JP2004521118A - 新規化合物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、哺乳動物における、不適当、過剰または望ましくない血管形成が起こっている疾患および/または過剰のTie2受容体活性が起こっている疾患の治療法に関する。
【背景技術】
【0002】
慢性増殖性疾患は、炎症および/または増殖性状態に寄与するか、またはこれを維持するか、あるいは血管の侵襲性増殖による組織破壊につながる明らかな血管形成を伴う(Folkman,EXS79:1−8,1997;Folkman,Nature Medicine1:27−31,1995;Folkman and Shing,J.Biol.Chem.267:10931,1992)。
血管形成は一般に新規または置換血管の発生を説明するために用いられる。これは必要かつ生理学的に正常なプロセスであり、これにより血管系が胚において確立される。排卵、月経、および創傷治癒の部位を除いて、ほとんどの正常な成人組織において一般に血管形成は起こらない。しかしながら、多くの疾患は、持続的で無秩序な血管形成により特徴づけられる。例えば、関節炎において、新規毛細血管は関節に侵入し、軟骨を破壊する(Colville−Nash and Scott,Ann.Rheum.Dis.,51,919,1992)。糖尿病(および多くの異なる眼病)において、新規血管は黄斑または網膜または他の眼構造に侵入し、失明を引き起こす可能性がある(Brooksら、Cell,79,1157,1994)。アテローム性動脈硬化症のプロセスは血管形成と関連する(Kahlonら、Can.J.Cardiol.8,60,1992)。腫瘍成長および転移は血管形成依存性であることが判明している(Folkman,Cancer Biol,3,65,1992;Denekamp,Br.J.Rad.66,181,1993;Fidler and Ellis,Cell,79,185,1994)。
【0003】
血管形成の阻害物質を同定および開発するための研究にともなって、血管形成の主な疾患における関与は認識されてきた。これらの阻害物質は一般に血管形成カスケードにおける別個の標的に応じて;例えば、血管形成シグナルによる内皮細胞の活性化;分解酵素の合成および放出;内皮細胞移動;内皮細胞の増殖;および毛細管の形成に応じて分類される。従って、血管形成は多くの段階において起こり、これら様々な段階での血管形成をブロックするために作用する化合物を発見し、開発する試みが進行中である。
様々なメカニズムにより作用する血管形成の阻害物質がガンおよび転移(O’Reillyら、Cell,79,315,1994;Ingberら、Nature,348,555,1990)、眼病(Friedlanderら、Science,270,1500,1995)、関節炎(Peacockら、J.Exp.Med.175,1135,1992;Peacockら、Cell,Immun.160,178,1995)および血管腫(Tarabolettiら、J.Natl.Cancer Inst.87,293,1995)。
【0004】
血管形成シグナルは特定のリガンドとその受容体との相互作用から生じる。Tie1およびTie2受容体は、シグナル貫膜、チロシンキナーゼ受容体である(TieはイムノグロブリンおよびEGFホモロジードメインを有するチロシンキナーゼ受容体を表す)。両方とも最近クローンされ、いくつかのグループにより報告された(Dumontら、Oncogene8:1293−1301、1993;Partanenら、Mol.Cell Biol.12:1698−1707,1992;Satoら、Oncogene8:1293−1301、1993;Partanenら、Mol.Cell Biol.12:1698−1707,1992;Satoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:9355−9358、1993)。
Tie受容体は、一つの推定膜貫通領域を有するおよそ125kDaのタンパク質である。これらの受容体の細胞外ドメインは、いくつかの領域に分類される:EGF−様ドメインにおいて見いだされるシステイン発現のパターンを有する3つの領域があり;イムノグロブリン様ドメインと弱い相同性を有し、構造的特徴を有する2つの領域があり;フィブロノネクチンIII繰り返し構造と相同性を有する3つの領域がある。細胞外ドメインのこの特定の組み合わせはTie受容体に特有である。Tie2の細胞内部分はFGF−R1、PDGF−Rおよびc−kitのキナーゼドメインと最も緊密に関連する(〜40%同一性)。Tie2の細胞内部分は、GXGXXG ATP結合部位コンセンサス配列および典型的なチロシンキナーゼモチーフ(すなわち、HRDLAARNおよびDFGL)を含むチロシンキナーゼの特徴の全てを含む。
【0005】
これらの受容体は、その発現において主に内皮細胞に限定される、血管内皮細胞成長因子(VEGF)以外の、唯一の受容体チロシンキナーゼであるので非常に興味深い。Tie2が血管形成において重要であることを示すいくつかの証拠があり、これは次の節で詳細に記載する。
a.Tie1およびTie2受容体位置
i.発生学的血管発生
胚におけるTie受容体の位置はインサイチュハイブリダイゼーションを用いて多くの研究者により研究されている。Korhonenら(Blood 80:2548−2555、1992)は、Tie受容体のmRNAは全ての血管を形成する内皮細胞およびマウス胚の心内膜に位置する。胚発生中、Tie受容体の発現は主なVEGF受容体、Flk−1の発現の次に、マウス胚発生中12〜24時間までに起こり、おそらくこのことはこれらの受容体システムの連続した異なる作用を示唆する(SchnurchおよびRisau、Development119:957−968,1993)。lacZ遺伝子と結合し、トランスジェニックマウスにおいて発現されたTie2の1.2Kbゲノム5’フランキング領域のクローニングは、胚発生中の内皮細胞における発現の選択的パターンを示した(Schlaegerら、Development121:1089−1098,1995)。従って、TieプロモーターはTie2の内皮細胞特異的発現を確実にするために作用する。
【0006】
ii.成人組織において
胚血管形成と異常な血管形成間の類似性から、腫瘍または慢性炎症環境においてTie機能をブロックすることは、例えば、血管形成をブロックし、従ってさらに細胞増殖をブロックし、治療的効果をもたらすという仮説がたてられる。TiemRNAは、肉芽組織における増殖毛細管が豊富なTiemRNAを含む活性な創傷治癒の部位を除いて成人の皮膚において観察できない(Korhonenら、Blood80:2548−2555,1992)。正常な皮膚から得られるcDNAのPCR増幅は、Tie受容体のシグナルを示さない(Kaipainenら、Cancer Res.54:6571−6577,1994)。対照的に、強力なシグナルが転移性黒色腫から得られるcDNAに関して見られ、インサイチュ研究によりこのシグナルは血管内皮に限定される。Tie受容体発現は確立された脈管構造において減少調節されるが、排卵中の卵巣、創傷および腫瘍(乳ガン、黒色腫および腎臓細胞癌)脈管構造においておこる血管形成においては、成人における血管形成が胚血管形成メカニズムを取り入れるという有力な見解と一致して増加調節される。
【0007】
b.Tieノックアウト動物
Tieノックアウトを有するか、または「優性阻害(dominant−negative)」Tie受容体をエンコードする導入遺伝子を有するホモ接合体マウスは、Tie受容体が胚発生に重要であることを確証した(Dumontら、Genes Dev.8:1897−1909,1994;Satoら、Nature376:70−74,1995)。これらのマウスにおける胚の死は、血管不全のために起こり、内皮細胞の数が非常に減少した。脈管形成(すなわち、内皮細胞の分化および血管のインサイチュ形成)はTie2のないマウスにおいて比較的正常であるように見える。その後の発生および再造形(その結果、血管枝の形成(血管形成)が起こる)は、Tie2突然変異マウス胚において非常に減少する。このように発生および血管形成がないと、実質的に成長、特に脳、神経管および心臓の成長が遅れ、その結果、生存能力が不足する。このことは、血管形成におけるTieの重要性を例示する。血管形成は多くの成長因子により調節されるので、このことは明らかである。興味深いことに、Flk(VEGF受容体)ノックアウトマウスは脈管形成において胚芽に致命的な欠陥を示し、これはTie2破壊よりも早く起こる。Tie受容体の破壊は、非常に異なり、後に欠陥表現型を生じ;マウス胚は、本来なら適格な血管系の不十分な統合性のために起こる出血のために発生の後期に死ぬ。併せて考えると、これらの研究は、VEGF/Flk1およびTieシステムは連続して作動し、Tie2は血管形成において重要な役割を果たすことを示唆している。
【0008】
c.Tie2リガンド
最近、Tie2受容体の2つのリガンドが報告されている。アンギオポエチン1は結合し、Tie2のチロシンリン酸化を誘発し、そのインビボでの発現は血管の発生と近接している(Davisら、Cell87:1161−1169,1996)。アンギオポエチン1が欠損するように操作されたマウスは、Tie2受容体のないマウスにおいてすでに見られるような脈管形成欠損を示し、このことはアンギオポエチン1がTie2の主な生理学的リガンドであり、Tie2は重要なインビボ血管形成作用を有することを示す(Suriら、Cell87:1171−1180,1996)。アンギオポエチン2は同一性スクリーニングにより同定され、Tie2受容体の天然に存在する拮抗物質であることが示された。アンギオポエチン2のトランスジェニック過剰発現は、マウス胚において血管形成を妨害する(Maisonpierreら、Science277:55−60,1997)。これらの結果はあわせて、血管形成におけるTie2受容体の役割を立証する。
【0009】
d.Tie阻害
血管形成におけるTie受容体の重要性に基づいて、Tie2キナーゼ活性の阻害は、血管形成を妨害し、疾患特異的治療効果をもたらすと予想される。最近、Linら(J.Clin.Invest.100:2072−2078,1997)は、外来的に投与された可溶性Tie2受容体が動物モデルにおいて血管形成および癌の増殖を阻害することを証明した。従って、他の手段によるTie2受容体の阻害、例えば、Tie2受容体キナーゼ活性の阻害は、血管形成を含む増殖性疾患において治療的有用性を有することが期待される。
本出願は、特定の構造を有する化合物はTie2受容体のキナーゼ活性、そのシグナル変換を阻害でき、従って血管形成のシグナルを阻害することにより増殖性疾患について有用であるという新たな知見を示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は新規化合物がTie2キナーゼを阻害でき、これらの化合物は過剰または不適当な血管形成により引き起こされる慢性炎症性または増殖性または血管形成疾患を治療するために血管形成を阻害するために用いることができるという発見である。Tie2受容体キナーゼ阻害剤として用いられる好ましい化合物は、本明細書に記載する式(I)の化合物(その医薬上許容される塩、水和物および溶媒和物を包含する)である。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明はTie受容体キナーゼ阻害剤の阻害と関連した疾患の治療において用いられる式(I)の新規化合物に関する。
従って、本発明は式(I)の化合物およびその医薬上許容される塩、溶媒和物、および水和物(以下、包括的に「式(I)の化合物」と称する):
【化1】
(I)
(式中:
R1はアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックアルキル、アロイル、およびアルカノイルからなる群から選択され;
R2は、H、C1−10アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され;
R1およびR2は独立して所望により置換されていてもよい)
を提供する。
【0012】
本明細書で用いられる場合、次の用語は以下のことを意味する;
・「C1−10アルキル」または「アルキル」−鎖の長さが限定されなければ、1〜10の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖ラジカルの両方を意味し、これらに限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、iso−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、およびn−ペンチルを包含する。
・「シクロアルキル」は本発明において、好ましくは3〜8個の炭素原子を有する炭素環式ラジカルを意味し、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを包含する。
・「アリール」−フェニルおよびナフチル。
・「ヘテロアリール」(それ自体または任意の組み合わせ、例えば、「ヘテロアリールオキシ」または「ヘテロアリールアルキル」において)−1またはそれ以上の環が1またはそれ以上のN、OまたはSからなる群から選択されるヘテロ原子を含む5〜10員芳香環系、例えば、これらに限定されないが、ピロール、ピラゾール、フラン、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キナゾリニル、ピリジン、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、イミダゾール、またはベンズイミダゾール。
・ヘテロサイクリック(それ自体または任意の組み合わせ、例えば、「ヘテロサイクリルアルキル」において)−1またはそれ以上の環がN、O、またはSからなる群から選択される1またはそれ以上のヘテロ原子を含む飽和または部分的不飽和4〜10員環系、例えば、これらに限定されないが、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロピラン、ピラン、またはイミダゾリジン。
・「アラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロサイクリックアルキル」は、本明細書において、特に明記しない限り、ベンジルおよびフェネチルを含む本明細書において定義されたアリール、ヘテロアリールまたはヘテロサイクリック部分に結合した前記定義のC1−4アルキルを意味する。
・「アロイル」−C(O)Ar(式中、Arはフェニル、ナフチル、または前記定義のようなアリールアルキル誘導体)。
・「アルカノイル」−C(O)C1−10アルキル(アルキルは前記定義の通りである)。
・「アルケニル」は、本明細書においてあらゆる場合において特に鎖長が限定されなければ、2〜10個の炭素原子を有し、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖ラジカルを意味し、これらに限定されないが、エテニル、1−プロペニル、2−プロペニル、2−メチル−1−プロペニル、1−ブテニル、および2−ブテニルを包含する。
・「シクロアルケニル」は、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有し、好ましくは5〜8個の炭素原子を有する環状ラジカルを意味し、これらに限定されないが、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルを包含する。
・「アルキニル」は、本明細書においてあらゆる場合に、特に鎖長が規定されない限り、2〜10個の炭素原子を有し、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖ラジカルを意味し、これらに限定されないが、プロピニル、1−ブチニル、および2−ブチニルを包含する。
・「ハロ」または「ハロゲン」は、ハロゲン:クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する。
【0013】
本明細書において用いられる場合、「置換されていてもよい」とは、特に定義しない限り、1またはそれ以上の基、例えば:
・ハロゲン(例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素);
・ヒドロキシ;
・ヒドロキシ置換C1−10アルキル;
・C1−10アルコキシ(例えば、メトキシまたはエトキシ);
・S(O)mアルキル(式中、mは0、1または2である)(例えば、メチルチオ、メチルスルフィニルまたはメチルスルホニル);
・アミノ;
・一置換アミノ(例えば、モノC1−6アルキル置換アミノ);
・二置換アミノ(例えば、ジ−C1−6アルキル置換アミノ);
・C1−10アルキル(例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、t−ブチルなど);
・シクロアルキル;
・シクロアルキルアルキル(例えば、シクロプロピルメチル);
・ハロ置換C1−10アルキル(例えばCF3);
・アリール(例えばフェニル)またはアラルキル(例えば、ベンジルまたはフェネチル)(ここにおいて、アリール部分は前記定義のハロゲン、ヒドロキシ、ヒドロキシ置換アルキル、C1−10アルコキシ、S(O)mアルキル、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、C1−10アルキル、またはハロ置換C1−10アルキルで1〜2回置換されていてもよい);
・アルケニル;
・アルキニル
で置換されている部分を意味する。
【0014】
R2がアルケニル、シクロアルケニル、またはアルキニルである場合、不飽和結合、すなわち、ビニレンまたはアセチレン結合は好ましくは窒素と直接結合しない。同様に、化合物がアルケニルまたはアルキニル置換基を含まない場合、ビニルまたはアセチレン結合は好ましくは該化合物中に存在し得る窒素、酸素または硫黄と直接結合しない。
R1は、好ましくは、置換または非置換アリール(さらに好ましくはフェニル)およびヘテロアリールから選択され、さらに好ましくは、置換フェニルである。R2は好ましくは、C1−10アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロサイクリックから選択される。例えば、R1は適当に置換されているかまたは置換されていないフェニル、チオフェン、ピリジニル、またはピラゾールである。このような置換されたR1の置換基は、さらに適当には1またはそれ以上、好ましくは1〜2の、C1−10アルキル(好ましくはメチル)、ハロ(好ましくはフルオロ、クロロ)、ハロ置換C1−10アルキル(好ましくはCF3)、C1−10アルコキシ(好ましくは、メトキシ)、アミノ、一置換アミノ、および二置換アミノ(好ましくはジメチルアミノ)から選択される基である。R1がフェニル誘導体である場合、置換基は、適当には、例えば、環の2−、3−、2,5−、2,6−、3,4−または3,5−位にある。R1がチオフェンまたはピラゾール誘導体である場合、置換基は、適当には、例えば環の2−位にある。
【0015】
例えば、R2は適当には、C1−10アルキル(好ましくはC1−4アルキル)、シクロアルキル、置換アリール(好ましくは置換フェニル)、およびヘテロサイクリックから選択される。さらに適当には、R2はメチル、エチル、tert−ブチル、シクロヘキシル、置換フェニルおよびピランからなる群から選択される。置換フェニルは、さらに適当には、1またはそれ以上、好ましくは1〜2個の、ハロ(好ましくはフルオロ、クロロ)、およびC1−10アルコキシ(好ましくはメトキシ)からなる群から選択される基で置換されている。R2がフェニル誘導体である場合、置換基は、適当には、例えば環の3−、4−、または3,4−位にある。
特に適当な化合物は、R1が置換フェニルであり、R2がC1−10アルキル、シクロアルキル、またはヘテロサイクリック、さらに好ましくは、C1−4アルキル(例えば、t−ブチル、メチル)、シクロヘキシル、またはテトラヒドロピラニルである化合物を包含する。このようなR1について好ましい置換基は、ハロ(例えば、クロロ、フルオロ)およびC1−4アルキル(例えば、メチル)、例えば、2,6−ジクロロ、2−クロロ−6−フルオロ、および2,5−ジメチルである。
【0016】
好ましいのは、次の化合物である:
3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2’−2−[N’−(1,1−ジメチルエチル)−尿素];
1−tert−ブチル−3−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素;
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素;
1−tert−ブチル−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素;
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素;および
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素。
【0017】
適当な医薬上許容される塩は当業者には周知であり、無機および有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、琥珀酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸、フェニル酢酸およびマンデル酸の塩基性塩を包含する。加えて、式(I)の化合物の医薬上許容される塩は、例えば置換基がカルボキシ部分を含むならば、医薬上許容されるカチオンを用いて形成することもできる。適当な医薬上許容されるカチオンは、当業者には周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンを包含する。
本発明の化合物は、立体異性体、レジオアイソマーまたはジアステレオマーとして存在し得ると認識される。これらの化合物は、1またはそれ以上の不斉炭素原子を有し、ラセミまたは光学的に活性な形態において存在し得る。これらの化合物の全ては、本発明の範囲に含まれる。
【0018】
合成法
以下で、本発明の化合物が容易に入手可能な出発物質からどのようにして調製できるかを説明する。
【化2】
文献(Hawes、E.M.;Gorecki、D.K.J.J.Heterocycl.Chem.1972,9(3)、703)の方法による置換アセトニトリルとの4−アミノニコチンアルデヒド(Turner,J.A.J.Org.Chem.1983,48,3401)の縮合により、2−アミノ−3−置換1,6−ナフチリジンが得られる。2−アミノ−3−置換1,6−ナフチリジン中間体の置換イソシアネートとの標準的条件下での反応により、2−ウレア−3−置換1,6−ナフチリジンが得られる。
式(I)の化合物の医薬上許容される酸付加塩は、公知方法、例えば、これを適当な溶媒の存在下、適当量の酸で処理することにより得ることができる。
【0019】
本発明の化合物は、過剰またはそうでなければ不適当または望ましくない血管形成により悪化または特徴づけられる疾患常態の治療または予防において用いることができる。本明細書において用いられる「過剰またはそうでなければ不適当または望ましくない血管形成」なる用語は、これらに限定されないが、血管腫および眼病により特徴づけられる疾患、組織増殖を伴う血管(脈管構造)増殖により特徴づけられる疾患、例えば癌、転移、関節炎、乾癬およびアテローム性動脈硬化症において起こるもの、眼血管新生、例えば、糖尿病性網膜症および黄斑変性、腫瘍増殖および転移、アテローム性動脈硬化症、およびある種の関節炎状態を包含する。本発明のTieチロシンキナーゼ受容体阻害剤は、これらの疾患常態の血管形成成分のブロッキングにおいて有用である。
本発明の化合物を療法において用いるためには、これは通常、標準的調剤例に従って医薬組成物に処方される。従って、本発明は有効かつ無毒量の式(I)の化合物とその医薬上許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物にも関する。
【0020】
式(I)の化合物、およびかかる化合物を組み入れた医薬組成物は、薬物投与に通常用いられる任意の経路、例えば、経口、局所、非経口または吸入により都合よく投与することができる。式(I)の化合物は、式(I)の化合物を標準的医薬担体と通常の手順に従って組み合わせることにより調製することができる。式(I)の化合物はまた、公知の第二の治療的に活性な化合物と組み合わせて通常の投与形態において投与することもできる。これらの手順は、成分を混合、顆粒化および圧縮し、または必要に応じて溶解して所望の製剤にすることを含む。医薬上許容される特性または希釈剤の形態および特徴は、組み合わせられる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数により規定されることは理解されるであろう。担体は、処方の他の成分と適合性であり、受容者に対して有害でないという意味で「許容」されなければならない。
用いられる医薬担体は、例えば、固体または液体のいずれかであってよい。固体担体の例は、ラクトース、白陶土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、水などである。同様に、担体または希釈剤は、当該分野に周知の遅延物質、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを単独またはワックスとともに含んでもよい。
【0021】
広範囲に及ぶ医薬形態を用いることができる。従って、固体担体が用いられる場合、製剤は、錠剤にするか、散剤またはペレット形態でハードゼラチンカプセル中に入れるか、あるいはトローチまたはロゼンジの形態にすることができる。固体担体の量は広範囲にわたって変化し得るが、好ましくは約25mgないし約1gである。液体担体を用いる場合、製剤は典型的にはシロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、滅菌注射可能な液体、例えばアンプルまたは非水性液体懸濁液の形態にされる。
式(I)の化合物は、非全身的(すなわち、化合物は著しく血液流中に侵入しない)、例えば、局所的に投与することができる。これは、式(I)の化合物を表皮または口腔に外部から適用すること、およびこのような化合物を耳、眼または鼻の中に滴下することを含み、該化合物が著しく血液流中に侵入しないようにする。
【0022】
局所投与に適した処方は、疾患/炎症の部位に対して皮膚を通して浸透するために適した液体または半液体製剤、例えば、リニメント、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および眼、耳または鼻への投与に適した滴剤を含む。活性成分は、局所投与については、処方の0.001%ないし10%w/w、例えば、1%ないし2重量%を構成する。処方の10%w/wまでであってもよいが、5%w/w以下、さらに好ましくは0.1%ないし1%w/wを構成する。
成する。
本発明のローションは、皮膚または眼への適用に適したものを含む。眼ローションは所望により殺菌剤を含んでもよい滅菌水性溶液を含んでもよく、滴剤の調製法と同様の方法により調製できる。皮膚へ適用するためのローションまたはリニメントは、乾燥を速め、皮膚を冷却する薬剤、例えば、アルコールまたはアセトン、および/またはモイスチャライザー、例えば、グリセロールまたは油、例えば、ヒマシ油または落花生油も含むことができる。
【0023】
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは、外部適用するための活性成分の半固体処方である。これらは、微粉砕または粉末化形態の活性成分を、単独あるいは水性または非水性液体中溶液または懸濁液中で、適当な機械の助けを借りて、グリース状または非グリース状基剤と混合することにより製造される。基剤は炭化水素、例えば、固体、液性または流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属セッケン;粘液;天然起源の油、例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油;羊毛脂またはその誘導体または脂肪酸、例えば、ステアリン酸またはオレイン酸をアルコール、例えばプロピレングリコールまたはマクロゲルとともに含んでもよい。処方は、任意の適当な界面活性剤、例えば、アニオン性、カチオン性または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を組み入れることができる。懸濁化剤、例えば、天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質、例えば、珪質シリカ、および他の成分、例えば、ラノリンも含めることができる。
【0024】
本発明の滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでもよく、活性成分を殺菌剤および/または殺真菌剤および/または任意の他の適当な防腐剤の適当な水性溶液中に溶解させることにより調製することができ、好ましくは界面活性剤を含む。結果として得られる溶液は、濾過により透明にし、適当な容器に移し、これを次いで密封し、98〜100℃で半時間、オートクレーブ処理または維持することにより滅菌する。別法として、溶液を、濾過により滅菌し、無菌技術により容器に移すこともできる。滴剤中に含めるために好適な殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀(0.002%)、ベンザルコニウムクロリド(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性溶液を調製するための適当な溶媒は、グリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
式(I)の化合物は、全身的、例えば、経口または非経口(すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、直腸内、膣内または腹膜組織内投与)的に投与することができる。非経口投与の皮下および筋肉内形態が一般に好ましい。このような投与の適当な投与形態は、通常の技術により調製することができる。式(I)の化合物は、吸入、すなわち、鼻内および経口吸入投与により投与することができる。このような投与のための適当な投与形態、例えばエアゾル処方または計量式吸入器を通常の技術により調製することができる。他の経口投与のための適当な投与形態は、通常の技術により調製することができる。
【0025】
式(I)の化合物は、Tie受容体活性を阻害して、正常なレベルまで、あるいは場合によっては正常以下のレベルまで下方調節し、疾患常態を改善または予防するために十分な量において投与される。
本明細書において開示された式(I)の化合物の全ての使用法について、一日経口投薬レジメは、好ましくは全体重1kgあたり約0.1ないし約80mgであり、好ましくは、約0.2ないし約30mg/kgであり、さらに好ましくは約0.5ないし約15mg・kgである。一日非経口投薬レジメは、全体重1kgあたりの約0.1ないし約80mgであり、好ましくは約0.2ないし約30mg/kgであり、さらに好ましくは約0.5mgないし約15mg/kgである。一日局所投薬レジメは、好ましくは0.1mgないし約150mgであり、毎日1ないし4回、好ましくは2または3回投与される。一日吸入投薬レジメは、好ましくは一日につき約0.01mg/kgないし約1mg/kgである。式(I)の化合物の最適量および個々の投薬の間隔は、治療される状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の患者により決められ、このような最適値は通常の技術により決定できることも、当業者には理解されるであろう。治療の最適経路、すなわち、所定の日数の間、一日当たり投与される式(I)の化合物の投与回数は、治療決定試験の通常の手続きを用いて当業者が確定できる。
本発明の化合物を前記投薬レジメにおいて投与する場合に、有毒な効果は予想されない。
【0026】
合成例
本発明を、単に例示的であって、本発明の範囲を制限すると解釈されない次の実施例に関連して説明する。
全ての温度は、摂氏度(℃)で記載し、全ての溶媒は入手可能な最高の純度であり、全ての反応は特に明記しない限りアルゴン雰囲気中、無水条件下で行う。マススペクトルは特に明記しない限り、VG Zabマススペクトロメーターで、高速原子衝撃を用いるか、またはキャリア溶媒として95:5CH3CN/CH3OHと1%ギ酸を用いて、陽イオンモードにおいてミクロマスプラットホームエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメーターで行った。1H NMR(以下、「NMR」)スペクトルを、Bruker AM250またはAM分光計を用いて250MHzで記録した。多重度は、s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線であり、brはブロードなシグナルを示す。Sat.は、飽和溶液を表し、eqは主な反応物質に対する試薬のモル当量の割合を表す。フラッシュクロマトグラフィーは、Merckシリカゲル60(230〜400メッシュ)上で行う。
【実施例1】
【0027】
3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2’−2−[N’−(1,1−ジメチルエチル)−尿素の調製
a)4−アミノニコチンアルデヒド
この実施例および他の実施例において、Turner,J.A.,J.Org.Chem.1983,48,3401の方法により調製する。
b)3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2−アミン
4−アミノニコチンアルデヒド(100mg、0.78ミリモル(以下、「mmol」と記載)、2,6−ジクロロフェニルアセトニトリル(217mg、1.2ミリモル)、10%水性NaOH(0.10mL、0.25ミリモル)および70μLの無水エタノールを合わせて、65℃で24時間(以下、「h」と記載)加熱する。反応混合物を周囲温度に冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させる。残留物を700μLのDMSOで希釈し、濾過し、分取逆相クロマトグラフィーで精製して、黄色固体として標記化合物を得る(191mg、収率84%)。MS ES+m/z=290
c)3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2’−2−[N’−(1,1−ジメチルエチル)−尿素]
3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2−アミン(51mg、0.176ミリモル)およびt−ブチルイソシアネート(17mg、0.176ミリモル)をCH2Cl2(1mL)中に溶解させる。NaH[60%鉱油中分散液(7mg、0.176ミリモル)]を添加し、24時間撹拌する。反応を濾過し、DMF(1mL)で洗浄する。残留物を濃縮し、シリカゲル上クロマトグラフィーにより精製し、25:1のCH2Cl2:MeOHで溶出して、白色固体として標記化合物を得る(25mg、収率36%)。MS ES+m/z=390。1H NMR(CDCl3):9.32(s、1H)、8.72(m、1H)、8.40(m、1H)、7.95(m、1H)、7.55(m、3H)、1.50(s、9H)。
実施例2〜79は、ニトリルおよび/またはイソシアネートを以下に示すように工程(b)および/または(c)において変える以外は、実施例1と同様にして調製する。
【実施例2】
【0028】
1−tert−ブチル−3−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリルを用いる以外は、実施例1bおよびcと同様。LC/MS ES+m/z=349(M+H)。
【実施例3】
【0029】
1−tert−ブチル−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=327(M+H)。
【実施例4】
【0030】
1−tert−ブチル−3−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロフェニルアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=373(M+H)。
【実施例5】
【0031】
1−tert−ブチル−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトのトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=349(M+H)。
【実施例6】
【0032】
1−tert−ブチル−3−(3−ピリジン−2−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−ピリジルアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=322(M+H)。
【実施例7】
【0033】
1−tert−ブチル−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=351(M+H)。
【実施例8】
【0034】
1−tert−ブチル−3−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=357(M+H)。
【実施例9】
【0035】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−tert−ブチル−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=369(M+H)。
【実施例10】
【0036】
1−tert−ブチル−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリルを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=335(M+H)。
【実施例11】
【0037】
1−シクロヘキシル−3−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=375(M+H)。
【実施例12】
【0038】
1−シクロヘキシル−3−[3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3−(5−ジメチルアミノ)−[1,3,4]オキサジアゾール)−アセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=382(M+H)。
【実施例13】
【0039】
1−シクロヘキシル−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MC ES+m/z=353(M+H)。
【実施例14】
【0040】
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−シクロヘキシル−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=399(M+H)。
【実施例15】
【0041】
1−シクロヘキシル−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=375(M+H)。
【実施例16】
【0042】
1−シクロヘキシル−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=377(M+H)。
【実施例17】
【0043】
1−シクロヘキシル−3−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=399(M+H)。
【実施例18】
【0044】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−シクロヘキシル−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=395(M+H)。
【実施例19】
【0045】
1−シクロヘキシル−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてシクロヘキシルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=361(M+H)。
【実施例20】
【0046】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール)−アセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=418(M+H)。
【実施例21】
【0047】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=389(M+H)。
【実施例22】
【0048】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(3,5−ビス−トリフルオロメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3,5−ビス−トリフルオロメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=519(M+H)。
【実施例23】
【0049】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=435(M+H)。
【実施例24】
【0050】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=411(M+H)。
【実施例25】
【0051】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−(3−ピリジン−2−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−ピリジルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=384(M+H)。
【実施例26】
【0052】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=413(M+H)。
【実施例27】
【0053】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=419(M+H)。
【実施例28】
【0054】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて5−アセチルチオフェンアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=431(M+H)。
【実施例29】
【0055】
1−(3−アセチル−フェニル)−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて3−アセチル−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=397(M+H)。
【実施例30】
【0056】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=421(M+H)。
【実施例31】
【0057】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3−(5−ジメチルアミノ[1,3,4]オキサジアゾール)−アセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=428(M+H)。
【実施例32】
【0058】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=399(M+H)。
【実施例33】
【0059】
1−[3−(ビス−トリフルオロメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−3−(クロロ−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて3,5−ビス−トリフルオロメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=529(M+H)。
【実施例34】
【0060】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=445(M+H)。
【実施例35】
【0061】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=421(M+H)。
【実施例36】
【0062】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=423(M+H)。
【実施例37】
【0063】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=429(M+H)。
【実施例38】
【0064】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=441(M+H)。
【実施例39】
【0065】
1−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて3−クロロ−4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=407(M+H)。
【実施例40】
【0066】
1−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=377(M+H)。
【実施例41】
【0067】
1−[3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール)−アセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=384(M+H)。
【実施例42】
【0068】
1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=355(M+H)。
【実施例43】
【0069】
1−[3−(ビス−トリフルオロメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3,5−ビス−トリフルオロメチル−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=385(M+H)。
【実施例44】
【0070】
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=401(M+H)。
【実施例45】
【0071】
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=377(M+H)。
【実施例46】
【0072】
1−(3−ピリジン−2−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−ピリジルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=350(M+H)。
【実施例47】
【0073】
1−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=379(M+H)。
【実施例48】
【0074】
1−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=385(M+H)。
【実施例49】
【0075】
1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてテトラヒドロ−ピラン−2−イソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=363(M+H)。
【実施例50】
【0076】
1−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=321(M+H)。
【実施例51】
【0077】
1−エチル−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=299(M+H)。
【実施例52】
【0078】
1−[3−(ビス−トリフルオロメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて3,5−ビス−トリフルオロメチル−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=429(M+H)。
【実施例53】
【0079】
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=345(M+H)。
【実施例54】
【0080】
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=321(M+H)。
【実施例55】
【0081】
1−エチル−3−(3−ピリジン−2−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−−尿素
工程bにおいて3−ピリジルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=294(M+H)。
【実施例56】
【0082】
1−エチル−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=323(M+H)。
【実施例57】
【0083】
1−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=329(M+H)。
【実施例58】
【0084】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=341(M+H)。
【実施例59】
【0085】
1−エチル−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてエチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=307(M+H)。
【実施例60】
【0086】
1−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=387(M+H)。
【実施例61】
【0087】
1−[3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて3−(5−ジメチルアミノ−[1,3,4]オキサジアゾール)−アセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=394(M+H)。
【実施例62】
【0088】
1−(4−フルオロ−フェニル)−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=365(M+H)。
【実施例63】
【0089】
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=411(M+H)。
【実施例64】
【0090】
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=387(M+H)。
【実施例65】
【0091】
1−(4−フルオロ−フェニル)−3−(3−ピリジン−2−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−ピリジルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=360(M+H)。
【実施例66】
【0092】
1−(4−フルオロ−フェニル)−3−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=389(M+H)。
【実施例67】
【0093】
1−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=395(M+H)。
【実施例68】
【0094】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(4−フルオロ−フェニル)−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=407(M+H)。
【実施例69】
【0095】
1−(4−フルオロ−フェニル)−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−メチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいて4−フルオロ−フェニルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=373(M+H)。
【実施例70】
【0096】
1−[3−(3,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて3,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=307(M+H)。
【実施例71】
【0097】
1−メチル−3−(3−チオフェン−3−イル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて3−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=285(M+H)。
【実施例72】
【0098】
1−[3−(ビス−トリフルオロメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて3,5−ビス−トリフルオロメチル−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=415(M+H)。
【実施例73】
【0099】
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=331(M+H)。
【実施例74】
【0100】
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて2,5−ジメチルフェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=307(M+H)。
【実施例75】
【0101】
1−[3−(2−メトキシ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて2−メトキシフェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=309(M+H)。
【実施例76】
【0102】
1−[3−(3,4−ジフルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて3,4−ジフルオロフェニルアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=315(M+H)。
【実施例77】
【0103】
1−[3−(5−アセチル−チオフェン−2−イル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−メチル−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=327(M+H)。
【実施例78】
【0104】
1−メチル−3−(3−m−トリル−[1,6]ナフチリジン−2−イル)−尿素
工程bにおいて5−アセチル−チオフェンアセトニトリル、工程cにおいてメチルイソシアネートを使用する以外は、実施例1bおよびcと同様の方法。LC/MS ES+m/z=293(M+H)。
【0105】
薬理学的試験法
A.Tieキナーゼ活性の測定
Tieキナーゼ研究のためのタンパク質を製造するために、Tie2受容体の部分cDNAクローンを用いる。一次スクリーニング分析を行うために、Tieキナーゼドメインのバクロウイルス発現GST融合を構築し、市販のベクターpAcGa(Pharmingen)を用いて発現する。
この最終構築物をバクロウイルス中にトランスフェクトし、可溶性GST融合産物をスクリーニング分析において使用する。従来の研究は、候補標的/シグナル化分子をスクリーンするためにネズミTieキナーゼドメインのバクロウイルス発現GST融合を使用することを記載している(Huangら、Oncogene 11:2097−2103、1995)。
【0106】
Tieキナーゼ活性分析
Tieキナーゼ活性分析は典型的には以下に記載するような2つの方法のうちの一つにおいて行われる。この分析法に少し変更をしても同様の結果が得られる。
自己リン酸化フラッシュプレート分析
材料:
キナーゼ緩衝液(最終20mM Tris−HCl、pH7.0、100mM NaCl、12mM MgCl2、1mM DTT)
ガンマ33p−ATP(通常の最終量0.5〜1uCi/ウェル)
ATP(最終30uM、または他の望ましい濃度)
フラッシュプレート(プラスチックシンチレーターでコートされたウェルを有する96ウェルポリスチレンマイクロプレート)
トップカウント(マイクロプレートシンチレーションカウンター)
方法:
インキュベーターシェーカーを作動させ、温度を30℃に調節する。
各ウェルあたり20ulの3Xキナーゼ緩衝液をフラッシュプレートに添加する。
バックグラウンド以外は各ウェルあたり20ulのタンパク質を添加する。
試験化合物、典型的にはDMSOストック中1〜2ulを添加する。
各ウェルあたり20ulのガンマ33p−ATPおよび冷ATPの混合物(典型的には1:1v/v)を添加する。
合計体積は60ulである。
透明なポリエステルフィルムで覆う。
シェーカー中、30℃で2時間、または所望の時間インキュベートする。
フラッシュプレートをシェーカーから取り出し、5回洗浄する(例えば、各ウェルにつき1XPBS中10uM ATP(300ul)を用いる)。
トップカウント上のプレートまたは他の計測数装置を読みとる。通常の計算法を用いて結果を阻害率(%)およびIC50として計算する。
【0107】
Tie2キナーゼの蛍光偏光
最終分析条件
50mM HEPES pH7.5
2%DMSO(化合物をスクリーニングする場合)
250uM ATP
2mM MgCl2
1mM DTT
50uM バナジン酸ナトリウム
10uM ペプチド基質
活性化tie2キナーゼ
ペプチド基質:
RFWKYEFWR−OH
MW(TFA塩)=1873Da
1mMペプチドストックを調製し、−20℃で貯蔵する。
使用直前に100uMに希釈する。
9Xキナーゼ緩衝液
450mM HEPES pH7.5
900mM NaCl
450uM バナジン酸ナトリウム
18mM MgCl2
100mM DTT
あらかじめ調製して、アリコートに分けて−20℃で貯蔵できる。
ATPストック:
25mM ATPストックを調製し、アリコートに分けて−20℃で必要になるまで貯蔵する。使用前に2.5mMに希釈する。
Tie2キナーゼの活性化
最終緩衝液条件:
20mM Tris−HCl pH7.5
12mM MgCl2
100mM NaCl
20uM バナジン酸ナトリウム
1mM DTT
30uM ATP
方法:
1.5uMのtie2キナーゼを300uM ATP中、前記のような緩衝条件でインキュベートする。
2.27℃で2時間インキュベートする。
3.2.5mlのインキュベートされたtieキナーゼ2反応ミックスを、20mM Tris−HCl pH7.5、100mM NaCl2中であらかじめ平衡化させたNAP−25脱塩カラム(Pharmacia Biotechカタログ番号17−0852−02)に添加して、酵素からATPを分離する。
4.酵素を5.0mlの20mM Tris−HCl pH7.5、100mM NaClで溶出する;タンパク濃度はこの時点で2.5uMでなければならない。
5.酵素を等分し、できるだけ早く−80℃で貯蔵する。
方法:
50ulの反応物に対して、次のものを96ウェルブラックハーフエリアプレート(Costar、カタログ番号3694)の各ウェルに添加する
1.5ulの10%DMSO中試験化合物
2.5ulの9Xキナーゼ緩衝液
3.5ulの2.5mM ATP
4.5ulの100uMペプチド基質
5.25ulのPTK検出ミックス(Panvera、P−2652、50ml−UK配給業者はCambridge Bioscienceである)
6.5ulの活性化tie2キナーゼ(下記のプロトコル)を1X緩衝液中で希釈して、反応を開始する。
7.酵素活性に従って30〜50分間循環するFP装置で偏光を読みとる。IC50は通常の計算法を用いて偏光(%)から決定できる。
本発明の化合物は、1ナノモル〜104ナノモルの範囲、典型的には700〜104ナノモルの範囲のIC50を有する。
【0108】
B.Tie2受容体シグナル変換の測定
HEL細胞(ATCC#TIB180)を、懸濁培養として2mMグルタミンおよび10%FBSで補足されたRPMI−1640培地中1から5×105mlの間で培養する。実験の16〜36時間前に、必要な数の細胞を0.5%FBS/RPMI培地中に接種する。実験当日に、細胞を収穫し、0.5%FBS RPMI中0.5〜1.0×107細胞mlの濃度で再懸濁させ、6ウェルプレート中2〜3ml/ウェルで接種する。
別法として、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)(Clonetics−Walkersville,MD)を分析のために使用することができる。2〜12継代の間のHUVECを、補足されたEGM(Clonetics)中6ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2×105および1×106細胞でプレートする。24時間後、培地を、3%BSAを含むEBA(Clonetics)に変え、細胞を一夜培養し、翌日分析に用いる。
細胞を適当な濃度の阻害化合物で30〜45分間処理する。ウェルの内容物をロッカー上で短時間混合し(約30秒)、次いで37℃でインキュベートする。細胞を次に、血清または繊維芽細胞順化培地などの天然のリガンドの供給源で10分間処理する。
10分のインキュベーション時間の最後に、プレートを氷上におく。細胞を収穫し、培地を除去する。細胞を変性サンプル緩衝液(Invitrogen−Carlsbad、CA)中で溶解させる。懸濁液を中程度のセッティングで5パルス音波処理し、氷に戻す。Tie2受容体のリン酸化状態を、下記のようにして、ウェスタンブロッティングにより測定し、抗ホスホ−Tie2抗体により検出する(Harlow、E.およびLane,D.P.、Antibodies−A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press:New York、1988)。30ulの溶解物を7%SDS/ポリアクリルアミドゲルにかける。ゲルを次いでウェスタンブロッティングの製造業者の指示によりニトロセルロースまたはPVDF膜に移す。
ブロットをPBS/0.05%Tween−20で洗浄し、3%BSA/PBS/Tweenで1時間、室温でブロックする。ブロットを次いでPBS/0.05%Tween中1ug/ml抗ホスホ−Tie2抗体(SmithKline BeechamまたはGlaxoSmithKline)とともに1時間インキュベートする。ブロットを次いでPBS/Tweenで4回(それぞれ5分)洗浄する。製造業者により推奨される希釈度で抗マウスHRP接合体二次抗体とともにブロットをPBS/Tween中1時間インキュベートする。ブロットをPBS/Tween中、4回(それぞれ5分)洗浄する。最後の洗浄の後、ブロットをECL法(Amersham)または同等の方法により展開させる。
デンシトメーターまたはグラフィックプログラム(例えば、ImageQuant−Molecular Dynamics)を用いて各ブロットをスキャンする。Tie−2バンドを単離し、各レーンについて「ブロック(boxed out)」する。各サンプルについてのピクセルボリュームまたは匹敵する測定値を分析する。さらに、同じ大きさの適当なバックグラウンド領域を各サンプルについて決める。バックグラウンドについて調節した後、リン酸化を未処理対照に対するホスホチロシン染色の比として表す。リン酸化の減少は、Tie−2−キナーゼの阻害を示す。
【0109】
C.インビボでの脈管形成の測定−ネズミ気泡(air pouch)肉芽腫モデル:
Tie2を阻害することにより血管の過剰、不適切または望ましくない増殖の組織破壊が抑えられることを示すために用いられる炎症性脈管形成のモデルを以下に記載する。慢性炎症のネズミ気泡肉芽腫モデル(Kimuraら、1985、J.Pharmacobio−Dyn.、8:393−400;Colville−Nashら、1995、J.Pharm.and Exp.Ther.、274:1463−1472)(その開示はその全体を出典明示により本発明の一部として参照される)は、炎症細胞の流入、線維組織の増殖および強度の脈管形成により特徴づけられる。これは炎症性脈管形成の代表であり、脈管形成成分を肉芽腫成長および大きさと独立して薬理学的に調節できることを示す。加えて、脈管形成は、血管キャスティング法により正確に計量できる。
−1日に、マウスをAerrane(イソフルラン)ガス(5%)または他の承認された方法を用いて麻酔し、その後、27g針を用いて3mlの空気を背部皮下組織中に注射する。マウスを回復させる。
0日に、マウスを再びAerraneまたは他の承認された方法を用いて麻酔し、一旦麻酔にかかったら、0.5mlのフロインド完全アジュバントと0.1%v/vクロトン油を−1日に形成された気泡中に注射する。動物に投薬レジメ(実験に応じた日数)を開始し、動物に典型的には0.2mlのN,N,ジメチルアセトアセトアミド(DMA)(Sigma、St.Louis、Mo.)/Cremephor EI(Sigma、St.Louis、Mo.)、食塩水(10/10/8)または他の適当なビヒクルを投与する。動物を回復させ、その後の投薬は、麻酔無しで動物に対して行う。
1〜5日に、動物にスケジュールにしたがって投薬する。
6日に、動物を再び麻酔し、その後、血管キャストが生じる(Kimuraら、1986、J.Pharmacobio−Dyn.、9:442−446);これは、1mlのカルミン赤(10%)(Sigma、St.Louis、Mo.)/ゼラチン(5%)(Sigma、St.Louis、Mo.)溶液の尾静脈内注射を含む。動物を次いで致死量の麻酔薬により屠殺し、4℃で2時間冷却した後、肉芽組織を取り出す。
肉芽腫を取り出したら、秤量し、次いで3日間45℃で乾燥し、再度秤量する。乾燥された組織を次に12U/ml−1パパイン(Sigma、St.Louis、Mo.)および0.33g/L−1N−アセチル−1−システイン(Sigma、St.Louis、Mo.)を含む0.9mlの0.05Mリン酸塩緩衝液pH7.0中で57℃で3日間消化する。3日消化した後、0.1mlの5mM NaOHを添加することによりカルミン赤を可溶性にする。サンプルを遠心分離器にかけ、次いで0.2umのアクロディスクを用いて濾過する。カルミン未処理動物から抽出された組織において作成されるカルミン赤標準曲線(0.5〜2mg/ml)に対してカルミン含量を決定し、490nmで読みとる。サンプルおよび標準値を、典型的にはDeltaSoft Elisa分析ソフトウェア(Biometallics Inc.,Princeton,NJ)を用いて決定する。次に様々な処理についての血管指数を決定するためにカルミン含量を用い、血管指数はmgカルミン色素/gm乾燥組織である
化合物の血管密度に対する効果を典型的には肉芽腫誘発6日後に測定する。この時間は脈管形成のピークまたはピーク付近となるように決定された。正の対照メドロキシプロゲステロンとして、脈管形成ステロイド(Grossら、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1176−1180)(その開示を出典明示により本発明の一部として参照する)を使用する。この対照は、このモデルにおいて50%の最大減少を示す。メドロキシプロゲステロンは乾燥重量により測定される肉芽腫の大きさに対して影響を及ぼさない。
【0110】
D.インビボでの脈管形成の測定−マトリゲルモデル
細胞外マトリックスゲルを約1週間マウスの皮膚下にいれ、次いでゲルの脈管侵入を計量するためにいくつかの測定値を用いることにより脈管形成をインビボでモデル化する(Biancone,L.ら、Development of Inflammatory Angiogenesis by Local Stimulation of Fas In Vivo.J.Exp.Med.186:147,1997)。簡単に説明すると、減少した成長因子、エンドトキシンのないマトリゲル(Becton−Dickison、Bedford、MA)は低温でゲルである。抗体または公知の脈管形成剤をゲルと混合して、全体積の2%を超えないようにする。8週令以上のC57メスマウスに0.5mlのマトリゲルを冷却したシリンジから背部皮下注射により投与する。生理的温度で液体マトリゲルは急速に固体および粘着性ゲルを形成する。実験中、マウスに試験化合物または対照を前記のように投与する。6日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを回収する。Drabkinの方法(Drabkin、DLおよびAustin,JH:Spectrophotometric Studies II.Preparations from washed blood cells;nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin.J Biol Chem 112:51,1935)(Sigma,St.Louis,MO)によりゲルのヘモグロビン含量を分析し、前記のようなCD31染色で血管を計量することにより、脈管形成を計量する。
【0111】
本明細書において記載する特許および特許出願を包含するが、これらに限定されない全ての出版物は、各出版物を完全に記載したかのように本発明において参照される。
前記載事項は、その好ましい態様を含む本発明を完全に開示する。本明細書において具体的に開示された態様の修正および改良は以下の請求の範囲内に含まれる。さらに工夫することなく、前記載事項を用いて当業者らは本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、本発明の実施例は単に例示的であって、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。排他的性質または優先権を主張される本発明の態様を請求の範囲に定義する。
Claims (20)
- R1はアリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群から選択される請求項1記載の化合物。
- R1がフェニル、チオフェン、ピリジニルおよびピラゾールからなる群から選択され、置換されていても、されていなくてもよい請求項1記載の化合物。
- R1が置換フェニルである請求項1記載の化合物。
- R1置換基が、C1−10アルキル、ハロ、ハロ置換C1−10アルキル、C1−10アルコキシ、アミノ、一置換アミノおよび二置換アミノから選択される前記請求項のいずれか一つに記載の化合物。
- R1置換基が、メチル、フルオロ、クロロ、CF3、メトキシおよびジメチルアミノから選択される前記請求項いずれか一つに記載の化合物。
- R2が、C1−10アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロサイクリックからなる群から選択され、置換されていても、されていなくてもよい前記請求項いずれか一つに記載の化合物。
- R2が、C1−10アルキル、シクロアルキル、置換アリールおよびヘテロサイクリックからなる群から選択される前記請求項いずれか一つに記載の化合物。
- R2が、メチル、エチル、tert−ブチル、シクロヘキシル、置換フェニルおよびピランからなる群から選択される前記請求項いずれか一つに記載の化合物。
- R1が置換フェニルであり、R2がC1−10アルキル、シクロアルキルおよびヘテロサイクリックからなる群から選択される請求項1記載の化合物。
- R2がC1−4アルキル、シクロヘキシルおよびテトラヒドロピラニルからなる群から選択される請求項10記載の化合物。
- R1置換基がハロおよびC1−4アルキルから選択される請求項10または11記載の化合物。
- 3−[2,6−ジクロロフェニル]−1,6−ナフチリジン−2’,2−[N’−(1,1−ジメチルエチル)−尿素];
1−tert−ブチル−3−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素;
1−[3−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素;
1−tert−ブチル−3−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−尿素;
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6]ナフチリジン−2−イル]−3−エチル−尿素;および
1−[3−(2,5−ジメチル−フェニル)−[1,6−]ナフチリジン−2−イル]−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−尿素
からなる群から選択される化合物。 - 有効で無毒量の前記請求項いずれか一つに記載の化合物と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
- これを必要とする哺乳動物においてTIE介在疾患を治療する方法であって、当該哺乳動物に有効量の請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物を投与することを含む方法。
- 哺乳動物におけるTIE介在疾患の治療において使用される請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物。
- 哺乳動物におけるTIE介在疾患の治療用医薬の製造における請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物の使用。
- これを必要とする哺乳動物における過剰、不適当または望ましくない血管形成により特徴づけられる疾患の治療法であって、当該哺乳動物に有効量の請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物を投与することを含む方法。
- 哺乳動物における過剰、不適当または望ましくない血管形成により特徴づけられる疾患の治療において用いられる請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物。
- 哺乳動物における過剰、不適当または望ましくない血管形成により特徴づけられる疾患の治療用医薬の製造における請求項1〜13のいずれか一つに記載の化合物の使用。
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