síntesis y la liberación de enzimas degradativas;
la migración de las células endoteliales; la proliferación de las
células endoteliales; y la formación de túbulos capilares. Por lo
tanto, la angiogénesis se produce en muchas etapas y se está
intentando descubrir y desarrollar compuestos que consigan bloquear
la angiogénesis en estas distintas etapas.
Hay publicaciones que enseñan que los
inhibidores de la angiogénesis, que actúan mediante diversos
mecanismos, son beneficiosos en enfermedades tales como el cáncer y
la metástasis (O'Reilly et al., Cell, 79, 315, 1994;
Ingber et al., Nature, 348, 555, 1990), enfermedades
oculares (Friedlander et al., Science, 270, 1500, 1995),
artritis (Peacock et al., J. Exp. Med. 175, 1135,
1992; Peacock et al., Cell. Immun. 160, 178, 1995) y
hemangioma (Taraboletti et al, J. Natl. Cancer Inst.
87, 293, 1995).
Las señales de la angiogénesis son resultado de
la interacción de ligandos específicos con sus receptores. Los
receptores Tie1 y Tie2 son receptores con
tirosina-cinasa y un dominio transmembranario
(Tie se refiere a receptores con
Tirosina-cinasa y con dominios homólogos a
inmunoglobulinas y EGF). Recientemente, varios grupos
clonaron y describieron ambos receptores (Dumont et al.,
Oncogene 8: 1293-1301, 1993; Partanen et
al., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707, 1992; Sato
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
9355-9358, 1993).
Los receptores Tie son proteínas de
aproximadamente 125 kDa, con una sola posible región
transmembranaria. El dominio extracelular de estos receptores se
divide en varias regiones: hay 3 regiones que tienen una patrón de
expresión de cisteínas encontrada en los dominios similares al EGF;
hay 2 regiones que tienen una homología débil con los dominios
inmunoglobulinoides y las características estructurales de los
mismos; y hay 3 regiones homólogas a la estructura de repetición de
la fibronectina III. Esta combinación particular de dominios
extracelulares es única para los receptores Tie. La porción
intracelular de Tie2 está mucho más estrechamente relacionada
(identidad de
-40%) con los dominios cinasa de FGF-R1, PDGF-R y c-kit. Las porciones intracelulares de Tie2 contienen todas las características de las tirosina-cinasas, incluidas una secuencia de consenso GXGXXG del sitio de unión al ATP y los motivos típicos de las tirosina-cinasas (a saber, HRDLAARN y DFGL).
-40%) con los dominios cinasa de FGF-R1, PDGF-R y c-kit. Las porciones intracelulares de Tie2 contienen todas las características de las tirosina-cinasas, incluidas una secuencia de consenso GXGXXG del sitio de unión al ATP y los motivos típicos de las tirosina-cinasas (a saber, HRDLAARN y DFGL).
Estos receptores han despertado el interés
porque son las únicas tirosina-cinasas receptoras,
diferentes de los receptores del factor de crecimiento de las
células del entodelio vascular (VEGF por sus siglas en inglés), que
limitan principalmente su expresión a las células endoteliales. Hay
varios conjuntos de pruebas que muestran que Tie2 es importante
para la angiogénesis, detalladas en los siguientes párrafos.
Numerosos investigadores han estudiado la
ubicación de los receptores Tie en el embrión utilizando la
hibridación in situ. Korhonen et al. (Blood
80: 2548-2555, 1992) demostraron que el ARNm de los
receptores Tie está localizado en las células endoteliales de todos
los vasos sanguíneos en formación y en el endocardio de los
embriones de ratón. Durante el desarrollo embrionario, se observa
la expresión de los receptores Tie en los angioblastos y en toda la
vasculatura en desarrollo. La expresión de los receptores Tie sigue
la expresión del principal receptor del VEGF, el
Flk-1, hasta 12 a 24 horas durante la embriogénesis
del ratón, lo que quizás sugiere acciones secuenciales y diferentes
de estos sistemas receptores (Schnurch y Risau, Development
119: 957-968, 1993). La clonación de una región
flanqueadora en 5' genómica de 1,2 Kb de Tie2, acoplada al gen
lacZ y expresada en ratones transgénicos, demostró una
patrón de expresión selectivo para las células endoteliales durante
el desarrollo embrionario (Schlaeger et al.,
Development 121: 1089-1098, 1995). Así, el
promotor de Tie2 actúa para asegurar la expresión específica de
Tie2 en las células endoteliales.
Las similitudes entre la angiogénesis
embrionaria y la angiogénesis patógena originan la hipótesis de que
bloquear el funcionamiento de Tie2, en tumores o en contextos
inflamatorios crónicos, por ejemplo, puede bloquear la angiogénesis
y, por lo tanto, se bloquea además la proliferación celular y
proporciona un beneficio terapéutico. El ARNm del Tie no se
puede observar en la piel adulta, salvo en los sitios de
cicatrización activa de las heridas, en los que los capilares en
proliferación en el tejido granuloso contienen abundante ARNm del
Tie (Korhonen et al., Blood 80:
2548-2555, 1992). La amplificación por PCR del ADNc
de la piel normal no logra mostrar una señal para el receptor Tie
(Kaipainen et al., Cancer Res. 54:
6571-6577, 1994). En cambio, se observa una fuerte
señal con ADNc de melanomas metastatizantes, en los que los estudios
in situ localizan esta señal en el endotelio vascular.
Mientras que la expresión del receptor Tie está reprimida en la
vasculatura establecida, está inducida en la angiogénesis que se
produce en el ovario durante la ovulación, en las heridas y en la
vasculatura del tumor (de mama, melanoma y carcinoma de células
renales), lo que concuerda con los puntos de vista prevalentes de
que la angiogénesis en el adulto se apropia de los mecanismos
angiogénicos embrionarios.
Los ratones homocigóticos con una genosupresión
en Tie2, o que llevan un transgén que codifica un receptor
Tie2 "negativo dominante", confirmaron que el receptor Tie2 es
decisivo para el desarrollo embrionario (Dumont et al.,
Genes Dev. 8: 1897-1909, 1994; Sato et
al., Nature 376: 70-74, 1995). La muerte
embrionaria en estos ratones se produjo debido a la insuficiencia
vascular y hubo una disminución considerable de la cantidad de
células endoteliales. La vasculogénesis -es decir, la diferenciación
de las células endoteliales y la formación in situ de los
vasos- se presentó relativamente normal en los ratones que carecían
de Tie2. El brote posterior y la reorganización que dio lugar a la
formación de vasos ramificados (angiogénesis) disminuyeron
considerablemente en los embriones de los ratones mutantes para
Tie2. Esta falta de brote y de angiogénesis dio lugar a un retraso
importante del crecimiento, en particular en el cerebro, en el tubo
neural y en el corazón, lo que dio lugar a una falta de viabilidad.
Esto ejemplifica la importancia decisiva de Tie2 en la
angiogénesis. Esto es importante, ya que la angiogénesis está
regulada por numerosos factores de crecimiento. Resulta interesante
que los ratones genosuprimidos para Flk1 (receptor del VEGF)
muestren unos defectos letales embrionarios en la vasculogenia, que
se produce antes que en los que tienen el Tie2 interrumpido.
La interrupción del receptor Tie1 produce un fenotipo muy diferente
y, posteriormente, defectuoso; el embrión del ratón muere tarde en
desarrollo debido a la hemorragia que se produce porque la
integridad de la vasculatura es defectuosa, que sería buena de otro
modo. En conjunto, estos estudios sugieren que el VEGF/Flk1 y los
sistemas de Tie operan de forma secuencial, teniendo Tie2 una
función decisiva en la angiogénesis.
Recientemente, se han descrito dos ligandos para
el receptor Tie2. La angiopoyetina-1 se une e induce
la fosforilación de la tirosina de Tie2 y su expresión in
vivo está muy próxima al desarrollo de los vasos sanguíneos
(Davis et al., Cell 87:
1161-1169,1996). Los ratones manipulados para que
carezcan de la angiopoyetina-1 muestran unos
déficits angiogénicos reminiscentes de los observados anteriormente
en los ratones que carecen de receptores Tie2, lo que demuestra que
la angiopoyetina-1 es un ligando fisiológico
primario de Tie2 y que Tie2 tiene acciones angiogénicas in
vivo decisivas (Suri et al., Cell 87:
1171-1180, 1996). La angiopoyetina-2
se identificó mediante un rastreo por homología y se demostró que
era un antagonista natural de los receptores Tie2. La
sobreexpresión de la angiopoyetina-2 en los
transgénicos interrumpe la formación de los vasos sanguíneos en el
embrión de ratón (Maisonpierre et al., Science 277:
55-60, 1997). Juntos, estos resultados apoyan la
importancia de los receptores Tie2 en la angiogénesis.
En base a la importancia de los receptores Tie2
en la angiogénesis, se predice que la inhibición de la actividad
cinasa de Tie2 interrumpe la angiogénesis, lo que proporciona unos
efectos terapéuticos específicos para la enfermedad. Recientemente,
Lin et al. (J. Clin. Invest. 100:
2072-2078, 1997) han demostrado que el receptor
Tie2 soluble administrado exógenamente inhibía la angiogénesis y el
crecimiento del cáncer en los modelos de animales. Así, la
inhibición de los receptores Tie2 por otros medios, como la
inhibición de la actividad cinasa del receptor Tie2, se espera que
tenga un beneficio terapéutico para las enfermedades proliferativas
que implican la angiogénesis.
La solicitud actual enseña el nuevo hallazgo de
que los compuestos con una estructura específica pueden inhibir la
actividad cinasa del receptor Tie2, que bloquean su transducción de
la señal y, así, pueden ser beneficiosos contra las enfermedades
proliferativas mediante la inhibición de las señales para la
angiogénesis.
La presente invención es el hallazgo de que
nuevos compuestos pueden inhibir la cinasa de Tie2, y que estos
compuestos se pueden utilizar para inhibir la angiogénesis para el
tratamiento de las enfermedades inflamatorias crónicas o
proliferativas o angiogénicas que están causadas por una
angiogénesis excesiva o inapropiada. Los compuestos preferidos a
utilizar como inhibidores de la cinasa del receptor Tie2 son los
compuestos de fórmula (I) como los mencionados en la presente
memoria, incluidos las sales farmacéuticamente aceptables, los
hidratos y los solvatos de los mismos.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos de fórmula (I) que se usan para el tratamiento de
trastornos asociados a la inhibición de inhibidores de la cinasa
del receptor Tie2.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente
aceptables, solvatos e hidratos de los mismos (de aquí en adelante
se citan alternativamente en su conjunto como
"compuesto(s) de fórmula (I)":
en la
que:
R1 se selecciona del grupo que consiste en
arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico,
heterociclicalquilo, aroílo y alcanoílo;
R2 se selecciona del grupo que consiste en H,
alquilo(C_{1}-C_{10}), cicloalquilo,
arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico,
heterociclicalquilo, alquenilo, cicloalquenilo y alquinilo; y
en la que R1 y R2 pueden estar independiente y
opcionalmente sustituidos.
Los siguientes términos, como se usan en la
presente memoria, se refieren a:
- \bullet
- "alquilo(C_{1-}C_{10})" o "alquilo": ambos son radicales de cadena lineal y ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otro modo, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo y n-pentilo.
- \bullet
- "cicloalquilo" se utiliza en la presente memoria para referirse a radicales carbocíclicos, preferiblemente de 3 a 8 carbonos, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, ciclopropilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
- \bullet
- "arilo": fenilo y naftilo.
- \bullet
- "heteroarilo" (por sí mismo o en cualquier combinación, como "heteroariloxi" o "heteroaril alquilo"): un sistema de anillos aromáticos de 5 a 10 átomos en el que uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O o S, como, pero sin limitarse a ellos, pirrol, pirazol, furano, tiofeno, quinolina, isoquinolina, quinazolinilo, piridina, pirimidina, oxazol, tiazol, tiadiazol, triazol, imidazol o bencimidazol.
- \bullet
- "heterocíclico" (por sí mismo o en cualquier combinación, como "heterociclilalquilo"): un sistema de anillos de 4 a 10 átomos saturado o parcialmente insaturado en el que uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, o S; como, pero sin limitarse a ellos, pirrolidina, piperidina, piperazina, morfolina, tetrahidropirano, pirano o imizadolidina.
- \bullet
- "aralquilo" o "heteroarilalquilo" o "heterociclicalquilo" se utiliza en la presente memoria para referirse a alquilo(C_{1-}C_{4}) como se definió anteriormente unido a un resto arilo, heteroarilo o heterocíclico como también se definió en la presente memoria, entre ellos bencilo y fenetilo, a menos que se indique otra cosa.
- \bullet
- "aroílo": un C(O)Ar, en el que Ar es un derivado de fenilo, naftilo o aril-alquilo como se definió anteriormente.
- \bullet
- "alcanoílo": un alquilo(C_{1-}C_{10})C(O) en el que el alquilo es como se definió anteriormente.
- \bullet
- "alquenilo" se utiliza en la presente memoria en todas los casos para referirse a un radical de cadena lineal o ramificada de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otra manera, que tiene, al menos, un doble enlace carbono-carbono, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo y 2-butenilo.
- \bullet
- "cicloalquenilo" se utiliza en la presente memoria para significar un radical cíclico, preferiblemente de 5 a 8 carbonos, que tiene, al menos, un doble enlace carbono-carbono, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, ciclopentenilo y ciclohexenilo.
- \bullet
- "alquinilo" se utiliza en la presente memoria en todos los casos para referirse a un radical de cadena lineal o ramificada de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otra manera, que tiene, al menos, un triple enlace carbono-carbono incluidos, pero sin limitarse a ellos, propinilo, 1-butinilo y 2-butinilo.
- \bullet
- "halo" o "halógeno" incluye los halógenos: cloro, fluoro, bromo y yodo.
Como se emplea en esta memoria, "opcionalmente
sustituido", a menos que se defina específicamente, se referirá
a que un resto está sustituido con uno o más grupos como:
- \bullet
- halógeno (como flúor, cloro, bromo y yodo);
- \bullet
- hidroxi;
- \bullet
- hidroxi sustituido con alquilo(C_{1-}C_{10});
- \bullet
- alcoxi(C_{1-}C_{10}) (como metoxi o etoxi);
- \bullet
- alquiloS(O)_{m}, en el que m es 0, 1 ó 2 (como metiltio, metil-sulfinilo o metil-sulfonilo);
- \bullet
- amino;
- \bullet
- amino mono-sustituido (como amino monosustituido con alquilo(C_{1-}C_{6}));
- \bullet
- amino disustituido (como amino disustituido con alquilo(C_{1-}C_{6}));
- \bullet
- alquilo(C_{1-}C_{10}) (como metilo, etilo, propilo, isopropilo, t-butilo, etc.);
- \bullet
- cicloalquilo;
- \bullet
- cicloalquil alquilo (como ciclopropil-metilo);
- \bullet
- alquilo(C_{1-}C_{10}) halosustituido (como CF_{3});
- \bullet
- arilo (como fenilo) o aralquilo (como bencilo o fenetilo), en el que los restos arilo también pueden estar sustituidos una o dos veces con halógeno, hidroxi, alquilo sustituido con hidroxi, alcoxi(C_{1-}C_{10}), alquilo-S(O)_{m}, amino, amino monosustituido, amino disustituido, alquilo(C_{1-}C_{10}), o alquilo(C_{1-}C_{10}) halosustituido como se describió anteriormente;
- \bullet
- alquenilo;
- \bullet
- alquinilo.
Donde R2 es alquenilo, cicloalquenilo o
alquinilo, la unión insaturada, a saber, la unión vinileno o
acetileno, preferiblemente no se conecta directamente al nitrógeno.
De forma similar, donde el compuesto comprende de otra manera un
grupo sustituyente alquenilo o alquinilo, la unión vinilo o
acetileno preferiblemente no se une directamente a un nitrógeno,
oxígeno o azufre que puede estar presente en el compuesto.
R1 se selecciona preferiblemente de heteroarilo
y arilo (más preferiblemente, fenilo) sustituido o sin sustituir, y
más preferiblemente, fenilo sustituido. R2 se selecciona
preferiblemente de alquilo(C_{1}-C_{10}),
cicloalquilo, arilo y heterocíclico. Por ejemplo, R1 es fenilo,
tiofeno, piridinilo o pirazol adecuadamente sustituido o sin
sustituir. Los grupos sustituyentes de tal R1 sustituido son más
adecuadamente uno o más, preferiblemente de 1 a 2, grupos
seleccionados entre alquilo(C_{1-}C_{10})
(preferiblemente, metilo), halo (preferiblemente, fluoro, cloro),
alquilo(C_{1-}C_{10}) halosustituido (preferiblemente
CF_{3}), alcoxi(C_{1-}C_{10}) (preferiblemente
metoxi), amino, amino monosustituido y amino disustituido
(preferiblemente dimetil-amino). Donde R1 es un
derivado de fenilo, los sustituyentes pueden estar adecuadamente, p.
ej., en la posición 2-, 3-, 2,5-, 2,6-, 3,4- o 3,5- del anillo.
Donde R1 es un derivado de tiofeno o pirazol, los sustituyentes
pueden estar adecuadamente, p. ej., en la posición 2- del
anillo.
Por ejemplo, R2 se selecciona adecuadamente del
grupo que consiste en alquilo(C_{1-}C_{10})
(preferiblemente, alquilo(C_{1-}C_{4}), cicloalquilo,
arilo sustituido (preferiblemente fenilo sustituido) y
heterocíclico. Más adecuadamente, R2 se selecciona del grupo que
consiste en metilo, etilo, terc-butilo, ciclohexilo, fenilo
sustituido y pirano. El fenilo sustituido está más adecuadamente
sustituido por uno o más, preferiblemente de 1 a 2, grupos
seleccionados del grupo que consiste en halo (preferiblemente
fluoro, cloro), y alcoxi(C_{1-}C_{10}) (preferiblemente
metoxi). Donde R2 es un derivado de fenilo, los sustituyentes pueden
estar adecuadamente, p. ej., en la posición 3-, 4- o 3,4- del
anillo.
Particularmente, los compuestos adecuados
incluyen aquéllos en los que R1 es fenilo sustituido y R2 es
alquilo(C_{1-}C_{10}), cicloalquilo o heterocíclico, más
preferiblemente, alquilo(C_{1-}C_{4}) (p. ej.,
t-butilo, metilo), ciclohexilo o tetrahidropiranilo.
Los sustituyentes preferidos en tal R1 son halo (p. ej., cloro,
fluoro) y alquilo(C_{1-}C_{4}) (p. ej., metilo), como
2,6-dicloro,
2-cloro-6-fluoro y
2,5-dimetilo.
Los compuestos preferidos son:
3-[2,6-diclorofenil]-1,6-naftiridin-2'-2-[N'-(1,1-dimetiletil)urea];
1-terc-butil-3-[3-(2-cloro-6-fluorofenil)-[1,6]naftiridin-2-il]urea;
1-[3-(2-cloro-6-fluorofenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-(tetrahidropiran-2-il)urea;
1-terc-butil-3-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin
2-il]urea;
1-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-etilurea;
y
1-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-(tetrahidropiran-2-il)urea
Los expertos en la técnica conocen bien las
sales farmacéuticamente aceptables adecuadas que incluyen sales
básicas de ácidos orgánicos e inorgánicos, como ácido clorhídrico,
ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido
metano-sulfónico, ácido
etano-sulfónico, ácido acético, ácido málico, ácido
tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido
succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido benzoico, ácido
salicílico, ácido fenilacético y ácido mandélico. Además, también se
pueden formar sales farmacéuticamente aceptables de compuestos de
fórmula (I) con un catión farmacéuticamente aceptable, por ejemplo,
si un grupo sustituyente comprende un resto carboxi. Los expertos
en la técnica conocen bien los cationes farmacéuticamente
aceptables adecuados que incluyen cationes alcalinos,
alcalinotérreos, amonio y amonio cuaternario.
Se reconoce que los compuestos de la presente
invención pueden existir como estereoisómeros, regioisómeros o
diastereoisómeros. Estos compuestos pueden contener uno o más átomos
de carbono asimétricos y pueden existir en formas racémicas y
ópticamente activas. Todos estos compuestos están incluidos dentro
del alcance de la presente invención.
Lo siguiente describe cómo los compuestos de la
presente invención se pueden preparar a partir de sustancias de
partida fáciles de conseguir.
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La condensación del
4-aminonicotinaldehído (Turner, J.A. J. Org.
Chem. 1983, 48, 3401) con acetonitrilos
sustituidos mediante el procedimiento de la bibliografía (Hawes, E.
M., Gorecki, D. K. J. J. Heterocycl. Chem. 1972,
9(3), 703) proporciona 1,6-naftiridinas
2-amino-3-sustituidas.
La reacción del intermedio 1,6-naftiridina
2-amino-3-sustituida
con un isocianato sustituido en las condiciones estándares
proporciona la 1,6-naftiridina
2-urea-3-sustituida.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables de los compuestos de fórmula (I) se pueden obtener de la
manera conocida, por ejemplo, mediante el tratamiento del mismo con
una cantidad adecuada de ácido en presencia de un disolvente
adecuado.
Los compuestos de la presente invención se
pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de los estados
patógenos exacerbados o caracterizados por una angiogénesis excesiva
o de otra manera inapropiada o indeseable. La terminología
"angiogénesis excesiva o de otra manera inapropiada o
indeseable" como se utiliza en la presente memoria incluye, pero
sin limitarse a ellas, las enfermedades que se caracterizan por
hemangiomas y enfermedades oculares, las enfermedades que se
caracterizan por una proliferación de los vasos (vasculatura)
acompañada de una proliferación del tejido circundante, como ocurre
en el cáncer, la metástasis, la artritis, la psoriasis y la
ateroesclerosis, las neovascularizaciones oculares, como la
retinopatía diabética y la degeneración macular, el crecimiento
tumoral y la metástasis, la ateroesclerosis y algunos estados
artríticos. Los inhibidores del receptor con tirosina cinasa Tie2
de la presente invención serán de utilidad para el bloqueo del
componente angiogénico de estos estados patógenos.
Para utilizar un compuesto de la presente
invención en un tratamiento, normalmente se formulará en una
composición farmacéutica conforme a la práctica farmacéutica
estándar. Por lo tanto, esta invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz no tóxica
de un compuesto de fórmula (I) y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de fórmula (I) y las
composiciones farmacéuticas que incorporan tales compuestos se
pueden administrar de manera conveniente mediante cualquiera de las
vías utilizadas convencionalmente para la administración de
fármacos, por ejemplo, por vía oral, tópica, parenteral o por
inhalación. Los compuestos de fórmula (I) se pueden administrar en
formas farmacéuticas convencionales preparadas por la combinación de
un compuesto de fórmula (I) con vehículos farmacéuticos estándares
según los procedimientos convencionales. Los compuestos de fórmula
(I) también se pueden administrar en las formas farmacéuticas
convencionales en combinación con un segundo compuesto conocido
terapéuticamente activo. Estos procedimientos pueden implicar
mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes como
resulte más apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que
la forma y el carácter del carácter o el diluyente farmacéuticamente
aceptable están dictados por la cantidad del ingrediente activo con
el cual se tiene que combinar, la vía de administración y otras
variables bien conocidas. El(los) vehículo(s)
debe(n) de ser "aceptable(s)" en el sentido de
ser compatible(s) con los otros ingredientes de la
formulación y no perjudicial para el receptor de la misma.
El vehículo farmacéutico empleado puede ser, por
ejemplo, tanto sólido como líquido. Ejemplos de vehículos sólidos
son lactosa, caolín, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma
arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares.
Ejemplos de vehículos líquidos son jarabe, aceite de cacahuete,
aceite de oliva, agua y similares. De forma similar, el vehículo o
el diluyente puede incluir material para liberación retardada bien
conocido en la técnica, como el monoestereato de glicerilo o
diestearato de glicerilo solo o con una cera.
Se puede emplear una amplia variedad de formas
farmacéuticas. Así, si se utiliza un vehículo sólido, la preparación
se puede comprimir, colocar en una cápsula de gelatina dura en
forma de polvo o en forma de sedimento o en forma de un trocisco o
pastilla. La cantidad del vehículo sólido variará ampliamente, pero
preferiblemente será de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1
g. Cuando se utiliza un vehículo líquido, por regla general la
preparación será en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de
gelatina suave, líquido inyectable estéril como una ampolla o una
suspensión líquida no acuosa.
Los compuestos de fórmula (I) se pueden
administrar no sistémicamente (a saber, el compuesto no entra
significativamente en el torrente circulatorio), como por vía
tópica. Esto incluye la aplicación de un compuesto de fórmula (I)
externamente a la epidermis o la cavidad bucal y la instilación de
tal compuesto en el oído, el ojo y la nariz, de tal forma que el
compuesto no entre significativamente en el torrente
circulatorio.
Formas farmacéuticas adecuadas para
administración tópica incluyen las preparaciones líquidas o
semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel
hasta la localización de la enfermedad/inflamación, como
linimentos, lociones, cremas, ungüentos o pastas, y gotas adecuadas
para la administración en el ojo, el oído o la nariz. El
ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica,
del 0,001% al 10% p/p, por ejemplo, del 1% al 2% del peso de la
forma farmacéutica. Mientras que puede comprender como mucho el 10%
p/p, preferiblemente comprenderá menos del 5% p/p, más
preferiblemente del 0,1% al 1% p/p de la forma farmacéutica.
Las lociones de acuerdo con la presente
invención incluyen aquéllas adecuadas para la aplicación en la piel
o el ojo. Una loción para el ojo puede comprender una disolución
acuosa estéril que contenga opcionalmente un bactericida y se puede
preparar por métodos similares a los utilizados para la preparación
de gotas. Las lociones o linimentos para la aplicación en la piel
también pueden incluir un agente para acelerar el secado y para
enfriar la piel, como un alcohol o acetona, y/o un humectante como
el glicerol o un aceite como el aceite de ricino o aceite de
cacahuete.
Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo con la
presente invención son formas farmacéuticas semisólidas del
ingrediente activo para aplicación externa. Pueden fabricarse
mezclando el ingrediente activo en una forma finamente dividida o
en polvo, sola o en disolución o suspensión en un líquido acuoso o
no acuoso, con la ayuda de una maquinaria adecuada, con una base
grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos como la
vaselina sólida, espesa o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón
metálico; un mucílago; un aceite de origen natural como el aceite
de almendra, de maíz, de cacahuete, de ricino o de oliva; grasa
lanosa o sus derivados o un ácido graso como el ácido esteárico o
ácido oleico junto con un alcohol como el propilenglicol o un
macrogel. La forma farmacéutica puede incorporar cualquier
surfactante como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico
como un éster de sorbitano o un derivado de polioxietileno del
mismo. También se pueden incluir agentes suspensores como las gomas
naturales, los derivados de celulosa o los materiales inorgánicos
como sílices silicáceos y otros ingredientes como lanolina.
Las gotas de acuerdo con la presente invención
pueden comprender disoluciones o suspensiones acuosas o aceitosas
estériles y se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en
una disolución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o
fungicida y/o cualquier otro conservador adecuado y,
preferiblemente, incluye un surfactante. Luego, la disolución
resultante puede depurarse por filtración, transferirse a un
contenedor adecuado que, luego, se sella y se esteriliza en un
autoclave o se mantiene a 98-100ºC durante media
hora. Alternativamente, la disolución puede esterilizarse por
filtración y transferirse al contenedor mediante una técnica
aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas o fungicidas adecuados
para inclusión en las gotas son el nitrato o acetato fenilmercúrico
(0,002%), el cloruro de benzalconio (0,01%) y el acetato de
clorhexidina (0,01%). Los disolventes adecuados para preparar una
disolución aceitosa incluyen glicerol, alcohol diluido y
propilenglicol.
Los compuestos de fórmula (I) se pueden
administrar sistémicamente, p. ej., oral o parenteralmente (es
decir, mediante administración intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intranasal, intrarrectal, intravaginal o
intraperitoneal). Por lo general, se prefieren las formas
subcutáneas e intramusculares de administración parenteral. Las
formas farmacéuticas adecuadas para tal administración se pueden
preparar mediante técnicas convencionales. Los compuestos de
fórmula (I) también se pueden administrar mediante inhalación, es
decir, mediante administración intranasal o inhalación oral. Las
formas farmacéuticas adecuadas para tal administración, como una
forma farmacéutica de aerosol o un inhalador de dosis medida, se
pueden preparar mediante técnicas convencionales. Las formas
farmacéuticas adecuadas para otra administración oral se pueden
preparar mediante técnicas convencionales.
Los compuestos de fórmula (I) se administran en
una cantidad suficiente para inhibir la actividad del receptor Tie2
de tal forma que se regule hasta unos niveles normales, o en algunos
casos hasta niveles subnormales, para mejorar o prevenir el estado
de la enfermedad.
Para todos los métodos de uso descritos en la
presente memoria para los compuestos de fórmula (I), la posología
de dosis oral diaria será preferiblemente de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal total, preferiblemente de
aproximadamente 0,1 a 30 mg/kg, más preferiblemente de
aproximadamente 0,5 mg a 15 mg. La posología de la dosis parenteral
diaria será de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 80 mg/kg de
masa corporal total, preferiblemente de aproximadamente 0,2 a
aproximadamente 30 mg/kg y, más preferiblemente, de aproximadamente
0,5 a 15 mg/kg. La posología de la dosis tópica diaria será
preferiblemente de 0,1 mg a 150 mg, administrada de una a cuatro,
preferiblemente de dos a tres, veces al día. La posología de la
dosis de inhalación diaria será preferiblemente de aproximadamente
0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg por día. El experto en la
técnica también se dará cuenta de que la cantidad óptima y el
espaciado de las dosis individuales de un compuesto de fórmula (I)
estarán determinados por la naturaleza y la extensión de la
enfermedad a tratar, la forma farmacéutica, la vía y el sitio de
administración, y el paciente concreto a tratar, y que tales óptimos
se pueden determinar mediante técnicas convencionales. El experto
en la técnica también se dará cuenta de que el trascurso óptimo del
tratamiento, a saber, el número de dosis de un compuesto de fórmula
(I) dadas por día durante un número definido de días, lo pueden
averiguar los expertos en la técnica con el trascurso convencional
de las pruebas de determinación para el tratamiento.
No se esperan efectos tóxicos cuando un
compuesto de la invención se administra en el intervalo de dosis
mencionado anteriormente.
A continuación, se describirá la invención por
referencia a los siguientes ejemplos que son simplemente
ilustrativos y que no se deben considerar como una limitación del
alcance de la presente invención.
Todas las temperaturas se dan en grados
centígrados (ºC), todos los disolventes son de la mayor pureza
disponible y todas las reacciones se llevan a cabo en condiciones
anhidras en una atmósfera de argón a menos que se indique de otra
manera. Los espectros de masa se realizaron en un espectrómetro de
masas VG Zab con bombardeo de átomos rápido o un espectrómetro de
masas de ionización por electropulverización sobre plataformas de
micromasa en el modo de iones positivos usando
CH_{3}CN/CH_{3}OH 95:5 con ácido fórmico al 1% como el
disolvente del vehículo, a menos que se indique de otra manera. Los
espectros de ^{1}H-RMN (de aquí en adelante
"RMN") se registraron a 250 MHz con un espectrómetro Bruker AM
250 o Am 400. Las multiplicidades indicadas son: s = singulete, d =
doblete, t = triplete, q = cuadruplete, m = multiplete y br indica
una señal amplia. Sat. indica una disolución saturada, eq indica la
proporción de un equivalente molar del reactivo respecto al
reactante principal. La cromatografía flash se lleva a cabo en un
gel de sílice 60 de Merck (230 - 400 de malla).
En este y en otros ejemplos, se prepara mediante
el método descrito por Turner, J. A., J. Org. Chem. 1983, 48,
3401.
Se combinan
4-aminonicotinaldehído (100 mg, 0,78 milimoles (de
aquí en adelante "mmol")),
2,6-diclorofenilacetonitrilo (217 mg, 1,2 mmol),
solución acuosa de NaOH al 10% (0,10 ml, 0,25 mmol) y 700 \mul de
etanol absoluto, y se calientan a 65ºC durante 24 horas (de aquí en
adelante "h"). La mezcla de reacción se enfría a temperatura
ambiente y los disolventes se evaporan a baja presión. El residuo se
diluye con 700 \mul de DMSO, se filtra y se purifica por
cromatografía de fase inversa preparativa para dar el compuesto del
título como un sólido amarillo (191 mg, rendimiento del 84%). MS
ES^{+} m/z = 290.
Se disuelven
3-[2,6-diclorofenil]-1,6-naftiridin-2-amina
(51 mg, 4,176 mmol) e isocianato de t-butilo (17
mg, 0,176 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Se añade NaH [dispersión
al 60% en aceite mineral (7 mg, 0,176 mmol)] y se agita durante 24
h. La reacción se filtra y se lava con DMF (1 ml). El residuo se
concentra y se purifica mediante cromatografía sobre gel de sílice
y se eluye con 25:1 en CH_{2}Cl_{2}:MeOH para dar el compuesto
del título como un sólido blanco (25 mg, rendimiento del 36%). MS
ES^{+} m/z = 390. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 9,32 (s, 1H),
8,72 (m, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,55 (m, 3H), 1,50 (s,
9H).
Los ejemplos 2 a 79 se preparan como en el
ejemplo 1, salvo que el nitrilo y/o el isocianato varían en los
procedimientos (b) y/o (c) como se indica más abajo.
Ej.
2
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 349 (M+H).
Ej.
3
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 327 (M+H).
Ej.
4
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 373 (M+H).
Ej.
5
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 349 (M+H).
Ej.
6
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-piridilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 322 (M+H).
\newpage
Ej.
7
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 351 (M+H).
Ej.
8
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 357 (M+H).
Ej.
9
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
5-acetil-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 369 (M+H).
Ej.
10
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b. LC/MS ES^{+} m/z = 335 (M+H).
Ej.
11
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 375 (M+H).
Ej.
12
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3-(5-dimetilamino-[1,3,4]oxadiazol)acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el
procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 382 (M+H).
Ej.
13
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 353 (M+H).
Ej.
14
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el
procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 399 (M+H).
Ej.
15
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 375 (M+H).
\newpage
Ej.
16
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 377 (M+H).
Ej.
17
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 399 (M+H).
Ej.
18
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 395 (M+H).
Ej.
19
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de ciclohexilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 361 (M+H).
Ej.
20
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3-(5-dimetilamino-[1,3,4]oxadiazol)acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-acetilfenilo en el procedimiento c. LC/MS ES^{+}
m/z = 418 (M+H).
Ej.
21
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 389 (M+H).
Ej.
22
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3,5-bis-trifluorometilfenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-acetilfenilo en el procedimiento c. LC/MS ES^{+}
m/z = 519 (M+H).
Ej.
23
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-acetilfenilo en procedimientos. LC/MS ES^{+}
m/z = 435 (M+H).
Ej.
24
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 411 (M+H).
\newpage
Ej.
25
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-piridilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 384 (M+H).
Ej.
26
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 413 (M+H).
Ej.
27
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 419 (M+H).
Ej.
28
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 431 (M+H).
Ej.
29
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 3-acetilfenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 397 (M+H).
Ej.
30
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 421 (M+H).
Ej.
31
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3-(5-dimetilamino-[1,3,4]oxadiazol)acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 428 (M+H).
Ej.
32
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 399 (M+H).
Ej.
33
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3,5-bis-trifluorometilfenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 529 (M+H).
\newpage
Ej.
34
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 445 (M+H).
Ej.
35
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 421 (M+H).
Ej.
36
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 423 (M+H).
Ej.
37
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 429 (M+H).
Ej.
38
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 441 (M+H).
Ej.
39
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de
3-cloro-4-fluorofenilo
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 407 (M+H).
Ej.
40
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 377 (M+H).
Ej.
41
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3-(5-dimetilamino-[-1,3,4]oxadiazol)acetonitrilo
en el procedimiento b y 2-isocianato de
tetrahidropirano en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z =
384 (M+H).
Ej.
42
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 355 (M+H).
\newpage
Ej.
43
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3,5-bis-trifluorometilfenil-acetonitrilo
en el procedimiento b y 2-isocianato de
tetrahidropirano en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z =
385 (M+H).
Ej.
44
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b y 2-isocianato de
tetrahidropirano en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z =
401 (M+H).
Ej.
45
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,3-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 377 (M+H).
Ej.
46
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-piridilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 350 (M+H).
Ej.
47
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 379 (M+H).
Ej.
48
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 385 (M+H).
Ej.
49
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b y 2-isocianato de tetrahidropirano
en el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 363 (M+H).
Ej.
50
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 321 (M+H).
Ej.
51
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 299 (M+H).
\newpage
Ej.
52
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3,5-bis-trifluorometilfenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 429 (M+H).
Ej.
53
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 345 (M+H).
Ej.
54
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 321 (M+H).
Ej.
55
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 294 (M+H).
Ej.
56
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 323 (M+H).
Ej.
57
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 329 (M+H).
Ej.
58
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 341 (M+H).
Ej.
59
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de etilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 307 (M+H).
Ej.
60
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 387 (M+H).
\newpage
Ej.
61
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3-(5-dimetilamino-[1,3,4]oxadiazol)acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
4-fluorofenilo en el procedimiento c. LC/MS ES^{+}
m/z = 394 (M+H).
Ej.
62
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 365 (M+H).
Ej.
63
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de
4-fluorofenilo en el procedimiento c. LC/MS ES^{+}
m/z = 411 (M+H).
Ej.
64
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 387 (M+H).
Ej.
65
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-piridilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 360 (M+H).
Ej.
66
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 389 (M+H).
Ej.
67
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 395 (M+H).
Ej.
68
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 407 (M+H).
Ej.
69
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-metilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de 4-fluorofenilo en
el procedimiento c. LC/MS ES^{+} m/z = 373 (M+H).
\newpage
Ej.
70
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,5-dimetilfenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 307 (M+H).
Ej.
71
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3-tiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 285 (M+H).
Ej.
72
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
3,5-bis-trifluorometilfenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 415 (M+H).
Ej.
73
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del
2-cloro-6-fluorofenil-acetonitrilo
en el procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c.
LC/MS ES^{+} m/z = 331 (M+H).
Ej.
74
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2,5-dimetifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 307 (M+H).
Ej.
75
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 2-metoxifenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 309 (M+H).
Ej.
76
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 3,4-difluorofenilacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 315 (M+H).
Ej.
77
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 327 (M+H).
Ej.
78
Mismo procedimiento que en el ejemplo 1 b y c,
salvo el uso del 5-acetiltiofenoacetonitrilo en el
procedimiento b e isocianato de metilo en el procedimiento c. LC/MS
ES^{+} m/z = 293 (M+H).
\newpage
Se utiliza un clon parcial del ADNc del receptor
Tie2 para fabricar una proteína para los estudios de la cinasa de
Tie. Para generar el análisis de detección primaria, se construye
una fusión, expresable en baculovirus, de GST con el dominio cinasa
de Tie2, y se expresa utilizando el vector comercial pAcG1
(Pharmingen).
Esta construcción final se transfecta en el
baculovirus y en los productos solubles fusionados a la GST se usan
para el análisis de detección. El trabajo anterior demuestra que se
puede usar la expresión en baculovirus de una fusión de GST con el
dominio cinasa de Tie2 murino para detectar las moléculas candidatas
diana o de señalización (Huang et al., Oncogene 11:
2097-2103, 1995).
Por regla general, el análisis de la actividad
de la cinasa de Tie2 se lleva a cabo de una de las dos maneras que
se describen a continuación. Pequeñas variaciones del análisis
ofrecen resultados similares.
- Tampón de cinasa (Tris-HCl a 20 mM, pH 7,0, NaCl a 100 mM, MgCl_{2} a 12 mM, DTT a 1 mM finales)
- Gamma ^{33}P-ATP (normalmente una cantidad final de 0,5-1 \muCi/pocillo)
- ATP (30 \muM finales u otra concentración deseada)
- Placa Flash (microplaca de poliestireno de 96 pocillos con los pocillos recubiertos de un plástico de centelleo)
- TopCount (contador de centelleo de microplacas)
- Encienda un agitador del incubador y ajuste la temperatura a 30ºC
- Añada 20 \mul de un tampón de cinasa a 3X por pocillo a la placa Flash.
- Añada 20 \mul de proteína por pocillo excepto para el fondo.
- Añada los compuestos de prueba, por regla general, de 1 a 2 \mul en soluciones de almacenamiento en DMSO.
- Añada 20 \mul de una mezcla de gamma^{33}P-ATP y ATP frío (por regla general, 1:1 v/v) por pocillo.
- El volumen total es de 60 \mul.
- Cubra con una película de poliéster transparente.
- Incube a 30°C durante dos horas en el agitador, o durante el tiempo deseado.
- Retire la placa Flash del agitador, lave cinco veces (por ejemplo, con 300 \mul de ATP a 10 \muM en PBS 1X por pocillo).
- Lea la placa en el TopCount u otro instrumento de recuento. Los resultados se calculan como % de inhibición y CI50, con los métodos de cálculo normales.
- HEPES a 50 mM, pH 7,5
- DMSO al 2% (en el caso de compuestos de detección)
- ATP a 250 \muM
- MgCl_{2} a 2 mM
- DTT a 1 mM
- Vanadato de sodio a 50 \muM
- Sustrato del péptido a 10 \muM
- Cinasa de Tie2 activada
- RFWKYEFWR-OH
- Masa molecular (sal de TFA) = 1873 Da
- Fabrique una solución madre 1 mM del péptido y almacénelo a -20°C.
- Diluya hasta 100 \muM justo antes de usarla.
- HEPES a 450 mM, pH 7,5
- NaCl a 900 mM
- Vanadato de sodio a 450 \muM
- MgCl_{2} a 18 mM
- DTT a 100 mM
Se puede fabricar con antelación y almacenar en
alícuotas a -20°C.
Fabrique una solución madre de ATP a 25 mM y
almacénela en alícuotas a -20°C hasta que se necesite. Dilúyala a
2,5 mM antes de usarla.
Condiciones del tampón final:
- Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5
- MgCl_{2} a 12 mM
- NaCl a 100 mM
- Vanadato de sodio a 20 \muM
- DTT a 1 mM
- ATP a 300 \muM
1. Incube la cinasa de Tie2 a 5 \muM en el ATP
300 \muM y las condiciones de tampón descritas anteriormente.
2. Déjelo incubando 2 horas a 27ºC.
3. Añada 2,5 ml de la mezcla de reacción de la
cinasa de Tie2 incubada a una columna de desalación
NAP-25 (Pharmacia Biotech n.º de catálogo
17-0852-02)
pre-equilibrada en Tris-HCl a 20 mM,
pH 7,5, NaCl_{2} a 100 mM para separar el ATP de la enzima.
4. Eluya la enzima con 5,0 ml de
Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5, NaCl_{2} a 100 mM; en
este punto, la concentración de la proteína debe ser 2,5
\muM.
5. Distribuya en alícuotas la enzima y
almacénela a -80ºC lo antes posible.
Para una reacción de 50 \mul, añada lo
siguiente a cada pocillo de un placa negra de 96 pocillos con la
mitad del área (Costar, n.º de catálogo 3694).
1. 5 \mul del compuesto de prueba en DMSO al
20%.
2. 5 \mul de un tampón de cinasa a 9X.
3. 5 \mul de ATP a 2,5 mM.
4. 5 \mul del sustrato del péptido a 100
\muM.
5. 25 \mul de una mezcla de detección de PTK
(Panvera, P-2652, 50 ml; el distribuidor de Gran
Bretaña es Cambridge Bioscience).
6. 5 \mul de la cinasa Tie2 activada
(protocolo de más abajo) diluidos en un tampón a 1X para iniciar la
reacción.
7. Lea la polarización sobre un instrumento de
FP ciclando durante 30 a 50 minutos de acuerdo con la actividad de
la enzima. La CI50 se puede determinar a partir del % de
polarización utilizando los métodos de cálculo normales.
Los compuestos de la invención tienen unas CI50
en un intervalo de 1 nanomolar a 10^{4} nanomolar, por regla
general en el intervalo de 700 a 10^{4} nanomolar.
Se cultivan células HEL (ATCC n.º TIB 180) entre
1 y 5 \times 10^{5} ml en el medio RPMI-1640
complementado con 2 mM de glutamina y FBS al 10% como un cultivo de
suspensión. Dieciséis a treinta y seis horas antes de un
experimento, el número de células necesario se pasa al medio
RPMI/FBS al 0,5%. El día del experimento, se recogen las células y
se resuspenden en una densidad de 0,5 a 1,0 x 10^{7} células/ml
FBS al 0,5%/RPMI y se inoculan a razón de 2-3
ml/pocillo en placas de seis pocillos.
Alternativamente, se pueden utilizar para este
análisis células endoteliales venosas umbilicales humanas (las
CEVUH) (Clonetics, Walkersville, MD). Las CEVUH entre los pases 2 y
12 se siembran en placas a 2 x10^{5} y 1 x 10^{6} células por
pocillo en una placa de seis pocillos en EGM complementado
(Clonetics). Después de 24 horas, los medios se cambian a EBM que
contiene ASB al 3% (Clonetics) y las células se cultivan durante
una noche y se utilizan para el análisis al día siguiente.
Las células se tratan con compuestos inhibidores
en concentraciones adecuadas durante 30 a 45 minutos. El contenido
de los pocillos se mezcla brevemente en un agitador oscilante
(aproximadamente 30 segundos) y, luego, se incuban a 37ºC. Luego,
las células se tratan con una fuente de ligando nativo, como un
medio acondicionado con suero o fibroblastos durante 10
minutos.
Al final del periodo de incubación de 10
minutos, se coloca la placa en hielo. Se recogen las células y se
retira el medio. Se lisan las células en un tampón de muestra
desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se sonica la
suspensión durante 5 pulsos ajustados a la mitad de la potencia y se
devuelve al hielo. El estado de fosforilación del receptor Tie2 se
determina mediante análisis de inmunotransferencia y detección
mediante un anticuerpo
anti-fosfo-Tie2, como se detalla más
abajo (Harlow, E., y Lane, D. P., Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nueva York, 1988).
Se migran 30 \mul del lisado en un gel de SDS/poliacrilamida al
7%. Luego, se transfiere el gel a una membrana de nitrocelulosa o de
PVDF como indican las instrucciones del fabricante para el análisis
de inmunotransferencia.
Las transferencias se lavan con
PBS/Tween-20 al 0,05% y, luego, se bloquean con ASB
al 3%/PBS/Tween durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las
transferencias se incuban con 1 \mug/ml de anticuerpo
anti-fosfo-Tie2 (SmithKline Beecham
o GlaxoSmithKline) en PBS/Tween al 0,05% durante 1 hora. Entonces,
se lava la transferencia 4 veces con PBS/Tween durante 5 minutos
cada una. Se incuba la transferencia con un anticuerpo secundario
conjugado anti-ratón-HRP en la
dilución recomendada por el fabricante, en PBS/Tween durante 1 hora.
Se lava la transferencia en PBS/Tween, 4 veces durante 5 minutos
cada una. Después del último lavado, se revela la transferencia
mediante el método de ECL (Amersham) u otro método equivalente.
Con un densitómetro o un programa de gráficos
(p. ej., ImageQuant de Molecular Dynamics), se explora cada
transferencia. La banda de Tie2 se aísla y se encuadra en cada
calle. Se analiza el volumen de píxeles o la medición comparable de
cada muestra. También, se determina una región de fondo adecuada de
las mismas dimensiones para cada muestra. Después de ajustar el
fondo, se expresa la fosforilación como la proporción de tinción de
fosfotirosina, respecto al control sin tratar. La disminución de la
fosforilación indica la inhibición de la cinasa de Tie2.
Lo que se describe más abajo es un modelo de
angiogénesis inflamatoria utilizado para mostrar que la inhibición
de Tie2 parará la destrucción del tejido de una proliferación de los
vasos sanguíneos excesiva, inadecuada o indeseable. El modelo de
inflamación crónica de granuloma de bolsa de aire murino (Kimura
et al., 1985, J. Pharmacobio-Dyn., 8:
393-400; Colville-Nash et
al.,1995, J. Pharm. and Exp. Ther., 274:
1463-1472) cuya descripción se incorpora en la
presente memoria en su totalidad por referencia, se caracteriza por
la afluencia de células inflamatorias, la proliferación del tejido
fibroso y la angiogénesis intensa. Es representativo de la
angiogénesis inflamatoria y demuestra que el componente angiogénico
se puede modular farmacológicamente de forma independiente del
crecimiento y el tamaño del granuloma. Además, la angiogénesis se
puede cuantificar con precisión mediante un método de
fundido
vascular.
vascular.
Día -1: se anestesian ratones con gas Aerrane
(isoflurano) (5%) u otros métodos aprobados, tras el cual se
inyectan 3 ml de aire en el tejido subcutáneo dorsal con una aguja
de 27 g. Se deja que los ratones se recuperen.
Día 0: de nuevo se anestesian los ratones con
Aerrane u otros métodos aprobados; una vez anestesiados, se
inyectan 0,5 ml de adyuvante completo de Freunds con aceite de
crotón al 0,1% v/v en la bolsa de aire formada el día -1. Los
animales también comienzan su pauta de dosificación (el número de
días depende del estudio) con los animales que por regla general
reciben el compuesto en 0,2 ml de
N,N-dimetil-acetoacetamida (DMA)
(Sigma, St. Louis, Mo.)/Cremephor El (Sigma, St. Louis, Mo.),
disolución salina (10/10/80) u otro vehículo adecuado. Se deja que
los animales se recuperen y toda la dosificación posterior en los
animales se realiza sin anestesia.
Días 1 a 5: los animales reciben la dosis de
acuerdo con la programación.
Día 6: de nuevo se anestesian los animales tras
lo cual se les realiza un fundido vascular (Kimura et al.,
1986, J.Pharmacobio-Dyn., 9:
442-446); esto implica una inyección i. v. en la
vena de la cola de 1 ml de una disolución de rojo carmín (10%)
(Sigma, St. Louis, Mo.) /-gelatina (5%) (Sigma, St. Louis, Mo.).
Luego, se sacrifican los animales con una dosis mortal de anestesia
y se enfrían a 4ºC durante 2 horas, antes de retirar el tejido del
granuloma.
Cuando se retira el granuloma, se pesa y, a
continuación, se seca durante 3 días a 45ºC y se vuelve a pesar.
Luego, el tejido secado se digiere en 0,9 ml de un tampón fosfato a
0,05 M, pH 7,0 que contiene 12 U ml^{-1} de papaína (Sigma, St.
Louis, Mo.) y 0,33 g l^{-1} de
N-acetil-1-cisteína
(Sigma, St. Louis, Mo.) a 57°C durante 3 días. Después de 3 días de
digestión, el rojo carmín se solubiliza añadiendo 0,1 ml de NaOH a 5
mM. Se centrifugan las muestras y, luego, se filtran con acrodiscos
de 0,2 \mum. Entonces, el contenido de carmín se determina en una
curva estándar de rojo carmín (de 0,5 a 2 mg/ml) generada en tejido
extraído de los animales tratados sin carmín y se lee a 490 nm. La
muestra y los valores estándares se determinan por regla general
con el software de análisis Elisa de DeltaSoft (Biometallics Inc.,
Princeton, NJ). Luego, el contenido de carmín se utiliza para
determinar los índices vasculares de los distintos tratamientos,
siendo el índice vascular los mg de tinte de carmín/gramo de tejido
seco.
El efecto de los compuestos en la densidad
vascular por regla general se mide 6 días después de la inducción
del granuloma. Este punto de tiempo se ha determinado que está en el
pico de angiogénesis o cerca de él. Como un control positivo, se
utiliza medroxiprogesterona, un esteroide angioestático (Gross et
al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:
1176-1180), cuya descripción se incorpora por la
presente por referencia en su totalidad. Este control demuestra una
disminución máxima del 50% en este modelo. La medroxiprogesterona no
tiene ningún efecto sobre el tamaño del granuloma cuando se mide
mediante el peso seco.
Se realiza un modelo de angiogénesis in
vivo colocando un gel de matriz extracelular por debajo de la
piel de un ratón durante aproximadamente una semana y, entonces, se
emplean varias mediciones para cuantificar la invasión angiogénica
del gel (Biancone, L, et. al. Development of Inflammatory
Angiogenesis by Local Stimulation of Fas In Vivo. J. Exp.
Med. 186: 147, 1997). Brevemente, el factor de disminución del
crecimiento, el Matrigel® sin endotoxina
(Becton-Dickinson, Bedford, MA), es un gel a bajas
temperaturas. Se mezclan anticuerpos o agentes angiogénicos
conocidos con el gel, de tal forma que no constituyan más del 2% del
volumen total. A los ratones hembra C57 de ocho semanas edad o más
se les administran 0,5 ml del Matrigel® mediante una inyección
subcutánea dorsal por medio de jeringuillas enfriadas. A la
temperatura fisiológica, el Matrigel® líquido rápidamente forma un
gel sólido y consistente. Durante el trascurso del experimento, los
ratones reciben compuestos de prueba o controles administrados como
se describe más arriba. Después de seis días, se sacrifican los
ratones y se recuperan los bloques de Matrigel®. Se cuantifica la
angiogénesis analizando el contenido de hemoglobina del gel
mediante el método de Drabkin (Drabkin, D. L. y Austin, J. H.:
Spectrophotometric Studies IL Preparations from washed blood cells;
nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. J Biol Chem 112:
51,1933) (Sigma, St. Louis, MO), o tiñendo y cuantificando los
vasos sanguíneos con tinción con CD31 como se describió
anteriormente.
Todas las publicaciones, incluidas, pero sin
limitarse a ellas, las patentes y las solicitudes de patentes,
citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente
memoria por referencia como si cada publicación individual
estuviera específicamente e individualmente indicada para
incorporarse por referencia en la presente memoria como si se
presentara en su totalidad.
La descripción de arriba describe totalmente la
invención, incluidas las realizaciones preferidas de la misma. Las
modificaciones y las mejoras de las realizaciones específicamente
descritas en la presente memoria se encuentran dentro del alcance
de las siguientes reivindicaciones. Sin más elaboración, se cree que
el experto en la técnica puede, con la descripción precedente,
utilizar la presente invención en su extensión más amplia. Por lo
tanto, los ejemplos en la presente memoria se deben considerar como
simplemente ilustrativos y de ningún modo una limitación del
alcance de la presente invención. Las realizaciones de la invención
en las que se reivindica una propiedad o privilegio se definen como
sigue.
Claims (18)
1. Un compuesto de fórmula (I) y las sales,
solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables del mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el
que:
R1 se selecciona del grupo que consiste en
arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico,
heterociclicalquilo, aroílo y alcanoílo;
R2 se selecciona del grupo que consiste en H,
alquilo(C_{1}-C_{10}), cicloalquilo,
arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterocíclico,
heterociclicalquilo, alquenilo, cicloalquenilo y alquinilo; y
en el que R1 y R2 pueden estar de forma
independiente opcionalmente sustituidos con uno o más grupos
seleccionados de la lista:
- \bullet
- halógeno;
- \bullet
- hidroxi;
- \bullet
- alquilo(C_{1-}C_{10}) sustituido con hidroxi;
- \bullet
- alcoxi(C_{1-}C_{10});
- \bullet
- alquilo S(O)_{m}, en el que m es 0, 1 ó 2;
- \bullet
- amino;
- \bullet
- amino monosustituido;
- \bullet
- amino disustituido;
- \bullet
- alquilo(C_{1-}C_{10});
- \bullet
- cicloalquilo;
- \bullet
- cicloalquil-alquilo;
- \bullet
- alquilo C_{1-}C_{10}) halosustituido;
- \bullet
- arilo, o aralquilo, en el que los restos de arilo también pueden estar sustituidos de una a dos veces con halógeno, hidroxi, alquilo sustituido con hidroxi, alcoxi(C_{1-}C_{10}), alquilo S(O)_{m}, amino, amino monosustituido, amino disustituido, alquilo(C_{1-}C_{10}) o alquilo(C_{1-}C_{10}) halosustituido;
- \bullet
- alquenilo;
- \bullet
- alquinilo;
en el que
- \bullet
- "alquilo(C_{1}-C_{10})" o "alquilo" significan radicales de cadena lineal o ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otra manera; "cicloalquilo" significa radicales carbocíclicos de 3 a 8 átomos de carbono; "cicloalquilo" significa radicales carbocíclicos;
- \bullet
- "arilo" significa fenilo y naftilo;
- \bullet
- "heteroarilo" (por sí mismo o en combinación, como "heteroarilalquilo") significa un sistema de anillos aromáticos de 5 a -10 átomos en el que uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, o S;
- \bullet
- "heterocíclico" significa un sistema de anillos de 4 a 10 átomos saturado o parcialmente insaturado en el que uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionado del grupo que consiste en N, O o S;
- \bullet
- "aralquilo" o "heteroarilalquilo" o "heterociclicalquilo" significa alquilo(C_{1-}C_{4}) como se definió anteriormente unido a un resto arilo, heteroarilo o heterocíclico como se definió anteriormente;
- \bullet
- "aroílo" significa un C(O)Ar, en el que Ar es un derivado de fenilo, naftilo o aril-alquilo como se definió anteriormente.
- \bullet
- "alcanoílo" significa un C(O)alquilo(C_{1}-C_{10}) en el que el alquilo es como se definió anteriormente.
- \bullet
- "alquenilo" significa un radical de cadena lineal o ramificada de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otra manera, que tiene, al menos, un doble enlace carbono-carbono;
- \bullet
- "cicloalquenilo" significa un radical cíclico, de 5 a 8 átomos de carbono que tiene, al menos, un doble enlace carbono-carbono;
- \bullet
- "alquinilo" significa un radical de cadena lineal o ramificada de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que la longitud de la cadena esté limitada de otra manera, que tiene, al menos, un triple enlace carbono-carbono;
- \bullet
- "halo" o "halógeno" significa los halógenos: cloro, fluoro, bromo y yodo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en arilo,
arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en fenilo,
tiofeno, piridinilo y pirazol, que puede estar sustituido o sin
sustituir.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R1 es fenilo sustituido.
5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que los grupos sustituyentes
de R1 se seleccionan de alquilo(C_{1-}C_{10}), halo,
alquilo(C_{1-}C_{10}) halosustituido,
alcoxi(C_{1-}C_{10}), amino, amino monosustituido, y
amino disustituido.
6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que los grupos sustituyentes
de R1 se seleccionan de metilo, fluoro, cloro, CF_{3}, metoxi, y
dimetil amino.
7. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que R2 se selecciona del
grupo que consiste en
alquilo(C_{1}-C_{10}), cicloalquilo,
arilo y heterocíclico, que puede estar sustituido o sin
sustituir.
8. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que R2 se selecciona del
grupo que consiste en
alquilo(C_{1}-C_{10}), cicloalquilo,
arilo sustituido y heterocíclico.
9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que R2 se selecciona del
grupo que consiste en metilo, etilo terc-butilo,
ciclohexilo, fenilo sustituido y pirano.
10. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R1 es fenilo sustituido y R2 se
selecciona del grupo que consiste en
alquilo(C_{1}-C_{10}), cicloalquilo y
heterocíclico.
11. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que R2 se selecciona del grupo que consiste
en alquilo(C_{1-}C_{4}), ciclohexilo y
tetrahidropiranilo.
12. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 10 u 11, en la que los grupos sustituyentes de R1 se
seleccionan de halo y alquilo(C_{1-}C_{4}).
13. Un compuesto seleccionado del grupo que
consiste en:
3-[2,6-diclorofenil]-1,6-naftiridin-2'-2-[N'-(1,1-dimetiletil)urea];
1-terc-butil-3-[3-(2-cloro-6-fluorofenil)-[1,6]naftiridin-2-il]urea;
1-[3-(2-cloro-6-fluorofenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-(tetrahidropiran-2-il)urea;
1-terc-butil-3-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin-2-il]urea;
1-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-etilurea;
y
1-[3-(2,5-dimetilfenil)-[1,6]naftiridin-2-il]-3-(tetrahidropiran-2-il)urea
14. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz y no tóxica de un compuesto de una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores y un excipiente o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
15. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 para usarse en el tratamiento de una
enfermedad mediada por TIE en un mamífero.
16. Uso de un compuesto de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para fabricar un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por TIE en
un mamífero.
17. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 para usarse en el tratamiento de una
enfermedad caracterizada por una angiogénesis excesiva,
inadecuada o indeseable en un mamífero.
18. Uso de un compuesto de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para fabricar un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad
caracterizada por una angiogénesis excesiva, inadecuada o
indeseable en un mamífero.
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