ES2256232T3 - Metodos y composiciones para provocar una respuesta inmunitaria. - Google Patents
Metodos y composiciones para provocar una respuesta inmunitaria.Info
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Abstract
El uso de una quimiotaxina de célula presentadora de antígeno (APC-quimiotaxina) y y un antígeno en la fábricación de un medicamento, en el cual la APC-quimiotaxina es: (a) una quimioquina seleccionada de la quimioquina-2 del citomegalovirus murino (vMCK-2) y mC10; (b) una variante de (a) que no cambia las propiedades quimiotácticas del polipéptido; o (c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
Description
Método y composiciones para provocar una
respuesta inmunitaria.
La inmunización, o vacunación, es un método
ampliamente utilizado para provocar una respuesta inmunitaria a un
antígeno para propósitos profilácticos. Por ejemplo, por
administración de una forma inocua de un antígeno de un patógeno,
tal como un virus atenuado, ocurre la producción de anticuerpos y la
estimulación de células inmunitarias específicas para la forma
nociva del patógeno. Sin embargo, los métodos actuales de
inmunización no son eficaces para todos los antígenos. Además,
existe un retardo temporal considerable desde la inmunización hasta
que el sistema inmunitario proporciona protección al individuo. Por
ello, se desean por la comunidad médica métodos y reactivos para
vacunación mejorados.
El documento
WO-A-99 53960 describe medicamentos
que comprenden un antígeno y una quimioquina (como adyuvante) que se
selecciona de un gran número de quimioquinas posibles.
Análogamente, el documento
WO-A-99 29728 describe el uso de
quimioquinas y antígenos para la preparación de un medicamento, y el
documento WO-A-99 43839 describe el
uso de quimioquinas y antígenos en la preparación de composiciones
farmacéuticas.
Sin embargo, ninguno de los documentos anteriores
identifica ninguna quimioquina específica como particularmente
ventajosa, en particular para atraer las células dendríticas y/o los
macrófagos, en tales composiciones.
La presente invención proporciona composiciones
útiles para atraer células presentadoras de antígeno a un sitio de
administración, y nuevas vacunas y métodos de inmunización. De
acuerdo con un aspecto de la presente invención, se utiliza una
quimiotaxina de las células presentadoras de antígeno
(APC-quimiotaxina) y un antígeno en la fabricación
de un medicamento, en el cual la APC-quimiotaxina
es:
(a) una quimioquina seleccionada de la
quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) y mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de quimioquina sustancialmente purificado y un
polipéptido antigénico, en la cual el polipéptido de quimioquina es
la quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) o una variante del mismo que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido, o mC10 o una variante
del mismo que no cambia las propiedades quimiotácticas del
polipéptido.
De acuerdo con un aspecto adicional, se
proporciona una composición que comprende una quimiotaxina de las
células presentadoras de antígeno sustancialmente purificada
(ATC-quimiotaxina) y un antígeno, en la cual dicha
ACP-quimiotaxina es:
(a) una quimioquina seleccionada del grupo
constituido por la quimioquina-2 del citomegalovirus
murino (vMCK-2) o mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
Opcionalmente, la composición puede comprender
además un excipiente o adyuvante convencional farmacéuticamente
aceptable.
De acuerdo con un aspecto adicional, se
proporciona un método de formulación de una composición capaz de
inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno específico en un
individuo, que comprende combinar una quimiotaxina de las células
presentadoras de antígeno (APC-quimiotaxina), el
antígeno especificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable o
un adyuvante convencional, en el cual la
APC-quimiotaxina es:
(a) una quimioquina seleccionada de la
quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) y mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
En una realización, el medicamento, vacuna o
composiciones de la presente invención pueden comprender además una
quimioquina adicional. En particular, el medicamento, vacuna o
composición puede comprender a la vez vMCK-2 y mC10.
La APC-quimiotaxina puede estar codificada por un
polinucleótido producido por recombinación in vitro de los
polinucleótidos que codifican vMCK-2 o mC10 y otra
quimioquina existente naturalmente.
En caso apropiado, pueden seleccionarse
quimioquinas adicionales de hMIP1\alpha, hMIP1\alpha (70 aa),
mMIP-1\alpha, hRANTES,
hMET-RANTES, mRANTES, hHCC-1,
hMPIF-1, hMPIF-1
(22-137), hMPIF-1
(46-137), hMIP-1\delta,
hMCP-4, mMCP-5, mMARC, mEotaxina,
mMCP-1(JE), mTECK, mMIP-2,
mBLC, hLeucotactina, mMIG, mMIP-1\beta,
hMCP-2, hMCP-3,
vMIP-1, hMIP-3\alpha,
hMIP-3\beta, mMDC, hMIP-1\beta
y/o mMIP-1\gamma.
En una realización, el antígeno puede derivarse
de un patógeno microbiano o un antígeno asociado a tumores. En
particular, el patógeno microbiano puede ser una bacteria o un
virus. La APC-quimiotaxina y el antígeno (v.g.
inmunógeno) pueden administrarse (v.g., por inyección) al mismo
tiempo, por ejemplo, por coinyección del inmunógeno y la
APC-quimiotaxina. Alternativamente, el inmunógeno
puede administrarse al individuo después que se ha administrado la
APC-quimiotaxina.
Como se ha indicado, cada una de las
composiciones descritas supra es útil para atraer las células
presentadoras de antígeno a un sitio especificado, v.g., un sitio de
concentración de antígeno, por ejemplo en o cerca de un tumor
sólido.
Del mismo modo, las composiciones son útiles para
estimular la respuesta inmunitaria innata del individuo.
La Figura 1 muestra caminos del desarrollo de
células dendríticas.
La Figura 2 muestra la secuencia de quimioquinas
quiméricas ilustrativas (seq. id. núms: 4-7) y
quimioquinas de las cuales se derivan éstas (seq. id. núms:
1-3).
Como se utiliza en esta memoria, una muestra de
células o población de células es "sustancialmente pura" o está
"sustancialmente purificada" si al menos aproximadamente 75%,
con preferencia al menos aproximadamente 85%, en muchos casos al
menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o más de las
células totales en la muestra son de un tipo definido (v.g. en una
preparación sustancialmente pura de células dendríticas, al menos
aproximadamente, v.g., 95% del número total de células son células
dendríticas, mientras que en una preparación sustancialmente pura de
células dendríticas inmaduras, al menos aproximadamente, v.g., 95%
del número total de células son células dendríticas inmaduras.
"Polinucleótido", tal como se utiliza en
esta memoria, se refiere a un des-oxirribonucleótido
(DNA) o ribonucleótido (RNA) en forma mono- o bicatenaria, y abarca
análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de
una manera similar a los nucleótidos existentes naturalmente. La
expresión "polinucleótido codificante" hace referencia una
secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína
o péptido específico(a). Las secuencias de ácido nucleico
incluyen tanto la secuencia de DNA que se transcribe en RNA como la
secuencia de RNA que se traduce en la proteína. La secuencia de
ácido nucleico incluye tanto la secuencia de ácido nucleico de
longitud total como secuencias de longitud menor que la total
derivadas de la secuencia de longitud total.
Como se utiliza en esta memoria, un
"individuo" es un mamífero tal como un primate (v.g., paciente
o voluntario humano, o primate no humano), u otro animal tal como
una rata, ratón, roedor, conejo (v.g. animales experimentales), y
análogos, y que incluye mamíferos importantes en agricultura, tales
como, sin limitación, una cabra, cerdo, vaca, oveja, caballo y
análogos, y mascotas tales como perros, gatos y análogos.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión
"identidad sustancial de secuencia", hace referencia a dos o
más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 60%, al menos
70%, al menos 80%, o al menos 90%, 95%, 98%, o 99% de identidad de
residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y se
alinean para correspondencia máxima, como se mide utilizando uno de
los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por
inspección visual. Dos secuencias (de aminoácidos o nucleótidos)
pueden compararse en su longitud total (v.g. la longitud de la más
corta de las dos, si las mismas tienen longitudes sustancialmente
diferentes) o en una subsecuencia tal como al menos aproximadamente
50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 500 o
aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos o al menos
aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30,
aproximadamente 50 o aproximadamente 100 residuos de aminoácidos
contiguos.
Para la comparación de secuencias, típicamente
una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se
comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de
comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia
se introducen en un ordenador, se diseñan las coordenadas de las
subsecuencias, en caso necesario, y se diseñan los parámetros del
programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de
secuencias calcula luego la identidad porcentual de secuencias para
la o las secuencias de ensayo con relación a la secuencia de
referencia, basándose en los parámetros del programa diseñado.
La alineación óptima de secuencias para
comparación puede realizarse, v.g., por el algoritmo de homología
local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482,
por el algoritmo de alineación de homologías de Needleman &
Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, por el método de
investigación de semejanzas de Pearson & Lipman, 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444, por implementaciones
computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en
el Paquete de Soporte Lógico de Genética Wisconsin, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección
visual (véase en general Ausubel et al., supra). Cada
una de estas referencias y algoritmos se incorporan por referencia
en esta memoria en su totalidad. Cuando se utiliza cualquiera de los
algoritmos mencionados supra, se utilizan los parámetros por
defecto para longitud de "ventana", penalidad por laguna,
etc.
Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar la identidad porcentual de secuencias y la semejanza de
secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et
al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. El
Soporte Lógico para la realización de los análisis BLAST está
disponible públicamente del Centro Nacional de Información de
Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo
implica en primer lugar identificar pares de secuencias de registro
alto (HSPs) por identificación de palabras cortas de longitud W en
la secuencia consultada, que coinciden o satisfacen algún registro
umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la
misma longitud en una secuencia de bases de datos. Se hace
referencia a T como el umbral de registro de palabras de proximidad
(Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabras
iniciales de proximidad actúan como siembras para iniciar las
búsquedas con objeto de encontrar HSPs más largas que los contengan.
Los aciertos de palabras se extienden luego en ambas direcciones a
lo largo de cada secuencia en la medida en que el registro de
alineación acumulado pueda incrementarse. La extensión de los
aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: el
registro de alineación acumulada disminuye en la cantidad X con
respecto a su valor máximo alcanzado; el registro acumulado
desciende a cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de
una o más alineaciones de residuos con registro negativo; o se
alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del
algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de
la alineación. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de
palabras (W) de 11, la matriz de registro BLOSUM62 (véase Henikoff
& Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915),
alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = -4, y una
comparación de ambas cadenas.
Abreviaturas: Cuando se hace referencia a una
quimioquina, "h" significa humano y "m" significa murino.
En algunos casos, se utilizan letras latinas en lugar de las griegas
\alpha, \beta, o \gamma. Así, tal como se utiliza en esta
memoria, mMIP-1a significa
MIP-1\alpha murina.
La invención proporciona composiciones útiles
para atraer células presentadores de antígeno a un sitio de
administración. En un aspecto, la presente invención proporciona
composiciones y métodos para inducir o aumentar una respuesta
inmunitaria a un antígeno en un individuo. Las composiciones y
métodos son útiles para, entre otras cosas, formulación de vacunas y
para protocolos de vacunación terapéutica y profiláctica
(inmunización), así como para la producción de anticuerpos útiles
(v.g. anticuerpos monoclonales para uso terapéutico o
diagnóstico).
En particular, la presente invención se refiere a
composiciones que contienen un agente que es quimiotáctico para las
células dendríticas (DCs) y/o los macrófagos (a los que se hace
referencia juntamente como "células presentadoras de antígeno"
o "APCs"). Por conveniencia, se hace referencia a veces al
agente quimiotáctico como una
"APC-quimiotaxina", y se hace referencia a
veces a la composición que contiene la
APC-quimiotaxina (que puede contener excipientes u
otros componentes) en esta memoria como "la composición
quimiotáctica" o "la composición".
En algunas realizaciones de la invención, la
APC-quimiotaxina es especialmente quimiotáctica para
tipos de células especificados (v.g., células dendríticas) o etapas
del desarrollo celular (v.g., células dendríticas inmaduras). En
realizaciones afines, el agente, aunque es quimiotáctico para
algunas células, no es quimiotáctico para ciertos tipos de
células (v.g., neutrófilos) o ciertas etapas del desarrollo celular
(v.g., células dendríticas maduras). La quimiotaxis se determina
utilizando uno o más de los ensayos descritos en esta memoria.
La presente invención implica adicionalmente la
administración de un antígeno, además de la composición
quimiotáctica. Así, en una realización, se administran al individuo
la composición quimiotáctica y un antígeno en el mismo sitio físico.
Por ejemplo, el antígeno puede combinarse con la composición
quimiotáctica, y administrarse (v.g., inyectarse) la mezcla
conjuntamente. Alternativamente, la composición y el antígeno
permitan por separado a la misma área del individuo (v.g., se
inyectan en el mismo sitio, se aplican tópicamente en el mismo
sitio, etcétera). En algunas realizaciones, como se describe en
detalle más adelante, la composición y el antígeno se
administran en momentos diferentes.
Sin pretender quedar ligados por un mecanismo
particular, se cree que la o las APC-quimiotaxinas
promueven una reacción inmunológica respecto al antígeno por aporte
de APCs a las áreas de contacto con el antígeno. Los antígenos son
absorbidos por las APCs y degradados parcialmente.
Subsiguientemente, una fracción del antígeno degradado se presenta
con moléculas del MHC clase I o II en la superficie de la APC. Tales
células estimulan la proliferación de células T citotóxicas o
células T adyuvantes, o la producción de anticuerpos por las células
B.
Resultará evidente que, en un aspecto, la
invención proporciona nuevos métodos y reactivos útiles para
inmunización terapéutica y profiláctica (es decir, la provocación,
aumento o intensificación deliberados de una respuesta inmunitaria
adaptativa). Ventajas particulares esperadas con respecto a los
métodos de inmunización anteriores incluyen: una respuesta
inmunitaria acelerada en un hospedador después de la administración
del antígeno, una respuesta más eficaz a la administración de, o
exposición a, cantidades muy pequeñas de un antígeno (v.g., toxina o
patógeno) debido a la absorción incrementada del antígeno por las
APCs, y terapias anti-tumorales más eficaces (v.g.
debidas a la absorción incrementada del antígeno tumoral por las
APCs del hospedador).
Como se utiliza en esta memoria, una "respuesta
inmunitaria" significa (a no ser que se especifique otra cosa)
una respuesta inmunitaria adaptativa a un antígeno específico. En un
aspecto, una respuesta inmunitaria implica la acción concertada de
linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas,
y diversas macromoléculas solubles en la defensa del cuerpo contra
la infección u otra exposición a moléculas extrañas. La respuesta
inmunitaria puede detectarse o cuantificarse (v.g., después de la
inmunización) por medida de las respuestas celulares o humorales de
acuerdo con numerosos ensayos conocidos en la técnica (véase, v.g.
Coligan et al., 1991 (supl. 1999), Current Protocols in
Immunology, John Wiley & Sons, (en lo sucesivo, a veces
"Coligan")). Por ejemplo, para detectar una respuesta
inmunitaria celular, se detectan los efectos de las células T
efectoras contra las células que expresan el antígeno utilizando
ensayos estándar, v.g., destrucción de las células diana, activación
de macrófagos, activación de células B o producción de linfoquinas.
Las respuestas humorales se miden por detección de la aparición de,
o aumento en el título de, anticuerpos específicos del antígeno
utilizando métodos rutinarios tales como ELISA. El progreso de la
respuesta de anticuerpos puede determinarse por medida del cambio
de clase (es decir, el cambio desde una respuesta de IgM temprana a
una respuesta de IgG posterior.
Diversos aspectos de la invención se describirán
a continuación con mayor detalle, para proporcionar orientación al
especialista.
De acuerdo con la invención, se administra una
composición que contiene una APC-quimiotaxina para
inducir o aumentar una respuesta inmunitaria en un individuo. En
diversas realizaciones, la quimiotaxina atrae células dendríticas,
macrófagos, o ambos. Las quimiotaxinas que atraen células
dendríticas, particularmente células dendríticas inmaduras, son
especialmente útiles. En una realización particularmente útil, la
quimiotaxina tiene un nivel elevado de especificidad para un tipo de
célula o etapa de desarrollo particulares, o ambos. Así, en una
realización, la APC-quimiotaxina atrae células
dendríticas inmaduras, pero no atrae una o más de las otras clases
de células siguientes: células dendríticas maduras, neutrófilos,
monocitos, células T, células B, eosinófilos, mastocitos, glóbulos
rojos, y células progenitoras.
Las APC-quimiotaxinas pueden ser
cualquiera de una gran diversidad de compuestos, tanto existentes
naturalmente como sintéticos, orgánicos o inorgánicos, con inclusión
de polímeros (v.g. oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos, y
polinucleótidos), moléculas pequeñas, anticuerpos, azúcares, ácidos
grasos, nucleótidos y análogos de nucleótidos, análogos de
estructuras existentes naturalmente (v.g., peptidomiméticos,
análogos de ácido nucleico, etcétera), y numerosos otros compuestos.
En la presente invención, la composición contiene al menos uno de
mC10, vMCK-2 o una variante de una quimioquina
mencionada supra, tal como un polipéptido recombinante
producido por mutación in vitro, recombinación in
vitro o desordenamiento de un polinucleótido que codifica las
quimioquinas, un polinucleótido que codifica al menos una de las
quimioquinas o moléculas variantes mencionadas supra, o una
variante de polipéptido sintética (es decir, sintetizada
químicamente) (v.g. mimética) de una o más de estas
quimioquinas.
Reactivos y métodos para, inter alia,
identificar APC-quimiotaxinas, y preparar y
administrar las composiciones de la invención se describen más
adelante.
En un aspecto de la invención, se identifican
APC-quimiotaxinas utilizando ensayos in vivo
o in vitro.
Las APC-quimiotaxinas utilizadas
en los métodos de la invención tienen ciertas propiedades, que
pueden detectarse en ensayos de quimiotaxis in vitro. Los
ensayos de quimiotaxis in vitro son bien conocidos. A menudo
se llevan a cabo ensayos de migración por separación física de las
células del agente quimioatrayente utilizando una membrana porosa y
dejando que las células se muevan direccionalmente, por un gradiente
de difusión de la quimiotaxina (véase, v.g., Keller, 1972, Agents
Actions 2: 161-69; Gee A.P., 1984, Mol. Cell.
Biochem. 62:5-11; Keller et al., 1974,
Antibiot. Chemother. 19:112-25).
Se conocen una diversidad de configuraciones de
ensayo que son adecuadas en la práctica de la presente invención. En
la mayoría de los casos, se utilizan ensayos estándar basados en
filtros, debido a que los mismos son cómodos, robustos, y
relativamente económicos. Estos ensayos basados en filtros incluyen
una cámara Boyden clásica o modificada y variantes (véase, v.g.,
Bozarth et al., 1997, Meth. Cell Science,
19:179-187; Frevert et al., 1998, J. Imm.
Methods, 213:41-52; Penno et al., 1997,
Meth. Cell Science, 19:189-195; O'Leary
et al., 1997, Am. J. Resp. Cell and Mol. Bio.,
16:267-274; Falk, et al., 1980, J. Imm.
Methods, 33:239-247; Harvath et al.,
1980, J. Imm. Methods, 37:39-45; Richards
et al., 1984, Immunological Communications,
13:49-62; Falk et al., 1982, Infection and
Immunity 36:450-454; Harvath et al.,
1982, Infection and Immunity 36:443-449). En
los ensayos basados en filtros, las células se colocan en un
compartimiento separadas de una quimiotaxina candidato por un filtro
a través del cual puede difundirse la quimiotaxina candidato.
Después de un periodo de incubación, se determina el número de
células (o el porcentaje de las células totales) que han migrado al
interior o a través del filtro. La migración de las células a un
nivel superior al ruido de fondo (es decir, la migración en ausencia
de la quimiotaxina candidato, v.g., en la presencia sólo de un
vehículo tal como PBS o tampón de Quimiotaxis (más adelante)
indica que la quimiotaxina candidato es realmente quimiotáctica para
el tipo de células diana. Inversamente, cuando el número de células
migratorias es igual a o inferior al ruido de fondo, la quimiotaxina
candidato se considera no quimiotáctica para el tipo de células
diana.
Un aparato adecuado para realización de ensayos
de quimiotaxis in vitro es una microplaca ChemoTx® de
96 pocillos (Neuroprobe Inc. Gaithersburg MD). El instrumento
ChemoTx® tiene una microplaca de 96 pocillos de poliestireno
transparente de la calidad de cultivo de tejidos moldeado por
inyección. La microplaca proporciona pocillos de fondo para
sustancias quimioatrayentes y otros reactivos. En lugar de los
"pocillos" superiores, se utiliza un filtro provisto de marco
que confina cada muestra de suspensión de células a su sitio encima
del filtro. Los 96 sitios del filtro corresponden a los 96 pocillos
en la microplaca y la suspensión de células pipeteada directamente
sobre los sitios de la parte superior del filtro se asienta en gotas
hemisféricas durante la incubación. Después de la incubación, se
cuentan las células que han migrado al filtro y a la microplaca.
Véase el documento U.S. Pat. No. 5.284.753.
Para ensayar la actividad quimiotáctica
utilizando un aparato tal como el aparato de microplacas
ChemoTx®, se añaden quimiotaxinas candidato a los pocillos
inferiores (v.g., aproximadamente 30 microlitros) a una o más
concentraciones (v.g., aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM,
aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente
100 ng/ml y/o aproximadamente 1 \mug/ml), y las células se
disponen sobre filtros de policarbonato porosos posicionados encima
de la solución de quimiotaxina en cada pocillo. Los filtros tienen
un tamaño de poros de aproximadamente 3 \mum, o aproximadamente 5
\mum, de tal modo que únicamente las células expuestas a aun
agente quimiotáctico para la célula migrarán al interior y/o a
través del filtro. En la configuración de microplacas, se utilizan
por lo general aproximadamente 20 microlitros de células (a
aproximadamente 1 x 10^{6} hasta aproximadamente 1 x 10^{7}
células por ml, v.g., 5 x 10^{6} células por ml). Las células se
incuban durante un periodo de tiempo (v.g., 0,5 a 6 horas, por lo
general aproximadamente 1,5 horas, a una temperatura comprendida
entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 39ºC, usualmente 37ºC)
y se deja que las células migren al interior o a través del
filtro.
Cuando se efectúan ensayos in vitro
utilizando una población de células purificada (v.g., células
dendríticas, neutrófilos, células dendríticas inmaduras, etc.) las
condiciones de ensayo se adaptan usualmente al tipo de célula
estudiado. Por ejemplo, las células que son relativamente plásticas
son capaces de reptar a través de ciertos filtros, mientras que
otras se quedan "pegadas" en el filtro. Así, los monocitos
expuestos a un agente quimiotáctico monocítico pueden migrar a
través de un filtro de 5 \mum (al sobrenadante de la cámara
inferior) y, en contraste, las células dendríticas inmaduras o
maduras expuestas a un agente quimiotáctico migran al interior de un
filtro de 3 \mum o 5 \mum, pero quedan retenidas en el filtro
(es decir, las células no migran a través del filtro). Por esta
razón, la elección del formato del ensayo de migración y el método
de cuantificación pueden variar dependiendo del tipo de células
estudiado. Por ejemplo, se utiliza usualmente un tamaño de poro de 5
\mum para un ensayo de migración de monocitos; el ensayo se
efectúa típicamente durante 90 minutos, y las células migratorias
(en su caso) se detectan en el pocillo. Para células dendríticas
maduras, se utilizan un filtro de 3 \mum de tamaño de poro y 90
min de incubación, y las células se detectan en el filtro. Estas y
otras condiciones de ensayo ilustrativas se muestran en la Tabla 1.
Sin embargo, se apreciará que, como se ha indicado supra,
pueden utilizarse cierto número de formatos de ensayo y condiciones
diferentes para determinar si un agente tiene (o no) actividad
quimiotáctica (v.g., para una célula particular). La Tabla 1
proporciona también controles ilustrativos positivos y negativos
para uso en los ensayos. Los controles positivos son agentes que,
cuando se utilizan a concentración 100 nM, tienen actividad
quimiotáctica. Los controles negativos son agentes que, cuando se
utilizan a concentraciones de 100 nM, no tienen actividad
quimiotáctica.
| Tipo de Célula | Filtro | Tiempo | Localización | + con. | - con. |
| Monocito | 5 \mum | 90 | Pocillo | RANTES | MIP1b |
| immDC | 5 \mum | 90 | Filtro | RANTES | SLC |
| matDC | 3 \mum | 90 | Filtro | LC | RANTES |
| Neutro | 3 \mum | 60 | Pocillo | IL8 | SLC |
| Eosino | 3 \mum | 60 | Pocillo | Eotaxina IL8 | |
| Célula T | 3 \mum | 180 | Pocillo | MDC | Eotaxina |
| Célula B | 3 \mum | 180 | Pocillo | SLC | Eotaxina |
| Macrófago | 5 \mum | 90 | Filtro (+ pocillo) | RANTES | SLC |
Clave: + con. (control positivo), y - con.
(control negativo), se utilizan a concentraciones de 100 nM.
El número de células que han migrado en presencia
del agente puede determinarse utilizando una diversidad de métodos.
Para ensayar células (v.g. células dendríticas) que quedan atrapadas
en un filtro, se rascan los filtros para eliminar las células no
adherentes (es decir, células que se han sedimentado simplemente
sobre la cara superior del filtro) y se cuantifican las células que
se han desplazado al interior del filtro o adherido a su superficie
inferior. Para las células que son capaces de migrar a través del
filtro (v.g. monocitos) el filtro puede desecharse y se determina el
número de células que han migrado a través del filtro a la cámara
"inferior" (cámara que contiene la quimiotaxina). Métodos
adecuados de cuantificación de células son bien conocidos e
incluyen recuento directo (microscópico) de células migradas,
métodos histológicos, citoquímicos, de inmunofluorescencia
(utilizando anticuerpos para marcadores específicos de células o
específicos de etapa), y de tinción in situ, uso de células
radiomarcadas, y ensayos para contenido de RNA o DNA (v.g.,
utilizando reactivos tales como CyQuant, Molecular Probes, Eugene
OR, v.g., sobre un extracto de células lisadas), contenido de
proteínas (v.g., utilizando tintes tales como Hema3), actividad
enzimática (v.g., \beta-glucuronidasa), y
análogos. A menudo es conveniente seleccionar las manchas que pueden
detectarse utilizando lectores de placa densitométricos o de
fluorescencia.
En algunas realizaciones, se utilizan varias
concentraciones de la quimiotaxina candidato para detectar una
concentración activa, v.g., al menos dos, típicamente al menos tres
concentraciones diferentes, a lo largo de un intervalo de
diferencias de al menos 10 veces, típicamente al menos 100 veces,
frecuentemente al menos 1000 veces, y a menudo al menos 10000
veces.
Los ensayos de quimiotaxis pueden realizarse
utilizando una mezcla de células heterogénea (v.g., células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs)) o una subpoblación
purificada (v.g., DCs inmaduras, DCs maduras, neutrófilos, monocitos
y análogos) o células de cultivo de tejidos derivadas de cierto tipo
de células y con características de dichas células (v.g., THP1 (una
línea de células de leucemia monocítica aguda, leucemia
linfoblástica CEM aguda, línea celular de linfoblastos T). cuando se
utiliza una mezcla de células heterogénea, el tipo de células o la
etapa de desarrollo de las células migratorias se determina
usualmente (v.g. basado en morfología, histología, o tinción de
marcadores específicos). Cuando el ensayo se efectúa utilizando una
preparación homogénea (v.g. neutrófilos purificados
sustancialmente), no es necesario determinar el tipo de célula de
las células migratorias dado que cualesquiera células que migren
hacia la quimiotaxina puede suponerse que son de dicho tipo.
En diversas realizaciones, una quimiotaxina
candidato se considera quimiotáctica para un tipo de célula
particular si la quimiotaxina candidato, a una concentración
aproximada comprendida entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente
1 \muM, v.g., entre aproximadamente 1 nM y 500 nM, v.g., 1 nM,
aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM, o entre
aproximadamente 1 pg/ml y aproximadamente 10 \mug/m, v.g., entre
aproximadamente 1 ng/ml y 1 \mug/ml, v.g., aproximadamente 10
ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml o aproximadamente 1 \mug/ml,
atrae la célula al menos 2 veces, con preferencia al menos 4 veces,
y a menudo al menos 8 veces más que el "tampón de quimiotaxis"
(un control negativo) en cualquier ensayo in vivo. El tampón
de quimiotaxis es 0,1% BSA (Sigma) en HBSS (Life
Technologies), con Ca^{++} 1,4 mM y Mg^{++} 1 mM. HBSS es Solución de Sales Equilibrada de Hank (CaCl_{2} (0,14 g/l, KCl (0,4 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,06 g/l), MgCl_{2}-6H_{2}O (0,1 g/l), MgSO_{4}-7H_{2}O (0,1 g/l), NaCl (8 g/l), NaHCO_{3} (0,3 g/l), Na_{2}HPO_{4} (0,048 g/l), D-glucosa (1 g/l)). Un control negativo alternativo es PBS. Se considera que una quimiotaxina candidato no es quimiotáctica para un tipo de célula si la quimiotaxina candidato, a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, o 10 ng/ml, 100 ng/ml o 1 \mug/ml, no atrae más células (v.g., al menos tantas, a veces al menos 1,5 veces más) que el control negativo en un ensayo in vitro. Análogamente, en diversas realizaciones, se considera que una quimiotaxina candidato es quimiotáctica para un tipo de célula particular si la quimiotaxina candidato, cuando se inyecta a 2 \mug, alternativamente 10 \mug, a menudo 20 \mug, atrae la célula al menos 2 veces, con preferencia al menos 5 veces, y a menudo al menos 10 veces más que PBS (un control negativo) en un ensayo in vitro (v.g. inyección intradérmica en un ratón o un mono). En diversas realizaciones, una quimiotaxina candidato se considera no quimiotáctica para un tipo de célula si la quimiotaxina candidato, cuando se inyecta a 2 \mug, alternativamente 10 \mug, a menudo 20 \mug, no atrae más células del tipo (v.g., al menos tantas, a veces al menos 1,5 veces más) que el control negativo en un ensayo in vivo. La PBS es solución salina tamponada con fosfato (KCl (0,2 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,2 g/l), NaCl (8,0 g/l), Na_{2}HPO_{4} (2,16 g/l)).
Technologies), con Ca^{++} 1,4 mM y Mg^{++} 1 mM. HBSS es Solución de Sales Equilibrada de Hank (CaCl_{2} (0,14 g/l, KCl (0,4 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,06 g/l), MgCl_{2}-6H_{2}O (0,1 g/l), MgSO_{4}-7H_{2}O (0,1 g/l), NaCl (8 g/l), NaHCO_{3} (0,3 g/l), Na_{2}HPO_{4} (0,048 g/l), D-glucosa (1 g/l)). Un control negativo alternativo es PBS. Se considera que una quimiotaxina candidato no es quimiotáctica para un tipo de célula si la quimiotaxina candidato, a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, o 10 ng/ml, 100 ng/ml o 1 \mug/ml, no atrae más células (v.g., al menos tantas, a veces al menos 1,5 veces más) que el control negativo en un ensayo in vitro. Análogamente, en diversas realizaciones, se considera que una quimiotaxina candidato es quimiotáctica para un tipo de célula particular si la quimiotaxina candidato, cuando se inyecta a 2 \mug, alternativamente 10 \mug, a menudo 20 \mug, atrae la célula al menos 2 veces, con preferencia al menos 5 veces, y a menudo al menos 10 veces más que PBS (un control negativo) en un ensayo in vitro (v.g. inyección intradérmica en un ratón o un mono). En diversas realizaciones, una quimiotaxina candidato se considera no quimiotáctica para un tipo de célula si la quimiotaxina candidato, cuando se inyecta a 2 \mug, alternativamente 10 \mug, a menudo 20 \mug, no atrae más células del tipo (v.g., al menos tantas, a veces al menos 1,5 veces más) que el control negativo en un ensayo in vivo. La PBS es solución salina tamponada con fosfato (KCl (0,2 g/l), KH_{2}PO_{4} (0,2 g/l), NaCl (8,0 g/l), Na_{2}HPO_{4} (2,16 g/l)).
En algunas realizaciones, se determina que un
agente es un agente quimiotáctico dado que el mismo tiene actividad
quimiotáctica mayor que una quimiotaxina conocida (v.g., conocida en
la técnica o determinada por los ensayos descritos en esta
memoria).
Pueden utilizarse también ensayos de quimiotaxis
no basados en filtros, v.g., puede realizarse un ensayo de
migración de células utilizando una monocapa de células que ha
crecido sobre el filtro como una barrera. En otros ejemplos, puede
evaluarse también la motilidad celular por monitorización del
movimiento de una sola célula bajo un
vídeo-microscopio. En estos tipos de experimentos,
el quimioatrayente se aplica a través de un capilar, y se registra
la distancia física de movimiento lateral de la célula hacia la
fuente del quimioatrayente.
En una realización, pueden determinarse las
propiedades quimiotácticas de un agente en animales, v.g.,
mamíferos tales como primates no humanos y ratones, como se describe
en los Ejemplos 2-4, más adelante. En un
ensayo in vivo, el agente quimiotáctico candidato (v.g.,
2-20 \mug en PBS) se administra por inyección
intradérmica al animal. Después de cierto período de tiempo (v.g.,
24 h, 72 h, 96 h), se practica la eutanasia al animal, o se efectúa
una biopsia. El área situada alrededor del sitio de inyección se
corta y se somete a histología rutinaria o técnicas
imunohistológicas para determinar la presencia o ausencia de
infiltración celular y, si está presente un infiltrado, caracterizar
y cuantificar las células infiltrantes (véase, v.g., células
mononucleares, neutrófilos, células dendríticas, etc.). Para métodos
histológicos generales, véase, v.g., The Ma-nual of
Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of
Pathology'', por Lee G. Luna, McGraw-Hill, 3ª
edición, 1968 (en lo sucesivo "Luna"). En una realización, las
células se caracterizan por preparación de secciones congeladas y
tinción con anticuerpos específicos del tipo de célula, o
combinaciones de anticuerpos específicas del tipo de células,
utilizando métodos bien conocidos (véase, Harlow et al.,
1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory).
Como se ha indicado supra, pueden
utilizarse poblaciones de células enriquecidas o sustancialmente
purificadas en ensayos de quimiotaxis in vitro. Estas
poblaciones de células se pueden preparar por una diversidad de
métodos conocidos en la técnica, dependiendo del tipo específico de
célula deseado. Típicamente, se preparan poblaciones de células
sustancialmente purificadas por cultivo en condiciones específicas,
por características físicas tales como comportamiento en un
gradiente de densidad, por clasificación de acuerdo con marcadores
característicos (v.g., por clasificación de células activada por
fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos monoclonales para
proteínas de la superficie celular, inmunoprecipitación), u otros
métodos.
Las células (v.g., en una muestra enriquecida
in vitro o en un infiltrado in vivo) pueden
identificarse histológicamente (véase, v.g., Luna, supra),
por tinción inmunológica, y métodos similares (véase, v.g., Harlow,
supra; Coligan et al., supra). Las Tablas 2A y
2B enumeran marcadores ilustrativos útiles para caracterización o
purificación (v.g., clasificación FACS) de ciertas células del
sistema inmunitario. Muchos otros marcadores se conocen en la
técnica, tanto para las células enumeradas como para otras células
del sistema inmunitario tales como células B, células T,
neutrófilos, eosinófilos, y otras (véase, v.g.,
Janeway-Travers, 1994, ImmunoBiology Garland Pub.,
N.Y.; Paul, Fundamental Immunology 3ª edición, Raven Press, N.Y.
1993). La Tabla 2A muestra ciertos marcadores clásicos de la
superficie celular; la Tabla 2B muestra ciertos receptores de
quimioquinas expresados por tipos de células específicos.
| CD3 | CD14 | CD20 | CD25 | CD68 | CD80 | CD83 | CD86 | HLA-DR | CD1a | |
| DCs | - | - | - | - | + | - | - | - | Baja | Alta |
| inmaduras | ||||||||||
| derivadas de | ||||||||||
| monocitos | ||||||||||
| DCs maduras | - | - | - | + | + | + | Alta | Alta | + | |
| Macrófagos | Alta | Alta | - | |||||||
| Monocitos | - | + | - | - | - | - | Baja | Baja | - | |
| \begin{minipage}[t]{160mm} Clave: La Tabla 2A muestra los niveles de marcadores tal como se determinan por tinción con un anticuerpo específico para el marcador. "-" indica tinción equivalente a un anticuerpo de control isotipo (un anticuerpo de control isotipo es un anticuerpo del mismo isotipo que el anticuerpo de tinción, pero que no reconoce el epítope en cuestión); "+" indica niveles de tinción al menos 10 veces mayores que el control isotipo; "baja" indica tinción 2-5 veces mayor que el control isotipo; "alta" indica tinción 10 a 1000 veces mayor que el control isotipo. \end{minipage} |
| CC | CC | CC | CC | CC | CC | CXC | CXC | CXC | CXC | CXC | XC | |
| R1 | R2 | R3 | R5 | R6 | R7 | R1 | R2 | R3 | R4 | R5 | R1 | |
| DCs | ||||||||||||
| inmaduras | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | - |
| DCs | ||||||||||||
| maduras | - | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - |
| Monocitos | + | + | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
Para ayudar adicionalmente al lector, se
describen a continuación brevemente métodos para preparar
composiciones de células sustancialmente purificadas para uso en
ensayos de quimiotaxis in vitro, y en los ejemplos. Sin
embargo, se reconocerá que la invención no requiere que se utilice
ningún método de purificación particular, con tal que se obtengan
las células deseadas, y que son conocidas por los expertos en la
técnica muchas variaciones y métodos alternativos. Adicionalmente,
se apreciará que muchos otros métodos de purificación y detección,
con inclusión de métodos adecuados para células no enumeradas
específicamente en esta memoria, se conocen en la técnica o pueden
desarrollarse. Aún más, se apreciará que, en caso deseado, pueden
utilizarse líneas de células clonadas derivadas de tejidos del
sistema inmunitario en los ensayos de quimiotaxis descritos en esta
memoria. Métodos generales inmunológicos, de purificación y de
cultivo de células se describen en Coligan et al., 1991,
Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, con
inclusión de los suplementos hasta 1999. A no ser que se especifique
otra cosa, las células, una vez cultivadas, se incuban a 37ºC en
CO_{2} al 5%.
Métodos adecuados para la purificación de
monocitos se encuentran en Bender et al., 1996, J.
Immunol. Methods 196:121-35 (véase también la
patente U.S. No. 5.994.126). Resumidamente, se aislan monocitos de
PBMC por agotamiento de células T utilizando anticuerpos
inmovilizados contra un marcador CD2 de la superficie de las células
T en bandeja. Convenientemente, se utiliza una fuente de anticuerpos
CD2 disponible comercialmente fijados a bolitas magnéticas (Dynal).
PBMC aisladas de una capa superficial de plasma coagulado
(típicamente 35 ml que contienen 400 x 10^{6} PBMC) por el método
convencional de centrifugación en gradiente de Ficoll se resuspenden
en tampón MACS (constituido por DPBS (HyClone) con 1% de BSA
(Sigma)) a 20 x 10^{6} células por ml. DPBS es Solución Salina
tamponada con Fosfato de Dulbecco (CaCl_{2} (0,1 g/l), KCl (0,2
g/l), KH_{2}PO_{4} (0,2 g/l),
MgCl_{2}-6H_{2}O (0,1 g/l), NaCl (8,0 g/l),
Na_{2}HPO_{4} (2,16 g/l)). Se añade a las células una cantidad
apropiada de bolitas magnéticas CD2+ inmovilizadas (típicamente 10
\mul por 10^{6} células). La mezcla se incuba durante 15 minutos
a 4ºC con rotación moderada. Las células T marcadas magnéticamente
se separan de las células sin marcar en un clasificador de células
magnético (Dynal) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las
células sin marcar contienen fundamentalmente monocitos y células
B.
Las células B contenidas en la preparación
anterior se separan por el método convencional de adherencia a
plástico. Resumidamente, PBMC empobrecidas en células T se dejan
adherir al plástico de un matraz de cultivo de tejidos
T-175 (100 x 10^{6} células/matraz) (Costar)
durante 3 horas a 37ºC. Las células no adherentes (que comprenden
principalmente células B) se aspiran. Los matraces se enjuagan 3
veces más con DPBS para separar completamente las células no
adherentes. Las células resultantes están muy enriquecidas (a saber,
> 90%) en monocitos.
Los monocitos pueden aislarse también por
selección positiva de antígeno CD14. Resumidamente, PBMC aisladas de
sangre periférica, tal como una capa superficial de plasma coagulado
por el método estándar de centrifugación en gradiente de Ficoll se
resuspenden en tampón MACS a 1 x 10^{6} células/ml. Se añaden
anticuerpos inmovilizados contra el antígeno de superficie CD14,
tales como microbolas magnéticas CD14+ (Milteyni) (1 \mul de
bolitas por cada 1 x 10^{6} células) y la mezcla se incuba a 4ºC
durante 15 minutos. Los monocitos se separan de las otras
poblaciones de células haciendo pasar la mezcla a través de una
columna de selección positiva sobre un clasificador de células
magnético (Miltenyi) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.
Los monocitos que quedan retenidos en la columna se eluyen con
tampón MACS después de retirar la columna del aparato MACS. Las
células se sedimentan después por centrifugación y se resuspenden en
medio RMPI más 10% FCS a 10^{6} células por ml. Los monocitos
aislados por este método se cultivan esencialmente de la misma
manera que los aislados por el método de agotamiento con CD2+.
Se conocen en la técnica métodos adecuados para
la purificación de células dendríticas, que incluyen poblaciones
maduras e inmaduras separadas. Las células dendríticas
sustancialmente purificadas (con inclusión de subpoblaciones de
células maduras o inmaduras) pueden prepararse por condiciones
selectivas de cultivo in vitro.
Las células dendríticas están ampliamente
distribuidas en todos los tejidos que tienen contacto con patógenos
potenciales (v.g., piel, tractos gastrointestinal y respiratorio, y
áreas ricas en células T de los tejidos linfoides secundarios). En
la piel y el tracto respiratorio superior, aquéllas forman una red
de células muy arborizadas (denominadas células de Langerhans en la
piel). Después de la captura del antígeno, las células dendríticas
en los tejidos periféricos tales como la piel y el intestino
transitan por el sistema linfático de drenaje a las áreas de las
células T de los ganglios linfáticos donde aquéllas presentan el
antígeno que se había internalizado en el punto de contacto con el
patógeno. Las células dendríticas inmaduras actúan para capturar y
procesar los antígenos. Durante la migración subsiguiente al ganglio
linfático de drenaje, la DC madura. Las células dendríticas maduras
actúan como la APC clave para iniciar las respuestas inmunológicas
por inducción de la proliferación de células T citotóxicas y
adyuvantes específicas del patógeno.
Poblaciones sustancialmente puras de células
dendríticas pueden producirse por cultivo in vitro (véase
más adelante). Adicionalmente, existen cambios marcados en la
expresión de receptores de quimioquinas durante la maduración de las
células dendríticas que pueden utilizarse para identificar la etapa
celular (Campbell et al., 1988, J. Cell Biol 141:
1053; Chan et al., 1999, Blood 93: 3610; Dieu et
al., 1998, J Exp Med 188: 373; Kellermann et al.,
1999, J Immunol 162: 3859). Por ejemplo, las células
dendríticas inmaduras expresan predominantemente CCR1, CCR5, y
CXCR4. Después de la maduración, estos receptores, con la excepción
de CXCR4, se regulan en sentido decreciente. Véase también la
Tabla 2B.
En cultivo, las formas inmaduras de las células
dendríticas experimentan una maduración que se cree análoga a lo que
ocurre durante la migración de las células dendríticas desde el
punto de contacto con el antígeno hasta su alojamiento en los
tejidos linfoides secundarios. Células dendríticas humanas o de
macaco de diversas etapas de desarrollo pueden generarse en cultivo,
a partir de progenitores CD14^{+} de la sangre utilizando
citoquinas específicas. Un linaje separado de células dendríticas
puede diferenciarse de las células precursoras CD34+ de sangre del
cordón umbilical o de la médula ósea. Así, en una realización de la
invención, se generan subpoblaciones de células dendríticas para
ensayos in vitro con objeto de identificación de
composiciones quimiotácticas (es decir, para evaluar la potencia y
selectividad de las quimiotaxinas contra sub-tipos
DC definidos). Subpoblaciones ilustrativas de células dendríticas
son: 1) células inmaduras derivadas de monocitos de sangre
periférica; 2) células maduras derivadas de monocitos de sangre
periférica, y 3) células derivadas de precursores CD34+. Las
subpoblaciones se aislan o producen por una diversidad de métodos
conocidos en la técnica.
Por ejemplo, las células dendríticas inmaduras y
maduras de PBMCs se producen de acuerdo con Bender et al.,
supra.
Resumidamente, se empobrecen PBMCs en células T
utilizando anticuerpos inmovilizados contra el marcador CD2 de la
superficie celular (presente en todas las células T). Pueden
utilizarse Dynabeads CD2+ disponibles comercialmente (Dynal) de
acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla empobrecida en
células T se separa en fracciones adherentes frente a fracciones no
adherentes por incubación de las células en plástico de calidad para
cultivo de tejidos durante 3 horas a 37ºC. Las células adherentes se
fijan a la superficie en el transcurso de las tres horas, mientras
que las células no adherentes quedan en suspensión. Las células no
adherentes se separan suavemente y las células adherentes
(generalmente monocitos CD14^{+}) se ponen en medio de cultivo
(v.g., RMPI + 10% FCS) complementado con 1000 U/ml en cada caso de
GM-CSF e IL-4 (R & D Systems,
Minneapolis, MN) ("Día 1"). Entre los días 3 y 7, las células
comienzan a exhibir una morfología velada, y las citoquinas se
reponen los días 2, 4 y 6, llegado cuyo momento las células pueden
cosecharse como células dendríticas inmaduras. En una realización,
las células de esta etapa in vitro se aislan y se utilizan en
el ensayo. Se obtienen por regla general aproximadamente 10 x
10^{6} células dendríticas a partir de 400 x 10^{6} PBMCs.
Las células dendríticas inmaduras del día 7
exhiben la morfología típica de células dendríticas, con cuerpo
celular alargado y muchas prominencias. El tamaño de las células
aumenta significativamente en comparación con los monocitos
precursores. Las células dendríticas inmaduras pueden caracterizarse
fenotípicamente por monitorización de su expresión de marcadores de
la superficie celular.
Las células dendríticas inmaduras (generadas a
partir de monocitos de sangre periférica o de precursores CD34+
derivados de médula ósea), pueden activarse y diferenciarse
ulteriormente para convertirse en células dendríticas maduras. Se
utilizan fundamentalmente dos métodos: MCM (medio acondicionado de
macrófagos) y estimulación con RNA-poli (I:C)
bicatenario (Cella et al., 1999, J. Exp. Med. 189:
821-9; Verdijk et al., 1999, J.
Immunol. 1999 1: 57-61).
En el método MCM, las células dendríticas
inmaduras del día 6 se cosechan por centrifugación y se resuspenden
a razón de 10^{6} células/ml en medio de maduración (v.g., MCM
diluido (hasta 1:1 con RPMI que contiene 10% FCS). Se añaden
GM-CSF (100 U/ml) e IL-4 (1000
U/ml). Las células se cultivan durante 3 días más, sin adición
ulterior de GM-CSF (1000 U/ml) e
IL-4. El día 9, las células se utilizan como células
dendríticas maduras.
En el método poli (I:C), las células dendríticas
inmaduras del día 6 se recosechan y se suspenden de nuevo en el
medio de cultivo estándar (RPMI más 10% FCS) complementado con 20
\mug/ml de poli (I:C) (Sigma), 1000 U/ml de GM-CSF
e IL-4. Las células se cultivan durante 3 días más
sin citoquinas adicionales. El día 9, las células son células
dendríticas maduras.
Las células dendríticas maduras generadas por
estos dos métodos diferentes exhiben propiedades fenotípicas y
funcionales distintas de las que son propias de las células
dendríticas inmaduras o los monocitos precursores (véase la Tabla
2A). Las células dendríticas maduras de cada preparación se
caracterizan concienzudamente por FACS para tener la seguridad de
que se obtienen los tipos de células deseables.
Es notable que las células dendríticas maduras
generadas expresan un nivel significativamente mayor de MHC clase II
en la superficie celular que las células inmaduras. La expresión de
CD80, CD83 y CD86 está regulada también en sentido creciente. La
expresión de los receptores de quimioquinas cambia también
espectacularmente durante el proceso de maduración. Por ejemplo,
CCR1 y CCR5 están regulados en sentido bruscamente decreciente en
las células maduras, mientras que CCR7 está regulado en el sentido
creciente y aparece en la superficie celular al cabo de unas pocas
horas después de la adición de MCM. Funcionalmente, las células
dendríticas maduras ya no son capaces de capturar eficientemente un
antígeno, pero adquieren la aptitud para estimular la proliferación
de células T tratar y células B naturales. Las células dendríticas
maduras cambian también sus comportamientos migratorios; las mismas
no responden ya a ligandos de CCR1, CCR2 y CCR5 tales como
MIP-1\alpha, RANTES y
MIP-1\beta. En lugar de ello, aquéllas responden a
los ligandos SLC y ELC de CCR7.
MCM se prepara como ha sido descrito por Romani
et al., 1996, J. Immunol. Methods 196: 137) con
modificaciones menores. Resumidamente, se recubren cápsulas petri
(100 mm, Falcon) con 5 ml de Ig humana (10 mg/ml) durante 30 min a
37ºC y se lavan 2-3 veces con PBS inmediatamente
antes de su utilización. Se estratifican 50 x 10^{6} PBMC en un
volumen de 8 ml sobre placas recubiertas con Ig humana durante
1-2 horas. Las células no adherentes se eliminan por
lavado y se desechan. Las células adherentes se incuban en medio
completo reciente (RPMI + 10% de suero humano normal) a 37ºC y el
medio resultante (MCM) se recoge después de 24 horas. La
concentración de TNF-a en el MCM se determina por
el método estándar ELISA (v.g., utilizando un kit ELISA de
TNF-a (R & D Systems, Minneapolis, MN)). El
nivel final de TNF-a en MCM se ajusta a 50 U/ml por
mezcla de una cantidad apropiada de MCM con RPMI que contiene 10% de
suero de ternero fetal.
Se conocen en la técnica medios adecuados para la
purificación de neutrófilos. De acuerdo con un método adecuado,
para purificar neutrófilos, se diluye sangre entera reciente (WB) en
relación 1:1 con dextrano al 3% en un tubo de centrífuga de 50 ml, y
se deja sedimentar durante 30-45 min a la
temperatura ambiente. 25 ml de WB más 25 ml de dextrano da como
resultado aproximadamente 35 ml de sobrenadante después de 30 min de
sedimentación. El sobrenadante se estratifica sobre
12-15 ml de Ficoll y se centrifuga a 400 x g durante
30-40 min a 18-20ºC. La capa de
plasma/plaquetas que contiene células mononucleares y
Ficoll-Paque se separa por aspiración. Los
neutrófilos se encuentran en la capa blanca por encima de la capa de
eritrocitos (RBC). (En algunas preparaciones, las capas de
neutrófilos y eritrocitos están mezcladas. En estos casos, se
separan los RBCs por lisis hipotónica de la manera siguiente: se
añaden 12,5 ml de NaCl al 0,2% frío al sedimento de neutrófilos/RBC
mientras se agita enérgicamente. Se añaden inmediatamente 12,5 ml de
NaCl al 1,6% frío mientras se agita todavía enérgicamente. Las
células se centrifugan a 60-100 x g durante 10 min y
se recuperan. En caso necesario, se repite el paso de lisis.) Los
neutrófilos resultantes tienen una pureza >95% (con los
eosinófilos como las células remanentes fundamentales).
Se conocen en la técnica métodos adecuados para
la purificación de macrófagos. Un método adecuado se describe en
Paluka et al., 1998, "Dendritic cells as the terminal stage
of monocyte differentiation", J. Imm. 9: 4587-95,
que se incorpora en esta memoria en su totalidad para todos los
propósitos.
Se conocen en la técnica métodos adecuados para
la purificación de células T. Los linfocitos T se preparan
rutinariamente por eliminación de monocitos a partir de las PBMC
preparadas por el método estándar de centrifugación en gradiente de
Ficoll (Coligan, supra). La eliminación de los monocitos se
efectúa dejando que las PBMC se adhieran a los matraces de cultivo
de tejidos. Las células no adherentes (linfocitos) se cultivan en
RPMI + 10% FCS en presencia de una combinación de PHA (5 \mug/ml)
e IL-2 recombinante humana (20 ng/ml) durante dos
semanas, y las células se recogen para su ensayo.
Se conocen en la técnica métodos adecuados para
la purificación de células B. Se aislan poblaciones de células B
altamente purificadas por selección negativa con agotamiento
secuencial de monocitos/células agresoras naturales y células T
(como se describe en Current Protocols in Immunology). El
empobrecimiento de monocitos y células NK se efectúan por
utilización de éster metílico de L-leucina
(L-LME). Resumidamente, las PBMC aisladas de sangre
periférica (v.g., de una capa superficial de plasma coagulado) por
el método estándar del gradiente de Ficoll se resuspenden a razón de
3 x 10^{6} células/ml en PBS. Se añade L-LME
recién preparado (solución 0,05 M en RPMI, sin suero) a las células
en una dilución de 1:10 (5 mM final). La mezcla se incuba durante 35
minutos a la temperatura ambiente, y se reducen las células a un
sedimento por centrifugación, seguido por lavado 3x con PBS. Las
células T se empobrecen ulteriormente por formación de rosetas con
glóbulos rojos de oveja tratados con neuraminidasa (NSRBC) de la
manera siguiente: Las células se ajustan a 10^{7} células/ml en
RPMI/10 FCS. Se transfieren 5 ml de células a un tubo de centrífuga
de 50 ml. Se añaden al tubo 2,5 ml de suero de ternero fetal y 2,5
ml de NSRBC. La mezcla se incuba durante 10 minutos a 37ºC. Se
centrifugan luego las células a 150 x g a la temperatura ambiente
durante 10 minutos para reducir las células a un sedimento y
promover la formación de rosetas. La mezcla se incuba a 4ºC durante
2 horas. Se resuspende suavemente el sedimento, y la suspensión de
células se soporta con Ficoll (10 ml). Se centrifuga el tubo a 400 x
g durante 25 minutos. Las células B que quedan en la interfase se
retiran, se reducen a un sedimento y se lavan tres veces con HBSS.
Después de repetir el paso de formación de rosetas, las células B se
resuspenden en RPMI/10% FCS para los ensayos de migración.
Se conocen en la técnica métodos adecuados para
la purificación de eosinófilos. Un método para preparación de
eosinófilos sustancialmente purificados es por aislamiento ulterior
a partir de la preparación descrita en el protocolo de aislamiento
de neutrófilos, supra. La separación de los eosinófilos a
partir de los neutrófilos se efectúa por un método de selección
negativo, en el cual se utilizan anticuerpos inmovilizados contra el
antígeno de superficie CD16 para empobrecer los neutrófilos CD16
positivos. Resumidamente, la preparación de neutrófilos se
resuspende en tampón MACS (1% BSA en DPBS) a una densidad de
10^{6} células/\mul. Se mezcla con las células un volumen igual
de microbolas CD16+ (CD16 inmovilizado sobre esferas magnéticas:
Miltenyi Biotech; Auburn, CA). La mezcla se incuba a 4ºC con
agitación suave mediante sacudidas durante 30 minutos. Se hacen
pasar luego las células a través de una columna de selección
negativa que separa los neutrófilos marcados magnéticamente (columna
CS, Miltenyi Biotech; Auburn, CA) LC, Miltenyi) y se lava la columna
con un volumen de columna de tampón MACs. Las fracciones de flujo
directo y de lavado contienen eosinófilos y se combinan. Los
eosinófilos aislados por este método tienen una pureza mayor que 95%
(como se determina por FACS, v.g., por la presencia de las células
CD16+).
Como se ha expuesto supra, las
APC-quimiotaxinas pueden ser cualquiera de cierto
número de tipos de compuestos. A menudo, la quimiotaxina es una
proteína, tal como una quimioquina, o un mimético de proteína. Así,
una composición quimiotáctica comprende una o más quimioquinas,
análogos de quimioquinas, o polinucleótidos codificantes de
quimioquinas.
Las quimioquinas son hormonas proteínicas que,
entre otras actividades, dirigen el tráfico de las poblaciones de
glóbulos blancos, v.g., en los órganos linfoides primarios, sangre,
tejidos, órganos linfoides secundarios, linfa, y (en algunos casos),
vuelven a la circulación. Se han identificado hasta la fecha más de
50 quimioquinas distintas en humanos, y se conocen numerosas
quimioquinas de otros mamíferos y quimioquinas codificadas por virus
de mamífero.
Estructuralmente, las quimioquinas conocidas se
dividen en cuatro clases: CC, CXC, C, y CX3C, basadas en el número y
el espaciamiento de los residuos cisteína
amino-terminales en un resto estructural conservado.
Las quimioquinas ejercen efectos promigratorios por fijarse a un
conjunto de receptores de la superficie celular en la superficie de
los leucocitos diana. Receptores conocidos son de la clase de los
receptores acoplados a la proteína G que abarca 7 dominios
transmembranales (7TM GPCR). De los casi 20 receptores de
quimioquinas humanos caracterizados (es decir, aquellos receptores
para los cuales se ha identificado un ligando y que fijan y/o
señalan sucesos bien caracterizados), nueve son receptores de
quimioquinas CC (CCR), seis son receptores de quimioquinas CXC
(CXCR), uno es un receptor de quimioquinas CX3C (CX3CR), y uno es un
receptor de quimioquinas C (provisionalmente 'XCR'). Adicionalmente,
se conoce un receptor de quimioquinas promiscuo de especificidad de
fijación ancha (conocido originalmente como el antígeno del grupo
sanguíneo Duffy (Duffy Ag, designado a veces 'DARC')).
Las proteínas quimioquina pueden obtenerse de
suministradores, v.g., R & D Systems (Minneapolis, MN;
http://cytokine.mdsystems.com/cyt_cat/cyt_cat.html),
o se pueden preparar utilizando técnicas de rutina basadas en
secuencias publicadas (v.g., como se describe en Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª edición)
Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel
et al., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Para
revisiones recientes sobre quimioquinas, véase Ward et al.,
1998, Immunity 9: 1-11 y Baggiolini et
al., 1998, Nature 392: 565-568, y las
referencias citadas en dicho lugar. Véanse también el CFD (Citokyne
Facts Book, 1994, Academic Press Ltd.), Chemokine Facts Book, 1997,
Academic Press Ltd. y la base de datos de secuencias proteínicas
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi). Referencias
adicionales se proporcionan más adelante en la Sección 14.
Las quimioquinas utilizadas en las composiciones
de la presente invención o para preparar las mismas pueden ser
naturales (es decir, tener la secuencia de una quimioquina existente
naturalmente), pueden ser el producto de recombinación in
vitro de polinucleótidos que codifican quimioquinas existentes
naturalmente, o pueden ser sintéticas (es decir, sintetizadas
químicamente) o variantes recombinantes de secuencias de
quimioquinas existentes naturalmente. Las quimioquinas comprenden
secuencias de especies humana, de primates, de roedores, víricas, y
otras. En algunas realizaciones, se utilizan secuencias xenógenas en
los métodos de vacunación de la invención (v.g., si la quimioquina
más potente es de una especie distinta de la especie del individuo a
inmunizar) debido a que cualesquiera efectos inmunógenos
intensificarán probablemente la actividad adyuvante.
En la presente invención, las composiciones
contienen al menos una APC-quimiotaxina,
seleccionada de las quimioquinas vMCK-2 y mC10,
variantes de la misma que no cambian las propiedades quimiotácticas
del polipéptido, o un polinucleótido que codifica una de las
anteriores.
Se llevaron a cabo ensayos de quimiotaxis in
vitro para determinar el perfil quimiotáctico de una serie
extensa de quimioquinas conocidas. Cierto número de quimioquinas
conocidas son quimiotácticas para las células dendríticas inmaduras,
pero no para las maduras, incluyendo: hMIP1\alpha, hMIP1\alpha
(70 aa), mMIP1\alpha, hRANTES, hMET-RANTES,
mRANTES, hHCC-1, hMPIF-1,
hMPIF-1 (22-137),
hMPIF-1 (46-137),
hMIP-1\delta, hMCP-4,
mMCP-5, mMARC, mEotaxina,
mMCP-1(JE), mTECK, mMIP-2,
nBLC, hLeucotactina, mMIG, y mIP-1\beta. Otras
quimioquinas particularmente útiles incluyen hMCP-2,
hMCP-3, vMIP-1,
hMIP-3\alpha, hMIP-3\beta, y
vMCK-2 (véanse los ejemplos, más adelante). Varias
quimioquinas eran quimiotácticas para las células dendríticas
inmaduras pero no eran quimiotácticas para los neutrófilos y otros
tipos de células ensayados en pruebas in vitro (mC10, mMDC,
hMIP-1\beta, mMIP-1\gamma; véase
la Tabla 3).
| DCs | DCs | Monocitos | Neutrófilos | Eosinófilos | CEM | |
| Inmaduras | Maduras | (línea de | ||||
| células T)^{1} | ||||||
| mC10 | + | - | - | - | - | - |
| mMDC | + | - | - | - | - | - |
| hMIP-1\beta | + | - | - | - | - | - |
| mMIP-1\gamma | + | - | - | - | - | - |
| 1. ATTC No. CCL-119. |
En una realización, una molécula de
APC-quimiotaxina tiene la secuencia de una molécula
de quimiotaxina existente naturalmente o tiene una secuencia de
aminoácidos con identidad sustancial de secuencia de aminoácidos
respecto a la secuencia de una molécula de quimiotaxina existente
naturalmente. Por ejemplo, polipéptidos de quimioquinas, tales como
las quimioquinas enumeradas supra, pueden modificarse de
maneras que no cambian las propiedades quimiotácticas del
polipéptido existente naturalmente, por ejemplo, por sustituciones
conservadoras de aminoácidos, truncaciones (especialmente en los
extremos), pequeñas deleciones o inserciones internas, etcétera.
Tales modificaciones pueden realizarse utilizando técnicas
rutinarias de ingeniería genética, v.g., utilizando mutagénesis
orientada, y los mutantes resultantes se evalúan respecto a
propiedades quimiotácticas (v.g., utilizando los ensayos descritos
en esta memoria).
Adicionalmente, pueden utilizarse técnicas
recombinantes y sintéticas para modificar moléculas o secuencias de
quimioquinas existentes naturalmente (con inclusión, pero sin
carácter limitante, de las enumeradas supra y en la Tabla 3)
para modificar las propiedades quimiotácticas del polipéptido en
comparación con el o los polipéptidos originarios.
Para los propósitos de la presente invención,
pueden prepararse quimiotaxinas sintéticas, modificadas por
ingeniería genética o recombinantes, y evaluarse respecto a la
aptitud para movilizar las APCs (v.g., células dendríticas). En una
realización, se generan APC-quimiotaxinas a partir
de una combinación de quimioquinas naturales utilizando tecnología
de DNA sintético o recombinante. Por ejemplo, pueden recombinarse
diferentes quimioquinas (v.g. humanas, víricas, murinas, etcétera)
(v.g., genéticamente) para formar quimeras o "hibriquinas" que
se ensayan respecto a la actividad deseada (v.g., la aptitud para
atraer células dendríticas inmaduras pero no neutrófilos, actividad
quimioatractiva intensificada a concentraciones menores). En una
realización afín, las quimeras se sintetizan químicamente basándose
en la secuencia de quimioquinas originarias (v.g., existentes
naturalmente).
En una realización, las secuencias de
polipéptidos de quimioquina de interés se dividen en cuatro
``dominios'' dictados por el espaciamiento de los residuos cisteína
(véase Fig. 2 y Ejemplo 5). Alternativamente, las secuencias se
dividen en "dominios" múltiples (v.g., 2, 3, 4 o más) de
cualquier longitud (pero típicamente al menos 5, más a menudo al
menos 10 residuos), para el propósito de construcción de híbridos.
Las secuencias se recombinan conceptualmente para formar secuencias
quiméricas, en las cuales una región tiene una secuencia de un
primer polipéptido de quimioquina y una segunda región tiene la
secuencia de un segundo polipéptido de quimioquina, como se ilustra
en Fig. 2. Se producen luego polipéptidos quiméricos (hibriquinas)
que tienen la secuencia quimérica por medios de síntesis rutinarios
(o, alternativamente, por utilización de técnicas de DNA
recombinantes, como se describe más adelante). Los métodos de
síntesis de polipéptidos son bien conocidos en la técnica y se
describen, v.g., en la patente U.S. No. 4.108.846; véase también,
Caruthers et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser.,
215-223; Horn et al., 1980,
Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232; Roberge, et al., 1995, Science, 269:202). Si se desea, polipéptidos cortos pueden fusionarse por condensación del término amino de una molécula con el término carboxilo de la otra molécula para formar un enlace peptídico a fin de producir un polipéptido más largo. El péptido recién sintetizado puede purificarse sustancialmente, por ejemplo, por cromatografía líquida preparativa de alta resolución (v.g. Creighton, 1983, Proteins, Structures, and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., Nueva York, NY).
Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232; Roberge, et al., 1995, Science, 269:202). Si se desea, polipéptidos cortos pueden fusionarse por condensación del término amino de una molécula con el término carboxilo de la otra molécula para formar un enlace peptídico a fin de producir un polipéptido más largo. El péptido recién sintetizado puede purificarse sustancialmente, por ejemplo, por cromatografía líquida preparativa de alta resolución (v.g. Creighton, 1983, Proteins, Structures, and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., Nueva York, NY).
En una realización alternativa, los
polinucleótidos que codifican quimioquinas originarias de interés se
manipulan para producir quimioquinas variantes o quiméricas tales
como las descritas supra (v.g., el polinucleótido se divide
en 'dominios' múltiples dictados por el espaciamiento de los
residuos cisteína del polipéptido codificado y construcciones de
genes híbridos) o se preparan polinucleótidos sintetizados
químicamente. Los genes híbridos se someten a subclonación en
vectores de expresión apropiados y se introducen (v.g., por
transfección) en células hospedadoras (v.g., células bacterianas o
eucariotas) y las células se cultivan en condiciones en las cuales
se expresa la proteína recombinante. Los sobrenadantes de las
células transfectadas se ensayan respecto a las propiedades
quimioatrayentes deseadas utilizando los ensayos arriba descritos.
Técnicas para manipulación y expresión de ácidos nucleicos se
describen en líneas generales, v.g., en Sambrook, et al.,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición), vols.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel et
al. (compiladores) (con suplementos hasta 1999) Current
Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY.
En una realización, la molécula quimérica puede
comprender al menos 10 residuos contiguos de cada una de al menos
dos quimioquinas diferentes existentes naturalmente. Al menos una de
las quimioquinas existentes naturalmente se selecciona de mC10 y
vMCK-2. Una, y a veces dos o más de las quimioquinas
adicionales, puede(n) seleccionarse de: hMIP1\alpha,
hMIP1\alpha (70aa),
mMIP-1\alpha, hRANTES,
hMET-RANTES, mRANTES, hHCC-1,
hMPIF-1, hMPIF-1
(22-137), hMPIF-1
(46-137), hMIP-1\delta,
hMCP-4, mMCP-5, mMARC, mEotaxina,
mMCP-1(JE), mTECK, mMIP-2,
mBLC, hLeucotactina, mMIG, mMIP-1\beta,
hMCP-2, hMCP-3,
vMIP-1, hMIP-3\alpha,
hMIP-3\beta, vMCK-2, y
especialmente, mC10, mMDC, hMIP-1\beta, y
mMIP-1\gamma. En una realización, las dos
quimioquinas diferentes existentes naturalmente son de especies
diferentes.
Derivados de quimioquinas existentes naturalmente
con propiedades intensificadas de atracción de células dendríticas
y reclutamiento reducido de células inmunológicas no dendríticas, se
construyen utilizando híbridos diferentes de quimioquinas humanas y
víricas. Por ejemplo, una APC-quimiotaxina (v.g. una
quimioquina) con actividad quimiotáctica potente de células
dendríticas pero actividad quimiotáctica indeseable de neutrófilos
puede recombinarse con un polipéptido que tenga actividad más débil
respecto a las células dendríticas y actividad quimiotáctica nula
para los neutrófilos a fin de producir un polipéptido con actividad
fuerte para las células dendríticas y sin actividad quimiotáctica
alguna para los neutrófilos.
En una realización, se construyen derivados de
quimioquinas con propiedades intensificadas (v.g., la aptitud para
atraer células dendríticas inmaduras pero no neutrófilos, actividad
quimioatrayente intensificada a concentraciones más bajas, etcétera)
utilizando evolución genética forzada in vitro por
utilización de cualquiera de varias técnicas rutinarias, que
incluyen enfoques de PCR propensa a error o de
recombinación/desordenamiento génico. Métodos para generar nuevos
polipéptidos con actividades deseadas por "desordenamiento"
génico se conocen en la técnica. Diversos métodos de desordenamiento
se describen en Patten et al., 1997, Curr. Opin.
Biotech.. 8:724-733; Stemmer, 1994,
Nature 370:389-391; Stemmer et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10747-10751; Zhao et al., 1997, Nucleic
Acids Res. 25: 1307-1308; Crameri et al.,
1998, Nature 391:288-291; Crameri et
al., 1997, Nat. Biotech. 15:436-438;
Arnold et al., 1997, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.
58:2-14; Zhang et al., 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et
al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:315-319;
Crameri et al., 1996, Nat. Med.
2:100-102; publicaciones PCT WO95/22625; WO97/20078;
WO97/35957; WO97/35966; WO98/13487; WO98/13485; PCT 98/00852; PCT
97/24239; y patentes U.S. Núms. 5.605.793, 5.811.238 y 5.928.905. Un
método de desordenamiento génico que conduce a un proceso de
amplificación de polinucleótidos en segmentos solapantes de una
población de variantes de un polinucleótidos en condiciones por las
cuales un segmento sirve como molde para la extensión de otro
segmento, a fin de generar una población de polinucleótidos
recombinantes, y escrutinio o selección de un polinucleótidos
recombinante o un producto de expresión del mismo para una propiedad
deseada. Algunos métodos de desordenamiento utilizan mutaciones
puntuales aleatorias (introducidas típicamente en un paso de
amplificación por PCR) como fuente de diversidad. Los polipéptidos
resultantes se ensayan respecto a actividad quimiotáctica como se ha
descrito arriba.
En una realización, el desordenamiento génico se
lleva a cabo comenzando con un polinucleótido que codifica una
quimioquina particular (v.g., vMCK-2 o mC10). En una
realización diferente, se utiliza el "desordenamiento de
familias" (véase, v.g., Cramer et al., 1998, Nature
152:88-91; Chang et al., 1999, Nat.
Biotechnol 17:793-7) y se utilizan al menos dos
polinucleótidos codificantes de quimioquinas "parentales" en la
reacción de desordenamiento de familias. Al menos uno de los
polinucleótidos codificantes de quimioquinas parentales codifica
mC10, vMCK-2 o una especie homóloga de las
mismas.
En una realización afín, el segundo o adicional
de los polinucleótidos codificantes de quimioquinas parentales
codifica una quimioquina del grupo hMIP1\alpha, hMIP1\alpha
(70aa), mMIP-1\alpha, hRANTES,
hMET-RANTES, mRANTES, hHCC-1,
hMPIF-1, hMPIF-1
(22-137), hMPIF-1
(46-137), hMIP-1\delta,
hMCP-4, mMCP-5, mMARC, mEotaxina,
mMCP-1(JE), mTECK, mMIP-2,
mBLC, mMIP-1\gamma, mMIG, y
mMIP-1\beta, hMCP-2,
hMCP-3, vMIP-1,
hMIP-3\alpha, hMIP-3\beta, mMDC,
hMIP-1\beta, y hLeucotactina.
En una realización, la molécula desordenada
resultante ("evolucionada") comprende al menos 10 residuos
contiguos de al menos una, a menudo al menos dos quimioquinas
diferentes existentes naturalmente, v.g., tales como los grupos
arriba enumerados.
En otros aspectos de la invención, se modifica
una APC-quimiotaxina (v.g., quimioquina) parental
por métodos convencionales de mutagénesis in vitro (v.g.,
mutagénesis orientada (Ausubel, supra) o manipulación
genética in vitro de polinucleótidos codificantes de
quimioquinas. La actividad de la variante resultante puede
determinarse utilizando los ensayos in vitro e in
vivo descritos en esta memoria.
En otro aspecto de la invención, se modifica un
polipéptido de APC-quimiotaxina parental (v.g., una
quimioquina) (v.g., por manipulación genética in vitro del
polinucleótido codificante de quimioquinas) a fin de producir una
versión amino- o carboxi-truncada de la proteína
madura. Alternativamente, estas versiones truncadas de la
APC-quimiotaxina pueden sintetizarse químicamente, o
producirse por procesamiento enzimático de una quimioquina existente
naturalmente. Adicionalmente, pueden utilizarse en los métodos y
composiciones de la invención variantes con sustituciones
conservadoras que retienen las propiedades deseadas. Tablas de
sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos
funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por
ejemplo, una pauta ilustrativa para seleccionar sustituciones
conservadoras incluye (residuo original seguido por sustitución
ilustrativa): ala/gly o ser; arg/lys; asn/gln o his; asp/glu;
cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala o pro; his/asn o gln; ile/leu o
val; leu/ile o val; lys/arg o gln o glu; met/leu o tyr o ile;
phe/met o leu o tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr, tyr/trp o phe; y
val/ile o leu.
Una pauta ilustrativa alternativa utiliza los
seis grupos siguientes, cada uno de los cuales contiene aminoácidos
que son sustituciones conservadoras unos de otros:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2)
Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (L),
Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I),
Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F),
Tirosina (Y), Triptófano (W); (véase también, v.g., Creighton (1984)
Proteins, W.H. Freeman and Company; Schulz y Schimer (1979)
Principles of Protein Structure,
Springer-Verlag).
Los miméticos de polipéptidos son adecuados
también para uso en los métodos de la invención. Los términos
"mimético" y "peptidomimético" hacen referencia a un
compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas
características estructurales y/o funcionales que un polipéptido de
APC-quimiotaxina de la invención (v.g. una
quimioquina específica). El mimético puede estar o bien compuesto
totalmente de análogos sintéticos no naturales de aminoácidos, o
bien se trata de una molécula quimérica constituida parcialmente por
aminoácidos peptídicos naturales y parcialmente por análogos de
aminoácidos no naturales. El mimético puede incorporar también
cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos
naturales con tal que tales sustituciones no alteren tampoco
sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. Las
composiciones de miméticos de polipéptidos pueden contener cualquier
combinación de componentes estructurales no naturales, los cuales
son típicamente de tres grupos estructurales: a) grupos de
eslabonamiento de residuos distintos de los eslabones de enlace
amídico ("enlace peptídico") naturales; b) residuos no
naturales en lugar de residuos de aminoácidos existentes
naturalmente; o c) residuos que inducen mimetismo estructural
secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura
secundaria, v.g. una conformación de vuelta beta, vuelta gamma, hoja
beta, hélice alfa y análogas.
Un polipéptido puede caracterizarse como un
mimético cuando la totalidad o algunos de sus residuos están unidos
por medios químicos distintos de los enlaces peptídicos naturales.
Los residuos peptidomiméticos individuales pueden estar unidos por
enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento,
tales como, v.g., aldehído glutárico, ésteres de
N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales,
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), o
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos enlazadores que pueden ser una alternativa a los eslabones de enlace amídico ("enlace peptídico") tradicionales incluyen, v.g., cetometileno (v.g., -C(=O)-CH_{2}- en lugar de -C(=O)-NH-), aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter (CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, v.g., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, ``Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY).
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos enlazadores que pueden ser una alternativa a los eslabones de enlace amídico ("enlace peptídico") tradicionales incluyen, v.g., cetometileno (v.g., -C(=O)-CH_{2}- en lugar de -C(=O)-NH-), aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter (CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, v.g., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, ``Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY).
Un polipéptido puede caracterizarse también como
un mimético por el hecho de contener todos o algunos residuos no
naturales en lugar de residuos de aminoácidos existentes
naturalmente. Residuos no naturales están bien descritos en la
bibliografía científica y de patentes; unas cuantas composiciones no
naturales y líneas orientativas ilustrativas útiles como miméticos
de residuos de aminoácidos naturales se describen a
continuación.
Pueden generarse miméticos de aminoácidos
aromáticos reemplazando por, v.g., D- o
L-naftilalanina; D- o
L-fenilglicina; D- o
L-2-tienilalanina; D- o L- 1-, 2-,
3-, ó 4-pirenilalanina; D- o L-
3-tienilalanina; D- o
L-(2-piridinil)-alanina; D- o
L-(3-piridinil)-alanina; D- o
L-(2-pirazinil)-alanina; D- o
L-(4-isopropil)-fenilglicina;
D-(trifluorometil)-fenilglicina;
D-(trifluorometil)-fenilalanina;
D-p-fluorofenilalanina; D- o
L-p-ifenilfenilalanina; K- o
L-p-metoxibifenifenilalanina; D- o
L-2-indol(alquil)alaninas;
y D- o L-alquilaininas; donde alquil puede ser
metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo,
iso-butilo, sec-isotilo,
iso-pentilo, o un aminoácido de carácter no ácido,
sustituido o no sustituido. Anillos aromáticos de aminoácidos no
naturales incluyen, v.g., anillos de tiazolilo, tiofenilo,
pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y
piridilo.
Los miméticos de aminoácidos de carácter ácido
pueden generarse sustituyendo por, v.g., aminoácidos no
carboxílicos al tiempo que se mantiene una carga negativa;
(fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales
carboxilo (v.g. aspartilo o glutamilo) pueden modificarse también
selectivamente por reacción con carbodiimidas
(R'-N-C-N-R')
tales como, v.g.,
1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil)-carbodiimida
o
1-etil-3(4-azonia-4,
4-dimetolpentil)-carbodiimida.
Aspartilo o glutamilo pueden convertirse también en residuos
asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
\newpage
Pueden generarse miméticos de aminoácidos básicos
por sustitución con, v.g., (además de lisina y arginina) los
aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido
(guanidino)-acético, o ácido
(guanidino)alquil-acético, donde alquil es
como se ha definido supra. Un derivado nitrilo (v.g.,
que contiene el resto CN en lugar de COOH) puede emplearse en
sustitución de asparagina o glutamina. Los residuos asparaginilo y
glutaminilo pueden desaminarse para dar los residuos aspartilo o
glutamilo correspondientes.
Pueden generarse miméticos de residuos arginina
por reacción de arginilo con, v.g., uno o más reactivos
convencionales que incluyen, v.g., fenilglioxal,
2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona, o ninhidrina, preferiblemente
en condiciones alcalinas.
Pueden generarse miméticos de residuos tirosina
por reacción de tirosilo con, v.g., compuestos de diazonio
aromáticos o tetranitrometano. Pueden utilizarse
N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar
especies de O-acetil-tirosilo y
3-nitroderivados, respectivamente.
Pueden generarse miméticos de residuos cisteína
por reacción de residuos cisteinilo con, v.g.,
alfa-haloacetatos tales como ácido
2-cloroacético o cloroacetamida y aminas
correspondientes; para dar derivados carboximetilo o
carboxiamidometilo. Pueden generarse también miméticos de residuos
cisteína por reacción de residuos cisteinilo con, v.g.,
bromo-trifluoroacetona, ácido
alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiónico;
fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,
3-nitro-2-piridil-disulfuro;
metil-2-piridil-disulfuro;
p-cloromercuribenzoato;
2-cloromercuri-4-nitrofenol;
o
cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol.
Pueden generarse miméticos de lisina (y pueden
alterarse residuos amino-terminales) por reacción
de lisinilo con, v.g., anhídridos de ácido succínico o de
otros ácidos carboxílicos. Pueden generarse también miméticos de
residuos lisina y otros residuos que contienen
alfa-amino por reacción con imidoésteres, tales como
picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal,
cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico,
O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y
reacciones con glioxilato catalizadas por transamidasas.
Pueden generarse miméticos de metionina por
reacción con, v.g., metionina-sulfóxido.
Miméticos de prolina incluyen, v.g., ácido pipecólico, ácido
tiazolidina-carboxílico, 3- o
4-hidroxi-prolina, deshidroprolina,
3- o 4-metilprolina, o
3,3-dimetilprolina. Pueden generarse miméticos de
residuos histidina por reacción de histidilo con, v.g.,
procarbonato de dietilo o bromuro de
para-bromofenacilo.
Otros miméticos incluyen, v.g., los
generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de
los grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo; metilación de
los grupos alfa-amino de lisina, arginina e
histidina; acetilación del amino N-terminal;
metilación de residuos amídicos de la cadena principal o sustitución
con N-metil-aminoácidos; o amidación
de grupos carboxilo C-terminales. Un componente de
un polipéptido natural puede reemplazarse también por un aminoácido
(o residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Así, cualquier
aminoácido existente naturalmente en la configuración L (a la que
puede hacerse también referencia como R o S, dependiendo de la
estructura de la entidad química) puede reemplazarse con el
aminoácido del mismo tipo químico estructural o un peptidomimético,
pero de la quiralidad opuesta, al que se hace referencia
generalmente como el D-aminoácido, pero que puede
designarse también adicionalmente como la forma R o S.
Los miméticos de la invención pueden incluir
también composiciones que contienen un residuo mimético estructural,
particularmente un residuo que induce o mimetiza estructuras
secundarias, tales como una vuelta beta, hoja beta, estructuras de
hélice alfa, vueltas gamma, y análogas. Por ejemplo, sustitución de
residuos de aminoácidos naturales con D-aminoácidos;
N-alfa-metil-aminoácidos;
C-alfa-metil-aminoácidos;
o deshidroaminoácidos contenidos dentro de un péptido pueden inducir
o estabilizar vueltas beta, vueltas gamma, hojas beta o
conformaciones de hélice alfa. Estructuras miméticas de vueltas beta
han sido descritas, v.g., por Nagai (1985) Tet. Lett.
26:647-650; Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc.
108:181-182; Kahn (1988) J. Amer. Chem. Soc.
110:1638-1639; Kemp (1988) Tet. Lett.
29:5057-5060; Kahn (1988) J. Molec.
Recognition 1:75-79. Estructuras miméticas de
hoja beta han sido descritas, v.g., por Smith (1992) J.
Amer. Chem. Soc. 114:10672-10674. Por ejemplo,
una vuelta beta de tipo VI inducida por un sustituto de cis
amida, tetrazol 1,5-disustiuido, ha sido descrita
por Beusen (1995) Biopolymers 36:181-200. La
incorporación de residuos de omega-aminoácidos
aquirales para generar unidades polimetileno como sustitución para
enlaces amídicos ha sido descrita por Banerjee (1996)
Biopolymers 39:769-777. Las estructuras
secundarias de polipéptidos pueden analizarse por, v.g., 1H
NMR de campo alto o espectroscopia NMR 2D, véase, v.g.,
Higgins (1997) J. Pept. Res. 50:421-435.
Véase también Hruby (1997) Biopolymers
43:219-266, Balaji, et al., patente
U.S.
No. 5.612.895.
No. 5.612.895.
Ejemplos específicos de miméticos que pueden
incorporarse en el polipéptido de la invención incluyen los
descritos por, v.g., Zhang (1998) Biochemistry
37:12465-12476, que construyó miméticos
conformacionales de (R y
S)-gamma-lactama funcionalmente
activos utilizando un resto 3-(R o
S)-amino-2-oxo-1-pirrolidina-acetamido
en lugar del Pro-Gly de la feromona de apareamiento
con el factor alfa tridecapeptídico de Saccharomyces
cerevisiae. Bradi (1998) J. Med. Chem.
41:401-406, utilizó una ruta basada en resina para
la síntesis de un mimético inhibidor de la trombina con una gama de
amidas carboxílicas lipófilas. Baures (1997) J. Med. Chem.
40:3594-3600, construyó un mimético conformacional
de dicetopiperazina en una estructura de
L-prolil-L-leucilglicinamida
y en la estructura peptidomimética de la lactama bicíclica PLG del
receptor de dopamina. Beaulieu (1997) J. Med. Chem.
40:2164-2176, utilizó un núcleo de
(hidroxietil)amidosuccinoílo para sintetizar una estructura
peptidomimética que inhibe la actividad de la proteasa vírica de
HIV. Misicka (1997) J. Pept. Res. 50:48-54,
diseñó miméticos de deltorfina I y dermencefalina que contienen
estereoisómero del aminoácido no usual
beta-metilfenilalanina para generar péptidos con
especificidad aumentada de fijación de ligandos.
El profesional experto reconocerá que pueden
sintetizarse residuos sintéticos individuales y polipéptidos que
incorporan miméticos utilizando una diversidad de procedimientos y
metodologías, que están adecuadamente descritos en la bibliografía
científica y de patentes, v.g., Organic Syntheses Collective
Volumes, Gilman et al., (compiladores) John Wiley & Sons
Inc., NY. Polipéptidos que incorporan miméticos pueden producirse
también utilizando procedimientos de síntesis en fase sólida, como
se describe, v.g., por Di Marchi, et al., patente U.S.
No. 5.422.426. Los miméticos de la invención pueden sintetizarse
también utilizando metodologías combinatorias. Diversas técnicas
para generación de genotecas de péptidos y peptidomiméticos son bien
conocidas, e incluyen, v.g., las técnicas Multipin, de bolsa
de té, y de
división-acoplamiento-mezcla; véase,
v.g., al-Obeidi (1998) Mol.
Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr.
Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997)
Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996)
Methods Enzymol. 267:220-234.
En una realización, se utilizan miméticos de
quimioquinas de molécula pequeña para movilizar APCs. Típicamente,
los miméticos de molécula pequeña se identifican utilizando
tecnologías de escrutinio de alta capacidad para compuestos de
molécula pequeña que fijan receptores de quimioquinas (CRs) y
transducen señales (v.g., movilización del ion calcio u otras
respuestas mediadas por receptores de quimioquinas). Por ejemplo,
pueden escrutarse inicialmente moléculas pequeñas por la aptitud
para actuar como agonistas de los receptores de quimioquinas que se
expresan en células dendríticas inmaduras y/o no se expresan en
otras células (véase, v.g., la Tabla 2B). La actividad
agonista puede detectarse de una diversidad de maneras, tales como
la detección de las respuestas de movilización de Ca2+ en células
transfectantes que expresan receptores de quimioquina clonados que
se sabe están presentes en las APCs.
Las propiedades quimiotácticas de las moléculas
se determinan luego utilizando los ensayos arriba descritos, y
aquéllas que tienen especificidad deseada (v.g., quimiotaxis para
las células dendríticas inmaduras pero no para las maduras) se
utilizan en los métodos de la presente invención.
Las composiciones quimiotácticas de la invención
contienen una o más APC-quimiotaxinas (o
polinucleótidos codificantes de quimiotaxinas). En una realización,
la composición contiene una APC-quimiotaxina que es
un polinucleótido o polipéptido aislado o recombinante. En una
realización, la(s) APC-quimiotaxina(s)
es/son la especie predominante (es decir, más de aproximadamente
50%, con mayor frecuencia más de aproximadamente 80% en peso del
total de los miembros de la clase de molécula en la composición) de
su clase (v.g., polipéptido, polinucleótido, lípido,
carbohidrato) en la composición. En otras realizaciones,
la(s) APC-quimiotaxina(s) es/son
"biológicamente puras". Los términos "aislado",
"puro", "sustancialmente purificado" o "biológicamente
puro" se refieren a un material que está sustancial o
esencialmente exento de componentes que lo acompañan normalmente tal
como se encuentra en su estado nativo. Así, en una realización, las
composiciones quimiotácticas de la invención contienen
APC-quimiotaxinas exentas de materiales asociados
normalmente con su entorno in situ (si existen naturalmente).
Típicamente, las quimiotaxinas aisladas de la invención tienen una
pureza de al menos aproximadamente 80%, por lo general al menos
aproximadamente 90%, y de modo preferible al menos aproximadamente
95%. La pureza u homogeneidad de las proteínas puede determinarse
por varios métodos bien conocidos en la técnica, tales como
electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína,
seguida de visualización por tinción. Para ciertos propósitos, será
necesaria alta resolución, y se utilizará HPLC o un medio similar
para la purificación.
En algunas realizaciones, las composiciones
pueden contener adicionalmente un excipiente o vehículo, tal como se
describe más adelante. En todos los casos la composición incluye uno
o más antígenos (a saber, el antígeno para el cual se desea inducir
o intensificar una respuesta inmunitaria), tal como se describe con
mayor detalle más adelante. En algunas realizaciones, las
composiciones pueden contener un adyuvante convencional. Los
adyuvantes convencionales convierten típicamente los antígenos
proteínicos solubles en forma particulada. Aquéllos incluyen
habitualmente a menudo bacterias o productos bacterianos. Adyuvantes
convencionales ilustrativos incluyen Adyuvante Incompleto de
Freund, Adyuvante Completo de Freund, Adyuvante Merck 65,
AS-2, alumbre, fosfato de aluminio, geles minerales
tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales
como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos,
emulsiones de aceite, hemocianina de lapa bocallave y dinitrofenol.
En algunas realizaciones, el adyuvante convencional es un adyuvante
adecuado para uso en pacientes humanos.
La presente invención proporciona un método para
suscitar o intensificar una respuesta inmunitaria a un antígeno,
v.g., un antígeno predeterminado o especificado. Un antígeno es una
molécula que reacciona con un anticuerpo. En algunas realizaciones,
el antígeno es un inmunógeno. En algunas realizaciones, el antígeno
está enlazado a un vehículo proteínico. Por ejemplo, en una
realización de la invención, una APC-quimiotaxina y
un antígeno están enlazados físicamente (v.g., producidos
como una proteína de fusión, reticulados de manera estable
utilizando reticuladores químicos, o enlazados por complejos tales
como biotina y estreptavidina).
Típicamente, un antígeno es un péptido, un
polipéptido, un compuesto químico, patógeno microbiano, bacteria
(v.g., viva, atenuada, o desactivada) un virus (con inclusión de
partículas víricas desactivadas, partículas víricas vivas
modificadas, y partículas de virus recombinantes), una célula
recombinante, glicoproteínas, lipoproteínas, glicopéptidos,
lipopéptidos, toxoides, carbohidratos, antígenos específicos de
tumores; y otros componentes inmunógenos de patógenos. En una
realización, se emplean mezclas de dos o más antígenos. En algunas
realizaciones, el antígeno es biológicamente puro.
En una realización, los métodos y reactivos de la
invención pueden utilizarse para proporcionar protección contra
agentes patógenos infecciosos exógenos extraños (tales como
bacterias, virus, y análogos) antes de la exposición esperada o
posible. En una realización afín, los métodos y reactivos de la
invención pueden utilizarse para proporcionar efectos terapéuticos
contra patógenos exógenos extraños a los cuales ha estado expuesto
un individuo o a un individuo que presenta síntomas de
exposición.
En una realización, los reactivos y métodos de la
invención pueden utilizarse para tratar cánceres, que incluyen, pero
sin carácter limitante, melanomas, cánceres de pulmón, carcinomas de
tiroides, cánceres de mama, carcinomas de células renales,
carcinomas de células escamosas, tumores cerebrales y cánceres de
piel. En una realización, el antígeno es un antígeno asociado a un
tumor (antígeno específico del tumor). Los antígenos de tumores son
moléculas, especialmente proteínas de la superficie celular, que se
expresan diferencialmente en células tumorales con relación a
tejidos no tumorales (v.g., telomerasa).
Para uso profiláctico, las composiciones que
contienen las APC-quimiotaxinas se administran
(v.g., en asociación con antígenos) a un individuo propenso a o que
se encuentra por cualquier otro motivo en riesgo de padecer una
enfermedad, v.g. un tumor, cáncer, infección, etcétera. Para uso
terapéutico, las composiciones que contienen las
APC-quimiotaxinas se administran (v.g., en
asociación con antígenos) a un individuo una vez que se ha detectado
o diagnosticado una enfermedad, v.g. un tumor, cáncer, infección,
etcétera, o después de la extirpación quirúrgica, v.g. de
tumores.
Antígenos o componentes de vacuna ilustrativos de
la invención incluyen antígenos derivados de patógenos microbianos
tales como bacterias [v.g., Tos ferina (Bordetella pertussis,
organismo entero desactivado); Cólera (Vibrio cholerae, organismo
entero muerto); Meningitis (Neisseria meningitidis, polisacárido del
organismo); Enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi, lipoproteína
OspA); Haemophilus B (polisacárido B de Haemophilus influenza,
conjugado de tétanos o OmpC); Neumonía (polisacárido capsular de
Streptococcus pneumoniae), Fiebre Tifoidea (vacuna del polisacárido
de Salmonella typhi, organismo entero muerto)], virus que incluyen
partículas de virus desactivadas, partículas víricas vivas
modificadas, y partículas víricas recombinantes para el virus de la
Gripe; Hepatitis A; Hepatitis B; Sarampión, virus de la Rubéola;
Parotiditis; Rabia, Poliovirus, virus de la Encefalitis Japonesa;
Rotavirus; Varicela], Difteria (Corynebacterium diphtheriae) y
Tétanos (Clostridium tetani).
En un aspecto, la
APC-quimiotaxina, el antígeno, o ambos se
suministran como DNA de tal modo que los polipéptidos se generan
in situ. En una realización, el DNA está "desnudo", como
ha sido descrito, por ejemplo, en Ulmer et al.,
Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por
Cohen, 1993, Science 259:1691-1692. La absorción del
DNA desnudo puede incrementarse aplicando el DNA en forma de
recubrimiento sobre un vehículo, v.g. cuentas biodegradables, que se
transporta eficientemente a las células. En tales vacunas, el DNA
puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de
sistemas de suministro conocidos por quienes poseen una experiencia
ordinaria en la técnica, con inclusión de sistemas de expresión de
ácido nucleico, sistemas de expresión bacterianos y víricos. Los
métodos para incorporación de DNA en tales sistemas de expresión son
bien conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la
técnica. Véanse, v.g., los documentos WO90/11092, WO93/24640,
WO93/17706, y la patente U.S. No. 5.736.524.
Las composiciones de la presente invención
contienen uno o más antígenos (o polinucleótidos codificantes de
antígeno). Los antígenos pueden administrarse en combinación con la
APC-quimiotaxina (es decir, en la misma mezcla).
Alternativamente, aquéllos pueden administrarse por separado.
Así, en un aspecto, la invención proporciona un
método de inmunización en el cual se administran a un individuo una
combinación de uno o más antígenos (o polinucleótidos codificantes
de antígeno) y una o más APC-quimiotaxinas de la
invención (o polinucleótidos codificantes de
APC-quimiotaxina). Opcionalmente, el antígeno o la
APC-quimiotaxina se administra en un vehículo de
suministro tal como un excipiente fisiológicamente aceptable.
Como se ha indicado arriba, en una realización de
la invención se administra un antígeno simultáneamente con la
composición quimiotáctica. En una realización alternativa, el
antígeno y la composición quimiotáctica se administran en momentos
diferentes, típicamente al mismo sitio. Por ejemplo, la composición
quimiotáctica (sin el antígeno) puede administrarse entre
aproximadamente 15 min y aproximadamente 96 h antes de la
administración del antígeno, más a menudo entre aproximadamente 15
min y aproximadamente 48 h, más a menudo todavía entre 24 h y 96 h,
con frecuencia entre aproximadamente 48 h y 72 h o entre 72 h y 96 h
antes de la administración del antígeno.
Cuando la composición quimiotáctica y una
composición de antígeno se inyectan en el mismo sitio a un
individuo, las inyecciones se localizan preferiblemente a una
distancia no mayor que 2 cm una de otra, con preferencia a una
distancia no mayor de 1 cm o no mayor de 0,5 cm una de otra en la
superficie bidimensional del cuerpo. En esta realización, las
administraciones deberían hacerse también a una profundidad similar
y a la misma capa de tejido (es decir, ambas inyecciones deberían
ser subcutáneas o ambas intradérmicas). Para inyecciones
intramusculares, la profundidad debería monitorizarse de modo más
preciso para conseguir una ubicación tridimensional equivalente de
la APC-quimiotaxina y el antígeno hasta menos de 2
cm uno de otro, preferiblemente hasta menos de 1 cm, e incluso
mejor hasta menos de 0,5 cm. Esto es realizado fácilmente por
médicos, enfermeros y otro personal adiestrado en técnicas médicas.
El sitio de inyección puede marcarse con una tinta indeleble para
ayudar al médico.
En una realización, se aplica una sola dosis
(administración) de la composición. En otra realización, la primera
administración va seguida por dosis de refuerzo. Así, en una
realización, la APC-quimiotaxina se administra en
dosis múltiples, a menudo en combinación con la administración del
antígeno (v.g., por co-administración). Así, en
varias realizaciones, la composición de
APC-quimiotaxina (que incluye opcionalmente
antígeno) se administra una vez, dos veces, tres veces, o más de
tres veces. El número de dosis administradas a un individuo depende
del antígeno, el alcance de la enfermedad, y la respuesta de un
individuo a la composición quimiotáctica. En una realización de la
invención, se efectúa una segunda administración (refuerzo) de la
composición quimiotáctica y el antígeno entre aproximadamente 7 días
y 1 año después de la primera administración. En una realización, se
efectúa una segunda administración (refuerzo) de la composición
quimiotáctica y el antígeno entre aproximadamente 14 días y 6 meses
después de la primera administración. Alternativamente, se efectúa
una segunda administración (refuerzo) de la composición
quimiotáctica y el antígeno entre aproximadamente 21 días y 3 meses
después de la administración original, a menudo entre
aproximadamente 28 días y 2 meses después de la administración
original. En una realización, se efectúa una tercera administración
(segundo refuerzo) entre aproximadamente 14 días y 10 años después
de la administración original, v.g., entre aproximadamente 14 días y
3 años después de la administración original, a menudo entre
aproximadamente 21 días y 1 año después de la administración
original, muy a menudo entre aproximadamente 28 días y 6 meses
después de la administración original. Pueden administrarse
refuerzos subsiguientes a intervalos de 2 semanas, o intervalos de 1
mes, 3 meses o 6 meses hasta 10 años.
Se reconocerá por quienes poseen una experiencia
ordinaria que pueden desarrollarse una diversidad de dosis y
protocolos de administración de vacunas basándose en los parámetros
arriba expuestos y conocidos en la técnica, y que la determinación
de una cantidad y número de dosis eficaces de las quimiotaxinas de
la invención, antígenos, o cualquier combinación de
quimiotaxina(s) y antígeno(s) para administración está
plenamente dentro de las aptitudes de los expertos en la
técnica.
Típicamente, se administrará al individuo una
cantidad de APC-quimiotaxina y antígeno que es
suficiente para inmunizar un animal contra un antígeno (es decir,
una "dosis inmunológicamente eficaz" o una "dosis
terapéuticamente eficaz"). Una cantidad adecuada para alcanzar
una "dosis inmunológicamente eficaz" dependerá de, v.g., la
composición de APC-quimiotaxina y antígeno, el modo
de administración, la fase y gravedad de la enfermedad de que se
trate, el peso y el estado general de salud del paciente, y el
criterio del médico que prescribe el tratamiento.
La dosis eficaz de antígeno y
APC-quimiotaxina puede formularse en modelos
animales para alcanzar una inducción de una respuesta inmunitaria
utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. Una persona
que posea experiencia ordinaria en la técnica puede optimizar
fácilmente la administración a humanos basándose en datos obtenidos
con animales. Cuando la APC-quimiotaxina es una
proteína, tal como una quimioquina, una dosis estará comprendida por
lo general entre aproximadamente 1 fg y aproximadamente 100 \mug,
a menudo entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 100 \mug,
más a menudo entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 50 \mug,
y por lo general entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 50
\mug. En algunas realizaciones, la dosis está comprendida entre
aproximadamente 1 fg y aproximadamente 100 \mug por kg de peso
corporal del individuo, a menudo entre aproximadamente 1 pg y
aproximadamente 100 \mug, más a menudo entre aproximadamente 1 ng
y aproximadamente 50 \mug, y por lo general entre aproximadamente
100 ng y aproximadamente 50 \mug por kg de peso corporal del
individuo.
La cantidad de antígeno que se administra variará
con la identidad y características del antígeno. En una realización,
una composición quimiotáctica de la presente invención contiene uno
o más antígenos y una o más quimiotaxinas en una relación molar o en
peso de aproximadamente 1:1000 o mayor, de quimiotaxina a antígeno.
En otra realización, la relación de quimiotaxina a antígeno en la
composición está comprendida entre aproximadamente 1:10 y 1:1000. En
otra realización, la relación de antígeno a quimiotaxina en la
composición está comprendida entre aproximadamente 1:10 y 1:1000, o
mayor que 1:1000, o mayor aún. En otra realización, la relación de
antígeno a quimiotaxina en la composición está comprendida entre
aproximadamente 1:10 y 10:1.
Las composiciones que contienen
APC-quimiotaxina de la invención pueden
administrarse de una diversidad de maneras, como se describe en esta
memoria. En diversas realizaciones, la composición quimiotáctica
incluye vehículos y excipientes (es decir, excipientes
farmacéuticamente aceptables) (que incluyen, pero sin carácter
limitante, tampones, carbohidratos, manitol, proteínas, polipéptidos
o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos,
agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o
conservantes), otras sustancias adyuvantes farmacéuticamente
aceptables que se requieran para aproximarse a las condiciones
fisiológicas, tales como agentes tampón, agentes de ajuste de la
tonicidad, agentes humectantes y análogos, y/o un adyuvante
convencional (v.g., como se ha expuesto anteriormente). Se
reconocerá que, si bien puede emplearse cualquier vehículo adecuado
conocido por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica
para administrar las composiciones de esta invención, el tipo de
vehículo variará dependiendo del modo de administración. Los
compuestos pueden también encapsularse dentro de liposomas
utilizando tecnología bien conocida. Pueden emplearse también
microesferas biodegradables como vehículos para las composiciones
farmacéuticas de esta invención. Microesferas biodegradables
adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. Núms.
4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763;
5.814.344 y 5.942.252.
Las composiciones de la invención pueden
esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien
conocidas, o pueden filtrarse en condiciones estériles. Las
soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para uso como
tales, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con
una solución estéril antes de la administración.
La composición APC-quimiotaxina
de la invención puede administrarse de una diversidad de maneras,
que incluyen inyección (v.g., intradérmica, subcutánea,
intramuscular, intraperitoneal y análogas), por inhalación, por
administración tópica, por supositorio, utilizando un parche
transdérmico, o por vía oral.
Cuando la administración se efectúa por
inyección, la o las quimiotaxinas puede(n) formularse en
soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente
compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o
tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener
agentes de formulación tales como agentes suspendedores,
estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, la composición
quimiotáctica puede presentarse en forma de polvo para constitución
con un vehículo adecuado, v.g., agua estéril exenta de pirógenos,
antes de su utilización.
Cuando la administración se efectúa por
inhalación, la o las quimiotaxinas pueden suministrarse en la forma
de una pulverización aerosol desde envases presurizados o un
nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, v.g.,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono u
otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad
de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula que
suministre una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, v.g.,
gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse de
modo que contengan una mezcla en polvo de las proteínas y una base
de polvos adecuada tal como lactosa o almidón.
Cuando la administración se efectúa por
administración tópica, la composición quimiotáctica puede
formularse como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones,
y análogos, como son bien conocidos en la técnica. En algunas
realizaciones, la administración se efectúa por medio de un parche
transdérmico.
Cuando la administración es por supositorio
(v.g., rectal o vaginal), las composiciones pueden formularse
también en composiciones que contienen una base de supositorios
convencional.
Cuando la administración es oral, puede
formularse fácilmente una composición por combinación de la
quimiotaxina con vehículos farmacéuticamente aceptables bien
conocidos en la técnica. Puede emplearse un vehículo sólido, tal
como manitol, lactosa, estearato de magnesio, y análogos; tales
vehículos permiten que la quimiotaxina se formule en forma de
tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes,
lodos, suspensiones y análogos, para ingestión oral por un individuo
a tratar. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo,
polvos, cápsulas y tabletas, excipientes adecuados incluyen cargas
tales como azúcares, preparaciones de celulosa, agentes de
granulación, y agentes aglomerantes.
Los métodos para producción de anticuerpos
policlonales y monoclonales, con inclusión de fragmentos de fijación
(v.g., F(ab)_{2}) y versiones de vacuna
simples, son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Véase, v.g., Coligan, 1991, Current Protocols in
Immunology, Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane, 1989, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY. Sin embargo, muchos
antígenos no son capaces de desencadenar una respuesta adecuada de
anticuerpos en animales. En una realización, una composición que
comprende una quimiotaxina de la invención y un antígeno se
administra a un animal como se describe en esta memoria, induciendo
o intensificando así la respuesta inmunitaria en el animal.
Anticuerpos policlonales o monoclonales se preparan
subsiguientemente por técnicas estándar.
En otro aspecto de la invención, las
composiciones de la invención se administran a un individuo para
estimular la respuesta inmunitaria innata. La respuesta inmunitaria
innata es la defensa inicial del cuerpo contra los patógenos y es
suscitada por una diversidad de células que incluyen APCs (células
dendríticas y los macrófagos). Estas células expresan receptores de
superficie y citoplásmicos que reconocen moléculas de origen extraño
(v.g., ácidos nucleicos bacterianos y víricos, proteínas,
carbohidratos). Después de la detección de estas señales, las
células dendríticas y los macrófagos suscitan una respuesta
defensiva que incluye la liberación de citoquinas (con inclusión de
interferones, TNFalfa, e IL12) y quimioquinas que atraen células
tales como células dendríticas inmaduras, macrófagos, células NK, y
granulocitos, al sitio de enfrentamiento.
Se cree que las composiciones de la invención son
útiles, no sólo para atraer células dendríticas y otras células al
sitio de administración, sino también que las composiciones actúan
para estimular dichas células a suscitar elementos de la respuesta
inmunitaria innata para conferir protección inespecífica mientras el
cuerpo está generando la respuesta adaptativa.
Así, en una realización, se administra una
composición de la invención antes o después de la exposición a una
infección anticipada.
En un aspecto, la invención proporciona kits que
contienen lo siguiente en un paquete o envase: (1) una composición
APC-quimiotaxina de la invención; (2) un adyuvante o
excipiente farmacéuticamente aceptable; (3) un antígeno (v.g., un
antígeno biológicamente puro); (4) instrucciones para
administración. Los apartados (1)-(3) se encuentran típicamente en
un envase tal como un vial, y pueden estar congelados o
liofilizados. Se contemplan también realizaciones en las cuales se
encuentran al menos los componentes (1) y (3) en el mismo
envase.
mMIP-1\alpha
Davatelis G,
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P10147 (hMIPI\alpha), no. de acceso P10855
(mMIP-1\alpha), no. de acceso P13501 (hRANTES),
no. de acceso P30882 (mRANTES), no. de acceso Q16627
(hHCC-1), no. de acceso P55773
(hMPIF-1), no. de acceso Q16663
(hMlP-1\delta), no. de acceso Q99616
(hMCP-4), no. de acceso Q-32431
(mMCP-5), no. de acceso Q03366 (mMARC), no. de
acceso P48298 (mEotaxina), no. de acceso P10148
(mMCP-1(JE)), no. de acceso O35903 (mTECK),
no. de acceso P10889 (mMIP-2), no. de acceso
AF044196 (mBLC), no. de acceso P18340 (rnMIG), no. de acceso P14097
(mMIP-1\beta), no. de acceso P80075
(hMCP-2), no. de acceso P80098
(hMCP-3), no. de acceso P78556
(hMlP-3\alpha), no. de acceso Q99731
(hMIP-3\beta), no. de acceso P27784 (mC10), no.
de acceso AJ238238 (mMDC), no. de acceso P13236
(hMIP-1\beta), y no. de acceso P51670
(mMIP-1y).
Ejemplo
1
Los ensayos de quimiotaxis se efectúan utilizando
células purificadas y una microcámara de quimiotaxis de 96 pocillos
(ChemoTx®, NeuroProbes, Inc, Gaithersburg MD). En este ensayo, se
utiliza un filtro poroso de policarbonato para permitir la formación
de un gradiente de concentración de sustancia quimioatrayente a
través del filtro, y permitir que las células migren al filtro o a
su través hasta el pocillo inferior.
Para realizar un ensayo de quimiotaxis de células
dendríticas inmaduras, se ponen 29 \mul de una
APC-quimiotaxina candidato o conocida a
concentraciones de 0, 1, 10 y 100 nM CHECK en los pocillos de la
cámara inferior. El filtro se dispone en la parte superior de la
cámara, de tal modo que la solución de sustancia quimioatrayente
toca el lado inferior del filtro. El día 7 se recogen las células
dendríticas inmaduras, se lavan una sola vez con tampón de
quimiotaxis que contiene 0,1% de BSA (Sigma) en HBSS (Life
Technologies), con Ca^{++} y Mg^{++}), y se resuspenden
finalmente en tampón de quimiotaxis a 5 x 10^{6} por ml. Se ponen
cuidadosamente 20 microlitros de células en el filtro. Se deja
transcurrir la migración durante 90 minutos a 37ºC en una incubadora
de cultivo de tejidos. La migración se termina por retirada de las
células que no migran en la parte superior del filtro utilizando un
rascador de caucho. El filtro se separa del aparato y se lava con
DPBS. (La cámara inferior se inspecciona microscópicamente para
determinar si cualesquiera células han migrado a los pocillos. Si
están presentes un número significativo de células en los pocillos,
la cuantificación se efectúa en los pocillos y en el filtro.) Para
detectar las células que han migrado al filtro de policarbonato en
el ensayo de migración de células dendríticas inmaduras, el filtro,
después de separarlo del aparato y lavarlo con DPBS (Hyclone), se
tiñe con una solución de tinción de células tal como el kit de
tinción Hema3 (Fisher Scientific). El filtro se sumerge en las tres
soluciones separadas secuencialmente, en cada caso durante
aproximadamente 5 segundos. Después de la última solución, el filtro
se lava varias veces con agua. El filtro se deja secar al aire y se
determina la señal por lectura del filtro en un lector de placas
(Molecular Devices) a una longitud de onda de 540 nm. La magnitud de
la migración se calcula como la relación de absorbancia entre los
pocillos con sustancias quimioatrayentes y los pocillos con tampón
de quimiotaxis solo.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe un ensayo in vivo en
el cual se demuestra la aptitud de varias quimioquinas para atraer
células dendríticas.
\newpage
Se obtuvieron las quimioquinas siguientes de
R&D Systems (Minneapolis, MN): MCP2, MCP3, MIP1\beta,
MIP3\alpha, MIP3\beta, Rantes, mMIG, mMDC, mC10, y vMIP1. Cada
quimioquina (2 \mug en PBS) se inyectó intradérmicamente en un
ratón BALB/c diferente. Un ratón recibió una inyección de control de
PBS sin quimioquina alguna. Setenta y dos horas después de la
inyección, se sacrificaron los ratones por eutanasia, se cortó el
área situada alrededor del sitio de inyección, y se sometió a
inmunohistología. Secciones congeladas se tiñeron con anticuerpo
anti-DEC-205 (disponible de
Bio-Whittaker Molecular Applications, Rockland, ME;
Kraal et al., 1986, J. Exp. Med. 163: 981), que reconoce una
molécula de la superficie específica para las células dendríticas.
Se asignó a cada sección un número de tinción relativo
en una escala de 0 a 5 (0 = infiltración mínima, 5 = infiltración máxima). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
en una escala de 0 a 5 (0 = infiltración mínima, 5 = infiltración máxima). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Varias quimioquinas suscitaron una infiltración
de DEC-205+ (célula dendrítica) al sitio de
inyección después de 72 horas cuando se inyectaron por vía
intradérmica al ratón. De éstas, MCP3, MIP3\beta, mMIG, mMDC,
mC10, y MIP1 vírica exhibían infiltración de DC, exhibiendo MCP3,
mMDC y mC10 la infiltración óptima.
| MCP2 | 0 |
| MCP3 | 3 |
| MIP1b | 0 |
| MIP3a | 0 |
| MIP3b | 1 |
| Rantes | 0 |
| mMIG | 2 |
| mMDC | 3 |
| mC10 | 4 |
| vMIP1 | 0 |
| PBS | 0 |
Ejemplo
3
Este ejemplo demuestra que ciertas quimioquinas
inyectadas intradérmicamente a un primate no humano suscitan
infiltración mononuclear al sitio de inyección.
Se inyectaron por vía intradérmica quimioquinas
codificadas estériles (2 \mug en PBS) (volumen de inyección 100
\mul) en la parte superior del brazo de un macaco Rhesus bajo
anestesia. En cada caso, se administraron a cada uno de dos monos
dos inyecciones de la misma quimioquina en dos sitios diferentes
(v.g. el brazo izquierdo frente al brazo derecho). Después de 72
horas, se practicó mediante punción una biopsia de un sitio de
inyección y se separó en una muestra de borde y una muestra de
centro, y se prepararon ambas muestras para inmunohistología.
Después de 96 horas, se practicó una biopsia mediante punción en el
otro sitio de inyección y se separó en una muestra de borde y una
muestra de centro, preparándose ambas muestras para
inmunohistología. Cada fila en la Tabla 5 representa un solo animal.
Una sección del tejido preparado se tiñó con hematoxilina y eosina,
y se identificaron las células mononucleares basándose en la
morfología celular (v.g. si eran mononucleares en contraste a
polinucleares). Se utilizaron como controles positivos
GM-CSF (dosis de 200 \mug) y Rantes (dosis de 20
\mug). Como control negativo se utilizaron inyecciones de PBS y
análisis de tejidos no inyectados.
La infiltración mononuclear se registró basándose
en la escala siguiente de 0 a 5: 0 = un infiltrado inflamatorio
mononuclear perivascular muy leve observado a través de la dermis; 1
= un infiltrado inflamatorio mononuclear perivascular leve observado
a través de la dermis; 2 = un infiltrado inflamatorio mononuclear
perivascular leve/moderado observado a través de la dermis; 3 = un
infiltrado inflamatorio mononuclear perivascular moderado observado
a través de la dermis; 4 = un infiltrado inflamatorio mononuclear
perivascular extenso observado a través de la dermis; 5 = un
infiltrado inflamatorio mononuclear perivascular florido observado a
través de la dermis. Los registros intermedios son indicativos,
v.g., "2/3" representa un registro entre 2 y 3.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
GM-CSF (dosis de 200 \mug) exhibía un nivel de
infiltración comprendido entre 2 y 3 a las 72 horas. RANTES (dosis
de 20 \mug) exhibía un nivel de infiltración comprendido entre 2 y
3 a las 72 horas. Muestras adicionales de RANTES codificadas
internamente (dosis de 20 \mug) exhibían un nivel de infiltración
de hasta 2. Los controles negativos (PBS) tenían usualmente un nivel
0 de infiltrado.
De las quimioquinas ensayadas,
MCP-2, MCP-3,
MIP-1\beta, MIP3\alpha, MIP3\beta, Rantes,
mMIG, mMDC, mC10, y MIP1 vírica exhibían infiltración mononuclear,
exhibiendo mMDC, mC10 y MIP vírica el nivel de infiltración máximo.
En general, se apreciaba mayor infiltración después de 72 horas que
después de 96 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
| 72 h | 98 h | |||
| Quimioquina | centro | Borde | Centro | Borde |
| GM-CSF(200 ug)* | 0 | 0 | 3 | 2/3 |
| Rantes(20 ug)* | 0/1 | 1 | 2/3 | 1/2 |
| MCP2 | 1/2 | 1 | 1/2 | 1 |
| MCP2 | 1 | 0/1 | 0 | 0 |
| MCP3 | 1/2 | 0 | No Determinado | 0 |
| MCP3 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 1 |
| MIP1b | 0 | 0/1focal | 1 | 0 |
| MIP1b | 1/2focal | 0/1 | 0 | 0 |
| MIP3a | 1 | 1/2 | 0/1 | 0/1 |
| MIP3a | 2 | 1/2focal | 1/2 | 0/1 |
| MIP3b | 2 | 1 | 0 | ½ |
| MIP3b | 1/2 | 1/2focal | -2 | 1/2focal |
| Rantes | 0 | 2 | 0 | 1/2focal |
| Rantes | 1/2 | 0/1 | 1/2focal | 0/1 |
| mMIG | 0/1 | 1 | 0/1 | 0/1 |
| mMIG | 0 | 0/2focal | 0 | 0/1 |
| 72 h | 98 h | |||
| Quimioquina | centro | Borde | Centro | Borde |
| mMDc | 1/2 | 1/2 | 0 | 1 |
| mMDC | 0/1 | 2/3focal | 2 | 2/3focal |
| mC10 | 3/4 | 1/2 | 1/2focal | 1 |
| mC10 | 3/4 | 1/2 | 1/2 | 1/2focal |
| vMIP1 | 2 | 0/1 | 0/1 | 1 |
| vMIP1 | 2 | 1/2 | 2/3 | 2/3 |
| \begin{minipage}[t]{150mm} Clave: "*" Utilizados como controles positivos. Cada fila horizontal representa un macaco Rhesus separado y los registros histológicos de las 4 muestras ensayadas de cada animal. "Focal", un vaso en la sección exhibía inflamación perivascular prominente (es decir, una sección del portaobjetos alrededor de un vaso exhibía infiltración prominente, mientras que el resto del portaobjetos era más o menos normal). "Centro" y "borde" se refieren al punto del que procedía la sección de tejido. Las secciones de tejido de "centro" se tomaron en el sitio de la inyección intradérmica; las secciones de tejido de "borde" se tomaron más lejos del sitio de inyección, hacia el borde de la pápula generada por la inyección. \end{minipage} | ||||
Ejemplo
4
En un segundo experimento, se inyectaron
intradérmicamente cantidades diferentes (aproximadamente 8, 2,4, ó
0,8 \mug en 100 \mul de PBS) de diferentes quimioquinas en
macacos Rhesus bajo anestesia. 24 ó 48 horas después, se practicaron
mediante punción biopsias de 6 mm de piel utilizando técnica
aséptica, se biseccionaron luego y se prepararon para análisis. Una
porción de la biopsia se incrustó en compuesto OCT, se congeló
instantáneamente y se guardó a -70ºC. La otra porción de la biopsia
se fijó en formalina y se incrustó en cera de parafina;
subsiguientemente, se tiñeron las secciones con hematoxilina y
eosina y se examinaron microscópicamente en cuanto a infiltración
de células en la dermis (Tabla 6). Como control negativo, se
inyectaron monos con PBS que carecía de quimioquinas.
La infiltración de células mononucleares en la
dermis se registró basándose en una escala de 0 a 4, como sigue: 0,
infiltración nula; 1, infiltración ligera; 2, infiltración moderada;
3, infiltración sustancial; 4, infiltración severa. Como se indica
en la Tabla 6, las quimioquinas mC10 y vMCK-2
causaban infiltración sustancial de células mononucleares,
especialmente en el momento puntual de 24 horas. Era notable que una
quimioquina codificada por un virus de ratón
(vMCK-2) exhibía una actividad potente en células de
primate. Se observaron células infiltrantes predominantemente en el
tejido adiposo, aunque se apreciaban también células en la región
subcutánea y, en el caso de vMCK-2 a las 48 horas,
en la matriz de colágeno de la dermis superficial. Las quimioquinas
mMDC y vMIP-1 causaban menos inflamación que mC10 y
vMCK-2.
| Quimioquina | 24 horas | 48 horas |
| mC10:0.8 ug | 2 | 0 |
| 2.4 ug | 1 | 2 |
| 8 ug | 3 | 2 |
| mMDC:0.8 ug | 2 | 0 |
| 2.4 ug | 0 | 0 |
| 8 ug | 2 | 0 |
| vMIP-1:0.8 ug | 0 | 0 |
| 2.4 ug | 1 | 0 |
| 8 ug | 0 | 0 |
Ejemplo
5
Las "hibriquinas" son polipéptidos
quiméricos de quimioquina diseñados para generar nuevas moléculas
con las cualidades apropiadas, deseadas y mejoradas. Usualmente, se
determina la secuencia de aminoácidos de una hibriquina deseada y se
produce la molécula por síntesis química. En este ejemplo, las
secuencias de las quimioquinas hMCP-2, mC10 y mMDC
se dividieron conceptualmente en dominios funcionales basados en el
espaciamiento de los residuos cisteína invariantes. Se prepararon
secuencias quiméricas por intercambio de dominios entre estas
moléculas. Las regiones de los términos amino (todos los aminoácidos
del terminal amino de la proteína nativa madura del primer residuo
cisteína conservado) se intercambiaron en la porción restante de una
molécula de quimioquina diferente para crear híbridos. Como se
muestra en Fig. 2, las regiones amino-terminales
entre mC10 y hMCP-2 crearon dos moléculas nuevas:
las moléculas de "hibriquina" mC10/hMCP2 y hMCP2/mC10.
Adicionalmente, las regiones amino-terminales entre
mMDC y hMCP-2 se intercambiaron para crear dos
moléculas nuevas adicionales: las moléculas de "hibriquina"
mMDC/hMCP-2 y hMCP-2/mMDC. Estos
polipéptidos se sintetizaron químicamente utilizando química clásica
de péptidos Fmoc. Los polipéptidos se utilizan en ensayos de
quimiotaxis in vitro e in vivo para determinar sus
propiedades quimiotácticas.
La presente invención proporciona nuevos métodos
y materiales relacionados con composiciones
APC-quimiotácticas e inmunización terapéutica y
profiláctica. Si bien se han proporcionado ejemplos específicos, la
descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas
variaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos
en la técnica después del examen de esta memoria descriptiva.
Claims (30)
1. El uso de una quimiotaxina de célula
presentadora de antígeno (APC-quimiotaxina) y un
antígeno en la fabricación de un medicamento, en el cual la
APC-quimiotaxina es:
(a) una quimioquina seleccionada de la
quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) y mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
2. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
composición comprende además una quimioquina adicional.
3. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
composición comprende a la vez vMCK-2 y mC10.
4. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
APC-quimiotaxina es codificada por un polinucleótido
producido por recombinación in vitro de polinucleótidos que
codifican vMCK-2 o mC10 y otra quimioquina existente
naturalmente.
5. El uso de la reivindicación 1, en el cual el
antígeno se deriva de un patógeno microbiano o es un antígeno
asociado a un tumor.
6. El uso de la reivindicación 5, en el cual el
patógeno microbiano es una bacteria o un virus.
7. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
APC-quimiotaxina es vMCK-2.
8. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
APC-quimiotaxina es mC10.
9. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
APC-quimiotaxina es un polinucleótido codificante
de vMCK-2.
10. El uso de la reivindicación 1, en el cual la
APC-quimiotaxina es un polinucleótido que codifica
mC10.
11. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de quimioquina sustancialmente purificado y un
polipéptido antigénico, en la cual el polipéptido de quimioquina es
la quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) o una variante de la misma que no cambia
las propiedades quimiotácticas del polipéptido, o mC10 o una
variante de la misma que no cambia las propiedades quimiotácticas
del polipéptido.
12. La composición de vacuna de la reivindicación
11, en la cual el polipéptido de quimioquina es
vMCK-2.
13. La composición de vacuna de la reivindicación
11, en la cual el polipéptido de quimioquina es mC10.
14. Una composición que comprende una
quimiotaxina de células presentadoras de antígeno
(APC-quimiotaxina) sustancialmente purificada y un
antígeno, en la cual dicha APC-quimiotaxina es:
(a) una quimioquina seleccionada del grupo
constituido por la quimioquina-2 del citomegalovirus
murino (vMCK-2) o mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
15. La composición de la reivindicación 14, que
comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable o
un adyuvante convencional.
16. La composición de la reivindicación 14, que
comprende adicionalmente una quimioquina adicional.
17. La composición de la reivindicación 14, que
comprende a la vez vMCK-2 y mC10.
18. La composición de la reivindicación 14, en la
cual el antígeno se deriva de un patógeno microbiano o es un
antígeno asociado a un tumor.
19. La composición de la reivindicación 18, en la
cual el patógeno microbiano es una bacteria o un virus.
20. La composición de la reivindicación 14, en la
cual la APC-quimiotaxina es
vMCK-2.
21. La composición de la reivindicación 14, en la
cual la APC-quimiotaxina es mC10.
\newpage
22. La composición de la reivindicación 14, en la
cual la APC-quimiotaxina es un polinucleótido que
codifica vMCK-2.
23. La composición de la reivindicación 14, en la
cual la APC-quimiotaxina es un polinucleótido que
codifica mC10.
24. Un método de formulación de una composición
capaz de inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno
especificado en un individuo, que comprende combinar una
quimiotaxina de células presentadoras de antígeno
(APC-quimiotaxina), el antígeno especificado y un
excipiente farmacéuticamente aceptable o un adyuvante convencional,
en el cual la APC-quimiotaxina es:
(a) una quimioquina seleccionada de la
quimioquina-2 del citomegalovirus murino
(vMCK-2) y mC10;
(b) una variante de (a) que no cambia las
propiedades quimiotácticas del polipéptido; o
(c) un polinucleótido que codifica (a) o (b).
25. el método de la reivindicación 24, en el cual
el antígeno especificado se deriva de un patógeno microbiano o es un
antígeno asociado a un tumor.
26. El método de la reivindicación 25, en el cual
el patógeno microbiano es una bacteria o un virus.
27. El método de la reivindicación 24, en el cual
la APC-quimiotaxina es vMCK-2.
28. El método de la reivindicación 24, en el cual
la APC-quimiotaxina es mC10.
29. El método de la reivindicación 24, en el cual
la APC-quimiotaxina es un polinucleótido que
codifica vMCK-2.
30. El método de la reivindicación 24, en el cual
la APC-quimiotaxina es un polinucleótido que
codifica mC10.
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